FR2662697A1 - New ganglioside from milk and process for producing it - Google Patents
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Abstract
Description
tTOUVEAU GMiGLIOSIDE PROVENANT DU LAIT ET SON PROCEDE
D' OBTEtTTIOI
La présente invention concerne un nouveau ganglioside, le 9-0-acètyl-GD3, provenant du lait de vache et d'autres produits laitiers, ainsi qu'un procédé d'obtention de ce gangiioside. t GMiGLIOSIDE FROM MILK AND METHOD
OBTEtTTIOI
The present invention relates to a new ganglioside, 9-0-acetyl-GD3, obtained from cow's milk and other dairy products, as well as to a process for obtaining this gangiioside.
Le 9-0-acétyl-GD3 est un dérivé particulier du ganglioside GD3, dans lequel le groupe hydroxyle sur le carbone If. 9 du résidu d'acide sialique est converti en ester acétique. On sait que les gangliosides existent dans les mélanomes, les cellules cancéreuses humaines de mélanome cutané, le tissu nerveux du rat et analogues et on prévoit différentes recherches concernant leurs fonctions et leur métabolisme. 9-0-acetyl-GD3 is a particular derivative of the ganglioside GD3, in which the hydroxyl group on the carbon If. 9 of the sialic acid residue is converted to acetic ester. Gangliosides are known to exist in melanomas, human skin melanoma cancer cells, rat nerve tissue, and the like, and various researches are planned on their functions and metabolism.
Les sphingoglycolipides comprenant les gangliosides consistent en une partie formée par une chaîne saccharidique et en une partie lipidique appelée céramide. Cette partie appelée céramide consiste en une base à longue chaîne et en un acide gras. En général, les sphingoglycolipides sont classés selon la partie formée par la chaîne saccharidique; cependant, on sait que l'on rencontre des variations dans la partie céramide chez les sphingoglycolipides bien qu'ils soient classés dans le même groupe et qu'ils comportent la même chaîne saccharidique. En effet, les glycolipides provenant du même tissu comportent la même chaîne saccharidique mais des bases à longues chaînes et des acides gras différents. On sait que cette variation est caractéristique des organes et tissus qui contiennent des gangliosides. The sphingoglycolipids comprising the gangliosides consist of a part formed by a saccharide chain and a lipid part called ceramide. This part called ceramide consists of a long chain base and a fatty acid. In general, sphingoglycolipids are classified according to the part formed by the saccharide chain; however, it is known that variations are found in the ceramide part in sphingoglycolipids although they are classified in the same group and that they contain the same saccharide chain. Indeed, glycolipids from the same tissue have the same saccharide chain but long chain bases and different fatty acids. We know that this variation is characteristic of organs and tissues that contain gangliosides.
De plus, on sait que la partie formée par la chaîne saccharidique participe aux fonctions physiologiques des sphingoglycolipides; par ailleurs, on sait aussi que la structure de la partie céramide participe largement à la manifestation des fonctions physiologiques comme le montre le cas des cérébrosides à activité anti-ulcère et antistress. Ainsi, la manifestation des fonctions physiologiques est influencée non seulement par la structure de la chaîne saccharidique mais aussi par la structure de la partie céramide. In addition, it is known that the part formed by the saccharide chain participates in the physiological functions of sphingoglycolipids; moreover, it is also known that the structure of the ceramide part plays a large part in the manifestation of physiological functions, as shown by the case of cerebrosides with anti-ulcer and anti-stress activity. Thus, the manifestation of physiological functions is influenced not only by the structure of the saccharide chain but also by the structure of the ceramide part.
On sait en particulier que le 9-0-acétyl-GD3 est un antigène spécifique du cancer qui a suscité beaucoup d'intérêt. Cependant, concernant le poids moléculaire et la structure du 9-0-acétyl-GD3 provenant des cellules de mélanome humain, on sait seulement que les constituants principaux sont la base à longue chaîne, la sphingosine (d 18:1) et les acides gras, l'acide palmitique (C 16:0) et l'acide tétracosénoïque (C 24:1) (J. Biol. Chem. 260 (1985), 14556-14563). Par ailleurs, on a trouvé récemment que le 90-acétyl-GD3 est présent dans le babeurre préparé à partir de lait de vache et qu'il s'agit d'un constituant normal de l'organisme (Lipids, li (1989), 680-684).On identifie ce 90-acétyl-GD3 à l'aide d'un anticorps monoclonal spécifique du 9-0-acétyl-GD3 mais on n'a pas déterminé sa structure par analyse spectrométrique ou par analyse chimique. Ainsi, on ne peut pas considérer que l'analyse de la structure du 9-0acétyl-GD3 provenant des cellules de mélanome humain est satisfaisante et en outre, jusqu'à maintenant, on n'a pas fait l'analyse de la structure du 9-0-acétyl-GD3 provenant du babeurre préparé à partir du lait de vache. Ceci est dû au fait que le 9-0-acétyl-GD3 existe dans les tissus ou les fluides corporels en des quantités extrêmement faibles et que par conséquent la quantité de ganglioside isolé et purifié est très faible. Pour étudier le 9-0-acétyl-GD3 du point de vue chimique et pour mettre en évidence ses fonctions physiologiques, il est nécessaire d'isoler et de purifier le 9-0-acétyl-GD3 en grandes quantités. We know in particular that 9-0-acetyl-GD3 is a cancer-specific antigen that has aroused much interest. However, regarding the molecular weight and structure of 9-0-acetyl-GD3 from human melanoma cells, it is only known that the main constituents are the long chain base, sphingosine (d 18: 1) and fatty acids , palmitic acid (C 16: 0) and tetracosenoic acid (C 24: 1) (J. Biol. Chem. 260 (1985), 14556-14563). Furthermore, it has recently been found that 90-acetyl-GD3 is present in buttermilk prepared from cow's milk and that it is a normal constituent of the organism (Lipids, li (1989), We identify this 90-acetyl-GD3 using a monoclonal antibody specific for 9-0-acetyl-GD3 but its structure has not been determined by spectrometric analysis or by chemical analysis. Thus, the analysis of the structure of 9-0acetyl-GD3 from human melanoma cells cannot be considered satisfactory and, moreover, until now, the analysis of the structure of 9-0-acetyl-GD3 from buttermilk prepared from cow's milk. This is due to the fact that 9-0-acetyl-GD3 exists in tissues or body fluids in extremely small amounts and therefore the amount of ganglioside isolated and purified is very small. To study 9-0-acetyl-GD3 from a chemical point of view and to demonstrate its physiological functions, it is necessary to isolate and purify 9-0-acetyl-GD3 in large quantities.
