FR2657167A1 - Process for in vitro prenatal screening of foetal trisomy 21 in a biological sample capable of containing hCG and set for its implementation - Google Patents
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Abstract
Description
PROCEDE DE DEPISTAGE PRENATAL IN VITRE DE LA TRISOMIE 21 FOETALE DANS UN ECHANTILLON BIOLOGIQUE SUSCEPTIBLE
DE CONTENIR DE L'hCG ET NECESSAIRE POUR SA MISE EN oeUVRE. PRENATAL SCREENING PROCESS IN FACE OF FETAL TRISOMY 21 IN A SUSCEPTIBLE BIOLOGICAL SAMPLE
TO CONTAIN hCG AND NECESSARY FOR ITS IMPLEMENTATION.
La présente invention concerne un procédé de dépistage prénatal in vitre de la trisomie 21 dans un échantillon susceptible de contenir de la gonadotropine chorionique humaine ainsi que le nécessaire ou "kit" pour la mise en oeuvre de ce procédé. The present invention relates to a method of prenatal in vitro screening for trisomy 21 in a sample capable of containing human chorionic gonadotropin as well as the kit or "kit" for the implementation of this method.
La gonadotropine chorionique humaine, ci-après dénommée hCG est une hormone glycoprotéique d'un poids moléculaire de 48000 qui est constituée de deux sous-unités polypeptidiques alpha et bêta. La sous-unité alpha est commune à plusieurs hormones, la LH, la FSH, la TSH; la sous-unité bêta confère à l'hormone sa spécificité immunologique. L'activité biologique de lthormone requiert l'association des deux sous-unités alpha et bêta de l'hCG, ci-après dénommée hCG totale. Human chorionic gonadotropin, hereinafter called hCG is a glycoprotein hormone with a molecular weight of 48,000 which is made up of two polypeptide subunits alpha and beta. The alpha subunit is common to several hormones, LH, FSH, TSH; the beta subunit gives the hormone its immunological specificity. The biological activity of the hormone requires the combination of the two alpha and beta subunits of hCG, hereinafter referred to as total hCG.
Le dosage de l'hCG totale est utilisé pour le diagnostic de la grossesse, comme cela est proposé notamment dans la demande de brevet français NO 2 407 475. The total hCG assay is used for the diagnosis of pregnancy, as is proposed in particular in French patent application NO 2 407 475.
Le dosage de lThCG totale a également été proposé pour le dépistage prénatal de la trisomie 21 foetale (voir notamment RUTA, D. A. et al, The Lancet, 24 septembre 1988, page 752; WHITE, I. et al,The New England Journal of
Medicine, Vol. 320, NO. 6, 9 février 1989)
Le dosage de l'hCG totale, entre la 14ème et la 18ème et préférentiellement entre 14ème et la 15ème semaine d'aménorrhée, permet de sélectionner un groupe de femmes à risque accru de trisomie 21 foetale. Dans ce groupe, les concentrations sériques en hCG totale se situent au-dessus d'une médiane déterminée chez des femmes à grossesse dite "normale". The assay of total THCG has also been proposed for prenatal screening for fetal trisomy 21 (see in particular RUTA, DA et al, The Lancet, September 24, 1988, page 752; WHITE, I. et al, The New England Journal of
Medicine, Vol. 320, NO. February 6, 9, 1989)
The determination of total hCG, between the 14th and 18th and preferably between 14th and 15th week of amenorrhea, makes it possible to select a group of women at increased risk of fetal trisomy 21. In this group, the serum total hCG concentrations are above a determined median in women with "normal" pregnancy.
L'étude clinique rétrospective effectuée par la demanderesse chez des femmes jeunes, moins de 38 ans a permis de confirmer cette observation. Le dosage de l'hCG totale permet de détecter environ 50 % des trisomies. The retrospective clinical study carried out by the applicant on young women, under 38 years of age, confirmed this observation. The total hCG assay can detect approximately 50% of Down's syndrome.
L'invention a pour but d'améliorer la sensibilité du test afin de diminuer le nombre de femmes dans le groupe à risque et donc de diminuer le nombre de caryotypes à effectuer. Un autre but du procédé de l'invention est de s'appliquer à l'ensemble des femmes enceintes, quel que soit leur âge. The invention aims to improve the sensitivity of the test in order to reduce the number of women in the risk group and therefore to reduce the number of karyotypes to be performed. Another object of the process of the invention is to apply to all pregnant women, whatever their age.
Ces buts sont atteints selon l'invention qui fournit un procédé de dépistage prénatal in vitre de la trisomie 21 dans un échantillon biologique susceptible de contenir de l'hCG caractérisé en ce qu'il comprend
- le dosage des chaînes bêta de l'hCG dissociées des chaînes alpha, ci-après dénommées hCG bêta libre, entre la 14ème et la 18même semaine d'aménohrrée;
- le dosage des chaînes bêta de 1'hCG dissociées ou non des chaînes alpha, ci-après dénommées hCG bêta totale, dans le même échantillon; hCG bêta libre
- la comparaison du rapport hCG bêta totale à
hCG bêta libre une valeur seuil correspondant au rapport hCG bêta totale normale, mesurée la même semaine.These objects are achieved according to the invention which provides a method of prenatal in-vitro screening for trisomy 21 in a biological sample capable of containing hCG, characterized in that it comprises
- the determination of the beta chains of hCG dissociated from the alpha chains, hereinafter called free beta hCG, between the 14th and 18th week of amenohrrea;
the assay of the beta chains of 1'hCG dissociated or not from the alpha chains, hereinafter called total beta hCG, in the same sample; hCG free beta
- comparison of the total beta hCG ratio to
hCG free beta a threshold value corresponding to the ratio hCG total beta normal, measured the same week.
