FR2678283A1 - NUCLEOTIDE SEQUENCES, CORRESPONDING AMINO ACID SEQUENCES, AND BIOLOGICAL APPLICATIONS THEREOF. - Google Patents
NUCLEOTIDE SEQUENCES, CORRESPONDING AMINO ACID SEQUENCES, AND BIOLOGICAL APPLICATIONS THEREOF. Download PDFInfo
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Abstract
Description
SEQUENCES DE NUCLEOTIDES, SEQUENCES D'ACIDES AMINES
CORRESPONDANTES ET LEURS APPLICATIONS BIOLOGIQUES.NUCLEOTIDE SEQUENCES, AMINO ACID SEQUENCES
CORRESPONDENTS AND THEIR BIOLOGICAL APPLICATIONS.
L' invention a pour objet des séquences de nucléotides et les séquences d'acides aminés correspondantes. Elle concerne également l'obtention de ces séquences et leurs applications. The subject of the invention is nucleotide sequences and the corresponding amino acid sequences. It also relates to obtaining these sequences and their applications.
I1 est admis depuis de nombreuses années que le néphroblastome induit par le virus auxiliaire de la myéloblastose aviaire (MAV) constitue un modèle animal de la tumeur de Wilms chez l'enfant. Bien que ces deux types de tumeurs aient des éthiologies différentes, aucun virus n'ayant été associé jusqu a présent au développement du néphroblastome humain, on conçoit que l'étude, au niveau moléculaire des néphroblastomes viro-induits, peut permettre de caractériser des paramètres difficilement accessibles dans le système humain. It has been recognized for many years that nephroblastoma induced by the avian myeloblastosis helper virus (AVM) is an animal model of Wilms' tumor in children. Although these two types of tumors have different ethiologies, no virus having been associated until now with the development of human nephroblastoma, it is conceivable that the study, at the molecular level of viral-induced nephroblastomas, can make it possible to characterize parameters hardly accessible in the human system.
Les études des inventeurs concernant de tels néphroblastomes aviaires induits par le MAV leur ont permis de caractériser chez la poule un gène embryonnaire appelé gène non dont l'expression s'avère stimulée à des niveaux variables dans les tumeurs, mais qui est éteint dans les cellules de rein adulte normal. The studies of the inventors concerning such avian nephroblastomas induced by MAV have enabled them to characterize in the chicken an embryonic gene called non gene whose expression proves to be stimulated at variable levels in tumors, but which is extinguished in cells normal adult kidney.
En développant leurs travaux dans ce domaine, les inventeurs ont élaboré des outils leur permettant d'étudier l'expression de gènes homologues dans les tumeurs humaines et dans certains types cellulaires. By developing their work in this area, the inventors have developed tools allowing them to study the expression of homologous genes in human tumors and in certain cell types.
Ainsi, en clonant les séquences désoxyribonucléiques et un ADN complémentaire correspondant au gène nov des cellules normales de poule, les inventeurs ont établi la séquence nucléotidique partielle des ADN et la séquence nucléotidique complète de l'ADNc. Des sondes moléculaires spécifiques ont été établies sur la base de cette séquence et utilisées pour détecter la présence et l'expression de gènes homologues dans divers types cellulaires humains. Thus, by cloning the deoxyribonucleic sequences and a complementary DNA corresponding to the nov gene of normal hen cells, the inventors established the partial nucleotide sequence of the DNAs and the complete nucleotide sequence of the cDNA. Specific molecular probes have been established based on this sequence and used to detect the presence and expression of homologous genes in various human cell types.
L'invention a donc pour but de fournir de nouvelles séquences de nucléotides d'un gène impliqué notamment dans les cellules tumorales. The object of the invention is therefore to provide new nucleotide sequences of a gene involved in particular in tumor cells.
Elle a également pour but de fournir des moyens pour l'isolement de ces séquences. It also aims to provide means for the isolation of these sequences.
L'invention vise en outre les protéines codées correspondantes et les anticorps polyclonaux et monoclonaux dirigés contre ces protéines. The invention further relates to the corresponding coded proteins and to the polyclonal and monoclonal antibodies directed against these proteins.
L'invention vise de plus l'utilisation de ces séquences, protéines et anticorps dans des applications biologiques, en particulier dans des tests de détection. The invention further relates to the use of these sequences, proteins and antibodies in biological applications, in particular in detection tests.
Les séquences de nucléotides de l'invention sont caractérisées en ce qu'elles renferment un enchaînement de nucléotides capable de s'hybrider, dans des conditions stringentes (50 de formamide 5 X SC), avec une ou plusieurs séquences du gène na de poule dont 1'ADNc présente l'enchaînement de nucléotides (I) suivant GCGGCGGGTAGACGGCCGGGACT ATG GAG ACG GGC GGC GGG CAG GGG CTG CCC GTC CTG CTG CTG CTC CTG CTC CTC CTC CGG CCG TGC GAG GTG 95
AGC GGG CGG GAG GCG GCG TGC CCC CGG CCC TGC GGC GGG CGC TGC CCC CCG GCG GAG CCG CCG CGC TGC GCC CCG GGA GTG CCC GCC CTG 185
GAC GGC TGC GCC TGC TGC CTG GTG TGC GCC CGG CAG CGC GGC GAG AGC TGC TCC CCT CTG CTG CCC TGC GAC GAG AGC GGC GGC CTC TAC 275
TGC GAC CGC GGC CCC GAG GAC GGC GGC GGC GGC GCC GGC ATC TGC ATG ATG GTG CTG GAA AAC TGC GTG TTC GAT GGG ATG ATT TAC CGC 365
AAC GGG GAG ACG TTC CAG CCC AGC TGC AAG TAC CAG TGC ACC TGC CGG GAC GGG CAG ATC GGG TGC CTG CCC CGC TGC AAC CTG GGC CTG 455
CTG CTC CCC GGC CCC GAC TGC CCC TTC CCG CGG AAG ATC GAA GTC CCC GGA GAG TGC TGC GAG AAG TGG GTG TGC GAC CCC AGG GAT GAA 545
GTG CTC CTG GGA GGC TTT GCT ATG GCT GCA TAC AGA CAG GAG GCC ACA CTT GGG ATA GAC GTG TCT GAT TCA AGT GCC AAT TGT ATT GAA 635
CAG ACA ACA GAA TGG AGC GCT TGT TCC AAA AGC TGT GGA ATG GGC TTT TCT ACC CGT GTT ACC AAC AGA AAT CAG CAG TGT GAG ATG GTG 725
AAG CAG ACA CGA CTT TGC ATG ATG AGA CCT TGT GAA AAC GAA GAG CCA TCT GAT CCT AAG AAA GGA AAA TGT ATC CAA ACA AAG AAA TCC 215
TGT AAA GCT GTT CGT TTT GAA TAC AAG AAC TGC ACC AGT GTG CAG ACT TAC AAA CCT CGT TAC TGT GGC CTC TGC AAT GAT GGG CGA TGC 905
TGT GTC TGT CAT GGT AAC AAA ACG ATT CAA GTT GAG TTC CGC TGT CCT CAG GGC AAA TTC CTA AAA AAG CCA ATG ATG TTG ATC AAT ACC 995
TGT GTC TGT CAT GGT AAC TGT CCT CAG AGT AAC AAT GCT TTC TTC CAG CCA TTA GAT CCC ATG TCT AGT GAA GCA AAA ATA TGAAATGTATA 1087
GTTTAGGTGGCCCAAAAGGTATGTAGTTTGTACAAACTTGACCCACAATCAGGTGAATGTAATAATTGCATATGTAAAAATATCTGAGATTTTTTTCTAAACAGTCTGAGTGCCTTTTT 1206
TTTCCTGTAGTTTACTAAATACCTCATGACGTTTCACCCCTCCAAATGTCTTTTATTCATTTGAAGGAAATTTTGTACCTTGGACAGAGCGCCTTCTGTTTTCTTGACAGTGGCATAAC 1325
GATTACAAAGTCAACAGCTAGTCTTTCTCTCTGAGTTTAGAGGACCTTGCCATGATTTTCAGTAGCCATAAGACTGGGCTTTTTAATAATGGATTCCTTGGGGAATGCATGATAATATG 1444
TCACAAAAGCTTCCAGAGTTTTCACTTTGAATAATGTGTACAAACACTTACACAGCCTTCTTCTTTCTGTTCAAGTTAAATTCTTCCGGATAACTGAAAATGTTACTGATGAGAGTCTG 1563
AATTCTCCTGGCTTATAAAGTACCTTCTATCTGTACCTCTTGACTTTCTCTGAGGGATTAGTTTGCACATAGCCTCAGAAATGACATAGCTAAGATCTCGTATCTTGAAGCATAGGAGA 1682
TTGATAGCTGATAACAAATTTCTCATTCGTAGCTTTATTAGCAGCCTAATCCAAAACCTACTGAAGAAAGTGTCTTACAAGAGCTTGGTTCTAACCAGTGTCTGTCTGTAGATAAAGTA 1801
GTTGTATGCAAAAATAAAATTTCTGTAAATTCCTTTAAAATACTAACTGTATCAGATGGTGCTTCACTTACTAGAAAGATGTTTATGTAAATAGAAACTGTATATATTGTAATATAAACT 1920
TTTATTAGGTAAATAAACTTTATGTGATCAAAATGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 1975
plus spécialement avec l'enchaînement (Il) suivant
CCC CGG CCC TGC GGG GGG CGC TGC CCC CCG GAG CCG CCG CGC TGC GCC CCG GGA GTG CCC GCC
CAC CGC TGC CGC TGC TGC CTG CTG TGC GCC CCC CAC CCC GGC CTG ACC TGG TCC CCT CTC CTG CCC TGC SAC CAC ACC CGC CGC CTC TAC
TGG GAC CGC GGC CCC GAG GAC GGC GGC GGC GCG GGG ATG TGG ATG GTG CTG GAA GGG GAC AAC TGT GTG TTC GAT GGG ATG ATT TAC CGC
