FR2651505A1 - Nucleic acid fragments derived from a genome of an appropriate mycobacterium, their applications in the diagnosis of infections caused by mycobacteria and plasmids containing the said fragments - Google Patents
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Abstract
Description
La présente invention est relative à des fragments d'acides nucléiques, dérives d'un génome de mycobactérie appropriée, notamment de Mycobacterium tuberculosis, à leurs applications dans le diagnostic des infections à mycobactéries, ainsi qu'à des plasmides contenant lesdits fragments. The present invention relates to nucleic acid fragments, derived from an appropriate mycobacterium genome, in particular from Mycobacterium tuberculosis, to their applications in the diagnosis of mycobacterial infections, as well as to plasmids containing said fragments.
Les mycobactéries correspondent au genre Mycobacterium qui comprend au moins 54 espèces différentes. Mycobacteria correspond to the genus Mycobacterium which includes at least 54 different species.
Parmi celles-ci environ 10 sont pathogènes ou opportunistes pour l'homme ou l'animal. Deux d'entre-elles, M. tuberculosis et M. leprae sont respectivement les agents de la tuberculose et de la lèpre. Of these, about 10 are pathogenic or opportunistic for humans or animals. Two of them, M. tuberculosis and M. leprae are the agents of tuberculosis and leprosy respectively.
Lu est connu que ces deux maladies représentent un problème majeur de Santé Publique; en effet, il existe actuellement entre 15 et 60 millions d'individus atteints de tuberculose dans le Monde et 2 à 3 millions de personnes meurent chaque année à cause de cette infection. Dans les pays développés, M. tuberculosis est la cause la plus commune des infections mycobactériennes. En France, il apparaît environ 104 nouveaux cas de tuberculose par an. La vaccination par le BCG (Bacille de
Calmette et Guérit, une souche atténuée de M. bovis) est loin d'être efficace au sein de toutes les populations. Cette efficacité varie environ de 80 % dans les pays occidentaux comme l'Angleterre à 0 % en Inde (résultats du dernier essai de vaccination à
Chingleput).De plus, l'apparition de souches de M. tuberculosîs résistantes aux antituberculeux usuels et l'existence d'une corrélation entre tuberculose et SIDA ajoute à l'urgence de mettre au point une méthode rapide de détection et d'identification des mycobactéries.It is known that these two diseases represent a major public health problem; in fact, there are currently between 15 and 60 million people with tuberculosis worldwide and 2 to 3 million people die each year from this infection. In developed countries, M. tuberculosis is the most common cause of mycobacterial infections. In France, there are approximately 104 new cases of tuberculosis per year. BCG vaccination (Bacillus
Calmette et Guérit, an attenuated strain of M. bovis) is far from being effective in all populations. This effectiveness varies from around 80% in Western countries such as England to 0% in India (results of the last vaccination trial at
In addition, the emergence of M. tuberculosis strains resistant to the usual anti-tuberculosis drugs and the existence of a correlation between tuberculosis and AIDS adds to the urgency of developing a rapid method for the detection and identification of mycobacteria.
Par exemple, une étude épidémiologique réalisée en Floride a montré que 10 % des malades atteints de SIDA sont atteints de tuberculose au moment du diagnostic du SIDA ou 18 mois avant celui-ci. Chez ces malades, la tuberculose apparaît dans 60 % des cas sous une forme disséminée donc non répérable par les critères de diagnostic classiques comme Ia radiographie pulmonaire ou l'analyse de crachats. For example, an epidemiological study carried out in Florida has shown that 10% of AIDS patients have tuberculosis when they are diagnosed with AIDS or 18 months before it is diagnosed. In these patients, tuberculosis appears in 60% of the cases in a disseminated form, therefore not identifiable by conventional diagnostic criteria such as chest radiography or sputum analysis.
Enfin, le diagnostic de la tuberculose et des autres mycobactérioses apparentées est difficile à réaliser pour différentes raisons : les maladies pulmonaires causées par différentes mycobactéries ne peuvent pas être distinguées cliniquement, radiologiquement ou histologiquement; les mycobactéries sont souvent présentes en faible quantité et lorsqu'elles sont en quantité détectable par les méthodes classiquement utilisées, la maladie est déjà en évolution et les malades sont contagieux pour leur entourage ; de plus, en raison du temps de génération très long de ces bactéries (24 h pour M. tuberculosis comparé à 20 min pour E. coli), la culture de- ces organismes est difficile. Ainsi faut-il 6 à 8 semaines pour identifier les germes et davan tage pour obtenir un antibiogramme utilisable pour le traitement adéquat des malades. Finally, the diagnosis of tuberculosis and other related mycobacteriosis is difficult to make for various reasons: pulmonary diseases caused by different mycobacteria cannot be distinguished clinically, radiologically or histologically; mycobacteria are often present in small quantities and when they are in quantities detectable by the conventionally used methods, the disease is already in progress and the patients are contagious to those around them; moreover, because of the very long generation time of these bacteria (24 h for M. tuberculosis compared to 20 min for E. coli), the culture of these organisms is difficult. Thus it takes 6 to 8 weeks to identify germs and more to obtain an antibiogram usable for the adequate treatment of patients.
