FR2678639A1

FR2678639A1 - Process for cloning nucleic acids

Info

Publication number: FR2678639A1
Application number: FR9108294A
Authority: FR
Inventors: Dumas Milne Edwa Jean-Baptiste; Mallet Jacques
Original assignee: Rhone Poulenc Rorer SA
Current assignee: Aventis Pharma SA
Priority date: 1991-07-03
Filing date: 1991-07-03
Publication date: 1993-01-08
Anticipated expiration: 2011-07-03
Also published as: FR2678639B1

Abstract

The invention relates to a process for cloning nucleic acids, comprising a step for ligating, to the 3' end of a primer extension product, a single-stranded oligonucleotide, non-complementary to the said primer extension product, and a step for synthesising the second strand using a primer complementary to the said oligonucleotide, optionally followed by amplification reactions.

Description

La présente invention concerne le domaine de la biologie moléculaire. Plus particulièrement, elle concerne un procédé de clonage d'acides nucléiques, une trousse pour sa mise en oeuvre, et ses applications. The present invention relates to the field of molecular biology. More particularly, it relates to a process for cloning nucleic acids, a kit for its implementation, and its applications.

L'un des enjeux de la biologie moléculaire réside dans l'étude et la caractérisation des acides nucléiques constituant le patrimoine génétique de chaque cellule (ADN) ou des intermédiaires obligés de la synthèse protéique (ARN). One of the challenges of molecular biology lies in the study and characterization of the nucleic acids constituting the genetic inheritance of each cell (DNA) or obligate intermediates of protein synthesis (RNA).

L'isolement et l'immortalisation de ces molécules au sein d'hôtes procaryotes ou eucaryotes (autrement appelé le clonage) constitue donc une étape clé dans l'approche moléculaire de la physiologie cellulaire.The isolation and immortalization of these molecules within prokaryotic or eukaryotic hosts (otherwise called cloning) therefore constitutes a key step in the molecular approach of cell physiology.

Les techniques de clonage connues font généralement appel à une succession d'étapes classiques. Il s'agit en premier lieu d'extraire les ARN d'une cellule (ARN totaux ou ARN messagers). Ensuite, compte tenu du fait que ces molécules sont rapidement dégradées, il est nécéssaire de réaliser leur rétrotranscription en ADN complémentaires simple brin (ADNc-sb) plus stables. Les molécules simple brin ainsi obtenues sont appelées produits d'extension d'amorce. Enfin, l'ADN in vivo étant une molécule bicaténaire, il est nécéssaire, pour incorporer l'ADNc-sb à un vecteur de clonage (plasmide, cosmide, phage ..), de transformer la molécule monocaténaire en une molécule bicaténaire : ADN complémentaire double brin (ADNc-db).Cette dernière étape consiste à synthétiser un brin complémentaire d'ADN en se basant sur le brin matrice que constitue l'ADNc-sb. Elle est réalisée au moyen d'enzymes (ADN polymérases), qui sont capables de recopier un brin matrice, en allant de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3'. Toutefois, ces enzymes ont besoin d'une amorce pour débuter la synthèse du nouveau brin. Selon les techniques de l'art antérieur, cet amorçage peut être obtenu de plusieurs façons:
Tout d'abord, par autoamoeçage. En effet, pour des raisons qui ne sont pas encore élucidées, une structure en épingle à cheveux se forme fréquemment à l'extrémité 3' de la molécule d'ADNc-sb. Cette structure peut être utilisée pour amorcer la néosynthèse du brin complémentaire de l'ADNc-db.Known cloning techniques generally use a succession of conventional steps. The first step is to extract the RNA from a cell (total RNA or messenger RNA). Then, given the fact that these molecules are rapidly degraded, it is necessary to carry out their retrotranscription into more stable complementary single-stranded DNA (cDNA-sb). The single stranded molecules thus obtained are called primer extension products. Finally, since DNA in vivo is a double-stranded molecule, it is necessary, in order to incorporate cDNA-sb into a cloning vector (plasmid, cosmid, phage, etc.), to transform the single-stranded molecule into a double-stranded molecule: complementary DNA double strand (cDNA-db). This last step consists in synthesizing a complementary strand of DNA based on the template strand which constitutes cs-sb DNA. It is carried out by means of enzymes (DNA polymerases), which are capable of copying a template strand, going from the 5 'end to the 3' end. However, these enzymes need a primer to start the synthesis of the new strand. According to the techniques of the prior art, this priming can be obtained in several ways:
First, by self-priming. Indeed, for reasons that are not yet understood, a hairpin structure frequently forms at the 3 'end of the cDNA-sb molecule. This structure can be used to initiate the neosynthesis of the complementary strand of the db-cDNA.

L'amorçage peut également être réalisé grace à des fragments de L'ART initial. En effet, l'étape de rétrotranscription de L'ART extrait génère des hétéroduplex
ADNc-sb/ARN, qui sont normalement convertis en ADNc-sb par digestion par l'ARNase H. Cependant, selon les conditions choisies, cette digestion peut n'être que partielle, et la néosynthèse du deuxième brin peut alors être amorcée au niveau des fragments d'ARN persistants. Priming can also be achieved using fragments of the initial ART. Indeed, the retrotranscription stage of the extracted ART generates heteroduplexes
CDNA-sb / RNA, which are normally converted into cDNA-sb by digestion with RNAse H. However, depending on the conditions chosen, this digestion may be only partial, and the second strand neosynthesis can then be initiated at the level persistent RNA fragments.

L'amorçage peut enfin être obtenu après addition d'une queue homopolymérique à l'extrémité 3' de l'ADNc-sb. Dans ce cas, la synthèse du deuxième brin est amorcée avec un oligonucléotide consistant en un homopolymère complémentaire de celui ajouté à rADNc-sb. Priming can finally be obtained after addition of a homopolymeric tail at the 3 'end of the sb cDNA. In this case, the synthesis of the second strand is initiated with an oligonucleotide consisting of a homopolymer complementary to that added to the cDNA-sb.

Toutefois, les techniques décrites ci-dessus présentent certains inconvénients, qui limitent leurs applications. Notamment, les étapes d'amorçage ne peuvent pas toujours être correctement contrôlées, et la spécificité de l'appariement de l'amorce, spécialement dans le cas d'une amorce homopolymérique, est limitée, générant un bruit de fond non négligeable. Par ailleurs, les clones obtenus avec des
ADNc-db amorcés à l'aide d'épingles à cheveux ou de fragments d'ARN sont, par construction, incomplets dans la partie correspondant à l'extrémité 5' des ARN (ou 3' du produit d'extension d'amorce).However, the techniques described above have certain drawbacks, which limit their applications. In particular, the priming steps cannot always be properly controlled, and the specificity of the pairing of the primer, especially in the case of a homopolymeric primer, is limited, generating a significant background noise. Furthermore, the clones obtained with
CDNA-db primed using hairpins or RNA fragments are, by construction, incomplete in the part corresponding to the 5 'end of the RNA (or 3' of the primer extension product) .

