FR2670215A1 - IMMORTALIZED CELL LINES AND THEIR APPLICATIONS, IN PARTICULAR TO THE PRODUCTION OF DIFFERENTIATED CELLS. - Google Patents
IMMORTALIZED CELL LINES AND THEIR APPLICATIONS, IN PARTICULAR TO THE PRODUCTION OF DIFFERENTIATED CELLS. Download PDFInfo
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Abstract
Description
La présente invention est relative à des lignées de cellules immortalisées conservant les mêmes propriétés que les cellules différenciées ou précurseurs primaires du donneur d'origine, à leurs applications en tant que système de production de cellules différenciées en grand nombre et en tant que modèle d'étude de la physiopathologie des cellules différenciées obtenues. The present invention relates to immortalized cell lines retaining the same properties as the differentiated cells or primary precursors of the original donor, to their applications as a system for producing differentiated cells in large numbers and as a model of study of the pathophysiology of the differentiated cells obtained.
La présente invention est également relative à l'application desdites cellules différenciées et/ou précurseurs comme agent à visée préventive et/ou thérapeutique, notamment dans le traitement des maladies génétiques, et plus particulièrement dans les myopathies. The present invention also relates to the application of said differentiated cells and / or precursors as a preventive and / or therapeutic agent, especially in the treatment of genetic diseases, and more particularly in myopathies.
Les lignées cellulaires immortalisées de l'Art antérieur ne permettent pas d'obtenir des cellules différenciées ayant les mêmes propriétés que les cellules qui se différencient normalement dans l'organisme vivant, pour former notamment un organe ; de plus, les lignées cellulaires immortalisées décrites dans l'Art antérieur sont spécifiques d'un organe ou d'un type cellulaire. The immortalized cell lines of the prior art do not make it possible to obtain differentiated cells having the same properties as cells which normally differentiate in the living organism, in particular to form an organ; in addition, the immortalized cell lines described in the prior art are specific for an organ or a cell type.
La Demande Internationale PCT WO 89/09816, au nom de MASSACHUSSETS INSTITUTE OF TECHNOLOGY décrit, par exemple, une lignée cellulaire immortalisée produite par incorporation dans des cellules précurseurs appropriées, d'un gène stimulateur de multiplication, qui est capable de permettre auxdites cellules de se multiplier, lequel gène est contrôlé par un facteur externe. Plus spécifiquement, cette Demande PCT décrit une lignée cellulaire immortalisée produite par incorporation, dans des cellules du système nerveux embryonnaire, d'un vecteur rétroviral comprenant un gène de multiplication, qui correspond au domaine sensible à la température de la souche tsA58 du virus SV4O et un gène résistant à un médicament, notamment à un antibiotique. PCT International Application WO 89/09816, in the name of MASSACHUSSETS INSTITUTE OF TECHNOLOGY, describes, for example, an immortalized cell line produced by incorporation into appropriate precursor cells of a multiplication stimulator gene, which is capable of enabling said cells to multiply, which gene is controlled by an external factor. More specifically, this PCT Application describes an immortalized cell line produced by incorporation, into embryonic nervous system cells, of a retroviral vector comprising a multiplication gene, which corresponds to the temperature sensitive domain of SV40 strain tsA58 and a gene resistant to a drug, especially an antibiotic.
Toutefois, le modèle proposé dans cette
Demande internationale PCT est spécifique des cellules nerveuses ; de plus, il comprend un vecteur rétroviral, comprenant un promoteur viral, qui comporte un certain nombre d'inconvénients, notamment les risques liés à la présence d'un fragment d'origine virale.However, the model proposed in this
International application PCT is specific for nerve cells; in addition, it comprises a retroviral vector, comprising a viral promoter, which has a certain number of disadvantages, in particular the risks associated with the presence of a fragment of viral origin.
Les Inventeurs se sont, en conséquence, donné pour but de pourvoir à des lignées de cellules immortalisées, permettant l'obtention de cellules différenciées présentant les caractéristiques des cellules différenciées obtenues normalement à partir de cellules primaires, quelle que soit la cellule d'origine. The inventors have therefore been intended to provide immortalized cell lines, allowing the production of differentiated cells having the characteristics of differentiated cells normally obtained from primary cells, regardless of the original cell.
La présente invention a pour objet des lignées cellulaires immortalisées, caractérisées en ce qu'elles sont obtenues par transformation appropriée de cellules primaires convenables, -issues d'un organe d'animal approprié, notamment un mammifère ou un oiseau,- par un fragment d'acide nucléique comprenant un oncogène viral immortalisant approprié, au moins un fragment des régions régulatrices du gène humain de la vimentine et éventuellement un gène dépourvu de son promoteur, mais dont l'activité est aisément détectable soit par un test enzymatique simple, soit par le fait qu'il confère une résistance à un antibiotique, lequel gène permet la sélection des transformants. The subject of the present invention is immortalized cell lines, characterized in that they are obtained by suitable transformation of suitable primary cells, derived from a suitable animal organ, in particular a mammal or a bird, by a fragment of nucleic acid comprising a suitable immortalizing viral oncogene, at least one fragment of the regulatory regions of the human gene of vimentin and optionally a gene devoid of its promoter, but whose activity is easily detectable either by a simple enzymatic test, or by the it confers resistance to an antibiotic, which gene allows the selection of transformants.
Selon un mode de réalisation avantageux desdites lignées cellulaires, l'oncogène viral immortalisant est choisi dans le groupe qui comprend l'oncogène
T/t de SV40, l'oncogène tST/At de SV40, l'oncogène T/At de SV40 et la région du gène immortalisant de l'adénovirus, du virus Epstein-Barr ou du virus herpétique.According to an advantageous embodiment of said cell lines, the immortalizing viral oncogene is chosen from the group which comprises the oncogene.
SV40 t / t, SV40 tST / At oncogene, SV40 T / At oncogene and immortalizing gene region of adenovirus, Epstein-Barr virus or herpesvirus.
Conformément à l'invention, le fragment des régions régulatrices du gène humain de la vimentine est, de préférence, le promoteur de la vimentine et plus particulièrement le fragment d'acide nucléique du promoteur de la vimentine, compris entre les bases -830 et +93 de la séquence régulatrice de la vimentine. According to the invention, the fragment of the regulatory regions of the human gene of vimentin is preferably the promoter of vimentin and more particularly the nucleic acid fragment of the vimentin promoter, between the bases -830 and + 93 of the regulatory sequence of vimentin.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, le fragment d'acide nucléique du promoteur de la vimentine comprend les bases -830 à -529 et/ou le fragment -540 à -140, situés en amont du site cap. According to an advantageous arrangement of this embodiment, the nucleic acid fragment of the vimentin promoter comprises the bases -830 to -529 and / or the fragment -540 to -140, located upstream of the cap site.