Les travaux de recherche menés par la demanderesse ont permit d'affiner le dépistage des femmes porteuses de foetus trisomique 21 en complétant le dosage de lthCG totale par celui des chaînes bêta de l'hCG dissociées des chaînes alpha et par celui des chaînes bêta de l'hCG dissociées ou non des chaînes alpha et en comparant le hCG bêta libre rapport hCG bêta totale à une valeur seuil correspondant au
hCG bêta libre rapport hCG bêta totale déterminé chez des femmes à grossesse dite "normale" la même semaine d'aménohrrée.The research carried out by the applicant has made it possible to refine the screening of women carrying a Down's syndrome fetus by supplementing the assay of total lthCG by that of the beta chains of hCG dissociated from the alpha chains and by that of the beta chains of the 'hCG dissociated or not from the alpha chains and by comparing the free beta hCG ratio total hCG beta to a threshold value corresponding to the
hCG free beta ratio total hCG beta determined in women with "normal" pregnancy the same week of amenohrrea.
Le cumul des deux dosages hCG bêta libre et hCG bêta totale sur un même échantillon permet de détecter 82 % des Trisomies 21 au lieu de 50 % avec le seul dosage de l'hCG totale. The combination of the two free beta hCG and total beta hCG assays on the same sample makes it possible to detect 82% of Trisomies 21 instead of 50% with the single assay of total hCG.
Le dosage de l'hCG bêta totale et/ou le dosage de l'hCG bêta libre sont avantageusement réalisés par des tests immunoenzymatiques, immunofluorescents, radioimmunologiques ou de radioimmunoprécipitation. The determination of total beta hCG and / or the determination of free beta hCG are advantageously carried out by immunoenzymatic, immunofluorescent, radioimmunological or radioimmunoprecipitation tests.
Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé de l'invention les dosages de l'hCG bêta totale et de l'hCG bêta libre sont réalisés par des tests immunologiques basés sur la méthode du "sandwich". According to a preferred embodiment of the process of the invention, the assays for total beta hCG and for free beta hCG are carried out by immunological tests based on the "sandwich" method.
Les tests immunologiques de types "sandwich" reposent sur la formation de complexes ternaires de la substance antigénique à doser, d'un premier anticorps insolubilisé et d'un deuxième anticorps marqué et lié à l'antigène en un site différent de celui reconnu par le premier anticorps. Immunological tests of the “sandwich” type are based on the formation of ternary complexes of the antigenic substance to be assayed, of a first insolubilized antibody and of a second antibody labeled and bound to the antigen at a site different from that recognized by the first antibody.
De manière avantageuse les dosages de l'hCG bêta totale et de l'hCG bêta libre sont réalisés de la façon suivante
- le dosage de l'hCG bêta totale est réalisé par un test immunologique de type "sandwich" utilisant deux anticorps spécifiques de la chaîne bêta de l'hCG, lesdits anticorps liant l'antigène en deux sites différents, lesdits sites étant accessibles que les chaînes alpha et bêta de l'hCG soient dissociées ou non.Advantageously, the assays of total beta hCG and of free beta hCG are carried out as follows
the assay for total beta hCG is carried out by an immunological test of the "sandwich" type using two antibodies specific for the beta chain of hCG, said antibodies binding the antigen at two different sites, said sites being accessible only by hCG alpha and beta chains are dissociated or not.
- le dosage de l'hCG bêta libre est réalisé par un test immunologique de type "sandwich" utilisant deux anticorps spécifiques de la chaîne bêta de lthCG, lesdits anticorps liant l'antigène en deux sites différents, lesdits sites étant accessibles uniquement lorsque les chaînes bêta de l'hCG sont dissociées des chaînes alpha. - the determination of free beta hCG is carried out by an immunological test of the "sandwich" type using two antibodies specific for the beta chain of lthCG, said antibodies binding the antigen at two different sites, said sites being accessible only when the chains hCG beta are dissociated from alpha chains.
La sous-unité alpha étant commune à plusieurs hormones, on préfère, afin d'éviter toute interférence avec d'autres hormones éventuellement présentes dans l'échantillon biologique, utiliser des anticorps spécifiques de la chaîne bêta de l'hCG. The alpha subunit being common to several hormones, it is preferred, in order to avoid any interference with other hormones possibly present in the biological sample, to use antibodies specific for the beta chain of hCG.
La chaîne bêta pouvant exister soit sous forme libre, soit associée à la chaîne alpha, certains sites ne sont accessibles que lorsque la chaîne bêta est libre, d'autres sites ne sont accessibles que lorsque la chaîne bêta est associée à la chaîne alpha, d'autres enfin sont accessibles que la chaîne bêta soit associée ou non à la chaîne alpha. The beta chain can exist either in free form or associated with the alpha chain, some sites are only accessible when the beta chain is free, other sites are only accessible when the beta chain is associated with the alpha chain, d Finally, others are accessible whether the beta chain is associated with the alpha chain or not.
On préfère donc, afin d'augmenter la spécificité du test, utiliser pour le dosage de I'hCG bêta totale deux anticorps liant l'antigène en deux sites différents accessibles que les chaînes alpha et bêta de l'hCG soient dissociées ou non, et pour le dosage de l?hCG bêta libre deux anticorps liant l'antigène en deux sites différents accessibles uniquement lorsque les chaînes bêta de l'hCG sont dissociées des chaînes alpha. It is therefore preferred, in order to increase the specificity of the test, to use for the determination of total beta hCG two antibodies binding the antigen at two different accessible sites whether the alpha and beta chains of hCG are dissociated or not, and for the determination of free beta hCG two antibodies binding the antigen at two different sites accessible only when the beta chains of hCG are dissociated from the alpha chains.