Les présents inventeurs sont parvenus à isoler et purifier de grandes quantités de 9-0-acétyl-GD3 provenant du lait de vache en utilisant comme produit de départ le lait de vache ou un produit laitier, et ils ont pu confirmer que le 9-0-acétyl-GD3 obtenu est sensiblement différent de celui qui provient des cellules de mélanome humain, en analysant la chaîne saccharidique, la base à longue chaîne et les acides gras pour révéler la structure du ganglioside, et parvenir ainsi à la présente invention. The present inventors have successfully isolated and purified large amounts of 9-0-acetyl-GD3 from cow's milk using cow's milk or a dairy product as their starting material, and have been able to confirm that 9-0 -acetyl-GD3 obtained is significantly different from that which comes from human melanoma cells, by analyzing the saccharide chain, the long chain base and the fatty acids to reveal the structure of the ganglioside, and thus arrive at the present invention.
Ainsi, un objet de la présente invention consiste à proposer un nouveau ganglioside 9-0-acétyl-GD3 qui provient du lait de vache ou d'un produit laitier. Thus, an object of the present invention consists in proposing a new ganglioside 9-0-acetyl-GD3 which comes from cow's milk or from a dairy product.
Un autre objet de la présente invention consiste à proposer un nouveau ganglioside 9-0-acétyl-GD3 qui provient du lait de vache ou d'un produit laitier et qui est utile dans différentes recherches en médecine; biochimie et analogues, en particulier pour la recherche concernant les mélanomes humains. Another object of the present invention is to provide a new ganglioside 9-0-acetyl-GD3 which comes from cow's milk or a dairy product and which is useful in various medical research; biochemistry and the like, in particular for research relating to human melanomas.
Un autre objet de l'invention consiste à proposer un nouveau ganglioside 9-0-acétyl-GD3 provenant du lait de vache ou d'un produit laitier, qui soit utile comme réactif dans le domaine de la biochimie. Another object of the invention consists in proposing a new ganglioside 9-0-acetyl-GD3 originating from cow's milk or from a dairy product, which is useful as a reagent in the field of biochemistry.
Un autre objet de la présente invention consiste à proposer un procédé de production d'un nouveau ganglioside 9-0-acétyl-GD3 intéressant, utilisant comme produit de départ le lait de vache ou un produit laitier. Another object of the present invention is to provide a process for the production of a new interesting 9-0-acetyl-GD3 ganglioside, using cow's milk or a dairy product as a starting product.
Ainsi, la présente invention concerne un ganglioside, le 9-0-acétyl-GD3, représenté par la formule générale suivante:
NeuS, 9Ac2 a 2 v 8Neu 5Ac a 2 3
3Gal 8 1 4Glc (3 1 > lCer (I) dans laquelle Neu représente un résidu d'acide neuraminique,
Ac représente un groupe acétyle, Gal représente un résidu de galactose, Glc représente un résidu de glucose et Cer représente un résidu de céramide.Thus, the present invention relates to a ganglioside, 9-0-acetyl-GD3, represented by the following general formula:
NeuS, 9Ac2 at 2 v 8 Neu 5Ac at 2 3
3Gal 8 1 4Glc (3 1> lCer (I) in which Neu represents a residue of neuraminic acid,
Ac represents an acetyl group, Gal represents a galactose residue, Glc represents a glucose residue and Cer represents a ceramide residue.
On obtient ce ganglioside à partir du lait ou d'autres produits laitiers. This ganglioside is obtained from milk or other dairy products.
En outre, la présente invention concerne un procédé de production du ganglioside 9-0-acétyl-GD3 de formule (I) dans lequel du lait de vache ou un autre produit laitier est traité avec un mélange chloroforme-méthanol ou chlorof ormeméthanol-eau pour extraire le ganglioside, et la solution d'extraction du ganglioside obtenue est lavée à l'acétone puis est soumise à une chromatographie d'échange d'ions et à une chromatographie sur gel de silice pour obtenir le ganglioside 9-0-acétyl-GD3. In addition, the present invention relates to a process for the production of the 9-0-acetyl-GD3 ganglioside of formula (I) in which cow's milk or another dairy product is treated with a chloroform-methanol or chloroformmethanol-water mixture for extract the ganglioside, and the ganglioside extraction solution obtained is washed with acetone then is subjected to ion exchange chromatography and to chromatography on silica gel to obtain the ganglioside 9-0-acetyl-GD3 .
La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description suivante qui se réfère aux dessins annexés dans lesquels: la figure 1 représente des spectrogrammes de résonance magnétique nucléaire du proton du ganglioside 9-0-acétyl-GD3 selon la présente invention obtenu à partir du lait de vache et d'autres produits laitiers; la figure 2 représente des spectrogrammes de résonance magnétique nucléaire du proton du ganglioside 9-0-acétyl-GD3 obtenu à partir de cellules de mélanome humain; la figure 3 représente un spectrogramme de masse du méthylester du N-méthyl-N-acétyl-9-0-méthyl-4,7, 8-tri-0-TMS- neuraminylméthylcétoside selon la présente invention; la figure 4 représente un spectrogramme de masse du méthylester du 8-0-TMS-N-méthyl-4,7,9-tri-0-méthyl-N-acétyl- neuraminylméthyl cétos ide; la figure 5 représente un spectrogramme de masse du méthylester du N-méthyl-4,7 , 8, 9-tétra-0-méthyl-N-acétyl- neuraminylméthyl cétos ide. The present invention will be better understood on reading the following description which refers to the accompanying drawings in which: FIG. 1 represents nuclear magnetic resonance spectrograms of the proton of the ganglioside 9-0-acetyl-GD3 according to the present invention obtained from cow's milk and other dairy products; FIG. 2 represents nuclear magnetic resonance spectrograms of the proton of ganglioside 9-0-acetyl-GD3 obtained from human melanoma cells; FIG. 3 represents a mass spectrogram of the methyl ester of N-methyl-N-acetyl-9-0-methyl-4,7,8-tri-O-TMS-neuraminylmethyl ketoside according to the present invention; FIG. 4 represents a mass spectrogram of the methyl ester of 8-0-TMS-N-methyl-4,7,9-tri-0-methyl-N-acetyl-neuraminylmethyl ketos ide; FIG. 5 represents a mass spectrogram of the methyl ester of N-methyl-4,7, 8, 9-tetra-0-methyl-N-acetyl-neuraminylmethyl ketos ide.