Un tel fragment d'acide nucléique hybride (oncogène grand T de SV 40 associé au promoteur de la vimentine) a notamment été décrit dans la Demande de
Brevet européen n 90402009.6 et est notamment incorporé dans un plasmide dénommé pHuVim830-T/t.Such a hybrid nucleic acid fragment (SV T large oncogene associated with the vimentin promoter) has in particular been described in the Application for
European Patent No. 90402009.6 and is incorporated in particular into a plasmid called pHuVim830-T / t.
Dans la présente invention, on entend par gène grand T, le gène qui exprime à la fois la protéine T et la protéine t (symbolisé T/t), alors que le gène T/At n'exprime que la protéine grand T (At correspond à la délétion du gène petit t). In the present invention, the term "gene large T" refers to the gene that expresses both the T protein and the t protein (symbolized T / t), while the T / At gene expresses only the large T protein (At). corresponds to the deletion of the small gene t).
Les Inventeurs ont mis au point une séquence qui contient le gène grand T thermosensible (ts) tST/At et le promoteur de la vimentine, laquelle séquence a l'avantage de n'exprimer conditionnellement que la protéine grand T et d'être activée par le promoteur de la vimentine ; de plus, ce gène grand T est modifié de manière à être thermosensible. Cette séquence peut notamment être insérée dans un plasmide, dénommé par les
Inventeurs pHuVim830-tST/Bt. The inventors have developed a sequence which contains the thermosensitive large T gene (ts) tST / At and the vimentin promoter, which sequence has the advantage of only conditionally expressing the large T protein and being activated by the promoter of vimentin; in addition, this large gene T is modified so as to be thermosensitive. This sequence may in particular be inserted into a plasmid, called by the
Inventors pHuVim830-tST / Bt.
Les lignées cellulaires conformes à l'invention, en raison de l'association fragment d'ADN codant pour'l'antigène T du virus SV40 et promoteur de la vimentine, -qui constitue l'activateur du gène immortalisant associé-, présentent un certain nombre d'avantages, notamment liés à la présence du promoteur de la vimentine. According to the invention, the cell lines according to the invention, due to the combination of DNA fragment coding for the SV40 virus antigen and the vimentin promoter, which constitutes the activator of the associated immortalizing gene, exhibit a certain number of benefits, particularly related to the presence of the vimentin promoter.
La vimentine est un polypeptide que l'on retrouve dans les cellules dérivées du mésenchyme. Il s'agit d'une protéine de structure des cellules ; le gène de la vimentine joue notamment un rôle dans la croissance cellulaire, la différenciation et le développement cellulaire. Vimentin is a polypeptide found in cells derived from mesenchyme. It is a cell structure protein; the vimentin gene plays a role in cell growth, differentiation and cell development.
La combinaison gène d'expression de l'antigène
T du SV40 et promoteur de la vimentine a notamment l'avantage de permettre un contrôle spécifique de la différenciation cellulaire
- l'activation du gène de l'antigène T est réalisée par le promoteur de la vimentine, en présence d'un agent mitogène approprié, éventuellement associé à des protéines qui se fixent sur un site du promoteur de la vimentine ; il en ressort qu'en l'absence d'agent mitogène, le promoteur de la vimentine est réprimé,
- l'antigène T lui-même, lorsqu'il est produit, active le promoteur de la vimentine, par action sur certains sites du promoteur de la vimentine sur lesquels peuvent se fixer des protéines activatrices (AP1, c-fos,
NK-KB) et l'antigène T lui-même.The gene expression combination of the antigen
SV40 T and vimentin promoter has the particular advantage of allowing specific control of cell differentiation
the activation of the T antigen gene is carried out by the vimentin promoter, in the presence of a suitable mitogenic agent, optionally combined with proteins which bind to a site of the vimentin promoter; it appears that in the absence of mitogenic agent, the vimentin promoter is repressed,
the T antigen itself, when it is produced, activates the vimentin promoter by action on certain sites of the vimentin promoter on which activating proteins (AP1, c-fos,
NK-KB) and the T antigen itself.
Une telle combinaison a également l'avantage de ne pas être spécifique vis-à-vis d'une cellule ou d'un organe, mais au contraire de permettre l'immortalisation de n'importe quelle cellule, tout en gardant les potentialités de différenciation de la cellule immortalisée. Such a combination also has the advantage of not being specific with respect to a cell or an organ, but on the contrary to allow the immortalization of any cell, while keeping the potential for differentiation. of the immortalized cell.
La combinaison gène d'expression de l'antigène
T sensible à la chaleur et promoteur de la vimentine, a de plus l'avantage de permettre un double contrôle, tant au niveau de l'antigène T lui-même (température d'activation, 34 C par exemple) que du promoteur de la vimentine (répression lorsque l'antigène T n'est plus fonctionnel), cette combinaison ayant de plus l'avantage de ne pas contenir le gène t, évitant ainsi des perturbations au niveau de la membrane cellulaire.The gene expression combination of the antigen
Heat sensitive and promoter of vimentin, has the further advantage of allowing a double control, both at the level of the T antigen itself (activation temperature, 34 C for example) and the promoter of the vimentin (repression when the T antigen is no longer functional), this combination having the further advantage of not containing the t gene, thereby avoiding disturbances at the cell membrane.
Selon un autre mode de réalisation avantageux desdites lignées, les cellules primaires sont avantageusement choisies dans le groupe qui comprend les cellules musculaires précurseurs de mammifère et plus particulièrement les myoblastes, les cellules épithéliales de mammifère et les cellules endothéliales de mammifère. According to another advantageous embodiment of said lines, the primary cells are advantageously chosen from the group which comprises the mammalian precursor muscle cells and more particularly the myoblasts, the mammalian epithelial cells and the mammalian endothelial cells.
Conformément à l'invention, les cellules musculaires précurseurs sont, de préférence, choisies dans le groupe qui comprend les myoblastes normaux de souris, les myoblastes mutants de souris et les myoblastes mutants humains. In accordance with the invention, the precursor muscle cells are preferably selected from the group consisting of normal mouse myoblasts, mouse mutant myoblasts and human mutant myoblasts.
Les myoblastes mutants de souris sont avanta geusement choisis dans le groupe qui comprend des myoblastes de dysgénésie musculaire, notamment dénommés myoblastes mdg et mdx et les myoblastes mutants humains sont notamment choisis dans le groupe qui comprend les cellules DMD et les cellules STEINERT. The mouse mutant myoblasts are advantageously selected from the group which comprises muscular dysgenesis myoblasts, notably called myoblasts mdg and mdx, and the human mutant myoblasts are in particular chosen from the group which comprises the DMD cells and the STEINERT cells.
La lignée de cellules immortalisées conforme à l'invention est avantageusement obtenue par transfection des cellules primaires appropriées par un plasmide choisi dans le groupe qui comprend le plasmide pHuVim830-tST/At, le plasmide pHuVim830-T/At et le plasmide pHuVim830-T/t. The immortalized cell line according to the invention is advantageously obtained by transfection of the appropriate primary cells with a plasmid chosen from the group which comprises the plasmid pHuVim830-tST / At, the plasmid pHuVim830-T / At and the plasmid pHuVim830-T / t.