AAC GGC GAG ACG TTC CAG CCC AGG TGT AAG TAC CAG TGT ACC TGG CGG GAC GGG CAG ATT GGG TGC CTG CCT CCC TGG AAC CTG GGC CTG
CTC CTC CCC CCC CCC CAC TGC CCC TTC CCC CGG AAG ATC CAA GTC CCC GGA GAC TGC TGC GAG MG TCC CTC TGC GAC CCC ACC CAT CAA
GTG CTC CTC CTA GGC TTT GCT ATG GCT GCA TAC AGA CAG GAC GCC ACA CTT CCC ATA GAC GTG TCT GAT TCA AGT GCC AAT TCA ATT CAA
CAC ACA ACA CAA TGG AGT GCT TCT TCC AAA AGC TCT GGA ATC GGC m TCT ACC CGT CTT ACC AAC AGA AAT
La séquence nucléotidique entière du clone d'ADNc nov de poule est formée de 1975 pb et comprend au moins 5 exons. Cette séquence comprend un cadre ouvert de lecture de 1,0 kb, codant pour une protéine potentielle de 32300
Da, allant du nucléotide 24 au nucléotide 1076. Ce cadre ouvert de lecture est suivi de 899 pb de séquences 3' non codantes qui contiennent deux signaux de motifs potentiels de polyadénylation AATAAA en position 1914 et 1932. Ce gène nov de poule est surexprimé dans des néphroblastomes aviaires induits par MAV étudiés par les inventeurs.The nucleotide sequences of the invention are characterized in that they contain a sequence of nucleotides capable of hybridizing, under stringent conditions (50 of formamide 5 X SC), with one or more sequences of the hen na gene of which The cDNA presents the nucleotide sequence (I) according to GCGGCGGGTAGACGGCCGGGACT ATG GAG ACG GGC GGC GGG CAG GGG CTG CCC GTC CTG CTG CTG CTC CTG CTC CTC CTC CGG CCG TGC GAG GTG 95
AGC GGG CGG GAG GCG GCG TGC CCC CGG CCC TGC GGC GGG CGC TGC CCC CCG GCG GAG CCG CCG CGC TGC GCC CCG GGA GTG CCC GCC CTG 185
GAC GGC TGC GCC TGC TGC CTG GTG TGC GCC CGG CAG CGC GGC GAG AGC TGC TCC CCT CTG CTG CCC TGC GAC GAG AGC GGC GGC CTC TAC 275
TGC GAC CGC GGC CCC GAG GAC GGC GGC GGC GGC GCC GGC ATC TGC ATG ATG GTG CTG GAA AAC TGC GTG TTC GAT GGG ATG ATT TAC CGC 365
AAC GGG GAG ACG TTC CAG CCC AGC TGC AAG TAC CAG TGC ACC TGC CGG GAC GGG CAG ATC GGG TGC CTG CCC CGC TGC AAC CTG GGC CTG 455
CTG CTC CCC GGC CCC GAC TGC CCC TTC CCG CGG AAG ATC GAA GTC CCC GGA GAG TGC TGC GAG AAG TGG GTG TGC GAC CCC AGG GAT GAA 545
GTG CTC CTG GGA GGC TTT GCT ATG GCT GCA TAC AGA CAG GAG GCC ACA CTT GGG ATA GAC GTG TCT GAT TCA AGT GCC AAT TGT ATT GAA 635
CAG ACA ACA GAA TGG AGC GCT TGT TCC AAA AGC TGT GGA ATG GGC TTT TCT ACC CGT GTT ACC AAC AGA AAT CAG CAG TGT GAG ATG GTG 725
AAG CAG ACA CGA CTT TGC ATG ATG AGA CCT TGT GAA AAC GAA GAG CCA TCT GAT CCT AAG AAA GGA AAA TGT ATC CAA ACA AAG AAA TCC 215
TGT AAA GCT GTT CGT TTT GAA TAC AAG AAC TGC ACC AGT GTG CAG ACT TAC AAA CCT CGT TAC TGT GGC CTC TGC AAT GAT GGG CGA TGC 905
TGT GTC TGT CAT GGT AAC AAA ACG ATT CAA GTT GAG TTC CGC TGT CCT CAG GGC AAA TTC CTA AAA AAG CCA ATG ATG TTG ATC AAT ACC 995
TGT GTC TGT CAT GGT AAC TGT CCT CAG AGT AAC AAT GCT TTC TTC CAG CCA TTA GAT CCC ATG TCT AGT GAA GCA AAA ATA TGAAATGTATA 1087
GTTTAGGTGGCCCAAAAGGTATGTAGTTTGTACAAACTTGACCCACAATCAGGTGAATGTAATAATTGCATATGTAAAAATATCTGAGATTTTTTTCTAAACAGTCTGAGTGCCTTTTT 1206
TTTCCTGTAGTTTACTAAATACCTCATGACGTTTCACCCCTCCAAATGTCTTTTATTCATTTGAAGGAAATTTTGTACCTTGGACAGAGCGCCTTCTGTTTTCTTGACAGTGGCATAAC 1325
GATTACAAAGTCAACAGCTAGTCTTTCTCTCTGAGTTTAGAGGACCTTGCCATGATTTTCAGTAGCCATAAGACTGGGCTTTTTAATAATGGATTCCTTGGGGAATGCATGATAATATG 1444
TCACAAAAGCTTCCAGAGTTTTCACTTTGAATAATGTGTACAAACACTTACACAGCCTTCTTCTTTCTGTTCAAGTTAAATTCTTCCGGATAACTGAAAATGTTACTGATGAGAGTCTG 1563
AATTCTCCTGGCTTATAAAGTACCTTCTATCTGTACCTCTTGACTTTCTCTGAGGGATTAGTTTGCACATAGCCTCAGAAATGACATAGCTAAGATCTCGTATCTTGAAGCATAGGAGA 1682
TTGATAGCTGATAACAAATTTCTCATTCGTAGCTTTATTAGCAGCCTAATCCAAAACCTACTGAAGAAAGTGTCTTACAAGAGCTTGGTTCTAACCAGTGTCTGTCTGTAGATAAAGTA 1801
GTTGTATGCAAAAATAAAATTTCTGTAAATTCCTTTAAAATACTAACTGTATCAGATGGTGCTTCACTTACTAGAAAGATGTTTATGTAAATAGAAACTGTATATATTGTAATATAAACT 1920
TTTATTAGGTAAATAAACTTTATGTGATCAAAATGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 1975
more especially with the following sequence (II)
CCC CGG CCC TGC GGG GGG CGC TGC CCC CCG GAG CCG CCG CGC TGC GCC CCG GGA GTG CCC GCC
CAC CGC TGC CGC TGC TGC CTG CTG TGC GCC CCC CAC CCC GGC CTG ACC TGG TCC CCT CTC CTG CCC TGC SAC CAC ACC CGC CGC CTC TAC
TGG GAC CGC GGC CCC GAG GAC GGC GGC GGC GCG GGG ATG TGG ATG GTG CTG GAA GGG GAC AAC TGT GTG TTC GAT GGG ATG ATT TAC CGC
AAC GGC GAG ACG TTC CAG CCC AGG TGT AAG TAC CAG TGT ACC TGG CGG GAC GGG CAG ATT GGG TGC CTG CCT CCC TGG AAC CTG GGC CTG
CTC CTC CCC CCC CCC CAC TGC CCC TTC CCC CGG AAG ATC CAA GTC CCC GGA GAC TGC TGC GAG MG TCC CTC TGC GAC CCC ACC CAT CAA
GTG CTC CTC CTA GGC TTT GCT ATG GCT GCA TAC AGA CAG GAC GCC ACA CTT CCC ATA GAC GTG TCT GAT TCA AGT GCC AAT TCA ATT CAA
CAC ACA ACA CAA TGG AGT GCT TCT TCC AAA AGC TCT GGA ATC GGC m TCT ACC CGT CTT ACC AAC AGA AAT
The entire nucleotide sequence of the hen nov cDNA clone is formed by 1975 bp and includes at least 5 exons. This sequence includes an open reading frame of 1.0 kb, encoding a potential protein of 32300
Da, going from nucleotide 24 to nucleotide 1076. This open reading frame is followed by 899 bp of 3 'non-coding sequences which contain two signals of potential AATAAA polyadenylation motif signals at position 1914 and 1932. This hen nov gene is overexpressed in avian nephroblastomas induced by MAV studied by the inventors.
Les expériences d'hybridation réalisées dans des conditions stringentes définies ci-dessus montrent que, de manière inattendue, des séquences homologues du gène nov de poule existent dans le génome humain. Hybridization experiments carried out under stringent conditions defined above show that, unexpectedly, homologous sequences of the hen nov gene exist in the human genome.
Des séquences de l'invention sont plus particulièrement caractérisées en ce qu'elles comprennent ou sont formées par un enchaînement de nucléotides capable de s'hybrider, dans les conditions stringentes évoquées cidessus, avec au moins une partie du deuxième exon du gène nov de poule qui comprend la séquence nucléotidique (III) suivante
CTCCTGCTCCTCCTCCGGCCGTGCGAGGTGAGCGGGCGGGAGGCGGCG-TGCCCCCGG
70 80 90 100 110 120
CCCTGCGGCGGGC-GCTGCCCCGCGGAGCCGCCGCGCTGCGCCCCGGGAGTGCCCGCC
130 140 150 160 170 180 GTGCTGGACGGCTGCGGCTGCTGCCTGGTGTGCGCCCGGCAGCGCGGCGAGAGCTGC
190 200 210 220 230
TCCCCTCTGCTGCCCTGCGACGAGAGCGGCGGCCTCTACTGCGACCGCGGCCCCGAGGA 240 250 260 270 280 290
CGGCGGCGGCGCCGGCATCTGCATGG
300 310 320
Les séquences de nucléotides capables de s'hybrider avec l'enchaînement (III) ci-dessus sont également caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une partie d'un fragment PstI d'environ 600 pb tel qu'obtenu à partir d'un sous-clone plasmidique dérivé d'un clone recombinant isolé d'une banque d'ADN de placenta humain. La carte de restriction enzymatique du clone recombinant ainsi que celle du sous-clone plasmidique dérivé renfermant la séquence nucléotidique en question sont représentées sur la figure 2A.Sequences of the invention are more particularly characterized in that they comprise or are formed by a sequence of nucleotides capable of hybridizing, under the stringent conditions mentioned above, with at least part of the second exon of the hen nov gene which includes the following nucleotide sequence (III)
CTCCTGCTCCTCCTCCGGCCGTGCGAGGTGAGCGGGCGGGAGGCGGCG-TGCCCCCGG
70 80 90 100 110 120
CCCTGCGGCGGGC-GCTGCCCCGCGGAGCCGCCGCGCTGCGCCCCGGGAGTGCCCGCC
130 140 150 160 170 180 GTGCTGGACGGCTGCGGCTGCTGCCTGGTGTGCGCCCGGCAGCGCGGCGAGAGCTGC
190 200 210 220 230
TCCCCTCTGCTGCCCTGCGACGAGAGCGGCGGCCTCTACTGCGACCGCGGCCCCGAGGA 240 250 260 270 280 290
CGGCGGCGGCGCCGGCATCTGCATGG
300 310 320
The nucleotide sequences capable of hybridizing with the above sequence (III) are also characterized in that they comprise at least part of a PstI fragment of approximately 600 bp as obtained from a plasmid subclone derived from a recombinant clone isolated from a human placenta DNA library. The enzymatic restriction map of the recombinant clone as well as that of the derived plasmid subclone containing the nucleotide sequence in question are represented in FIG. 2A.
