FR2663748A1 - ANTIBODIES SPECIFIC TO THE ISOPEPTIDIC BINDING INDUCED BY TRANSGLUTAMINASES, ANTIGENS CONSTITUTED BY GLU-LYS ISOPEPTIDES RECOGNIZED BY THE SAID ANTIBODIES, DIAGNOSIS AGENTS AND THERAPEUTIC COMPOSITIONS CONTAINING THEM. - Google Patents
ANTIBODIES SPECIFIC TO THE ISOPEPTIDIC BINDING INDUCED BY TRANSGLUTAMINASES, ANTIGENS CONSTITUTED BY GLU-LYS ISOPEPTIDES RECOGNIZED BY THE SAID ANTIBODIES, DIAGNOSIS AGENTS AND THERAPEUTIC COMPOSITIONS CONTAINING THEM. Download PDFInfo
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Abstract
Description
La présente Invention est relative à des anticorps spécifiques de la liaison isopeptidique induite par les transglutaminases, à des antigènes constitués par un isopeptide dans lequel une protéine est conjuguée par l'intermédiaire du résidu acide glutamique qu'elle contient à la fonction amine primaire d'une lysine contenue dans une autre protéine. La présente Invention s'étend aux procédés d'obtention desdits anticorps et antigènes et à leurs applications diagnostiques et thérapeutiques. The present invention relates to antibodies specific for the isopeptide binding induced by transglutaminases, to antigens consisting of an isopeptide in which a protein is conjugated via the glutamic acid residue that it contains to the primary amine function of a lysine contained in another protein. The present invention extends to methods for obtaining said antibodies and antigens and to their diagnostic and therapeutic applications.
La formation de liaisons transversales entre des chaînes de protéines a généralement lieu par l'intermédiaire des groupes e-NH2 de résidus lysine de peptides, pour donner lieu à la formation de liaisons isopeptidiques N-(glutamyl)lysine en présence de transglutaminases : il se forme ainsi une liaison covalente entre les groupes t-carboxamide des résidus glutamine contenus dans une protéine et les groupes e-amino de résidus lysine contenus dans les mêmes chaînes de protéines ou dans des chaînes différentes.Une telle réticulation a été identifiée aussi bien dans le cas de protéines cellulaires (collagène, kératine), que dans des protéines extra-cellulaires (fibrine insoluble du plasma, utéroglobuline du fluide séminal, protéines du cristallin et pellicules capillaires) et elle a été observée aussi bien entre des protéines homologues qu'entre des protéines hétérologues. The formation of crosslinks between protein chains usually takes place through the e-NH2 groups of lysine residues of peptides, to give rise to the formation of N- (glutamyl) lysine isopeptide bonds in the presence of transglutaminases: it occurs thus forms a covalent bond between the t-carboxamide groups of glutamine residues contained in a protein and the e-amino groups of lysine residues contained in the same protein chains or in different chains. cellular proteins (collagen, keratin), as in extra-cellular proteins (insoluble plasma fibrin, seminal fluid uteroglobulin, lens proteins and hair dandruff) and it has been observed both between homologous proteins and between homologous proteins. heterologous proteins.
I1 a été rapporté récemment que la teneur en isopeptides cellulaires varie en fonction directe de la croissance des cellules et il a été observé que la fonction maximale d'isopeptides coïncide avec une activité transglutaminase dans les cellules concernées. It has recently been reported that the content of cellular isopeptides varies as a direct function of cell growth and it has been observed that the maximum function of isopeptides coincides with transglutaminase activity in the cells concerned.
En ce qui concerne les protéines extracellulaires telles que la fibrine, comme on le sait, la forme de la fibrine qui constitue un marqueur pour la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) et pour les infarctus du myocarde, est la forme dimérique "D-Dimer" (Francis et Al., "Circulation", 75, (1987), p. 11701177).Or il est connu que cette dimérisation est réalisée entre deux chaînes monomères du fragment D, par la formation d'une liaison isopeptidique entre le e-NH2 de la lysine d'un monomère D et le -carboxamide d'une glutamine d'un autre monomère D, par action du facteur XIIIa, qui est la transglutaminase plasmatique, conformément à la formule ci-après
Ce qui vient d'être dit montre que si une corrélation entre l'activité transglutaminase et la formation de liaisons isopeptidiques est vérifiée, la possibilité de révéler les liaisons isopeptidiques et l'activité transglutaminase pourrait permettre, entre autres, de diagnostiquer de façon très précoce des lésions ou des tumeurs bénignes ou malignes du sein ou du tractus gastro-intestinal, de diagnostiquer des maladies cardiovasculaires, de diagnostiquer des maladies virales accompagnées de séquelles telles que fièvre hémorragique, voire des applications thérapeutiques. What has just been said shows that if a correlation between the transglutaminase activity and the formation of isopeptide bonds is verified, the possibility of revealing the isopeptide bonds and the transglutaminase activity could make it possible, among other things, to diagnose very early. benign or malignant lesions or tumors of the breast or the gastrointestinal tract, to diagnose cardiovascular diseases, to diagnose viral diseases accompanied by sequelae such as hemorrhagic fever, or even therapeutic applications.
L'emploi d'inhibiteurs spécifiques compétitifs (Polylysine, Spermine, Putrescine, CBZ-gln-gly) de TG injectés chez la souris en même temps que des cellules tumorales inhibent la croissance tumorale (Yancey et Laki, 1972). Le même effet est obtenu par l'immunisation de la souris contre la TG cellulaire (Yancey et Laki, 1972). The use of specific competitive inhibitors (Polylysine, Spermine, Putrescine, CBZ-gln-gly) of TG injected into mice at the same time as tumor cells inhibits tumor growth (Yancey and Laki, 1972). The same effect is obtained by immunizing mice against cellular TG (Yancey and Laki, 1972).
La TG cellulaire semble jouer un rôle dans la métastase puisqu'il a été montré une relation inverse entre l'activité TG et le pouvoir métastasiant de clones cellulaires provenant de rhabdomyosarcome de rat (DELCROS et col., 1986). Chez le rat, l'activité TG dans la tumeur primaire (sarcome de foie) diminue lorsque des métastases sont détectées dans le poumon (Barnes et col., 1985). Cellular TG appears to play a role in metastasis since an inverse relationship has been shown between TG activity and metastasizing power of cell clones from rat rhabdomyosarcoma (DELCROS et al., 1986). In rats, TG activity in the primary tumor (liver sarcoma) decreases when metastases are detected in the lung (Barnes et al., 1985).
L'activité TG pourrait donc être un marqueur enzymatique du pouvoir métastasiant. TG activity could therefore be an enzymatic marker of metastasizing power.
D'autres auteurs ont pu mesurer en même temps que l'activité, la quantité d'enzyme cellulaire par test
ELISA avec des anticorps anti-TG (Fesus et Arato, 1986).Other authors were able to measure at the same time as the activity, the quantity of cellular enzyme per test
ELISA with anti-TG antibodies (Fesus and Arato, 1986).
Ainsi, dans des fibroblastes humains WI38 en culture (isolés d'un tissu pulmonaire embryonnaire), le contenu en TG varie parallèlement à l'activité TG selon l'ordre suivant fibroblaste au repos > prolifératif > transformé.Thus, in cultured human WI38 fibroblasts (isolated from embryonic lung tissue), the TG content varies in parallel with the TG activity in the following order: resting fibroblast> proliferative> transformed.
Au niveau cellulaire, les Inventeurs ont pris pour hypothèse que l'utilisation de la TG comme marqueur diagnostique, par marquage de biopsies tumorales à l'aide d'anticorps dirigés contre les isopeptides produits par la réaction TG, pourrait permettre de différencier entre tumeur bénigne et tumeur maligne et éventuellement de classifier les états intermédiaires, qui posent toujours des problèmes aux anatomopathologistes. At the cellular level, the inventors assumed that the use of TG as a diagnostic marker, by labeling tumor biopsies using antibodies directed against the isopeptides produced by the TG reaction, could make it possible to differentiate between benign tumor and malignant tumor and possibly to classify the intermediate states, which always pose problems to pathologists.
La TG plasmatique (facteur XIII de coagulation) pourrait également jouer un rôle indirect dans le développement tumoral de nombreuses tumeurs solides sont entourées d'un
manchon de fibrine (Chew et Wallace, 1976). Ces molé
cules de fibrine réticulées par action du facteur XIII
pourraient masquer les antigènes tumoraux et donc la
reconnaissance des cellules tumorales par les cellules
immunocompétentes.Plasma TG (coagulation factor XIII) could also play an indirect role in tumor development Many solid tumors are surrounded by a
fibrin sleeve (Chew and Wallace, 1976). These molé
fibrin cells crosslinked by the action of factor XIII
could mask tumor antigens and therefore
recognition of tumor cells by cells
immunocompetent.
le DFMO ajouté dans l'eau de boisson de souris
porteuses de tumeur de Lewis inhibe la croissance de la
tumeur primaire à 40-50 % et la formation de métastases
pulmonaires à 80 % (Sunkara et col., 1982). Or en plus
de son effet direct sur l'ODC, le DFMO est un inhibi
teur compétitif de TG (Delcros et al., 1984). Ceci est
à prendre en considération en interprétant les résul
tats des expériences in vivo. En effet, la TG plasma
tique (facteur XIII) pourrait être une cible privilé
giée du DFMO, ce qui expliquerait l'augmentation du
temps de coagulation observé chez les rats traités par
DFMO (Luk et col., 1983).DFMO added to the drinking water of mice
carriers of Lewis tumor inhibits the growth of
40-50% primary tumor and metastasis formation
80% pulmonary (Sunkara et al., 1982). Gold in addition
its direct effect on ODC, DFMO is an inhibitor
competitive agent of TG (Delcros et al., 1984). this is
to be taken into consideration when interpreting the results
states of in vivo experiments. Indeed, TG plasma
tick (factor XIII) could be a preferred target
of the DFMO, which would explain the increase in
clotting time observed in rats treated with
DFMO (Luk et al., 1983).