Les dosages de 1'hCG bêta totale et de l'hCG bêta libre selon des tests immunologiques basés sur la méthode du "sandwich" peuvent être effectués suivant plusieurs protocoles différents, notamment les trois protocoles suivants
- Un premier protocole consiste à mettre en contact l'échantillon biologique susceptible de contenir de l'hCG d'abord avec l'anticorps insolubilisé puis après un éventuel lavage avec l'anticorps marqué;
- Un second protocole consiste à mettre en contact l'échantillon biologique d'abord avec l'anticorps marqué puis après un éventuel lavage avec l'anticorps insolubilisé.The assays for total beta hCG and free beta hCG according to immunological tests based on the "sandwich" method can be carried out according to several different protocols, in particular the following three protocols
- A first protocol consists in contacting the biological sample likely to contain hCG first with the insolubilized antibody then after a possible washing with the labeled antibody;
- A second protocol consists in contacting the biological sample first with the labeled antibody then after a possible washing with the insolubilized antibody.
- Un troisième protocole consiste à mettre en contact l'échantillon simultanément avec les deux anticorps. - A third protocol consists in bringing the sample into contact simultaneously with the two antibodies.
De manière plus précise le procédé de dépistage de la Trisomie 21 de l'invention comprend, selon le troisième protocole, les étapes suivantes
a - mise en contact d'une première fraction de l'échantillon biologique avec deux anticorps spécifiques de la chaîne bêta de l'hCG liant l'antigène en deux sites différents, lesdits sites étant accessibles uniquement lorsque les chaînes bêta de lthCG sont dissociées des chaînes alpha; l'un des anticorps étant marqué, l'autre étant insolubilisé;
b - incubation pendant une durée suffisante pour provoquer la formation du complexe ternaire insoluble;
c - séparation de l'échantillon et de l'anticorps marqué ayant pas réagi;;
d - mesure de la quantité d'anticorps marqué engagé dans le complexe ternaire ou de la quantité d'anticorps marqué n'ayant pas réagi;
e - mise en relation de la quantité d'anticorps marqué mesurée en (d) avec la quantité d'anticorps marqué mesurée pour un échantillon témoin préparé conformément aux étapes (a) à (c), ledit échantillon témoin étant dépourvu de chaîne bêta d'hCG libres, pour déterminer la présence d'hCG bêta libre dans ledit échantillon biologique, ou mise en relation de la quantité d'anticorps marqué mesurée en (d) avec la quantité d'anticorps marqué mesurée dans des échantillons contenant des quantités connues de chaînes bêta d'hCG libres et préparés conformément aux étapes (a) à (c) pour déterminer la concentration en hCG bêta libre dans l'échantillon;;
f - mise en contact d'une seconde fraction de l'échantillon biologique avec deux anticorps spécifiques de la chaîne bêta de l'hCG liant l'antigène en deux sites différents, lesdits sites étant accessibles que les chaînes alpha et bêta de l'hCG soient dissociées ou non; l'un des anticorps étant marqué, l'autre insolubilisé;
g - incubation pendant une durée suffisante pour provoquer la formation du complexe ternaire insoluble;
h - séparation de l'échantillon et de l'anticorps marqué n'ayant pas réagi;
i - mesure de la quantité d'anticorps marqué engagé dans le complexe ternaire ou de la quantité d'anticorps marqué n'ayant pas réagi;;
j - mise en relation de la quantité d'anticorps marqué mesurée en (i) avec la quantité d'anticorps marqué mesurée pour un échantillon témoin préparé conformément aux etapes (f) à (h), ledit échantillon témoin étant dépourvu de chaînes bêta d'hCG, pour déterminer la présence d'hCG bêta totale dans ledit échantillon biologique, ou mise en relation de la quantité d'anticorps marqué mesurée en (i) avec la quantité d'anticorps mesurée dans des échantillons contenant des quantités connues de chaîne bêta d'hCG et préparés conformément aux étapes (f) à (h) pour déterminer la concentration en hCG bêta totale dans l'échantillon,
k - comparaison du rapport hCG bêta libre / hCG bêta totale à une valeur seuil correspondant au rapport hCG bêta libre / hCG bêta totale normale, mesurée la même semaine d'aménohrrée.More specifically, the trisomy 21 screening method of the invention comprises, according to the third protocol, the following steps
a - bringing a first fraction of the biological sample into contact with two antibodies specific for the hCG beta chain binding the antigen at two different sites, said sites being accessible only when the beta chains of lthCG are dissociated from alpha chains; one of the antibodies being labeled, the other being insolubilized;
b - incubation for a sufficient time to cause the formation of the insoluble ternary complex;
c - separation of the sample and of the unreacted labeled antibody;
d - measurement of the quantity of labeled antibody engaged in the ternary complex or of the quantity of unreacted labeled antibody;
e - relating the amount of labeled antibody measured in (d) to the amount of labeled antibody measured for a control sample prepared in accordance with steps (a) to (c), said control sample being devoid of beta chain d 'free hCG, to determine the presence of free beta hCG in said biological sample, or relating the amount of labeled antibody measured in (d) to the amount of labeled antibody measured in samples containing known amounts of free hCG beta chains prepared according to steps (a) to (c) to determine the concentration of free hCG beta in the sample;
f - bringing a second fraction of the biological sample into contact with two antibodies specific for the hCG beta chain binding the antigen at two different sites, said sites being accessible only the hCG alpha and beta chains whether dissociated or not; one of the antibodies being labeled, the other insolubilized;
g - incubation for a sufficient time to cause the formation of the insoluble ternary complex;
h - separation of the sample and of the unreacted labeled antibody;
i - measurement of the quantity of labeled antibody engaged in the ternary complex or of the quantity of unreacted labeled antibody;
j - relating the amount of labeled antibody measured in (i) to the amount of labeled antibody measured for a control sample prepared in accordance with steps (f) to (h), said control sample being free of beta d chains 'hCG, to determine the presence of total beta hCG in said biological sample, or relating the amount of labeled antibody measured in (i) to the amount of antibody measured in samples containing known amounts of beta chain hCG and prepared in accordance with steps (f) to (h) to determine the concentration of total hCG beta in the sample,
k - comparison of the ratio hCG free beta / hCG beta total to a threshold value corresponding to the ratio hCG free beta / hCG beta total normal, measured the same week of amenohrrea.