Le ganglioside 9-0-acétyl-GD3 selon la présente invention peut être représenté par la formule (II) suivante:
dans laquelle R1 représente un groupe CH3- (CH2)1- ou un groupe CH3-(CH2)m-CH=CH-, et R2 représente un groupe CH3(CH2)n- ou un groupe CH3(CH2)p-CH=CH-(CH2)7-, 1 représentant un nombre entier compris entre 13 et 15, m représentant un nombre entier compris entre 11 et 13, n représentant un nombre entier compris entre 16 et 22 et p représentant un nombre entier compris entre 7 et 13. The ganglioside 9-0-acetyl-GD3 according to the present invention can be represented by the following formula (II):
in which R1 represents a group CH3- (CH2) 1- or a group CH3- (CH2) m-CH = CH-, and R2 represents a group CH3 (CH2) n- or a group CH3 (CH2) p-CH = CH- (CH2) 7-, 1 representing an integer between 13 and 15, m representing an integer between 11 and 13, n representing an integer between 16 and 22 and p representing an integer between 7 and 13.
De plus, selon l'invention, les résidus -COOH de la formule (II) mentionnée ci-dessus peuvent être sous forme de sels. Des exemples de sels comprennent les sels de métaux alcalins tels que le sodium, le potassium etc. et les sels d'ammonium. En outre, les sels peuvent être des sels d'addition d'acides aminés basiques tels que l'arginine et la lysine ou de substances basiques telles que des amines. In addition, according to the invention, the -COOH residues of the formula (II) mentioned above can be in the form of salts. Examples of salts include the alkali metal salts such as sodium, potassium etc. and ammonium salts. In addition, the salts can be addition salts of basic amino acids such as arginine and lysine or basic substances such as amines.
Le ganglioside 9-0-acétyl-GD3 selon la présente invention comprend aussi les sels mentionnés ci-dessus. The ganglioside 9-0-acetyl-GD3 according to the present invention also comprises the salts mentioned above.
Des exemples de gangliosides sont les composés suivants:
Composé R1 R2 (III) CU3-(CH2)1- CH3-(CH2)n
1 = 13-15 n = 16, 20, 21 ou 22 (IV) CH3-(CH2)1- CH3(CH2)p-CH=CH-(CH2)7
1 = 13-15 p = 7, 11, 12 ou 13 (V) CH3-(CH2)m-CH=cH- CH3-(CH2)n
m = 11-13 n = 16, 20, 21 ou 22 (VI) CH3(CH)m-cH=cH- CH3(CH2)p-CH=CH-(CH2)7
m = 11-13 p = 7, 11, 12 ou 13
Ainsi, le ganglioside 9-0-acétyl-GD3 a une céramide comprenant principalement de l'hexadécasphinganine, (d 16:0), de l'hexadécasphingénine, (d 16:1) ou de la sphinganine (d 18:0) (ou de la sphingénine d 18:1) comme base à longue chaîne et de l'acide octadécanoïque (C 18:0), de l'acide octadécénoique (C 18:1), de l'acide docosanoïque (C 22:0), de l'acide tricosanoique (C 23::0) ou de l'acide tétracosanoïque (C 24:0) comme acide gras, comme le montrent les formules (III), (IV), (V) et (VI).Examples of gangliosides are the following compounds:
Compound R1 R2 (III) CU3- (CH2) 1- CH3- (CH2) n
1 = 13-15 n = 16, 20, 21 or 22 (IV) CH3- (CH2) 1- CH3 (CH2) p-CH = CH- (CH2) 7
1 = 13-15 p = 7, 11, 12 or 13 (V) CH3- (CH2) m-CH = cH- CH3- (CH2) n
m = 11-13 n = 16, 20, 21 or 22 (VI) CH3 (CH) m-cH = cH- CH3 (CH2) p-CH = CH- (CH2) 7
m = 11-13 p = 7, 11, 12 or 13
Thus, ganglioside 9-0-acetyl-GD3 has a ceramide mainly comprising hexadecasphinganine, (d 16: 0), hexadecasphingenin, (d 16: 1) or sphinganine (d 18: 0) ( or sphingenine d 18: 1) as long-chain base and octadecanoic acid (C 18: 0), octadecenoic acid (C 18: 1), docosanoic acid (C 22: 0) , tricosanoic acid (C 23 :: 0) or tetracosanoic acid (C 24: 0) as fatty acid, as shown in formulas (III), (IV), (V) and (VI).
De plus, la présente invention comprend les composés qui comprennent deux ou plus de deux des substances mentionnées ci-dessus en combinaison.
