FR2655269A1

FR2655269A1 - PROTEINS PREVENTING THE INTERACTION BETWEEN A FRAGMENT OF AN IMMUNOGLOBULIN AND ITS RECEPTOR AND USE IN THERAPEUTICS, PARTICULARLY IN THE TREATMENT OF CONDITIONS RELATED TO HIV VIRUSES.

Info

Publication number: FR2655269A1
Application number: FR8915935A
Authority: FR
Inventors: Khayat David; Soubrane Claude; Hirel Philippe-Herve; Visonneau Sophie; Mouawad Roger; Jacquillat Claude
Original assignee: Rhone Poulenc Sante SA; Universite Pierre et Marie Curie Paris 6
Current assignee: Rhone Poulenc Sante SA; Universite Pierre et Marie Curie Paris 6
Priority date: 1989-12-01
Filing date: 1989-12-01
Publication date: 1991-06-07
Anticipated expiration: 2009-12-01
Also published as: FR2655269B1; WO1991008301A1; CA2070166A1; JPH05505303A; EP0504234A1

Abstract

Protein at least partially preventing interaction between the fragment Fc of an immunoglobulin G and its receiver, in particular receiver R III. This protein may be a protein having a commun sequence with the antigen CD 16 of receiver III, or an antibody directed against antigen CD 16. These antibodies may be directed against different antigenetic determinants of antigen CD 16, particularily antibody 3 G 8. These proteins or fragments of proteins, including antibodies or fragments of antibodies, may be used in the preparation of medicines, pharmaceutic compositions to be administered by parenteral or enteral means, or may be used in treating affections linked to the HIV virus, in particularily AIDS, myelodisplasia, and auto-immune affections. The proteins having a commun sequence with antigens CD 16 of the receiver Fc gamma III may be obtained by genetic recombinant techniques.

Description

L'invention a pour objet des protéines empêchant
l'interaction entre le fragment Fc d'une immunoglobuline G et son récepteur ainsi que l'utilisation de ces protéines dans le traitement de maladies immunodépressives au toimmunes et virales.The invention relates to proteins preventing
the interaction between the Fc fragment of an immunoglobulin G and its receptor as well as the use of these proteins in the treatment of immune and depressive immune and viral diseases.

La présente invention porte particulièrement sur le traitement des affections liées aux virus HIV par des anticorps dirigés contre les récepteurs des immunoglobulines de type IgG. The present invention relates in particular to the treatment of conditions linked to HIV viruses with antibodies directed against the immunoglobulin receptors of the IgG type.

A la surface de nombreuses cellules, il existe des récepteurs qui permettent une relation entre les anticorps et les cellules de l'immunité . Parmi ces récepteurs, certains ont une affinité spécifique pour le fragment Fc des immunoglobulines
Un modèle particulièrement étudié a été celui des antigènes CD 16 portés par le récepteur Fc gamma R III. Les
CD 16 sont des antigènes de différenciation exprimés par les cellules humaines appartenant aux populations suivantes: cellules dites "natural killer " (NK), cellules
K, macrophages, polynucléaires neutrophiles et eosi nophiles et une sous population de cellules T (CD 16+, CD 3
Ils sont spécifiquement reconnus par une série d'anticorps monoclonaux dont les plus utilisés sont le 3G8 et l'anti-leu 11 B . (Unkeless et al., Ann. Rev. Immunol.On the surface of many cells, there are receptors that allow a relationship between antibodies and cells of immunity. Among these receptors, some have a specific affinity for the Fc fragment of immunoglobulins
A particularly studied model was that of CD 16 antigens carried by the Fc gamma R III receptor. The
CD 16 are differentiation antigens expressed by human cells belonging to the following populations: cells called "natural killer" (NK), cells
K, macrophages, polymorphonuclear neutrophils and eosi nophiles and a subpopulation of T cells (CD 16+, CD 3
They are specifically recognized by a series of monoclonal antibodies, the most used of which are 3G8 and anti-leu 11 B. (Unkeless et al., Ann. Rev. Immunol.

1988 ; 6 : 251-281).1988; 6: 251-281).

L'anticorps anti CD 16 3G8 est un anticorps monoclonal de souris de sous classe IgG 1, décrit et isolé par
FLEIT (FLEIT et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA,1982,79, 3275-3279) et résultant après clonage en agarose, de la fusion de cellules spléniques de souris CD 2 F1 immuni sées par voie intrapéritonéale à 2 semaines d'intervalle par 5 x 106 polynucléaires viables et de cellules de myélome P3U.The anti CD 16 3G8 antibody is a mouse monoclonal antibody of the IgG 1 class, described and isolated by
FLEIT (FLEIT et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 1982,79, 3275-3279) and resulting after agarose cloning, from the fusion of spleen cells of CD 2 F1 mice immunized intraperitoneally to 2 weeks apart by 5 x 106 viable polynuclear and P3U myeloma cells.

Cet anticorps monoclonal est dirigé contre le récepteur Fc de faible affinité de type III portant l'antigène CD 16. I1 est étudié et sélectionné pour sa capacité à inhiber la formation de rosettes EIgG (Unkeless et al. J. Exp.This monoclonal antibody is directed against the type III low affinity Fc receptor carrying the CD 16 antigen. It is studied and selected for its ability to inhibit the formation of EIgG rosettes (Unkeless et al. J. Exp.

Med.1979 ,150,580 ). Med. 1979, 150,580).

L'anticorps est ainsi apte à bloquer in vitro la re connaissance de la partie Fc des immunoglobulines de type G par le récepteur CD 16. Le nombre de sites de liaison du 3G8 aux polynucléaires est de 120 000 environ par cellule. The antibody is thus able to block in vitro recognition of the Fc part of type G immunoglobulins by the CD 16 receptor. The number of sites for binding of 3G8 to polynuclear cells is approximately 120,000 per cell.

Cet anticorps reconnaît une forte proportion de monocytes cultivés in vitro pendant plusieurs jours, ainsi que certaines cellules spécifiques comme les macrophages pulmonaires .(CLARKS0N et al. J. Exp. Med, 1988; 167: 408-417).This antibody recognizes a high proportion of monocytes cultured in vitro for several days, as well as certain specific cells such as pulmonary macrophages (CLARKS0N et al. J. Exp. Med, 1988; 167: 408-417).

Cet anticorps monoclonal a été utilisé en clinique humaine dans le traitement des purpuras auto-immuns résistants (CLARKS0N et al., N. Engl. J.Med.,1986,314,12361239). This monoclonal antibody has been used in human clinic in the treatment of resistant auto-immune purpuras (CLARKS0N et al., N. Engl. J. Med., 1986,314,12361239).

Dans ce cas, cet anticorps bloque les récepteurs Fc inhibant la phagocytose des particules opsonisées telles que les plaquettes recouvertes d'anticorps auto-immuns. I1 a été observé que l'activité NK des patients était fortement inhibée. In this case, this antibody blocks the Fc receptors inhibiting the phagocytosis of opsonized particles such as platelets coated with autoimmune antibodies. It was observed that the NK activity of the patients was strongly inhibited.

Les antigènes CD 16 sont portés par les récepteurs pour le fragment Fc des IgG de faible affinité ou hu-Fc-gamma RIII . Ils ont une affinité préférentielle pour les IgG aggrégées ou impliquées dans des immuns complexes. CD 16 antigens are carried by receptors for the Fc fragment of low affinity IgG or hu-Fc-gamma RIII. They have a preferential affinity for IgG aggregated or involved in complex immune systems.

Lors de la maturation leucocytaire et monocytaire, ce récepteur apparaît tardivement (au stade métamyélocyte et macrophagique). In vivo, les CD 16 jouent un rôle clé dans la clairance des complexes immuns à IgG (pour lesquels ils ont une affinité particulière) dont le rôle fut démontré tant chez le primate que chez l'homme atteint de purpura thrombopénique autoimmun par l'injection in vivo d'un anticorps monoclonal spécifique du récepteur(le 3G8),rôle clé enfin dans tous les phénomènes de phagocytose
ADCC (Cytotoxicité cellulaire Anticorps dépendante), de reconnaissance et de présentation des antigènes par des cellules compétentes du système immunitaire. During leukocyte and monocytic maturation, this receptor appears late (at the metamyelocyte and macrophagic stage). In vivo, CD 16 plays a key role in the clearance of IgG immune complexes (for which they have a particular affinity) whose role has been demonstrated in both primates and humans affected by autoimmune thrombocytopenic purpura by injection in vivo of a monoclonal antibody specific for the receptor (3G8), a key role finally in all phagocytosis phenomena
ADCC (Cell-dependent Antibody Cytotoxicity), recognition and presentation of antigens by competent cells of the immune system.

L'ADCC (Cytotoxicité Cellulaire Anticorps-dépendante ) est déterminée par la technique décrite par PERUSSIA et al. (J. of Immunology, 1986, 133, N"1, 180-189) . Cet te technique est réalisée dans des plaques de microtitra
51 tion par un essai de relargage de chrome 51 de 3 heures. The ADCC (Antibody-dependent Cellular Cytotoxicity) is determined by the technique described by PERUSSIA et al. (J. of Immunology, 1986, 133, N "1, 180-189). This technique is performed in microtitra plates
51 tion by a 3 hour chromium 51 release test.

Les cellules P815 Y de souris sensibilisées par un anticorps IgG de lapin anti P 815 Y (dilution l/loeooe) ou des érythrocytes de poulet sensibilisés par une dilution au 1/100e de l'anticorps IgG de lapin anti-érythrocytes de poulet sont utilisés comme cellules cibles par les PBL (lymphocytes du sang périphérique ) et les monocytes . Dans 1' expérience d'inhibition de la cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps, les différents anticorps (ascites ou surnageants ) sont incubés pendant les périodes d'incubation . La concentration de l'anticorps est gardée constante dans chaque puits.Mouse P815 Y cells sensitized with rabbit IgG anti P 815 Y antibody (dilution 1 / loeooe) or chicken erythrocytes sensitized by a 1 / 100th dilution of rabbit IgG antibody anti chicken erythrocytes are used as target cells by PBL (peripheral blood lymphocytes) and monocytes. In the antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity inhibition experiment, the various antibodies (ascites or supernatants) are incubated during the incubation periods. The concentration of the antibody is kept constant in each well.

La stimulation des cellules NK in vitro par différentes entités immunologiques tels que : anticorps anti CD 16 type 3G8, complexes immuns entre autres antigènes stimulateurs a été décrite (ANEGON et al.,J.Exp. Med.,1988, 167,452-472 ; CUTURI et al., J. Exp. Med., 1989,169, 569-583 ) Ces références bibliographiques dé crivent un système de culture de cellules NK. The stimulation of NK cells in vitro by different immunological entities such as: anti CD 16 type 3G8 antibody, immune complexes among other stimulating antigens has been described (ANEGON et al., J.Exp. Med., 1988, 167,452-472; CUTURI et al., J. Exp. Med., 1989,169, 569-583) These bibliographic references describe an NK cell culture system.

Selon cette technique les lymphocytes du sang périphérique sont cultivés à 370C avec des cellules lymphoblastoi- des RPMI 8866 irradiées à 50 grays pendant 10 jours (5 : 1
PBM/ cellules lymphoblastoldes, 2.5 x 105 PBM/ml/ RPMI/10% FCS) dans des plaques de cultures à 5% CO2 . Le milieu RPMI (milieu 1640) est contient du L-glutamate,et est dépourvu de bicarbonate de soude (MOORE et al., 1967, J.A.M.A. , 199, 519) . Le nombre total de cellules après 10 jours de culture est augmenté de 10 fois et la popula tion cellulaire comprend 60 à 80% de cellules NK CD 16+/
NKH 1+/CD 3 et 20 à 40% de cellules T CD 3+/CD 16-NKH 1-. According to this technique, peripheral blood lymphocytes are cultured at 370C with RPMI 8866 lymphoblast cells irradiated with 50 grays for 10 days (5: 1
PBM / lymphoblastold cells, 2.5 x 105 PBM / ml / RPMI / 10% FCS) in culture plates at 5% CO2. RPMI medium (medium 1640) contains L-glutamate, and is free of baking soda (MOORE et al., 1967, JAMA, 199, 519). The total number of cells after 10 days of culture is increased by 10 times and the cell population comprises 60 to 80% of NK CD 16 + cells /
NKH 1 + / CD 3 and 20 to 40% of CD 3 + / CD 16-NKH 1- T cells.