La nécessité d'un test de détection n'exigeant pas de culture des germes et directement utilisable avec les échantillons pathologiques, même lorsque les germes y sont présents à de faibles concentrations, est donc indispensable.The need for a detection test which does not require a culture of the germs and which can be directly used with pathological samples, even when the germs are present at low concentrations therein, is therefore essential.
Plusieurs techniques sont actuellement utilisées en clinique, pour identifier une infection mycobactérienne. Several techniques are currently used in the clinic to identify a mycobacterial infection.
I1 faut tout d'abord citer la détection directe des microorganismes au microscope; cette technique est rapide, mais ne permet pas l'identification de l'espèce mycobactérienne observée et manque de sensibilité dans la mesure où un grand nombre de microerganlsmes doit être présent dans l'échantillon ( > 104/ml) pour permettre une détection fiable (BATES J., CHEST, 1979, 76, (suppL), 757-763). We must first of all cite the direct detection of microorganisms under the microscope; this technique is rapid, but does not allow the identification of the mycobacterial species observed and lacks sensitivity insofar as a large number of microerganlsmes must be present in the sample (> 104 / ml) to allow reliable detection ( BATES J., CHEST, 1979, 76, (suppL), 757-763).
Les cultures, lorsqu'elles sont positives, ont une spécificité approchant 100 % et permettent l'identification de l'espèce mycobactérienne isolée; néanmoins, comme précisé ci-dessus, la croissance des mycobactéries in vitro ne peut être réalisée qu'en 3 à 6 semaines et lorsque peu de mycobactéries sont présentes au site de l'infection, des cultures répétées sont nécessaires pour s'assurer d'un résultat positif (BATES J., 1979 et BATES J. et al., Am. Rev. Respir. Dis., 1986, 134,415417). The cultures, when positive, have a specificity approaching 100% and allow the identification of the isolated mycobacterial species; however, as noted above, growth of mycobacteria in vitro can only be achieved in 3 to 6 weeks and when few mycobacteria are present at the site of infection, repeated cultures are required to ensure a positive result (BATES J., 1979 and BATES J. et al., Am. Rev. Respir. Dis., 1986, 134,415417).
Les techniques sérologiques peuvent s'avérer utiles dans certaines conditions, mais leur utilisation est limitée par leur sensibilité et/ou leur spécificité faibles 0)PANEL T.M. et al., Am. Rev. Respir. Dis., 1987, 135, 1137-1151). Serological techniques may prove useful in certain conditions, but their use is limited by their low sensitivity and / or specificity 0) PANEL T.M. et al., Am. Rev. Breathe. Dis., 1987, 135, 1137-1151).
La présence ou l'absence de mycobactéries peut également être déterminée par hybridation avec de 1'ADN ou de L'ART en utilisant des sondes spécifiques des séquences d'ADN (KIEHN TE. et al., J. Clin Microbiol., 1987, 25, 15511552 ; ROBERTS M.C. et al., J. Clin. Microbiol., 1987, 25, 1239-1243; DRAKE T.A. et al., J. Clin. Microbiol., 1987, 25, 1442-1445). Cependant, ces méthodes reposent sur le polymorphisme des séquences-nucléotidiques des fragments utilisés ou sur le polymorphisme des régions avoisinantes et nécessitent également la culture des microorganismes. The presence or absence of mycobacteria can also be determined by hybridization with DNA or ART using probes specific for DNA sequences (KIEHN TE. Et al., J. Clin Microbiol., 1987, 25, 15511552; ROBERTS MC et al., J. Clin. Microbiol., 1987, 25, 1239-1243; DRAKE TA et al., J. Clin. Microbiol., 1987, 25, 1442-1445). However, these methods are based on the polymorphism of the nucleotide sequences of the fragments used or on the polymorphism of the surrounding regions and also require the culture of the microorganisms.