De telles séquences sont en outre caractérisées en ce qu'elles comportent l'information génétique pour coder pour une protéine renfermant une séquence ayant une homologie d'au moins 62 g avec le fragment de protéine correspondant au deuxième exon du gène noyez de poule, ce
fragment présentant la séquence d'acides aminés (IV)
suivante
R V P G A R Y K T C A G R D R
47 62 77
Q A P D Q G E G E Q C Q S T A
K K V S F G K S E R G K P E H 137 152 167 A E C A E H E L L S R E S S A 182 197 212
F A * P S C F S I S W D S K W 227 242 257
H T L K M P P K L L C P P W W 272 287 302
P P F G H R A H C V F C P S * 317 332 347 V V S P C L A C L Q V A A T Q 362 377 392
R C P P Q C P G R C P A T P P 407 422 437
T C A P G V R A V L D G C S C 452 467 482
C L V C A R Q R G E S C S D L 497 512 527
E P C D E S S G L Y C D R S A 542 557 572
D P S N Q T G I C T G N P A P 587 S A V * P L L L Q
Les lettres indiquées dans ces enchaînements présentent les significations conventionnelles figurant dans "A practical guide to molecular cloning, second edition, B. Perbal, John Wiley and Sons, New York, 1988".Such sequences are further characterized in that they include the genetic information to code for a protein containing a sequence having homology of at least 62 g with the protein fragment corresponding to the second exon of the hen's walnut gene, this
fragment with the amino acid sequence (IV)
next
RVPGARYKTCAGRDR
47 62 77
QAPDQGEGEQCQSTA
KKVSFGKSERGKPEH 137 152 167 AECAEHELLSRESSA 182 197 212
FA * PSCFSISWDSKW 227 242 257
HTLKMPPKLLCPPWW 272 287 302
PPFGHRAHCVFCPS * 317 332 347 VVSPCLACLQVAATQ 362 377 392
RCPPQCPGRCPATPP 407 422 437
TCAPGVRAVLDGCSC 452 467 482
CLVCARQRGESCSDL 497 512 527
EPCDESSGLYCDRSA 542 557 572
DPSNQTGICTGNPAP 587 SAV * PLLLQ
The letters indicated in these sequences present the conventional meanings appearing in "A practical guide to molecular cloning, second edition, B. Perbal, John Wiley and Sons, New York, 1988".
L'invention vise en particulier les séquences nucléotidiques comportant l'information génétique pour coder pour une protéine ayant une homologie de plus de 70 % avec le fragment de protéine correspondant au deuxième exon du gène nov de poule répondant à la séquence (V) suivante
PCEVSGREAACPRPCGGRCPAEPPRCAPGVPAVLDGCSCCLVCARQRGES CSPLLPCD
30 40 50 60 70
ESGGLYCDRGPEDGGGAGIC 80 90 100 et plus spécialement pour une séquence d'acides aminés ayant une homologie d'environ 65 % avec la séquence d'acides aminés déduite du fragment nucléotidique du deuxième exon du gène nov de poule, cette séquence présentant l'enchaînement (VI) suivant
120 130 140 150 160 170
ACLQVAATQRCPPQCPGRCPATPPTCAPGVRAVLDGCSCCLVCARQRGESCSDLEPCD
180 190
ESSGLYCDRSADPSNQTGIC
On notera la présence dans ces séquences d'acides aminés d'une séquence consensus de liaison aux facteurs de croissance du type insuline (IGF), cette séquence apparaissant donc conservée chez l'homme.The invention relates in particular to the nucleotide sequences comprising the genetic information to code for a protein having a homology of more than 70% with the protein fragment corresponding to the second exon of the hen nov gene corresponding to the following sequence (V)
PCEVSGREAACPRPCGGRCPAEPPRCAPGVPAVLDGCSCCLVCARQRGES CSPLLPCD
30 40 50 60 70
ESGGLYCDRGPEDGGGAGIC 80 90 100 and more specifically for an amino acid sequence having a homology of approximately 65% with the amino acid sequence deduced from the nucleotide fragment of the second exon of the hen nov gene, this sequence having the sequence (VI ) following
120 130 140 150 160 170
ACLQVAATQRCPPQCPGRCPATPPTCAPGVRAVLDGCSCCLVCARQRGESCSDLEPCD
180 190
ESSGLYCDRSADPSNQTGIC
Note the presence in these amino acid sequences of a consensus sequence for binding to insulin-type growth factors (IGF), this sequence therefore appearing to be conserved in humans.
Ces séquences comportent plus particulièrement au moins une partie de l'enchaînement nucléotidique (VII) suivant
10 20 30 40 50 60
GCGCGTCCCA GGAGCGCGCT ATAAAACCTG TGCTGGGCGT GATCGGCAAG CACCGGACCA
70 80 90 100 110 120
GGGGGAAGGC GAGCAGTGCC AATCTACAGC GAAGAAAGTC TCGTTTGGTA AAAGCGAGAG
130 140 150 160 170 180
GGGAAAGCCT GAGCATGCAG AGTGTGCAGA GCACGAGCTT TTGTCTCGCG AAAGCAGTGC
190 200 210 220 230 240
CTTTGCCTGA CCTTCCTGCT TCTCCATCTC CTGGGACAGT AAGTGGCACA CCCTTAAGAT
250 260 270 280 290 300
GCCCCCAAAG TTACTTTGCC CGCCTTGGTG GCCCCCATTT GGTCACCGGG CTCACTGCGT
310 320 330 340 350 360
CTTCTGTCCC AGCTGAGTGG TTTCTCCTTG TCTCGCCTGC CTTCAGGTCG CTGCGACTCA
370 380 390 400 410 420
GCGCTGCCCT CCCCAGTGCC CGGGCCGGTG CCCTGCGACG CCGCCGACCT GCGCCCCCGG
430 440 450 460 470 480
GGTGCGCGCG GTGCTGGACG GCTGCTCATG CTGTCTGGTG TGTGCCCGCC AGCGTGGCGA
490 500 510 520 530 540 GAGCTGCTCA GATCTGGAGC CATGCGACGA GAGCAGTGGC CTCTACTGTG ATCGCAGCGC
550 560 570 580 590 600
GGACCCCAGC AACCAGACTG GCATCTGCAC GGGTAATCCT GCTCCCTCTG CTGTTTGACC
610
TCTTCTCCTG CAG plus spécialement de l'enchaînement (VIII) suivant
330 340 350 360 370 380
CTCCTTGTC-TCG-CCTGCCTT-C-AGGTC-GCTG-CG--ACTCAGCGCTGCCCTCCCCAGTGCC
390 400 410 420 430 440 45
CGGGCCGGTGCCCTGCGACGCCGCCGACCTGCGCCCCCGGGGTGCGCGCGGTGCTGGACGGCTGCI
460 470 480 490 500 510
CATGCTGTCTGGTGTGTGCCCGCCAGCGTGGCGAGAGCTGCTCAGATCTGGAGCCATGCGACGAG
520 530 540 550 560 570 GCAGTGGCCTCTACTGTGATCGCAGCGCGGACCCCAGCAACCAGACTGGCATCTGCACGG
L'enchaînement (VIII) comporte 249 nucléotides avec 73 % d'homologie environ avec l'exon 2 du gène nov de poule.These sequences more particularly comprise at least part of the following nucleotide sequence (VII)
10 20 30 40 50 60
GCGCGTCCCA GGAGCGCGCT ATAAAACCTG TGCTGGGCGT GATCGGCAAG CACCGGACCA
70 80 90 100 110 120
GGGGGAAGGC GAGCAGTGCC AATCTACAGC GAAGAAAGTC TCGTTTGGTA AAAGCGAGAG
130 140 150 160 170 180
GGGAAAGCCT GAGCATGCAG AGTGTGCAGA GCACGAGCTT TTGTCTCGCG AAAGCAGTGC
190 200 210 220 230 240
CTTTGCCTGA CCTTCCTGCT TCTCCATCTC CTGGGACAGT AAGTGGCACA CCCTTAAGAT
250 260 270 280 290 300
GCCCCCAAAG TTACTTTGCC CGCCTTGGTG GCCCCCATTT GGTCACCGGG CTCACTGCGT
310 320 330 340 350 360
CTTCTGTCCC AGCTGAGTGG TTTCTCCTTG TCTCGCCTGC CTTCAGGTCG CTGCGACTCA
370 380 390 400 410 420
GCGCTGCCCT CCCCAGTGCC CGGGCCGGTG CCCTGCGACG CCGCCGACCT GCGCCCCCGG
430 440 450 460 470 480
GGTGCGCGCG GTGCTGGACG GCTGCTCATG CTGTCTGGTG TGTGCCCGCC AGCGTGGCGA
490 500 510 520 530 540 GAGCTGCTCA GATCTGGAGC CATGCGACGA GAGCAGTGGC CTCTACTGTG ATCGCAGCGC
550 560 570 580 590 600
GGACCCCAGC AACCAGACTG GCATCTGCAC GGGTAATCCT GCTCCCTCTG CTGTTTGACC
610
TCTTCTCCTG CAG more especially of the following sequence (VIII)
330 340 350 360 370 380
CTCCTTGTC-TCG-CCTGCCTT-C-AGGTC-GCTG-CG - ACTCAGCGCTGCCCTCCCCAGTGCC
390 400 410 420 430 440 45
CGGGCCGGTGCCCTGCGACGCCGCCGACCTGCGCCCCCGGGGTGCGCGCGGTGCTGGACGGCTGCI
460 470 480 490 500 510
CATGCTGTCTGGTGTGTGCCCGCCAGCGTGGCGAGAGCTGCTCAGATCTGGAGCCATGCGACGAG
520 530 540 550 560 570 GCAGTGGCCTCTACTGTGATCGCAGCGCGGACCCCAGCAACCAGACTGGCATCTGCACGG
The sequence (VIII) comprises 249 nucleotides with approximately 73% homology with exon 2 of the hen nov gene.