Des populations homogènes de cellules NK et T sont sélectionnées et purifiées par gradient de densité et technique de rosettes indirectes avec des anticorps de chèvre anti Ig de souris sensibilisées. La pureté de ces préparations ( supérieure à 98%) est déterminée par ìmmunofluo- rescence indirecte (cytofluorométre de flux) grâce à un panel d'anticorps monoclonaux . Les cellules NK et T obtenues de ces cocultures sont cultivées à 37"C, 5 x 106 cellules/ml RPMI 10% sérum veau foetal, pendant différen tes périodes avec différents inducteurs.Les ligands formant des rosettes (ligands FCR) sont des anticorps anti CD 16 (3 G 8) liés à la sépharose 4 B activée au bromure de cyanogène (5 mg anticorps / ml sépharose , 5 microlitres de billes pour 106 cellules) et des immuns complexes c'est-à-dire des anticorps IgG sensibilisés par des érythrocytes de boeuf (EA7S). Des anticorps non relevants liés à la sépharose 4B et des érythrocytes sont utilisés comme contrôles . Après culture, le surnageant de culture et/ou les cellules sont recueillis, les billes de sépharose sont détachées des cellules par vibrations (vortex) et éliminées de la suspension cellulaire après une centrifugation d'une minute à 500 Rpm . Les complexes immuns sont éliminés par lyse des globules rouges avec un milieu hypotonique . La viabilité cellulaire est supérieure à 95 dans toutes les conditions . Les cellules libres de tout ligand et les surnageants de culture sont ensuite utilisés dans différents essais de dosage de cytokines par tests radioimmunologiques ou immunoenzymatiques selon des techniques classiques disponibles dans le commerce. Homogeneous populations of NK and T cells are selected and purified by density gradient and indirect rosette technique with goat anti-Ig antibodies from sensitized mice. The purity of these preparations (greater than 98%) is determined by indirect immunofluorescence (flow cytofluorometer) using a panel of monoclonal antibodies. The NK and T cells obtained from these cocultures are cultured at 37 ° C., 5 × 10 6 cells / ml RPMI 10% fetal calf serum, for different periods with different inducers. Rosette ligands (FCR ligands) are anti CD 16 (3 G 8) linked to sepharose 4 B activated with cyanogen bromide (5 mg antibody / ml sepharose, 5 microliters of beads for 106 cells) and complex immune systems, ie IgG antibodies sensitized by beef erythrocytes (EA7S). Non-relevant antibodies linked to sepharose 4B and erythrocytes are used as controls. After culture, the culture supernatant and / or the cells are collected, the sepharose beads are detached from the cells by vibration. (vortex) and removed from the cell suspension after one minute centrifugation at 500 Rpm. Immune complexes are removed by lysis of red blood cells with hypotonic medium. Cell viability is known. below 95 in all conditions. The cells free of any ligand and the culture supernatants are then used in various assays for the determination of cytokines by radioimmunological or immunoenzymatic tests according to conventional techniques available commercially.

On observe que cette mise en contact est suivie d'un effet de stimulation des cellules CD 16+ NK et ces cellules stimulées relarguent alors des molécules cytotoxiques et cytokines et des facteurs de croissances telles que le facteur de nécrose tumorale (T.N.F.), l'interféron gamma
(IFN-gamma ) , l'interleukine 1 (IL1) l'interleukine 3 (IL3), le facteur de stimulation de la croissance des macrophages et des granulocytes (GM-CSF).Aucune production d'interleukine 1 bêta (IL 1 bêta) ou de G-CSF n'est prouvée en revanche.It is observed that this bringing into contact is followed by a stimulating effect on the CD 16+ NK cells and these stimulated cells then release cytotoxic molecules and cytokines and growth factors such as tumor necrosis factor (TNF), gamma interferon
(IFN-gamma), interleukin 1 (IL1) interleukin 3 (IL3), the factor stimulating the growth of macrophages and granulocytes (GM-CSF). No production of interleukin 1 beta (IL 1 beta) ) or G-CSF is not proven however.

PERUSSIA et al (J. of Immunology, 1986, 133, n"l, 180-189) ont aussi développé une technique de caractérisation des anticorps anti-CD 16,par inhibition de la formation de rosettes . Selon cette technique, des érythrocytes de boeuf sont sensibilisés par un anticorps IgG de lapin anti-érythrocytes de boeuf (EA7S) à une dilution au
La préparation EA7S est gardée en suspens ion à 1% en RPMI 1640 supplémentée par 10% de sérum de veau foetal pendant au minimum 1 semaine . Les cellules PBL (50 microlitres 5 x 1015 cellules) sont mélangées à 50 microlitres d'une suspension EA7S à 0.5% dans des plaques de microtitration pour la formation de rosettes . Le mélange est centrifugé (1000 rpm/l minute) et le culot est incubé à 40C pendant 30 minutes . Deux cent cellules au minimum sont comptées et les cellules portant 5 et plus EA7S sont considérées positives .Dans les expériences d'inhibition de formation de rosettes EA7S, les PBL ( 25 microlitres , 5 x 105 cellules ) sont mélangés avec un volume égal de l'anticorps et avec la préparation EA7S. Les anticorps monoclonaux non relevants en spécificité et de différentes sous classes d'immunoglobulines G sont utilisés comme contrôles . Le pourcentage d'inhibition est calculé selon la formule A/B x 100, dans laquelle A est la proportion de cellules formant rosettes (RFC) en présence de l'anticorps inhibiteur et B est la proportion de RFCEA7S en absence de l'anticorps.PERUSSIA et al (J. of Immunology, 1986, 133, n "l, 180-189) have also developed a technique for characterizing anti-CD 16 antibodies, by inhibiting rosette formation. According to this technique, erythrocytes from beef are sensitized by rabbit IgG anti-erythrocyte antibody (EA7S) at a dilution
The EA7S preparation is kept in suspension at 1% in RPMI 1640 supplemented with 10% fetal calf serum for at least 1 week. The PBL cells (50 microliters 5 × 1015 cells) are mixed with 50 microliters of an EA7S suspension at 0.5% in microtitration plates for the formation of rosettes. The mixture is centrifuged (1000 rpm / l minute) and the pellet is incubated at 40C for 30 minutes. A minimum of two hundred cells are counted and cells carrying 5 and more EA7S are considered positive. In experiments to inhibit the formation of EA7S rosettes, the PBLs (25 microliters, 5 × 105 cells) are mixed with an equal volume of l antibody and with EA7S preparation. The non-specific monoclonal antibodies of specificity and of different subclasses of immunoglobulins G are used as controls. The percentage inhibition is calculated according to the formula A / B x 100, in which A is the proportion of rosette-forming cells (RFC) in the presence of the inhibiting antibody and B is the proportion of RFCEA7S in the absence of the antibody.

Récemment, le gène du CD 16 a été cloné par de nombreuses équipes . Ainsi, le CD 16 des neutrophiles est une protéine liée à la membrane cellulaire par un groupement phosphatidyl inositol glycane et peut, par conséquent être relargué de la surface cellulaire par action de l'enzyme phospholipase C. Recently, the CD 16 gene has been cloned by many teams. Thus, CD 16 of neutrophils is a protein bound to the cell membrane by a phosphatidyl inositol glycan group and can therefore be released from the cell surface by the action of the enzyme phospholipase C.

Le CD 16 des cellules NK et des macrophages est résistant à cette tentative de digestion . Ce CD 16 est en fait codé par un autre gène, lui aussi récemment cloné, qui code pour un récepteur lié à la membrane cellulaire par une partie transmembranaire et intracytoplasmique
(RAVETCH et al. J. Exp. Med. 1989, 170, 481-487).The CD 16 of NK cells and macrophages is resistant to this digestion attempt. This CD 16 is actually coded by another gene, also recently cloned, which codes for a receptor linked to the cell membrane by a transmembrane and intracytoplasmic part.
(RAVETCH et al. J. Exp. Med. 1989, 170, 481-487).

I1 a été montré (DAERON et FRIDMAN, Ann. Inst. It has been shown (DAERON and FRIDMAN, Ann. Inst.

Pasteur/ Immunol.(1985), 136C, 383-437) que les récepteurs pouvaient être relargués in vitro à partir de cellules mises en culture dans des milieux sans sérum. Ces formes solubles de récepteurs ont été baptisées Immunoglobulin
Binding Factors (IBF) , car , une fois relarguées, elles conservent leur affinité spécifique pour le fragment Fc des IgG
I1 a été prouvé que ces IBF ont la capacité lorsqu'elles sont mises en contact avec des lymphocytes B activés d'inhiber puissamment et spécifiquement la secrétion d'IgG par ces lymphocytes activés. A 1 inverse, ces
IBF sont secretées ,lorsque le milieu de culture est enrichi en IgG .Ainsi, un véritable réseau de régulation de la sécrétion des IgG a été mis en évidence in vitro
Par la suite, ce même type de réseau a été mis en évidence pour les autres classes d'immunoglobulines récepteur à Fc-epsilon pour des IgE, récepteur à Fc-alpha pour les IgA définissant ainsi un réseau de régulation isotypique de la production d'immunoglobulines.Pasteur / Immunol. (1985), 136C, 383-437) that the receptors could be released in vitro from cells cultured in serum-free media. These soluble forms of receptors have been dubbed Immunoglobulin
Binding Factors (IBF) because, once released, they retain their specific affinity for the Fc fragment of IgG
It has been proven that these IBFs have the ability when brought into contact with activated B cells to strongly and specifically inhibit the secretion of IgG by these activated lymphocytes. Conversely, these
IBF are secreted, when the culture medium is enriched in IgG. Thus, a true network of regulation of the secretion of IgG has been demonstrated in vitro
Subsequently, this same type of network was demonstrated for the other classes of immunoglobulins Fc-epsilon receptor for IgE, Fc-alpha receptor for IgA thus defining an isotypic regulatory network for the production of immunoglobulins.

Chez la souris en 1984 et chez l'homme en 1987 l'existence de ces formes solubles de récepteurs Fc gamma de faible affinité a été mise en évidence dans le sérum
(KHAYAT et al., J. Immunol.(1985), 132 : 2496-2501; KHAYAT et al., J. Immunol. Methods., (1987) , 100: 235-241).Chez la souris, il a pu être montré que ces récepteurs sériques augmentaient avec l'age ainsi qu'au cours de certaines affections autoimmunes, infectieuses ou de certains syndromes lymphoprolifératifs (KHAYAT et al., J. Immunol.(1985), 24:83-91 .KHAYAT et al . Scand. J. Immunol. 1986, 24, 83-91. PURE et al., J. Exp. Med. (1984) , 160: 1836-1849).In mice in 1984 and in humans in 1987, the existence of these soluble forms of low affinity gamma Fc receptors has been demonstrated in serum.
(KHAYAT et al., J. Immunol. (1985), 132: 2496-2501; KHAYAT et al., J. Immunol. Methods., (1987), 100: 235-241). In mice, he was able be shown that these serum receptors increase with age as well as during certain autoimmune, infectious diseases or certain lymphoproliferative syndromes (KHAYAT et al., J. Immunol. (1985), 24: 83-91 .KHAYAT et al Scand. J. Immunol. 1986, 24, 83-91. PURE et al., J. Exp. Med. (1984), 160: 1836-1849).

I1 a été enfin décrit récemment l'existence de molécules CD 16 solubles dans le sérum ou plasma humain à l'aide d'un test immunoenzymatique (Elisa) spécifique basé sur l'utilisation de deux anticorps monoclonaux anti
CD 16 (3G8 et anti- leu 11 B (KHAYAT et al., J.Immunol.I1 was finally described recently the existence of CD 16 molecules soluble in human serum or plasma using a specific immunoenzymatic test (Elisa) based on the use of two anti monoclonal antibodies.
CD 16 (3G8 and anti-leu 11 B (KHAYAT et al., J. Immunol.

Methods , (1987), 100: 235-241).Methods, (1987), 100: 235-241).

Ces molécules solubles du sérum ont pu être adsorbées par chromatographie sur colonne d'IgG -sépharose et
Fc-sépharose , mais non sur Fab'2 sepharose démontrant qu'elles conservent leur affinité pour le Fc des IgG.These soluble serum molecules could be adsorbed by chromatography on an IgG -sepharose column and
Fc-Sepharose, but not on Fab'2 Sepharose demonstrating that they retain their affinity for the Fc of IgG.

