FR2655855A1 - Protection genetique d'animaux contre l'infection par le virus leucemogene bovin, et provirus et virus recombinant derive de ce virus. - Google Patents
Protection genetique d'animaux contre l'infection par le virus leucemogene bovin, et provirus et virus recombinant derive de ce virus. Download PDFInfo
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Abstract
L'invention concerne l'induction de résistance à l'infection par un rétrovirus pathogène d'une cellule différantiable ou par un variant de celui-ci par l'introduction dans la cellule d'un gène dérivé de l'ARN du rétrovirus pathogène et codant pour une glycoprotéine d'enveloppe de ce rétrovirus, le gène étant sous le contrôle d'un promoteur permettant la transcription et l'expression de ce gène dans ces cellules.
Description
PROTECTION GENETIQUE D'ANINAUX CONTRE L'INFECTION PAR LE
VIRUS LEUCEMOGENE BOVIN, ET PROVIRUS ET VIRUS
RECOMBINANT DERIVE DE CE VIRUS
L'invention concerne un procédé de protection d'animaux des infections virales.
VIRUS LEUCEMOGENE BOVIN, ET PROVIRUS ET VIRUS
RECOMBINANT DERIVE DE CE VIRUS
L'invention concerne un procédé de protection d'animaux des infections virales.
L'invention concerne également des rétrovirus recombinants et des procédés applicables dans l'étude des rétrovirus qui mettent en oeuvre ces rétrovirus recombinants.
L'invention concerne plus précisément l'introduction d'un gène ou d'un fragment d'un gène dérivé de 1'ARN du Virus Leucémogène Bovin (BLV) et codant pour une glycoprotéine d'enveloppe de ce rétrovirus dans des cellules animales, le gène étant sous le contrôle d'un promoteur permettant la transcription et l'expression de ce gène dans ces cellules et ayant pour effet de rendre les cellules résistantes à l'infection par le BLV.
L'invention concerne plus particulièrement un procédé pour rendre les espèces ovines et bovines résistantes au BLV.
Le Virus Leucémogène Bovin ou Bovine Leukemia Virus (VLB ou BLV respectivement) induit chez ces animaux la
Leucose Bovine Enzootique (LBE). Cette maladie contagieuse se traduit par une phase de lymphocytose persistante suivie dans quelques cas par une tumorisation de certains tissus. Les données épidémiologiques des Services Vétérinaires au 31 décembre 1987 font état de 50.000 troupeaux atteints par la LBE (soit 9% des troupeaux français) et 300.000 animaux séropositifs (soit 1.9% des animaux).
Leucose Bovine Enzootique (LBE). Cette maladie contagieuse se traduit par une phase de lymphocytose persistante suivie dans quelques cas par une tumorisation de certains tissus. Les données épidémiologiques des Services Vétérinaires au 31 décembre 1987 font état de 50.000 troupeaux atteints par la LBE (soit 9% des troupeaux français) et 300.000 animaux séropositifs (soit 1.9% des animaux).
Pour lutter contre l'extension de cette maladie, il existe déjà des plans d'action visant à l'éradication de la L.B.E. Ces plans comprennent notamment des actions de dépistage sérologique et l'abattage des animaux infectés.
La possibilité de créer des souches d'animaux génétiquement résistants à la LBE permettrait la mise en place de noyaux d'animaux résistants dans les zones fortement contaminées et l'exportation de reproducteurs garantis indemnes. La technique utilisée devrait être applicable aux espèces ovines et bovines qui sont toutes deux sensibles à la Leucose, alors que le plan d'éradication ne concerne que l'espèce bovine.
Pour protéger les animaux contre l'infection par le
BLV, l'invention utilise un gène viral du BLV codant pour la protéine d'enveloppe du virus ou une partie de ce gène, l'expression intracellulaire de cette protéine virale, induisant le blocage de l'infection.
BLV, l'invention utilise un gène viral du BLV codant pour la protéine d'enveloppe du virus ou une partie de ce gène, l'expression intracellulaire de cette protéine virale, induisant le blocage de l'infection.
L'invention étudie, en un premier temps, des gènes d'enveloppes (env) du BLV, pour établir si l'expression de ces gènes dans des cellules animales confère une protection contre l'infection par le rétrovirus concerné.
L'invention démontre qu'une cellule animale génétiquement manipulée pour pouvoir exprimer une glycoprotéine d'enveloppe du BLV est protégée contre l'infection par ce rétrovirus. La glycoprotéine d'enveloppe se fixe sur le récepteur cellulaire normal du rétrovirus et empêche lors d'une infection virale, la fixation des particules virales sur la cellule. Il s'agit donc d'une protection in vivo des infections virales.
La protection génétique des poulets contre l'infection par le virus de la leucose aviaire (ALV) par expression du gène env dans les cellules du poulet, a déjà été envisagée (Can. J. Anim. Sci., Vol. 65, p.
553-562, Sept. 1985). Ce document décrit plusieurs possibilités pour introduire le gène d'enveloppe du virus de la leucose aviaire (ALV) dans la lignée cellulaire germinative du poulet afin de rendre l'animal résistant à l'infection par le rétrovirus. Plus particulièrement, les auteurs examinent l'insertion du gène env d'un virus du sous-groupe A et le vecteur peut être un vecteur d'ADN contenant env et les éléments nécessaires à l'expression ou un rétrovirus entier ou encore un rétrovirus recombinant défectif. L'obtention de protection contre l'infection n'est pas décrite.
On peut s'attendre qu'une protection contre l'infection par le ALV soit ainsi possible, parce qu'il est connu qu'un phénomène d'interférence naturel existe chez le poulet.
Ce phénomène est du à l'expression de gènes env d'
ALV endogènes, présents dans le génome de certains animaux qui sont ainsi protégés contre la surinfection.
ALV endogènes, présents dans le génome de certains animaux qui sont ainsi protégés contre la surinfection.
Par contre, une telle interférence n'est pas connue chez le bovin. Il n'est donc pas possible de prévoir que l'expression du gène env dans une cellule bovine protégerait cette cellule de l'infection par BLV.
I1 est aussi à noter que les virus ALV et BLV sont très différents dans leurs propriétés. Par exemple, la cellule cible du BLV est le lymphocyte B conduisant à des lymphomes, tandis que le ALV est un virus qui infecte toutes les cellules et qui se manifeste par la présence de sarcomes. La régulation des deux virus est également différente, le BLV possédant une séquence pX codant pour deux protéines régulatrices indispensables pour exprimer les autres gènes viraux et notamment les gènes d'enveloppe.
L'introduction du gène codant pour la protéine d'enveloppe ou d'un fragment de ce gène peut être effectuée, par exemple, par transfection d'un plasmide qui contient le gène sous le contrôle d'un promoteur approprié. Il peut aussi être introduit par infection avec un rétrovirus recombinant ou par toute autre technique permettant d'entrer le gène dans la cellule.
Le gène introduit est dérivé de 1'ARN du BLV codant pour la glycoprotéine d'enveloppe, et peut correspondre à tout ou partie des gènes Env viraux. I1 est donc envisagé dans le cadre de l'invention de produire des cellules animales exprimant la protéine d'enveloppe ou un fragment de cette protéine qui induit l'effet protecteur.