D'autres séquences nucléotidiques de l'invention sont caractérisées en ce qu'elles sont formées par ou qu'elles comprennent un enchaînement de nucléotides capable de s'hybrider, dans les conditions stringentes évoquées ci
dessus, avec au moins une partie des troisième et quatrième
exons du gène nov de poule qui comprennent la séquence
nucléotidique (IX) suivante
TG CTC CAA GGG GAC AAC TGC CTC TTC CAT GGG ATC ATT TAC CCC 365
AAC GGC GAG ACC TTC CAG CCC AGC TGC AAG TAC CAG TGC ACC TCC CCC CAC GCC CAG ATC GGC TGC CTG CCC CCC TGG AAC CTG GGC CTC 455
CTC CTC CCC GGC CCC GAC TGC CCC TTC CCC CCG AAC ATC GAA CTC CCC CGA GAG TGG TGC GAG AAG TGG GTG TGC CAC CCC AGG CAT CAA 545
GTG CTC CTC GGA CCC TTT TTT GCT ATC GCT CCA TAC AGA CAG GAC GCC ACA CTT GGC ATA GAC CTG TCT CAT TCA ACT CCC MT TGT ATT GM 635
CAG ACA ACA GM TGC AGT GCT TCT TCC MA ACC TCT GGA ATG CGC m TCT ACC CGT CTT ACC MC AGA MT CAC CAC TCT GAG ATC CTG 725
AAG CAG ACA CGA CTT TCC ATC ATG AGA CCT TGT GAA MC GAA CAC CCA TCT GAT MC
Ces séquences sont également caractérisées en ce
qu'elles comprennent au moins une partie d'un fragment
PstI d'environ 700 pb tel qu'obtenu à partir d'un sous
clone plasmidique dérivé d'un clone recombinant isolé d'une
banque d'ADN de placenta humain La carte de restriction
enzymatique du clone recombinant ainsi que du sous-clone
plasmidique dérivé renfermant la séquence nucléotidique en
question est représentée sur la figure 2B.Other nucleotide sequences of the invention are characterized in that they are formed by or that they comprise a sequence of nucleotides capable of hybridizing, under the stringent conditions mentioned above.
on it, with at least some of the third and fourth
exons of the hen nov gene that include the sequence
nucleotide (IX) next
TG CTC CAA GGG GAC AAC TGC CTC TTC CAT GGG ATC ATT TAC CCC 365
AAC GGC GAG ACC TTC CAG CCC AGC TGC AAG TAC CAG TGC ACC TCC CCC CAC GCC CAG ATC GGC TGC CTG CCC CCC TGG AAC CTG GGC CTC 455
CTC CTC CCC GGC CCC GAC TGC CCC TTC CCC CCG AAC ATC GAA CTC CCC CGA GAG TGG TGC GAG AAG TGG GTG TGC CAC CCC AGG CAT CAA 545
GTG CTC CTC GGA CCC TTT TTT GCT ATC GCT CCA TAC AGA CAG GAC GCC ACA CTT GGC ATA GAC CTG TCT CAT TCA ACT CCC MT TGT ATT GM 635
CAG ACA ACA GM TGC AGT GCT TCT TCC MA ACC TCT GGA ATG CGC m TCT ACC CGT CTT ACC MC AGA MT CAC CAC TCT GAG ATC CTG 725
AAG CAG ACA CGA CTT TCC ATC ATG AGA CCT TGT GAA MC GAA CAC CCA TCT GAT MC
These sequences are also characterized in that
that they include at least part of a fragment
PstI of around 700 bp as obtained from a sub
plasmid clone derived from a recombinant clone isolated from a
human placenta DNA bank restriction map
of the recombinant clone and of the subclone
derived plasmid containing the nucleotide sequence in
question is shown in Figure 2B.
De telles séquences sont encore caractérisées en
ce qu'elles codent pour un fragment de protéine répondant à
l'enchaînement (X) suivant d'acides aminés. Such sequences are further characterized in
what they code for a protein fragment responding to
the following sequence (X) of amino acids.
Q I P T R I P D A L D V R V P 48 63 78
Q C L T S A S P T P L F P S S 93 108 123
S P A K D G A P C I F G G T V 138 153 168
Y R S G E S F Q S S C K Y Q C 183 198 213
T C L D G A V G C M P L C S M 228 243 258
D V R L P S P D C P F P R R V 273 288 303
K L P G K C C E E W V C D E P 318 333 346
K D Q T V L G P A S R V S R V 363 378 393
F L * V R V V I L S Q G G S P 408 423 438
N C A D R T G E I P Y P G V D 453 468 483
H G V C V L C S R S L P T G R 498 513 528 H V W P R P N Y D * S Q L p G 543 558 573 p D T E W S A C S K T C G M G 588 603 Y S T R V T N D N A
Des séquences du type de celles du fragment PstI de 700 pb ci-dessus sont plus particulièrement caractérisées en ce qu'elles sont formées par ou qu'elles comprennent un enchaînement de nucléotides capable de s'hybrider dans les conditions stringentes définies cidessous, avec au moins une partie du troisième exon du gène nov de poule qui comprend la séquence (XI) suivante CTGCGTGTTCGATGGGATGATTTACCGCAACGGGGAGACGTTCCAGCCCAGCTGCAAGTACCAGTGCACC
350 360 370 380 390 400 190 200 210 220 230 240 250
TGCCGGGACGGGCAGATCGGGTGCCTGCCCCGCTGCAACCTGGGCCTGCTGCTCCCCGGCCCCGACTGCC
420 430 440 450 460 470
CCTTCCCGCGGAAGATCGAAG-TCCCCGGAGAGTGCTGCGAGAAGTGGGTGTGCGAC
490 500 510 520 530
D'autres séquences de nucléotides de l'invention
comportent l'information génétique pour coder pour une
protéine ayant une homologie d'au moins 60 g environ avec
le fragment de protéine potentiel du troisième exon du gène
nov de poulé répondant à la séquence (XII) suivante
EGDNCVFDGMIYRNGETFQPSCKYQCTCRDGQIGCLPRCNLGLLLPGPDCPFPRKIEVPGECCEKW
110 120 130 140 150 160
VCD-PR 170
Il s'agit en particulier de séquences comportant
l'information génétique pour coder pour une protéine ayant
la séquence(XIII > d'acides aminés suivants
40 50 60 70 80 90 100
DGAPCIFGGTVYRSGESFQSSCKYQCTCLDGAVGCMPLCSMDVRLPSPDCPFPRRVKLPGKCCEEWVCDE
PR
Ces séquences comportent plus particulièrement au
moins une partie de l'enchaînement nucléotidique (XIV)
suivant: 1
CC
3 18 33
CAG ATC CCA ACT CGC ATC CCT GAC GCT CTG GAT GTG AGA GTG CCC
48 63 78
CAA TGC CTG ACC TCT GCA TCC CCC ACC CCT CTC TTC.CCT TCC TCT
93 108 123
TCT CCA GCC AAA GAT GGT GCT CCC TGC ATC TTC GGT GGT ACG GTG
138 153 168
TAC CGC AGC GGA GAG TCC TTC CAG AGC AGC TGC AAG TAC CAC TGC
183 198 213
ACG TGC CTG GAC GGG GCG GTG GGC TGC ATG CCC CTG T.GC AGC ATG
228 243 258
GAC GTT CGT CTG CCC AGC CCT GAC TGC CCC TTC CCG AGG AGG GTC
273 288 303
AAG CTG CCC GGG AAA TGC TGC GAG GAG TGG GTG TGT GAC GAG CCC
318 333 348
AAG GAC CAA ACC GTC CTT GGG CCT GCC TCG CGG GTG AGT CGA GTC
363 378 393
TTC CTC TAA GTC AGG GTC GTG ATT CTC TCC CAG GGA GGG AGT CCT
408 423 438
AAC TGT GCC GAC CGA ACG GGG GAA ATA CCT TAT CCA GGC GTT TTA
453 468 483
CAT GGT GTT TGT GTG CTC TGC TCT CGC AGC TTA CCG ACT GGA AGA
498 513 528
CAC GTT TGG CCC AGA CCC AAC TAT GAT TAG AGC CAA CTG CCT GGT
543 558 573
CCA GAC ACA GAG TGG AGC GCC TGT TCC AAG ACC TGT GGG ATG GGC
588 603
ATC TCC ACC CGG GTT ACC AAT GAC AAC GCC TC
Ces séquences comprennent plus particulièrement
l'enchaînement nucléotidique (XV) suivant :
190 200 210 220 230 240 250
TGCCTGGTCCAGACA CAGAGTGGAGCGCCTGTTCCAAGACCTGTGGGATGGGCATCTCCACCCGGGT
260
CCAA
D'autres séquences du type de celles du fragment
PstI de 700 pb sont encore caractérisées en ce qu'elles sont formees par ou qu'elles comprennent un enchaînement de nucléotides capable de s'hybrider dans les conditions stringentes définies ci-dessus avec au moins une partie du quatrième exon du gène nov de poule, qui comprend 1 'enchaînement (XVI) suivant GCTTTGCTATGGCTGCATACAGACAGGAGGCCACACTTGGGATAGACGTGTCT--GATTCAAGTGCCAAT
570 580 590 600 610- 620
TGTATTGAACAGACAACAGAATGGAGTGCTTGTTCCAAAAGCTGTGGAATGGGCTTTTCTACCCGTGTTA 630 640 650 660 670 680 690
CCAA
De telles séquences sont encore caractérisées en ce qu'elles sont capables de coder pour une protéine ayant une homologie d'au moins 86 % avec le fragment de proteine potentiel du quatrième exon du gène nov de poule répondant à l'enchaînement (XVII) suivant
TEWSACSKSCGMGFSTRVTNRN
210 220
Il s'agit en particulier de séquences comportant l'information génétique pour coder pour une proteine ayant la séquence (XVIII) suivante en acides aminés.QIPTRIPDALDVRVP 48 63 78
QCLTSASPTPLFPSS 93 108 123
SPAKDGAPCIFGGTV 138 153 168
YRSGESFQSSCKYQC 183 198 213
TCLDGAVGCMPLCSM 228 243 258
DVRLPSPDCPFPRRV 273 288 303
KLPGKCCEEWVCDEP 318 333 346
KDQTVLGPASRVSRV 363 378 393
FL * VRVVILSQGGSP 408 423 438
NCADRTGEIPYPGVD 453 468 483
HGVCVLCSRSLPTGR 498 513 528 HVWPRPNYD * SQL p G 543 558 573 p DTEWSACSKTCGMG 588 603 YSTRVTNDNA
Sequences of the type of those of the 700 bp PstI fragment above are more particularly characterized in that they are formed by or that they comprise a sequence of nucleotides capable of hybridizing under the stringent conditions defined below, with at least minus part of the third exon of the hen nov gene which comprises the following sequence (XI) CTGCGTGTTCGATGGGATGATTTACCGCAACGGGGAGACGTTCCAGCCCAGCTGCAAGTACCAGTGCACC
350 360 370 380 390 400 190 200 210 220 230 240 250
TGCCGGGACGGGCAGATCGGGTGCCTGCCCCGCTGCAACCTGGGCCTGCTGCTCCCCGGCCCCGACTGCC
420 430 440 450 460 470
CCTTCCCGCGGAAGATCGAAG-TCCCCGGAGAGTGCTGCGAGAAGTGGGTGTGCGAC