Le procédé d'isolement du récepteur CD 16 ainsi que le produit de ce procédé et un procédé de dosage de ce récepteur ont fait l'objet de la demande de brevet PCT/
FR 88/00103 (publication WO 88/06733).The process for isolating the CD 16 receptor as well as the product of this process and a method for assaying this receptor were the subject of the patent application PCT /
FR 88/00103 (publication WO 88/06733).

On a maintenant découvert que les protéines empêchant l'interaction entre un fragment Fc d'une immunoglobuline et son récepteur permettent de traiter des maladies immunodépressives et/ou des maladies autoimmunes. It has now been discovered that the proteins preventing the interaction between an Fc fragment of an immunoglobulin and its receptor make it possible to treat immunosuppressive diseases and / or autoimmune diseases.

Les demandeurs ont montré de manière surprenante en utilisant le procédé de dosage du CD 16 décrit dans la demande WO 88/06.733 précédemment citée que,parmi une population infectée par le virus HIV, le taux de CD 16 soluble pouvait être corrêlé de manière significative avec le taux de T4 de p24, ou d'anticorps anti p 24 ainsi que d'une manière plus générale avec le stade clinique de la maladie HIV. The applicants have surprisingly shown using the CD 16 assay method described in application WO 88 / 06.733 cited above that, among a population infected with the HIV virus, the level of soluble CD 16 could be significantly correlated with the level of T4 of p24, or of anti-p24 antibodies as well as more generally with the clinical stage of the HIV disease.

Faisant suite à cette étude , la demanderesse a montré que cet anticorps avait une efficacité réelle dans le traitement de malades atteint du Sida. Following this study, the Applicant has shown that this antibody has real effectiveness in the treatment of patients suffering from AIDS.

La présente invention a donc pour objet de nouvelles protéines empêchant au moins partiellement l'interaction entre le fragment Fc d'une immunoglobuline G et son ré cepteur de type membranaire ou soluble, à l'exclusion des récepteurs gamma I et II. The present invention therefore relates to new proteins at least partially preventing the interaction between the Fc fragment of an immunoglobulin G and its receptor of membrane or soluble type, to the exclusion of the gamma I and II receptors.

Elle a également pour objet l'utilisation des protéines , anticorps ou autres et leurs fragments pour le traitement des affections liées aux virus HIV, notamment du SIDA , des myélodisplasies et/ou des affections autoimmunes
Les protéines ou leurs fragments autres que les anticorps anti récepteur empêchant au moins partiellement l'interaction entre un fragment Fc d'une IgG et son récepteur de type membranaire ou soluble, peuvent être notamment des protéines ayant une communauté de séquence avec le récepteur pour le fragment Fc des immunoglobulines G.It also relates to the use of proteins, antibodies or others and their fragments for the treatment of conditions linked to HIV viruses, in particular AIDS, myelodisplasia and / or autoimmune conditions
The proteins or their fragments other than the anti-receptor antibodies at least partially preventing the interaction between an Fc fragment of an IgG and its receptor of membrane or soluble type, can in particular be proteins having a sequence community with the receptor for the Fc fragment of immunoglobulins G.

Préférentiellement, ces protéines ou fragments de protéines auront une communauté de séquence avec le récepteur Fc gamma III porteur de l'antigène CD 16 , spécifique des immunoglobulines de type IgG et pourront notamment être obtenues par recombinaison génétique.Les fragments de protéines seront préférentiellement actifs et solubles
Encore plus préférentiellement , ces protéines ou fragments de protéines ayant une communauté de séquence avec l'antigène CD 16 seront obtenues par expression d'un vecteur recombiné génétiquement dans des cellules d'Escheria Coli ou dans des cellules eucaryotes , et en particulier dans la lignée de cellules d'hamster CHO.Preferably, these proteins or protein fragments will have a sequence community with the Fc gamma III receptor carrying the CD 16 antigen, specific for immunoglobulins of the IgG type and may in particular be obtained by genetic recombination. The protein fragments will preferably be active and soluble
Even more preferably, these proteins or fragments of proteins having a sequence community with the CD 16 antigen will be obtained by expression of a recombinant vector genetically in Escheria Coli cells or in eukaryotic cells, and in particular in the line. CHO hamster cells.

L'invention a d'autre part pour objet des protéines caractérisées en ce qu'elles sont des anticorps ayant des activités immunologiques spécifiques dirigées contre des fragments de la protéine CD 16,ou des anticorps antiidiotypes dirigés contre des anticorps anti-CD16. The invention also relates to proteins characterized in that they are antibodies having specific immunological activities directed against fragments of the CD 16 protein, or antiidiotypic antibodies directed against anti-CD16 antibodies.

De tels fragments seront notamment les fragments de la protéine CD 16 ayant les séquences d'acides aminés suivantes ou des fragments de ces séquences
NH2-PRO-ARG-TRP- VAL-PHE - LYS-GLU-GLU-ASP-PRO-ILE-HIS-LEU
ARG-CYS-C02H.Such fragments will in particular be the fragments of the CD 16 protein having the following amino acid sequences or fragments of these sequences
NH2-PRO-ARG-TRP- VAL-PHE - LYS-GLU-GLU-ASP-PRO-ILE-HIS-LEU
ARG-CYS-C02H.

NH2-LEU-GLN-ASN-GLY-LYS-ASP-ARG-LYS-TYR-PHE-HIS-HIS-ASN-
SER-CYS-C02H.NH2-LEU-GLN-ASN-GLY-LYS-ASP-ARG-LYS-TYR-PHE-HIS-HIS-ASN-
SER-CYS-C02H.

NH2-ALA-THR-VAL-ASN-ASP-SER-GLY-GLU-TYR-ARG-CYS-GLU-C02H
NH2-VAL-SER-THR-ISO-SER-SER-PHE-SER-PRO-PRO-GLY-C02H.
NH2-ALA-THR-VAL-ASN-ASP-SER-GLY-GLU-TYR-ARG-CYS-GLU-C02H
NH2-VAL-SER-THR-ISO-SER-SER-PHE-SER-PRO-PRO-GLY-C02H.

Ces protéines ou fragments de protéines y compris les anticorps ou fragments d'anticorps peuvent notamment être définis comme inhibants au moins en partie la formation de rosettes entre des neutrophiles humains et des globules rouges de moutons opsonisés par des immunoglobulines G anti-globules rouges de moutons,selon la technique définie précédemment
Les anticorps ou fragments d'anticorps peuvent aussi être définis comme stimulants la synthèse et éventuelle ment le relargage de cytokine(s) et/ou de facteur(s) de croissance par les cellules NK en cultures, notamment de
TNF , selon la technique définie précédemment.These proteins or protein fragments including the antibodies or antibody fragments can in particular be defined as inhibiting at least in part the formation of rosettes between human neutrophils and red blood cells of sheep opsonized by immunoglobulins G anti-red blood cells of sheep , according to the technique defined above
The antibodies or antibody fragments can also be defined as stimulating the synthesis and optionally the release of cytokine (s) and / or growth factor (s) by NK cells in cultures, in particular of
TNF, according to the technique defined above.

Les protéines ou fragments de protéines y compris les anticorps ou fragments d'anticorps précédemment décrits peuvent aussi être définis comme inhibants au moins partiellement la cytotoxicité cellulaire anticorps-dépendante (ADCC ) mesurée par la méthode telle que définie précédemment
L'invention a encore pour objet des médicaments contenant ces protéines ou fragments de protéines pour le traitement des affections liées aux virus HIV, notamment du
SIDA , des myélodisplasies et/ou des affections autoimmunes.The proteins or protein fragments including the antibodies or antibody fragments described above can also be defined as at least partially inhibiting the antibody-dependent cell cytotoxicity (ADCC) measured by the method as defined above.
Another subject of the invention is medicaments containing these proteins or protein fragments for the treatment of conditions linked to HIV viruses, in particular
AIDS, myelodisplasia and / or autoimmune conditions.

La présente invention a aussi pour objet des compositions pharmaceutiques contenant une quantité efficace d'au moins une de ces protéines ou fragments de protéines en association avec un ou plusieurs diluants ou adjuvants compatibles et pharmaceutiquement acceptables . Ces compositions peuvent être utilisées dans le traitement des affections liées aux virus HIV, notamment du SIDA, des myélodisplasies et/ou des affections auto-immunes. A subject of the present invention is also pharmaceutical compositions containing an effective amount of at least one of these proteins or protein fragments in combination with one or more compatible and pharmaceutically acceptable diluents or adjuvants. These compositions can be used in the treatment of conditions linked to HIV viruses, in particular AIDS, myelodisplasia and / or autoimmune conditions.

Ces compositions peuvent notamment être administrées par voie parentérale et entérale. These compositions can in particular be administered parenterally and enterally.

L'invention est de plus relative à l'utilisation de ces protéines ou fragments de protéines pour le traitement des affections liées aux virus HIV, notamment du
SIDA , des myélodisplasies et/ou des affections autoimmunes.The invention further relates to the use of these proteins or protein fragments for the treatment of conditions linked to HIV viruses, in particular of
AIDS, myelodisplasia and / or autoimmune conditions.

La présente invention ,outre l'utilisation de protéines et de fragments de protéines présentant une communauté de séquence avec le récepteur pour le fragment Fc des immunoglobulines G, a pour autre objet l'utilisation d'une protéine ou fragments de protéine ,empêchant au moins partiellement l'interaction entre un fragment
Fc d'une immunoglobuline G et son récepteur de type membranaire ou soluble, l'exclusion des récepteurs Fc gamma I et II, pour la fabrication d'un médicament pour le traitement des affections liées aux virus HIV , notamment du SIDA, des myélodisplasies et/ou des affections auto- immunes.The present invention, in addition to the use of proteins and protein fragments having a sequence community with the receptor for the Fc fragment of immunoglobulins G, has another object the use of a protein or protein fragments, preventing at least partially the interaction between a fragment
Fc of an immunoglobulin G and its membrane or soluble receptor, the exclusion of Fc gamma I and II receptors, for the manufacture of a medicament for the treatment of conditions linked to HIV viruses, in particular AIDS, myelodisplasia and / or autoimmune conditions.

Ces protéines ou fragments de protéines peuvent notamment avoir une communauté de séquence avec le récepteur III pour le fragment Fc des immunoglobulines G. These proteins or protein fragments can in particular have a sequence community with the receptor III for the Fc fragment of immunoglobulins G.

La protéine rentrant dans cette fabrication peut aussi être un anticorps anti-récepteur , c'est-à-dire un anticorps dirigé contre le récepteur membranaire ou soluble du fragment Fc de l'immunoglobuline , et en particulier un anticorps anti-CD 16
Cette protéine peut être définie comme inhibant au moins en partie la formation de rosettes selon la technique de PERUSSIA et al.(J.of Immunology 1986, 133 , n"l, 180-189) précédemment citée.The protein used in this production can also be an anti-receptor antibody, that is to say an antibody directed against the membrane receptor or soluble of the Fc fragment of the immunoglobulin, and in particular an anti-CD 16 antibody.
This protein can be defined as at least partially inhibiting the formation of rosettes according to the technique of PERUSSIA et al. (J. of Immunology 1986, 133, n "l, 180-189) previously cited.

Une telle protéine peut aussi inhiber au moins partiellement l'activité cytotoxique anticorps-dépendante (ADCC) telle que définie précédemment et mesurée selon
PERUSSIA et al.(J. of Immunology, 1986, 133, n0l, 180-189). Such a protein can also at least partially inhibit the antibody-dependent cytotoxic activity (ADCC) as defined above and measured according to
PERUSSIA et al. (J. Of Immunology, 1986, 133, nol, 180-189).

Un anticorps de ce type peut aussi stimuler la synthèse et éventuellement le relarguage de cytokine(s) et/ou de facteur (s) de croissance par les cellules "Natural Killer" (NK) en culture selon la technique précédemment citée (ANEGON et al. 1988 J. of Exp. Med, 167, 452 - 472; CUTURI et al. , J. Exp. Med, 1989, 169, 569-583). An antibody of this type can also stimulate the synthesis and possibly the release of cytokine (s) and / or growth factor (s) by "Natural Killer" (NK) cells in culture according to the previously mentioned technique (ANEGON et al. 1988 J. of Exp. Med, 167, 452 - 472; CUTURI et al., J. Exp. Med, 1989, 169, 569-583).