Selon l'invention, ce principe est appliqué dans la production d'animaux transgéniques qui sont ainsi génétiquement protégés contre l'infection.
L'introduction du gène s'effectue dans ce cas dans la lignée cellulaire germinale, par exemple par microinjection. La construction utilisée pour l'introduction du gène dans la cellule comporte un promoteur qui permet l'expression de la protéine Env dans l'ensemble des tissus infectables par le rétrovirus ou par un promoteur ubiquitaire.
L'invention concerne également des provirus recombinants dérivés de provirus leucémogènes Bovin (BLV) dont une partie a été remplacée par une séquence nucléotidique hétérologue, caractérisés en ce que la partie du provirus BLV remplacée correspond à la séquence virale des gènes rétroviraux gag, prt, pol et env pris dans leur ensemble ou à un fragment de cette séquence virale.
Plus particulièrement, la partie du génome viral
BLV remplacée par la séquence hétérologue pour former les provirus et rétrovirus recombinant de l'invention, comprend les gènes viraux gag, prt, pol et env, le gène env comprenant une partie codante commune avec le gène pX (par exemple les séquences virales comprises entre les sites SmaI (616pb) et BamHI (6997pb) ou un fragment de cette partie du génome viral. Comme fragment de cette partie, on peut citer par exemple les gènes viraux pol et env et la partie de pX compris dans env (par exemple les séquences virales comprises entre les sites BamHI (1831pb) et BamHI (6997pb), ou encore les gènes viraux gag, prt et pol (par exemple les séquences virales comprises entre les sites SmaI (616pb) et BamHI (3872pb).
BLV remplacée par la séquence hétérologue pour former les provirus et rétrovirus recombinant de l'invention, comprend les gènes viraux gag, prt, pol et env, le gène env comprenant une partie codante commune avec le gène pX (par exemple les séquences virales comprises entre les sites SmaI (616pb) et BamHI (6997pb) ou un fragment de cette partie du génome viral. Comme fragment de cette partie, on peut citer par exemple les gènes viraux pol et env et la partie de pX compris dans env (par exemple les séquences virales comprises entre les sites BamHI (1831pb) et BamHI (6997pb), ou encore les gènes viraux gag, prt et pol (par exemple les séquences virales comprises entre les sites SmaI (616pb) et BamHI (3872pb).
L'invention vise également des rétrovirus recombinants obtenus par l'insertion d'un provirus de l'invention dans des cellules exprimant les protéines virales du BLV.
Comme exemple de retrovirus recombinants de l'invention, on peut citer ceux qui sont obtenus à partir des provirus recombinants pBLVBnlsLacZ (Figure 4); pBLVsnlsLacZ (Figure 7); pBLVsSVnlsLacZ (Figure 8) et pBLVsnlsLacZEnvpX (Figure 6).
Les virus de l'invention et plus particulièrement les virus BLVsSVnlsLacZ, BLVsnlsLacZ et BLVsnlsLacZ
EnvpX, peuvent servir de modèle pour étudier les mécanismes mis en oeuvre dans les cellules infectables pour réguler l'expression du virus BLV sauvage (Figure 6). Ceci permet de mieux comprendre les phénomènes régulant les phases d'extinction et de réactivation du virus (correspondant à la séropositivité et au déclenchement de la maladie).
EnvpX, peuvent servir de modèle pour étudier les mécanismes mis en oeuvre dans les cellules infectables pour réguler l'expression du virus BLV sauvage (Figure 6). Ceci permet de mieux comprendre les phénomènes régulant les phases d'extinction et de réactivation du virus (correspondant à la séropositivité et au déclenchement de la maladie).
En effet, les provirus et rétrovirus recombinants de l'invention sont conçus pour pouvoir être utilisés dans le cadre de l'invention pour étudier la biologie du virus BLV et notamment l'infectabilité de cellules par le BLV, mais aussi pour le transfert de gènes dans des cellules eucaryotes et dans les embryons de mammifères.
Les propriétés des provirus et rétrovirus recombinants de l'invention, et par conséquent, la manière dont ils peuvent être utilisés sont déterminés par l'étendue des séquences virales remplacées par la séquence hétérologue, et par la nature de la séquence hétérologue elle-même.
Par exemple, l'expression d'un gène hétérologue sous la dépendance du promoteur BLV ne peut avoir lieu que si le transactivateur viral tax ou d'autres activateurs du LTR sont présents.
L'incorporation d'un promoteur supplémentaire (ou promoteur "interne") dans la séquence hétérologue permet l'expression du gène hétérologue en l'absence du transactivateur tax.
Les virus recombinants dont les genes de structure gag et pol ont été délétés par l'insertion de la séquence nucléotidique, contiennent l'ensemble des signaux et des protéines de régulation du BLV nécessaire à l'expression du virus.
Les provirus (le génome du rétrovirus BLV est porté dans ce cas par un plasmide par ex pBLV) et rétrovirus de l'invention peuvent être utilisés dans une série de tests d'infectabilité d'une cellule par le BLV. Ces tests seront décrits dans les paragraphes suivants.
Le rétrovirus BLV est un virus apparenté aux HTLV humains, sa biologie est complexe et encore imparfaitement connue. C'est pour cette raison que parallèlement à l'étude sur le BLV, l'invention développe un modèle d'immunisation génétique de la souris contre les rétrovirus M-MuLV (qui induisent des leucémies de types variés). Ce virus M-MuLV est plus simple, mieux connu et bien étudié au laboratoire.
Pour les modèles souris, la technique utilisée pour étudier l'infectabilité des cellules, est la suivante les cellules à tester sont infectées par un rétrovirus recombinant, transférant par voie rétrovirale le gène
LacZ dont l'expression peut être révélée par une coloration histochimique simple.
LacZ dont l'expression peut être révélée par une coloration histochimique simple.
48 heures après l'infection, on révèle les cellules exprimant la P-galactosidase codée par le gène LacZ, grâce a une coloration histochimique X-gal.
A l'issue de cette coloration, les cellules infectées sont révélées par un marquage nucléaire bleu (figure 1).
Les cellules protégées par l'expression intracellulaire de protéine Env, ne sont plus infectables. A l'issue de la coloration, leur noyau n'est pas marqué.
Ce test peut être appliqué à l'infectabilité d'une cellule par le BLV. Plus précisément, dans un mode de réalisation de l'invention, les virus recombinants de l'invention, contenant comme gène hétérologue un gène marqueur par exemple le LacZ (nlsLacZ si la séquence nls est utilisée pour localiser la couleur produite par LacZ dans le noyau) sert de test pour détecter l'infectabilité des cellules exprimant les gènes Env.
Ces virus recombinants sont produits par transfection du provirus correspondant dans des cellules exprimant BLV.
Selon le test de l'invention, les rétrovirus recombinants sont mis en contact avec la cellule en question et une étape de révélation du gène marqueur est effectuée, par exemple par coloration histochimique.
Aucune coloration histochimique n'est détectée dans les cellules cibles si celles-ci sont protégées contre l'infection par expression intracellulaire de la protéine Env du BLV.
Ce test peut s'appliquer de nombreuses façons différentes
Lors de la production d'animaux transgéniques résistants au BLV, il est important de connaître les types de tissus susceptibles d'être infectés et d'exprimer le BLV, et par conséquent, d'utiliser un promoteur qui permet l'expression de la protéine Env dans ces tissus infectables. Le test de l'invention peut donc être utilisé dans l'étude de la spécificité des promoteurs.