Enfin, l'utilisation de ces techniques ne permet pas la réalisation de banques d'ADNc de populations cellulaires à effectif restreint. En effet, l'expérience montre qu'il est pratiquement impossible de réaliser des banques d'ADNc si la quantité d'ARNm ayant servi de matrice à la rétrotranscription est inférieure à quelques centaines de nanogrammes. De telles quantités sont obtenues à partir de quelques dizaines de milligrammes de tissu frais, ou encore, de 107 et plus cellules en culture. Finally, the use of these techniques does not allow the creation of cDNA libraries of cell populations with limited numbers. Indeed, experience shows that it is practically impossible to make cDNA libraries if the quantity of mRNA which served as a template for the retrotranscription is less than a few hundred nanograms. Such quantities are obtained from a few tens of milligrams of fresh tissue, or even from 107 and more cells in culture.

Ainsi les noyaux de cerveau humain, les embryons, les cultures primaires de cellules, les biopsies d'organes ou de tissus malades, les formes non libres de parasites, etc, ne peuvent être facilement utilisés comme matériel de départ pour construire des banques d'ADNc. L'utilisation des techniques d'amplification d'ADN in vitro pourrait permettre d'atteindre la masse critique d'ADNc nécéssaire au clonage. Toutefois, ces techniques ne peuvent s'appliquer qu'à des fragments d'ADN dont les extrémités sont connues.Thus the nuclei of the human brain, embryos, primary cell cultures, biopsies of diseased organs or tissues, non-free forms of parasites, etc., cannot be easily used as starting material for building banks of CDNA. The use of DNA amplification techniques in vitro could make it possible to reach the critical mass of cDNA necessary for cloning. However, these techniques can only be applied to DNA fragments whose ends are known.

La présente invention permet de remédier à ces inconvénients. En effet, la demanderesse a maintenant mis au point un procédé de clonage d'acides nucléiques permettant de générer des clones entiers, notamment au niveau des régions 5' des messagers, avec une grande spécificité. Le procédé de l'invention permet également la synthèse, et par la suite l'amplification, de molécules d'ADNc-sb dont les extrémités sont inconnues, à partir de peu de matériel (cellules, ADN, ARN). The present invention overcomes these drawbacks. Indeed, the applicant has now developed a method for cloning nucleic acids making it possible to generate whole clones, in particular at the level of the 5 'regions of the messengers, with great specificity. The process of the invention also allows the synthesis, and subsequently the amplification, of cDNA-sb molecules whose ends are unknown, from little material (cells, DNA, RNA).

Un objet de l'invention réside donc dans un procédé de clonage d'acides nucléiques caractérisé en ce que l'on éffectue les étapes suivantes:
- dans une première étape, la ligature à l'extrémité 3' d'un produit d'extension d'amorce, d'un oligonucléotide simple brin, non complémentaire dudit produit d'extension d'amorce,
- dans une deuxième étape, la synthèse du deuxième brin au moyen d'une
ADN polymérase, en utilisant une amorce complémentaire dudit oligonucléotide, et,
- dans une troisième étape facultative, l'amplification de l'ADNc-db ainsi obtenu.An object of the invention therefore resides in a process for cloning nucleic acids, characterized in that the following steps are carried out:
in a first step, ligation at the 3 ′ end of a primer extension product, of a single-stranded oligonucleotide, not complementary to said primer extension product,
- in a second step, the synthesis of the second strand by means of a
DNA polymerase, using a primer complementary to said oligonucleotide, and,
- In an optional third step, amplification of the cDNA-db thus obtained.

Dans ce qui suit, l'oligonucléotide simple brin et non complémentaire est désigné par le terme oligonucléotide. In what follows, the single-stranded and non-complementary oligonucleotide is designated by the term oligonucleotide.

Dans un mode préféré de l'invention, le procédé met en oeuvre un produit d'extension d'amorce obtenu à partir d'une matrice ARN. Il peut s'agir d'ARN totaux, comme d'ARN messagers (ARNm) ou d'ARN ribosomaux (ARNr). La préparation des ARN totaux peut être réalisée selon différents protocoles connus de l'homme du métier. Notamment, la technique décrite par Belyavsky et al (Nucleic Acids Res. 17 (1989) 2919-2932) ou des techniques dérivées de celle-ci peuvent être utilisées. Dans le cas où la matrice initiale est constituée par un ARNm polyadénylé en 3', celui-ci peut être extrait par chromatographie d'affinité vis-à-vis de l'extrémité polyA. In a preferred embodiment of the invention, the method uses a primer extension product obtained from an RNA template. It can be total RNA, such as messenger RNA (mRNA) or ribosomal RNA (rRNA). The preparation of total RNA can be carried out according to different protocols known to those skilled in the art. In particular, the technique described by Belyavsky et al (Nucleic Acids Res. 17 (1989) 2919-2932) or techniques derived therefrom can be used. In the case where the initial matrix consists of a 3 'polyadenylated mRNA, this can be extracted by affinity chromatography with respect to the polyA end.

La rétrotranscription des ARN extraits peut être effectuée par des procédés connus de l'homme du métier, directement à partir de préparations d'ARN totaux, ou à partir d'ARN du type recherché (ARNm, ARNr). L'amorce utilisée pour cette réaction est préférentiellement bloquée en 5', pour éviter la formation de concatémères des ADNc-sb lors de l'étape de ligation. A titre d'exemple, les conditions de rétrotranscription décrites par Rhyner et al (J. Neurosci. Res. 16 (1986) 167-181), éventuellement adaptées en fonction de la quantité d'ARN de départ, peuvent être utilisées pour préparer le produit d'extension d'amorce mis en oeuvre dans la présente invention. The retrotranscription of the extracted RNAs can be carried out by methods known to those skilled in the art, directly from total RNA preparations, or from RNA of the type sought (mRNA, rRNA). The primer used for this reaction is preferably blocked in 5 ′, to avoid the formation of concatemers of the cDNA-sb during the ligation step. By way of example, the retrotranscription conditions described by Rhyner et al (J. Neurosci. Res. 16 (1986) 167-181), possibly adapted as a function of the quantity of starting RNA, can be used to prepare the primer extension product used in the present invention.

Dans un autre mode particulier de l'invention, le procédé met en oeuvre un produit d'extension d'amorce obtenu à partir d'une matrice ADN. Il peut s'agir préférentiellement d'ADN génomique. En effet, l'une des applications particulièrement avantageuses du procédé de l'invention concerne la caractérisation moléculaire de séquences génomiques, et plus spécifiquement, de séquences génomiques impliquées dans le contrôle de l'expression de gènes connus. In another particular embodiment of the invention, the method uses a primer extension product obtained from a DNA template. It may preferably be genomic DNA. Indeed, one of the particularly advantageous applications of the process of the invention relates to the molecular characterization of genomic sequences, and more specifically, of genomic sequences involved in controlling the expression of known genes.