Conformément à l'invention - la lignée, dénommée HVM, est obtenue par transfection de myoblastes normaux de souris par un plasmide pHuVim830-tST/At et a été déposée sous le n I-1019 en date du 7 décembre 1990 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par l'INSTITUT
PASTEUR.According to the invention - the line, called HVM, is obtained by transfection of normal myoblasts of mice with a plasmid pHuVim830-tST / At and was deposited under the n I-1019 dated December 7, 1990 with the National Collection of Microorganism Cultures held by the INSTITUT
PASTOR.
- la lignée dénommée HVMd est obtenue par transfection de myoblastes mutants mdg de souris par un plasmide pHuVim830-tST/At et a été déposée sous le n I-1020 en date du 7 décembre 1990 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par l'INSTITUT
PASTEUR.the line designated HVMd is obtained by transfection of mouse mdg mutant myoblasts with a plasmid pHuVim830-tST / At and was deposited under No. I-1020 dated December 7, 1990 with the National Collection of Microorganism Cultures held by INSTITUTE
PASTOR.
Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, la lignée cellulaire est obtenue par microinjection d'une séquence linéaire d'acide nucléique appropriée, obtenue à partir d'un plasmide choisi dans le groupe qui comprend le plasmide pHuVim830-tST/At, le plasmide pHuVim830-T/At et le plasmide pHuVim830-T/t, dans des cellules primaires convenables. According to another advantageous arrangement of this embodiment, the cell line is obtained by microinjection of a suitable linear sequence of nucleic acid, obtained from a plasmid chosen from the group which comprises the plasmid pHuVim830-tST / At, the plasmid pHuVim830-T / At and the plasmid pHuVim830-T / t, in suitable primary cells.
Conformément à l'invention, la lignée dénommée
HVE est obtenue par microinjection d'un plasmide pHuVim830-T/t linéarisé dans des cellules endothéliales humaines du cordon ombilical et a été déposée sous le n I-1016 en date du 3 décembre 1990 auprès de la
Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par 1'INSTITUT PASTEUR.According to the invention, the named line
HVE is obtained by microinjection of a linearized pHuVim830-T / t plasmid into human endothelial cells of the umbilical cord and was deposited as I-1016 on December 3, 1990 in the United States.
National Collection of Cultures of Microorganisms held by INSTITUT PASTEUR.
On obtient ainsi des lignées cellulaires présentant un taux de multiplication élevé. Cell lines with a high multiplication rate are thus obtained.
La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention de cellules musculaires (myotubes) différenciées, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes
(a) culture d'une lignée cellulaire musculaire immortalisée, conforme à l'invention, comprenant un plasmide contenant un oncogène viral immortalisant thermosensible, notamment le plasmide pHuVim830-tST/At, sur un milieu approprié, contenant une quantité appropriée de sérum d'un animal convenable, à une température comprise entre 34 C et 36 C, permettant l'expression conditionnelle d'une protéine virale, et notamment de l'antigène tsT et une multiplication cellulaire importante
(b) modification de la température des cellules en culture à une température comprise entre 38 C et 40 C, associée, éventuellement, à une modification du milieu de culture, notamment par diminution de la concentration en sérum dudit milieu et/ou utilisation d'un sérum d'un animal différent de celui de l'étape (a) ; et
(c) obtention de cellules différenciées en grand nombre par culture desdites cellules dans les conditions appropriées à la différenciation de l'étape (b).The present invention also relates to a process for obtaining differentiated muscle cells (myotubes), characterized in that it comprises the following steps
(a) culturing an immortalized muscle cell line, according to the invention, comprising a plasmid containing a thermally sensitive immortalizing viral oncogene, in particular the plasmid pHuVim830-tST / At, on a suitable medium, containing an appropriate amount of serum of a suitable animal, at a temperature of between 34 ° C. and 36 ° C., allowing the conditional expression of a viral protein, and in particular of the tsT antigen, and a large cell multiplication
(b) modifying the temperature of the cells in culture at a temperature of between 38 ° C. and 40 ° C., possibly associated with a modification of the culture medium, in particular by reducing the serum concentration of said medium and / or using a serum of an animal different from that of step (a); and
(c) obtaining differentiated cells in large numbers by culturing said cells under the conditions appropriate for the differentiation of step (b).
Dans les cellules différenciées ainsi obtenues (stade myotubes), le promoteur de la vimentine est réprimé et la protéine T n'est pas fonctionnelle. In the differentiated cells thus obtained (myotube stage), the vimentin promoter is repressed and the T protein is not functional.
En variante, le procédé d'obtention de cellules musculaires (myotubes) différenciées comprend les étapes suivantes
(a) culture d'une lignée cellulaire musculaire immortalisée, conforme à l'invention, comprenant un plasmide contenant un oncogène viral immortalisant, notamment un plasmide choisi dans le groupe qui comprend le plasmide pHuVim830-T/t et le plasmide pHuVim830-T/At, sur un milieu approprié, contenant une quantité convenable de sérum d'un animal convenable, à une température appropriée notamment 37C
(b) modification du milieu de culture, notamment par diminution de la concentration en sérum dudit milieu
(c) obtention de cellules différenciées en grand nombre par culture desdites cellules dans les conditions appropriées à la différenciation de l'étape (b)
La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention de cellules épithéliales ou endothéliales différenciées, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes
(a) culture d'une lignée cellulaire épithéliale ou endothéliale, conforme à l'invention en présence d'un agent d'activation approprié, qui conditionne l'expression d'une protéine virale appropriée et notamment de l'antigène T en présence du promoteur de la vimentine et permet une multiplication cellulaire importante
(b) transfert de ladite lignée immortalisée dans un milieu dépourvu en agent d'activation et/ou à une température comprise entre 37 C et 40 C ; et
(c) obtention de cellules différenciées en grand nombre.Alternatively, the method of obtaining differentiated muscle cells (myotubes) comprises the following steps
(a) culture of an immortalized muscle cell line, according to the invention, comprising a plasmid containing an immortalizing viral oncogene, in particular a plasmid chosen from the group which comprises the plasmid pHuVim830-T / t and the plasmid pHuVim830-T / At a suitable medium, containing a suitable amount of serum of a suitable animal, at an appropriate temperature including 37C
(b) modifying the culture medium, in particular by reducing the serum concentration of said medium
(c) obtaining differentiated cells in large numbers by culturing said cells under the conditions appropriate for the differentiation of step (b)
The present invention also relates to a process for obtaining differentiated epithelial or endothelial cells, characterized in that it comprises the following steps
(a) culturing an epithelial or endothelial cell line, according to the invention in the presence of an appropriate activating agent, which conditions the expression of a suitable viral protein and in particular of the T antigen in the presence of promoter of vimentin and allows a large cell multiplication
(b) transferring said immortalized line into a medium lacking an activating agent and / or at a temperature of between 37 ° C. and 40 ° C .; and
(c) obtaining differentiated cells in large numbers.