Lors de la production d'animaux transgéniques résistants au BLV, il est important de connaître les types de tissus susceptibles d'être infectés et d'exprimer le BLV, et par conséquent, d'utiliser un promoteur qui permet l'expression de la protéine Env dans ces tissus infectables. Le test de l'invention peut donc être utilisé dans l'étude de la spécificité des promoteurs.
Cet aspect de l'invention comprend donc un procédé d'identification de promoteurs permettant l'expression du gène codant pour la glycoprotéine d'enveloppe du BLV dans une cellule eucaryote, caractérisé par les étapes suivantes - mise en contact du rétrovirus recombinant selon l'invention avec une cellule eucaryote comprenant un gène dérivé de 1'ARN du BLV et codant pour une glycoprotéine d'enveloppe de ce rétrovirus, ce gène étant sous le contrôle du promoteur d'intérêt, - révélation ou non de l'expression du gène marqueur dans la cellule, par exemple par coloration histochimique, l'expression du gène marqueur signifiant la fonctionnalité du promoteur.
Un rétrovirus approprié pour ce mode de réalisation de l'invention sera le BLVsSVnlsLacZ
Le test selon l'invention peut aussi être utilisé pour étudier quelle(s) partie(s) des gènes Env est (sont) nécessaire(s) pour induire la résistance à l'infection par BLV. Dans ce cas, il s'agit d'un procédé d'identification de(s) fragment(s) du gène codant pour la glycoprotéine d'enveloppe du BLV nécessaire pour l'induction de la résistance à l'infection par le BLV d'une cellule eucaryote, caractérisé par les étapes suivantes - mise en contact du rétrovirus recombinant selon l'invention, avec des cellules eucaryotes, chacune de ces cellules eucaryotes comprenant un fragment différent du gène codant pour la glycoprotène d'enveloppe du BLV sous le contrôle d'un promoteur permettant la transcription et l'expression de ce gène dans ces cellules, - révélation ou non de l'expression du gène marqueur dans les cellules, par exemple par coloration histochimique, l'expression du gène marqueur signifiant l'infection de la cellule en question, par le rétrovirus recombinant et par conséquent l'incapacité de ce fragment du gène de la glycoprotéine d'enveloppe d'induire la résistance.
Le test selon l'invention peut aussi être utilisé pour étudier quelle(s) partie(s) des gènes Env est (sont) nécessaire(s) pour induire la résistance à l'infection par BLV. Dans ce cas, il s'agit d'un procédé d'identification de(s) fragment(s) du gène codant pour la glycoprotéine d'enveloppe du BLV nécessaire pour l'induction de la résistance à l'infection par le BLV d'une cellule eucaryote, caractérisé par les étapes suivantes - mise en contact du rétrovirus recombinant selon l'invention, avec des cellules eucaryotes, chacune de ces cellules eucaryotes comprenant un fragment différent du gène codant pour la glycoprotène d'enveloppe du BLV sous le contrôle d'un promoteur permettant la transcription et l'expression de ce gène dans ces cellules, - révélation ou non de l'expression du gène marqueur dans les cellules, par exemple par coloration histochimique, l'expression du gène marqueur signifiant l'infection de la cellule en question, par le rétrovirus recombinant et par conséquent l'incapacité de ce fragment du gène de la glycoprotéine d'enveloppe d'induire la résistance.
De cette façon, il est possible de définir d'une manière très précise quel(s) fragment(s) des gènes Env du BLV est (sont) nécessaire(s) pour l'induction de l'effet protecteur. Le virus BLVsSVnlsLacZ pourrait être utilisé dans ce test.
Un autre aspect de l'invention concerne un procédé d'identification de cellules eucaryotes susceptibles d'être infectées par le BLV, caractérisé par les étapes suivantes - mise en contact du rétrovirus recombinant selon l'invention avec une cellule eucaryote, - révélation ou non de l'expression du gène marqueur dans la cellule, par exemple par coloration histochimique, l'expression du gène marqueur signifiant l'infectabilité de la cellule par le BLV.
Le virus BLVsSVnlsLacZ, par exemple, permet d'étudier l'infectabilité des cellules primaires ovines et bovines, afin d'identifier les types cellulaires susceptibles de servir de réservoir au virus chez l'animal infecté. Parallèlement à l'infection des cellules, il faut introduire le provirus par transfection dans les cellules à tester, afin de vérifier que le promoteur SV est actif dans ces cellules "non infectables". Cette étude nous permettra de cerner aussi la spécificité du promoteur à utiliser pour l'expression des gènes Env chez les animaux transgéniques Env+ génétiquement protégés.
Un autre aspect de l'invention concerne un procédé d'identification de lignées cellulaires autorisant l'expression du virus BLV, caractérisé par les étapes suivantes - mise en contact du rétrovirus recombinant selon l'invention avec une cellule de la lignée sous test, - révélation ou non de l'expression du gène marqueur dans la cellule, par exemple par coloration histochimique, l'expression du gène marqueur signifiant l'expression potentielle d'un virus BLV dans cette cellule.
Le virus BLVsSVnlsLacZEnvpX peut être utilisé dans ce test.
Encore un aspect de l'invention concerne un procédé d'identification d'anticorps protecteur contre l'infection par le BLV, caractérisé par les étapes suivantes - mise en contact d'anticorps dirigés contre le BLV avec le rétrovirus recombinant selon l'invention, dans des conditions permettant une réaction immunologique entre les anticorps et le rétrovirus recombinant, - mise en contact du complexe anticorps-rétrovirus recombinant formé dans l'étape précédente avec une cellule susceptible d'être infectée par le BLV, - révélation ou non de l'expression du gène marqueur dans la cellule, par exemple par coloration histochimique, l'expression du gène marqueur signifiant l'infection des cellules par le rétrovirus recombinant et par conséquent, le caractère non-protecteur des anticorps.
Finalement, l'invention concerne également un procédé de détermination de l'état infecté ou non d'une cellule eucaryote par le BLV, caractérisé par les étapes suivantes - mise en contact du rétrovirus recombinant selon l'invention avec un prélèvement des cellules sous test, - révélation ou non de l'expression du gène marqueur dans les cellules, par exemple par coloration histochimique, l'expression du gène marqueur signifiant l'infection des cellules par le rétrovirus recombinant et par conséquent, l'absence d'infection par BLV dans les cellules avant leur mise en contact avec le rétrovirus recombinant.
Le virus BLVsSVnlsLacZ sera approprié pour effectuer ce test.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les rétrovirus recombinants de l'invention peuvent être utilisés comme vecteurs dans le transfert de gènes dans des cellules eucaryotes. Par exemple les rétrovirus recombinants défectifs BLVsnlsLacZ et BLVsSVnlsLacZ montrent qu'il est possible de conserver les propriétés d'encapsidation, de reverse-transcription et d'intégration à un ARN recombinant BLV après délétion des séquences virales comprises entre les sites Smal (616pb) et BamHl (6997pb). Il est donc possible d'utiliser le BLV pour transférer jusqu'à 6 kb d'ADN.
Après infection, le promoteur BLV est inactif en l'absence du transactivateur tax; l'expression du gène transféré peut être obtenue de manière ubiquitaire ou tissu-spécifique, à partir d'un promoteur interne placé en 5' de ce gène.