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du procédé de dépistage de la Trisomie 21 selon l'invention, les dosages de l'hCG bêta libre et de l'hCG bêta totale sont réalisés par des tests immunologiques de type "sandwich" utilisant trois anticorps, un premier anticorps insolubilisé, un deuxième anticorps marqué et un troisième anticorps identique au deuxième anticorps non marqué. According to an advantageous embodiment of the trisomy 21 screening method according to the invention, the assays of free beta hCG and of total beta hCG are carried out by immunological tests of the “sandwich” type using three antibodies. , a first insolubilized antibody, a second labeled antibody and a third antibody identical to the second unlabeled antibody.
L'utilisation d'un troisième anticorps permet de désaturer le deuxième anticorps et ainsi d'éviter l'effet crochet encore dénommé effet "Hook" dû à un excès d'antigène dans l'échantillon, ce troisième anticorps reconnait le même site que le deuxième anticorps mais n'est pas marqué. The use of a third antibody makes it possible to desaturate the second antibody and thus to avoid the hook effect also called "Hook" effect due to an excess of antigen in the sample, this third antibody recognizes the same site as the second antibody but is not labeled.
Pour améliorer la sensibilité et la spécificité du procédé au moins un des anticorps utilisés est un anticorps monoclonal. To improve the sensitivity and specificity of the method at least one of the antibodies used is a monoclonal antibody.
Selon une forme de mise en oeuvre préférée de l'invention la marque des anticorps marqués est choisie dans le groupe comprenant un isotope radioactif, une enzyme, une substance fluorescente, une molécule chargée électriquement, une particule colorée, la biotine, un composé organométallique et l'examen est effectué au moyen d'une méthode adaptée, radiométrique, fluorimétrique, enzymatique, électrique, colorimétrique ou par absorption des rayonnements infra-rouges. According to a preferred embodiment of the invention, the brand of labeled antibodies is chosen from the group comprising a radioactive isotope, an enzyme, a fluorescent substance, an electrically charged molecule, a colored particle, biotin, an organometallic compound and the examination is carried out using an appropriate method, radiometric, fluorimetric, enzymatic, electrical, colorimetric or by absorption of infrared radiation.
L'invention a également pour objet de fournir un nécessaire ou "kit" pour la mise en oeuvre du procédé de dépistage de la Trisomie 21 selon l'invention, comprenant au moins
- une quantité donnée de deux anticorps monoclonaux spécifiques de la chaîne bêta de l'hCG et liant l'antigène en deux sites différents, lesdits sites étant accessibles uniquement lorsque les chaînes bêta de l'hCG sont dissociées des chaînes alpha; l'un des anticorps étant marqué, l'autre étant insolubilisé;
- une quantité donnée de deux anticorps monoclonaux spécifiques de la chaîne bêta de l'hCG liant l'antigène en deux sites différents, lesdits sites étant accessibles que les chaînes alpha et bêta de l'hCG soient dissociées ou non; l'un des anticorps étant marqué, l'autre insolubilisé;
- des réactifs permettant la détection des anticorps marqués.The invention also aims to provide a kit or "kit" for the implementation of the Down's syndrome screening method according to the invention, comprising at least
a given quantity of two monoclonal antibodies specific for the beta chain of hCG and binding the antigen at two different sites, said sites being accessible only when the beta chains of hCG are dissociated from the alpha chains; one of the antibodies being labeled, the other being insolubilized;
- A given amount of two monoclonal antibodies specific for the beta chain of hCG binding the antigen at two different sites, said sites being accessible whether the alpha and beta chains of hCG are dissociated or not; one of the antibodies being labeled, the other insolubilized;
- reagents for the detection of labeled antibodies.
De manière avantageuse le "kit" précédent comprend une quantité donnée de deux anticorps monoclonaux non marqués spécifiques de la chaîne bêta de l'hCG, chacun liant l'antigène en un site identique de celui reconnu par chacun des anticorps marqués. Advantageously, the above “kit” comprises a given quantity of two unlabeled monoclonal antibodies specific for the hCG beta chain, each one binding the antigen at a site identical to that recognized by each of the labeled antibodies.
Le procédé de dépistage de la Trisomie 21 selon l'invention repose sur le dosage de l1hCG bêta libre et de l'hCG bêta totale, ces deux dosages peuvent être réalisés comme décrit précédemment en parallèle sur deux fractions du même échantillon mais ils peuvent être également réalisés simultanément sur une fraction unique de l'échantillon biologique susceptible de contenir de l'hCG. The trisomy 21 screening method according to the invention is based on the determination of 11 hCG free beta and total hCG beta, these two assays can be carried out as described previously in parallel on two fractions of the same sample but they can also be performed simultaneously on a single fraction of the biological sample likely to contain hCG.