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, l'agent d'activation est notamment choisi dans le groupe qui comprend l'antigène T lui-même et des agents mitogènes appropriés. According to an advantageous embodiment of said method, the activating agent is in particular chosen from the group which comprises the T antigen itself and appropriate mitogenic agents.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, l'agent mitogène est notamment choisi dans le groupe qui comprend les sérums, les facteurs de croissance tels que le PDGF, 1'EGF ou le FGF, l'interleukine II, les interférons et la phytohémaglutinine (PHA). According to an advantageous arrangement of this embodiment, the mitogenic agent is especially chosen from the group which comprises sera, growth factors such as PDGF, EGF or FGF, interleukin II, interferons. and phytohemaglutinin (PHA).
Lorsque l'agent d'activation consiste en l'antigène T lui-même, il agit sur certains sites du promoteur de la vimentine et active ainsi le promoteur puis, le promoteur activé active ensuite l'antigène T. When the activating agent consists of the T antigen itself, it acts on certain sites of the vimentin promoter and thus activates the promoter and then the activated promoter activates the T antigen.
Lorsque l'agent d'activation consiste en du sérum, ce dernier agit plus particulièrement sur les protéines AP1, c-fos et NF-KB, qui se fixent sur l'acide nucléique du promoteur de la vimentine au niveau notamment des bases -707, -693, -197, -195 et -227, permettant au gène codant pour l'antigène T, d'exprimer ledit antigène. When the activating agent consists of serum, the latter acts more particularly on the AP1, c-fos and NF-κB proteins, which bind to the nucleic acid of the vimentin promoter, in particular to the bases -707 , -693, -197, -195 and -227, allowing the gene encoding the T antigen, to express said antigen.
La présente invention a également pour objet les cellules différenciées obtenues par l'un quelconque des procédés d'obtention de cellules différenciées décrits ci-dessus. The subject of the present invention is also the differentiated cells obtained by any of the methods for obtaining differentiated cells described above.
Les cellules différenciées ou précurseurs conformes à l'invention trouvent notamment application comme agent à visée préventive, vaccin par exemple, notamment par adjonction d'un fragment d'acide nucléique d'un virus approprié et/ou comme agent à visée thérapeutique, notamment par adjonction d'un fragment d'acide nucléique dit "correcteur", plus spécifiquement dans le traitement de maladies génétiques, par exemple les myopathies. The differentiated cells or precursors according to the invention find particular application as preventive agent, vaccine for example, in particular by adding a nucleic acid fragment of a suitable virus and / or as therapeutic agent, particularly by addition of a nucleic acid fragment called "corrector", more specifically in the treatment of genetic diseases, for example myopathies.
En effet, dans de telles cellules, le promoteur de la vimentine est réprimé ; de plus, elles n'expriment plus l'antigène T. Indeed, in such cells, the vimentin promoter is repressed; in addition, they no longer express the T antigen.
La présente invention a également pour objet un agent à visée préventive et/ou thérapeutique, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une cellule différenciée conforme à l'invention, éventuellement modifiée par adjonction d'un fragment d'acide nucléique approprié et éventuellement~associée à au moins un véhicule pharmaceutique approprié. The present invention also relates to a preventive and / or therapeutic agent, characterized in that it comprises at least one differentiated cell according to the invention, optionally modified by adding an appropriate nucleic acid fragment and optionally ~ associated with at least one suitable pharmaceutical vehicle.
La présente invention a également pour objet un agent à visée préventive et/ou thérapeutique, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une lignée cellulaire conforme à l'invention, éventuellement modifiée par adjonction d'un fragment d'acide nucléique approprié et éventuellement associée à au moins un véhicule pharmaceutique approprié. The present invention also relates to a preventive and / or therapeutic agent, characterized in that it comprises at least one cell line according to the invention, optionally modified by adding an appropriate nucleic acid fragment and optionally associated with at least one suitable pharmaceutical vehicle.
La présente invention a, de plus, pour objet un modèle d'étude et d'identification des systèmes biochimiques dont l'expression nucléaire, cytoplasmique ou membranaire est impliquée dans la prolifération et la différenciation cellulaire des cellules musculaires, épithéliales, endothéliales ou nerveuses, caractérisé en ce qu'il est constitué par une lignée cellulaire conforme à 1' invention. The subject of the present invention is also a model for the study and identification of biochemical systems whose nuclear, cytoplasmic or membrane expression is involved in the proliferation and cellular differentiation of muscle, epithelial, endothelial or nerve cells. characterized in that it consists of a cell line according to the invention.
La présente invention a, en outre, pour objet une séquence d'acide nucléique, caractérisée en ce qu'elle comprend successivement
- une séquence codant pour l'antigène grand T de SV40, ne comportant pas le fragment codant pour l'antigène petit t, laquelle séquence est thermosensible, ou un fragment de celle-ci
- une séquence comprenant au moins un fragment des régions régulatrices du gène humain de la vimentine et notamment au moins un fragment du promoteur de la vimentine humaine, d'une longueur de 830 paires de bases à partir du site cap ou un fragment de celle-ci, notamment le fragment -830 à -529 et/ou le fragment -540 à -140, en amont dudit site cap ; et, éventuellement
- un gène, dépourvu de son promoteur, mais dont l'activité est aisément détectable soit par un test enzymatique simple, soit par le fait qu'il confère une résistance à un antibiotique.The present invention further relates to a nucleic acid sequence, characterized in that it comprises successively
a sequence coding for the SV40 large T antigen, not containing the fragment coding for the small t antigen, which sequence is thermosensitive, or a fragment thereof
a sequence comprising at least one fragment of the regulatory regions of the human gene of vimentin and in particular at least one 830 base pair length of the human vimentin promoter fragment from the cap site or a fragment thereof; ci, in particular the fragment -830 to -529 and / or the fragment -540 to -140, upstream of said cap site; and eventually
a gene, devoid of its promoter, but whose activity is easily detectable either by a simple enzymatic test or by the fact that it confers resistance to an antibiotic.
Une telle séquence peut notamment être insérée dans un vecteur approprié, notamment un plasmide, lequel vecteur est apte à immortaliser une lignée cellulaire appropriée ; un tel plasmide a été dénommé, comme précisé plus haut, pHuvim830-tsT/At par les Inventeurs. Such a sequence may in particular be inserted into a suitable vector, in particular a plasmid, which vector is capable of immortalizing an appropriate cell line; such a plasmid has been named, as specified above, pHuvim830-tsT / At by the inventors.
La présente invention a, de plus, pour objet une méthode de production d'un mammifère transgénique non humain, caractérisée en ce qu'elle comprend l'introduction d'un plasmide choisi dans le groupe qui comprend le plasmide pHuVim830-T/t, le plasmide pHuVim830-T/At et le plasmide pHuVim830-tST/At dans un mammifère non humain à un stade embryonnaire précoce. The present invention further relates to a method for producing a transgenic non-human mammal, characterized in that it comprises the introduction of a plasmid selected from the group which comprises the plasmid pHuVim830-T / t, the plasmid pHuVim830-T / At and the plasmid pHuVim830-tST / At in a non-human mammal at an early embryonic stage.