Les rétrovirus de l'invention contenant le gène marqueur LacZ pourraient donc être utilisés pour déterminer le niveau d'infectabilité des oeufs des animaux domestiques (vache, brebis, truie, lapin) par les virus recombinants BLV. Les rétrovirus recombinants défectifs BLV peuvent offrir une alternative à l'emploi de la micro-injection ou des rétrovirus murins pour la création de bovins et d'ovins transgéniques. Outre le niveau d'infectabilité des oeufs, il faut étudier l'influence des séquences virales présentes dans le provirus recombinant sur l'expression du gène que l'on transfère. Seul un système où le virus recombinant se comporterait comme un vecteur de transfert de gènes sans influence sur l'expression du transgène, serait effectivement utilisable.Les propriétés spécifiques d'activation du BLV permettent d'envisager le développement d'un tel système utilisant le BLV.
Les rétrovirus recombinants de l'invention pourraient aussi être utilisés pour la transgénèse somatique.
S'il est possible de mettre au point des producteurs efficaces de virus recombinants défectifs
BLV, on peut également envisager l'utilisation du BLV pour réaliser le transfert de gènes dans les cellules somatiques de l'individu. L'infection in vivo de souches de cellules différenciées (mammaires par exemple) d'un animal permettrait de vérifier les propriétés et les conséquences biologiques d'une construction, avant de réaliser la transgénèse dans la lignée germinale de "vrais" animaux transgéniques. I1 serait également possible d'étudier l'influence d'un gène dans un tissu donné, en réalisant une infection locale.
BLV, on peut également envisager l'utilisation du BLV pour réaliser le transfert de gènes dans les cellules somatiques de l'individu. L'infection in vivo de souches de cellules différenciées (mammaires par exemple) d'un animal permettrait de vérifier les propriétés et les conséquences biologiques d'une construction, avant de réaliser la transgénèse dans la lignée germinale de "vrais" animaux transgéniques. I1 serait également possible d'étudier l'influence d'un gène dans un tissu donné, en réalisant une infection locale.
Dans un autre aspect de l'invention, les BLV recombinants contenant le gène marqueur LacZ peuvent être mis en oeuvre dans l'optimisation des conditions de production des rétrovirus recombinants.
Les systèmes complexes de régulation de l'expression du BLV font qu'il est difficile de trouver une lignée cellulaire dans laquelle le BLV s'exprime d'une manière stable; au bout d'un certain temps, l'expression des protéines régulatrices du BLV induit la synthèse de protéines cellulaires particulières réprimant l'expression virale. A cet égard les propriétés d'expression stable du BLV par la lignée
FLK-BLV contenant un provirus sauvage sont exceptionnelles. Il est donc indispensable d'identifier une lignée cellulaire autorisant la mise au point d'un système de production à haut titre des virus recombinants défectifs BLV.
FLK-BLV contenant un provirus sauvage sont exceptionnelles. Il est donc indispensable d'identifier une lignée cellulaire autorisant la mise au point d'un système de production à haut titre des virus recombinants défectifs BLV.
Le provirus BLVsnlsLacZ-Env-pX sert à identifier cette lignée. Après transfection de ce plasmide, cette lignée devra exprimer le gène LacZ d'une façon stable et intense, sous la dépendance du promoteur BLV grâce aux protéines régulatrices Tax et rex synthétisées à partir de la construction. Une telle cellule devrait alors exprimer efficacement un provirus BLV intact. Elle serait un bon candidat pour la production de virus BLV, ou de rétrovirus recombinants BLV.
EXEMPLES
I - ETUDE DU NODULE SOURIS ET DU VIRUS XOLONEY
ECOTROPIQUE
1. Protection contre l'infection par un M-MuLV de cellules murines 3T3 Env (WEN) obtenues par trans fection
Dans cet exemple, il est démontré sur le modèle souris, que des cellules exprimant constitutivement les protéines Env (codée par un provirus écotropique défectif) sont protégées contre l'infection par un rétrovirus recombinant M-MuLV LacZ écotropique. De plus, les variants infectables qui ont pu être isolés à très faible fréquence, à partir de ces cellules immunes, se sont avérés ne plus exprimer les gènes Env.
I - ETUDE DU NODULE SOURIS ET DU VIRUS XOLONEY
ECOTROPIQUE
1. Protection contre l'infection par un M-MuLV de cellules murines 3T3 Env (WEN) obtenues par trans fection
Dans cet exemple, il est démontré sur le modèle souris, que des cellules exprimant constitutivement les protéines Env (codée par un provirus écotropique défectif) sont protégées contre l'infection par un rétrovirus recombinant M-MuLV LacZ écotropique. De plus, les variants infectables qui ont pu être isolés à très faible fréquence, à partir de ces cellules immunes, se sont avérés ne plus exprimer les gènes Env.
Des cellules de souris, cellules 3T3, sont transfectées par un provirus écotropique défectif contenant les gènes Env. Les cellules obtenues par cette transfection, les 3T3 Env (WEN) expriment constitutivement les protéines Env du MLV. Les cellules sont testées par infection avec 100 pl de surnageant de cellules productrices de virus LacZ écotropique M
MULVSVLacZ (voir tableau 1). Après 48 heures, l'expression du gène LacZ est révélée par coloration histochimique.
MULVSVLacZ (voir tableau 1). Après 48 heures, l'expression du gène LacZ est révélée par coloration histochimique.
Dans une deuxième série d'expériences, un plasmide contenant le gène Env placé sous la dépendance du double promoteur SV-Tk, par exemple le pM-MuLVSVTkEnv, a été introduit dans des cellules 3T3 de souris par cotransfection avec un marqueur sélectif. Après sélection, les clones obtenus sont testés quant à leur infectabilité certains de ces clones sont 80 fois moins infectables par un virus LacZ écotropique que les cellules contrôle 3T3.
Le clone le plus protégé, WEN 3, a été sous-cloné l'un des sous-clones WEN 3.9 présente une infectabilité relative de 0.0036 par rapport aux cellules contrôles 3T3. Les cellules Psi2 sont des cellules exprimant les gènes Env à partir d'un provirus défectif ; elles presentent ainsi une infectabilité très réduite (tableau 1).
2. Protection contre l'infection par un K-XuLV de cellules murines 3T3 Env obtenues par infection
Le rétrovirus recombinant défectif susceptible de transférer le gène Env du MLV (M-MuLV SVTkEnv) est produit par les cellules Psi2 Env.
Le rétrovirus recombinant défectif susceptible de transférer le gène Env du MLV (M-MuLV SVTkEnv) est produit par les cellules Psi2 Env.
Une population de cellules murines 3T3 et une autre population exprimant les gènes gag et pol ont été infectées par ce rétrovirus (voir tableau 2).
Avec 1 ml de virus écotropique M-MuLV SVnlsLacZ, il est possible d'infecter 70 à 90% des cellules 3T3 et 3T3 gagpol. 4 jours après l'infection de ces cellules par le virus M-MuLV SVTkEnv, les deux populations cellulaires sont toujours infectables à 75%. Toutefois, 10 jours après l'infection par le virus Env, il ne reste plus que 0.02% de cellules 3T3 gagpol encore infectables par le virus M-MuLV SVnlsLacZ. Le gène Env a pu se propager par complémentation avec les protéines gag et pol dans la population 3T3 gagpol. Les cellules Psi2 Env sont les cellules productrices du virus M-MuLV SV-TkEnv; elles sont protégées à 99.98% contre l'infection par un virus écotropique.