Dans ce cas, la matrice ADN simple brin peut être obtenue à partir d'ADN génomique total, éventuellement coupé au moyen d'enzymes de restriction, après dénaturation des molécules bicaténaires. Le produit d'extension d'amorce est ensuite synthétisé en utilisant une amorce correspondant à une région du gène étudié, puis purifié. En particulier, il peut être particulièrement avantageux d'utiliser pour la synthèse du produit d'extension une amorce biotinylée, qui permet une purification simple par chromatographie d'affinité sur colonne d'avidine. In this case, the single-stranded DNA template can be obtained from total genomic DNA, possibly cut by means of restriction enzymes, after denaturation of the double-stranded molecules. The primer extension product is then synthesized using a primer corresponding to a region of the gene studied, and then purified. In particular, it may be particularly advantageous to use for the synthesis of the extension product a biotinylated primer, which allows simple purification by affinity chromatography on an avidin column.

Lorsque le produit d'extension d'amorce est synthétisé, les hétéroduplex sont convertis en ADNc-sb par traitement à l'ARNase H, et/ou par hydrolyse alcaline. Par ailleurs, il est également préférable dtéliminer l'amorce libre résiduelle, pour éviter les réactions secondaires de ligation entre l'oligonucléotide et l'amorce. Ceci peut être fait par exemple par chromatographie d'exclusion. When the primer extension product is synthesized, the heteroduplexes are converted to ss-cDNA by treatment with RNAse H, and / or by alkaline hydrolysis. Furthermore, it is also preferable to remove the residual free primer, to avoid secondary ligation reactions between the oligonucleotide and the primer. This can be done for example by exclusion chromatography.

Au cours de la première étape du procédé de l'invention, on utilise préférentiellement pour la ligation un oligonucléotide synthétisé par voie chimique. During the first step of the process of the invention, an oligonucleotide synthesized by chemical means is preferably used for ligation.

La synthèse de cet oligonucléotide est réalisée en tenant compte du fait qu'il est essentiel d'utiliser un oligonucléotide non complémentaire du produit d'extension d'amorce, pour éviter l'amplification d'ADN allochtone.The synthesis of this oligonucleotide is carried out taking into account the fact that it is essential to use an oligonucleotide which is not complementary to the primer extension product, to avoid amplification of allochthonous DNA.

Avantageusement, l'oligonucléotide utilisé est préalablement fonctionnalisé, pour éviter la formation de concatémères à la suite de son auto-ligation. La ligation s'effectuant entre l'extrémité 5' -phosphate de l'oligonucléotide et l'extrémité 3'-OH du produit d'extension d'amorce, il est toutefois indispensable de conserver l'extrémité 5' de l'oligonucléotide réactive. Dans ces conditions, la fonctionnalisation de l'oligonucléotide consiste à bloquer l'extrémité 3'. Préférentiellement, cette fonctionnalisation est faite de telle sorte que l'extrémité 5' comporte un phosphate et l'extrémité 3' ne comporte pas de radical hydroxyle.Ceci peut être réalisé en ajoutant à l'extrémité 3' de l'oligonucléotide un 2'-3' didéoxyribonucléotide de formule ddW dans laquelle X peut être choisi parmi les bases connues entrant dans la compositions des acides nucléiques, telles que notamment l'adénosine, la guanine, la thymidine, etc. La fonction 3'-OH peut également être bloquée par amination, suivie ou non de l'addition d'une biotine. Advantageously, the oligonucleotide used is functionalized beforehand, to avoid the formation of concaterers following its self-ligation. Since the ligation takes place between the 5 ′ -phosphate end of the oligonucleotide and the 3′-OH end of the primer extension product, it is however essential to keep the 5 ′ end of the reactive oligonucleotide . Under these conditions, the functionalization of the oligonucleotide consists in blocking the 3 ′ end. Preferably, this functionalization is done so that the 5 'end contains a phosphate and the 3' end does not contain a hydroxyl radical. This can be achieved by adding a 2 'to the 3' end of the oligonucleotide -3 'dideoxyribonucleotide of formula ddW in which X can be chosen from the known bases used in the composition of nucleic acids, such as in particular adenosine, guanine, thymidine, etc. The 3'-OH function can also be blocked by amination, whether or not followed by the addition of a biotin.

Encore plus préférentiellement, on utilise un oligonucléotide ne formant pas de structure secondaire. De telles structures seraient en effet de nature à perturber, sinon la ligation, du moins l'étape de sytnhèse du brin complémentaire. Even more preferably, an oligonucleotide that does not form a secondary structure is used. Such structures would indeed be likely to disturb, if not the ligation, at least the step of synthesis of the complementary strand.

Par ailleurs, pour augmenter la spécificité de l'amplification invitro, il est particulièrement interessant d'utiliser des oligonucléotides ayant une température d'hybridation relativement élevée. Pour cette raison, un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention est obtenu avec un oligonucléotide ayant un GCio au moins égal à 60 %. Furthermore, to increase the specificity of the invitro amplification, it is particularly interesting to use oligonucleotides having a relatively high hybridization temperature. For this reason, a preferred embodiment of the invention is obtained with an oligonucleotide having a GCio at least equal to 60%.

Dans une variante particulière de l'invention, on utilise un oligonucléotide dont les base situées en 5' forment un ou plusieurs sites de coupure reconnus par des enzymes de restriction. Ceci permet la formation, par digestion enzymatique, de sites compatibles avec ceux d'un vecteur de clonage. In a particular variant of the invention, an oligonucleotide is used, the bases of which 5 'form one or more cleavage sites recognized by restriction enzymes. This allows the formation, by enzymatic digestion, of sites compatible with those of a cloning vector.

La longueur de l'oligonucléotide utilisé dans l'invention doit être suffisante pour permettre l'hybridation d'une amorce d'ADN polymérase. Préférentiellement, on utilise un oligonucléotide d'une longueur au moins égale à 20 mer. Pour une meilleure mise en oeuvre de l'invention, il peut être préférable d'utiliser un oligonucléotide ayant une longueur suffisante pour permettre la réalisation d'étapes supplémentaires d'amplification. Dans ces conditions, la longueur de l'oligonucléotide est avantageusement comprise entre 20 et 60 mer. The length of the oligonucleotide used in the invention must be sufficient to allow hybridization of a DNA polymerase primer. Preferably, an oligonucleotide of a length at least equal to 20 m is used. For a better implementation of the invention, it may be preferable to use an oligonucleotide having a length sufficient to allow the carrying out of additional steps d 'amplification. Under these conditions, the length of the oligonucleotide is advantageously between 20 and 60 m.

La ligation de l'oligonucléotide au produit d'extension d'amorce est effectuée préférentiellement au moyen d'une enzyme capable de lier des molécules simple brin. Ligation of the oligonucleotide to the primer extension product is preferably carried out by means of an enzyme capable of binding single-stranded molecules.

Préférentiellement, on utilise la T4 RNA ligase. Cette enzyme est connue pour sa capacité à lier des molécules d'ARN. La Demanderesse a maintenant montré que cette enzyme pouvait également être utilisée pour ligaturer des ADN sb, ou des oligonucléotides synthétiques à des produits d'extension d'amorce. La réaction de ligation est généralement effectuée à 200C environ pendant une période de 24 à 96 heures. Il est entendu que la durée de la réaction peut être optimisée selon l'efficacité recherchée et la quantité de matériel disponible.Preferably, T4 RNA ligase is used. This enzyme is known for its ability to bind RNA molecules. We have now shown that this enzyme can also be used to ligate sb DNA, or synthetic oligonucleotides to primer extension products. The ligation reaction is generally carried out at around 200C for a period of 24 to 96 hours. It is understood that the duration of the reaction can be optimized depending on the desired efficiency and the quantity of material available.