Certaines séquences d'ADN de différentes mycobactéries et notamment certains gènes codant pour des antigènes mycobactériens ont été décrits. On peut citer notamment la Demande Internationale PCT WO 88/00974, qui a pour Inventeur
YOUNG R. et dont le contenu est repris dans un article paru dans Nature, 1985, 316, 450 ; ces publications décrivent les gènes codant pour cinq antigènes de M. leprae immunodominants et en particulier le gène codant pour l'antigène de 65 kDA a été séquencé. On peut également citer la Demande Internationale PCT WO 88/05823, qui a pour Co-Inventeurs IRIS SON R., YOUNG R. et SHINNICK T. et dont le contenu est repris dans l'article paru dans J.Bact., 1987, 169, 1081088 et qui décrit les gènes de M. tuberculosis codant pour des antigènes protéiques et notamment pour l'antigène de 65 kDa. Cette Demande Internationale précise, en particulier, que les antigènes de
M. tuberculosis codant pour cinq protéines immunologiquement actives ont été isolés par un criblage systématique d'une banque d'ADN recombinant exprimée dans un bactériophage lambda gtll, avec une collection d'anticorps monoclonaux dirigés contre les antigènes protéiques de cette bactérie. L'un des antigènes de M. tuberculosis, une protéine 65 kDa présente des déterminants communs à M. tuberculosis et M.Certain DNA sequences from different mycobacteria and in particular certain genes coding for mycobacterial antigens have been described. Mention may in particular be made of PCT International Application WO 88/00974, which has as Inventor
YOUNG R. and whose content is reproduced in an article published in Nature, 1985, 316, 450; these publications describe the genes coding for five immunodominant M. leprae antigens and in particular the gene coding for the 65 kDA antigen has been sequenced. We can also cite the PCT International Application WO 88/05823, which has IRIS SON R., YOUNG R. and SHINNICK T. as Co-Inventors, and the content of which is reproduced in the article published in J. Bact., 1987, 169, 1081088 and which describes the genes of M. tuberculosis coding for protein antigens and in particular for the 65 kDa antigen. This International Application specifies, in particular, that the antigens of
M. tuberculosis coding for five immunologically active proteins were isolated by systematic screening of a recombinant DNA library expressed in a bacteriophage lambda gtll, with a collection of monoclonal antibodies directed against the protein antigens of this bacterium. One of the antigens of M. tuberculosis, a 65 kDa protein has determinants common to M. tuberculosis and M.
leprae.leprae.
La Demande Internationale PCT WO 88/06591, qui a notamment pour Co-Inventeur T. SHINNICK, décnt une protéine recombinante de 540 acides aminés (protéine de 65 kDa) ainsi que la séquence d'ADN et les vecteurs d'expression de ladite protéine, ainsi que les applications de ladite protéine recombinée. Cette
Demande décrit également des peptides correspondant à des séquences de cette protéine et leurs applications.PCT International Application WO 88/06591, which has, in particular, for Co-Inventor T. SHINNICK, a recombinant protein of 540 amino acids (65 kDa protein) as well as the DNA sequence and the expression vectors of said protein , as well as the applications of said recombinant protein. This
Application also describes peptides corresponding to sequences of this protein and their applications.
Les gènes codant pour les protéines d'autres mycobactéries (M. afri- canum, M. smegmatîs, M. bovis BCG et M. aviurn) ont également été isolés. On peut citer notamment THOLE et al. infect. Immunol., 1987, 55, 1466-1475), qui ont décrit une protéine de 64 kDa de M. bovis BCG exprimée dans E. coli. The genes coding for the proteins of other mycobacteria (M. africanum, M. smegmatîs, M. bovis BCG and M. aviurn) have also been isolated. Mention may in particular be made of THOLE et al. infectious Immunol., 1987, 55, 1466-1475), who described a 64 kDa protein from M. bovis BCG expressed in E. coli.
Cependant, les quantités d'ADN mycobactérien présentes dans la plupart des échantillons biologiques sont insuffisantes pour donner un signal positif; cette technique s'est donc révélée inadaptée à l'identification d'ADN mycobactérien extrait directement d'échantillons biologiques ; en effet, les sondes utilisées sont constituées d'ADN, d'ARN ribosomique ou de fragments d'ADN mycobactériens non caractérisés et provenant de banque de gènes. However, the amounts of mycobacterial DNA present in most biological samples are insufficient to give a positive signal; this technique has therefore proved unsuitable for the identification of mycobacterial DNA extracted directly from biological samples; in fact, the probes used consist of DNA, ribosomal RNA or uncharacterized mycobacterial DNA fragments and coming from gene banks.