L'anticorps est en particulier l'anticorps monoclonal 3G8. The antibody is in particular the 3G8 monoclonal antibody.

Selon un mode de mise en oeuvre préférentiel de l'invention, le traitement des malades par l'anticorps se fait par voie parentérale ou entérale. According to a preferred embodiment of the invention, the treatment of patients with the antibody is done parenterally or enterally.

L'invention sera encore illustrée sans être aucunement limitée par les exemples qui suivent dans lesquels:
Les figures 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 et 9 sont des diagrammes dans lesquels on a donné en abscisses le temps exprimé en jours, avec des échelles variables selon les jours , et en ordonnées le nombre respectivement de plaquettes, d'érythroblastes, de réticulocytes, de myélocy
tes, de polyneutrophiles, de métamyélocytes, de monocytes , de leucocytes , et de lymphocytes.The invention will be further illustrated without being in any way limited by the examples which follow in which:
Figures 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 and 9 are diagrams in which the time expressed in days has been given on the abscissa, with scales varying according to the days, and on the ordinate the number of respectively platelets, erythroblasts, reticulocytes, myelocyte
tes, polyneutrophiles, metamyelocytes, monocytes, leukocytes, and lymphocytes.

La figure 10 représente l'évolution du taux de lymphocytes T4 (en ordonnée) en fonction du temps exprimé en jours (en abscisse). FIG. 10 represents the evolution of the rate of T4 lymphocytes (on the ordinate) as a function of the time expressed in days (on the abscissa).

La figure 11 représente l'évolution des activités des cellules NK et de la cytotoxicité cellulaire anticorps - dépendante (ADCC) en ordonnée, en fonction du temps exprimé en jours en abscisse. FIG. 11 represents the evolution of the activities of NK cells and of antibody-dependent cell cytotoxicity (ADCC) on the ordinate, as a function of the time expressed in days on the abscissa.

La figure 12 est un diagramme représentant l'évolution du taux d'anticorps 3G8 dans le sérum d'un patient traité par cet anticorps exprimé en ordonnée en ng/ml en fonction du temps exprimé en jours, avec des échelles variables selon les jours, en abscisse
Les figures 13, 14, 15, 16, 17 et 18 représentent l'évolution en fonction du temps exprimé en jours, avec des échelles variables pour les jours (en abscisse) des taux de cytokines sériques, respectivement de facteur de nécrose tumorale (TNF), de l'IFN-gamma, du récepteur à l'interleukine 2 soluble (CD25S), de l'interleukine 1
alpha , de l'interleukine 2 soluble et du facteur de stimulation de la croissance des macrophages et des granulocytes (GM-CSF).FIG. 12 is a diagram representing the evolution of the level of 3G8 antibody in the serum of a patient treated with this antibody expressed on the ordinate in ng / ml as a function of the time expressed in days, with scales varying according to the days, on the x-axis
Figures 13, 14, 15, 16, 17 and 18 represent the evolution as a function of time expressed in days, with variable scales for the days (on the abscissa) of the levels of serum cytokines, respectively of tumor necrosis factor (TNF) ), IFN-gamma, the soluble interleukin 2 receptor (CD25S), interleukin 1
alpha, soluble interleukin 2 and macrophage and granulocyte growth stimulating factor (GM-CSF).

Sur ces 18 figures, T1, T2, T3 et T4 correspondent aux quatre injections d'anticorps 3G8. In these 18 figures, T1, T2, T3 and T4 correspond to the four injections of 3G8 antibodies.

La figure 19 représente la mesure du taux de CD16 soluble dans le milieu conditionné dans les cellules CDO de hamster. FIG. 19 represents the measurement of the level of soluble CD16 in the conditioned medium in the hamster CDO cells.

La figure 20 représente un gel obtenu par électrophorèse SDS-PAGE des protéines des souches BL 21 DE 3,
BL 21 plys E, BL 21 pLys S induites ou non induites.FIG. 20 represents a gel obtained by SDS-PAGE electrophoresis of the proteins of the BL 21 DE 3 strains,
BL 21 plys E, BL 21 pLys S induced or not induced.

EXEMPLE 1
Etude sérologique de la distribution des antigènes
CD 16 solubles.EXAMPLE 1
Serological study of the distribution of antigens
CD 16 soluble.

A l'aide du procédé de dosage des CD 16 solubles
décrits dans la demande de brevet WO 88/06.733 précédemment mentionnée des études séro-épidémiologiques dans des pathologies infectueuses, néoplastiques et autoimmunes ont été effectuées pour définir la distribution du CD 16 soluble au cours de désordres pathologiques
10) Etude sérologique
Au cours de ce type d'études séroépidémiologiques le taux de CD 16 soluble a été dosé dans plus de 500 serums appartenant à des individus sains ou atteints de différentes pathologies . Ainsi, une évolution tout à
fait significative des taux de CD 16 soluble a été observée dans le sérum de patients atteints d'infection par le virus HIV au fur et a mesure de l'aggravation de leur maladie chez 73 individus tous infectés par le virus HIV et présentant des degrés différents de symptomatologie
allant de la simple séropositivité à l'acquisition de maladies graves ou tumorales. Using the soluble CD 16 assay process
described in patent application WO 88 / 06.733 previously mentioned, seroepidemiological studies in infectious, neoplastic and autoimmune pathologies were carried out to define the distribution of soluble CD 16 during pathological disorders
10) Serological study
During this type of seroepidemiological study, the level of soluble CD 16 was measured in more than 500 sera belonging to healthy individuals or suffering from various pathologies. Thus, an evolution quite
significant fact that soluble CD 16 levels have been observed in the serum of patients infected with the HIV virus as their disease worsens in 73 individuals all infected with the HIV virus and with different degrees symptomatology
ranging from simple seropositivity to the acquisition of serious or tumor diseases.

Pour chacun de ces patients, une série large d'informations était disponible (âge, mode de contamination, sexe , stade clinique d'évolution, nombre de lymphocytes T4, de lymphocytes T8, taux sérique de p 24, d'anti p24, d'IgG, d'IgA, d'IgM, d'IgE) et on a ainsi pu rechercher l'existence de corrélation statistique entre le taux sérique de CD 16 soluble et les autres paramètres cliniques ou biologiques
I1 a été ainsi mis en évidence une corrélation extrêmement significative entre le taux de CD 16 soluble et le stade clinique de la maladie HIV (p = 0.002) , le taux de T4 (p = 0.02 ) et le taux de P 24 circulant (p = 0.02) ainsi que le taux d'anticorps anti-p24 (p = 0.003).For each of these patients, a wide range of information was available (age, mode of contamination, sex, clinical stage of development, number of T4 lymphocytes, T8 lymphocytes, serum p 24, anti p24, d (IgG, IgA, IgM, IgE) and it was thus possible to investigate the existence of a statistical correlation between the serum level of soluble CD 16 and the other clinical or biological parameters
It has thus been demonstrated an extremely significant correlation between the level of soluble CD 16 and the clinical stage of HIV disease (p = 0.002), the T4 level (p = 0.02) and the circulating P 24 level (p = 0.02) as well as the level of anti-p24 antibodies (p = 0.003).

Ces résultats figurent dans les tableaux I et II suivants ;dans le tableau II le taux de CD16 soluble est exprimé comme l'inverse de la dernière dilution positive du sérum. These results are shown in Tables I and II below; in Table II the level of soluble CD16 is expressed as the inverse of the last positive dilution of the serum.

TABLEAU I
Relations entre les paramètres immunologiques et le
taux de CD 16 dans le sérum des patients atteints d'une
affection liée aux virus HIV.TABLE I
Relations between immunological parameters and
CD 16 levels in the serum of patients with
condition linked to HIV viruses.

Paramètres (Coefficient de corrélation)
Immunologiques avec le taux de CD 16 soluble P
Cellules CD4+ 0.2359 .02
Cellules CD8+ 0.0734 NS
Antigène p24 - 0.2272 .02
Anticorps anti-p24 0.3146 .003
IgG 0.1099 NS*
IgM - 0.0976 NS*
IgA - 0.1168 NS*
IgE 0.0869 NS*
CD25 soluble - 0.1431 NS* *NS = non significatif. Parameters (Correlation coefficient)
Immunological with soluble CD 16 P level
CD4 + cells 0.2359 .02
CD8 + 0.0734 NS cells
Antigen p24 - 0.2272 .02
Anti-p24 antibody 0.3146 .003
IgG 0.1099 NS *
IgM - 0.0976 NS *
IgA - 0.1168 NS *
IgE 0.0869 NS *
Soluble CD25 - 0.1431 NS * * NS = not significant.

TABLEAU II
Corrélation entre l'état des patients selon la classification CDC et le
stade clinique Taux de CD 16 P
soluble
Patients sains (contrôles) 3.92 (0.68)
Stade CDC II 8.54 (1.26) 0.0003
Stade CDC III 7.63 (1.30) 0.002
Stade CDC IV 1.08 (0.43) 0.05
Les chiffres entre parenthèses correspondent aux écarts types.TABLE II
Correlation between the condition of patients according to the CDC classification and the
clinical stage CD level 16 P
soluble
Healthy patients (controls) 3.92 (0.68)
CDC II stage 8.54 (1.26) 0.0003
CDC III stage 7.63 (1.30) 0.002
CDC IV stage 1.08 (0.43) 0.05
The figures in parentheses correspond to standard deviations.

Ainsi , il apparaît que le taux de CD 16 soluble est directement proportionnel à la gravité de l'évolution clinique de la maladie HIV et que ce taux est également proportionnel aux paramètres biologiques classiques caractéristiques du pronostic de cette affection:T4, p24 et anti p-24. Thus, it appears that the level of soluble CD 16 is directly proportional to the severity of the clinical course of HIV disease and that this level is also proportional to the classic biological parameters characteristic of the prognosis of this condition: T4, p24 and anti p -24.

I1 est apparu aussi que chez des patients dans le stade final de la maladie . Le stade IV dans la classification définie par le "Center for Disease Control" (stade CDC IV) le taux de CD 16 soluble peut devenir nul. It also appeared only in patients in the final stage of the disease. Stage IV in the classification defined by the "Center for Disease Control" (CDC IV stage) the level of soluble CD 16 may become zero.

2)Etude cytologique
L'expression cellulaire du CD 16 a été également dé terminée
I1 a été montré par BOROS et al..(Abstract Th BP 84 in Program and Abstract from the V International
Conference on Aids, Montréal, Canada, 1989) que sur les neutrophiles des malades atteints de maladie HIV, l'expression du récepteur Fc était significativement diminuée lors du passage au Sida vrai, cependant aucune information n'était donnée quant à l'expression des CD 16 des cellules NK et lymphocytes T. Par des méthodes de fluorescence en double marquage, l'expression du CD 16 sur la membrane de cellules CD3+/CD16+ (T) et NK de 30 des 73 patients infectés a été observée et il a été
prouvé que la population CD3+/CD 16+ est sensiblement
augmentée en proportion et en valeur absolue chez les pa
tients infectés.2) Cytological study
CD 16 cell expression has also been determined
It has been shown by BOROS et al. (Abstract Th BP 84 in Program and Abstract from the V International
Conference on Aids, Montreal, Canada, 1989) that on the neutrophils of patients with HIV disease, the expression of the Fc receptor was significantly reduced during the transition to true AIDS, however no information was given as to the expression of CD 16 of NK cells and T lymphocytes. By double labeling fluorescence methods, the expression of CD 16 on the membrane of CD3 + / CD16 + (T) and NK cells of 30 of the 73 infected patients was observed and it was
proven that the CD3 + / CD 16+ population is significantly
increased in proportion and in absolute value among pa
infected patients.

Le tableau III ci-après résume les résultats obtenus. Table III below summarizes the results obtained.

Dans ce tableau les chiffres entre parenthèses correspon
dent aux écarts types.In this table the figures in parentheses correspond
standard deviation tooth.