Par ailleurs, des méthodes capables de distinguer in vivo et/ou in vitro le fibrinogène de la fibrine ont été proposées : plusieurs équipes ont fait appel à des moyens immunologiques en développant les anticorps monoclonaux (AcM) spécifiques de la fibrine, qui ne réagissent pas avec le fibrinogène. In addition, methods capable of distinguishing in vivo and / or in vitro fibrinogen from fibrin have been proposed: several teams have used immunological means by developing monoclonal antibodies (MAbs) specific to fibrin, which do not react. with fibrinogen.
Pour ce faire, ils ont utilisé le fait que le clivage du fibrinogène par la thrombine fait apparaître sur la molécule de fibrine ainsi formée, des séquences peptidiques N-terminales nouvelles qui sont différentes de celles présentes sur la molécule de fibrinogène intacte. To do this, they used the fact that the cleavage of fibrinogen by thrombin causes the appearance on the fibrin molecule thus formed, of new N-terminal peptide sequences which are different from those present on the intact fibrinogen molecule.
L'immunisation des animaux avec cette fibrine génère des anticorps dirigés contre tous les épitopes sur la fibrine Certains de ces anticorps donnent des réactions croisées avec le fibrinogène natif, d'autres ne réagissent qu'avec la fibrine et plus particulièrement avec la nouvelle séquence N-terminale. Immunization of animals with this fibrin generates antibodies directed against all epitopes on fibrin Some of these antibodies give cross reactions with native fibrinogen, others only react with fibrin and more particularly with the new N sequence -terminal.
La synthèse chimique de ce peptide spécifique de la région N-terminale a permis de sélectionner un
AcM 59D8 spécifique (Hui et al. Science, 1983, 222, 1129) et de l'utiliser après marquage à 111In pour visualiser par immuno-scintigraphie les caillots formés expérimentalement chez le chien et le lapin (Knight et al. J.The chemical synthesis of this specific peptide of the N-terminal region made it possible to select a
Specific 59D8 mAb (Hui et al. Science, 1983, 222, 1129) and to use it after labeling at 111In to visualize by immunoscintigraphy the clots formed experimentally in dogs and rabbits (Knight et al. J.
Nuclear Med., 1988, 29, 494).Nuclear Med., 1988, 29, 494).
Plusieurs autres AcM, capables de réagir spécifiquement avec la fibrine ont été décrits. Several other MAbs capable of reacting specifically with fibrin have been described.
Deux des AcM les plus utilisés sont DD-1C3/108 (Elms et al., Thromb Haemostas, 1983, 50,
591-594), DD3B6 disponible commercialement chez American
Diagnostica, Greenwich, C.T.Two of the most widely used mAbs are DD-1C3 / 108 (Elms et al., Thromb Haemostas, 1983, 50,
591-594), DD3B6 commercially available from American
Diagnostica, Greenwich, CT
Cependant, ces AcM présentent des inconvénients
DD-1C3/108 réagit avec le D-Dimer de la fibrine et également avec les produits de dégradation de la fibrine de haut poids moléculaire contenant des chaînes y-7 (Elms et al., 1983),
DD3B6 réagit avec un épitope présent sur le fragment D qu'il soit sous forme monomérique ou sous forme dimérique D-Dimer (Devine et Greenberg, A.J.C.P. 1988, 89, p. 663-666).However, these MAbs have drawbacks
DD-1C3 / 108 reacts with fibrin D-Dimer and also with high molecular weight fibrin degradation products containing γ-7 chains (Elms et al., 1983),
DD3B6 reacts with an epitope present on fragment D, whether in monomeric form or in dimeric D-Dimer form (Devine and Greenberg, AJCP 1988, 89, p. 663-666).
Or la forme e la fibrine qui constitue un marqueur pour la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) et pour les infractus du myocarde, est la forme dimérique, D-Dimer. Now the form of fibrin, which constitutes a marker for disseminated intravascular coagulation (DIC) and for myocardial infracti, is the dimeric form, D-Dimer.
Il est donc clair que DD3 B6 qui est l'AcM le plus utilisé à l'heure actuelle dans les coffrets de diagnostic pour les déterminations du taux de D-Dimer, par agglutination et par ELISA, n'a pas la spécificité absolue requise pour mesurer le D-Dimer en présence de
D-monomère du fait de sa réaction avec la fibrine non-réticulée (Devine et Greenberg, A.J.C.P., 1988, 89, p. 663-666).It is therefore clear that DD3 B6, which is the mAb most used at present in diagnostic kits for determinations of the D-Dimer rate, by agglutination and by ELISA, does not have the absolute specificity required for measure the D-Dimer in the presence of
D-monomer due to its reaction with non-crosslinked fibrin (Devine and Greenberg, AJCP, 1988, 89, p. 663-666).
L'imagerie des thrombi a fait l'objet de recherches en médecine nucléaire depuis de nombreuses années. Toutefois, aucune des techniques proposées (HSA, 99mTc-HSA, sérum-albumine, MBA marqué au 99mTc ; fibrinogène marqué à 123I, 131I-streptokinase, TPA marqué à 1' 1111n, 99mTc-plasmine, 1311-strombospondine, entre autres) n'a eu que des applications étendues du fait de son manque de sensibilité et/ou de spécificité. Imaging of thrombi has been the subject of research in nuclear medicine for many years. However, none of the proposed techniques (HSA, 99mTc-HSA, serum albumin, MBA labeled with 99mTc; fibrinogen labeled with 123I, 131I-streptokinase, TPA labeled with 1111n, 99mTc-plasmin, 1311-strombospondin, among others) n 'has had wide application due to its lack of sensitivity and / or specificity.
De même en ce qui concerne les plaquettes autologues marquées à l'1llIn, elles requièrent beaucoup de temps et d'adresse technique pour la séparation et le marquage de plaquettes fonctionnellement actives.Likewise with regard to autologous platelets labeled with 111In, they require a great deal of time and technical skill for the separation and labeling of functionally active platelets.
Des Anticorps monoclonaux ont été produits contre les plaquettes, mais ils ne peuvent pas être utilisés dans d'autres cas que pour la détection de thrombi récents, en cours de développement. De plus, l'administration d'héparine, en pareils cas, rend inutilisable ce genre d'anticorps. Monoclonal Antibodies have been produced against platelets, but they cannot be used for anything other than the detection of recent, developing thrombi. In addition, the administration of heparin in such cases renders this type of antibody unusable.
On connait également des anticorps antifibrine qui, toutefois, ne reconnaissent que la fibrine libre et non la fibrine réticulée. Antifibrin antibodies are also known which, however, recognize only free fibrin and not crosslinked fibrin.
La présente Invention s'est en conséquence donné pour but de pourvoir à des anticorps spécifiques de la liaison isopeptidique induite par des transglutaminases, propres à-permettre la détection in vivo et/ou in vitro de l'isopeptide produit en présence de transglutaminase, qu'il s'agisse de l'isopeptide cellulaire ou extra-cellulaire. The aim of the present invention is therefore to provide antibodies specific for the isopeptide binding induced by transglutaminases, suitable for enabling the in vivo and / or in vitro detection of the isopeptide produced in the presence of transglutaminase, which 'it is the cellular or extracellular isopeptide.
La présente Invention s'est également donné pour but de pourvoir à un immunogène protéique contenant ladite liaison isopeptidique et propre à permettre, par immunisation de mammifères appropriés, l'obtention des anticorps susdits dirigés contre l'isopeptide produit en présence de transglutaminase, et également propre à permettre le dosage d'immuncomplexes contenant des anticorps dirigés contre ledit isopeptide. The object of the present invention is also to provide a protein immunogen containing said isopeptide bond and capable of making it possible, by immunization of appropriate mammals, to obtain the aforesaid antibodies directed against the isopeptide produced in the presence of transglutaminase, and also suitable for allowing the assay of immune complexes containing antibodies directed against said isopeptide.
La présente invention a pour objet des anticorps qui reconnaissent de façon spécifique l'isopeptide NE-(y-glutamyl)-lysine formé sous l'action de la transglutaminase, entre le groupe -carboxamide d'un résidu glutamine présent dans une protéine et le groupe -NH2 de la lysine ou entre le groupe e-NH2 d'un résidu lysine libre ou présent dans une protéine et le groupe T-carboxyle de l'acide glutamique libre ou présent dans une protéine, ou des fragments desdits anticorps. The present invention relates to antibodies which specifically recognize the isopeptide NE- (y-glutamyl) -lysine formed under the action of transglutaminase, between the -carboxamide group of a glutamine residue present in a protein and the -NH2 group of lysine or between the e-NH2 group of a lysine residue free or present in a protein and the T-carboxyl group of glutamic acid free or present in a protein, or fragments of said antibodies.