Le dosage simultané de l'hCG bêta libre et de l'hCG bêta totale peut alors être effectué selon les quatres protocoles suivants
1) Le dosage simultané de l'hCG bêta libre et de l'hCG totale est effectué selon un test immunologique de type "sandwich" utilisant les quatre anticorps spécifiques de la chaînes bêta de l'hCG suivants
- un premier anticorps insolubilisé liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est dissociée de la chaîne alpha;
- un deuxième anticorps marqué par un premier marqueur liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est dissociée de la chaîne alpha, ledit site étant différent de celui reconnu par le premier anticorps;;
- un troisième anticorps insolubilisé liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est associée à la chaîne alpha;
- un quatrième anticorps marqué par un second marqueur différent du premier et liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est associée à la chaîne alpha, ledit site étant différent de celui reconnu par le troisième anticorps.The simultaneous determination of free beta hCG and total beta hCG can then be carried out according to the following four protocols
1) The simultaneous determination of free beta hCG and total hCG is carried out according to an immunological test of the "sandwich" type using the four antibodies specific for the following beta chain of hCG
- A first insolubilized antibody binding the beta chain of hCG at a site accessible only when the beta chain of hCG is dissociated from the alpha chain;
a second antibody labeled with a first marker binding the beta chain of hCG at a site accessible only when the beta chain of hCG is dissociated from the alpha chain, said site being different from that recognized by the first antibody;
- a third insolubilized antibody binding the beta chain of hCG at a site accessible only when the beta chain of hCG is associated with the alpha chain;
a fourth antibody labeled with a second marker different from the first and binding the beta chain of hCG at a site accessible only when the beta chain of hCG is associated with the alpha chain, said site being different from that recognized by the third antibody.
L'échantillon est mis en contact avec ces quatres anticorps pendant une durée suffisante pour la formation d'une part des complexes ternaires insolubles du premier anticorps, de la chaîne bêta de l'hCG libre et du deuxième anticorps, et d'autre part des complexes ternaires insolubles du troisième anticorps, de l'hCG totale et du quatrième anticorps. The sample is brought into contact with these four antibodies for a sufficient time for the formation on the one hand of the insoluble ternary complexes of the first antibody, of the beta chain of free hCG and of the second antibody, and on the other hand of the insoluble ternary complexes of the third antibody, total hCG and the fourth antibody.
On mesure les quantités des deuxième et quatrième anticorps marqués engagées dans les complexes ou n'ayant pas réagi et l'on met en relation les quantités mesurées avec des standards et des témoins afin de déterminer les concentrations en hCG totale et en hCG bêta libre. La concentration en hCG bêta totale est déterminée en additionnant les concentrations en hCG bêta libre et en hCG totale. The quantities of the second and fourth labeled antibodies engaged in the complexes or which have not reacted are measured and the quantities measured are compared with standards and controls in order to determine the concentrations of total hCG and of free beta hCG. The total beta hCG concentration is determined by adding the free beta hCG and total hCG concentrations.
2) Le dosage simultané de l'hCG bêta libre et de lthCG totale est effectué selon un test immunologique de type "sandwich" utilisant les trois anticorps spécifiques de la chaîne bêta de l'hCG suivants
- un premier anticorps insolubilisé liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible que la chaîne bêta de l'hCG soit dissociée ou non de la chaîne alpha;
- un deuxième anticorps marqué par un premier marqueur et liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est dissociée de la chaîne alpha, ledit site étant donc différent de celui reconnu par le premier anticorps;;
- un troisième anticorps marqué par un second marqueur différent du premier et liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est associée à la chaîne alpha, ledit site étant donc différent de ceux reconnus par le premier et le deuxième anticorps.2) The simultaneous determination of free beta hCG and total lthCG is carried out according to an immunological test of the "sandwich" type using the three antibodies specific for the following beta chain of hCG
- A first insolubilized antibody binding the beta chain of hCG at an accessible site whether the beta chain of hCG is dissociated or not from the alpha chain;
a second antibody labeled with a first marker and binding the beta chain of hCG at a site accessible only when the beta chain of hCG is dissociated from the alpha chain, said site therefore being different from that recognized by the first antibody ;;
a third antibody labeled with a second marker different from the first and binding the hCG beta chain to a site accessible only when the hCG beta chain is associated with the alpha chain, said site therefore being different from those recognized by the first and second antibodies.
Le premier anticorps va lier toute les chaînes bêta de l'hCG quelles soient libres ou associées aux chaînes alpha, le deuxième anticorps va reconnaître spécifiquement les chaînes bêta libres et le troisième anticorps va reconnaître spécifiquement les chaînes bêta associées aux chaîne alpha, les deuxième et troisième anticorps étant marqués différemment il sera possible de mesurer sélectivement les concentrations en hCG totale et en hCG bêta libre. The first antibody will bind all the beta chains of hCG which are free or associated with the alpha chains, the second antibody will specifically recognize the free beta chains and the third antibody will specifically recognize the beta chains associated with the alpha chain, the second and as the third antibody is labeled differently, it will be possible to selectively measure the concentrations of total hCG and of free beta hCG.
L'échantillon est mis en contact avec ces trois anticorps pendant une durée suffisante pour la formation d'une part des complexes ternaires insolubles du premier anticorps, de la chaîne bêta de l'hCG libre et du deuxième anticorps, et d'autre part des complexes ternaires insolubles du premier anticorps, de l'hCG totale et du deuxième anticorps. The sample is brought into contact with these three antibodies for a sufficient time for the formation on the one hand of the insoluble ternary complexes of the first antibody, of the beta chain of free hCG and of the second antibody, and on the other hand of the insoluble ternary complexes of the first antibody, total hCG and the second antibody.