TABLEAU III
Corrélation entre l'expression de l'antigène CD 16 à la surface des lymphocytes de patients atteints par la maladie HIV le taux de CD 16 soluble et le stade chimique selon la classification CDC:
Type cellulaire
CD3+ CD16+ Leul9+ CD16+ [(Leul9+CDl6+/Leul9+)j
(en % x 100) ( en % x 100) (en % x 100)
Stade CDC Il 73.4 (17.5) 101.4 (34.1) 46.9 (5.4)
Stade CDC III 64.4 (15.4) 82.0 (19.4) 47.3 (2.9)
Stade CDC IV 56.0 (11.6) 169.7 (57.0) 51.9 (7.7)
P NS NS NS
Taux de CD 16 0.3 NS NS soluble
EXEMPLE 2
a) Utilisation thérapeutique de l'anticorps 3G8
Une étude pilote d'injection de l'anticorps 3G8 réa
lisée chez la souris et chez le primate a montré une bonne tolérance à ces injections.De plus, cet anticorps a été utilisé avec succès chez un patient dans le traitement d'un purpura auto-immun résistant (CLARKSON et al,l986,
N. Engl. J. Med., 314,1236-1239).TABLE III
Correlation between the expression of the CD 16 antigen on the surface of the lymphocytes of patients affected by HIV disease, the level of soluble CD 16 and the chemical stage according to the CDC classification:
Cell type
CD3 + CD16 + Leul9 + CD16 + [(Leul9 + CDl6 + / Leul9 +) j
(in% x 100) (in% x 100) (in% x 100)
CDC Stage II 73.4 (17.5) 101.4 (34.1) 46.9 (5.4)
CDC III stage 64.4 (15.4) 82.0 (19.4) 47.3 (2.9)
CDC IV stage 56.0 (11.6) 169.7 (57.0) 51.9 (7.7)
P NS NS NS
CD 16 0.3 NS NS soluble rate
EXAMPLE 2
a) Therapeutic use of the 3G8 antibody
A pilot study of injection of the 3G8 antibody
It has been shown in mice and primates to be tolerable to these injections and has been successfully used in a patient to treat auto-immune purpura (CLARKSON et al, l986,
N. Engl. J. Med., 314, 1236-1239).

L'anticorps monoclonal 3G8 a été injecté à un patient atteint d'une maladie liée au virus HIV évoluée associée à un purpura auto-immun résistant à toute thérapeutique,tel qu'il se rencontre souvent au cours des maladies liées au virus HIV. The monoclonal antibody 3G8 was injected into a patient suffering from an advanced HIV virus-related disease associated with an autoimmune purpura resistant to any therapy, as it is often encountered during diseases linked to the HIV virus.

I1 s'agissait d'un patient de 35 ans ayant pour antécédent une hépatite B, plusieurs blénnoragies et un herpès génital
Le patient présentait les signes généraux de la ma
ladie HIV permettant de le classer ARC depuis au moins deux ans . Différentes thérapeutiques avaient été déjà tentées sur ce patient : la cyclosporine, suivie d'une splénectomie .Une thérapeutique par 1'AZT et le zovirax (aciclovir,dictionnaire Vidal, éd. 1989, p.l758) avait été aussi tentée sans résultat
Avant le traitement par l'anticorps 3G8 , le patient se trouvait au stade III ou IV de la maladie HIV selon la classification CDC et n'avait pas subi de traitement ayant une action sur le système immunologique depuis au moins 28 jours
L'injection de l'anticorps a été effectuée dans les conditions qui suivent
L'anticorps monoclonal a été préparé dans des conditions de sécurité sur la lignée (stérilité, absence de virus leucémogènes, de mycoplasmes) sur l'anticorps purifié (pureté, concentration en anticorps , en protéines, en sous-classes d'Ig, DNA, polynucléotides, stérilité, absence de pyrogène et mycoplasmes ).It was a 35-year-old patient with a history of hepatitis B, several gonorrhea and genital herpes
Patient had general signs of AD
ladie HIV allowing to classify ARC for at least two years. Various therapies had already been attempted on this patient: cyclosporine, followed by a splenectomy. A therapy with AZT and zovirax (aciclovir, Vidal dictionary, ed. 1989, p.l758) had also been tried without result
Before treatment with the antibody 3G8, the patient was in stage III or IV of the HIV disease according to the CDC classification and had not undergone any treatment having an action on the immune system for at least 28 days
The injection of the antibody was carried out under the following conditions
The monoclonal antibody was prepared under safe conditions on the line (sterility, absence of leukemogenic viruses, of mycoplasmas) on the purified antibody (purity, concentration of antibodies, proteins, in Ig subclasses, DNA , polynucleotides, sterility, absence of pyrogen and mycoplasmas).

L'injection suit la posologie suivante : 0.4 mg/kg en perfusion intraveineuse d'une heure diluée dans une solution d'albumine à 4%. The injection follows the following dosage: 0.4 mg / kg as a one hour intravenous infusion diluted in a 4% albumin solution.

La première injection a été réalisée entre 10 heures et 11 heures du matin en une perfusion d'une heure
Durant l'administration du produit , aucun effet n'a été à signaler , en revanche une heure plus tard, l'apparition de frissons intenses d'une fièvre à 400C justifiait l'administration de 10 mg de polaramine
(maléate de dexchlorphéniramine, dictionnaire Vidal, éd.The first injection was given between 10 a.m. and 11 a.m. in an hour-long infusion
During the administration of the product, no effect was to be reported, however an hour later, the appearance of intense chills of a fever at 400C justified the administration of 10 mg of polaramine
(dexchlorpheniramine maleate, Vidal dictionary, ed.

1989, p.1327) et 200 mg d'hémisuccinate d'hydrocortisone
L'ensemble de ces phénomènes fut régressif aux environs de 12 heures ; quant à la température , elle s'est normalisée aux environs de 20 heures
Une seconde injection de 3G8 à la même dose a été réalisée à la même heure 2 jours plus tard en brève perfusion. Celle-ci a été suivie du même phénomène thermique et de l'apparition de frissons intenses accompagnés de douleurs osseuses tolérables .Ces phénomènes ont cessé, en deux heures pour les frissons , en 6 heures pour la fièvre et les algies osseuses, d'où recours à l'administration de prodalfalgan (chlorhydrate de propacétamol, dictionnaire Vidal, éd. 1989,p.1373) à raison de 3 ampoules et de 10 mg de polaramine et 200 mg d'hémisuccinate d'hydrocortisone
Un dernier traitement par 3G8 a été réalisé comportant une première injection de 8 heures à 9 heures du matin suivie d'une deuxième injection de 10 heures à 11 heures du matin le même jour. Cette double dose a été suivie des mêmes phénomènes cliniques précédemment rencontrés , à savoir syndrome fébrile à 390C durant 4 heures, frissons intenses durant 2 heures , l'ensemble de ces phénomènes ayant cessé sous 10 mg de polaramine et 200 mg d'hémisuccinate d 'hydrocortisone.1989, p.1327) and 200 mg of hydrocortisone hemisuccinate
The whole of these phenomena was regressive around 12 o'clock; as for the temperature, it normalized around 20 hours
A second injection of 3G8 at the same dose was given at the same time 2 days later in a brief infusion. This was followed by the same thermal phenomenon and the appearance of intense chills accompanied by tolerable bone pain. These phenomena ceased, in two hours for the chills, in 6 hours for fever and bone pain, hence resort to the administration of prodalfalgan (propacetamol hydrochloride, Vidal dictionary, ed. 1989, p.1373) at the rate of 3 ampoules and 10 mg of polaramine and 200 mg of hydrocortisone hemisuccinate
A last treatment with 3G8 was carried out comprising a first injection from 8 am to 9 am followed by a second injection from 10 am to 11 am the same day. This double dose was followed by the same clinical phenomena previously encountered, namely feverish syndrome at 390C for 4 hours, intense chills for 2 hours, all of these phenomena having stopped under 10 mg of polaramine and 200 mg of hemisuccinate. hydrocortisone.

En revanche , il convient de signaler l'apparition dès la fin de la 2ème injection de douleurs osseuses intenses justifiant la mise sous morphine par voie injectable . Ces douleurs osseuses se sont atténués sous stupéfiants mais n'ont vraiment cessé que 4 jours plus tard. On the other hand, it is advisable to announce the appearance as of the end of the 2nd injection of intense bone pains justifying the setting under morphine by injectable way. These bone pains eased with narcotics but did not really stop until 4 days later.

b) Suivi de l'étude
Cette étude s'est déroulée avec des examens réguliers et fondamentaux pour apprécier l'efficacité du traitement par l'anticorps monoclonal anti CD 16 chez ce patient à savoir NFS plaquettes à Jo,Jl,(toutes les 3 heures ), J2 (matin et soir), J3 puis chaque jour - Profil Sanguin
Biochimique chaque jour- sous populations lymphocytaires à
Jo, J1, J2, J3 puis 2 à 3 fois par semaine ainsi que l'activité NK à Jo, J1, J3 puis 1 fois par semaine , mesure de 1'ADCC à Jo, J1, J3 puis 1 fois par semaine , dosage de la pharmacocinétique du 3G8 chaque heure pendant 8 heures puis 2 fois par jour, dosage des anticorps anti IgG de souris chaque jour, et prélèvement pour dosage des facteurs de croissance et lymphokines sériques 2 fois par jour, virémie, p24, anti p 24 et immunoglobulines 1 fois par jour; ceci pendant l'hospitalisation elle-même du patient
D'autre part, en ambulatoire, la consultation du patient est réalisée 1 fois par semaine pendant 1 mois puis régulièrement 1 fois par mois pendant toute la durée de l'étude et assortie de ces mêmes examens et prélèvements.b) Study follow-up
This study was carried out with regular and fundamental examinations to assess the effectiveness of the treatment with the anti-CD16 monoclonal antibody in this patient, namely NFS platelets at Jo, Jl, (every 3 hours), D2 (morning and evening), D3 then every day - Sanguine Profile
Biochemical every day - under lymphocyte populations to
Jo, J1, J2, J3 then 2-3 times a week as well as the NK activity at Jo, J1, J3 then once a week, measurement of ADCC at Jo, J1, J3 then once a week, dosage of the pharmacokinetics of 3G8 each hour for 8 hours then 2 times a day, assay of anti mouse IgG antibodies each day, and sampling for assay of growth factors and serum lymphokines 2 times a day, viremia, p24, anti p 24 and immunoglobulins 1 time per day; this during the patient's own hospitalization
On the other hand, as an outpatient, the patient is consulted once a week for 1 month and then regularly once a month for the duration of the study and accompanied by these same examinations and samples.

c) Résultats-observations:
1) données hématologiques ~
I1 a été observé différentes données très significatives : tout d'abord une remontée spectaculaire et toujours durable à ce jour du taux de plaquettes (Fig.l). Celle-ci s'est affirmée dès la première injection de l'anticorps monoclonal 3G8 et ceci à la 22ème heure après injection, ce taux légèrement effondré à la deuxième injection s'est à nouveau élevé après celle-ci , les 3ème et 4ème injections ayant provoqué une remontée spectaculaire et toujours durable . Ceci est d'un intérêt considérable dans la mesure où sont alors écartés tous risques d'hémorragies incontrolâbles toujours graves.c) Results-observations:
1) hematological data ~
I1 was observed various very significant data: first of all a spectacular and still lasting rise to date in the platelet count (Fig.l). This was confirmed at the first injection of the monoclonal antibody 3G8 and this at the 22nd hour after injection, this rate slightly collapsed at the second injection rose again after this one, the 3rd and 4th injections having caused a spectacular and still lasting recovery. This is of considerable interest insofar as all risks of uncontrollable bleeding which are still serious are then ruled out.

De la même façon, la 3ème et 4ème injections de l'anticorps monoclonal et après une stabilisation du taux d'érythroblastes (Fig.2) au cours des 2 premières injec tions, est observée une remontée brusque et spectaculaire du taux d'érythroblastes. Ce taux est resté constant pendant les 18 jours où des prélèvements ont été effectués puis a retrouvé le niveau de base initial au jour 48. In the same way, the 3rd and 4th injections of the monoclonal antibody and after a stabilization of the rate of erythroblasts (Fig. 2) during the first 2 injections, a sudden and spectacular rise in the rate of erythroblasts is observed. This rate remained constant during the 18 days when samples were taken and then returned to the initial base level on day 48.

A la 3ème injection et à partir du jour 10 de la 4ème injection, on a pu observer également une forte re montée du taux de réticulocytes (fig.3). On the 3rd injection and from day 10 of the 4th injection, there was also a sharp rise in the reticulocyte count (fig. 3).