m=16, 20, 21, 22 n=13, 15 (III)
chaîne saccharidique comme ci-dessus m=7, 11, 12, 13 n=13, 15 (IV)
chaîne saccharidique corne ci-dessus m=16, 20, 21, 22 n=ll, 13 (v)
chaîne saccharidique comme ci-dessus m=7,11,12,13
n=11,13 (VI)
De plus, le ganglioside 9-0-acétyl-GD3 selon la présente invention est produit généralement de la manière suivante:
On utilise comme matière première du lait de vache ou d'autres produits laitiers provenant du lait de vache, tels que le babeurre, le petit lait et le lait écrémé. Ces matières premières contiennent différents constituants tels que des protéines, du lactose, des graisses, des glycolipides neutres et des gangliosides y compris le 9-0acétyl-GD3.Les présents inventeurs ont présenté antérieurement un procédé pour concentrer efficacement les gangliosides du lait de vache (brevet japonais mis à la disposition du public N . 269992/1988). Le concentré obtenu selon ce procédé contient du 9-0-acétyl-GD3 sous une forme très concentrée. Selon la présente invention, on applique un tel procédé et on concentre encore par séchage le concentré obtenu; on le traite avec un mélange chloroforme-méthanol pour extraire une fraction lipidique contenant les gangliosides et on sèche l'extrait. Puis, on retire les graisses et les cholestérols par lavage à l'acétone de l'extrait sec obtenu. On peut utiliser aussi un mélange chloroforme-méthanol-eau pour l'extraction de la fraction lipidique qui contient les gangliosides.On soumet ensuite cet extrait, qui est une fraction lipidique complexe contenant principalement des glycolipides et des phospholipides, à une chromatographie d'échange d'ions puis à une chromatographie sur gel de silice; on obtient ainsi le ganglioside 9-0-acétyl-GD3 selon la présente invention, sous forme d'une poudre blanche, comportant un constituant du composé (III) ou (VI), avec une pureté supérieure à 90%.m = 16, 20, 21, 22 n = 13, 15 (III)
saccharide chain as above m = 7, 11, 12, 13 n = 13, 15 (IV)
saccharide chain horn above m = 16, 20, 21, 22 n = ll, 13 (v)
saccharide chain as above m = 7,11,12,13
n = 11.13 (VI)
In addition, the ganglioside 9-0-acetyl-GD3 according to the present invention is generally produced in the following manner:
Cow's milk or other dairy products derived from cow's milk, such as buttermilk, whey and skim milk, are used as the raw material. These raw materials contain various constituents such as proteins, lactose, fats, neutral glycolipids and gangliosides including 9-0acetyl-GD3. The present inventors have previously presented a method for efficiently concentrating the gangliosides of cow's milk ( Japanese patent made available to the public N. 269992/1988). The concentrate obtained according to this process contains 9-0-acetyl-GD3 in a highly concentrated form. According to the present invention, such a process is applied and the concentrate obtained is further concentrated by drying; it is treated with a chloroform-methanol mixture to extract a lipid fraction containing the gangliosides and the extract is dried. Then, the fats and cholesterols are removed by washing with acetone from the dry extract obtained. A chloroform-methanol-water mixture can also be used for the extraction of the lipid fraction which contains the gangliosides. This extract, which is a complex lipid fraction containing mainly glycolipids and phospholipids, is then subjected to exchange chromatography. ions then chromatography on silica gel; 9-0-acetyl-GD3 ganglioside according to the present invention is thus obtained, in the form of a white powder, comprising a constituent of compound (III) or (VI), with a purity greater than 90%.
De plus, il est possible également d'isoler ces composés par chromatographie de partage en phase inverse. In addition, it is also possible to isolate these compounds by reverse phase partition chromatography.
Les analyses de la structure des gangliosides obtenus par le procédé selon la présente invention de la manière décrite ci-dessus sont les suivantes:
(1) Hydrolyse alcaline douce:
A la fraction de 9-0-acétyl-GD3 isolée on a ajouté de l'hydroxyde de sodium 0,2N dans le méthanol et on a fait réagir le mélange à la température ambiante pendant 2 heures puis on l'a concentré et déminéralisé pour le soumettre à une chromatographie en couche mince. La mobilité du 9-0acétyl-GD3 non hydrolysé en chromatographie en couche mince était supérieure à celle du GD3 dépourvu de groupe acétyle; cependant, lorsque le 9-0-acétyl-GD3 était hydrolysé, la mobilité était totalement identique à celle du GD3. Ceci signifie que le ganglioside purifié était instable en milieu alcalin et était un dérivé du GD3. The analyzes of the structure of the gangliosides obtained by the method according to the present invention in the manner described above are the following:
(1) Mild alkaline hydrolysis:
To the isolated 9-0-acetyl-GD3 fraction was added 0.2N sodium hydroxide in methanol and the mixture was reacted at room temperature for 2 hours then concentrated and demineralized to subject it to thin layer chromatography. The mobility of non-hydrolyzed 9-0acetyl-GD3 in thin layer chromatography was greater than that of GD3 lacking an acetyl group; however, when 9-0-acetyl-GD3 was hydrolyzed, the mobility was completely identical to that of GD3. This means that the purified ganglioside was unstable in an alkaline medium and was a derivative of GD3.
(2) Spectrophotométrie RMN H
Selon un procédé connu, on a traité environ 3 mg de 90-acétyl-GD3 provenant du lait de vache pour effectuer une substitution par de l'eau lourde puis on l'a dissous dans un mélange diméthylsulfoxyde-eau lourde (98:2 en volume) pour le soumettre à une mesure au spectromètre de résonance magnétique nucléaire à 900C. Les résultats sont représentés sur la figure 1. La partie correspondant à la chaîne saccharidique de ce spectrogramme était sensiblement identique à celle du 9-0-acétyl- & 3 purifié provenant de cellules de mélanome humain (figure 2) et l'on a confirmé par spectrométrie que la structure de la chaîne saccharidique du ganglioside de la présente invention correspond à la formule générale (I).(2) H NMR spectrophotometry
According to a known method, about 3 mg of 90-acetyl-GD3 from cow's milk was treated to make a substitution with heavy water and then it was dissolved in a dimethyl sulfoxide-heavy water mixture (98: 2 in volume) to be subjected to a measurement using a nuclear magnetic resonance spectrometer at 900C. The results are represented in FIG. 1. The part corresponding to the saccharide chain of this spectrogram was substantially identical to that of purified 9-0-acetyl- & 3 originating from human melanoma cells (FIG. 2) and it was confirmed by spectrometry that the structure of the saccharide chain of the ganglioside of the present invention corresponds to the general formula (I).