On mesure les quantités des deuxième et troisième anticorps marqués engagées dans les complexes ou n'ayant pas réagi et l'on met en relation les quantités mesurées avec des standards et des témoins afin de déterminer les concentrations en hCG totale et en hCG bêta libre. La concentration en hCG bêta totale est déterminée en additionnant des concentrations en hCG bêta libre et hCG totale. The quantities of the second and third labeled antibodies engaged in the complexes or which have not reacted are measured and the quantities measured are compared with standards and controls in order to determine the concentrations of total hCG and of free beta hCG. The concentration of total beta hCG is determined by adding concentrations of free beta hCG and total hCG.
3) Le dosage simultané de l'hCG bêta libre et de l'hCG bêta totale est effectué selon un test immunologique de type "sandwich" utilisant les trois anticorps spécifiques de la chaîne bêta de l'hCG suivants
- un premier anticorps insolubilisé liant la chaîne bêta de lthCG en un site accessible que la chaîne bêta de l'hCG soit dissociée ou non de la chaîne alpha;
- un deuxième anticorps marqué par un premier marqueur et liant la chaîne bêta de lthCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est dissociée de la chaîne alpha, ledit site étant donc différent de celui reconnu par le premier anticorps;;
- un troisième anticorps marqué par un second marqueur différent du premier et liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible que les chaînes alpha et bêta de l'hCG soient dissociées ou non, ledit site étant donc différent de ceux reconnus par le premier et le deuxième anticorps.3) The simultaneous determination of free beta hCG and total beta hCG is carried out according to an immunological test of the “sandwich” type using the following three antibodies specific for the beta chain of hCG
- A first insolubilized antibody binding the beta chain of lthCG at an accessible site whether the beta chain of hCG is dissociated or not from the alpha chain;
- A second antibody labeled with a first marker and binding the beta chain of lthCG in a site accessible only when the beta chain of hCG is dissociated from the alpha chain, said site therefore being different from that recognized by the first antibody;
a third antibody labeled with a second marker different from the first and binding the beta chain of hCG at an accessible site whether the alpha and beta chains of hCG are dissociated or not, said site therefore being different from those recognized by the first and second antibody.
Le premier anticorps va lier toutes les chaînes bêta de l'hCG quelles soient libres ou associées aux chaînes alpha, le deuxième anticorps va reconnaître spécifiquement les chaînes bêta libres et le troisième anticorps va reconnaître toutes les chaînes bêta de l'hCG quelles soient libres ou associées aux chaînes alpha, le deuxième et le troisième anticorps étant marqués différemment il sera possible de mesurer sélectivement et directement les concentrations en hCG bêta totale et en hCG bêta libre. The first antibody will bind all the beta chains of hCG which are free or associated with alpha chains, the second antibody will specifically recognize the free beta chains and the third antibody will recognize all the beta chains of hCG which are free or associated with alpha chains, the second and third antibodies being labeled differently it will be possible to selectively and directly measure the concentrations of total hCG beta and free hCG beta.
L'échantillon est mis en contact avec ces trois anticorps pendant une durée suffisante pour la formation d'une part des complexes ternaires insolubles du premier anticorps, de la chaîne bêta de l'hCG associée à la chaîne alpha et du deuxième anticorps, et d'autre part des complexes quaternaires insolubles du premier anticorps, de la chaîne bêta de l'hCG libre, du deuxième et du troisième anticorps. The sample is brought into contact with these three antibodies for a sufficient time for the formation of a part of the insoluble ternary complexes of the first antibody, of the beta chain of hCG associated with the alpha chain and of the second antibody, and d on the other hand, insoluble quaternary complexes of the first antibody, of the beta chain of free hCG, of the second and of the third antibody.
On mesure les quantités des deuxième et troisième anticorps marqués engagées dans les complexes ou n'ayant pas réagi et lton met en relation les quantités mesurées avec des standards et des témoins afin de déterminer directement les concentrations en hCG bêta totale et en hCG bêta libre. The quantities of the second and third labeled antibodies engaged in the complexes or which have not reacted are measured and the quantities measured are compared with standards and controls in order to directly determine the concentrations of total beta hCG and of free beta hCG.
4) Le dosage simultané de l'hCG bêta libre et de l'hCG bêta totale est effectué selon un test immunologique de type "sandwich" utilisant les quatre anticorps spécifiques de la chaîne bêta de l'hCG suivants
- un premier anticorps insolubilisé liant la chaîne bêta de lthCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est dissociée de la chaîne alpha;
- un deuxième anticorps marqué par un premier marqueur liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est dissociée de la chaîne alpha, ledit site étant différent de celui reconnu par le premier anticorps;;
- un troisième anticorps insolubilisé liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est associée à la chaîne alpha;
- un quatrième anticorps marqué par un second marqueur différent du premier et liant la chaîne bêta de lthCG en un site accessible que les chaînes alpha et bêta de lthCG soient dissociées ou non, ledit site étant donc différent de ceux reconnus par le premier, le deuxième et le troisième anticorps.4) The simultaneous determination of free beta hCG and total beta hCG is carried out according to a sandwich immunoassay using the following four antibodies specific for the following beta chain of hCG
- A first insolubilized antibody binding the beta chain of lthCG at a site accessible only when the beta chain of hCG is dissociated from the alpha chain;
a second antibody labeled with a first marker binding the beta chain of hCG at a site accessible only when the beta chain of hCG is dissociated from the alpha chain, said site being different from that recognized by the first antibody;
- a third insolubilized antibody binding the beta chain of hCG at a site accessible only when the beta chain of hCG is associated with the alpha chain;
a fourth antibody labeled with a second marker different from the first and binding the beta chain of lthCG to an accessible site whether the alpha and beta chains of lthCG are dissociated or not, said site therefore being different from those recognized by the first, the second and the third antibody.