Les molécules simple brin hybrides ainsi formées contenant I'oligonucléotide lié en 3' du produit d'extension d'amorce peuvent ensuite être soumises à la seconde étape du procédé conduisant à la synthèse du deuxième brin. Cette étape met en oeuvre une ADN polymérase, dont l'activité est initiée par une amorce complémentaire de l'oligonucléotide. L'amorce complémentaire peut être synthétisée aisément par vois chimique, comme cela est décrit dans les exemples. Cette étape de synthèse du brin complémentaire peut être réalisée selon des techniques connues de l'homme du métier. En particulier, il est possible d'utiliser différentes enzymes disponibles dans la technique, telles que le fragment Klenow de l'ADN polymérase de
E.coli, ou des ADN polymérases thermostables, telles que l'enzyme TaqPol (Cetus), la Replinase (Beckman) ou l'Amplifiase (Appligène).Des protocoles détaillés sont décrits dans les références mentionnées ci-après dans les techniques générales de clonage.The hybrid single-stranded molecules thus formed containing the oligonucleotide linked 3 'to the primer extension product can then be subjected to the second step of the process leading to the synthesis of the second strand. This step uses a DNA polymerase, the activity of which is initiated by a primer complementary to the oligonucleotide. The complementary primer can be easily synthesized by chemical means, as described in the examples. This step of synthesizing the complementary strand can be carried out according to techniques known to those skilled in the art. In particular, it is possible to use different enzymes available in the art, such as the Klenow fragment of DNA polymerase.
E. coli, or thermostable DNA polymerases, such as the enzyme TaqPol (Cetus), Replinase (Beckman) or Amplifiase (Appligen). Detailed protocols are described in the references mentioned below in general techniques. cloning.

Les molécules double brin ainsi formées peuvent ensuite être soumises à une réaction d'amplification. Ceci peut être fait en utilisant, en plus de l'amorce ayant servi dans la seconde étape du procédé, une deuxième amorce choisie dans la partie 5' du produit d'extension d'amorce. Cette réaction d'amplification peut notamment être réalisée selon des techniques connues de l'homme de l'art, telles que la "PCR" (saki et al., Science 239 (1988) 487491). Par ailleurs, dans un mode particulièrement avantageux de mise en oeuvre de l'invention, la réaction d'amplification est réalisée simultanément à l'étape de synthèse du brin complémentaire (seconde étape du procédé). Dans ce cas, les deux amorces sont introduites ensemble, en présence de l'ADN polymérase. The double-stranded molecules thus formed can then be subjected to an amplification reaction. This can be done using, in addition to the primer used in the second step of the process, a second primer selected from the 5 'part of the primer extension product. This amplification reaction can in particular be carried out according to techniques known to those skilled in the art, such as "PCR" (saki et al., Science 239 (1988) 487491). Furthermore, in a particularly advantageous embodiment of the invention, the amplification reaction is carried out simultaneously with the step of synthesis of the complementary strand (second step of the process). In this case, the two primers are introduced together, in the presence of the DNA polymerase.

De plus, plusieurs réactions d'amplification peuvent être effectuées successivement, en choisissant pour chaque nouvelle réaction des amorces définissant une région plus petite permettant ainsi des amplifications emboitées ("nested amplification"). In addition, several amplification reactions can be carried out successively, choosing for each new reaction primers defining a smaller region thus allowing nested amplification.

Selon cette variante du procédé, il est possible de cloner spécifiquement des acides nucléiques, en partant de très peu de matériel, et en l'absence de toute information concernant leur séquence. According to this variant of the method, it is possible to specifically clone nucleic acids, starting from very little material, and in the absence of any information concerning their sequence.

Un autre objet de l'invention réside dans une trousse pour la mise en oeuvre du procédé de clonage d'acides nucléiques décrit ci-avant, comprenant l'oligonucléotide de ligation et éventuellement l'enzyme permettant sa ligation au produit d'extension d'amorce. Another subject of the invention resides in a kit for the implementation of the nucleic acid cloning method described above, comprising the ligation oligonucleotide and optionally the enzyme allowing its ligation to the extension product of primer.

Selon une variante particulière de l'invention, la trousse comprend également les amorces et enzymes permettant la rétrotranscription de la matrice initiale ARN en
ADNc-sb.According to a particular variant of the invention, the kit also comprises the primers and enzymes allowing the retrotranscription of the initial RNA matrix into
CDNA-sb.

Selon une autre variante particulière de l'invention, la trousse comprend également les amorces et enzymes permettant l'amplification de l'acide nucléique cloné. According to another particular variant of the invention, the kit also comprises the primers and enzymes allowing the amplification of the cloned nucleic acid.

Ces trousses peuvent être utilisées de manière particulièrement simple et avantageuse pour réaliser des banques d'ADNc, ou pour cloner les régions 5' d'ARN messagers, ou encore pour l'étude et la caractérisation moléculaire de séquences génomiques. These kits can be used in a particularly simple and advantageous manner for making cDNA libraries, or for cloning the 5 'regions of messenger RNA, or even for the study and molecular characterization of genomic sequences.

D'autres avantages de la présente invention apparaitront à la lecture des exemples suivants, donnés à titre illustratif et non limitatif. Other advantages of the present invention will appear on reading the following examples, given by way of illustration and not limitation.

Légende des figures
Figure 1 : Séquence et position respective des oligonucléotides BM 5',
BM 1-5', BM 2-5', BM 3-5', BM 3', BM 1-3', BM 2-3' et BM 3-3'.Legend of figures
Figure 1: Sequence and respective position of the BM 5 'oligonucleotides,
BM 1-5 ', BM 2-5', BM 3-5 ', BM 3', BM 1-3 ', BM 2-3' and BM 3-3 '.

Figure 2 : Séquence et position des oligonucléotides spécifiques de la TPH utilisés lors du clonage du messager de la TPH-B. Les oligonucléotides de la série
BM 5' décrits dans la figure 1 ont également été utilisés lors du clonage.Figure 2: Sequence and position of TPH-specific oligonucleotides used when cloning the TPH-B messenger. The oligonucleotides of the series
BM 5 'described in Figure 1 were also used during cloning.

Figure 3 : Schéma représentant les différentes étapes du procédé de l'invention, appliqué au clonage de rextrêmité 5' d'ARN messagers. Dans le cas de la TPH-ss (exemple 2), il n'a pas été nécessaire de réaliser la troisième étape d'amplification. Figure 3: Diagram representing the different stages of the method of the invention, applied to the cloning of a 5 're-end of messenger RNA. In the case of TPH-ss (example 2), it was not necessary to carry out the third amplification step.