Les myélocytes sont également impliqués dans la ré ponse cellulaire à l'injection de 3G8 (fig.4). Après la première injection, le taux très élevé va chuter au jour 2, de la même façon le taux de myélocytes élevé à nouveau après la 2ème injection chute au jour 4, les 3ème et 4ème injections provoquent une remontée spectaculaire de taux de myélocytes constant pendant 24 heures avant de chuter au jour 9
Les polynucléaires neutrophiles (fig.5) remontent à chaque injection de 3G8 immédiatement après la première injection , 2 jours après la deuxième injection, et dès la troisième et quatrième injections , le taux atteint un maximum qui ne réatteindra le niveau basal que deux jours plus tard.Myelocytes are also involved in the cellular response to the injection of 3G8 (fig. 4). After the first injection, the very high rate will drop on day 2, in the same way the high myelocyte level again after the 2nd injection drops on day 4, the 3rd and 4th injections cause a spectacular rise in constant myelocyte levels during 24 hours before falling on day 9
Polynuclear neutrophils (fig. 5) go back to each 3G8 injection immediately after the first injection, 2 days after the second injection, and from the third and fourth injections, the rate reaches a maximum which will only reach the basal level for two days more late.

Les métamyélocytes (fiv,6) sont augmentés de la même façon après chaque injection de l'anticorps monoclonal rejoignant le niveau initial un jour après la première injection, 2 jours après la deuxième injection et 3 jours après les deux dernières injections
Les taux de monocytes (fig.7) baissent après la première injection avant d'augmenter à J2, la deuxième injection montre un phénomène identique , les troisième et quatrième injections également.Metamyelocytes (fiv, 6) are increased in the same way after each injection of the monoclonal antibody reaching the initial level one day after the first injection, 2 days after the second injection and 3 days after the last two injections
The levels of monocytes (fig. 7) drop after the first injection before increasing on D2, the second injection shows an identical phenomenon, the third and fourth injections also.

Les taux de leucocytes (fig.8) augmentent dès la première injection ainsi que les trois suivantes avec une chute à chacune des injections un jour après la remontée maximale. The leukocyte levels (fig. 8) increase from the first injection as well as the following three with a fall with each injection one day after the maximum rise.

2)Données lymphocytaires
De la même façon et comme pour les données hématologiques , on a pu obtenir à chacune des injections une élé vation très spectaculaire et ensuite toujours durable du taux de lymphocytes totaux (fig.9) et T4 plus particulièrement (CD4+) (fiv.10) Cette observation est d'un grand intérêt puisque l'on sait que les T4 circulants sont directement liés au pronostic des affections liées aux virus HIV. 2) Lymphocyte data
In the same way and as for the hematological data, it was possible to obtain with each of the injections a very spectacular and then always lasting elevation of the total lymphocyte count (fig. 9) and T4 more particularly (CD4 +) (fiv. 10) This observation is of great interest since we know that circulating T4s are directly linked to the prognosis of conditions linked to HIV viruses.

3) Activité NK. 3) NK activity.

L'activité naturelle des cellules NK a été testée comme décrit précédemment par la technique classique de
Chrome - Release.The natural activity of NK cells was tested as described previously by the conventional technique of
Chrome - Release.

On remarque figure Il que la fonction NK est très altérée au début du traitement , ce qui est classique chez ce type de patient HIV , mais s'améliore de manière très significative au cours du traitement , et notamment à partir de la 3ème injection. We note in figure II that the NK function is very altered at the start of treatment, which is classic in this type of HIV patient, but improves very significantly during treatment, and in particular from the third injection.

4) Données concernant la cytotoxicité cellulaire anticorps dépendante .(ADCC). 4) Data concerning antibody dependent cell cytotoxicity (ADCC).

L'activité ADCC a été mesurée par la méthode de
PERUSSIA et al. (J. of Immunology, 1986, 133, n"l, 180-189 ).Cette activité qui était très importante chez ce patient est tombée dès la première injection d'anticorps 3G8 et est restée à un taux faible durant toute la durée de l'étude, comme le montre la figure 11. 5)Pharmacocinétique de l'anticorps 3G8
Le taux de 3G8 dans le sérum du patient a été déter miné au cours du traitement . La pharmacocinétique de cet anticorps est représentée sur la figure 12, qui montre sa disparition progressive.ADCC activity was measured by the method of
PERUSSIA et al. (J. of Immunology, 1986, 133, n "l, 180-189). This activity, which was very important in this patient, fell from the first injection of 3G8 antibodies and remained at a low rate throughout the duration of the study, as shown in Figure 11. 5) Pharmacokinetics of the 3G8 antibody
The level of 3G8 in the patient's serum was determined during treatment. The pharmacokinetics of this antibody is shown in Figure 12, which shows its gradual disappearance.

6) Production et relargage de cytokines sériques.6) Production and release of serum cytokines.

Le dosage des cytokines sériques a été effectué à l'aide de kit immunoenzymatiques commerciaux de type Elisa. The assay of serum cytokines was carried out using commercial immunoenzymatic kits of the Elisa type.

Le taux de facteur de nécrose des tumeurs(TNF) sérique s'élève très rapidement après chaque injection et en particulier lors de la première injection , comme le montre la figure 13. The serum tumor necrosis factor (TNF) rate rises very quickly after each injection and in particular during the first injection, as shown in Figure 13.

De façon similaire on a dosé d'autres cytokines l'interféron gamma (figure 14),le récepteur à l'Interleukine 2 soluble (CD 25 S), (figure 15), l'Interleukine 1 alpha (figure 16),1'Interleukine 2 soluble (figure 17) et le facteur de stimulation de la croissance des macrophages et des granulocytes GM-CSF (figure 18). D'une façon tout à fait si- milaire , la première injection entraîne une augmentation importante du taux de ces diverses cytokines dans le sérum. Similarly, other cytokines were assayed for gamma interferon (Figure 14), the soluble Interleukin 2 receptor (CD 25 S), (Figure 15), Interleukin 1 alpha (Figure 16), 1 ' Soluble interleukin 2 (Figure 17) and the growth stimulating factor of macrophages and GM-CSF granulocytes (Figure 18). Quite similarly, the first injection leads to a significant increase in the level of these various cytokines in the serum.

Cette augmentation se retrouve lors des injections suivantes en fonction des cytokines dosées.This increase is found during the following injections depending on the cytokines dosed.

7) CONCLUSIONS DE L'ETUDE THERAPEUTIQUE
On remarquera tout d'abord que le patient ne s'est pas immunisé contre l'anticorps monoclonal 3G8
Cette étude a permis d'une manière générale de mon trer l'efficacité du traitement par les anticorps 3G8 sur divers facteurs caractéristiques de la maladie HIV
Notamment , on observe que l'injection d'anticorps 3G8 provoque une élévation importante des éléments hématopolétiques chez le patient infecté par le virus HIV et une élévation spectaculaire et durable du taux de lymphocytes et du taux de T4 circulants. Ce résultat est particulièrement intéressant car l'on sait que ces facteurs sont directement liés au diagnostic et au pronostic des affections liées aux virus HIV.7) CONCLUSIONS OF THE THERAPEUTIC STUDY
First, note that the patient did not immunize against the 3G8 monoclonal antibody
This study has generally made it possible to demonstrate the efficacy of treatment with 3G8 antibodies on various factors characteristic of HIV disease.
In particular, it is observed that the injection of 3G8 antibodies causes a significant elevation of the hematopoletic elements in the patient infected with the HIV virus and a spectacular and lasting elevation of the level of lymphocytes and of the level of circulating T4. This result is particularly interesting because we know that these factors are directly linked to the diagnosis and prognosis of conditions linked to HIV viruses.

I1 a d'autre part été observé par une analyse effectuée par un appareil de triage de cellules par fluorescence(FACS ) que l'injection d'anticorps 3G8 induisait une myélimie importante se traduisant par l'apparition de cel lules très immatures
Toutes ces observations sont confirmées sur un autre patient infecté par le virus HIV et traité par l'anticorps monoclonal 3G8.On the other hand, it has been observed by an analysis carried out by a fluorescence cell sorting device (FACS) that the injection of 3G8 antibodies induces a significant myelemia resulting in the appearance of very immature cells.
All these observations are confirmed in another patient infected with the HIV virus and treated with the monoclonal antibody 3G8.

EXEMPLE III
Préparation des anticorps monoclonaux
Les anticorps monoclonaux anti CD 16 solubles humains sont produits après l'immunisation des souris par des séquences peptidiques formées de 15, 12 ou 11 acides aminés
Ces séquences sont choisies par ordinateur à partir du géne du CD16 (Simmons et al.1988 , Nature, 333,568) et sont les suivantes:
Séquence n0l: Proline-Arginine-Tryptophane-Valine-Phényl
alanine-Lysine - Acide Glutamique-Acide
Aspartique - Proline- Isoleucine-Histidine
Leucine- Arginine-Cystéine.EXAMPLE III
Preparation of monoclonal antibodies
Soluble anti-human CD 16 monoclonal antibodies are produced after immunization of mice with peptide sequences formed from 15, 12 or 11 amino acids
These sequences are chosen by computer from the CD16 gene (Simmons et al. 1988, Nature, 333,568) and are as follows:
Sequence # 0: Proline-Arginine-Tryptophan-Valine-Phenyl
Alanine-Lysine - Glutamic Acid-Acid
Aspartic - Proline- Isoleucine-Histidine
Leucine- Arginine-Cysteine.

Séquence n02: Leucine - Glutamine -Aspargine-Glycine
Lysine - Acide Aspartique -Arginine- Lysine
Tyrosine-Phénylalanine- Histidine- Histidine
Asparagine- Sérine - Cystéine.Sequence n02: Leucine - Glutamine -Aspargine-Glycine
Lysine - Aspartic Acid -Arginine- Lysine
Tyrosine-Phenylalanine- Histidine- Histidine
Asparagine- Serine - Cysteine.

Séquence n03: Alanine- Thréonine- Valine- Aspargine
Aspartate- Sérine- Glycine-Glutamate-Tyro
sine-Arginine- Cystéine- glutamine.Sequence n03: Alanine- Thréonine- Valine- Aspargine
Aspartate- Serine- Glycine-Glutamate-Tyro
sine-Arginine- Cysteine- glutamine.

Séquence n04: Valine - Sérine - Thréonine- Isoleucine
Sérine - Sérine- Phénylalanine- Sérine
Proline - Proline- Glycine.Sequence n04: Valine - Serine - Threonine - Isoleucine
Serine - Serine - Phenylalanine - Serine
Proline - Proline- Glycine.

L'immunisation a été effectuée sur plusieurs séries de souris BALB/C femelles de 5 semaines à des doses de 60 microgrammes ,de peptides émulsifiées avec l'adjuvant complet de Freund (volume/volume) à j (O) et 2 autres injections à j 21 et j 36 à la même dose , et ceci par voie intrapéritonéale . Après la dernière injection, la fusion cellulaire est réalisée d'après la méthode dérivée de celle de Kohler et Milstein (1975, Nature, 256, 495) comme suit:Les cellules spléniques des souris immunisées (BALB/C) sont fusionnées avec des cellules de myélome déficient en HGPRT et non sécréteurs d'immunoglobulines (lignée MSl/Ag 4.1)
L'hybridation est réalisée en présence d'agents chimiques tels que le polyéthylène-glycol (PEG à 33%), d'après la méthode de Galfre et al. (Méth. Enzym.l981, 73, 1 ).The immunization was carried out on several series of female BALB / C mice of 5 weeks at doses of 60 micrograms, of peptides emulsified with the complete Freund's adjuvant (volume / volume) at d (O) and 2 other injections at day 21 and day 36 at the same dose, and this intraperitoneally. After the last injection, cell fusion is carried out according to the method derived from that of Kohler and Milstein (1975, Nature, 256, 495) as follows: The spleen cells of immunized mice (BALB / C) are fused with cells of myeloma deficient in HGPRT and not secreting immunoglobulins (line MSl / Ag 4.1)
Hybridization is carried out in the presence of chemical agents such as polyethylene glycol (PEG at 33%), according to the method of Galfre et al. (Meth. Enzym. 1981, 73, 1).