Le premier anticorps va lier uniquement les chaînes bêta de l'hCG libres, le deuxième anticorps va reconnaître spécifiquement les chaînes bêta libres, le troisième anticorps va reconnaître spécifiquement les chaînes bêta de l'hCG associées aux chaînes alpha et le quatrième anticorps va lier toutes les chaînes bêta de l'hCG quelles soient libres ou associées aux chaînes alpha; le deuxième et le quatrième anticorps étant marqués différemment il sera possible de mesurer sélectivement et directement les concentrations en hCG bêta totale et en hCG bêta libre. The first antibody will bind only the free hCG beta chains, the second antibody will specifically recognize the free beta chains, the third antibody will specifically recognize the hCG beta chains associated with the alpha chains, and the fourth antibody will bind all hCG beta chains which are free or associated with alpha chains; the second and the fourth antibody being labeled differently, it will be possible to selectively and directly measure the concentrations of total beta hCG and of free beta hCG.
L'échantillon est mis en contact avec ces quatres anticorps pendant une durée suffisante pour la formation d'une part des complexes ternaires insolubles du troisième anticorps, de la chaîne bêta de l'hCG associée à la chaîne alpha et du quatrième anticorps, et d'autre part des complexes quaternaires insolubles du premier anticorps, de la chaîne bêta de l'hCG libre, du deuxième et du quatrième anticorps. The sample is brought into contact with these four antibodies for a sufficient time for the formation of a part of the insoluble ternary complexes of the third antibody, of the beta chain of hCG associated with the alpha chain and of the fourth antibody, and d on the other hand, insoluble quaternary complexes of the first antibody, of the beta chain of free hCG, of the second and of the fourth antibody.
On mesure les quantités des deuxième et quatrième anticorps marqués engagées dans les complexes ou n 'ayant pas réagi et l'on met en relation les quantités mesurées avec des standards et des témoins afin de déterminer directement les concentrations en hCG bêta totale et en hCG bêta libre. The quantities of the second and fourth labeled antibodies engaged in the complexes or which have not reacted are measured and the quantities measured are compared with standards and controls in order to directly determine the concentrations of total hCG beta and of hCG beta free.
Les quatres protocoles précédents reposent sur le marquage différent des deux anticorps marqués, dans le cas dtun dosage immunoenzymatique on peut par exemple utiliser un anticorps marqué par la phosphatase et un anticorps marqué par la peroxydase, la mesure sera effectuée simultanément et sélectivement en révélant chaque enzyme avec son substrat. The four previous protocols are based on the different labeling of the two labeled antibodies, in the case of an enzyme immunoassay one can for example use an antibody labeled with phosphatase and an antibody labeled with peroxidase, the measurement will be carried out simultaneously and selectively by revealing each enzyme with its substrate.
Ces dosages simultanés permettent un meilleur rendement du procédé de dépistage de la Trisomie 21 de l'invention, qui peut alors être mis en oeuvre en utilisant les nécessaires ou "kit" suivants
Un premier kit comprenant au moins
- une quantité donnée d'un premier anticorps insolubilisé liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est dissociée de la chaîne alpha;
- une quantité donnée d'un deuxième anticorps marqué par un premier marqueur liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de lthCG est dissociée de la chaîne alpha, ledit site étant différent de celui reconnu par le premier anticorps;;
- une quantité donnée d'un troisième anticorps insolubilisé liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de lthCG est associée à la chaîne alpha;
- une quantité donnée d'un quatrième anticorps marqué par un second marqueur différent du premier et liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est associée à la chaîne alpha, ledit site étant différent de celui reconnu par le troisième anticorps;
- des réactifs permettant la détection des anticorps marqués.These simultaneous dosages allow a better performance of the trisomy 21 screening method of the invention, which can then be implemented using the following kits or "kit"
A first kit including at least
- a given quantity of a first insolubilized antibody binding the beta chain of hCG at a site accessible only when the beta chain of hCG is dissociated from the alpha chain;
- a given amount of a second antibody labeled with a first marker binding the beta chain of hCG at a site accessible only when the beta chain of lthCG is dissociated from the alpha chain, said site being different from that recognized by the first antibody;;
- a given quantity of a third insolubilized antibody binding the beta chain of hCG at a site accessible only when the beta chain of lthCG is associated with the alpha chain;
a given amount of a fourth antibody labeled with a second marker different from the first and binding the beta chain of hCG at a site accessible only when the beta chain of hCG is associated with the alpha chain, said site being different that recognized by the third antibody;
- reagents for the detection of labeled antibodies.
Un second kit comprenant au moins
- une quantité donnée d'un premier anticorps insolubilisé liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible que la chaîne bêta de l'hCG soit dissociée ou non de la chaîne alpha;
- une quantité donnée d'un deuxième anticorps marqué par un premier marqueur et liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est dissociée de la chaîne alpha;
- une quantité donnée d'un troisième anticorps marqué par un second marqueur différent du premier et liant la chaîne bêta de llhCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de 1'hCG est associée à la chaîne alpha;
- des réactifs permettant la détection des anticorps marqués.A second kit including at least
- A given amount of a first insolubilized antibody binding the beta chain of hCG at an accessible site whether the beta chain of hCG is dissociated or not from the alpha chain;
a given amount of a second antibody labeled with a first marker and binding the beta chain of hCG at a site accessible only when the beta chain of hCG is dissociated from the alpha chain;
a given amount of a third antibody labeled with a second marker different from the first and binding the beta chain of llhCG at a site accessible only when the beta chain of 1'hCG is associated with the alpha chain;
- reagents for the detection of labeled antibodies.