Techniques générales de clonage
Les méthodes classiques de biologie moléculaire comme l'électrophorèse en gel d'agarose, la révélation des acides nucléiques au bromure d'éthidium, le transfert des acides nucléiques sur des membranes (de nylon) et la détection de séquences à l'aide de sondes sont décrites dans la littérature (Maniatis et al., Molecular cloning, A
Laboratoty manual, Second edition, 1989, Cold Spring Harbor, Laboratory press;
Berger et Kimmel, Guide fo molecular cloning techniques, Methods in enzymology 152, 1987, Academic press).De même les techniques comme la réparation d'ADN grace à l'activité exonucléase 3'-5' de la T4 DNA polymerase, la ligature de "linkers", l'introduction de fragments d'ADN dans des vecteurs de clonage comme les bactériophages M13 ou lambda ZAP (Stratagène) sont bien documentées dans
Maniatis et al. précité.General cloning techniques
Conventional molecular biology methods such as agarose gel electrophoresis, revealing of nucleic acids with ethidium bromide, transfer of nucleic acids to (nylon) membranes and sequence detection using probes are described in the literature (Maniatis et al., Molecular cloning, A
Laboratoty manual, Second edition, 1989, Cold Spring Harbor, Laboratory press;
Berger and Kimmel, Guide fo molecular cloning techniques, Methods in enzymology 152, 1987, Academic press). Likewise techniques such as DNA repair thanks to the 3'-5 'exonuclease activity of T4 DNA polymerase, ligation of "linkers", the introduction of DNA fragments into cloning vectors such as the bacteriophages M13 or lambda ZAP (Stratagene) are well documented in
Maniatis et al. cited above.

Exemple 1 : Synthèse et fonctionnalisation d'oligonucléotides et amorces
pour la mise en oeuvre de l'invention.Example 1: Synthesis and functionalization of oligonucleotides and primers
for the implementation of the invention.

Différents oligonucléotides ont été synthétisés en utilisant la chimie des phosphoramidites. La séquence de ces oligonucléotides est donnée sur la figure 1, ainsi que leurs positions respectives. Different oligonucleotides have been synthesized using phosphoramidite chemistry. The sequence of these oligonucleotides is given in FIG. 1, as well as their respective positions.

Les séquences BM 1-5', BM 2-5', BM 3-5', BM 1-3', BM 2-3' et BM 3-3', ont été utilisées comme amorces pour les amplifications successives ("nested amplifications"). The sequences BM 1-5 ', BM 2-5', BM 3-5 ', BM 1-3', BM 2-3 'and BM 3-3', were used as primers for the successive amplifications ("nested amplifications ").

La séquence BM 5' a été utilisée comme oligonucléotide de ligation. The BM 5 'sequence was used as the ligation oligonucleotide.

La séquence BM 3' a été utilisée comme amorce pour la rétrotranscription des ARN totaux extraits des cellules PC12 (exemple 3). The BM 3 'sequence was used as a primer for the retrotranscription of the total RNAs extracted from the PC12 cells (example 3).

La fonctionnalisation de l'oligonucléotide de ligation a été réalisée en présence de la transférase terminale, par ajout d'un 2'-3' didéoxyribonucléotide à l'extrémité 3'. Pratiquement, cette réaction se déroule avec: 500 ng d'oligonucléotide dans 25 p1 de milieu (Cacodylate de sodium 100 mM, CoC12 1 mM, Tris-HCl pH=7.5 30 mM, albumine sérique de boeuf (ASB) 12.5 Fg, DDT 0.1 mM, dideoxyadenosine-triphosphate (ddATP) 100 mM, [a-P3 2',3'-ddATP 2,5 pCi de la solution Amersham d'activité spécifique 3000 Ci mM-l) en présence de 25 unités de transférase terminale (Boehringer Manheim) 1 heure à 370C. Puis, l'enzyme est désactivée par la chaleur (10 minutes à 750C).Les 25cru sont chargés sur un gel de polyacrylamide et la bande correspondant à l'oligonucléotide modifié est excisée et transférée dans une cartouche SPIN-X (Costar). 200 a d'eau sont ajoutés à l'acrylamide et l'ensemble est congelé dans de la carboglace puis décongelé plusieurs fois. La cartouche est ensuite centrifugée (12000 rpm, 5 minutes), l'éluat est précipité [Dextran T 40 (Pharmacia) 0.5 Mg, 0.5 M LiCI, 75 to éthanol] puis dissous dans 50 > 1 d'eau et stocké à -20 C jusqu'à l'utilisation. The functionalization of the ligation oligonucleotide was carried out in the presence of the terminal transferase, by adding a 2'-3 'dideoxyribonucleotide to the 3' end. In practice, this reaction takes place with: 500 ng of oligonucleotide in 25 p1 of medium (100 mM sodium cacodylate, 1 mM CoC12, Tris-HCl pH = 7.5 30 mM, bovine serum albumin (ASB) 12.5 Fg, DDT 0.1 mM, dideoxyadenosine triphosphate (ddATP) 100 mM, [a-P3 2 ', 3'-ddATP 2.5 pCi of the Amersham solution of specific activity 3000 Ci mM-1) in the presence of 25 units of terminal transferase (Boehringer Manheim) 1 hour at 370C. Then, the enzyme is deactivated by heat (10 minutes at 750C). The 25cru are loaded onto a polyacrylamide gel and the band corresponding to the modified oligonucleotide is excised and transferred to a SPIN-X cartridge (Costar). 200 a of water are added to the acrylamide and the whole is frozen in dry ice and then thawed several times. The cartridge is then centrifuged (12,000 rpm, 5 minutes), the eluate is precipitated [Dextran T 40 (Pharmacia) 0.5 Mg, 0.5 M LiCI, 75 to ethanol] then dissolved in 50> 1 of water and stored at -20 C until use.

Exemple 2: Clonage des messagers entiers de la Tryptophane Hydroxylase
de la glande pinéale de rat (TPH-B).Example 2: Cloning of Whole Messengers of Tryptophan Hydroxylase
of the rat pineal gland (TPH-B).

L'ARNm codant pour la Tryptophane Hydroxylase de la glande pinéale de rat présente un polymorphisme au niveau de l'extrémité 5'. Deux formes sont actuellement caractérisées : TPH-a et TPH-B. Comme indiqué sur la figure 2, TPH-a est comprise dans TPH-B. Par ailleurs, TPH-a est relativement abondante (0,5 to des méssagers totaux), et est à peu près 100 fois plus représentée que TPH-B. La capacité à cloner TPH-ss constitue un bon test d'efficacité d'un procédé de clonage. The mRNA encoding Tryptophan Hydroxylase from the rat pineal gland shows a polymorphism at the 5 'end. Two forms are currently characterized: TPH-a and TPH-B. As shown in Figure 2, TPH-a is included in TPH-B. In addition, TPH-a is relatively abundant (0.5 to total messengers), and is about 100 times more represented than TPH-B. The ability to clone TPH-ss is a good test of the efficiency of a cloning process.

Les ARN totaux d'une glande pinéale de rat sont extraits selon la méthode de
Belyavsky (précité). 25 % des ARN ainsi obtenus, soit 200 ng environ, sont utilisés pour réaliser le clonage des extrémités 5' du messager de la TPH selon le schéma général décrit dans la figure 3.The total RNA of a rat pineal gland is extracted according to the method of
Belyavsky (cited above). 25% of the RNAs thus obtained, or approximately 200 ng, are used to clone the 5 ′ ends of the TPH messenger according to the general diagram described in FIG. 3.

