FR2657168A1

FR2657168A1 - Process for the preparation of a support for medical analysis

Info

Publication number: FR2657168A1
Application number: FR9000670A
Authority: FR
Inventors: Chateau Guy
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1990-01-12
Filing date: 1990-01-12
Publication date: 1991-07-19

Abstract

According to the invention, the process for the preparation of a support for medical analysis by adsorption of reagent consists in subjecting all or part of the surface of the support, for example the wells of a microtitre plate, to an electrical treatment and then placing the surface thus treated into contact with the reagent(s) to be adsorbed. The electrical treatment should increase the surface tension of the material constituting the support by at least 10%. For blood typing, the reagents are specific antibodies; for the detection of antibodies, the reagents are specific red blood cells.

Description

PROCEDE DE PREPARATION DE SUPPORTS D'ANALYSE MEDICALE
La présente invention concerne la préparation de supports d'analyse médicale , et en particulier de plaques de microtitration pour groupage sanguin en phase solide.PROCESS FOR THE PREPARATION OF MEDIA FOR MEDIA ANALYSIS
The present invention relates to the preparation of medical analysis supports, and in particular of microtitration plates for blood grouping in solid phase.

Le groupage sanguin est une analyse effectuée sur le sang d'un malade ou d'un donneur dans le but de réaliser des transfusions sanguines compatibles. Elle se fait par la recherche d'agglutinations susceptibles d'apparaître lorsqu'on met en présence un sérum-test et les globules rouges du sang dont on cherche à déterminer le groupe. Blood grouping is an analysis carried out on the blood of a patient or a donor in order to carry out compatible blood transfusions. It is done by the search for agglutinations likely to appear when a test serum and red blood cells are brought together, the group of which we are trying to determine.

Traditionnellement les réactions d'agglutination étaient réalisées sur différents supports , soit des plaques dites d'opaline ou des tubes dits à hémolyse. Depuis quelques années l'usage de plaques de microtitration à fond en U s'est développé. Traditionally, agglutination reactions were carried out on various supports, either so-called opaline plates or so-called hemolysis tubes. In recent years the use of microtiter plates with U-bottom has developed.

Ces plaques présentent l'avantage de la miniaturisation par rapport aux tubes à hémolyse, puisque le volume de chaque cuvette est de l'ordre de 250 microlitres, à comparer aux 7ml d'un tube à hémolyse.These plates have the advantage of miniaturization compared to hemolysis tubes, since the volume of each cuvette is of the order of 250 microliters, compared to the 7 ml of a hemolysis tube.

Pour réaliser un test d'agglutination , on dépose dans chaque cuvette d'une plaque de microtitration 50 microlitres de réactif ( sérum-test ou globule-test) dilué en moyenne de 5 à 10 fois ; on ajoute 50 microlitres d'une suspension globulaire réalisée à partir du sang dont on cherche à déterminer le groupe puis on effectue différentes opérations : agitation pour homogénéiser le mélange, incubation , centrifugation pour accélérer l'agglutination , agitation pour remettre en suspension homogène les hématies non agglutinées de manière à distinguer si la réaction est positive ou négative ; enfin on interprète les résultats en fonction de la présence ou non d'agglutinats, soit visuellement soit grâce à un lecteur automatique. To carry out an agglutination test, 50 microliters of reagent (test serum or test globule) diluted on average 5 to 10 times are placed in each microtiter plate of a microtiter plate; 50 microliters of a globular suspension made from blood are added, the group of which is sought to be determined, then various operations are carried out: agitation to homogenize the mixture, incubation, centrifugation to accelerate agglutination, agitation to resuspend the red cells not agglutinated so as to distinguish whether the reaction is positive or negative; finally, the results are interpreted according to the presence or absence of agglutinates, either visually or using an automatic reader.

On a déjà proposé des plaques de microtitration dans les cuvettes desquelles les réactifs (sérum-test ou globules-tests) sont préalablement déposés puis séchés. De telles plaques sont donc prêtes à l'emploi. Cependant , après réhydratation des réactifs, le mode opératoire du test d'agglutination est inchangé, et le seul avantage réside dans le fait que l'utilisateur est dispensé d'acheter des réactifs en flacon. Microtiter plates have already been proposed in the cuvettes of which the reagents (test serum or test globules) are deposited beforehand and then dried. Such plates are therefore ready for use. However, after rehydration of the reagents, the procedure for the agglutination test is unchanged, and the only advantage lies in the fact that the user is dispensed from buying reagents in a bottle.