490 500 510 520 530
Other nucleotide sequences of the invention
carry genetic information to code for a
protein with a homology of at least about 60 g with
the potential protein fragment of the third exon of the gene
Nov of poulé corresponding to the following sequence (XII)
EGDNCVFDGMIYRNGETFQPSCKYQCTCRDGQIGCLPRCNLGLLLPGPDCPFPRKIEVPGECCEKW
110 120 130 140 150 160
VCD-PR 170
These are in particular sequences comprising
genetic information to code for a protein having
the sequence (XIII> of following amino acids
40 50 60 70 80 90 100
DGAPCIFGGTVYRSGESFQSSCKYQCTCLDGAVGCMPLCSMDVRLPSPDCPFPRRVKLPGKCCEEWVCDE
PR
These sequences more particularly include
minus part of the nucleotide sequence (XIV)
next: 1
CC
3 18 33
CAG ATC CCA ACT CGC ATC CCT GAC GCT CTG GAT GTG AGA GTG CCC
48 63 78
CAA TGC CTG ACC TCT GCA TCC CCC ACC CCT CTC TTC.CCT TCC TCT
93 108 123
TCT CCA GCC AAA GAT GGT GCT CCC TGC ATC TTC GGT GGT ACG GTG
138 153 168
TAC CGC AGC GGA GAG TCC TTC CAG AGC AGC TGC AAG TAC CAC TGC
183 198 213
ACG TGC CTG GAC GGG GCG GTG GGC TGC ATG CCC CTG T.GC AGC ATG
228 243 258
GAC GTT CGT CTG CCC AGC CCT GAC TGC CCC TTC CCG AGG AGG GTC
273 288 303
AAG CTG CCC GGG AAA TGC TGC GAG GAG TGG GTG TGT GAC GAG CCC
318 333 348
AAG GAC CAA ACC GTC CTT GGG CCT GCC TCG CGG GTG AGT CGA GTC
363 378 393
TTC CTC TAA GTC AGG GTC GTG ATT CTC TCC CAG GGA GGG AGT CCT
408 423 438
AAC TGT GCC GAC CGA ACG GGG GAA ATA CCT TAT CCA GGC GTT TTA
453 468 483
CAT GGT GTT TGT GTG CTC TGC TCT CGC AGC TTA CCG ACT GGA AGA
498 513 528
CAC GTT TGG CCC AGA CCC AAC TAT GAT TAG AGC CAA CTG CCT GGT
543 558 573
CCA GAC ACA GAG TGG AGC GCC TGT TCC AAG ACC TGT GGG ATG GGC
588,603
ATC TCC ACC CGG GTT ACC AAT GAC AAC GCC TC
These sequences more particularly include
the following nucleotide sequence (XV):
190 200 210 220 230 240 250
TGCCTGGTCCAGACA CAGAGTGGAGCGCCTGTTCCAAGACCTGTGGGATGGGCATCTCCACCCGGGT
260
CCAA
Other sequences of the type of those of the fragment
PstI of 700 bp are further characterized in that they are formed by or that they comprise a sequence of nucleotides capable of hybridizing under the stringent conditions defined above with at least part of the fourth exon of the hen nov gene , which includes the sequence (XVI) according to GCTTTGCTATGGCTGCATACAGACAGGAGGCCACACTTGGGATAGACGTGTCT - GATTCAAGTGCCAAT
570 580 590 600 610- 620
TGTATTGAACAGACAACAGAATGGAGTGCTTGTTCCAAAAGCTGTGGAATGGGCTTTTCTACCCGTGTTA 630 640 650 660 670 680 690
CCAA
Such sequences are further characterized in that they are capable of coding for a protein having at least 86% homology with the potential protein fragment of the fourth exon of the hen nov gene responding to the following sequence (XVII)
TEWSACSKSCGMGFSTRVTNRN
210 220
These are in particular sequences comprising the genetic information for coding for a protein having the following sequence (XVIII) in amino acids.
70 80
TEWSACSKTCGMGISTRVTNDN
Ces séquences sont formées par ou comprennent plus particulièrement l'enchaînement nucléotidique (XIX) suivant
130 140 150 160 170 180
GCTCTGCTCTCGCAGCTTACCGACTGGAAGACACGTTTGGCCCAGACCCAACTATGATT-A-GAGCCAAC
190 200 210 220 230 240 250
TGCCTGGTCCAGACA-CAGAGTGGAGCGCCTGTTCCAAGACCTGTGGGATGGGCATCTCCACCCGGGTTA
260
CCAA
Selon un autre aspect, l'invention vise une séquence recombinante comprenant l'une des séquences définies ci-dessus, le cas échéant associée à un promoteur capable de contrôler la transcription de la séquence et une séquence d'ADN codant pour les signaux de terminaison de la transcription.70 80
TEWSACSKTCGMGISTRVTNDN
These sequences are formed by or more particularly comprise the following nucleotide sequence (XIX)
130 140 150 160 170 180
GCTCTGCTCTCGCAGCTTACCGACTGGAAGACACGTTTGGCCCAGACCCAACTATGATT-A-GAGCCAAC
190 200 210 220 230 240 250
TGCCTGGTCCAGACA-CAGAGTGGAGCGCCTGTTCCAAGACCTGTGGGATGGGCATCTCCACCCGGGTTA
260
CCAA
According to another aspect, the invention relates to a recombinant sequence comprising one of the sequences defined above, optionally associated with a promoter capable of controlling the transcription of the sequence and a DNA sequence coding for the termination signals of the transcript.
Il est entendu que les bases des séquences de nucléotides considérées peuvent être dans un ordre différent de celui trouvé dans les gènes et/ou que ces bases peuvent être, le cas échéant, substituées. Les séquences correspondantes entrent dans le cadre de l'invention, dès lors qu'un fragment de ces séquences utilisé comme sonde donne une réponse caracteristique et non équivoque quant à la capacité de reconnaître la présence de gènes codant pour des protéines telles que définies ci-dessus exprimées dans les cellules tumorales. It is understood that the bases of the nucleotide sequences under consideration may be in a different order from that found in the genes and / or that these bases may, where appropriate, be substituted. The corresponding sequences fall within the scope of the invention, when a fragment of these sequences used as a probe gives a characteristic and unequivocal response with regard to the ability to recognize the presence of genes coding for proteins as defined above. above expressed in tumor cells.
L'invention vise également en tant que nouveaux produits les ARN correspondant aux différentes sequences définies ci-dessus et les séquences complémentaires des différents enchaînements nucleotidiques définis. The invention also targets, as new products, the RNAs corresponding to the different sequences defined above and the complementary sequences of the different defined nucleotide sequences.
L'invention se rapporte également aux vecteurs recombinants de clonage et d'expression capables de transformer ' une cellule hôte appropriée, comportant au moins une partie d'une séquence de nucléotides telle que définie ci-dessus sous le contrôle d'éléments de régulation permettant son expression. The invention also relates to recombinant cloning and expression vectors capable of transforming an appropriate host cell, comprising at least part of a nucleotide sequence as defined above under the control of regulatory elements allowing his expression.
Les souches de microorganismes transformées ou transfectées entrent egalement dans le cadre de l'invention. Ces souches comportent l'une des sequences de nucléotides définies ci-dessus ou encore un vecteur recombinant tel que défini précédemment. The strains of transformed or transfected microorganisms also fall within the scope of the invention. These strains comprise one of the nucleotide sequences defined above or also a recombinant vector as defined above.
Elle vise également les séquences d'acides aminés correspondant, selon le code génétique universel, aux séquences de nucléotides définies plus haut, et les protéines exprimées par les gènes comportant ces séquences. It also targets the amino acid sequences corresponding, according to the universal genetic code, to the nucleotide sequences defined above, and the proteins expressed by the genes comprising these sequences.
Les séquences d'acides aminés homologues à celles codées par l'exon 2, qui contiennent le site de liaison aux facteurs de croissance IGF présentent - un intérêt particulier, étant donné que le gène IGFII, qui se trouve chez l'homme sur le chromosome llp15, est surexprimé dans certaines tumeurs de Wilms et pourrait donc être impliqué dans cette pathologie. Amino acid sequences homologous to those encoded by exon 2, which contain the IGF growth factor binding site are of particular interest, since the IGFII gene, which is found in humans on the chromosome llp15, is overexpressed in certain Wilms tumors and could therefore be involved in this pathology.
Dès lors que le motif consensus des protéines se liant à 1'IGF joue une rôle important dans le développement des néphroblastomes en conjonction avec la dérégulation de l'expression d'IGFII, on mesure l'intérêt de la détection d'une expression anormale des protéines de l'invention qui renferment un tel motif. Since the consensus motif of proteins binding to IGF plays an important role in the development of nephroblastomas in conjunction with the deregulation of IGFII expression, the value of detecting an abnormal expression of proteins of the invention which contain such a motif.