2.1. Synthèse des ADNc-sb
La rétrotranscription est réalisée au moyen de l'amorcée PEX, dont la position sur L'ART matrice et la séquence sont données sur la figure 2. Six picomoles d'amorce ont été utilisées, et, pour obtenir un marquage détectable du produit d'extension d'amorce, une première extension de 40 min. est réalisée à 420C en présence de 0,05 mM de dCTP et 0,5 mCi/ml de [a-32P] dCTP. Après avoir ramené la concentration en dCTP à 0,5 mM, la synthèse est prolongée de 40 minutes.2.1. Synthesis of ss-cDNAs
The retrotranscription is carried out by means of the primer PEX, the position of which on the ART matrix and the sequence are given in FIG. 2. Six picomoles of primer were used, and, to obtain a detectable labeling of the product of primer extension, a first extension of 40 min. is carried out at 420C in the presence of 0.05 mM of dCTP and 0.5 mCi / ml of [a-32P] dCTP. After reducing the dCTP concentration to 0.5 mM, the synthesis is extended by 40 minutes.

L'excès de PEX est ensuite éliminé par chromatographie d'exclusion. Pour cela, le produit de la rétrotranscription auquel est ajouté 4 Crl d'EDTA 0,5M est déposé sur une colonne chromatographique de 2 ml de résine Ultrogel AcA 34 (IBF/LKB) équilibrée en Tris-HC1 (pH 8,0, 10 mM, NaCI 300 mM, EDTA 1 mM,
SDS 0,05 %). Des fractions de 100 l sont recueillies, et les fractions contenant les hétéroduplex ADNc-sb/ARN sont réunies. Les ARN restants sont ensuite éliminés par hydrolyse alcaline (fractions incubées 30 minutes en présence de 0,3M NaOH, puis neutralisées en présence d'acide acétique).Enfin, les ADNc-sb sont précipités dans une solution Dextran T40 0,5 g (Pharmacia), 0,5 M Ceci, 75 % méthanol, les culots lavés une fois à l'éthanol 75 % puis séchés sous vide et resuspendus dans un faible volume d'eau (4 à 10 l).The excess PEX is then removed by exclusion chromatography. For this, the product of the transcription to which 4 Crl of 0.5M EDTA is added is deposited on a chromatographic column of 2 ml of Ultrogel AcA 34 resin (IBF / LKB) balanced in Tris-HC1 (pH 8.0, 10 mM, NaCI 300 mM, EDTA 1 mM,
SDS 0.05%). 100 l fractions are collected, and the fractions containing the cDNA-sb / RNA heteroduplexes are combined. The remaining RNAs are then eliminated by alkaline hydrolysis (fractions incubated for 30 minutes in the presence of 0.3M NaOH, then neutralized in the presence of acetic acid). Finally, the cDNA-sb are precipitated in a Dextran T40 0.5 g solution ( Pharmacia), 0.5 M This, 75% methanol, the pellets washed once with 75% ethanol then dried under vacuum and resuspended in a small volume of water (4 to 10 l).

2.2. Ligature de l'oligonucléotide et de l'ADNc-sb
La ligature est effectuée par la T4 RNA ligase. Pour cela, 1 0 d'ADNc-sb et 0,5 FI de l'oligonucléotide BM 5' fonctionalisé selon l'exemple 1 sont incubés avec 10 Ude T4 RNA ligase (Biolab's) à 22 C pendant 48 heures, dans 10 p1 finaux de tampon Tris-HCI pH 8,0 50 mM, MgC12 10 mM, ASB 10 mg/ml, PEG 8000 25 to,
Chlorure de cobalt hexamine 1 mM, ATP 20 SuM. 2.2. Ligation of the oligonucleotide and the ss-cDNA
The ligation is carried out by T4 RNA ligase. For this, 1 0 of sb cDNA and 0.5 FI of the oligonucleotide BM 5 'functionalized according to example 1 are incubated with 10 U of T4 RNA ligase (Biolab's) at 22 C for 48 hours, in 10 final p1 Tris-HCI buffer pH 8.0 50 mM, MgC12 10 mM, ASB 10 mg / ml, PEG 8000 25 to,
Cobalt chloride hexamine 1 mM, ATP 20 SuM.

2.3. Synthèse du second brin et amplification
Vingt % du produit de la ligation a été utilisé dans des réactions d'amplification in vitro dans un volume final de 100 p1 d'un tampon Tris pH 8,9 10 mM, MgC12 1,5 mM, KCl5 mM, dXTP 200 CLAM, gélatine 0,1 v/v, en présence de 2
U, d'AmpliTaq et des oligonucléotides BM 1-5' (Fig. 1) et Ba (Fig. 2) à la concentration de 0,1 yM. Après 40 cycles (930C, 30 secondes; 510C, 30 secondes; 72 C, 1 minute), 1 p1 des amplifiats est prélevé et soumis à une deuxième série d'amplification (30 cycles) dans un volume final de 50 1ll, 1 U AmpliTaq et les amorces BM 2-5' et Ca (Fig. 2) ou bien BM 2-5' et Da (Fig. 2).2.3. Second strand synthesis and amplification
Twenty% of the ligation product was used in in vitro amplification reactions in a final volume of 100 μl of a Tris buffer pH 8.9 10 mM, 1.5 mM MgCl 2, KCl5 mM, dXTP 200 CLAM, 0.1 v / v gelatin, in the presence of 2
U, AmpliTaq and oligonucleotides BM 1-5 '(Fig. 1) and Ba (Fig. 2) at a concentration of 0.1 µM. After 40 cycles (930C, 30 seconds; 510C, 30 seconds; 72 C, 1 minute), 1 p1 of the amplifiers is removed and subjected to a second series of amplification (30 cycles) in a final volume of 50 1ll, 1 U AmpliTaq and the primers BM 2-5 'and Ca (Fig. 2) or else BM 2-5' and Da (Fig. 2).

L'analyse des différents produits d'amplification par la technique de
Southern a montré que TPH-a était présente dans les produits d'amplification [BM 1 5s/Ba] et [BM 2-5'/Ca]. D'autre part la forme la moins abondante TPH-ss, est amplifiée à un niveau détectable dans les produits d'amplification [BM 2-5'/Ca] et [BM 2-5'1Da]. Notons que le signal obtenu dans cette dernière amplification est visible en coloration au bromure d'éthidium. Analysis of the different amplification products by the technique of
Southern showed that TPH-a was present in the amplification products [BM 1 5s / Ba] and [BM 2-5 '/ Ca]. On the other hand, the less abundant form TPH-ss, is amplified to a detectable level in the amplification products [BM 2-5 '/ Ca] and [BM 2-5'1Da]. Note that the signal obtained in this last amplification is visible in staining with ethidium bromide.