Afin de simplifier les tests d'agglutination, on a aussi proposé des plaques de microtitration dans les cuvettes desquelles des anticorps d'origine humaine purifiés sont déposés et fixés par adsorption. Ces plaques sont dans un matériau plastique, notamment en polystirène, qui présente la propriété , lorsqu'il est mis en contact avec une solution contenant des protéines, d'absorber une partie de ces protéines. Les anticorps purifiés par chromatographie d'affinité sont mis en solution tamponnée phosphate, laquelle solution est déposée dans les cuvettes de la plaque de microtitration et laissée en contact pendant plusieurs heures. Les anticorps non fixés sont éliminés par rinçage à l'eau physiologique. Les plaques sont conservées humides.Du fait que les plaques sont préparées à partir d'anticorps purifiés , le test d'agglutination ne comporte plus qu'une addition de la suspension globulaire et qu'une centrifugation. In order to simplify the agglutination tests, microtitration plates have also been proposed in the cuvettes from which purified antibodies of human origin are deposited and fixed by adsorption. These plates are made of a plastic material, in particular of polystirene, which has the property, when it is brought into contact with a solution containing proteins, of absorbing a part of these proteins. The antibodies purified by affinity chromatography are put in phosphate buffered solution, which solution is deposited in the cuvettes of the microtitration plate and left in contact for several hours. The unbound antibodies are removed by rinsing with physiological water. The plates are kept moist. Since the plates are prepared from purified antibodies, the agglutination test only involves adding the globular suspension and centrifuging.

Cependant le mode de préparation précité , décrit
TRANSFUSION 1985 ; 25 : 21-23 présente différents inconvénients.However the aforementioned mode of preparation, described
TRANSFUSION 1985; 25: 21-23 has various disadvantages.

Son rendement est faible , son temps de préparation est important.Its yield is low, its preparation time is important.

On pourrait compléter ou remplacer l'adsorption passive des anticorps par le matériau plastique par une adsorption active en utilisant comme fixateur le glutaraldéhyde à 0,25% , comme cela a été préconisé dans le J. Immunol,meth 1979 ; 26 : 87-95. Mais cette méthode présente l'inconvénient de détruire certains déterminants antigéniques et son application est donc limitée dans les recherches d'anticorps aux seules spécificités non altérées. One could supplement or replace the passive adsorption of antibodies by the plastic material by an active adsorption using as glutaraldehyde at 0.25%, as was recommended in J. Immunol, meth 1979; 26: 87-95. However, this method has the drawback of destroying certain antigenic determinants and its application is therefore limited in the search for antibodies to only unaltered specificities.

Le problème que vise à résoudre le demandeur est d'améliorer la préparation des supports d'analyse médicale , et en particulier des plaques de microtitration pour groupage sanguin selon la méthode précitée d'adsorption passive dite en phase solide. The problem which the applicant aims to solve is to improve the preparation of medical analysis supports, and in particular microtiter plates for blood grouping according to the aforementioned passive adsorption method known as in solid phase.

Ce but est atteint par le procédé de préparation selon l'invention. Ledit procédé consiste à soumettre tout ou partie de la surface du support à un traitement électrique , puis à mettre la surface ainsi traitée en contact avec le ou les réactifs à adsorber. This object is achieved by the preparation process according to the invention. Said method consists in subjecting all or part of the surface of the support to an electrical treatment, then putting the surface thus treated in contact with the reagent (s) to be adsorbed.

De façon inattendue , le demandeur a constaté qu'un traitement électrique de la surface du support améliorait de manière importante les propriétés d'adsorption du matériau constitutif du support pour les réactifs mis en jeu dans les analyses médicales , lorsque la mise en contact de la surface traitée électriquement avec le ou les réactifs intervenait dans un délai raisonnable , après le traitement , ce délai étant fonction du matériau et du traitement. Unexpectedly, the applicant has found that an electrical treatment of the surface of the support significantly improves the adsorption properties of the material constituting the support for the reagents used in medical analyzes, when the contacting of the surface electrically treated with the reagent (s) occurred within a reasonable time, after treatment, this time being dependent on the material and the treatment.