Ces études confirment que la protection par expression des gènes Env est effective, et que ce blocage est obtenu avec une remarquable efficacité.
3. Souris transgéniques exprimant les gènes Env du
MMuLV
Les gènes Env du MMuLV ont été placés dans un provirus recombinant sous le contrôle du promoteur du gène d d'histocompatibilité H24 de la souris. Cette construction, appelée pMMULVH2-4EnVMLV permet l'expression constitutive du gène Env dans des cellules de souris en culture.
MMuLV
Les gènes Env du MMuLV ont été placés dans un provirus recombinant sous le contrôle du promoteur du gène d d'histocompatibilité H24 de la souris. Cette construction, appelée pMMULVH2-4EnVMLV permet l'expression constitutive du gène Env dans des cellules de souris en culture.
La même construction est utilisée pour créer des lignées de souris transgénique exprimant les gènes Env du MMuLV.
Pour tester la protection de ces animaux contre la leucose murine, le virus sauvage M-MuLV est inoculé à des souriceaux nouveaux-nés, l'apparition éventuelle de la virémie chez les souris adultes est étudiée.
II - ETUDE DE LA PROTECTION DES CELLULES OVINES ET
BOVINES CONTRE LE B.L.V.
BOVINES CONTRE LE B.L.V.
1. Reconstitution d'un provirus B.L.V. sauvage (pBLV)
La figure 2 (A,B,C) illustre les étapes impliquées dans la reconstitution d'un provirus sauvage à partir de deux clones isolés d'une banque d'ADN génomique de cellules tumorales bovines par Couez et al. (Couez et al., 1984, J. Virol. 49 (2) 615-620); Deschamps et al., 1981, J. Virol. 40 (2) 605-609).
La figure 2 (A,B,C) illustre les étapes impliquées dans la reconstitution d'un provirus sauvage à partir de deux clones isolés d'une banque d'ADN génomique de cellules tumorales bovines par Couez et al. (Couez et al., 1984, J. Virol. 49 (2) 615-620); Deschamps et al., 1981, J. Virol. 40 (2) 605-609).
Ce clone BLV a été choisi, car plusieurs études avaient prouvé que le promoteur du LTR 3' était fonctionnel ; l'origine belge de ce virus garantissait également une plus grande ressemblance avec les virus présents en Europe que d'autres clones utilisables d'origine japonaise.
La figure 3 montre la construction détaillée de pBLV.
2. Activation du promoteur BLV par le transactivateur Tax
Le gène marqueur LacZ a ensuite été inséré dans le provirus reconstitué pBLV sous la dépendance du promoteur BLV. Cette construction s'appelle pBLVnlsLacZ.
Le gène marqueur LacZ a ensuite été inséré dans le provirus reconstitué pBLV sous la dépendance du promoteur BLV. Cette construction s'appelle pBLVnlsLacZ.
La séquence nls ("nuclear localization sequence") localise la couleur produite par LacZ dans le noyau.
La figure 4 montre la position du gène LacZ dans le génome viral.
Cette construction a permis de vérifier la fonctionnalité du promoteur du provirus reconstitué pBLV : en l'absence du transactivateur viral Tax, le promoteur du pBLVnlsLacZ est inactif dans les cellules ovines, il permet par contre une forte expression lorsque la cellule exprime un virus BLV sauvage ou une construction exprimant spécifiquement le transactivateur tax (tableau 3). La figure 3 présente les transactivateurs du BLV.
Lorsque le plasmide pBLVnlsLacZ est transfecté, seules les cellules FLK-BLV synthétisant constitutivement le transactivateur tax, peuvent exprimer le gène LacZ placé sous la dépendance du promoteur BLV. Lorsque le plasmide pBLVnlsLacZ est cotransfecté avec une construction codant pour Tax, toutes les cellules expriment LacZ sous la dépendance du promoteur BLV. (Les cellules FLK sont décrites dans "Comparative Leukaemia Research" 1975, Bibl. Haemat. Ne 43 - Ed. J. Clemmesen and D.S. Yohn, pp. 360-342 (Karger, Basel, 1976).
3. Développement de rétrovirus recombinants défectifs i) Rétrovirus recombinant BLV,nlsLacZ
Le provirus recombinant pBLVBnlsLacZ a été introduit par transfection dans des cellules FLK-BLV exprimant BLV. La production d'un rétrovirus recombinant
BLVnlsLacZ était obtenue en raison de 2 103 particules par ml de surnageant des cellules FLK-BLV BLVBnlsLacZ (tableau 4A). Les cellules étaient transfectées par 10 g de plasmide pBLVBnlsLacZ.
Le provirus recombinant pBLVBnlsLacZ a été introduit par transfection dans des cellules FLK-BLV exprimant BLV. La production d'un rétrovirus recombinant
BLVnlsLacZ était obtenue en raison de 2 103 particules par ml de surnageant des cellules FLK-BLV BLVBnlsLacZ (tableau 4A). Les cellules étaient transfectées par 10 g de plasmide pBLVBnlsLacZ.
La transfection du plasmide pBLV nlslacZ montre que les cellules RFM2 pX1 clones 11 et 14, ainsi que les cellules FLK-BLV, synthétisent le transactivateur Tax nécessaire à l'expression de LacZ placé sous la dépendance du promoteur du BLV. Les cellules RFM2 pXl clones 12 et 13 ne synthétisent pas assez de Tax pour activer le promoteur BLV.
Apres infection par 2 ml de surnageant des cellules
FLK-BLV BLVBnlsLacZ, les clones RFM2 pX1 clones 11 et 14 synthétisant Tax, expriment le gène LacZ. Ceci met en évidence la production de virus recombinants BLV6 nlsLacz par les cellules FLK-BLV BLVBnlsLacZ.
FLK-BLV BLVBnlsLacZ, les clones RFM2 pX1 clones 11 et 14 synthétisant Tax, expriment le gène LacZ. Ceci met en évidence la production de virus recombinants BLV6 nlsLacz par les cellules FLK-BLV BLVBnlsLacZ.
Le provirus BLVBnlsLacZ a conservé le signal d'encapsidation du virus car il permet la production de virus recombinants (tableaux 5 et 6).
ii) Rétrovirus BLV < nlsLacZ
Dans un plasmide contenant le provirus BLV, près de 7 kb de séquences provirales (plus particulièrement les séquences rêtroviraux entre les sites SmaI (616pb) et
BamHI (6997 pb) ont été remplacées par le gène marqueur
LacZ (provirus BLVsnlsLacZ, Figure 5); après transfection de ce plasmide dans les cellules FLK-BLV contenant un provirus fonctionnel BLV, la production de virus recombinant LacZ n'a été obtenue. Avec ce virus pour lequel le gène LacZ est placé sous le contrôle du promoteur BLV, l'expression LacZ a été obtenue que dans les cellules infectables exprimant le transactivateur
Tax (Tableau 5).