Pour économiser le matériel, un aliquote de chacun de ces produits d'amplification a été prélevé et amplifié une trentaine de cycles avec les mêmes amorces auxquelles avaient été préalablement ajouté un phosphate en 5'. Après avoir éliminer les amorces par une chromatographie sur gel AcA 34, nous avons poli les fragments d'ADN avec de T4 DNA polymérase. Ces fragments sont ensuite clonés dans le bactériophage M13mp8 coupé SmaI et déphosphorylé (Amersham). To save material, an aliquot of each of these amplification products was taken and amplified around thirty cycles with the same primers to which a 5 'phosphate had previously been added. After eliminating the primers by chromatography on AcA 34 gel, we polished the DNA fragments with T4 DNA polymerase. These fragments are then cloned into the bacteriophage M13mp8 cut SmaI and dephosphorylated (Amersham).

Le criblage des clones obtenus avec des sondes oligonucléotidiques a montré que plus de 50 % des clones obtenus contenaient des séquences hybridant avec une sonde prise dans la partie commune de la TPH (67 % des clones [BM 1-5t/Ba], 55 % des clones [BM 2-5'/Ca] et 74 % des clones [BM 2-5'1Da]. Un criblage plus fin de ces clones (avec une sonde spécifique de la forme -ss) montre que parmi ces clones, 1,5 % des clones TPH [BM 1-5t/Ba], 0,5 % des clones TPH [BM 2-5'/Ca] et 100 % des clones TPH [BM 2-5t/Da] sont des clones TPH-ss. Screening of the clones obtained with oligonucleotide probes showed that more than 50% of the clones obtained contained sequences hybridizing with a probe taken in the common part of TPH (67% of the clones [BM 1-5t / Ba], 55% of clones [BM 2-5 '/ Ca] and 74% of clones [BM 2-5'1Da]. A finer screening of these clones (with a specific probe of the form -ss) shows that among these clones, 1 , 5% of TPH clones [BM 1-5t / Ba], 0.5% of TPH clones [BM 2-5 '/ Ca] and 100% of TPH clones [BM 2-5t / Da] are TPH- clones ss.

La séquence de quelques-uns des clones obtenus montre que tous les clones
TPH-a sont des clones complets correspondant aux séquences déjà publiées. Le seul artefact rencontré est une variation dans la base terminale en 5' (G,A ou T ont été rencontrés). Les clones -(3 séquencés présentent tous en 5' 5 nouvelles bases TGCCC montrant que le procédé de l'invention permet d'obtenir des régions 5' plus complètes.The sequence of some of the clones obtained shows that all the clones
TPH-a are complete clones corresponding to the sequences already published. The only artifact encountered is a variation in the terminal base in 5 '(G, A or T have been encountered). The clones - (3 sequenced all have 5 '5 new TGCCC bases showing that the process of the invention makes it possible to obtain more complete 5' regions.

Exemple 3: Construction d'une banque ADNc en partant de peu de cellules
: réalisation et criblage d'une banque à partir des ARN extraits
de 104 cellules PC12
Les cellules PC12 sont des cellules de phéochromocytome de rat. La moitié (environ 10 ng) des ARN totaux extraits de 104 cellules est utilisée pour une rétrotranscription amorcée par BM-3' figure 1). A la fin de la synthèse, cette amorce est éliminée par chromatographie sur gel d'AcA 34 comme décrit précédemment.Example 3: Construction of a cDNA Library Starting from Few Cells
: creation and screening of a bank from extracted RNA
104 PC12 cells
PC12 cells are rat pheochromocytoma cells. Half (approximately 10 ng) of the total RNA extracted from 104 cells is used for a retrotranscription initiated by BM-3 '(Figure 1). At the end of the synthesis, this primer is removed by chromatography on AcA 34 gel as described above.

La ligature de l'ADNc-sb avec BM-5' (préparé et fonctionnalisé comme dans l'exemple 1) est réalisée en 24 heures, dans les mêmes conditions que pour l'exemple 2.2. Ligation of the sb cDNA with BM-5 ′ (prepared and functionalized as in Example 1) is carried out in 24 hours, under the same conditions as for Example 2.2.

La totalité de la ligature est utilisée pour une amplification in vitro dans un volume final de 100 p1 d'un tampon Tris pH 8,9 10 mM, MgCl2 1,5 mM, KC1 5 mM, dXIP 200 iM, gélatine 0,1 v/v, en présence de 2 U d'AmpliTaq et des oligonucléotides BM 1-5' et BM 1-3' (figure 1) à la concentration de 0,1 FM. Après 25 cycles (93"C, 30 secondes/55"C, 30 secondesJ72 C, 1 minute), les petits fragments d'ADN sont éliminés par chromatographie sur une colonne de Séphacryl S 400 (Pharmacia) équilibrée en Tris-HCl pH=8.5 0,1 M. 1 al des éluats est prélevé et soumis à une deuxième série d'amplification (25 cycles) dans un volume final de 50 1, 1U AmpliTaq et les amorces BM 2-5' et BM 2-3' (figure 1). Enfin 1 p1 des éluats est prélevé et soumis à une troisième série d'amplification (25 cycles) dans un volume final de 50 p1, 1U AmpliTaq et les amorces BM 3-5' et BM 3-3' (figure 1) et les produits de cette amplification sont purifiés sur une colonne de Séphacryl S 400. The entire ligation is used for in vitro amplification in a final volume of 100 μl of Tris buffer pH 8.9 10 mM, MgCl2 1.5 mM, KC1 5 mM, dXIP 200 iM, gelatin 0.1 v / v, in the presence of 2 U of AmpliTaq and of the oligonucleotides BM 1-5 'and BM 1-3' (Figure 1) at a concentration of 0.1 FM. After 25 cycles (93 "C, 30 seconds / 55" C, 30 seconds J72 C, 1 minute), the small DNA fragments are eliminated by chromatography on a column of Sephacryl S 400 (Pharmacia) balanced in Tris-HCl pH = 8.5 0.1 M. 1 al of the eluates is removed and subjected to a second series of amplification (25 cycles) in a final volume of 50 1, 1U AmpliTaq and the primers BM 2-5 'and BM 2-3' ( figure 1). Finally 1 p1 of the eluates is removed and subjected to a third series of amplification (25 cycles) in a final volume of 50 p1, 1U AmpliTaq and the primers BM 3-5 'and BM 3-3' (Figure 1) and the products of this amplification are purified on a column of Sephacryl S 400.

Par souci de conserver du matériel, un aliquote des éluats de colonne est repris et soumis à 20 cycles d'amplification [BM 3-3'1BM 3-5'] avec des amorces dont l'extrémité 5' est phosphatée. Après polissage à la T4 DNA polymérase, des "linkers"
Eco RI sont ligaturés aux fragments d'ADN. Puis ceux-ci sont clonés au site Eco RI du bactériophage Lambda ZAP (Stratagène). Le criblage de la banque obtenue avec une sonde ADNc spécifique de la tyrosine hydroxylase (TH) révèle la présence de clones à une fréquence (3/10000) qui est compatible avec l'abondance de ce messager dans ces cellules (2/10000).For the sake of keeping material, an aliquot of column eluates is taken up and subjected to 20 amplification cycles [BM 3-3'1BM 3-5 '] with primers whose 5' end is phosphated. After polishing with T4 DNA polymerase, "linkers"
Eco RIs are ligated to DNA fragments. These are then cloned at the Eco RI site of the Lambda ZAP bacteriophage (Stratagene). Screening of the library obtained with a cDNA probe specific for tyrosine hydroxylase (TH) reveals the presence of clones at a frequency (3/10000) which is compatible with the abundance of this messenger in these cells (2/10000).