La présente invention a également pour objet un mammifère transgénique non humain, caractérisé en ce qu'il est obtenu par la méthode ci-dessus décrite, et en ce que les cellules comprenant le plasmide choisi dans le groupe qui comprend le plasmide pHuVim830-T/t, le plasmide pHuVim830-T/t et le plasmide pHuVim830 tST/t, peuvent se différencier normalement in vivo, tout en pouvant produire des cellules immortalisées in vitro. The subject of the present invention is also a non-human transgenic mammal, characterized in that it is obtained by the method described above, and in that the cells comprising the plasmid chosen from the group which comprises the plasmid pHuVim830-T / The plasmid pHuVim830-T / t and the plasmid pHuVim830 tST / t can differentiate normally in vivo, while being able to produce immortalized cells in vitro.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention. In addition to the foregoing, the invention also comprises other arrangements, which will emerge from the description which follows, which refers to examples of implementation of the method that is the subject of the present invention.
I1 doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. It should be understood, however, that these examples are given solely by way of illustration of the object of the invention, of which they in no way constitute a limitation.
Exemple 1 : Préparation des plasmides.Example 1: Preparation of Plasmids
1) Plasmide pHuVim830-T/t
Ce plasmide est décrit dans la Demande de
Brevet européen 90402009.6 ; il exprime l'antigène grand
T et l'antigène petit t. Le fragment -830 - +93 du promoteur de la vimentine est cloné dans un plasmide pUC 18 les clones sont obtenus par digestion de la séquence 5' du gène de la vimentine au niveau du site de l'enzyme de restriction Pvu II. Le plasmide pUC 18 contenant le fragment d'ADN du promoteur de la vimentine est linéarisé par l'enzyme de restriction Xba I ; on obtient une extrémité 3' cohésive, qui est ajustée de manière à obtenir une extrémité franche, puis on lie le fragment d'ADN du promoteur de la vimentine ainsi obtenu avec le fragment d'ADN de l'antigène T, par ligation de l'extrémité 3' Xba
I du promoteur avec l'extrémité Sfi I du fragment SV40.1) pHuVim830-T / t Plasmid
This plasmid is described in the Application for
European Patent 90402009.6; he expresses the big antigen
T and the small antigen t. The vimentin promoter -830 - +93 fragment is cloned into a plasmid pUC 18 clones are obtained by digesting the 5 'sequence of the vimentin gene at the site of the restriction enzyme Pvu II. The plasmid pUC 18 containing the DNA fragment of the vimentin promoter is linearized with the restriction enzyme Xba I; a cohesive 3 'end is obtained, which is adjusted to obtain a blunt end, and then the vimentin promoter DNA fragment thus obtained is ligated with the DNA fragment of the T antigen, by ligation of the 'end 3' Xba
I of the promoter with the Sfi I end of the SV40 fragment.
Les extrémités BamH I 5' et 3' sont liées en présence de
T4 ligase. Les séquences codant pour l'antigène T sont ainsi sous le contrôle de la région régulatrice de la vimentine de 830 paires de bases.The BamHI ends 5 'and 3' are linked in the presence of
T4 ligase. The sequences encoding the T antigen are thus under the control of the 830 base pair vimentin regulatory region.
2) Plasmide pHuVim830-tST/At :
Ce plasmide contient la séquence codant pour l'antigène grand T dans laquelle les nucléotides 4630 à 4900 ont été retirés. Ce plasmide n'exprime plus la protéine t et l'expression de la protéine T est thermosensible. Cette thermosensibilité est obtenue à l'aide d'une mutation au niveau du nucléotide 3505.2) Plasmid pHuVim830-tST / At:
This plasmid contains the coding sequence for the large T antigen in which nucleotides 4630 to 4900 have been removed. This plasmid no longer expresses the T protein and the expression of the T protein is thermosensitive. This thermosensitivity is obtained by means of a mutation at nucleotide 3505.
Le plasmide qui n'exprime que la protéine T, est activé par le gène de la vimentine humaine. The plasmid, which only expresses the T protein, is activated by the gene for human vimentin.
La séquence codant pour l'antigène T commence en position 5234 et s'arrête en position 2533 ; ce fragment est généré par digestion de 1'ADN de SV40 par les enzymes de restriction suivantes : Sfi I, (position 5234) et BamH I (position 2533). La figure 1 décrit plus précisément ce plasmide, qui comprend successivement un fragment de 830 paires de bases du promoteur humain de la vimentine, la séquence codant pour l'antigène T et le plasmide pUC18. The coding sequence for the T antigen begins at position 5234 and stops at position 2533; this fragment is generated by digesting the SV40 DNA with the following restriction enzymes: Sfi I (position 5234) and BamHI (position 2533). Figure 1 further describes this plasmid, which comprises successively an 830 base pair fragment of the human vimentin promoter, the sequence encoding the T antigen and the pUC18 plasmid.
Exemple 2 : Production de lignées cellulaires musculaires précurseurs conformes à l'invention et cellules musculaires différenciées, obtenues à partir de ces lignées.EXAMPLE 2 Production of Precursor Muscle Cell Lines in Accordance with the Invention and Differentiated Muscle Cells Obtained from These Lines
a- Lignées cellulaires musculaires précurseurs
Les myoblastes immortalisés sont obtenus par transfection avec le plasmide pHuVim-tST/At décrit cidessus, à 34 C dans un milieu DMEM contenant du sérum de veau foetal à 20 t. Dans ces conditions, toutes les cellules expriment l'antigène T (figures 2A et 2B), indiquant qu'elles ont toutes intégrées le plasmide ; en effet, à 34 C la protéine grand T fonctionnelle induit la multiplication et l'immortalisation de la cellule.Ces figures 2A et 2B représentent l'immunofluorescence indirecte obtenue, lorsqu'une lignée cellulaire immortalisée, réalisée à partir de myoblastes normaux (figure 2A) ou de myoblastes mdg (figure 2B), est mise en contact avec des anticorps monoclonaux anti-protéine T ; à 34 C, tous les noyaux cellulaires expriment l'antigène T.a- precursor muscle cell lines
The immortalized myoblasts are obtained by transfection with the pHuVim-tST / At plasmid described above at 34 ° C. in a DMEM medium containing fetal calf serum at 20 t. Under these conditions, all the cells express the T antigen (FIGS. 2A and 2B), indicating that they have all integrated the plasmid; in fact, at 34 C, the functional large T protein induces multiplication and immortalization of the cell. FIGS. 2A and 2B show the indirect immunofluorescence obtained, when an immortalized cell line made from normal myoblasts (FIG. 2A ) or myoblasts mdg (Figure 2B) is contacted with anti-T protein monoclonal antibodies; at 34 C, all the cell nuclei express the T antigen.