Dans un plasmide contenant le provirus BLV, près de 7 kb de séquences provirales (plus particulièrement les séquences rêtroviraux entre les sites SmaI (616pb) et
BamHI (6997 pb) ont été remplacées par le gène marqueur
LacZ (provirus BLVsnlsLacZ, Figure 5); après transfection de ce plasmide dans les cellules FLK-BLV contenant un provirus fonctionnel BLV, la production de virus recombinant LacZ n'a été obtenue. Avec ce virus pour lequel le gène LacZ est placé sous le contrôle du promoteur BLV, l'expression LacZ a été obtenue que dans les cellules infectables exprimant le transactivateur
Tax (Tableau 5).
Le provirus BLVsnlsLacZ a conservé le signal d'encapsidation du virus car il permet la production de virus recombinants (tableaux 5 et 6).
iii) Rétrovirus BLVSVnlsLacZ
Un autre rétrovirus recombinant BLV a été mis au point pour transférer le transgène SVnlsLacZ (provirus BLVsSVnlsLacZ, Figure 6). Ce virus permet l'expression du gène LacZ dans des cellules n'exprimant pas Tax, sous le contrôle du promoteur SV.
Un autre rétrovirus recombinant BLV a été mis au point pour transférer le transgène SVnlsLacZ (provirus BLVsSVnlsLacZ, Figure 6). Ce virus permet l'expression du gène LacZ dans des cellules n'exprimant pas Tax, sous le contrôle du promoteur SV.
Les séquences virales comprises entre les sites
SmaI (616pb) et BamHI (6997pb) ont été remplacées par les séquences SVnlsLacZ.
SmaI (616pb) et BamHI (6997pb) ont été remplacées par les séquences SVnlsLacZ.
iv) Rétrovirus BLV,nlsLacZEnvpX
La réalisation d'un autre virus recombinant LacZ,
BLVS nlsLacZ-Env-pX (Figure 6) permet d'étudier l'expression du virus chez l'animal. Ce virus contient en effet l'ensemble des signaux et des protéines de régulation du BLV, seuls les gènes de structures gag et pol (plus particulièrement les séquences virales comprises entre les sites SmaI (616pb) et BamHI (3871pb), ont été remplacés par le gène LacZ.
La réalisation d'un autre virus recombinant LacZ,
BLVS nlsLacZ-Env-pX (Figure 6) permet d'étudier l'expression du virus chez l'animal. Ce virus contient en effet l'ensemble des signaux et des protéines de régulation du BLV, seuls les gènes de structures gag et pol (plus particulièrement les séquences virales comprises entre les sites SmaI (616pb) et BamHI (3871pb), ont été remplacés par le gène LacZ.
L'expression du gène LacZ dans une cellule infectée par ce virus révèle donc l'expression potentielle d'un virus
BLV sauvage dans cette même cellule.
BLV sauvage dans cette même cellule.
4. Protection des cellules FLK-BLV contre la surinfection par BLVnlsLacZ
Le gène LacZ a été transféré dans des cellules n'exprimant pas les gènes Env du BLV (cellules RFM2) par infection avec le rétrovirus recombinant BLV nlsLacz.
Le gène LacZ a été transféré dans des cellules n'exprimant pas les gènes Env du BLV (cellules RFM2) par infection avec le rétrovirus recombinant BLV nlsLacz.
Par contre, les cellules FLK-BLV exprimant le provirus sauvage (et donc les protéines Env) ne révèlent pas le virus LacZ après infection, et ce malgré leur capacité à exprimer le provirus introduit par transfection ; elles sont donc protégées contre la surinfection par un rétrovirus BLVnlsLacZ (tableau 4B).
Ces résultats montrent que les cellules n'exprimant pas Env BLV sont de l'ordre de 1000 fois plus infectables que les cellules exprimant le virus sauvage.
En conséquence, il parait que l'expression des gènes Env du BLV protège la cellule contre l'infection par le BLV.
Bien que les cellules de mouton RFM2 se soient avérées infectables par les rétrovirus recombinants BLV, aucun des trois rétrovirus BLVBnlsLacZ, BLVsSVnlsLacZ n'a permis de transférer le gène LacZ dans les cellules
FLK-BLV exprimant le provirus BLV. Ceci est très vraisemblablement dû à un phénomène d'interférence virale bloquant l'infection plutôt qu'à un blocage de 1'expression, puisque ces cellules expriment le gène
LacZ lorsque ces provirus sont introduits par transfection. Les cellules FLK-BLV exprimant constitutivement la protéine Env du BLV sont donc effectivement protégés contre la surinfection par un rétrovirus BLV (tableau 6).
FLK-BLV exprimant le provirus BLV. Ceci est très vraisemblablement dû à un phénomène d'interférence virale bloquant l'infection plutôt qu'à un blocage de 1'expression, puisque ces cellules expriment le gène
LacZ lorsque ces provirus sont introduits par transfection. Les cellules FLK-BLV exprimant constitutivement la protéine Env du BLV sont donc effectivement protégés contre la surinfection par un rétrovirus BLV (tableau 6).
5. Expression spécifique du gène Env dans des lignées de cellules ovines et bovines
Une construction SVTkEnvBLv qui permet l'expression spécifique du gène Env du BLV sous le contrôle du double promoteur SVTk est en cours d'essai dans des lignées de cellules ovines et bovines. L'efficacité du blocage ainsi obtenu pourra alors être testée.
Une construction SVTkEnvBLv qui permet l'expression spécifique du gène Env du BLV sous le contrôle du double promoteur SVTk est en cours d'essai dans des lignées de cellules ovines et bovines. L'efficacité du blocage ainsi obtenu pourra alors être testée.
6. Blocage de l'infection par le BLV dans des cellules bovines
De nouveaux plasmides et des rétrovirus recombinants BLV porteurs des gènes Env ou du gène testeur LacZ ont été développés afin d'étudier in vitro le blocage de l'infection par le BLV.
De nouveaux plasmides et des rétrovirus recombinants BLV porteurs des gènes Env ou du gène testeur LacZ ont été développés afin d'étudier in vitro le blocage de l'infection par le BLV.
Par exemple
. pBLVH2-4EnvBLv : un plasmide contenant les gènes Env du BLV placés sous la dépendance du promoteur du gène d'histocompatibilité H2Rw de la souris.
. pBLVH2-4EnvBLv : un plasmide contenant les gènes Env du BLV placés sous la dépendance du promoteur du gène d'histocompatibilité H2Rw de la souris.
Les virus recombinants BLVLacZ sont également utilisés pour déterminer chez l'animal, les types de tissus susceptibles d'être infectés et d'exprimer le
BLV. La spécificité du promoteur nécessaire à l'expression des seules protéines Env dans l'ensemble des tissus infectables par le BLV est ainsi déterminée.
BLV. La spécificité du promoteur nécessaire à l'expression des seules protéines Env dans l'ensemble des tissus infectables par le BLV est ainsi déterminée.
7. Spectre d'hote du virus
Le virus BLVsSVnlsLacZ a permis de tester l'infectabilité des cellules de différentes espèces animales par le BLV. 50.000 cellules sont infectées par 1 ml de virus BLVsSVnlsLacZ. Par rapport à d'autres méthodes telles que la détection de syncitium ou d'une production de particules virales, l'utilisation des virus LacZ présentent les avantages suivants (1) Après infection et intégration du provirus recombinant, l'expression LacZ est obtenue à partir du promoteur "ubiquitaire" SV (contrairement aux autres méthodes nécessitant l'activation du promoteur BLV) (2) Les cellules infectées sont identifiées par la coloration histochimique au Xgal aisément détectable.