Bien sûr on sait que les traitements thermiques sont utilisés dans l'industrie des plastiques pour permettre l'accrochage en surface d'encres, de vernis, de colles ou d'enduction d'autres matières plastiques. Of course we know that heat treatments are used in the plastics industry to allow adhesion on the surface of inks, varnishes, adhesives or coating of other plastics.

Cependant il n'était pas évident qu'un tel traitement modifierait l'adsorption d'un matériau donné vis-à-vis de réactifs pour analyse médicale du type anticorps , et que ces réactifs garderaient , une fois fixés , leur capacité de réaction. C'est le mérite de l'invention que d'avoir osé faire cette transposition d'un traitement usuel de l'industrie des matières plastiques dans le domaine médical , et d'avoir vérifié l'amélioration apportée. However, it was not obvious that such a treatment would modify the adsorption of a given material towards reagents for medical analysis of the antibody type, and that these reagents would keep, once fixed, their reaction capacity. It is the merit of the invention to have dared to make this transposition of a usual treatment of the plastics industry in the medical field, and to have verified the improvement made.

Selon le mode préféré de l'invention, le support d'analyse médicale est une plaque de microtitration pour groupage sanguin selon la méthode en phase solide et les réactifs à adsorber sont des sérums-tests ou globules-tests en solution. According to the preferred embodiment of the invention, the medical analysis support is a microtiter plate for blood grouping according to the solid phase method and the reagents to be adsorbed are test sera or test globules in solution.

De préférence , le support est en polychlorure de vinyle, dont la capacité d'adsorption vis-à-vis des réactifs est particulièrement importante, après traitement électrique. Preferably, the support is made of polyvinyl chloride, whose adsorption capacity with respect to the reactants is particularly high, after electrical treatment.

Le traitement électrique destiné à modifier la surface du support selon l'invention est d'un type connu dans l'industrie des matières plastiques , par exemple la décharge électrique dite aussi effet couronne ou Corona su encore le plasma différé de micro-ondes. The electrical treatment intended to modify the surface of the support according to the invention is of a type known in the plastics industry, for example the electric discharge also known as corona effect or still known as delayed microwave plasma.

D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture de la description qui va être faite d'un exemple de préparation d'une plaque de microtitration pour groupage sanguin, illustré par le dessin annexé dans lequel la figure unique est une vue en perspective d'une plaque à 96 cuvettes. Other advantages and characteristics of the invention will appear on reading the description which will be given of an example of preparation of a microtiter plate for blood grouping, illustrated by the appended drawing in which the single figure is a view. in perspective of a plate with 96 bowls.

La plaque 1 de microtitration comporte 96 cuvettes 2 réparties en douze rangées de huit cuvettes Chaque cuvette 2 a un volume utile de l'ordre de 150 à 200 microlitres. Le fond 3 a une forme conique , sa section ayant une forme en Vé. Les cuvettes 2 sont solidaires par leur bord supérieur 2a du support-cuvettes 4, qui comporte des prolongements 5 débordant perpendiculairement au plan formé par les bords supérieurs 2a des cuvettes 2, de sorte que la plaque 1 peut être posée à plat sur les prolongements 5 en forme de rectangle. The microtiter plate 1 comprises 96 cuvettes 2 distributed in twelve rows of eight cuvettes Each cuvette 2 has a useful volume of the order of 150 to 200 microliters. The bottom 3 has a conical shape, its section having a V-shape. The bowls 2 are secured by their upper edge 2a to the bowl holder 4, which has extensions 5 projecting perpendicular to the plane formed by the upper edges 2a of the bowls 2, so that the plate 1 can be placed flat on the extensions 5 in the shape of a rectangle.

La plaque 1 est en polychlorure de vinyle , elle est obtenue par moulage. Elle est soumise à un traitement électrique par décharge à partir d'une électrode dite à chaînettes , chaque chaînette pénétrant dans une cuvette. La puissance mise en oeuvre, la distance entre l'électrode et la surface de la plaque et les autres conditions de traitement sont déterminées pour obtenir une augmentation de la tension superficielle de la plaque 1 d'au moins dix pour cent. The plate 1 is made of polyvinyl chloride, it is obtained by molding. It is subjected to an electrical treatment by discharge from a so-called chain electrode, each chain entering a bowl. The power used, the distance between the electrode and the surface of the plate and the other processing conditions are determined to obtain an increase in the surface tension of the plate 1 of at least ten percent.