Selon un mode de réalisation de l'invention, lesdits anticorps spécifiques sont des anticorps polyclonaux obtenus par immunisation d'un mammifère approprié à l'aide d'un immunogène convenable, contenus dans le sérum prélevé chez ce dernier et, éventuellement, isolés dudit sérum par des techniques de purification appropriées. According to one embodiment of the invention, said specific antibodies are polyclonal antibodies obtained by immunization of a suitable mammal with the aid of a suitable immunogen, contained in the serum taken from the latter and, optionally, isolated from said serum. by appropriate purification techniques.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, lesdits anticorps spécifiques sont des anticorps monoclonaux obtenus par immunisation d'un mammifère approprié à l'aide d'un immunogène convenable, suivie de la fusion des -cellules spléniques prélevées chez ledit mammifère immunisé, avec les cellules d'un myélome judicieusement choisi, d'un mammifère de même espèce, sélection des hybridomes secrétant les anticorps recherchés, clonage, culture et collecte des anticorps monoclonaux spécifiques. According to another advantageous embodiment of the invention, said specific antibodies are monoclonal antibodies obtained by immunization of a suitable mammal with the aid of a suitable immunogen, followed by the fusion of the splenic cells taken from said immunized mammal. , with the cells of a carefully chosen myeloma, of a mammal of the same species, selection of the hybridomas secreting the desired antibodies, cloning, culture and collection of the specific monoclonal antibodies.
Conformément à la présente invention, celle-ci a également pour objet un immunogène propre à être mis en oeuvre pour l'immunisation de mammifères appropriés en vue de la production d'anticorps spécifiques dirigés contre l'isopeptide N-(Y-glutamyl)-lysine et, de plus, propre à être mis en oeuvre pour le dosage d'anticorps dirigés contre ledit isopeptide, contenus dans des immuncomplexes, lequel immunogène est caractérisé en ce qu'il est constitué par une protéine contenant de l'acide glutamique, conjuguée par l'intermédiaire du groupe y-carboxyle dudit acide au groupe e-NH2 d'un résidu lysine contenu dans une protéine appropriée. In accordance with the present invention, the latter also relates to an immunogen suitable for being used for the immunization of mammals suitable for the production of specific antibodies directed against the isopeptide N- (Y-glutamyl) - lysine and, moreover, suitable for being used for the assay of antibodies directed against said isopeptide, contained in immunocomplexes, which immunogen is characterized in that it consists of a protein containing glutamic acid, conjugated through the y-carboxyl group of said acid to the e-NH 2 group of a lysine residue contained in a suitable protein.
Selon une disposition avantageuse de l'invention, les anticorps monoclonaux spécifiques susdits sont sous forme libre. According to an advantageous arrangement of the invention, the aforementioned specific monoclonal antibodies are in free form.
Selon une autre disposition avantageuse de l'invention, lesdits anticorps monoclonaux spécifiques sont immobilisés sur des supports insolubles appropriés. According to another advantageous arrangement of the invention, said specific monoclonal antibodies are immobilized on suitable insoluble supports.
Selon encore une autre disposition avantageuse de l'invention, l'immunogène susdit est immobilisé sur un support insoluble approprié. According to yet another advantageous arrangement of the invention, the aforementioned immunogen is immobilized on a suitable insoluble support.
Conformément à une modalité avantageuse de l'invention, lesdits anticorps monoclonaux sont marqués à l'aide de tous marqueurs appropriés. In accordance with an advantageous form of the invention, said monoclonal antibodies are labeled using any suitable markers.
De façon plus spécifique, lesdits anticorps monoclonaux sont marqués à l'aide de radio-éléments appropriés, notamment lorsqu'ils sont destinés à être mis en oeuvre en imagerie, auquel cas ils sont avantageusement marqués par tous radio-éléments usuels, notamment par 123I, 13lI, 1loin, 99MTc. Lorsqu'ils sont destinés à être mis en- oeuvre dans des tests de diagnostic in vitro, lesdits anticorps monoclonaux sont marqués à l'aide de tous marqueurs convenables tels que radio-éléments, marqueurs enzymatiques, marqueurs fluorescents, luminescents, notamment, entre autres. More specifically, said monoclonal antibodies are labeled using appropriate radioelements, in particular when they are intended to be used in imaging, in which case they are advantageously labeled with all the usual radioelements, in particular with 123I. , 13II, 1distance, 99MTc. When they are intended to be used in in vitro diagnostic tests, said monoclonal antibodies are labeled using any suitable markers such as radioelements, enzymatic markers, fluorescent markers, luminescent markers, in particular, among others. .
La présente invention a en outre pour objet un agent de diagnostic in vitro de lésions ou de tumeurs de tissus mammaires ou colorectaux humains, par techniques immunohistochimiques sur des biopsies desdits tissus, caractérisé en ce qu'il est constitué par ledit anticorps spécifique polyclonal ou monoclonal, de préférence sous forme libre, convenablement marqué. The present invention also relates to an agent for in vitro diagnosis of lesions or tumors of human mammary or colorectal tissues, by immunohistochemical techniques on biopsies of said tissues, characterized in that it consists of said specific polyclonal or monoclonal antibody , preferably in free form, suitably labeled.
La présente invention a, de plus, pour objet un agent de diagnostic in vitro, de maladies cardiovasculaires et de maladies virales accompagnées de séquelles telles que fièvre hémorragique, caractérisé en ce qu'il est constitué par ledit anticorps spécifique monoclonal, de préférence immobilisé sur un support insoluble, convenablement marqué. The present invention further relates to an agent for in vitro diagnosis of cardiovascular diseases and viral diseases accompanied by sequelae such as hemorrhagic fever, characterized in that it consists of said specific monoclonal antibody, preferably immobilized on an insoluble support, suitably labeled.
La présente invention a également pour objet un agent de diagnostic in vivo de tumeurs malignes et de maladies cardiovasculaires, caractérisé en ce qu'il est constitué par ledit anticorps monoclonal spécifique, ou l'un des ses fragments, sous forme libre, convenablement marqué. A subject of the present invention is also an agent for the in vivo diagnosis of malignant tumors and cardiovascular diseases, characterized in that it consists of said specific monoclonal antibody, or one of its fragments, in free form, suitably labeled.
La présente invention a, par ailleurs, pour objet une composition thérapeutique caractérisée en ce qu'elle comprend ledit anticorps monoclonal spécifique, ou l'un de ses fragments, couplé à au moins une enzyme protéolytique appropriée ou à un médicament convenable. A subject of the present invention is, moreover, a therapeutic composition characterized in that it comprises said specific monoclonal antibody, or one of its fragments, coupled to at least one suitable proteolytic enzyme or to a suitable drug.
Conformément à l'invention, ledit anticorps ou l'un de ses fragments, peut avantageusement servir de vecteur à une enzyme protéolytique choisie dans le groupe qui comprend notamment, mais non limitativement, l'urokinase, la streptokinase, le TPA. In accordance with the invention, said antibody or one of its fragments can advantageously serve as a vector for a proteolytic enzyme chosen from the group which comprises in particular, but not limited to, urokinase, streptokinase, TPA.
La présente invention a encore pour objet un agent de détection d'anticorps dirigés contre un isopeptide formé sous l'action de la transglutaminase, présents dans un tissu ou un fluide corporel, notamment sous la forme d'immuncomplexes, caractérisé en ce qu'il est constitué par un isopeptide formé d'une protéine contenant un résidu glutamine, conjuguée par l'intermédiaire du groupe 7-carboxamide de ce dernier au groupe e-NH2 d'un résidu lysine contenu dans une protéine appropriée, lequel isopeptide est, si on le désire, convenablement marqué. A subject of the present invention is also an agent for detecting antibodies directed against an isopeptide formed under the action of transglutaminase, present in a tissue or a body fluid, in particular in the form of immune complexes, characterized in that it consists of an isopeptide formed from a protein containing a glutamine residue, conjugated through the 7-carboxamide group of the latter to the e-NH2 group of a lysine residue contained in a suitable protein, which isopeptide is, if one desire, suitably marked.
Conformément à l'invention, ledit anticorps peut se présenter soit sous forme d'Immunoglobulines entières, soit sous forme de fragments Fab, Fat'2 etc... According to the invention, said antibody can be either in the form of whole immunoglobulins, or in the form of Fab, Fat'2, etc ... fragments.
chimérisés ou non. chimerized or not.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. In addition to the foregoing arrangements, the invention also comprises other arrangements, which will emerge from the description which follows.
L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples d'obtention d'anticorps et d'immunogènes conformes à la présente invention et à la vérification de leur activité. The invention will be better understood with the aid of the additional description which follows, which refers to examples of obtaining antibodies and immunogens in accordance with the present invention and to the verification of their activity.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples et les parties descriptives correspondantes sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. It should be understood, however, that these examples and the corresponding descriptive parts are given only by way of illustration of the object of the invention, of which they in no way constitute a limitation.
EXEMPLES
EXEMPLE I - Préparation d'AcM
1) Préparation de l'immunogène
A 1.36 mg de Keyhole Limpet Hemocyanine (KLH) en solution dans lml de tampon phosphate 10 mM pH6 ont été ajoutés 8,7 mg (20 moles) de N-a-CBZ-lysine-pnitrophenyl ester qui sera désigné ci-après sous le nom de" (Z-lys) " en présence de 3,8 mg (20 moles) de 1 -éthyl3 (3-dimethyl aminopropyl) -carbodiimide (EDC). Le mélange a été laissé à la température de la pièce avec agitation douce pendant 6 h.EXAMPLES
EXAMPLE I - Preparation of mAb
1) Preparation of the immunogen
To 1.36 mg of Keyhole Limpet Hemocyanine (KLH) in solution in 1 ml of 10 mM phosphate buffer pH6 was added 8.7 mg (20 moles) of Na-CBZ-lysine-pnitrophenyl ester which will be referred to below under the name of "(Z-lys)" in the presence of 3.8 mg (20 moles) of 1 -ethyl3 (3-dimethyl aminopropyl) -carbodiimide (EDC). The mixture was left at room temperature with gentle stirring for 6 h.