Le virus BLVsSVnlsLacZ a permis de tester l'infectabilité des cellules de différentes espèces animales par le BLV. 50.000 cellules sont infectées par 1 ml de virus BLVsSVnlsLacZ. Par rapport à d'autres méthodes telles que la détection de syncitium ou d'une production de particules virales, l'utilisation des virus LacZ présentent les avantages suivants (1) Après infection et intégration du provirus recombinant, l'expression LacZ est obtenue à partir du promoteur "ubiquitaire" SV (contrairement aux autres méthodes nécessitant l'activation du promoteur BLV) (2) Les cellules infectées sont identifiées par la coloration histochimique au Xgal aisément détectable.
Les résultats montrent que des cellules de mouton (RFM2), de rat (BRL) et de chat (G355.5) sont fortement infectables. (tableau 5.)
8. Blocage du virus BLBeSVnlsLacZ par un anticorps bloquant spécifique du BLV
Cet exemple montre la capacité d'un rétrovirus recombinant selon l'invention de mettre en évidence le caractère bloquant d'un anticorps anti-BLV.
8. Blocage du virus BLBeSVnlsLacZ par un anticorps bloquant spécifique du BLV
Cet exemple montre la capacité d'un rétrovirus recombinant selon l'invention de mettre en évidence le caractère bloquant d'un anticorps anti-BLV.
Les virus (BLVsSVnlsLacZ et le témoin MLVSnlsLacZ) sont incubés pendant 30 minutes en présence d'anticorps neutralisant du BLV dans un volume de 240 pl (à 37 C ou à 4" C).
Le virus BLVsSVnlsLacZ est neutralisé par l'anticorps à 37 C et à 4 C, alors que le MLVSVnlsLacZ n'est pas affecté par la présence de cet anticorps.
L'anticorps neutralisant bloque donc spécifiquement les virus BLV. Le tableau 7 montre le nombre de cellules
LacZ+ revélées par coloration Xgal, 48 heures après l'infection par un surnageant de culture neutralisée (ou non) par un anticorps bloquant spécifique du BLV.
LacZ+ revélées par coloration Xgal, 48 heures après l'infection par un surnageant de culture neutralisée (ou non) par un anticorps bloquant spécifique du BLV.
Cette expérience montre que le rétrovirus BLVsSVnlsLacZ est neutralisé par un anticorps bloquant du BLV, ce qui indique que l'infection virale par le BLV est bloquée par un anticorps neutralisant. En revanche, le témoin Moloney MLVSVnlsLacZ n'est pas neutralisé par le même anti-corps anti-BLV.
La souche E. coli SCS1 contenant le plasmide pBLV13 a été déposée le 20 juillet 1989 auprès de la Collection
Nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM) sous le numéro I-897.
Nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM) sous le numéro I-897.
Claims (29)
1. Cellule eucaryote comprenant un gène dérivé de 1'ARN du virus leucémogène Bovin (BLV) et codant pour une glycoprotéine d'enveloppe de ce rétrovirus ou un fragment de ce gène, sous le contrôle d'un promoteur permettant la transcription et l'expression de ce gène dans ces cellules, pour rendre celles-ci résistantes à l'infection par le BLV ou un variant de celui-ci.
2. Cellule selon la revendication 1, qui est une cellule d'animal transgénique, le gène codant pour la glycoprotéine étant intégré d'une manière stable dans le génome de ladite cellule, et ladite glycoprotéine se trouvant fixée sur le récepteur cellulaire normal du rétrovirus.
3. Cellule selon l'une quelconque des revendications précédentes, qui est une cellule bovine ou ovine, le gène étant le gène Env du BLV ou un fragment de ce gène.
4. Cellule selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractrisée en ce que l'expression du gène codant pour la glycoprotéine se fait sous le contrôle d'un promoteur différent de celui qui règle son expression dans le rétrovirus sauvage.
5. Procédé d'induction de résistance à l'infection par le virus leucémogène Bovin (BLV) d'une cellule eucaryote ou par un variant de celui-ci, caractérisé par l'introduction dans la cellule d'un gène dérivé de L'ART du BLV et codant pour une glycoprotéine d'enveloppe de ce rétrovirus, le gène étant sous le contrôle d'un promoteur permettant la transcription et l'expression de ce gène dans ces cellules, la glycoprotéine d'enveloppe ainsi exprimée se fixant sur le récepteur cellulaire normal du rétrovirus.
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'expression du gène codant pour la glycoprotéine se fait sous le contrôle d'un promoteur différent de celui qui règle son expression dans le rétrovirus sauvage.
7. Provirus recombinant, dérivé du provirus leucémogène Bovin (BLV) dont une partie a été remplacée par une séquence nucléotidique hétérologue, caractérisé en ce que la partie du provirus BLV remplacée correspond à la séquence virale des gènes rétroviraux gag, prt, pol, env et la partie codante du gène PX qui est commune avec env pris dans leur ensemble ou à un fragment de cette partie du génome rétroviral.
8. Provirus recombinant selon la revendication 7, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique hétérologue comprend un gène, codant pour un polypeptide et éventuellement une séquence regulatrice, plus particulièrement un ou des promoteur(s).
9. Provirus recombinant selon la revendication 8 caractérisé en ce que le gène codant pour un polypeptide comprend un gène marqueur, plus particulièrement le gène
LacZ.
10. Provirus recombinant selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que la partie du provirus BLV remplacée comprend les gènes rétroviraux pol et env et plus particulièrement la partie du génome rétroviral comprise entre les sites BamHI (1831pb) et
BamHI (6997pb).
11. Provirus recombinant selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que la partie du provirus BLV qui a été remplacée comprend les gènes rétroviraux gag, prt, pol et env, et plus particulièrement la partie du génome rétroviral comprise entre les sites SmaI (616pb) et BamHI (6997pb).
12. Provirus recombinant selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que la partie du provirus BLV qui a été remplacée comprend les gènes rétroviraux gag, prt et pol et plus particulièrement la partie du génome rétroviral comprise entre les sites
SmaI (616pb) et BamHI (3871pb).
13. Provirus recombinant pBLV illustré dans la figure 3.
14. Provirus recombinant pBLVBnlsLacZ illustré dans la figure 4.
15. Provirus recombinant pBLVsnlsLacZ illustré dans la figure 7.
16. Provirus recombinant pBLVsSVnlsLacZ illustré dans la figure 8.
17. Provirus recombinant pBLVsnlsLacZEnvpx illustré dans la figure 6.
18. E.Coli SUCS1 contenant le plasmide pBLV13 (CNCM I-897).
19. Retrovirus recombinant produit par insertion du provirus recombinant selon l'une quelconque des revendications 7 à 17 dans des cellules exprimant les protéines virales du BLV.
20. Retrovirus recombinant selon la revendication 19 caractérisée en ce qu'il est produit par l'insertion de provirus selon la revendication 9, dans des cellules exprimant les protéines virales du BLV.
21. Procédé de détermination de llinfectabilité au
BLV d'une cellule eucaryote selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé par la mise en contact de ladite cellule avec un rétrovirus recombinant selon la revendication 20, suivie par la révélation ou non de l'expression du gène marqueur, par exemple le gène LacZ dans la cellule par coloration histochimique.