La synthèse de la protéine grand T est caractérisée après électrophorèse d'extraits myoblastiques après couplage avec des anticorps spécifiques dirigés contre ladite protéine T. La quantité de protéine T est similaire dans les myoblastes normaux et dans les myoblastes mdg. The synthesis of the large T protein is characterized after electrophoresis of myoblastic extracts after coupling with specific antibodies directed against said protein T. The amount of T protein is similar in normal myoblasts and in myoblasts mdg.
L'analyse de 1'ADN génomique révèle que le gène recombinant est intégré (figures 3A et 3B). Ces figures représentent l'intégration du plasmide pHuVim830tST/At dans les cellules musculaires. L'ADN des cellules immortalisées est traité par l'enzyme de restriction
Hinc II, puis est soumis à une électrophorèse sur gel, suivie d'un transfert sur bande de nitrocellulose ; on procède ensuite à une incubation avec une sonde d'ADN marquée au 32P (32p dCTP), correspondant au fragment codant pour l'antigène T (les 632 derniers nucléotides du gène SV40 T (Amersham Multiprime kit) ; si le fragment est effectivement intégré, on observe une bande d'environ 1 kb (figure 3A : muscle normal, souche sauvage ; figure 3B : muscle mdg, dysgénésie musculaire g).Analysis of the genomic DNA reveals that the recombinant gene is integrated (FIGS. 3A and 3B). These figures represent the integration of the plasmid pHuVim830tST / At in the muscle cells. The DNA of the immortalized cells is treated with the restriction enzyme
Hinc II, then is subjected to gel electrophoresis, followed by transfer to nitrocellulose tape; incubation is then carried out with a 32P-labeled DNA probe (32p dCTP), corresponding to the fragment encoding the T antigen (the last 632 nucleotides of the SV40 T gene (Amersham Multiprime kit), if the fragment is indeed integrated a band of approximately 1 kb is observed (Figure 3A: normal muscle, wild strain, Figure 3B: muscle mdg, muscular dysgenesis g).
Le temps de doublement de ces cellules immortalisées est d'environ 24 heures. The doubling time of these immortalized cells is approximately 24 hours.
b- obtention de cellules musculaires différenciées
Les lignées cellulaires obtenues ci-dessus, sont mises dans des conditions de différenciation appropriées à savoir à 39 C, dans un milieu DMEM contenant du sérum de cheval à 10 %. b- obtaining differentiated muscle cells
The cell lines obtained above are put under appropriate differentiation conditions, namely at 39 ° C., in a DMEM medium containing 10% horse serum.
La thermosensibilité de l'expression de l'antigène T conduit à une augmentation de la différenciation terminale, lorsque l'antigène T est réprimé. Dans ces conditions de différenciation (39'C, milieu DMEM contenant du sérum de cheval à 10 %), les cellules mononucléées (myoblastes) non fusionnées expriment la protéine T alors que les myoblastes fusionnés (myotubes multinucléés) n'expriment pas la protéine T, indiquant la répression du promoteur de la vimentine au stade myotubes. The thermosensitivity of T antigen expression leads to an increase in terminal differentiation when the T antigen is repressed. Under these differentiation conditions (39'C, DMEM medium containing 10% horse serum), unfused mononuclear cells (myoblasts) express T protein while fused myoblasts (multinucleate myotubes) do not express T protein. , indicating the repression of the vimentin promoter at the myotubes stage.
Les souris normales et les souris présentant une dysgénésie musculaire (souris dites mdg), sont capables de former des myotubes. Deux clones ont plus particulièrement été étudiés HMV pour les myoblastes normaux et HMVd pour la dysgénésie musculaire. Normal mice and mice with muscular dysgenesis (so-called mdg mice) are able to form myotubes. Two clones were more particularly studied HMV for normal myoblasts and HMVd for muscular dysgenesis.
2. Caractéristiques des cellules différenciées obtenues
L'apparition de sarcomères normaux, de triades et du couplage excitation-contraction sont des marqueurs de la différenciation terminale des cellules musculaires en culture.2. Characteristics of differentiated cells obtained
The appearance of normal sarcomeres, triads and excitation-contraction coupling are markers of terminal differentiation of muscle cells in culture.
Les cellules différenciées obtenues à partir de la lignée immortalisée de souris normales se contrac tent spontanément en culture et leur organisation sarcomérique peut être visualisée, alors que dans les myotubes mdg immortalisés obtenus conformément à l'invention, l'organisation sarcomérique est peu développée. Contrairement aux myotubes immortalisés normaux conformes à l'invention, le courant calcique de type L n'est pas retrouvé dans les cellules différenciées mdg. The differentiated cells obtained from the immortalized line of normal mice contract spontaneously in culture and their sarcomeric organization can be visualized, whereas in the immortalized mdg myotubes obtained in accordance with the invention, the sarcomeric organization is poorly developed. Unlike normal immortalized myotubes according to the invention, the L-type calcium current is not found in differentiated mdg cells.
Exemple 3 : Production de lignées cellulaires endothéliales conformes à l'invention et cellules différenciées, obtenues à partir de ces lignées.Example 3 Production of endothelial cell lines according to the invention and differentiated cells obtained from these lines.
a. Immortalisation de cellules endothéliales
Les cellules endothéliales de porc et de lapin sont recueillies, à partir d'échantillons de sang, par ponction veineuse dans des tubes héparinisés suivie d'une centrifugation sur Ficoll (d=1,09). Les cellules endothéliales humaines sont recueillies, après une digestion limitée à la collagénase, des veines du cordon ombilical ou des vaisseaux du cerveau ; ces cellules sont mises en culture dans des récipients de culture recouverts de gélatine, avec un milieu DMEM supplémenté avec du sérum de veau foetal à 10 %, de la glutamine à 2 mM et des antibiotiques, incubées à 37 C en atmosphère humidifiée contenant 10 % de CO2.at. Immortalization of endothelial cells
The porcine and rabbit endothelial cells are collected from blood samples by venipuncture into heparinized tubes followed by Ficoll centrifugation (d = 1.09). Human endothelial cells are collected after digestion limited to collagenase, umbilical cord veins or vessels of the brain; these cells are cultured in gelatin-coated culture vessels, with a DMEM medium supplemented with 10% fetal calf serum, 2 mM glutamine and antibiotics, incubated at 37 ° C in a humidified atmosphere containing 10% of CO2.