Par analogie avec l'industrie des matières plastiques, on détermine l'intensité du traitement par l'évolution subséquente de la tension superficielle. Avant traitement électrique , la valeur de la tension superficielle de la plaque: est de 38 dyn. On a obtenu des résultats particulièrement intéressants avec un traitement ayant conduit à une tension superficielle de 50 dyn. By analogy with the plastics industry, the intensity of the treatment is determined by the subsequent development of the surface tension. Before electrical treatment, the value of the surface tension of the plate: is 38 dyn. Particularly interesting results have been obtained with a treatment which has led to a surface tension of 50 dyn.

Dans le délai d'une heure après le traitement électrique, on dépose dans chacune des cuvettes 2 50 microlitres de solution d'IgM spécifique à une concentration de 1 mg/ml en eau physiologique ou en tampon phosphate pH 7,2. On laisse en contact pendant 10 à 20 mm à l'étuve à 370C , puis on lave à l'eau physiologique à 90/,.,. de chlorure de sodium . Enfin on laisse sécher la plaque 1 pendant 2 heures à l'étuve à 370C. Within one hour after the electrical treatment, 250 microliters of specific IgM solution at a concentration of 1 mg / ml in physiological water or in phosphate buffer pH 7.2 are deposited in each of the cuvettes. Is left in contact for 10 to 20 mm in an oven at 370C, then washed with physiological water at 90 /,.,. sodium chloride. Finally, the plate 1 is left to dry for 2 hours in an oven at 370C.

La plaque 1 est prête à l'emploi. Plate 1 is ready for use.

Pour réaliser le test d'agglutination, on ajoute 50 microlitres d'hématies en suspension à 0,1 % en eau physiologique ou en tampon , puis on centrifuge une minute à 300 g environ. To carry out the agglutination test, 50 microliters of red cells in suspension at 0.1% in physiological water or in buffer are added, then centrifuged for one minute at approximately 300 g.

Sous 1' influence de la force centrifuge , les hématies descendent dans la cuvette 2 et viennent en contact des molécules d'IgM qui sont fixées par adsorption sur les parois de la cuvette 2, et qui portent l'activité anticorps spécifique. Under the influence of the centrifugal force, the red cells descend into the cuvette 2 and come into contact with the IgM molecules which are fixed by adsorption on the walls of the cuvette 2, and which carry the specific antibody activity.

S'il y a correspondance entre la spécificité anticorps de l'IgM et les antigènes portés par la membrane du globule rouge, celui-ci est capté par l'IgM et reste fixé, grâce à la liaison anticorps-antigène, à la paroi de la cuvette. If there is a correspondence between the antibody specificity of IgM and the antigens carried by the membrane of the red blood cell, the latter is taken up by IgM and remains fixed, thanks to the antibody-antigen bond, to the wall of the bowl.

S'il n'y a pas correspondance , le globule rouge descend le long de la paroi sans s'y fixer jusqu'au centre du fond 3 de la cuvette 2. If there is no match, the red blood cell descends along the wall without fixing itself to the center of the bottom 3 of the bowl 2.

Ainsi une réaction positive se traduit par un voile monocouche d'hématies captées sur la paroi de la cuvette, produisant visuellement une teinte rosée homogène. Thus a positive reaction results in a monolayer veil of red blood cells captured on the wall of the bowl, visually producing a homogeneous pink tint.

Une réaction négative se manifeste par un culot de sédimentation au centre du fond conique 3 de la cuvette 2. A negative reaction is manifested by a sedimentation pellet in the center of the conical bottom 3 of the bowl 2.

La lecture du phénomène d'agglutination est grandement facilitée , tant visuellement que de manière automatique par lecteur photométrique ou densitométrique. Reading the agglutination phenomenon is greatly facilitated, both visually and automatically by photometric or densitometric reader.