Les protéines de l'invention sont également caractérisées en ce qu'elles sont telles qu'obtenues par transformation de cellules hôtes au moyen d'un vecteur recombinant comme défini ci-dessus, mise en culture, dans un milieu approprié, des cellules hôtes transformées ou transfectées et récupération de la protéine à partir de ces cellules ou directement à partir du milieu de culture. The proteins of the invention are also characterized in that they are as obtained by transformation of host cells using a recombinant vector as defined above, culturing, in an appropriate medium, of the transformed host cells or transfected and recovery of the protein from these cells or directly from the culture medium.
La production de ces protéines par un tel procédé fait également partie de l'invention. The production of these proteins by such a process is also part of the invention.
Les protéines de l'invention et leurs fragments, qui peuvent être également obtenus par synthèse chimique, présentent avantageusement un degré de pureté élevé et sont utilisés pour former, selon les techniques classiques, des anticorps polyclonaux. The proteins of the invention and their fragments, which can also be obtained by chemical synthesis, advantageously have a high degree of purity and are used to form, according to conventional techniques, polyclonal antibodies.
De tels anticorps polyclonaux, ainsi que les anticorps monoclonaux capables de reconnaître spécifiquement un épitope des protéines ci-dessus, ou d'un fragment de ces protéines, sont également visés par l'invention. Such polyclonal antibodies, as well as monoclonal antibodies capable of specifically recognizing an epitope of the above proteins, or of a fragment of these proteins, are also targeted by the invention.
L'invention vise en outre les applications biologiques des séquences de nucléotides, des protéines correspondantes et des anticorps monoclonaux ou polyclonaux. The invention further relates to the biological applications of nucleotide sequences, corresponding proteins and monoclonal or polyclonal antibodies.
Ces applications comprennent l'élaboration, à partir de fragments intragéniques purifiés, ou d'ARN correspondants, de sondes moléculaires pour rechercher la présence éventuelle de sequences de nucléotides apparentées au gène non dans divers types cellulaires. These applications include the development, from purified intragenic fragments, or from corresponding RNA, of molecular probes to search for the possible presence of nucleotide sequences related to the non gene in various cell types.
L'élaboration de ces sondes comprend, notamment, la dénaturation des séquences double-brin pour obtenir une séquence monobrin. The development of these probes includes, in particular, the denaturation of the double-stranded sequences to obtain a single-stranded sequence.
Les essais effectués pour détecter la présence de séquences complémentaires dans diverses tumeurs et tissus humaines ont mis en évidence la grande spécificité de ces fragments intragéniques. The tests carried out to detect the presence of complementary sequences in various tumors and human tissues have demonstrated the great specificity of these intragenic fragments.
L'utilisation de ces sondes a ainsi permis de montrer que le gène renfermant les séquences nucléotidiques definies ci-dessus est exprimé dans plusieurs s types de cellules humaines, y compris certaines tumeurs du rein. The use of these probes has thus made it possible to show that the gene containing the nucleotide sequences defined above is expressed in several types of human cells, including certain kidney tumors.
L'invention vise donc des sondes de détection caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une partie d'une séquence de nucléotides définie ci-dessus. The invention therefore relates to detection probes characterized in that they comprise at least part of a nucleotide sequence defined above.
Toute sonde ne se distinguant de la précédente, au niveau de sa séquence de nucléotides, que par des substitutions ou alterations de nucléotides n'entraînant pas de modification de ses propriétés d'hybridation avec le gène humain apparenté au gène nov de poule comme défini plus haut entre dans le cadre de l'invention. Any probe which differs from the previous one, in terms of its nucleotide sequence, only in terms of nucleotide substitutions or alterations which do not modify its hybridization properties with the human gene related to the hen nov gene as defined more top is within the scope of the invention.
Le fragment d'ADN utilisé comme sonde comporte un nombre de nucléotides suffisant pour obtenir la spécificité requise et la formation d'un hybride stable. The DNA fragment used as probe contains a sufficient number of nucleotides to obtain the required specificity and the formation of a stable hybrid.
Il est possible d'utiliser des fragments atteignant plusieurs kb, des résultats de haute spécificité étant cependant également obtenus avec des fragments plus cours d'environ 25 à 40 nucléotides. It is possible to use fragments reaching several kb, results of high specificity being however also obtained with shorter fragments of approximately 25 to 40 nucleotides.
Des sondes appropriées pour ce type de détection sont avantageusement marquées par un élément radio-actif ou tout autre groupe permettant sa reconnaissance à l'état hybridé avec la préparation renfermant les nucléotides à étudier. Probes suitable for this type of detection are advantageously labeled with a radioactive element or any other group allowing its recognition in the hybridized state with the preparation containing the nucleotides to be studied.
Selon les techniques classiques, ces sondes sont mises en contact avec l'échantillon biologique à tester ou leurs acides nucléiques, dans des conditions autorisant l'hybridation éventuelle de la séquence de nucléotides de la sonde avec une séquence complementaire, éventuellement contenue dans le produit étudie. According to conventional techniques, these probes are brought into contact with the biological sample to be tested or their nucleic acids, under conditions allowing possible hybridization of the nucleotide sequence of the probe with a complementary sequence, possibly contained in the product studied. .
On peut, par exemple, avoir recours à la méthode d'hybridation sur taches ou à la méthode d'hybridation sur réplique, selon la technique de Southern. Dans la première méthode, selon la technique classique, on depose une quantité aliquote d'ADN denaturé sur des membranes de nitrocellulose. La deuxième méthode comprend la separation électrophorétique en gel d'agarose des fragments d'ADNs engendrés après traitement de l'ADN par des enzymes de restriction, le transfert après dénaturation alcaline sur des membranes appropriées et leur hybridation avec la sonde dans les conditions usuelles. One can, for example, have recourse to the method of hybridization on spots or to the method of hybridization on replica, according to the technique of Southern. In the first method, according to the conventional technique, an aliquot of denatured DNA is deposited on nitrocellulose membranes. The second method comprises the electrophoretic separation in agarose gel of the DNA fragments generated after treatment of the DNA with restriction enzymes, the transfer after alkaline denaturation on appropriate membranes and their hybridization with the probe under the usual conditions.
Ces sondes constituent des marqueurs tumoraux en permettant la détection précoce de l'expression du gène renfermant lesdites séquences nucléotidiques, qui normalement n'est pas ou peu exprimé dans les tissus normaux correspondants. L'invention fournit ainsi des moyens permettant d'évaluer le développement et/ou la différentiation tumorale. These probes constitute tumor markers by allowing the early detection of the expression of the gene containing said nucleotide sequences, which normally is not or little expressed in the corresponding normal tissues. The invention thus provides means for assessing tumor development and / or differentiation.
La détection pour l'identification spécifique des
ADN peut être également réalisée par des techniques d'amplification de l'ADN (PCR) telles que décrites dans les brevets US 4683202 et 4683195 au nom de Cetus Corportation.Detection for specific identification of
DNA can also be produced by DNA amplification techniques (PCR) as described in US patents 4683202 and 4683195 in the name of Cetus Corportation.
Dans ces techniques, on utilise deux amorces d'environ une quinzaine de nucléotides comprises dans l'une des séquences de nucléotides définies ci-dessus et distantes d'environ 200 à 250 nucléotides. L'une des séquences est capable de se lier à une séquence de nucléotides de l'un des brins du fragment d'ADN à amplifier et située au niveau de l'une des extremites de ce fragment, par exemple à l'extrémité 5'. L'autre séquence est capable de se lier à une séquence de nucléotides du deuxième brin du fragment d'ADN à amplifier, et se trouve située au niveau de l'extrémité de ce fragment opposee à celle mentionnée plus haut (à l'extrémité 3', lorsque la première se trouver à l'extrémité 5'). In these techniques, two primers of approximately fifteen nucleotides are used which are included in one of the nucleotide sequences defined above and which are distant from approximately 200 to 250 nucleotides. One of the sequences is capable of binding to a nucleotide sequence of one of the strands of the DNA fragment to be amplified and located at one of the ends of this fragment, for example at the 5 'end . The other sequence is capable of binding to a nucleotide sequence of the second strand of the DNA fragment to be amplified, and is located at the end of this fragment opposite to that mentioned above (at end 3 ', when the first is at the end 5').
L'invention vise également un procédé de détection in vitre de la présence dans un échantillon biologique de séquences complémentaires de celles définies ci-dessus. Ce procédé est caractérisé en ce qu il comprend les étapes suivantes
- la mise en contact de l'échantillon biologique à étudier avec une sonde nucléotidique telle que définie plus haut dans des conditions permettant la production d'un complexe d'hybridation formé entre la sonde et la séquence de nucléotides recherchée,
- la détection du complexe d'hybridation.The invention also relates to a method for in vitro detection of the presence in a biological sample of sequences complementary to those defined above. This process is characterized in that it comprises the following stages
bringing the biological sample to be studied into contact with a nucleotide probe as defined above under conditions allowing the production of a hybridization complex formed between the probe and the desired nucleotide sequence,
- detection of the hybridization complex.
Le cas échéant, on procède à une amplification préalable de la quantité de séquences de nucléotides susceptibles d'être contenues dans l'échantillon, à l'aide d'amorces, telles que décrites ci-dessus, susceptibles respectivement de se lier, d'une part à l'extrémité 5' d'un brin de ladite séquence de nucléotides et d'autre part, à l'extrémité 3' de l'autre brin de ladite séquence de nucléotides. If necessary, a prior amplification of the quantity of nucleotide sequences which may be contained in the sample is carried out, using primers, as described above, which are capable of binding, of on the one hand at the 5 'end of a strand of said nucleotide sequence and on the other hand, at the 3' end of the other strand of said nucleotide sequence.
L'utilisation d'un tel procédé représente une augmentation de sensibilité et un gain de temps considérable par rapport aux techniques classiques qui nécessitent souvent une technologie ne pouvant être mise en oeuvre que dans des services spécialisés. I1 permet de plus une détection rapide et de grande spécificité des ADN et des différentes espèces d'ARNm de transcription. Ce procédé constitue un moyen de détection d'un remaniement chromosomique au niveau des gènes qui codent pour les ARN nov sans avoir recours à des cultures cellulaires. The use of such a method represents an increase in sensitivity and a considerable time savings compared to conventional techniques which often require a technology which can only be implemented in specialized services. It also allows rapid and highly specific detection of DNAs and of the different species of transcription mRNA. This method constitutes a means of detecting a chromosomal rearrangement in the genes which code for RNA nov without resorting to cell cultures.