(3) Détermination du site de liaison du groupe acétyle de GD3 acétvlé
On a réalisé ensuite une acétalisation avec le méthylvinyléther, une méthylation, une méthanolyse et une triméthylsilylation (TMS) du ganglioside selon la méthode de
Gasa et al. (Method in Research on Complex Glycolipids II, page 87) pour introduire un groupe méthyle au niveau d'un groupe hydroxyle ayant un groupe acétyle de liaison et un groupe triméthyle au niveau d'un groupe hydroxyle libre, puis l'on a analysé le ganglioside obtenu par chromatographie gaz-liquide (CGL) /spectrométrie de masse (colonne de CGL: DB-1; tension d'ionisation pour la spectrométrie de masse: 70 eV). Comme le montre la figure 3, le spectre de masse du méthylester du N-méthyl-N-acétyl-9-0méthyl-4, 7,8 -tri-0-TMS-neuraminylméthylcétoside a été confirmé. En plus de ce résultat, l'hydrolyse partielle du ganglioside avec la sialidase a produit du GD3 mais pas de 9-0-acétyl-GD3. Ces résultats indiquent qu'un groupe acétyle est lié au groupe hydroxyle au niveau du neuvième atome de carbone de l'acide sialique terminal de GD3. (3) Determination of the acetyl group binding site of acetylated GD3
Acetalization was then carried out with methylvinyl ether, methylation, methanolysis and trimethylsilylation (TMS) of the ganglioside according to the method of
Gasa et al. (Method in Research on Complex Glycolipids II, page 87) to introduce a methyl group at the level of a hydroxyl group having an acetyl linking group and a trimethyl group at the level of a free hydroxyl group, and then the ganglioside obtained by gas-liquid chromatography (CGL) / mass spectrometry (CGL column: DB-1; ionization voltage for mass spectrometry: 70 eV). As shown in Figure 3, the mass spectrum of the methyl ester of N-methyl-N-acetyl-9-0methyl-4,8,8-tri-O-TMS-neuraminylmethyl ketoside was confirmed. In addition to this result, partial hydrolysis of ganglioside with sialidase produced GD3 but not 9-0-acetyl-GD3. These results indicate that an acetyl group is linked to the hydroxyl group at the ninth carbon atom of the terminal sialic acid of GD3.
(4) Détermination du site de liaison de l'acide sialique par analyse par méthylation
On a méthylé totalement environ 1 mg de 9-0-acétyl-GD3 par la méthode de Hakomori (J. Bio. Chem., iS, 205 (1964)) et on a soumis le produit obtenu à une méthanolyse avec 0,5 ml d'un mélange HC1 0,3IT-méthanol à 750C pendant 18 heures.(4) Determination of the binding site of sialic acid by methylation analysis
About 1 mg of 9-0-acetyl-GD3 was completely methylated by the method of Hakomori (J. Bio. Chem., IS, 205 (1964)) and the product obtained was subjected to methanolysis with 0.5 ml. of an HCl 0.3IT-methanol mixture at 750C for 18 hours.
Après avoir retiré le solvant, on a soumis le résidu à une triméthylsilylation à 600C pendant 20 minutes. On a analysé le dérivé TMS ainsi obtenu par chromatographie gaz-liquide (CGL)/spectrométrie de masse (colonne de CGL: DB-1; tension d'ionisation pour la spectrométrie de masse: 70 eV). Comme le montrent les figures 4 et 5, les spectres de masse du méthylester du 8-0-TMS 8-0-TMS-0:T-méthyl-4,7 ,9-tri-0-méthyl-N-acétyl- neuraminylméthylcétoside et du méthylester du N-méthyl 4,7,8,9-tétra-0-méthyl-t1-acétyl-neuraminylméthylcétoside ont été confirmés.After removing the solvent, the residue was subjected to trimethylsilylation at 600C for 20 minutes. The TMS derivative thus obtained was analyzed by gas-liquid chromatography (CGL) / mass spectrometry (CGL column: DB-1; ionization voltage for mass spectrometry: 70 eV). As shown in Figures 4 and 5, the mass spectra of the methyl ester of 8-0-TMS 8-0-TMS-0: T-methyl-4,7, 9-tri-0-methyl-N-acetyl-neuraminylmethyl ketoside and methyl ester of N-methyl 4,7,8,9-tetra-0-methyl-t1-acetyl-neuraminylmethyl ketoside were confirmed.
(5) Détermination du site de liaison de la chaîne saccharidique par analyse par méthylation
En utilisant le 9-0-acétyl-GD3 totalement méthylé préparé en (4) ci-dessus, on a préparé un dérivé d'acétate d'alditol partiellement méthylé selon un procédé connu.(5) Determination of the saccharide chain binding site by methylation analysis
Using fully methylated 9-0-acetyl-GD3 prepared in (4) above, a partially methylated alditol acetate derivative was prepared according to a known method.
L'analyse par chromatographie gaz-liquide/spectrométrie de masse (colonne de CGL: DB-1; tension d'ionisation pour la spectrométrie de masse: 70 eV) a confirmé les spectres de masse du l,3,5-triacétyl-2,4,6-triméthylgalactitol et du 1,4,5-triacétyl-2,3,6-triméthylglucitol. Analysis by gas-liquid chromatography / mass spectrometry (CGL column: DB-1; ionization voltage for mass spectrometry: 70 eV) confirmed the mass spectra of 1,3,5-triacetyl-2 , 4,6-trimethylgalactitol and 1,4,5-triacetyl-2,3,6-trimethylglucitol.
(6) Comoosition des acides gras
On a introduit environ 1 mg de ganglioside dans un tube à essai à sommet fileté et bouchon en Teflon Q et on a ajouté 1 ml de mélange méthanol aqueux-HCl 1N. On a chauffé le mélange à 750C pendant 18 heures. Après refroidissement à l'air, on a extrait trois fois avec 2 ml d'hexane à chaque fois pour obtenir des méthylesters d'acides gras. En outre, pour acétyler les résidus hydroxyle des esters, on a retiré le solvant avec un évaporateur à azote et on a séché suffisamment la substance obtenue, on lui a ajouté 0,1 ml de mélange pyridine-acide acétique anhydre (1:1 en volume) et on l'a chauffée à 800C pendant 30 minutes. On a analysé le dérivé ainsi obtenu par chromatographie gaz-liquide (colonne
DB-1) et par chromatographie gaz-liquide/spectrométrie de masse (colonne DB-1).Les résultats sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous.(6) Comoposition of fatty acids
About 1 mg of ganglioside was introduced into a test tube with a threaded top and a Teflon Q stopper and 1 ml of 1N aqueous methanol-HCl mixture was added. The mixture was heated at 750C for 18 hours. After cooling in air, it was extracted three times with 2 ml of hexane each time to obtain methylesters of fatty acids. In addition, to acetylate the hydroxyl residues of the esters, the solvent was removed with a nitrogen evaporator and the substance obtained was dried sufficiently, 0.1 ml of anhydrous pyridine-acetic acid mixture (1: 1 in volume) and heated to 800C for 30 minutes. The derivative thus obtained was analyzed by gas-liquid chromatography (column
DB-1) and by gas-liquid chromatography / mass spectrometry (column DB-1). The results are presented in table 1 below.