Entre 500 et 2000 cellules sont individuellement microinjectées dans leurs noyaux, avec un plasmide pHuVim830-T/t linéarisé (environ 3,5 kb), tel que décrit dans la Demande de Brevet européen n 90402009.6, à savoir comprenant le gène codant pour l'antigène T complet de SV40 (grand T et petit t) et la séquence comprise entre les nucléotides -830 et +93 du promoteur de la vimentine, linéarisé par digestion Sph I/BamH I dudit plasmide à une concentration de 2 ng/l dans un tampon Tris-EDTA. La microinjection de ce plasmide dans le noyau desdites cellules est suivie de l'intégration et de l'expression de l'antigène grand T dans les cellules dérivées. La quantité injectée est d'environ deux fois supérieure à la taille du noyau. Between 500 and 2000 cells are individually microinjected in their nuclei, with a linearized pHuVim830-T / t plasmid (approximately 3.5 kb), as described in European Patent Application No. 90402009.6, namely comprising the gene coding for the SV40 full T antigen (large T and small t) and the sequence between nucleotides -830 and +93 of the vimentin promoter, linearized by Sph I / BamH I digestion of said plasmid at a concentration of 2 ng / l in a Tris-EDTA buffer. The microinjection of this plasmid into the nucleus of said cells is followed by the integration and expression of the large T antigen in the derived cells. The amount injected is about twice the size of the core.
2. Caractéristiques de la multiplication cellulaire
L'efficacité du clonage est testée sur des plaques contenant 50 puits de~ culture de 10 mm de diamètre, lesquels puits sont inoculés avec 1-10 cellules.2. Characteristics of cell multiplication
The cloning efficiency is tested on plates containing 50 culture wells 10 mm in diameter, which wells are inoculated with 1-10 cells.
Les courbes de croissance sont établies à partir de trois plaques, en utilisant des cellules COS comme référence.Growth curves are established from three plates, using COS cells as a reference.
La croissance dans un milieu semi-solide est réalisée comme décrit par GIMBRONE et al. (Cell, 1976, e, 685693), avec du DMEM supplémenté en sérum de veau foetal à 10 %.Growth in a semi-solid medium is carried out as described by GIMBRONE et al. (Cell, 1976, e, 685693), with DMEM supplemented with 10% fetal calf serum.
Trois semaines après la microinjection, des foyers multicouches de cellules apparaissent dans toutes les cultures primaires, envahissant les cellules résiduelles. De tels foyers n'apparaissent jamais dans les cultures contrôle, dans lesquelles la monocouche confluente de cellules subit une dégénération spontanée en 3 à 5 semaines. Three weeks after microinjection, multilayer foci of cells appear in all primary cultures, invading the residual cells. Such foci never appear in control cultures, in which the confluent cell monolayer undergoes spontaneous degeneration within 3 to 5 weeks.
Les caractéristiques des lignées cellulaires obtenues sont résumées dans le tableau I ci-après
<tb> COMPORTEMENT <SEP> ENDOTHELIUM <SEP> ENDOTHELIUR <SEP> ENDOTHELIUM
<tb> CELLULAIRE <SEP> LAPIN <SEP> PORC <SEP> HUMAIN
<tb> <SEP> Clone <SEP> Clone
<tb> <SEP> 1 <SEP> CEH
<tb> Nombre <SEP> de
<tb> passages <SEP> 60 <SEP> 20 <SEP> 15 <SEP> 15
<tb> Temps <SEP> de <SEP> double- <SEP> 20h <SEP> 36h <SEP> 66h <SEP> 32h
<tb> ment <SEP> (SVF <SEP> 10 <SEP> %)
<tb> Temps <SEP> de <SEP> double- <SEP> 34h <SEP> 40h <SEP> - <SEP> 35h
<tb> ment <SEP> (SVF <SEP> 5 <SEP> %)
<tb> Temps <SEP> de <SEP> double- <SEP> 41h <SEP> <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> ment <SEP> (SVF <SEP> 0,1 <SEP> %)
<tb> Capacité <SEP> de <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> clonage
<tb> Présence <SEP> de <SEP> + <SEP> <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> foyers
<tb> Croissance <SEP> dans <SEP> + <SEP> <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> milieu <SEP> semi
<tb> solide
<tb>
L'antigène T intranucléaire est identifié à l'aide d'un anticorps monoclonal de souris et un anticorps de lapin anti-souris conjugué avec un de la fluorescéine, après fixation à l'éthanol-acétone (7/3), pendant 6 minutes à 20'C ; les filaments intermédiaires sont détectés par immunofluorescence indirecte en présence d'un anticorps monoclonal de souris anti-vimentine (Amersham) ; la mise en évidence du facteur VIII est réalisée comme décrit dans Little et al.(J. Pathol., 1986, 149, 89-95), en utilisant un anticorps de lapin anti-facteur VIII (Zymed Laboratories)
La figure 4 représente l'immunofluorescence indirecte obtenue, lorsqu'une lignée cellulaire immortalisée, réalisée à partir de cellules endothéliales immortalisées, est mise en contact avec des anticorps monoclonaux anti-protéine T. <tb> BEHAVIOR <SEP> ENDOTHELIUM <SEP> ENDOTHELIUR <SEP> ENDOTHELIUM
<tb> CELL <SEP> RABBIT <SEP> PORK <SEP> HUMAN
<tb><SEP> Clone <SEP> Clone
<tb><SEP> 1 <SEP> CEH
<tb> Number <SEP> of
<tb> passages <SEP> 60 <SEP> 20 <SEP> 15 <SEP> 15
<tb> Time <SEP> of <SEP> double- <SEP> 20h <SEP> 36h <SEP> 66h <SEP> 32h
<tb> ment <SEP> (SVF <SEP> 10 <SEP>%)
<tb> Time <SEP> of <SEP> double- <SEP> 34h <SEP> 40h <SEP> - <SEP> 35h
<tb> ment <SEP> (SVF <SEP> 5 <SEP>%)
<tb> Time <SEP> of <SEP> double- <SEP> 41h <SEP><SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> ment <SEP> (SVF <SEP> 0.1 <SEP>%)
<tb> Capacity <SEP> of <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> cloning
<tb>SEP> presence of <SEP> + <SEP><SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> homes
<tb> Growth <SEP> in <SEP> + <SEP><SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> middle <SEP> semi
<tb> solid
<Tb>
The intranuclear T-antigen is identified using a mouse monoclonal antibody and a fluorescein-conjugated rabbit anti-mouse antibody, after fixation with ethanol-acetone (7/3), for 6 minutes. at 20'C; the intermediate filaments are detected by indirect immunofluorescence in the presence of an anti-vimentin mouse monoclonal antibody (Amersham); the detection of factor VIII is carried out as described in Little et al., J. Pathol., 1986, 149, 89-95, using a rabbit anti-Factor VIII antibody (Zymed Laboratories).
FIG. 4 represents the indirect immunofluorescence obtained, when an immortalized cell line made from immortalized endothelial cells is brought into contact with monoclonal antibodies against T-protein.