A la fin de cette période, les produits so- lubles ont été éliminés par dialyse prolongée (4 x 30mn) contre le tampon phosphate IOmM pH6. L'adsorption (W) du
CBZ a permis de déterminer que 3,7 Rmoles Z-lys étaient couplées par mg KLH.At the end of this period, the soluble products were removed by prolonged dialysis (4 x 30mn) against 10mM phosphate buffer pH6. Adsorption (W) of
CBZ determined that 3.7 Rmoles Z-lys were coupled per mg KLH.
2) Préparation de l'antigène pour déterminer le taux d'anticorps dans les sérums de souris, les milieux de culture et les liquides d'ascites de souris. 2) Preparation of the antigen for determining the level of antibodies in mouse sera, culture media and mouse ascites fluids.
Afin de diminuer les réactions croisées avec la KLH qui a servi comme-immunogène, le (Z-lys) a été couplé à la sérum albumine bovine (BSA) dans les conditions identiques à celles décrites ci-dessus. In order to decrease the cross reactions with the KLH which served as immunogen, the (Z-lys) was coupled to bovine serum albumin (BSA) under the conditions identical to those described above.
3) Immunisation des souris
Les souris femelles Balb/C agées de 6 à 8 semaines ont chacune été injectées par voie intraperitonéale (IP) au premier jour (JO) avec 100 pig de KLH-Z-lys emulsifiés avec un volume égal (100F1) de l'adjuvant complet de Freund. A J12 et à J24, les animaux on reçu des rappels de KLH-Z-Lys avec adjuvant incomplet de Freund, à des doses de 100 et 50g respectivement.3) Immunization of mice
The female Balb / C mice aged 6 to 8 weeks were each injected intraperitoneally (IP) on the first day (D0) with 100 pig of KLH-Z-lys emulsified with an equal volume (100F1) of the complete adjuvant. by Freund. On D12 and D24, the animals received boosters of KLH-Z-Lys with incomplete Freund's adjuvant, at doses of 100 and 50 g respectively.
4) Détermination du taux d'anticorps des souris immunisées. 4) Determination of the antibody level of the immunized mice.
Les serums prélevés tous les 10 jours par ponction rétro-orbitale ont été éprouvés pour leur taux en anticorps anti Ne(yglu)lys par leur réaction avec la
BSA-Z-lys adsorbée sur nitrocellulose (Dot-blot).The sera collected every 10 days by retro-orbital puncture were tested for their anti-Ne (yglu) lys antibody level by their reaction with the
BSA-Z-lys adsorbed on nitrocellulose (Dot-blot).
5) Fusion de cellules et sélection des clones
Les souris présentant les taux d'anticorps les plus élevés ont été sacrifiées, les rates prélevées et les cellules spléniques ont été fusionnées avec les cellules du myélome de souris Sp2/OAgl4 selon le procédé classique de Kohler & Milstein (1975).5) Cell fusion and selection of clones
The mice exhibiting the highest antibody levels were sacrificed, the spleens removed and the spleen cells were fused with the mouse myeloma cells Sp2 / OAgl4 according to the standard method of Kohler & Milstein (1975).
Les clones sécrétant des Ac ont été sélection- nés par Dot-blot et sub-clonés par la méthode de dillution limite. The Ac secreting clones were selected by dot blotting and subcloned by the limit dilution method.
Sur 720 puits ensemencés, 102 ont donné une réaction positive avec la BSA-Z-lys, un rendement de 14,2 %. Of 720 seeded wells, 102 gave a positive reaction with BSA-2-lys, a yield of 14.2%.
20 des 102 hybridomes ont été sélectionnés selon le critère de l'intensité de la réaction positive de leur milieu avec la BSA-Z-lys en Dot-blot. Elles ont été clonées par la méthode de dilution limite dans les plaques à 96 puits. A partir de ce clonage, 85 clones ont été sélectionnés : 5 d'entre eux (71A3fl, 81AlblO, 81Dlc2,81Dlell et 82D6g7) dont les milieux montraient une forte immunoréactivité avec la BSA-Z-lys ont été retenus. 20 of the 102 hybridomas were selected according to the criterion of the intensity of the positive reaction of their medium with BSA-Z-lys in Dot-blot. They were cloned by the limit dilution method in 96-well plates. From this cloning, 85 clones were selected: 5 of them (71A3fl, 81Alb10, 81Dlc2,81Dlell and 82D6g7) whose media showed strong immunoreactivity with BSA-Z-lys were selected.
Ils ont été cultivés par la suite dans les fioles de 75 cm2 pour la préparation des AcM en quantité plus grande. They were subsequently cultured in the 75 cm 2 flasks for the preparation of mAbs in a larger quantity.
6) Détermination de la sous-classe d'Immunoglobuline (Ig). 6) Determination of the Immunoglobulin (Ig) subclass.
La sous-classe d'Ig produite par chaque clone a été déterminée par Dot-blot à l'aide de sérums de lapin spécifiques de chaque sous-classe. Le coffret provenant de ZYMED (Laboratories, INC - U.S.A) a été utilisé selon les instructions fournies par le fabricant. The Ig subclass produced by each clone was determined by Dot-blotting using rabbit sera specific for each subclass. The kit from ZYMED (Laboratories, INC - U.S.A) was used according to the instructions provided by the manufacturer.
EXEMPLE II
REACTIVITE A L'AcM de l'EXEMPLE J DE TISSUS
FIXES PUIS INCLUS EN PARAFFINE : COMPARAISON
BENIN / MALIN / ETATS INTERMEDIAIRES.EXAMPLE II
REACTIVITY TO mAb of EXAMPLE J TISSUES
FIXED THEN INCLUDED IN PARAFFIN: COMPARISON
BENIN / MALIN / INTERMEDIATE STATES.
Les tissus sont fixés dans la solution de
Bouin (acide picrique, formol, acide acétique) puis inclus en paraffine. Pour chaque biopsie étudiée, 3 coupes de 5clam sont déparaffinées puis traitées avec l'AcM concentré : 1/8 ou 1/2 et 1 témoin sans AcM. La réaction positive à l'anticorps anti Glu-Lys est révélée sur les coupes par la présence d'un chromogène rouge. Les noyaux sont contre-colorés en bleu.The tissues are fixed in the solution of
Bouin (picric acid, formalin, acetic acid) then included in paraffin. For each biopsy studied, 3 5clam sections are deparaffinized and then treated with concentrated mAb: 1/8 or 1/2 and 1 control without mAb. The positive reaction to the anti Glu-Lys antibody is revealed on the sections by the presence of a red chromogen. The nuclei are counterstained blue.
Une coupe adjacente est traitée à l'hématoxyline-safran -éosine pour servir de référence histopathologique. An adjacent section is treated with hematoxylin-saffron -eosin to serve as a histopathological reference.
Ont été examinés
- 34 carcinomes infiltrants galactophoriques (4 différenciés, 14 moyennement différenciés et 16 indifférenciés) dont 16 étaient associés sur la même coupe avec des zones bénignes,
- 11 carcinomes in situ dont 9 associés à du tissu bénin sur la même coupe.Have been examined
- 34 infiltrating galactophoric carcinomas (4 differentiated, 14 moderately differentiated and 16 undifferentiated) of which 16 were associated on the same section with benign areas,
- 11 carcinomas in situ including 9 associated with benign tissue on the same section.
Outre ces zones bénignes mitoyennes des carcinomes, 38 mastopathies fibrokystiques ou fibrohyperplasiques typiques dont 11 étaient associées à des métaplasies idrosadénoides, 10 à des hyperplasies atypiques, 11 à du sclerosing adenosis, ont été observées. In addition to these benign areas adjoining carcinomas, 38 typical fibrocystic or fibrohyperplastic mastopathies, 11 of which were associated with idrosadenoid metaplasias, 10 with atypical hyperplasias, 11 with sclerosing adenosis, were observed.
L'AcM conforme à l'invention ne réagit qu'avec la chromatie cellulaire. Les acini glandulaires encore organisées réagissent avec l'AcM alors que les cellules tumorales toutes proches ne sont pas réactives. A l'intérieur même d'un groupe d'acini les cellules tumorales apparaissent négatives. The mAb in accordance with the invention reacts only with cell chromaty. The glandular acini which are still organized react with the MAb while the nearby tumor cells are not reactive. Even within a group of acini tumor cells appear negative.
Afin de comparer la réactivité des différentes cellules sur les coupes, les Inventeurs ont estimé sur chaque coupe le pourcentage de la population cellulaire réagissant avec l'AcM soit 0%, in férieur à 10%, compris entre 10 et 50% ou supérieur à 50%. In order to compare the reactivity of the different cells on the sections, the Inventors estimated on each section the percentage of the cell population reacting with the mAb, ie 0%, less than 10%, between 10 and 50% or greater than 50%. %.