Tableau 1 acide gras teneur acide gras teneur
% %
C 14:0 0,2 C 22:1 1,1
C 16:0 1,2 C 22:0 31,0
C 18:0 8,8 C 23:1 1,5
C 18:1 4,1 C 23:0 23,0
C 20:0 2,4 C 24:1 4,3
C 21:0 1,7 C 24:0 16,5
C 22:2 3,9
(7) Composition de la base à longue chaîne
Après l'extraction à l'hexane, on a séché la solution méthanolîque préparée en (6) ci-dessus à l'aide d'un évaporateur à azote et on a ajouté au résidu obtenu un réactif de triméthylsilylation, puis on a chauffé le mélange formé à 600C pendant 20 minutes. On a analysé le dérivé ainsi obtenu par chromatographie gaz-liquide et chromatographie gaz-liquide (CGL)/spectrométrie de masse (colonne de CGL: DB-1; tension d'ionisation pour la spectrométrie de masse: 70 eV). Les résultats sont présentés dans le tableau 2.Table 1 fatty acid content fatty acid content
%%
C 14: 0 0.2 C 22: 1 1.1
C 16: 0 1.2 C 22: 0 31.0
C 18: 0 8.8 C 23: 1 1.5
C 18: 1 4.1 C 23: 0 23.0
C 20: 0 2.4 C 24: 1 4.3
C 21: 0 1.7 C 24: 0 16.5
C 22: 2 3.9
(7) Composition of the long chain base
After the extraction with hexane, the methanolic solution prepared in (6) above was dried using a nitrogen evaporator and a trimethylsilylation reagent was added to the residue obtained, then the mixture was heated. mixture formed at 600C for 20 minutes. The derivative thus obtained was analyzed by gas-liquid chromatography and gas-liquid chromatography (CGL) / mass spectrometry (CGL column: DB-1; ionization voltage for mass spectrometry: 70 eV). The results are presented in Table 2.
D'après les caractéristiques présentées en (1) ou (7), on a identifié le ganglioside selon l'invention comme étant un ganglioside de formule générale (III), (IV), (V) ou (VI), ce qui est représenté de la manière suivante:
IJeu5, 9 kc 2 a 2 v 8 Neu 5 Ac a 2 9
3 Gal ss 1 + 4 Glc ss 1 + 1 Cer
Tableau 2 base à longue chaîne teneur
d 16:1 13,9
d 16:0 35,3
d 17:1 4,1
d 17:0 1,8
d 18:1 38,7
d 18::0 6,2
En général, étant donné que les gangliosides ont une grande importance du point de vue physiologique, le ganglioside 9-0-acétyl-GD3 de la présente invention est aussi très important et peut être utilisé efficacement comme réactif en recherche médicale ou biologique, en particulier dans la recherche sur les mélanomes.From the characteristics presented in (1) or (7), the ganglioside according to the invention has been identified as being a ganglioside of general formula (III), (IV), (V) or (VI), which is represented as follows:
I Game 5, 9 kc 2 a 2 v 8 Neu 5 Ac a 2 9
3 Gal ss 1 + 4 Glc ss 1 + 1 Cer
Table 2 long chain base content
d 16: 1 13.9
d 16: 0 35.3
d 17: 1 4.1
d 17: 0 1.8
d 18: 1 38.7
d 18 :: 0 6.2
In general, since the gangliosides are of great physiological importance, the ganglioside 9-0-acetyl-GD3 of the present invention is also very important and can be used effectively as a reagent in medical or biological research, in particular in melanoma research.
Le ganglioside selon la présente invention est le 9-0acétyl-GD3 provenant du lait de vache et il s'agit d'un nouveau ganglioside dont la structure de la partie céramide est différente de celle du 9-0-acétyl-GD3 provenant des mélanomes humains. Grâce à la présente invention, on dispose d'un réactif utile pour la recherche en médecine et en biochimie, en particulier pour la recherche concernant les mélanomes et on peut développer des produits pharmaceutiques ou diagnostiques. The ganglioside according to the present invention is 9-0acetyl-GD3 from cow's milk and it is a new ganglioside whose structure of the ceramide part is different from that of 9-0-acetyl-GD3 from melanomas. humans. Thanks to the present invention, a reagent which is useful for research in medicine and in biochemistry, in particular for research concerning melanomas, is available and pharmaceutical or diagnostic products can be developed.
Les exemples non limitatifs suivants sont destinés à illustrer la présente invention. The following nonlimiting examples are intended to illustrate the present invention.
Exemple 1
On a dissous trois kilogrammes de petit lait dans 30 litres d'eau chaude et on a ajouté à cette solution 80 litres de méthanol. On a agité le mélange à la température ambiante pendant 30 minutes et on a ajouté au mélange 40 litres de chloroforme. On a agité de nouveau le mélange à la température ambiante pendant 30 minutes pour extraire les gangliosides.Example 1
Three kilograms of whey were dissolved in 30 liters of hot water and 80 liters of methanol were added to this solution. The mixture was stirred at room temperature for 30 minutes and 40 liters of chloroform was added to the mixture. The mixture was again stirred at room temperature for 30 minutes to extract the gangliosides.
Puis, après avoir filtré la solution extraite et l'avoir concentrée par séchage, on a ajouté au concentré 500 ml de mélange chloroforme-méthanol (2:1 en volume). On a agité le mélange résultant à la température ambiante pendant 30 minutes puis on l'a filtré. Au filtrat ainsi obtenu on a ajouté 20 litres d'acétone puis on l'a laissé au repos pendant une nuit à 40C. Après l'avoir filtré, on a obtenu un précipité blanc. Then, after having filtered the extracted solution and having concentrated it by drying, 500 ml of chloroform-methanol mixture (2: 1 by volume) were added to the concentrate. The resulting mixture was stirred at room temperature for 30 minutes and then filtered. To the filtrate thus obtained, 20 liters of acetone were added and then left to stand overnight at 40C. After filtering it, a white precipitate was obtained.