On comprend que le traitement électrique vise à augmenter les propriétés d'adsorption , de la surface du support d'analyse qui est destinée à fixer les réactifs par adsorption, voire même à conférer au matériau de telles propriétés si celles-ci n'existent pas naturellement . Il n'est donc pas nécessaire d'effectuer le traitement électrique sur toute la surface du support , le traitement pouvant être localisé aux seules zones d'adsorption, notamment de l'intérieur des cuvettes de microtitration . Cependant un traitement électrique sur toute la surface ne s'avère pas gênant. It is understood that the electrical treatment aims to increase the adsorption properties of the surface of the analysis support which is intended to fix the reagents by adsorption, or even to give the material such properties if they do not exist. naturally. It is therefore not necessary to carry out the electrical treatment on the entire surface of the support, the treatment being able to be located only at the adsorption zones, in particular from the interior of the microtitration cuvettes. However, an electrical treatment over the entire surface is not a problem.

Grâce au procédé de l'invention , on a pu préparer de nombreux supports d'analyse médicale , par exemple des plaques de phénotypage sanguin comportant les spécificités suivantes anti-A, anti-B, anti-A.B, anti-D (Rhésus), anti-C (RH 2), anti-E (RH 3). Thanks to the process of the invention, it has been possible to prepare numerous medical analysis supports, for example blood phenotyping plates comprising the following specificities anti-A, anti-B, anti-AB, anti-D (Rhesus), anti-C (RH 2), anti-E (RH 3).

Pour la recherche d'anticorps , on a préparé des plaques de microtitration sur lesquelles ont été fixées, après traitement électrique , des hematies A1 , A2, B et 0. Après fixation sur le support, les hématies sont hémolysées puis séchées . Le protocole d'utilisation de telles plaques comporte les opérations suivantes: incubation des sérums à tester, lavage pour éliminer les anticorps non fixés sur le tapis de globules , addition d'une suspension de globules recouverts d'antiglobuline humaine, centrifugation et lecture. For the search for antibodies, microtiter plates were prepared on which red blood cells A1, A2, B and 0 were fixed after electrical treatment. After fixing on the support, the red blood cells are hemolyzed and then dried. The protocol for using such plates comprises the following operations: incubation of the sera to be tested, washing to remove the antibodies which are not fixed on the cell pool, addition of a suspension of cells coated with human antiglobulin, centrifugation and reading.

L'effet du traitement électrique se dissipe dans le temps, il est donc important que la mise au contact de la surface traitée du support et des réactifs soit réalisée dans un bref délai après le traitement électrique, en tout état de cause un délai suffisant pour que l'augmentation de la tension superficielle du matériau soit au moins de 10% lors de la mise en contact. The effect of the electrical treatment dissipates over time, it is therefore important that the contacting of the treated surface with the support and the reagents be carried out as soon as possible after the electrical treatment, in any event sufficient time for that the increase in the surface tension of the material is at least 10% when brought into contact.

L'invention n'est pas limitée au mode de réalisation qui a été décrit à titre d'exemple non exhaustif, mais en couvre toutes les variantes. The invention is not limited to the embodiment which has been described by way of non-exhaustive example, but covers all variants thereof.

Claims

1. A method of preparing a medical analysis support by adsorption of reagent, characterized in that it consists in subjecting all or part of the surface of the support to an electrical treatment, then putting the surface thus treated in contact with the or the reagents to adsorb.

2. Method according to claim 1 characterized in that the analysis support is in a plastic material naturally having adsorption properties called passive vis-à-vis the reagents whereby the method improves said properties.

3. Method according to claim 2 characterized in that the support is made of polyvinyl chloride.

4. Method according to claim 1 characterized in that, the support being a microtitration plate, the electrical treatment consists in carrying out an electrical discharge, of the crown type, in the cuvettes (2) thanks to a chain electrode.

5. Method according to claim 1 characterized in that the contacting of the treated surface and the reagents takes place within a time such that the surface tension of the treated support is at least, when brought into contact, 10% (ten for cent) greater than that of the untreated support.

6. Method according to claim 1 for preparing a support for blood grouping in which the reagents to be adsorbed are specific antibodies, such as anti-A, anti-B, anti-AB, anti-D, anti-C, anti-E .

7. Method according to claim 1 for preparing a support for the search for antibodies, in which the reagents to be absorbed are specific red cells, such as A1, A2, B and 0.