L'analyse de 1'ADN génomique révèle que le gène recombinant est intégré (figure 5). Cette figure représente l'intégration du plasmide pHuVim830T/t dans les cellules : l'ADN des cellules immortalisées est traité par l'enzyme de restriction Hinc II, puis est soumis à une électrophorèse sur gel, suivie d'un transfert sur bande de nitrocellulose ; on procède ensuite à une incubation avec une sonde d'ADN marquée au 32P (32p dCTP), correspondant au fragment codant pour l'antigène T (les 632 derniers nucléotides du gène SV40 T (Amersham
Multiprime kit) ; si le fragment est effectivement intégré, on observe une bande d'environ 1 kb.Analysis of the genomic DNA reveals that the recombinant gene is integrated (Figure 5). This figure represents the integration of the plasmid pHuVim830T / t into the cells: the DNA of the immortalized cells is treated with the restriction enzyme Hinc II, then is subjected to gel electrophoresis, followed by a nitrocellulose band transfer. ; incubation is then carried out with a 32 P-labeled DNA probe (32 p dCTP), corresponding to the fragment encoding the T antigen (the last 632 nucleotides of the SV40 T gene (Amersham
Multiprime kit); if the fragment is indeed integrated, a band of about 1 kb is observed.
b. Arrêt de la multiplication desdites lignées immortalisées
Dès que l'on transfert les cellules immortalisées telles que préparées ci-dessus, sur un milieu dépourvu en sérum ou contenant moins de 1 % de sérum, lesdites cellules gardent les propriétés caractéristiques des cellules endothéliales, notamment la production de facteur VIII.b. Stop the multiplication of said immortalized lines
As soon as the immortalized cells as prepared above are transferred to serum-free medium or containing less than 1% serum, said cells retain the characteristic properties of the endothelial cells, in particular the production of factor VIII.
Exemple 4 : Production de lignées cellulaires épithéliales conformes à l'invention et cellules différenciées, obtenues à partir de ces lignées.Example 4 Production of epithelial cell lines according to the invention and differentiated cells obtained from these lines.
a. Immortalisation de cellules
les cellules épithéliales de glande mammaire de lapin sont obtenues après digestion de ces tissus par la collagénase
les cellules épithéliales d'oviductes bovins sont récoltées après lavage des oviductes avec un milieu
DMEM.at. Immortalization of cells
mammary epithelial cells of rabbit are obtained after digestion of these tissues by collagenase
bovine oviduct epithelial cells are harvested after washing the oviducts with a medium
DMEM.
Les cellules sont microinjectées comme décrit à l'exemple 3, ci-dessus. The cells are microinjected as described in Example 3, above.
Les caractéristiques des lignées cellulaires obtenues sont résumées dans le tableau II ci-après
<tb> COMPORTEMENT <SEP> EPITHELIUM <SEP> EPITHELIUM
<tb> CELLULAIRE <SEP> MAMMAIRE <SEP> D'OVIDUCTE
<tb> <SEP> LAPIN <SEP> BOVIN
<tb> Nombre <SEP> de <SEP> 55 <SEP> 30
<tb> passages
<tb> Temps <SEP> de <SEP> double- <SEP> 22h <SEP> 20h
<tb> ment <SEP> (SVF <SEP> 10 <SEP> %) <SEP>
<tb> Temps <SEP> de <SEP> double- <SEP> 22h <SEP> 22h
<tb> ment <SEP> (SVF <SEP> 5 <SEP> %)
<tb> Temps <SEP> de <SEP> double- <SEP> 35h
<tb> ment <SEP> (SVF <SEP> 0,1 <SEP> %)
<tb> Capacité <SEP> de <SEP> + <SEP> +
<tb> clonage
<tb> Présence <SEP> de <SEP> foyers
<tb> Croissance <SEP> dans <SEP> +
<tb> milieu <SEP> semi-solide
<tb>
b.Arrêt de la multiplication desdites lignées immortalisées ::
Dès que l'on transfert les cellules immortalisées telles que préparées ci-dessus, sur un milieu dépourvu en sérum ou contenant moins de 1 % de sérum, lesdites cellules gardent les propriétés caractéristiques des cellules épithéliales, notamment la détection des filaments intermédiaires, par immunofluorescence indirecte en présence d'un anticorps monoclonal de souris anti-kératine.<tb> BEHAVIOR <SEP> EPITHELIUM <SEP> EPITHELIUM
<tb> CELLULAR <SEP> MAMMARY <SEP> OF OVIDUCTE
<tb><SEP> RABBIT <SEP> BOVINE
<tb> Number <SEP> of <SEP> 55 <SEP> 30
<tb> passages
<tb> Time <SEP> of <SEP> double- <SEP> 22h <SEP> 20h
<tb> ment <SEP> (SVF <SEP> 10 <SEP>%) <SEP>
<tb> Time <SEP> of <SEP> double- <SEP> 22h <SEP> 22h
<tb> ment <SEP> (SVF <SEP> 5 <SEP>%)
<tb> Time <SEP> of <SEP> double- <SEP> 35h
<tb> ment <SEP> (SVF <SEP> 0.1 <SEP>%)
<tb> Capacity <SEP> of <SEP> + <SEP> +
<tb> cloning
<tb> Presence <SEP> of <SEP> outbreaks
<tb> Growth <SEP> in <SEP> +
<tb> medium <SEP> semi-solid
<Tb>
b.Stop of the multiplication of said immortalized lines ::
As soon as the immortalized cells as prepared above are transferred to serum-free medium or containing less than 1% of serum, said cells retain the characteristic properties of the epithelial cells, in particular the detection of the intermediate filaments by immunofluorescence. indirect in the presence of a mouse monoclonal anti-keratin antibody.
De telles cellules immortalisées trouvent notamment application pour servir de cellules nourricières aux embryons de bovins lors du sexage des embryons. Such immortalized cells find particular application to serve as feeder cells for bovine embryos during sexing embryos.
Exemple 5 : Souris transgénique.Example 5: Transgenic mouse.
On microinjecte 70 oeufs au stade une cellule avec un fragment linéarisé du plasmide pHuVim830-tST/At puis on transfert lesdits oeufs dans les oviductes de 35 souris. L'analyse en ADN des cellules de la queue par la méthode de Southern montre que 3 jeunes souris sont transgéniques. Les souris transgéniques obtenues expriment le gène T de SV40 et trouvent notamment application dans l'étude dans la tumorigénécité in vivo et comme source de cellules immortalisées, dans la mesure où le promoteur HuVim830 est inductible en culture in vitro. Seventy eggs were microinjected at the one-cell stage with a linearized fragment of plasmid pHuVim830-tST / At and then transferred to the oviducts of mice. The DNA analysis of the tail cells by the Southern method shows that 3 young mice are transgenic. The transgenic mice obtained express the SV40 T gene and find particular application in the study in tumorigenicity in vivo and as a source of immortalized cells, insofar as the HuVim830 promoter is inducible in vitro culture.
Le croisement d'une souris transgéniques "VimT" avec un mutant mdg ou un mutant mdx conduit à un animal dont les cellules mises en culture sont à la fois immortelles et portent la mutation précitée. The crossing of a transgenic mouse "VimT" with a mutant mdg or mutant mdx leads to an animal whose cultured cells are both immortal and carry the above mutation.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. As is apparent from the above, the invention is not limited to those of its modes of implementation, implementation and application which have just been described more explicitly; it encompasses all the variants that may come to the mind of the technician in the field, without departing from the scope or scope of the present invention.
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