Un troisième kit comprenant au moins
- une quantité donnée d'un premier anticorps insolubilisé liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible que la chaîne bêta de l'hCG soit dissociée ou non de la chaîne alpha;
- une quantité donnée d'un deuxième anticorps marqué par un premier marqueur et liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est dissociée de la chaîne alpha;
- une quantité donnée d'un troisième anticorps marqué par un second marqueur différent du premier et liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible que les chaînes alpha et bêta de l'hCG soient dissociées ou non;
- des réactifs permettant la détection des anticorps marqués.A third kit including at least
- A given amount of a first insolubilized antibody binding the beta chain of hCG at an accessible site whether the beta chain of hCG is dissociated or not from the alpha chain;
a given amount of a second antibody labeled with a first marker and binding the beta chain of hCG at a site accessible only when the beta chain of hCG is dissociated from the alpha chain;
- A given amount of a third antibody labeled with a second marker different from the first and binding the beta chain of hCG at an accessible site whether the alpha and beta chains of hCG are dissociated or not;
- reagents for the detection of labeled antibodies.
Un quatrième kit comprenant au moins
- une quantité donnée d'un premier anticorps insolubilisé liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est dissociée de la chaîne alpha;
- une quantité donnée d'un deuxième anticorps marqué par un premier marqueur liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est dissociée de la chaîne alpha, ledit site étant différent de celui reconnu par le premier anticorps;
- une quantité donnée d'un troisième anticorps insolubilisé liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible uniquement lorsque la chaîne bêta de l'hCG est associée à la chaîne alpha;;
- une quantité donnée d'un quatrième anticorps marqué par un second marqueur différent du premier et liant la chaîne bêta de l'hCG en un site accessible que les chaînes alpha et bêta de lthCG soient dissociées ou non;
- des réactifs permettant la détection des anticorps marqués.A fourth kit including at least
- a given quantity of a first insolubilized antibody binding the beta chain of hCG at a site accessible only when the beta chain of hCG is dissociated from the alpha chain;
a given amount of a second antibody labeled with a first marker binding the beta chain of hCG at a site accessible only when the beta chain of hCG is dissociated from the alpha chain, said site being different from that recognized by the first antibody;
- a given amount of a third insolubilized antibody binding the beta chain of hCG at a site accessible only when the beta chain of hCG is associated with the alpha chain;
a given quantity of a fourth antibody labeled with a second marker different from the first and binding the beta chain of hCG at an accessible site whether the alpha and beta chains of lthCG are dissociated or not;
- reagents for the detection of labeled antibodies.
Il est admis que dans un même échantillon la concentration en chaîne bêta libre est très inférieure à la concentration en chaînes bêta associées aux chaînes alpha; aussi le procédé de dépistage in vitre de la trisomie 21 selon l'invention, peut être effectué en première approximation à partir des dosages dans un même échantillon de l'hCG bêta libre et de l'hCG totale, entre la 14ème et la 18ème semaine d'aménohrrée, et en comparant le rapport hCG bêta libre /hCG totale à une valeur seuil correspondant au rapport hCG bêta libre /hCG totale normale, mesurée la même semaine. Cette valeur seuil est mesurée chez des femmes à grossesse dite "normale" la même semaine d'aménohrrée. It is recognized that in the same sample the concentration of free beta chain is much lower than the concentration of beta chains associated with alpha chains; also the in vitro screening method for trisomy 21 according to the invention, can be carried out as a first approximation from the assays in the same sample of free beta hCG and total hCG, between the 14th and the 18th week and by comparing the hCG free beta / total hCG ratio to a threshold value corresponding to the normal hCG free beta / total hCG ratio, measured the same week. This threshold value is measured in women with "normal" pregnancy the same week of amenohrrea.
La présente invention a été décrite au moyen d'exemples de mise en oeuvre sans pour autant être limitée à la forme particulière de ces exemples. De nombreuses modifications peuvent être envisagées sans sortir de l'étendue de l'invention, notamment en ce qui concerne les protocoles de dosage de l'hCG bêta totale, de l'hCG totale et de lthCG bêta libre. The present invention has been described by means of working examples without however being limited to the particular form of these examples. Many modifications can be envisaged without departing from the scope of the invention, in particular with regard to the assay protocols for total hCG beta, total hCG and free beta-lthCG.
Claims (18)
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|---|---|---|---|
| FR9000457A FR2657167B1 (en) | 1990-01-16 | 1990-01-16 | METHOD FOR IN VITRO PRENATAL SCREENING FOR FETAL TRISOMY IN A BIOLOGICAL SAMPLE LIKELY CONTAINING HCG AND NECESSARY FOR ITS IMPLEMENTATION. |
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|---|---|---|---|
| FR9000457A FR2657167B1 (en) | 1990-01-16 | 1990-01-16 | METHOD FOR IN VITRO PRENATAL SCREENING FOR FETAL TRISOMY IN A BIOLOGICAL SAMPLE LIKELY CONTAINING HCG AND NECESSARY FOR ITS IMPLEMENTATION. |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4222573C1 (en) * | 1992-05-16 | 1993-08-12 | Dorothee Dr. 4400 Muenster De Ahlert |
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| EP0219870A2 (en) * | 1985-10-24 | 1987-04-29 | The General Hospital Corporation | Method for the detection of a polypeptide subunit in the presence of a quaternary protein containing the subunit |
| WO1988008535A1 (en) * | 1987-04-30 | 1988-11-03 | Beckman Instruments, Inc. | Method to achieve a linear standard curve in a sandwich immunoassay |
| EP0327337A2 (en) * | 1988-02-01 | 1989-08-09 | Monoclonetics International, Inc. | Genetic markers for down's syndrome, fetal abnormalities and twins |
-
1990
- 1990-01-16 FR FR9000457A patent/FR2657167B1/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4222573C1 (en) * | 1992-05-16 | 1993-08-12 | Dorothee Dr. 4400 Muenster De Ahlert |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2657167B1 (en) | 1992-05-07 |
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