Comme le montre le tableau I ci-après, tandis que 88 % (soit 30 sur 34) des malins invasifs ne réagissent pas avec l'AcM conforme à l'invention, c'est le cas seulement pour 20 % (soit 13 sur 63) des mastopathies bénignes ; 7 carcinomes in situ sur 10 (cribriforme) se comportent comme la majorité des carcinomes infiltrants ; 7 hyperplasies atypiques Sur 10 et 8 cas de Sclerosing adenosis sur 11 se comportent comme la grande majorité des coupes bénignes. As shown in Table I below, while 88% (i.e. 30 out of 34) of invasive malignancies do not react with the mAb according to the invention, this is the case only for 20% (i.e. 13 out of 63). ) benign mastopathies; 7 out of 10 carcinomas in situ (cribriform) behave like the majority of invasive carcinomas; 7 atypical hyperplasias out of 10 and 8 cases of Sclerosing adenosis out of 11 behave like the vast majority of benign cuts.
Pour savoir si les différences de réactivité observées étaient significatives, les Inventeurs ont réalisé un test de Chi2 en regroupant les classes pour ne garder que 2 groupes : le négatif (inférieur à 10 %) et le positif (supérieur à 10 %). Le calcul de Chi2 (avec la correction de Yates) montre que la réactivité des cellules de chaque type histologique à l'AcM apparait significative (p 0.001) entre
- bénin et carcinome invasif,
- hyperplasie atypique et carcinome invasif,
- sclerosing adenosis et carcinome invasif,
- bénin et carcinome in situ. To find out whether the differences in reactivity observed were significant, the Inventors carried out a Chi2 test by grouping the classes together to keep only 2 groups: the negative (less than 10%) and the positive (greater than 10%). Calculation of Chi2 (with Yates' correction) shows that the reactivity of cells of each histological type to mAb appears significant (p 0.001) between
- benign and invasive carcinoma,
- atypical hyperplasia and invasive carcinoma,
- sclerosing adenosis and invasive carcinoma,
- benign and carcinoma in situ.
TABLEAU I
<SEP> N <SEP> cas <SEP> observés <SEP> Fibrokystique <SEP> Hyperplasie <SEP> Sclerosing <SEP> Carcinome <SEP> Carcinome
<tb> % <SEP> de <SEP> cellules <SEP> Fibrohyperplasique <SEP> atypique <SEP> Adenosis <SEP> in <SEP> situ <SEP> invasif
<tb> réagissant <SEP> avec <SEP> ( <SEP> n <SEP> = <SEP> 63) <SEP> (n <SEP> = <SEP> 10) <SEP> (n <SEP> = <SEP> 11) <SEP> (n <SEP> = <SEP> 10) <SEP> (n <SEP> = <SEP> 34)
<tb> l'AcM <SEP> de <SEP> l'Invention
<tb> <SEP> 0 <SEP> 7 <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 5 <SEP> 23
<tb> AcM <SEP> 0 <SEP> à <SEP> 10 <SEP> 6 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> 7
<tb> <SEP> 1/2 <SEP> 10 <SEP> à <SEP> 50 <SEP> 14 <SEP> 4 <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> 2
<tb> <SEP> 50 <SEP> à <SEP> 100 <SEP> 36 <SEP> 3 <SEP> 5 <SEP> 2 <SEP> 2
<tb> <SEP> 0 <SEP> 15 <SEP> 5 <SEP> 3 <SEP> 13 <SEP> 35
<tb> AcM <SEP> 0 <SEP> à <SEP> 10 <SEP> 5 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> <SEP> 1/8 <SEP> 10 <SEP> à <SEP> 50 <SEP> 18 <SEP> 4 <SEP> 6 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> <SEP> 50 <SEP> à <SEP> 100 <SEP> 20 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> Le calcul de Chi2 avec la correction de Yates montre que la différence de réactivité des cellules avec l'AcM de L'Exemple 1 est :
Significative entre : . BENIN et CARCINOME INVASIF (AcM 1/2 ou 1/8 : p 0.001) . HYPERPLASIE ATYPIQUE et CARCINOME INVASIF (AcM 1/2 : p 0.001, AcM 1/8 : p 0.01) . SCLEROSING ADENOSIS et CARCINOME INVASIF (AcM 1/2 : p 0.001, AcM 1/8 : p 0.01) . BENIN et CARCINOME IN SITU (AcM 1/2 : p 0.01, A M 1/8 : p 0.001)
La présence d'isopeptides Glu-Lys constitue donc un marqueur fiable qui différencie nettement le tissu malin du tissu bénin sur coupes Ristologiques.<SEP> N <SEP> observed <SEP> cases <SEP> Fibrocystic <SEP> Hyperplasia <SEP> Sclerosing <SEP> Carcinoma <SEP> Carcinoma
<tb>% <SEP> of <SEP> cells <SEP> Fibrohyperplastic <SEP> atypical <SEP> Adenosis <SEP> in <SEP> situ <SEP> invasive
<tb> reacting <SEP> with <SEP>(<SEP> n <SEP> = <SEP> 63) <SEP> (n <SEP> = <SEP> 10) <SEP> (n <SEP> = <SEP > 11) <SEP> (n <SEP> = <SEP> 10) <SEP> (n <SEP> = <SEP> 34)
<tb> AcM <SEP> of <SEP> Invention
<tb><SEP> 0 <SEP> 7 <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 5 <SEP> 23
<tb> AcM <SEP> 0 <SEP> to <SEP> 10 <SEP> 6 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> 7
<tb><SEP> 1/2 <SEP> 10 <SEP> to <SEP> 50 <SEP> 14 <SEP> 4 <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> 2
<tb><SEP> 50 <SEP> to <SEP> 100 <SEP> 36 <SEP> 3 <SEP> 5 <SEP> 2 <SEP> 2
<tb><SEP> 0 <SEP> 15 <SEP> 5 <SEP> 3 <SEP> 13 <SEP> 35
<tb> AcM <SEP> 0 <SEP> to <SEP> 10 <SEP> 5 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb><SEP> 1/8 <SEP> 10 <SEP> to <SEP> 50 <SEP> 18 <SEP> 4 <SEP> 6 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb><SEP> 50 <SEP> to <SEP> 100 <SEP> 20 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> Calculation of Chi2 with Yates' correction shows that the difference in reactivity of cells with mAb from Example 1 is:
Significant between:. BENIN and INVASIVE CARCINOMA (mAb 1/2 or 1/8: p 0.001). ATYPICAL HYPERPLASIA and INVASIVE CARCINOMA (mAb 1/2: p 0.001, mAb 1/8: p 0.01). SCLEROSING ADENOSIS and INVASIVE CARCINOMA (mAb 1/2: p 0.001, mAb 1/8: p 0.01). BENIN and CARCINOMA IN SITU (AcM 1/2: p 0.01, AM 1/8: p 0.001)
The presence of Glu-Lys isopeptides therefore constitutes a reliable marker which clearly differentiates malignant tissue from benign tissue on histological sections.
EXEMPLE III
DOSAGE DES PRODUITS DE REACTION TG EN FONCTION
DE LA CROISSANCE CELLULAIRE
Des cellules HEp2 ou MRC5 sont trypsinées puis ensemencées dans une boîte de Petri contenant du milieu de culture et une lame de verre. La lame couverte de cellules est prélévée à différents temps de culture. Les cellules sont fixées en acétone. Pour tester l'ensemble des produits de réaction TG, en plus du test de réactivité à l'AcM anti Glu - Lys, les Inventeurs ont testé la réactivité des cellules à l'antisérum antiPA. L'AcM conforme à l'invention réagit uniquement avec le noyau aussi bien pour Hep2 que pour MRC5 comme le font les cellules des biopsies.EXAMPLE III
DOSAGE OF TG REACTION PRODUCTS IN FUNCTION
OF CELLULAR GROWTH
HEp2 or MRC5 cells are trypsinized and then seeded in a Petri dish containing culture medium and a glass slide. The slide covered with cells is taken at different culture times. The cells are fixed in acetone. To test all of the TG reaction products, in addition to the anti-Glu-Lys mAb reactivity test, the inventors tested the reactivity of the cells to antiPA antiserum. The mAb in accordance with the invention reacts only with the nucleus, both for Hep2 and for MRC5, as do the cells of the biopsies.
Afin de quantifier la réaction, les Inventeurs ont fait pousser les cellules dans des plaques de microtitration et après traitement avec les anticorps spécifiques le chromogène qui reste soluble donne une réaction colorée lisible à 490 nm sur un lecteur de plaque. In order to quantify the reaction, the inventors grew the cells in microtiter plates and after treatment with the specific antibodies, the chromogen which remains soluble gives a colored reaction which can be read at 490 nm on a plate reader.
L'immunomarquage varie pendant la croissance cellulaire.Immunostaining varies during cell growth.
Ces variations sont corrélées avec celles de l'activité TG, sur les homogénats cellulaires. Cette activité a été dosée en présence d'un excès de substrats exogènes : dimethylcaséine DMC (ler substrat) et 14C Put (2ème substrat). Dans ce cas, le seul facteur limitant de la réaction est la TG. Le témoin en absence de DMC renseigne sur la disponibilité de ler substrats endogènes. These variations are correlated with those of TG activity on cell homogenates. This activity was assayed in the presence of an excess of exogenous substrates: dimethylcasein DMC (1st substrate) and 14C Put (2nd substrate). In this case, the only limiting factor of the reaction is the TG. The control in the absence of DMC provides information on the availability of endogenous substrates.
EXEMPLE IV
Dosage, au niveau plasmatique, d'anticorps
anti-isopeptide sous forme d'immuncomplexes.EXAMPLE IV
Assay, at plasma level, of antibodies
anti-isopeptide in the form of immune complexes.
Le dosage d'immuncomplexes par un "Covalent
Enzyyme Linked Immuno Assay" (CELIA) a été mis au point.The assay of immune complexes by a "Covalent
Enzyyme Linked Immuno Assay "(CELIA) has been developed.