22. Procédé d'identification de promoteurs permettant l'expression du gène codant pour la glycoprotéine d'enveloppe du BLV dans une cellule eucaryote, caractérisé par les étapes suivantes - mise en contact du rétrovirus recombinant selon la revendication 20 avec une cellule eucaryote infectable par le BLV comprenant un gène dérivé de L'ART du BLV et codant pour une glycoprotéine d'enveloppe de ce rétrovirus, ce gène étant sous le contrôle du promoteur d'intérêt, - révélation ou non de l'expression du gène marqueur dans la cellule, par exemple par coloration histochimique, l'expression du gène marqueur signifiant la fonctionnalité du promoteur.
23. Procédé d'identification de(s) fragment(s) du gène codant pour la glycoprotéine d'enveloppe du BLV nécessaire pour l'induction de la résistance à l'infection par le BLV d'une cellule eucaryote, caractérisé par les étapes suivantes - mise en contact du rétrovirus recombinant selon la revendication 20 avec des cellules eucaryotes, chacune de ces cellules eucaryotes comprenant un fragment différent du gène codant pour la glycoprotène d'enveloppe du BLV sous le contrôle d'un promoteur permettant la transcription et l'expression de ce gène dans ces cellules, - révélation ou non de l'expression du gène marqueur dans les cellules, par exemple par coloration histochimique, l'expression du gène marqueur signifiant l'infection de la cellule en question, par le rétrovirus recombinant et par conséquent l'incapacité de ce fragment du gène de la glycoprotéine d'enveloppe d'induire la résistance.
24. Procédé d'identification de cellules eucaryotes susceptibles d'être infectées par le BLV, caractérisé par les étapes suivantes - mise en contact du rétrovirus recombinant selon la revendication 20 avec une cellule eucaryote, - révélation ou non de l'expression du gène marqueur dans la cellule, par exemple par coloration histochimique, l'expression du gène marqueur signifiant llinfectabilité de la cellule par le BLV.
25. Procédé d'identification d'anticorps protecteur contre l'infection par le BLV, caractérisé par les étapes suivantes - mise en contact d'anticorps dirigés contre le BLV avec le rétrovirus recombinant selon la revendication 20 dans des conditions permettant une réaction immunologique entre les anticorps et le rétrovirus recombinant, - mise en contact du complexe anticorps-rétrovirus recombinant formé dans l'étape précédente avec une cellule susceptible d'être infectée par le BLV, - révélation ou non de l'expression du gène marqueur dans la cellule, par exemple par coloration histochimique, l'expression du gène marqueur signifiant l'infection des cellules par le rétrovirus recombinant et par conséquent, le caractère non-protecteur des anticorps.
26. Procédé de détermination de l'état infecté ou non d'une cellule eucaryote par le BLV, caractérisé par les étapes suivantes - mise en contact du rétrovirus recombinant selon la revendication 20 avec un prélèvement des cellules sous test, - révélation ou non de l'expression du gène marqueur dans les cellules, par exemple par coloration histochimique, l'expression du gène marqueur signifiant l'infection des cellules par le rétrovirus recombinant et par conséquent, l'absence d'infection par BLV dans les cellules avant leur mise en contact avec le rétrovirus recombinant.
27. Utilisation du provirus selon l'une quelconque des revendications 7 à 17 ou du rétrovirus recombinant selon l'une quelconque des revendications 19 ou 20 comme vecteur pour le transfert de gène(s) dans des cellules eucaryotes.
28. Utilisation du provirus selon l'une quelconque des revendications 7 à 17 ou du rétrovirus recombinant selon l'une quelconque des revendications 19 ou 20 comme vecteur pour le transfert de gène(s) dans des cellules eucaryotes et dans des lignées d'animaux domestiques par exemple ovins et bovins, le produit d'expression du gène ou des gènes transféré(s) n'ayant pas de propriétés thérapeutiques.
29. Provirus selon l'une quelconque des revendications 7 à 17 caractérisé en ce qu'il est intégré dans le génome d'une cellule eucaryote selon les revendications 1 à 4 ou dwun animal domestique.
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR8916929A FR2655855B1 (fr) | 1989-12-20 | 1989-12-20 | Protection genetique d'animaux contre l'infection par le virus leucemogene bovin, et provirus et virus recombinant derive de ce virus. |
AU70522/91A AU7052291A (en) | 1989-12-20 | 1990-12-20 | Genetic protection of animals against infection by the bovine leukemia virus, and provirus and recombinant virus derived from this virus |
PCT/FR1990/000935 WO1991009116A1 (fr) | 1989-12-20 | 1990-12-20 | Protection genetique d'animaux contre l'infection par le virus leucemogene bovin, et provirus et virus recombinant derive de ce virus |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR8916929A FR2655855B1 (fr) | 1989-12-20 | 1989-12-20 | Protection genetique d'animaux contre l'infection par le virus leucemogene bovin, et provirus et virus recombinant derive de ce virus. |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FR2655855A1 true FR2655855A1 (fr) | 1991-06-21 |
FR2655855B1 FR2655855B1 (fr) | 1992-04-10 |
Family
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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FR8916929A Expired - Lifetime FR2655855B1 (fr) | 1989-12-20 | 1989-12-20 | Protection genetique d'animaux contre l'infection par le virus leucemogene bovin, et provirus et virus recombinant derive de ce virus. |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
AU (1) | AU7052291A (fr) |
FR (1) | FR2655855B1 (fr) |
WO (1) | WO1991009116A1 (fr) |
Cited By (1)
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WO1997013856A1 (fr) * | 1995-10-10 | 1997-04-17 | Medical Research Council | Perfectionnements relatifs a la protection contre une infection intracellulaire |
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WO1988007080A2 (fr) * | 1987-03-09 | 1988-09-22 | The Upjohn Company | Cellules animales transgeniques resistantes aux infections virales |
WO1989005349A1 (fr) * | 1987-12-09 | 1989-06-15 | The Australian National University | Procede servant a combattre des infections virales |
WO1989009271A1 (fr) * | 1988-03-21 | 1989-10-05 | Viagene, Inc. | Retrovirus recombinants |
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FR2606030B1 (fr) * | 1986-10-31 | 1989-10-20 | Pasteur Institut | Retrovirus recombinant defectif, son procede de fabrication et ses applications, notamment pour l'etude de l'interaction des retrovirus sauvages avec des lignees cellulaires infectables par celui-ci |
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1989
- 1989-12-20 FR FR8916929A patent/FR2655855B1/fr not_active Expired - Lifetime
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1990
- 1990-12-20 WO PCT/FR1990/000935 patent/WO1991009116A1/fr unknown
- 1990-12-20 AU AU70522/91A patent/AU7052291A/en not_active Abandoned
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THEOR. APPL. GENET., vol. 77, 1989, pages 457-461, Springer-Verlag; D.W. SALTER et al.: "Artificial insertion of a dominant gene for resistance to avian leukosis virus into the germ line of the chicken" * |
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Also Published As
Publication number | Publication date |
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AU7052291A (en) | 1991-07-18 |
FR2655855B1 (fr) | 1992-04-10 |
WO1991009116A1 (fr) | 1991-06-27 |
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