On a dissous le précipité blanc dans un mélange chloroforme-méthanol-eau (30:60:8 en volume) et on a appliqué le mélange résultant sur une colonne (3,0 x 40 cm) de résine échangeuse d'ions (DEAE-Sephadexe A-25) pour permettre l'adsorption des gangliosides. Ensuite, on a élué les glycolipides neutres avec 1500 ml d'un mélange chloroforme-méthanol-eau (30:60:8 en volume) et 300 ml de méthanol, puis on a élué les gangliosides avec 300 ml d'une solution d'acétate de sodium 0,2M dans le méthanol. The white precipitate was dissolved in a chloroform-methanol-water mixture (30: 60: 8 by volume) and the resulting mixture was applied to a column (3.0 x 40 cm) of ion exchange resin (DEAE- Sephadexe A-25) to allow adsorption of gangliosides. Then, the neutral glycolipids were eluted with 1500 ml of a chloroform-methanol-water mixture (30: 60: 8 by volume) and 300 ml of methanol, then the gangliosides were eluted with 300 ml of a solution of 0.2M sodium acetate in methanol.
On a dialysé la solution d'extraction des gangliosides pour éliminer l'acétate de sodium puis on l'a séchée par évaporation au moyen d'un évaporateur pour obtenir 1,2 g de gangliosides sous forme d'une poudre blanche. Cette poudre blanche était un composé du 9-0-acétyl-GD3 contenant 24 mg de 9-0-acétyl-GD3 pour un total de 1,2 g. The ganglioside extraction solution was dialyzed to remove the sodium acetate and then dried by evaporation using an evaporator to obtain 1.2 g of gangliosides in the form of a white powder. This white powder was a 9-0-acetyl-GD3 compound containing 24 mg of 9-0-acetyl-GD3 for a total of 1.2 g.
On a dissous cette poudre dans un mélange chloroformeméthanol-eau (70:30:3 en volume) et on a appliqué le mélange obtenu sur une colonne de gel de silice (3,0 x 100 cm) pour permettre l'adsorption des gangliosides. Ensuite, on a élué les fractions dépourvues de gangliosides avec 1,5 litre d'un mélange chloroforme-methanol-eau (70:30:3 en volume). Puis, on a élué le 9-0-acétyl-GD3 par fractionnement avec 5 litres de mélange chloroforme-méthanol-eau (65:35:35 en volume). On a confirmé la fraction contenant le 9-0-acétyl-GD3 par chromatographie en couche mince et on a recueilli le 9-0acétyl-GD3 que l'on a séché par évaporation à l'aide d'un évaporateur. On a ainsi obtenu 7,5 mg de 9-0-acétyl-GD3 présentant une pureté supérieure à 95% confirmée par chromatographie en couche mince. This powder was dissolved in a chloroform-methanol-water mixture (70: 30: 3 by volume) and the mixture obtained was applied to a column of silica gel (3.0 x 100 cm) to allow adsorption of the gangliosides. Next, the ganglioside-free fractions were eluted with 1.5 liters of a chloroform-methanol-water mixture (70:30: 3 by volume). Then, 9-0-acetyl-GD3 was eluted by fractionation with 5 liters of chloroform-methanol-water mixture (65:35:35 by volume). The fraction containing 9-0-acetyl-GD3 was confirmed by thin layer chromatography and the 9-0acetyl-GD3 was collected which was dried by evaporation using an evaporator. There was thus obtained 7.5 mg of 9-0-acetyl-GD3 having a purity greater than 95% confirmed by thin layer chromatography.
Exemple2
On a dissous 40 kilogrammes de babeurre en poudre dans 400 litres d'eau puis on a ajouté à la solution 1 kg de protéase de Bacillus subtilis. On a fait réagir la solution obtenue à pH 7,0, 400C pendant 15 heures en vue de la protéolyse puis on la chauffée à 900C pendant 10 minutes pour inactiver l'enzyme.Example2
40 kg of powdered buttermilk were dissolved in 400 liters of water and then 1 kg of Bacillus subtilis protease was added to the solution. The solution obtained was reacted at pH 7.0, 400C for 15 hours for proteolysis and then heated to 900C for 10 minutes to inactivate the enzyme.
Ensuite, on a filtré à 400C la solution ainsi obtenue à un débit de 15 litres/heure et sous une pression moyenne de 0,6 MPa à laide d'un dispositif d'ultrafiltration (module de type LAB-20, produit par la société DDS) muni d'une membrane d'ultrafiltration d'une surface de 0,36 m2 pour concentrer les gangliosides. Après l'avoir concentrée, on a recueilli la solution à partir du bain de concentration et on l'a lyophilisée; on a ainsi obtenu 3000 g de poudre. Then, the solution thus obtained was filtered at 400C at a flow rate of 15 liters / hour and under an average pressure of 0.6 MPa using an ultrafiltration device (module type LAB-20, produced by the company DDS) fitted with an ultrafiltration membrane with a surface area of 0.36 m2 to concentrate the gangliosides. After concentrating, the solution was collected from the concentration bath and lyophilized; 3000 g of powder were thus obtained.
Ensuite, on a ajouté à la poudre 5 litres de mélange chloroforme-méthanol (2:1 en volume) et on a agité le mélange obtenu à la température ambiante pendant 30 minutes puis on l'a filtré. Au filtrat ainsi obtenu on a ajouté 40 litres d'acétone et on l'a laissé au repos pendant une nuit à 40C. Après filtration on a obtenu un précipité blanc. Then, 5 liters of chloroform-methanol mixture (2: 1 by volume) were added to the powder and the resulting mixture was stirred at room temperature for 30 minutes and then filtered. To the filtrate thus obtained, 40 liters of acetone were added and left to stand overnight at 40C. After filtration, a white precipitate was obtained.