Il permet, contrairement à toutes les autres techniques publiées à ce jour (liaison du Clq ou de la conglutinine, précipitation avec le polyethylène-glycol..) de mesurer le taux de l'anticorps faisant partie de l'immumcomplexe et qui est spécifique d'un antigène particulier.It makes it possible, unlike all the other techniques published to date (binding of Clq or of conglutinin, precipitation with polyethylene glycol, etc.) to measure the level of the antibody forming part of the immumcomplex and which is specific for 'a particular antigen.
Lorsqu'un sérum humain est dissocié à pH 2,25 puis réassocié in situ sur plaque-Spm à pH 8,1 son contenu en IgG antiSpm est augmenté de 9 fois par rapport au sérum non dissocié. L'augmentation est de 2 fois pour les IgM anti-Spm. When a human serum is dissociated at pH 2.25 and then reassociated in situ on a Spm plate at pH 8.1, its antiSpm IgG content is increased by 9 times compared with the undissociated serum. The increase is 2 times for anti-Spm IgM.
Cette observation n'est pas restreinte à un seul sérum : pour 9 autres sérums de malades bronchopulmonaires, leur contenu en IgG antiSpm est accru de 2,7 à 13,5 fois après dissociation et réassociation par rapport à celui des sérums non dissociés. This observation is not restricted to a single serum: for 9 other sera from bronchopulmonary patients, their antiSpm IgG content is increased by 2.7 to 13.5 times after dissociation and reassociation compared to that of non-dissociated sera.
Une différence significative est toutefois notée : pour 5 sur 6 des sérums de malades cancéreux l'augmentation est moins que 8,5 fois tandis que pour les 3 sérums de malades témoins elle est supérieure à 10,6 fois. A significant difference is however noted: for 5 out of 6 sera from cancer patients the increase is less than 8.5 times while for the 3 sera from control patients it is greater than 10.6 times.
EXEMPLE V
Détermination de la spécificite des AcM
vis-à-vis de la fibrine et du D-Dimer
a-envers le fibrinogène, la fibrine et la
BSA-Z lys.EXAMPLE V
Determination of the specificity of mAbs
with respect to fibrin and D-Dimer
a-towards fibrinogen, fibrin and
BSA-Z lily.
Cette expérience a été effectuée par Dot-blot sur carrés de nitrocellulose sur chacun desquels ont été absorbés 2Rg de fibrinogène, de fibrine (en suspens ion fine obtenue par sonication), et de BSA-Z-lys. Les carrés ont été ensuite incubés avec un tampon (A) contenant 10 %
Régilait dans PBS pendant 30 mn à la température am biante. A la fin de cette période, les carrés ont été rincés avec PBS, puis mis à incuber avec le milieu de culture de l'AcM 71 A3fl dilué 1/100 dans un tampon (B) 0,1 % Tween 20 dans PBS.This experiment was carried out by Dot-blotting on nitrocellulose squares on each of which were absorbed 2Rg of fibrinogen, of fibrin (in fine suspension obtained by sonication), and of BSA-2-lys. The squares were then incubated with buffer (A) containing 10%
Regulated in PBS for 30 min at room temperature. At the end of this period, the squares were rinsed with PBS, then incubated with the culture medium of mAb 71 A3fl diluted 1/100 in buffer (B) 0.1% Tween 20 in PBS.
L'ensemble des carrés a été incubé pendant 2h à 37" C. All of the squares were incubated for 2 h at 37 ° C.
A la fin de la période d'incubation, les carrés de nitrocellulose ont été lavés tout d'abord avec le tampon B, ensuite traités avec les anticorps (mouton) marqués à 125I, dirigés contre les IgG de souris (AMERSHAM) dilués au 1/50 dans une suspension de Régilait dilué à 5 % dans le PBS. At the end of the incubation period, the nitrocellulose squares were first washed with buffer B, then treated with the antibodies (sheep) labeled at 125I, directed against mouse IgG (AMERSHAM) diluted to 1 / 50 in a suspension of Regilait diluted to 5% in PBS.
Après un temps de contact de 1 h à 37 C, les carrés ont été lavés plusieurs fois avec le tampon B jusqu'à ce que le liquide de lavage ne contienne plus de trace de I'125I. After a contact time of 1 h at 37 ° C., the squares were washed several times with buffer B until the washing liquid no longer contained any trace of 125 I.
La radioactivité retenue sur chaque carré a ensuite été déterminée dans un compteur 7. The radioactivity retained on each square was then determined in a counter 7.
b - envers la fibrine humaine formée in situ
A 4 tubes contenant chacun 0,5 ml de plasma humain prélevé sur citrate, a été ajouté CaC12 à une concentration finale de 40 mM.b - towards human fibrin formed in situ
To 4 tubes each containing 0.5 ml of human plasma collected on citrate, was added CaCl2 to a final concentration of 40 mM.
A 2 tubes contenant chacun 0,5 ml de plasma prélevé sur citrate a été ajouté du NaCl 0,14 M à la place de CaC12. To 2 tubes each containing 0.5 ml of plasma collected on citrate was added 0.14 M NaCl in place of CaCl2.
Tous les tubes ont été incubés une nuit à 37 C. Après cette période, ils ont été centrifugés à 700 g pendant 10 mn. All the tubes were incubated overnight at 37 ° C. After this period, they were centrifuged at 700 g for 10 min.
2 tubes de la série (A) et 2 tubes de la série (C) ont été lavés 3 fois avec le tampon B pour éliminer les traces de protéines plasmatiques. 2 tubes of series (A) and 2 tubes of series (C) were washed 3 times with buffer B to remove traces of plasma proteins.
Les tubes de la série (B) n'ont pas été lavés pour déterminer l'influence du lavage. The tubes of series (B) were not washed to determine the influence of washing.
A la fin de cette étape, 1 tube de chaque série a reçu 200 Al du milieu de culture de l'AcM 71A3fl et l'autre 200 Al d'un AcM irrelevant. At the end of this step, 1 tube of each series received 200 Al of the culture medium of MAb 71A3fl and the other 200 Al of irrelevant MAb.
Après incubation pendant 2 h à la température du laboratoire, tous les tubes ont été lavés par centrifugation avec le Tampon B. Cette étape était suivie par l'addition d'une solution diluée 1/50 ( 5 % Régilait dans
PBS) d'anticorps (mouton) marqués à 125I dirigés contre les IgG de souris. Après incubation pendant 2 h, à la température du laboratoire, les étapes de lavage et de mesure de la radioactivité étaient identiques à celles décrites ci-dessus.After incubation for 2 h at laboratory temperature, all the tubes were washed by centrifugation with Buffer B. This step was followed by the addition of a dilute solution 1/50 (5% regulated in
PBS) of antibodies (sheep) labeled with 125I directed against mouse IgGs. After incubation for 2 h at laboratory temperature, the steps for washing and measuring the radioactivity were identical to those described above.
c - envers le D-Dimer
1) Immobilisation de l'AcM par couplage direct
Les sphères paramagnétiques porteuses de groupements NH2 ont été utilisées. Les groupements NH2 ont été convertis en acide-hydrazide : CO-NH-NH2(AH) selon les techniques décrites dans l'Art antérieur
Des IgG spécifiques (71 A3 fl) ont été préparés à partir de liquide d'ascite.c - towards the D-Dimer
1) Immobilization of mAb by direct coupling
Paramagnetic spheres carrying NH 2 groups were used. The NH2 groups were converted into acid-hydrazide: CO-NH-NH2 (AH) according to the techniques described in the prior art.
Specific IgGs (71 A3 fl) were prepared from ascitic fluid.
50 \g de ces IgG purifiées ont été oxydés à l'aide de périodate de sodium et couplés à la fonction AH des sphères selon la méthode décrite. 50 μg of these purified IgGs were oxidized using sodium periodate and coupled to the AH function of the spheres according to the method described.
2) Immobilisation de l'AcM par immuno-capture
Dans ce cas, les IgG (chèvre) anti Fc souris ont été tout d'abord couplées par l'intermédiaire de liaisons hydrazone qui a été formée entre ces IgG oxydées et les groupements AH sur les sphères (Quash et al.,1989)
3,5 mg de ces sphères anti IgG de souris ont été ensuite mises à réagir directement avec 50 Rg d'IgG purifié (71 A3 fl) pendant 1 nuit à 4"C. Le lendemain, les sphères ont été lavées par plusieurs cycles d'aimantation, tout d'abord à l'aide du tampon B et ensuite par un tampon (C) contenant
- 0,05 M Tris ajusté à pH 8.1 avec l'acide
citrique,
- 0,1 % Tween 20 (V/V),
- 0,14 M NaCl. 2) Immobilization of mAb by immunocapture
In this case, the anti-mouse Fc (goat) IgGs were first of all coupled via hydrazone bonds which were formed between these oxidized IgGs and the HA groups on the spheres (Quash et al., 1989).
3.5 mg of these anti mouse IgG spheres were then reacted directly with 50 μg of purified IgG (71 A3 fl) overnight at 4 ° C. The next day, the spheres were washed by several cycles of d 'magnetization, first with the aid of buffer B and then with a buffer (C) containing
- 0.05 M Tris adjusted to pH 8.1 with acid
citric,
- 0.1% Tween 20 (V / V),
- 0.14 M NaCl.
1 mg de ces sphères-AcM ainsi lavées a été resuspendu dans 1 ml de tampon 1 et ajouté à 16 Al de plasma humain étalon contenant le D-Dimer (fourni par
STAGO).1 mg of these MAb-spheres thus washed was resuspended in 1 ml of buffer 1 and added to 16 Al of standard human plasma containing D-Dimer (supplied by
STAGO).