Pour la mise en oeuvre d'une telle méthode de dépistage invitro, basée sur l'utilisation de sondes nucléotidiques, on a recours avantageusement à des nécessaires ou kits comprenant
- une quantité déterminée d'une sonde nucléotidique selon l'invention,
- un milieu approprié à la formation d'une réaction d'hybridation entre la séquence à détecter et la sonde et, avantageusement,
- des réactifs permettant la détection des complexes d'hybridation formés entre la séquence de nucléotides et la sonde lors de la réaction d'hybridation. For the implementation of such an invitro screening method, based on the use of nucleotide probes, use is advantageously made of kits or kits comprising
- a determined quantity of a nucleotide probe according to the invention,
a medium suitable for the formation of a hybridization reaction between the sequence to be detected and the probe and, advantageously,
- reagents for the detection of hybridization complexes formed between the nucleotide sequence and the probe during the hybridization reaction.
L'invention vise également les applications immunologiques des protéines définies ci-dessus, plus spécialement pour l'élaboration d'antisérums spécifiques ainsi que d'anticorps polyclonaux et monoclonaux. The invention also relates to the immunological applications of the proteins defined above, more specifically for the development of specific antisera as well as polyclonal and monoclonal antibodies.
Les anticorps polyclonaux sont induits selon les techniques classiques par injection des protéines à des animaux, récupération des antisérums puis, à partir de ces derniers, des anticorps, par exemple par chromatographie d'affinité. The polyclonal antibodies are induced according to conventional techniques by injecting proteins into animals, recovering the antisera and then, from the latter, antibodies, for example by affinity chromatography.
Les anticorps monoclonaux sont produits de manière habituelle en fusionnant des cellules de myélomes avec des cellules de rates d'animaux préalablement immunisés à l'aide des protéines de l'invention. Monoclonal antibodies are produced in the usual way by fusing myeloma cells with spleen cells from animals previously immunized with the proteins of the invention.
Ces anticorps revêtent un grand intérêt pour détecter in vitre l'expression du gène renfermant les séquences ci-dessous. These antibodies are of great interest for in vitro detection of the expression of the gene containing the sequences below.
La méthode de dépistage in vitro dans un échantillon biologique de la présence éventuelle des produits d'expression d'un tel gène est caractérisé en ce qu'il comprend
- la mise en contact de l'échantillon biologique à étudier avec un anticorps selon l'invention, dans des conditions permettant la production d'un complexe immunologique formé entre tout ou partie des protéines exprimées par le gène humain apparenté au gène nov de poule et cet anticorps, et
- la détection du complexe immunologique.The method of in vitro screening in a biological sample of the possible presence of the expression products of such a gene is characterized in that it comprises
bringing the biological sample to be studied into contact with an antibody according to the invention, under conditions allowing the production of an immunological complex formed between all or part of the proteins expressed by the human gene related to the hen nov gene and this antibody, and
- detection of the immunological complex.
Dans cette méthode de dépistage invitro, on aura recours avantageusement à des nécessaires ou kits, comprenant
- une quantité déterminée d'un anticorps polyclonal ou monoclonal selon l'invention,
- un milieu approprié à la formation d'une réaction immunologique entre au moins une partie des produits exprimés et l'anticorps et, avantageusement,
- des réactifs permettant la détection des complexes immunologiques formés lors de la réaction immunologique.In this invitro screening method, advantageous use will be made of kits or kits, comprising
- a determined quantity of a polyclonal or monoclonal antibody according to the invention,
a medium suitable for the formation of an immunological reaction between at least part of the products expressed and the antibody and, advantageously,
- reagents for the detection of the immunological complexes formed during the immunological reaction.
La présence dans les protéines de l'invention d'une séquence de liaison aux facteurs de croissance du type insuline (IGF) est avantageusement mise à profit selon l'invention pour le dosage des protéines. A cet effet, on met en contact les protéines de l'échantillon biologique à étudier avec un IGF comportant un groupe marqué, par exemple un groupe radioactif ou sonde froide et on effectue le dosage de la quantité de produit fixé. The presence in the proteins of the invention of a binding sequence to insulin-type growth factors (IGF) is advantageously used according to the invention for the determination of proteins. To this end, the proteins of the biological sample to be studied are brought into contact with an IGF comprising a labeled group, for example a radioactive group or cold probe, and the quantity of fixed product is assayed.
On rapporte ci-après à titre d'exemples non limitatifs le clonage et le séquençage du gène nov de poule, et de séquences de nucléotides répondant aux définitions données plus haut. Dans ces exemples, il est fait référence aux figures 1 à 6,
- la figure 1 représentant la séquence d'ADNc du gène nov de poule et celle de la protéine potentielle codée
- les figures 2 A et 2 B les cartes de restriction de fragments d'ADN de l'invention
- les figures 3 et 4, les séquences nucléotidiques de fragments d'ADN et les fragments de protéines codées, et
- les figures 5 et 6, les séquences de ces fragments homologués avec le gène nov de poule. The cloning and sequencing of the hen nov gene and of nucleotide sequences corresponding to the definitions given above are reported below by way of nonlimiting examples. In these examples, reference is made to FIGS. 1 to 6,
FIG. 1 representing the cDNA sequence of the hen nov gene and that of the potential protein encoded
- Figures 2 A and 2 B the restriction maps of DNA fragments of the invention
FIGS. 3 and 4, the nucleotide sequences of DNA fragments and the fragments of encoded proteins, and
- Figures 5 and 6, the sequences of these fragments approved with the hen nov gene.
Procédés de clonage moléculaire et séquençage rapportés dans les exemples
purification des acides nucléiques : utilisation de dichlorométhane comme décrit dans V. Maloisel et al.,
Met. Mol. Cell. Biol. 1, 245-247, 1990.Molecular cloning and sequencing methods reported in the examples
purification of nucleic acids: use of dichloromethane as described in V. Maloisel et al.,
Met. Mol. Cell. Biol. 1, 245-247, 1990.
Southern et Northern blots, et autres procédés de clonage : effectués selon les protocoles standards publiés par B. Perbal dans "A practical guide to molecular cloning, second edition, B. Perbal John Wiley and Sons, New York, 1988
purification des fragments d'ADN BamHI-HindIII de 7 kb et SacI de 6,6 kb : méthode Geneclean (Bio 101).Southern and Northern blots, and other cloning methods: carried out according to standard protocols published by B. Perbal in "A practical guide to molecular cloning, second edition, B. Perbal John Wiley and Sons, New York, 1988
purification of the DNA fragments BamHI-HindIII of 7 kb and SacI of 6.6 kb: Geneclean method (Bio 101).
Sondes radioactives : préparées par nick translation en présence d'a dCTP 32P. Radioactive probes: prepared by nick translation in the presence of a dCTP 32P.
Séquençage des nucléotides : selon la méthode de terminaison de chaîne au didéoxy en présence d'a dATP 3ES, de T7 polymérase ou de Séquenase (USB). Nucleotide sequencing: according to the dideoxy chain termination method in the presence of a dATP 3ES, T7 polymerase or Sequenase (USB).
Example 1:
Isolement de 1'ANDC du gène nov de poule
25 ng d'ADNc correspondant à de llARN poly A de fibroblastes d'embryons de poule de 13 jours sont ligaturés avec 1 pg de bras lambda gtlO pour préparer une banque d'ADNc de fibroblastes normaux de poule en utilisant le kit d'Amersham.Example 1:
Isolation of ANDC from the hen nov gene
25 ng of cDNA corresponding to the poly A RNA of fibroblasts from 13-day hen embryos are ligated with 1 μg of lambda gt10 arm to prepare a cDNA library of normal hen fibroblasts using the Amersham kit.
Après criblage avec une sonde cellulaire dérivée d'une tumeur, on purifie 7 clones, l'insert le plus long (1,9 kb) est purifié selon la méthode de Geneclean (BIO 101) et sous-cloné au site KpnI de Bluescript KS+ (Stratagène) pour générer le clone pClK. After screening with a cell probe derived from a tumor, 7 clones are purified, the longest insert (1.9 kb) is purified according to the Geneclean method (BIO 101) and subcloned at the KpnI site of Bluescript KS + (Stratagene) to generate the pClK clone.
Séquençage nucléotidique
Le séquençage est réalisé par la méthode de terminaison de chaînes didéoxy-nucléotide en présence d'a 35S dATP et de polymérase T7 (Pharmacia) ou de Séquenase dans les conditions décrites par les fabricants.Nucleotide sequencing
The sequencing is carried out by the method of terminating dideoxy-nucleotide chains in the presence of a 35S dATP and of T7 polymerase (Pharmacia) or of Sequenase under the conditions described by the manufacturers.
Des matrices sont obtenues à partir des clones recombinants M13mpl8 et -M13mp19. Les amorces de séquençage proviennent de Biolabs, New England. Les compressions GC sont résolues en utilisant la déoxy-inosine (USB). Matrices are obtained from the recombinant clones M13mpl8 and -M13mp19. The sequencing primers are from Biolabs, New England. GC compressions are resolved using deoxy-inosine (USB).
Caractérisation du gène cellulaire nov
On effectue une analyse par Northern Blot d'ARN isolés de reins normaux, de fibroblastes d'embryons de poule (FEP) et de néphroblastomes en utilisant les sondes cellulaires dérivées d'une tumeur. La sonde HX1024 permet de détecter dans les FEP normaux une espèce d'ARNm de 2,2 kb dont l'expression est altérée dans tous les autres néphroblastomes. Le criblage d'une banque d'ADNc de FEP permet d'isoler un clone d'ADNc de 1,9 kb représentant l'ARNm de 2,2 kb exprimé dans les FEP normaux.Characterization of the nov cell gene
Northern blot analysis of RNA isolated from normal kidneys, hen embryo fibroblasts (FEP) and nephroblastomas is performed using tumor derived cell probes. The HX1024 probe makes it possible to detect, in normal FEPs, a 2.2 kb mRNA species whose expression is altered in all the other nephroblastomas. Screening of an FEP cDNA library makes it possible to isolate a 1.9 kb cDNA clone representing the 2.2 kb mRNA expressed in normal FEPs.