Exemple : Comparaison de l'efficacité du procédé de l'invention par rapport à la technique utilisant le "tailing"
Pour réaliser cette expérience nous avons utilisé un mélange d'ARN messagers constitué de 50 fg (fentogramme 10-15 g) d'un ARNm de tryptophane hydroxylase (TPH) de rat synthétique et de 500 pg (picogramme = 10-12 g) d'une échelle de poids moléculaire d'ARN constituée de 6 espèces moléculaires couvrant une masse de 0,24 à 9,5 kb (kilobase). Les ARN messagers ont été rétrotranscripts en utilisant l'amorce BM-3' précédemment décrite.Example: Comparison of the Efficiency of the Process of the Invention Against the Technique Using "Tailing"
To carry out this experiment, we used a mixture of messenger RNA consisting of 50 fg (fentogram 10-15 g) of a synthetic rat tryptophan hydroxylase (TPH) mRNA and 500 pg (picogram = 10-12 g) d '' an RNA molecular weight scale made up of 6 molecular species covering a mass of 0.24 to 9.5 kb (kilobase). The messenger RNAs were retrotranscripts using the primer BM-3 'previously described.

Une queue homopolymérique de dG a été ajoutée à l'extrémité 3' d'une partie des ADNc-sb en utilisant l'activité de la terminale transférase ("tailing"). Par la suite les molécules "tailées" et "non tailées" résultant de cette réaction ont subi un cycle d'amplification in vitro avec une amorce de séquence anticomplémentaire à BM-5' et contenant en 3' une queue homopolymérique de 6 résidus dC. Afin de limiter les phénomènes d'amplification aspécifique observés au cours des expériences précédentes, cette amorce a été utilisée pour un seul cycle et en très faible quantité. A homopolymeric tail of dG was added to the 3 'end of part of the cDNA-sb using the activity of the terminal transferase ("tailing"). Subsequently, the "tailed" and "non-tailed" molecules resulting from this reaction underwent an in vitro amplification cycle with a primer of anticomplementary sequence with BM-5 'and containing in 3' a homopolymeric tail of 6 dC residues. In order to limit the phenomena of aspecific amplification observed during the previous experiments, this primer was used for a single cycle and in very small quantity.

Pour les autres amplifications, nous avons suivi la stratégie d'amplification emboîtée (nested PCR) déjà décrite pour l'amplification des messagers des cellules PC12. For the other amplifications, we followed the nested PCR strategy already described for the amplification of messengers from PC12 cells.

En parallèle, une autre partie des ADNc-sb a été utilisée dans des expériences de ligation identiques à celles décrites pour l'amplification des ADNc de la lignée de cellules PC12 (exemple 3). In parallel, another part of the ss-cDNA was used in ligation experiments identical to those described for the amplification of the cDNAs of the PC12 cell line (Example 3).

Des "Southerns blots" des produits de la troisième amplification emboitée (amorces BM 3-5' et BM 3-3') hybridés avec un oligonucléotide spécifique de la TPH mettent clairement en évidence la présence de séquences nucléotidiques complémentaires de la sonde dans les tubes résultant du "tailing" et du clonage selon l'invention. Cependant, un signal non spécifique important apparaît également dans les tubes témoins contenant tous les produits utilisés pour le "tailing" à l'exception de l'enzyme, alors qu'aucune amplification aspécifique n'apparaît dans les témoins de l'invention. Ceci montre clairement que le procédé de l'invention est beaucoup plus sélectif que ceux disponibles dans l'art antérieur. "Southern blots" of the products of the third nested amplification (primers BM 3-5 'and BM 3-3') hybridized with a specific oligonucleotide of TPH clearly demonstrate the presence of nucleotide sequences complementary to the probe in the tubes resulting from "tailing" and cloning according to the invention. However, an important non-specific signal also appears in the control tubes containing all the products used for "tailing" with the exception of the enzyme, while no aspecific amplification appears in the controls of the invention. This clearly shows that the process of the invention is much more selective than those available in the prior art.

Claims

1. A method of cloning nucleic acids characterized in that the following steps are carried out:

in a first step, ligation at the 3 ′ end of a primer extension product, of a single-stranded oligonucleotide, not complementary to said primer extension product,

- in a second step, the synthesis of the second strand by means of a

DNA polymerase, using a primer complementary to said oligonucleotide, and,

- In an optional third step, amplification of the cDNA-db thus obtained.

2. Method according to claim 1 characterized in that the primer extension product is obtained from an RNA matrix.

3. Method according to claim 1 characterized in that the primer extension product is obtained from a DNA matrix.

4. Method according to claim 1 characterized in that, during the first step, using an oligonucleotide functionalized in 3 'so as to prevent its self-ligation.

5. Method according to claim 4 characterized in that an oligonucleotide is used which does not contain a hydroxyl radical in 3 '.

6. Method according to claim 5 characterized in that an oligonucleotide is used comprising in 3 'a 2'-3' dideoxyribonucleotide of formula ddXIP in which X is chosen from the known bases used in the composition of nucleic acids.

7. Method according to claim 5 characterized in that an oligonucleotide is used comprising at 3 'an amine function.

8. Method according to claim 4 characterized in that an oligonucleotide is used which does not form secondary structures.

9. Method according to claim 4 characterized in that an oligonucleotide is used whose bases located in 5 'form one or more cleavage sites recognized by restriction enzymes.

10. Method according to claim 4 characterized in that an oligonucleotide using a length at least equal to 20 mer is used.

11. Method according to claim 1 characterized in that the ligation is carried out in the presence of an enzyme capable of binding single-stranded nucleic acids.

12. Method according to claim 11 characterized in that the enzyme is

T4 RNA ligase.

13. The method of claim 12 characterized in that the ligation is carried out at a temperature of about 200C, for a period of 24 to 96 hours.

14. Method according to claim 1 characterized in that for the third step, a second primer is used in addition, corresponding to a region of the 5 'part of the primer extension product.

15. The method of claim 14 characterized in that one carries out several amplification cycles.

16. Kit for carrying out the method of cloning nucleic acids according to claims 1 to 15 comprising the oligonucleotide ligation and optionally the enzyme allowing its ligation to the primer extension product.

17. Kit according to claim 16 characterized in that it also comprises the primers and enzymes allowing the retrotranscription of an initial RNA matrix into cDNA-sb.

18. Kit according to one of claims 16 or 17 characterized in that it also comprises primers and enzymes allowing the amplification of the cloned nucleic acid.

19. Use of a kit according to any one of claims 16 to 18 for making cDNA libraries, or for cloning the 5 'regions of messenger RNA, or also for the study and molecular characterization of genomic sequences .