La séparation ou la sélection des hybridomes est effectuée au moyen d'un milieu sélectif RAT composé de 90% de DMEM, 10% de sérum foetal de veau, 1% de pyruvate de sodium , 1% antibiotique, 2,5g/ml d'amphotéricine et 10-4M d'hypoxanthine 4 x 10 7M d'aminophtérine et 1,6 x de thymidine . Ce traitement entraîne la mort des cellules non fusionnées , seules restent vivantes les cellules hybrides (Littlefield et al., Science 1964, 145, 709)
La sélection d'hybridomes sécréteurs d'anticorps
est réalisée par des microdosages par une technique enzy moimmunologique (ELISA), contre le peptide immunisant de la façon suivante : dans une plaque de microtitration en polystyrène rigide Nunc on dépose 100 microlitres de tampon de couplage contenant 1 micro g du peptide imunisant
et on laisse incuber pendant une nuit à 40C .Ensuite la plaque est lavée 5 fois avec du PBS + 0,1% Tween 20.The separation or selection of hybridomas is carried out by means of a selective RAT medium composed of 90% DMEM, 10% fetal calf serum, 1% sodium pyruvate, 1% antibiotic, 2.5 g / ml of amphotericin and 10-4M of hypoxanthine 4 x 10 7M of aminophterine and 1.6 x of thymidine. This treatment results in the death of the non-fused cells, only the hybrid cells remain alive (Littlefield et al., Science 1964, 145, 709)
Selection of antibody-secreting hybridomas
is carried out by microdosing by an enzy-immunological technique (ELISA), against the immunizing peptide in the following manner: in a microtiter plate made of rigid Nunc polystyrene, 100 microliters of coupling buffer are deposited containing 1 micro g of the immunizing peptide
and left to incubate overnight at 40 ° C. Then the plate is washed 5 times with PBS + 0.1% Tween 20.

Après ces lavages, on dépose 100 microlitres du milieu de culture des clônes cultivés et on incube pendant 2 h a température ambiante.After these washes, 100 microliters of the culture medium of the cultured clones are deposited and incubated for 2 h at room temperature.

Après 6 lavages, 100 microlitres d'anticorps antiimmunoglobuline de souris couplé à la peroxydase et produit chez le mouton (deuxième anticorps), diluée au 1/1000ème dans du PBS + 0,01 % Tween 20 sont déposés dans chaque puit et incubés pendant 1 heure à température am brante
Après 6 autres lavages, on ajoute par puits 100 microlitres d'orthophénylène diamine (OPD) diluée à 0,04% dans un tampon phosphate-citrate PH 5,6 et 14 microlitres de péroxyde (H202 à 30%) . La réaction est ensuite
bloquée avec de l'acide sulfurique à 108. La quantité de deuxième anticorps est déterminée à partir de la densité optique dans un lecteur Titertek (Société Flow) à une longueur d'onde de 492 mm.Dans chaque plaque des témoins négatifs constitués du même milieu de culture mais
n'ayant jamais servi à la culture de ces clônes sont présents.After 6 washes, 100 microliters of mouse anti-immunoglobulin antibody coupled to peroxidase and produced in sheep (second antibody), diluted to 1 / 1000th in PBS + 0.01% Tween 20 are deposited in each well and incubated for 1 hour at room temperature
After 6 other washes, 100 microliters of orthophenylene diamine (OPD) diluted to 0.04% in a phosphate-citrate PH 5.6 buffer and 14 microliters of peroxide (H202 at 30%) are added per well. The reaction is then
blocked with sulfuric acid at 108. The amount of second antibody is determined from the optical density in a Titertek reader (Société Flow) at a wavelength of 492 mm. In each plate of negative controls made up of the same culture medium but
never used to grow these clones are present.

Les anticorps obtenus appartiennent aux classes suivantes des immunoglobulines : IgG, IgM et IgA. The antibodies obtained belong to the following classes of immunoglobulins: IgG, IgM and IgA.

Afin d'obtenir un type unique d'anticorps, les hybri
domes sont clonés par la méthode de dilutions limites (Immunology ,Today, 5, 265, Lefkovits et al . 1984). In order to obtain a unique type of antibody, the hybri
domes are cloned by the limit dilution method (Immunology, Today, 5, 265, Lefkovits et al. 1984).

Après le clonage et lorsque les lignées d'hybridomes sont établies, leur prolifération et simultanément la production en masse de leurs anticorps monoclonaux sont réalisées,
a)soit in vitro par culture cellulaire dans un milieu formé de 90% de DMEM (Milieu Modifié de Dulbecco avec 4,2 g de glucose ) (Dulbecco et al.,1959 ,Virology,8,396) + 10t de sérum embryonnaire de veau + 100 unités de pénicilline et 50 micro g de streptomycine par ml de milieu + 2,5 micro g d'amphotéricine par ml de milieu.After cloning and when the hybridoma lines are established, their proliferation and simultaneously the mass production of their monoclonal antibodies are carried out,
a) or in vitro by cell culture in a medium formed of 90% DMEM (Modified Medium from Dulbecco with 4.2 g of glucose) (Dulbecco et al., 1959, Virology, 8.396) + 10 t of embryonic calf serum + 100 units of penicillin and 50 micro g of streptomycin per ml of medium + 2.5 micro g of amphotericin per ml of medium.

L'incubation de ces boîtes est effectuée à 370C dans une atmosphère humide contenant 6% de C02 dans l'air
b) soit in vivo sous forme d'ascites ,d'après la méthode de GOSSE et coll.(1983 ,Hybridomes Perspectives et
Réalités SELF éd. Paris). Dans ce cas 5 x 106 cellules hybrides sont injectées dans le péritoine de souris
BALB/C agées, pré-traitées au pristane . En moyenne 15 jours après l'innoculation , le liquide d'ascite s'étant accumulé,sera prélevé, centrifugé et testé en Elisa.The incubation of these dishes is carried out at 370C in a humid atmosphere containing 6% C02 in the air
b) or in vivo in the form of ascites, according to the method of GOSSE et al. (1983, Hybridomes Perspectives et
SELF realities ed. Paris). In this case 5 x 106 hybrid cells are injected into the peritoneum of mice
BALB / C aged, pretreated with pristane. On average 15 days after the innoculation, the ascites liquid having accumulated, will be sampled, centrifuged and tested in Elisa.

Ces anticorps sont sélectionnés pour leur activité anti CD 16 d'après la méthode Elisa mise au point par
KHAYAT et coll.1987 (J. Immunol. Method, 100,235) et ceci contre le CD 16 recombinant génétique, contre le sérum d'un sujet sain contenant un taux élevé de CD16 soluble et contre du CD 16 soluble purifié sur colonne d'anticorps spécifiques (type 3G8) couplée à du sépharose 4B-C NBR ou purifiée sur colonne de gel de filtration, ainsi que en FACS contre les différentes lignées cellulaires du sang exprimant le CD16 , comme les polynucléaires (UNKELESS, 1988, Ann. Rev. Immunol ,6, 251).These antibodies are selected for their anti-CD 16 activity according to the Elisa method developed by
KHAYAT et al. 1987 (J. Immunol. Method, 100,235) and this against genetic recombinant CD 16, against the serum of a healthy subject containing a high level of soluble CD16 and against soluble CD 16 purified on an antibody column specific (type 3G8) coupled to 4B-C NBR sepharose or purified on a filtration gel column, as well as in FACS against the various blood cell lines expressing CD16, such as polynuclear cells (UNKELESS, 1988, Ann. Rev. Immunol , 6, 251).

La purification de ces anticorps à partir des surnageants ou des ascites est effectuée par précipitation au sulfate d'ammonium à 50% puis dialyse contre du PBS pendant la nuit et par chromatographie d'affinité (EY et coll.l978 - Immunochemistry, 1978, 15, 429) soit sur antigène immobilisé sur supports (type sépharose couplé au peptide immunisant ) ou sur des supports comportant des immunoglobulines anti IgG ou anti IgM de souris selon la classe de l'anticorps considéré. The purification of these antibodies from the supernatants or ascites is carried out by precipitation with 50% ammonium sulphate then dialysis against PBS overnight and by affinity chromatography (EY et al. 1978 - Immunochemistry, 1978, 15 , 429) either on antigen immobilized on supports (sepharose type coupled to the immunizing peptide) or on supports comprising anti IgG or anti mouse IgM immunoglobulins according to the class of the antibody considered.

EXEMPLE IV
Production de CD16 soluble in vitro dans des systèmes
procaryotes et eucaryotes:
10) PRODUCTION DE CD16 SOLUBLE EN CELLULES CHO
Les oligonucléotides xol22 (5-GAATTCAAGCTTCATATGTGGCAGCT -GCTCCTCCCAACT-3') et xol23( 5'-GAATTCGGATCCTTAGTACCC
AGGTGGAGAGAATGATGA-3') ont été synthétisés sur un appareil 8600 (Milligen/Biosearch, Burlington,USA) . Ils ont ensuite été utilisés pour amplifier par PCR (Réaction en chaîne utilisant une polymérase) (SAIKI et al.,1988,Science,239, 487-491) un fragment codant pour la partie extracellulai
re du Fc RIII avec son peptide signal à partir du plasmide pCD16 portant le cDNA du gène complet (SIMMONS & SEED 1988, Nature, 333,568-570) 30 cycles d'amplification ont été réalisés à une température d'élongation de 65"C. EXAMPLE IV
Production of soluble CD16 in vitro in systems
prokaryotes and eukaryotes:
10) PRODUCTION OF SOLUBLE CD16 IN CHO CELLS
The oligonucleotides xol22 (5-GAATTCAAGCTTCATATGTGGCAGCT -GCTCCTCCCAACT-3 ') and xol23 (5'-GAATTCGGATCCTTAGTACCC
AGGTGGAGAGAATGATGA-3 ') were synthesized on an 8600 device (Milligen / Biosearch, Burlington, USA). They were then used to amplify by PCR (Chain reaction using a polymerase) (SAIKI et al., 1988, Science, 239, 487-491) a fragment coding for the extracellular part.
re Fc RIII with its signal peptide from the plasmid pCD16 carrying the cDNA of the complete gene (SIMMONS & SEED 1988, Nature, 333,568-570) 30 amplification cycles were carried out at an elongation temperature of 65 "C.

Après extraction par le chloroforme et précipitation
par l'éthanol,le fragment amplifié a été hydrolysé par les enzymes de restriction BamHI et HindIII et incubé en présence de T4-DNA ligase avec le grand fragment du vecteur pSV2-cat ( Gorman et al. 1982, Mol. Cell. Biol., 2,1044-1051) coupé par les enzymes BgIII et HindIII,puis
transfecté dans la souche E. coli C 600. Les clones recombinants ont été caractérisés par hydrolyse enzymatique et l'un d'entre eux a été sélectionné et préparé sur gradient de césium.After extraction with chloroform and precipitation
with ethanol, the amplified fragment was hydrolyzed by the restriction enzymes BamHI and HindIII and incubated in the presence of T4-DNA ligase with the large fragment of the vector pSV2-cat (Gorman et al. 1982, Mol. Cell. Biol. , 2.1044-1051) cut with the enzymes BgIII and HindIII, then
transfected into the E. coli C 600 strain. The recombinant clones were characterized by enzymatic hydrolysis and one of them was selected and prepared on a cesium gradient.

L'ADN du plasmide recombinant obtenu (pXL 1603) a été
contrôlé par séquençage puis introduit par cotransfection avec le vecteur pSV2-dhfr (Subramani et al.1981, Mol.The DNA of the recombinant plasmid obtained (pXL 1603) was
controlled by sequencing then introduced by cotransfection with the vector pSV2-dhfr (Subramani et al. 1981, Mol.

Cell. Biol, 1. 854-864 )dans des cellules CHOdhfr. Cell. Biol, 1.854-864) in CHOdhfr cells.