Après 1 nuit à 4"C, les sphères ont été lavées 3 fois avec le tampon (C) contenant 1 M NaC1 par aimentation pour éliminer toute protéine réagissant non spécifiquement avec les sphères-AcM. After 1 night at 4 ° C, the spheres were washed 3 times with buffer (C) containing 1 M NaCl by feeding to remove any protein reacting not specifically with the spheres-mAb.
Les sphères airrsi récupérées ont été soumises à l'électrophorèse en gel de polyacrylamide à 7,5 % dans des conditions non dénaturantes. The recovered airrsi spheres were subjected to 7.5% polyacrylamide gel electrophoresis under non-denaturing conditions.
d - envers les dipeptides
La spécificité fine d'un de ces AcM 71 A3 fl a été recherchée à l'aide du peptide homologue N (7-glu) lys et des peptides hétérologues Na - (α-glu)lys et Na (aglu)lys.d - towards dipeptides
The fine specificity of one of these MAbs 71 A3 fl was sought using the homologous peptide N (7-glu) lys and the heterologous peptides Na - (α; -glu) lys and Na (aglu) lys.
Chaque dipeptide à des concentrations variant de 0,03 Wmol à 1 Rmol, a été ajouté, à O,lml de milieu dilué 1/50 dans tampon (B). Le milieu dilué 1/50 additionné de 100 ptl de PBS servait de contrôle. Each dipeptide at concentrations varying from 0.03 Wmol to 1 Rmol was added to 0.1 ml of medium diluted 1/50 in buffer (B). The diluted 1/50 medium supplemented with 100 µl of PBS served as a control.
Après incubation pendant 1 h à 37"C, les milieux ainsi traités ont été mis en contact avec les carrés de nitrocellulose sur lesquels avaient été préalablement déposés 2Rg de BSA-Z-lys et incubés en présence de tampon (A). After incubation for 1 h at 37 ° C., the media thus treated were brought into contact with the nitrocellulose squares on which 2Rg of BSA-2-lys had previously been deposited and incubated in the presence of buffer (A).
L'ensemble des carrés et des milieux a été incubé pendant 2 h à 37 C. All of the squares and media were incubated for 2 h at 37 C.
A la fin de la période d'incubation, les carrés de nitrocellulose ont été lavés tout d'abord avec du tampon A et ensuite traités avec les anticorps (mouton) marqués à 125I dirigés contre les IgG de souris (Amersham
Code 1M 131) dilué au 1/50 dans PBS - Régilait 5 %.At the end of the incubation period, the nitrocellulose squares were first washed with buffer A and then treated with the antibodies (sheep) labeled with 125I directed against mouse IgGs (Amersham
Code 1M 131) diluted to 1/50 in PBS - Regulated 5%.
La suite de l'expérimentation est identique à celle décrite en (a). The rest of the experiment is identical to that described in (a).
EXEMPLE VI
Détermination de la spécificité de l'AcM
conforme à l'invention.EXAMPLE VI
Determination of the specificity of mAb
according to the invention.
La sélection des AcM a été effectuée à l'aide de l'isopeptide Na(7-glu)lys. Néanmoins, il a été vérifié si ces anticorps avaient une spécificité stricte pour le dipeptide homologue ou s'ils donnaient des réactions croisées avec d'autres dipeptides hétérologues contenant glu et lys tels que Na (r-glu)lys qui existe naturellement dans des proteines ou même avec N(a-glu)lys dont l'existence naturelle dans des proteines n'a pas encore été trouvée à ce jour. The selection of mAbs was carried out using the isopeptide Na (7-glu) lys. Nevertheless, it was verified whether these antibodies had strict specificity for the homologous dipeptide or whether they were cross-reacting with other heterologous dipeptides containing glu and lys such as Na (r-glu) lys which naturally exists in proteins. or even with N (a-glu) lys whose natural existence in proteins has not yet been found.
Détermination de la spécificité fine de
l'AcM 71 A3 fl
Pour ce faire, ces deux dipeptides ainsi que l'homologue Na(7-glu)lys ont été additionnés (à des concentrations variables) à l'AcM avant son contact avec la BSA-Z-lys. L'expérimentation a été menée comme décrit à l'EXEMPLE V (d).Determination of the fine specificity of
mAb 71 A3 fl
To do this, these two dipeptides as well as the Na (7-glu) lys homolog were added (at varying concentrations) to the mAb before its contact with the BSA-2-lys. The experiment was carried out as described in EXAMPLE V (d).
Les résultats obtenus sont représentés sur la
Fig. 1 annexée.The results obtained are represented on the
Fig. 1 attached.
Il est clair que le taux d'inhibition maximale avec les dipeptides Na (a-glu)lys et Na (a-glu)lys ne dépasse pas 15 %. It is clear that the maximum inhibition rate with the dipeptides Na (a-glu) lys and Na (a-glu) lys does not exceed 15%.
En revanche, avec le Na (7-glu) lys, cette inhibition atteint 60 %. Dans d'autres expériences d'inhibition utilisant cette fois-ci un dosage immunoenzymatique, l'inhibition par le dipeptide homologue a atteint 72,4 % tandis que celles obtenues avec les dipeptides hétérologues n'ont jamais dépassé 10 %. On the other hand, with Na (7-glu) lys, this inhibition reaches 60%. In other inhibition experiments this time using an enzyme immunoassay, the inhibition by the homologous dipeptide reached 72.4% while those obtained with the heterologous dipeptides never exceeded 10%.
Détermination de la réactivité de 71 A3 fl
avec le fibrinogène et la fibrine.Determination of the reactivity of 71 A3 fl
with fibrinogen and fibrin.
Cette expérience a effectuée par Dot-bloot conformément aux modalités décrites à l'EXEMPLE V (a). This experiment was carried out by Dot-bloot in accordance with the modalities described in EXAMPLE V (a).
Les résultats représentés à la Fig. 2 annexée montrent que cet AcM réagit effectivement avec la fibrine et avec la BSA-Z-lys utilisée comme contrôle mais ne réagit pas avec le fibrinogène. The results shown in FIG. 2 attached show that this MAb actually reacts with fibrin and with BSA-2-lys used as a control, but does not react with fibrinogen.
Toutefois, comme cette réaction avec la fibrine ne permettait pas de dire si cet AcM réagirait avec la fibrine native car la sonication subie par la fibrine pour faire une suspension homogène, lors des dot-blots, aurait pu révéler sur la molécule les liaisons N(Y- glu)lys, qui pourraient être à l'état cryptique dans la fibrine native, la réactivité de l'AcM conforme à l'invention sur la fibrine néo-formée, à été testée. However, as this reaction with fibrin did not make it possible to say whether this MAb would react with native fibrin because the sonication undergone by the fibrin to make a homogeneous suspension, during the dot-blots, could have revealed the N bonds on the molecule ( Y-glu) lys, which could be in the cryptic state in native fibrin, the reactivity of the MAb according to the invention on the neo-formed fibrin, was tested.
Détermination de la réactivité de 71 A3 fl
avec la fibrine néoformée.Determination of the reactivity of 71 A3 fl
with newly formed fibrin.
L'expérimentation a été menée comme décrit à l'EXEMPLE V (b) pour déterminer l'influence éventuelle d'autres protéines plasmatiques sur la réaction de l'AcM avec la fibrine. The experiment was carried out as described in EXAMPLE V (b) to determine the possible influence of other plasma proteins on the reaction of mAb with fibrin.
Les résultats qui figurent dans le Tableau II ci-après montrent que cet AcM est capable de réagir avec la fibrine néo-formée. Même en présence d'autres protéines plasmatiques (série non-lavée), l'interaction reste spécifique. The results which appear in Table II below show that this MAb is capable of reacting with neo-formed fibrin. Even in the presence of other plasma proteins (unwashed series), the interaction remains specific.
TABLEAU II
Réactivité de l'AcM avec caillot humain préformé
Essais Résultats Corrigés
(dpm) (-Témoin conjugué)
+Témoin conjugué* 6000 0 (A) Plasma + Ca -Témoin AcM non spécifique 9700 3700
caillot lavé + AcM spécifique 31000 25000 (B) Plasma + Ca +Témoin AcM non spécifique 5700 0
caillot non lavé + AcM spécifique 9500 3500 (C) Plasma - Ca +Témoin AcM non spécifique 1300 0
+ Lavage + AcM spécifique 4500 0 * : Anti-IgG de souris marquée à I125. TABLE II
Reactivity of mAb with preformed human clot
Tests Corrected Results
(dpm) (- Conjugate witness)
+ Conjugate control * 6000 0 (A) Plasma + Ca - Non-specific mAb control 9700 3700
washed clot + specific mAb 31,000 25,000 (B) Plasma + Ca + Non-specific mAb control 5700 0
unwashed clot + specific mAb 9500 3500 (C) Plasma - Ca + Non-specific mAb control 1300 0
+ Wash + specific mAb 4500 0 *: Mouse anti-IgG labeled with I125.
Détermination de la réactivité de l'AcM
conforme à l'invention avec le D-DIMER.Determination of the reactivity of mAb
according to the invention with D-DIMER.
La procédure expérimentale mise en oeuvre est celle décrite à l'EXEMPLE V (c). The experimental procedure implemented is that described in EXAMPLE V (c).