On a dissous le précipité blanc dans un mélange chloroforme-méthanol-eau (30:60:8 en volume) et on a appliqué le mélange résultant sur une colonne (100 x 60 cm) de résine échangeuse d'ions (DEAE-Sephadexe A-25) pour permettre l'adsorption des gangliosides. The white precipitate was dissolved in a chloroform-methanol-water mixture (30: 60: 8 by volume) and the resulting mixture was applied to a column (100 x 60 cm) of ion exchange resin (DEAE-Sephadexe A -25) to allow adsorption of gangliosides.
Puis on a élué les glycolipides neutres avec 15 litres d'un mélange chloroforme-méthanol-eau (30:60:8 en volume) et 5 litres de méthanol, après quoi on a élué les gangliosides avec 25 litres d'une solution d'acétate de sodium 0,2 M dans le méthanol. Then the neutral glycolipids were eluted with 15 liters of a chloroform-methanol-water mixture (30: 60: 8 by volume) and 5 liters of methanol, after which the gangliosides were eluted with 25 liters of a solution of 0.2 M sodium acetate in methanol.
On a dialysé l'éluat de gangliosides pour éliminer l'acétate de sodium puis on l'a séché par évaporation à l'aide d'un évaporateur; on a ainsi obtenu 5,4 g de gangliosides sous forme d'une poudre blanche. Cette poudre était un composé du 9-0-acétyl-GD3 contenant 100 mg de 9-0acétyl-GD3 pour un total de 5,4 g. The ganglioside eluate was dialyzed to remove the sodium acetate and then dried by evaporation using an evaporator; 5.4 g of gangliosides were thus obtained in the form of a white powder. This powder was a 9-0-acetyl-GD3 compound containing 100 mg of 9-0acetyl-GD3 for a total of 5.4 g.
On a dissous cette poudre dans un mélange chloroformeméthanol-eau (70:30:3 en volume) et on a appliqué le mélange résultant sur une colonne de gel de silice (3,3 x 120 cm) pour permettre l'adsorption des gangliosides. Ensuite, on a élué les fractions dépourvues de gangliosides avec 2,5 litres d'un mélange chloroforme-méthanol-eau (70:30:3 en volume). Puis, on a élué le 9-0-acétyl-GD3 par fractionnement avec 5 litres d'un mélange chloroformeméthanol-eau (65:35:3,5 en volume). On a confirmé par chromatographie en couche mince la fraction contenant le 90-acétyl-GD3 et on a recueilli le 9-0-acétyl-GD3 que l'on a séché par évaporation à l'aide d'un évaporateur. On a ainsi obtenu 100 mg de 9-0-acétyl-GD3 d'une pureté supérieure à 95% confirmée par chromatographie en couche mince. This powder was dissolved in a chloroform-methanol-water mixture (70: 30: 3 by volume) and the resulting mixture was applied to a column of silica gel (3.3 x 120 cm) to allow adsorption of the gangliosides. Next, the ganglioside-free fractions were eluted with 2.5 liters of a chloroform-methanol-water mixture (70: 30: 3 by volume). Then, 9-0-acetyl-GD3 was eluted by fractionation with 5 liters of a chloroform-methanol-water mixture (65:35: 3.5 by volume). The fraction containing 90-acetyl-GD3 was confirmed by thin layer chromatography and the 9-0-acetyl-GD3 was collected which was dried by evaporation using an evaporator. There was thus obtained 100 mg of 9-0-acetyl-GD3 with a purity greater than 95% confirmed by thin layer chromatography.
Exemple 3
Pour séparer les types moléculaires du 9-0-acétyl-GD3 provenant du lait de vache ou d'un produit laitier, on a utilisé 100 mg de 9-0-acétyl-GD3 obtenu selon l'exemple 2.Example 3
To separate the molecular types of 9-0-acetyl-GD3 from cow's milk or a dairy product, 100 mg of 9-0-acetyl-GD3 obtained according to Example 2 was used.
On a dissous le 9-0-acétyl-GD3 dans un mélange méthanol-eau (85:15 en volume) et on a appliqué le mélange obtenu sur une colonne en phase inverse C18 (3,3 x 120 cm,
YMC ODS).The 9-0-acetyl-GD3 was dissolved in a methanol-water mixture (85:15 by volume) and the mixture obtained was applied to a column in reverse phase C18 (3.3 x 120 cm,
YMC ODS).
Ensuite, on a elué les gangliosides avec 1,5 litre d'un mélange méthanol-eau (85:15 en volume) pour fractionner les types moléculaires de 9-0-acétyl-GD3 en surveillant l'absorbance à 205 nm. Next, the gangliosides were eluted with 1.5 liters of a methanol-water mixture (85:15 by volume) to fractionate the molecular types of 9-0-acetyl-GD3 by monitoring the absorbance at 205 nm.
On a obtenu six fractions correspondant à six pics d'absorption principaux. On a confirmé que chaque fraction était constituée par un type d'acide gras et un type de base à longue chaîne de la manière suivante: hexadécasphinganine (d 16:0) et acide docosanoique (C 22:0), hexadécasphinganine (d 16:0) et acide tricosanoique (C 23:0), hexadécasphinganine (d 16:0) et acide tétracosanoïque (C 24:0), sphingénine (d 16:0) et acide docosanoique (C 22:0), sphingénine (d 16:0) et acide tricosanoique (C 23:0), et sphingénine (d 16:0) et acide tétracosanoïque (C 24:0). Six fractions were obtained corresponding to six main absorption peaks. It was confirmed that each fraction was made up of a type of fatty acid and a basic long chain type as follows: hexadecasphinganine (d 16: 0) and docosanoic acid (C 22: 0), hexadecasphinganine (d 16: 0) and tricosanoic acid (C 23: 0), hexadecasphinganine (d 16: 0) and tetracosanoic acid (C 24: 0), sphingenine (d 16: 0) and docosanoic acid (C 22: 0), sphingenine (d 16 : 0) and tricosanoic acid (C 23: 0), and sphingenine (d 16: 0) and tetracosanoic acid (C 24: 0).
Ainsi, on a séparé six types moléculaires différents de 9-0acétyl-GD3. Thus, six different molecular types of 9-0acetyl-GD3 were separated.
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Also Published As
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|---|---|
| JPH0436294A (en) | 1992-02-06 |
| FR2662697B1 (en) | 1995-05-24 |
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