(URLAUB et al.1980,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)77,4216).Les cellules recombinantes ont été sélectionnées par culture
en milieu DMEM sans hypoxanthine ni thymidine puis amplifiées en présence de quantités croissantes de méthotrexa te (jusqu'à 25 micro M).Le milieu conditionné par les clones recombinants a été concentré 10 fois après précipitation au sulfate d'ammonium puis dosé par ELISA sandwich selon la méthode décrite de la demande WO 88/06.733 et un clone (P 2.4 ) a été sélectionné comme indiqué sur la figure 19 qui montre la relation entre la densité optique des échantillons, déterminée en ELISA et la dilution du milieu de culture des cellules 20)PRODUCTION DE CD16 SOLUBLE DANS ESCHERICHIA COLI
Les oligonucléotides xol23 (cf. paragraphe précédent et xol24 (5' -AAGCTTGAATTCATATGCGGACTGAAGATCTCCCAAAGG-3') ont été synthétisés sur un appareil 8600 (Milligen/Biosearch,
Burlington, USA). Ils ont ensuite été utilisés pour amplifier par PCR un fragment codant pour la partie extracellulaire mature du Fc RIII ,sans son peptide signal, à partir du plasmide pCD16 portant le cDNA complet du gène d'un
Fc RIII membranaire . 30 cycles d'amplification ont été réalisés à une température d'élongation de 620C.(URLAUB et al. 1980, Proc.Natl.Acad.Sci. (USA) 77,4216) The recombinant cells were selected by culture
in DMEM medium without hypoxanthine or thymidine then amplified in the presence of increasing amounts of methotrexa te (up to 25 micro M). The medium conditioned by the recombinant clones was concentrated 10 times after precipitation with ammonium sulphate and then assayed by sandwich ELISA according to the method described in application WO 88 / 06.733 and a clone (P 2.4) was selected as indicated in FIG. 19 which shows the relationship between the optical density of the samples, determined by ELISA and the dilution of the cell culture medium 20) PRODUCTION OF SOLUBLE CD16 IN ESCHERICHIA COLI
The oligonucleotides xol23 (cf. previous paragraph and xol24 (5 '-AAGCTTGAATTCATATGCGGACTGAAGATCTCCCAAAGG-3') were synthesized on an 8600 device (Milligen / Biosearch,
Burlington, USA). They were then used to amplify by PCR a fragment coding for the mature extracellular part of Fc RIII, without its signal peptide, from the plasmid pCD16 carrying the complete cDNA of the gene for
Fc RIII membrane. 30 amplification cycles were carried out at an elongation temperature of 620C.

Après extraction par le chloroforme et précipitation par l'éthanol, le fragment amplifié a été hydrolysé par l'enzyme de restriction BamHI et incubé en présence de
T4-DNA ligase et du vecteur M13mpl8 (Pharmacia,
Suède)linéarisé par l'enzyme EcoRI (Biolabs, USA) puis introduit par transfection dans la souche E. coli TG1. Les clones recombinants ont été caractérisés par hydrolyse enzymatique et l'un d'entre eux a été sélectionné et préparé sur gradient de césium.L'ADN du M13 recombinant été hydrolysé par les enzymes de restriction Ndel Pvul et BamHI, et le fragment de restriction de 608 pb a été préparé par électroélution . Ce fragment portant le gène codant pour la partie extracellulaire du CD16 a été cloné entre les sites NdeI et BamHI du vecteur d'expression pET3a (Rosenberg et al.1987,Gène ,56,125-135) et transfecté dans E. coli
C600. Les plasmides recombinants ont été caractérisés par hydrolyse enzymatique, l'un d'entre eux (pXL1790) a été choisi et introduit par transformation dans les souches
E.coli BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS et BL21(DE3)pLysE. Les clones recombinants ont été sélectionnés en présence d'ampicilline et de chloramphénicol (pour pLysS et pLysE).After extraction with chloroform and precipitation with ethanol, the amplified fragment was hydrolyzed with the restriction enzyme BamHI and incubated in the presence of
T4-DNA ligase and the vector M13mpl8 (Pharmacia,
Sweden) linearized with the enzyme EcoRI (Biolabs, USA) then introduced by transfection into the strain E. coli TG1. The recombinant clones were characterized by enzymatic hydrolysis and one of them was selected and prepared on a cesium gradient. The recombinant M13 DNA was hydrolyzed by the restriction enzymes Ndel Pvul and BamHI, and the restriction fragment of 608 bp was prepared by electroelution. This fragment carrying the gene coding for the extracellular part of CD16 was cloned between the NdeI and BamHI sites of the expression vector pET3a (Rosenberg et al. 1987, Gene, 56, 125-135) and transfected into E. coli
C600. The recombinant plasmids were characterized by enzymatic hydrolysis, one of them (pXL1790) was chosen and introduced by transformation into the strains
E.coli BL21 (DE3), BL21 (DE3) pLysS and BL21 (DE3) pLysE. The recombinant clones were selected in the presence of ampicillin and chloramphenicol (for pLysS and pLysE).

Un clone recombinant a été choisi dans chaque cas et a servi à inoculer 10 ml de milieu LB qui a été incubé une nuit à 37"C. 600 microlitres de chaque inoculum ont servi à ensemencer o0 ml de milieu LB frais contenant 100 micro g/ml d'ampicilline et 50 micro g/ml de chloramphénicol. Ces cultures ont été incubées à 37"C avec agitation (200 rpm) jusqu'à une densité optique de 1 à 650 nm. Chaque culture a été divisée en deux et lmM IPTG ont été rajoutés à l'une, puis les cultures ont été agitées 3 heures de plus à 370C. A recombinant clone was chosen in each case and served to inoculate 10 ml of LB medium which was incubated overnight at 37 ° C. 600 microliters of each inoculum were used to inoculate o0 ml of fresh LB medium containing 100 micro g / ml of ampicillin and 50 micro g / ml of chloramphenicol. These cultures were incubated at 37 ° C. with shaking (200 rpm) to an optical density of 1 to 650 nm. Each culture was divided into two and 1 mM IPTG were added to one, then the cultures were shaken an additional 3 hours at 370C.

En fin d'induction, les bactéries ont été récoltées par centrifugation et les culots ont été repris dans 15 ml de tampon de lyse (Tris 50mM pH8 , DTT lmM , EDTA lmM,TritonX-100 0,1%),congelés puis lysés par sonication.At the end of induction, the bacteria were harvested by centrifugation and the pellets were taken up in 15 ml of lysis buffer (Tris 50mM pH8, lmM DTT, lmM EDTA, 0.1% TritonX-100), frozen and then lysed by sonication.

1,5 ml d'extrait cellulaire ainsi préparé des différentes souches ont été centrifugés 5 min. à 10.000 g et le culot a été soumis à une electrophorèse SDS-PAGE sur gel de polyacrylamide à 12,5 % . La figure 19 montre les profils d'élution des protéines des différentes souches, les puits 1 et 8 correspondant aux marqueurs de poids moléculaire les puits 2 et 3 à la souche BL 21 DE 3 non induite (puits 2) ou induite (puits 3); les puits 4 et 5 à la souche BL 21 pLys S non induite (puits 4) ou induite (puits 5) ,les puits 6 et 7 correspondants à la souche BL21pLysE non induite (puits 6) ou induite (puits 7). 1.5 ml of cell extract thus prepared from the different strains were centrifuged for 5 min. at 10,000 g and the pellet was subjected to SDS-PAGE electrophoresis on 12.5% polyacrylamide gel. FIG. 19 shows the elution profiles of the proteins of the different strains, wells 1 and 8 corresponding to the molecular weight markers wells 2 and 3 to the BL 21 DE 3 strain not induced (well 2) or induced (well 3) ; wells 4 and 5 to the BL 21 pLys S strain not induced (well 4) or induced (well 5), wells 6 and 7 corresponding to the BL21pLysE strain not induced (well 6) or induced (well 7).

Claims

CLAIMS 1. Proteins at least partially preventing the interaction between the Fc fragment of an immunoglobulin G and its membrane-type or soluble receptor, excluding the Fc gamma I and II receptors.

2.Protein according to claim 1, characterized in that it has a sequence community with the receptor for the Fc fragment of immunoglobulins G.

3.Protel according to one of claims 1 or 2, characterized in that said receptor is the Fc gamma III receptor carrying the CD 16 antigen.

4.Protein according to any one of claims 1 to 3, characterized in that it consists of a fragment of the CD 16 protein.

5.Protein or protein fragment according to any of the claims 1 to 4, obtained by genetic recombination

6. Protein or protein fragment according to claim 5 obtained by expression of a genetically recombined vector in Escherichia Coli cells.

7.Protein or protein fragment according to claim 5 obtained by expression of a genetically recombinant vector in eukaryotic cells, and in particular in the hamster cell line CHO.

8.Protein according to claim 1, characterized in that it is an antibody having a specific immunological activity directed against a fragment of the protein

CD16 or an anti-idiotype antibody raised against an antiCD16 antibody.

9. Antibody according to claim 8, characterized in that it is directed against the fragment of the CD16 protein having the following amino acid sequence or a part of this sequence

NH2-PRO-ARG-TRP-VAL-PHE-LYS -GLU-GLU-ASP-PRO-ILE-HIS-LEU ARG-CYS-CO2H.

10. An antibody according to claim 8, characterized in that it is directed against the fragment of the CD16 protein having the following amino acid sequence or a part of this sequence

NH2-LEU-GLN-ASN-GLY-LYS-ASP-ARG-LYS-TYR-PHE-HIS-HIS-ASN-SER -CYS-CO2H.

11.An antibody according to claim 8, characterized in that it is directed against the fragment of the CD16 protein having the following amino acid sequence or a part of this sequence NH2-ALA-THR-VAL-ASN-ASP-SER -GLY-GLU-TYR-ARG-CYS-GLU-CO2H.

12. Antibody according to claim 8, characterized in that it is directed against the fragment of the CD16 protein having the following amino acid sequence or a part of this sequence NE2-VAL-SER-THR-ISO-SER-SER -PHE-SER-PRO-PRO-GLY-C02H.

13.Protein or protein fragment according to any one of claims 1 to 12, including an antibody or antibody fragment at least partially inhibiting the formation of rosettes between human neutrophils and red cells of sheep opsonized by immunoglobulins

G red sheep anti-globules.

14. Antibody or antibody fragment according to any one of claims 8 to 12, stimulating the synthesis and optionally the recycling of cytokine (s) and / or growth factor (s) by NK cells in culture, in particular of TNF.

15. A protein or protein fragment, including an antibody or antibody fragment according to any one of claims 1 to 12, at least partially inhibiting antibody-dependent cell cytotoxicity.

16. A medicament containing at least one protein or protein fragment according to any one of claims 1 to 15.

17. The medicament according to claim 16 for the treatment of affections linked to HIV viruses, and in particular of AIDS, myelodisplasia and / or autoimmune affections.

18. Pharmaceutical composition characterized in that it contains an effective amount of at least one protein according to any one of claims 1 to 15 in combination with one or more compatible and pharmaceutically acceptable diluents or adjuvants.

9. Composition according to Claim 18, characterized in that it is intended for the treatment of affections linked to HIV viruses, in particular AIDS, myelodisplasia and autoimmune conditions.

20.Composition according to one of claims 18 or 19 presented for parenteral or enteral administration.

21. Use of the proteins or protein fragments according to any one of claims 1 to 15 for the treatment of conditions linked to HIV viruses, in particular AIDS, myelodisplasia and autoimmune conditions

22. Use of proteins or protein fragments at least partially preventing the interaction between the Fc fragment of an immunoglobulin G and its membrane or soluble receptor, excluding the Fc gamma receptors

I and II, for the manufacture of a medicament for the treatment of conditions linked to HIV viruses, and in particular of

AIDS, myelodisplasia and autoimmune conditions

23. Use according to claim 22 of proteins and protein fragments having a sequence community with the receptor for the Fc fragment of immunoglobulins G, for the manufacture of a medicament for the treatment of conditions linked to HIV viruses, in particular of the AIDS, myelodisplasia and autoimmune conditions.

24. Use of a monoclonal antibody, at least partially preventing the interaction between the Fc fragment of an immunoglobulin G and its membrane or soluble receptor, excluding the Fc gamma I and II receptors, for the manufacture of a medicament for the treatment of conditions linked to HIV viruses, in particular AIDS, myelodisplasia and autoimmune conditions.

25. Use according to any one of claims 22 to 24 of a protein, or protein fragment, including an antibody or antibody fragment at least partially inhibiting the formation of rosettes between human phile neutrol and red blood cells sheep opsonized with sheep anti-red blood cell immunoglobulin G.

26. Use according to any one of claims 22 and 24 of an antibody or antibody fragment stimulating the synthesis and optionally the release of cytokine (s) and / or growth factor (s) and in particular TNF by NK cells in culture

27. Use according to any one of claims 22 to 24 of a protein or protein fragment, including an antibody or antibody fragment at least partially inhibiting cell cytotoxicity, antibody-dependent.

28. Use according to any one of claims 24 to 27 of an anti-CD 16 antibody.

29. Use according to any one of claims 24 to 28 of the monoclonal antibody 3G8.

30.Use according to any one of claims 22 to 29 for the manufacture of a medicament for parenteral or enteral treatment.