Immunocapture
Pour faciliter la séparation des produits de cette réaction l'IgG anti isopeptides 71 A3 fl a été tout d'abord purifiée à partir d'un liquide d'ascites et ensuite couplée par liaison covalente (hydrazone) à des sphères paramagnétiques.Immunocapture
To facilitate the separation of the products of this reaction, the anti-isopeptide IgG 71 A3 fl was first purified from an ascitic fluid and then coupled by covalent bond (hydrazone) to paramagnetic spheres.
Les sphères -IgG ont été mises en contact soit avec le D-Dimer purifié, soit avec un sérum contenant le
D-Dimer. Après incubation à 4 C, pendant 1 h, les sphères ont été lavées par 4 cycles successifs d'aimantation et ensuite soumises directement à une séparation électrophorétique sur gel de polyacrylamide 7,5 % dans les conditions non-dénaturantes.The -IgG spheres were contacted either with the purified D-Dimer or with a serum containing the
D-Dimer. After incubation at 4 ° C. for 1 h, the spheres were washed by 4 successive cycles of magnetization and then subjected directly to electrophoretic separation on 7.5% polyacrylamide gel under non-denaturing conditions.
Les résultats obtenus sont présentés sur les
Fig. 3A et 3B annexées.The results obtained are presented on the
Fig. 3A and 3B appended.
Il est clair que
1) les IgG anti isopeptide ont pu interagir avec le D-Dimer en solution,
2) de toutes les protéines présentes dans un sérum, seul le D-Dimer a été reconnu par les anticorps anti isopeptide.It's clear that
1) the anti-isopeptide IgGs were able to interact with the D-Dimer in solution,
2) of all the proteins present in a serum, only D-Dimer was recognized by the anti isopeptide antibodies.
Ces résultats montrent sans équivoque non seulement la spécificité de l'AcM pour une seule protéine plasmatique, le D-Dimer, mais également la possibilité de l'isoler en quantité suffisante afin de servir comme immunogène. These results show unequivocally not only the specificity of mAb for a single plasma protein, D-Dimer, but also the possibility of isolating it in sufficient quantity to serve as an immunogen.
Les résultats sont similaires, que l'AcM soit couplé directement par liaison hydrazone sur les sphères ou lié indirectement par l'intermédiaire d'IgG de mouton anti IgG souris fixée elle-même par liaison hydrazone sur les sphères. The results are similar whether the mAb is coupled directly by hydrazone bonding to the spheres or indirectly bound via sheep anti mouse IgG itself attached by hydrazone bonding to the spheres.
DETECTION DE CAILLOT CHEZ LE LAPIN
Etude d'un anticorps anti-liaison isopeptique marqué à l'Indium 111, chez le lapin Fauve de Bourgogne, sur lequel une thrombose rouge "in situ" a été réalisée.CLOT DETECTION IN RABBITS
Study of an anti-isopeptic binding antibody labeled with Indium 111, in the Fauve de Bourgogne rabbit, on which a red thrombosis "in situ" was carried out.
Visualisation par l'utilisation de la Gamma
Caméra, après 1 heure, 4 h, 24h et 48 h.Visualization by the use of Gamma
Camera, after 1 hour, 4 hours, 24 hours and 48 hours.
Le volume d'injection est de 600 Ciel./ 500 mg anticorps. La concentration radioactive par animal 300ici. The injection volume is 600 Ciel./ 500 mg antibody. The radioactive concentration per animal 300here.
Marquage anticorps 71 A3 fl. Antibody labeling 71 A3 fl.
- couplage au DTPA (acide éthylènediaminetetra-acétique). A 6,5 mg d'anticorps 71 A3 fl dans 2,2 ml de NaHC03 0,1 M on ajouter 0,157 mg d'anhydride de DTPA dans du DMSO anhydre ( rapport molaire DTPA/Anticorps = 10). Après incubation de 20 minutes à température ambiante le DTPA non lié à l'anticorps est éliminé par gel filtration sur HR 200 (30 x 1,5) élué par NaCl 0,15 M. - coupling to DTPA (ethylenediaminetetra-acetic acid). To 6.5 mg of antibody 71 A3 fl in 2.2 ml of 0.1 M NaHCO3, add 0.157 mg of DTPA anhydride in anhydrous DMSO (molar ratio DTPA / Antibody = 10). After incubation for 20 minutes at room temperature, the DTPA not bound to the antibody is removed by gel filtration on HR 200 (30 x 1.5) eluted with 0.15 M NaCl.
Ensuite l'anticorps est reconcentré par ultrafiltration ( cellule Amicon) à la concentration de 1,7 mg/ml dans NaCl 0,15 M.
- Marquage à l'indium 111
A 170 pcg d'anticorps ( 100 Rl) couplés au
DTPA on rajoute 100 Rl de tampon acetate 0,2 M pM 5,0 puis 300 Al d'endium 111 Cl3 ( à 100R1/ml)
Après incubation de 60 minutes le rendement de marquage est supérieur à 90 %.Then the antibody is reconcentrated by ultrafiltration (Amicon cell) at a concentration of 1.7 mg / ml in 0.15 M NaCl.
- Indium 111 marking
A 170 pcg of antibodies (100 Rl) coupled to
DTPA is added 100 Rl of 0.2 M pM 5.0 acetate buffer then 300 Al of endium 111 Cl3 (at 100R1 / ml)
After incubation for 60 minutes, the labeling yield is greater than 90%.
Réalisation d'une thrombose rouge "in situ"
chez le lapin
- Chirurgie sur l'animal
Une incision parallèle à la trachée-artère est pratiquée. La veine jugulaire est dégagée, un abaisselangue (type médical) est glissé sous la veine, un coton fortement imbibé de formaline (aldéhyde formique pur en solution à 30 %) est appliqué sur celle-ci durant 20 minutes. Realization of a red thrombosis "in situ"
in the rabbit
- Animal surgery
An incision parallel to the windpipe is made. The jugular vein is released, a tongue depressor (medical type) is slipped under the vein, a cotton ball strongly soaked in formalin (pure formaldehyde in 30% solution) is applied to it for 20 minutes.
Passée cette période, le coton est retiré et la plaie nettoyée à l'aide de sérum physiologique puis refermée. After this period, the cotton is removed and the wound is cleaned with physiological serum and then closed.
L'injection de la solution d'anticorps marqué est effectuée 30 minutes après la fin de l'opération par la voie intra-veineuse. The injection of the labeled antibody solution is carried out 30 minutes after the end of the operation by the intravenous route.
EXPLOITATION
La visualisation du thrombus est tentée 1 heure et 4 heures après la-fin de l'injection ;
On note une fixation hépatique et une activité circulante importantes.OPERATION
Visualization of the thrombus is attempted 1 hour and 4 hours after the end of the injection;
There is significant hepatic fixation and circulating activity.
Après 24 heures, on peut observer une petite fixation au niveau de la plaie sur un des 2 lapins. After 24 hours, a small fixation can be observed at the level of the wound on one of the 2 rabbits.
A 48 heures, la fixation est apparente sur les 2 lapins, avec toujours une fixation hépatique et une activité circulante importantes. At 48 hours, fixation was apparent in the 2 rabbits, still with significant hepatic fixation and circulating activity.
Pour vérification, le thrombus et lml de sang sont prélevés et comptés sur la chaine de mesure universelle ECT 33
ANTI-CORPS ANTI-LIAISON ISOPEPTIDIQUE In 111
ACTIVITE LAPIN LAPIN N"1 N"2
THROMBUS/g 1053 2733
SANG/ml 2053 2185
THROMBUS/SANG 1,97 1,25
Il est clairement démontré par les exemples que l'AcM conforme à l'invention réagit exclusivement sur la fibrine sous forme de polymère et non pas sous forme de monomère.For verification, the thrombus and lml of blood are taken and counted on the universal measurement chain ECT 33
ANTI-BODY ANTI-BOND ISOPEPTIDIC In 111
RABBIT RABBIT ACTIVITY N "1 N" 2
THROMBUS / g 1053 2733
BLOOD / ml 2053 2185
THROMBUS / BLOOD 1.97 1.25
It is clearly demonstrated by the examples that the mAb in accordance with the invention reacts exclusively with fibrin in the form of a polymer and not in the form of a monomer.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. As emerges from the foregoing, the invention is in no way limited to those of its embodiments, embodiments and applications which have just been described more explicitly; on the contrary, it embraces all the variants which may occur to the technician in the field, without departing from the framework or the scope of the present invention.
Claims (15)
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9007887A FR2663748B1 (en) | 1990-06-22 | 1990-06-22 | SPECIFIC ANTIBODIES FOR TRANSGLUTAMINASE-INDUCED ISOPEPTIDE BINDING, ANTIGENS CONTAINED BY GLU-LYS ISOPEPTIDES RECOGNIZED BY SAID ANTIBODIES, DIAGNOSTIC AGENTS AND THERAPEUTIC COMPOSITIONS CONTAINING THEM. |
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Citations (2)
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Non-Patent Citations (2)
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| CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 99, no. 25, 19 décembre 1983, page 342, résumé no. 209051f, Columbus, Ohio, US; D.B. RYLATT et al.: "An immunoassay for human D dimer using monoclonal antibodies", & THROMB. RES. 1983, 31(6), 767-78 * |
| THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 119, no. 3, septembre 1977, paes 901-905, Baltimore, MD, US; N.K.V. CHEUNG et al.: "Development of a hemolytic plaque assay for glutamic acid, lysine-containing polypeptides: demonstration that nonresponder mice produce antibodies to these peptides when conjugated to an immunogenic carrier" * |
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