On a représenté sur la figure 1 la séquence entière nucléotidique de 1975 pb du clone d'ADNc de ce nouveau gène, surexprimé dans les néphroblastomes étudiés, appelé gène nov. Ce gène apparaît constitué de 5 exons. Un cadre ouvert de lecture de 1,0 kb codant pour une protéine potentielle de 32300 Da a été identifié du nucléotide 24 au nucléotide 1076. Ce cadre ouvert de lecture est suivi de 899 pb de séquences 3' non codantes qui contiennent deux motifs potentiels de signaux de polyadénylation (AATAAA) aux positions 1914 et 1932. FIG. 1 shows the entire 1975 bp nucleotide sequence of the cDNA clone of this new gene, overexpressed in the nephroblastomas studied, called the nov gene. This gene appears to consist of 5 exons. A 1.0 kb open reading frame coding for a potential protein of 32300 Da has been identified from nucleotide 24 to nucleotide 1076. This open reading frame is followed by 899 bp of 3 'non-coding sequences which contain two potential motifs of polyadenylation signals (AATAAA) at positions 1914 and 1932.
On a également indiqué sur cette figure les acides aminés potentiellement codés. Le polypeptide nov potentiel contient un noyau hydrophobe caractéristique d'un signal peptidique à son extrémité amino (avec 6 leucines). Cette protéine nov étant dépourvue d'autres régions hydrophobes présentes dans les protéines trans-membranaires, il est vraisemblable qu'elle est sécrétée. La protéine nov contient , également le motif consensus GCGCCXXC des protéines liant les facteurs de croissance du type insuline (IGF) et un total de 39 résidus cystéine ne formant pas de cluster. The potentially coded amino acids have also been indicated in this figure. The potential nov polypeptide contains a hydrophobic nucleus characteristic of a peptide signal at its amino terminus (with 6 leucines). This nov protein is devoid of other hydrophobic regions present in the trans-membrane proteins, it is likely that it is secreted. The nov protein also contains the consensus motif GCGCCXXC of proteins which bind insulin-type growth factors (IGF) and a total of 39 non-clustering cysteine residues.
Exemple2 : Isolement dans des cellules humaines de séquences de nucléotides apparentées au gène nov de poule. Example 2: Isolation in human cells of nucleotide sequences related to the hen nov gene.
On effectue un Southern blot de fragments d'ADN humain digéré par EcoRI avec le clone d'ADNc du gène nov de poule pClK. On opère dans les conditions stringentes rapportées par B. Perbal (voir référence ci-dessus). A Southern blot of fragments of human DNA digested with EcoRI is carried out with the cDNA clone of the hen nov gene pClK. One operates under the stringent conditions reported by B. Perbal (see reference above).
On constate que quatre fragments EcoRI s'hybrident avec des séquences du gène nov de poule. Ces fragments comportent respectivement 15, 12, 8 et'5,6 kb. It is found that four EcoRI fragments hybridize with sequences of the hen nov gene. These fragments contain respectively 15, 12, 8 and 5.6 kb.
Exemple3 : Isolement de séquences de nucléotides apparentées au gène nov de poule. Example 3: Isolation of nucleotide sequences related to the hen nov gene.
A partir d'une banque d'ADN de placenta humain, on isole à l'aide de la sonde pClK radiomarquée deux groupes de clones lambda gtll recombinants. From a library of human placenta DNA, two groups of recombinant lambda gtll clones are isolated using the radiolabeled pClK probe.
Les cartes de restriction de ces deux clones, établies par hybridations successives, sont rapportées sur la figure 2A et 2B. The restriction maps of these two clones, established by successive hybridizations, are reported in FIGS. 2A and 2B.
Les séquences de nucléotides humaines homologues à celles du gène nov de poule sont localisées dans un fragment d'ADN de 7,0 kb BamHI-HindIII du clone Hu92 et dans un fragment d'ADN de 6,6 kb SacI du clone Hu93. The human nucleotide sequences homologous to those of the hen nov gene are located in a 7.0 kb BamHI-HindIII DNA fragment from clone Hu92 and in a 6.6 kb SacI DNA fragment from clone Hu93.
Le sous-clonage de ces fragments dans les vecteurs pUC18 et pUC19, appelés respectivement clones pBH7 et pS6 permet de localiser plus précisément les séquences homologues dans deux fragments PstI d'ADN de 600 et 700 pb, désignés ci-après PBP06 et PSP07. The subcloning of these fragments into the vectors pUC18 and pUC19, called respectively clones pBH7 and pS6 makes it possible to locate more precisely the homologous sequences in two PstI DNA fragments of 600 and 700 bp, designated hereafter PBP06 and PSP07.
Sur ces cartes, les enzymes de restriction sont désignées comme suit : B = BglII, P = PstI, K = KpnI,
H = HindIII, S = SacI, E = EcoRI et X = Xba.On these maps, the restriction enzymes are designated as follows: B = BglII, P = PstI, K = KpnI,
H = HindIII, S = SacI, E = EcoRI and X = Xba.
L'utilisation des fragments PstI d'ADN purifiés comme sondes dans des expériences d'hybridation Southern avec les fragments EcoRI de l'exemple 2 conduit à la seule détection du fragment EcoRI d'ADN de 12 kb avec PB06 et du fragment EcoRI de 15 kb avec PS07 démontrant que les séquences de PB06 et PS07 correspondent à un sous-ensemble des exons nov de l'ADNc de poule. The use of the PstI fragments of purified DNA as probes in Southern hybridization experiments with the EcoRI fragments of Example 2 leads to the sole detection of the EcoRI DNA fragment of 12 kb with PB06 and of the EcoRI fragment of 15. kb with PS07 demonstrating that the sequences of PB06 and PS07 correspond to a subset of the nov exons of hen cDNA.
On rapporte sur les figures 3 et 4 les séquences nucléotidiques des fragments PBP06 etPS P07 avec celles des acides aminés potentiellement codés. The nucleotide sequences of the PBP06 and PS P07 fragments are reported in FIGS. 3 and 4 with those of the potentially coded amino acids.
Sur la figure 5, on a représenté la séquence de
PBP06 en correspondance avec la séquence homologue du gène nov de poule, le signe ":" désignant l'homologie entre les nucléotides de ces deux chaînes.In FIG. 5, the sequence of
PBP06 in correspondence with the homologous sequence of the hen nov gene, the sign ":" designating the homology between the nucleotides of these two chains.
De même la figure 6 représente les homologies existant entre la séquence PSP07 et le gène nov de poule au niveau nucléotidique. Likewise, FIG. 6 represents the homologies existing between the PSP07 sequence and the hen nov gene at the nucleotide level.
Exemple : Détection d'ARN du génome humain apparentés au gène non de poule. Example: Detection of RNA from the human genome related to the non hen gene.
On rapporte dans le tableau suivant les résultats d'expériences d'hybridation Northern avec différents tissus et lignées cellulaires en utilisant comme sondes les enchaînements de formule VIII, XV et XVI ci-dessus homologues respectivement des exons E2, E3 et E4 du gène nov de poule (ces codes étant utilisés dans le tableau pour les désigner). The results of the Northern hybridization experiments with different tissues and cell lines are reported in the following table using, as probes, the sequences of formula VIII, XV and XVI above homologous respectively to exons E2, E3 and E4 of the nov gene. hen (these codes being used in the table to designate them).
TISSUS ET LIGNEES
CELLULAIRES SONDES HUMAINES NOV
E2 E3-E4 kb de
l'ARNm
Moelle osseuse
Thymus - + (7,4)
Foie (foetal) + - (2,7)
HEL - + (2,7)
Cerveau (foetal) + - (2,7)
- + (7,4)
Neuroblastome 1 + + (2,7)
Neuroblastome 162 + + (2,7)
+ (7,4)
Rein nt + (2,7)
Nephroblastome Bou nt + (2,7)
Tissu mammaire nt + (2,7)
Tumeur mammaire gg nt + (2,7)
Tumeur mammaire sc nt + (2,7)
+ + (3,5)
+ (7,4)
SK-BR3 + + (2,7)
+ + (3,5)
- + (7,4)
MCF7 - + (7,4)
Carcinome embry test. 8 nt + (2,7)
- + (7,4)
Teratocarcinome test. 10 nt + (2,7)
- + (7,4)
Teratocarcinome test. 11 nt + (2,7)
- + (7,4)
Adenocarcinome U377 nt + (2,7)
- + (7,4) HL6O nt + (7,4) nt = non testé
Les résultats obtenus montrent que le gène humain homologue du gène nov de poule est exprimé selon les tissus ou lignées sous la forme de différentes espèces d'ARN détectés soit par les deux sondes, soit par une seule d'entre elles.FABRICS AND LINES
NOV HUMAN PROBES CELLULARS
E2 E3-E4 kb from
mRNA
Bone marrow
Thymus - + (7.4)
Liver (fetal) + - (2.7)
HEL - + (2.7)
Brain (fetal) + - (2.7)
- + (7.4)
Neuroblastoma 1 ++ (2.7)
Neuroblastoma 162 ++ (2.7)
+ (7.4)
Kidney nt + (2.7)
Nephroblastoma Bou nt + (2.7)
Nt + breast tissue (2.7)
Breast tumor gg nt + (2.7)
Sc nt + breast tumor (2.7)
+ + (3.5)
+ (7.4)
SK-BR3 + + (2.7)
+ + (3.5)
- + (7.4)
MCF7 - + (7.4)
Carcinoma embry test. 8 nt + (2.7)
- + (7.4)
Teratocarcinoma test. 10 nt + (2.7)
- + (7.4)
Teratocarcinoma test. 11 nt + (2.7)
- + (7.4)
Adenocarcinoma U377 nt + (2.7)
- + (7.4) HL6O nt + (7.4) nt = not tested
The results obtained show that the human gene homologous to the hen nov gene is expressed according to the tissues or lines in the form of different RNA species detected either by the two probes, or by only one of them.
Ainsi, on constate que les cellules de moelle osseuse normale, d'un neuroblastome et de la lignée SK-BR3 expriment un ARNm de 2,7 kb et que cet ARNm est reconnu par les deux sondes utilisées. Thus, it can be seen that the normal bone marrow, neuroblastoma and SK-BR3 line cells express a 2.7 kb mRNA and that this mRNA is recognized by the two probes used.
L'espèce d'ARNm de 7,4 kb exprimée par certains tissus et lignées n'apparaît reconnue que par la sonde
PSP07.The 7.4 kb mRNA species expressed by certain tissues and lines appears to be recognized only by the probe
PSP07.
Ces résultats indiquent que la régulation du gène nov chez l'homme dépendrait de la spécificité tissulaire. These results indicate that regulation of the nov gene in humans is dependent on tissue specificity.
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