Un certain nombre d'études ont également montré une certaine homologie de structure entre les différentes mycobactéries. Cependant, des différences dans la séquence d'ADN de M. tuberculosis et M. bovis ont été décrites dans la région 3' du cadre ouvert de lecture de l'antigène 65 kDa (SHINNICK et al., 1987,
THOLE et al., 1987), mais une région homologue n'a pas été observée dans l'ADN de
M. leprae (MEHRA et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1986, 83, 7013-7017, également PCT 88/000974). A number of studies have also shown a certain structural homology between the different mycobacteria. However, differences in the DNA sequence of M. tuberculosis and M. bovis have been described in the 3 'region of the open reading frame of the 65 kDa antigen (SHINNICK et al., 1987,
THOLE et al., 1987), but a homologous region was not observed in the DNA of
M. leprae (MEHRA et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1986, 83, 7013-7017, also PCT 88/000974).
ll existe également des publications qui ont mis en évidence l'existence de séquences répétées chez les mycobactéries ; on peut citer en particulier l'article au -nom de KD. EISENACH et al (J. Clin. Microbiol., 1988, X, 11, 22402245) qui décrit trois segments clonés d'ADN de M. tubercuiosis, qui ont été identi fiés par hybridation sélective avec de l'ADN de M. bovis.Ces trois segments recombinants, dénommés respectivement M13KE37 (790 paires de bases), M13KE49 (570 paires de bases) et M13KE115 (environ 1600 paires de bases) sont obtenus par clone nage dans le bactériophage M13 de fragments d'ADN de M. aiberculosis. Toutefois, la séquence nucléotidique des segments correspondants n'est pas connue. There are also publications which have demonstrated the existence of repeated sequences in mycobacteria; one can quote in particular the article with the name of KD. EISENACH et al (J. Clin. Microbiol., 1988, X, 11, 22402245) which describes three cloned segments of M. tubercuiosis DNA, which have been identified by selective hybridization with M. bovis DNA. These three recombinant segments, respectively named M13KE37 (790 base pairs), M13KE49 (570 base pairs) and M13KE115 (approximately 1600 base pairs) are obtained by clone swimming in the bacteriophage M13 of DNA fragments of M. aiberculosis. However, the nucleotide sequence of the corresponding segments is not known.
On peut également citer l'article de D.M. COLLINS et al. (FEMS
Microbiol. Letters, 1989, 60, 175-178), qui décrit l'identification d'une séquence d'ADN répétitive spécifique de M. paratuberculosis. We can also cite the article by DM COLLINS et al. (WOMEN
Microbiol. Letters, 1989, 60, 175-178), which describes the identification of a repetitive DNA sequence specific for M. paratuberculosis.
Les références complémentaires suivantes constituent également l'état de l'Art préalable à la présente invention
BAESS L, Acta Path. Microbiol. Scand, 1979, 87, 221-226
BEAUCAGE S.L. et al., Tetrahedron Lett., 1981,22, 1859-1862 ; EISENACH KD. The following additional references also constitute the state of the art prior to the present invention.
BAESS L, Acta Path. Microbiol. Scand, 1979, 87, 221-226
BEAUCAGE SL et al., Tetrahedron Lett., 1981,22, 1859-1862; EISENACH KD.
et al., Am. Rev. Respir. Dis., 1986, 133, 1065-1068; GHEORGH1U M. et al., J. BioI.et al., Am. Rev. Breathe. Dis., 1986, 133, 1065-1068; GHEORGH1U M. et al., J. BioI.
Standardization, 1988, 16, 15-26 ; GLASSROTH J. et al., N. Engi. J. Med., 1980, 302, 1441-1450 ; HAWKINS C.C. et al., Aun. Intern. Med, 1985, 105, 184-188 IMEDA T., Int. J. Systematic BacterioL, 1985, 35, 147-150; IMAEDA T. et al., Int.Standardization, 1988, 16, 15-26; GLASSROTH J. et al., N. Engi. J. Med., 1980, 302, 1441-1450; HAWKINS C.C. et al., Aun. Intern. Med, 1985, 105, 184-188 IMEDA T., Int. J. Systematic BacterioL, 1985, 35, 147-150; IMAEDA T. et al., Int.
J. Systematic Bacteriol., 1988, 38, 151-156; KOGAN S.C. et al., N. Engl. J. Med., 1987,317,985-990 ; LI IL et al., Nature (Lond.), 1988,335,414417 ; LU M.C. et al.,
Infect. Immun., 1987, 55, 2378-2382 ; MANIATIS T. et al., 1982, Cold Spring
Harbor, New York; McFADDEN J.J. et al., Mol. Microbiol., 1987, 1,283-291; PAO
C.C. et al., Tubercle, 1988,69,27-36 ; PATEL R, J. Gen. Microbiol., 1986, 132, 541- 551; SAIKI R.K. et al., Science, 1988, 239, 487-491; SANGER F. et al., Proc. Natl. J. Systematic Bacteriol., 1988, 38, 151-156; KOGAN SC et al., N. Engl. J. Med., 1987,317,985-990; LI IL et al., Nature (Lond.), 1988,335,414417; LU MC et al.,
Infect. Immun., 1987, 55, 2378-2382; MANIATIS T. et al., 1982, Cold Spring
Harbor, New York; McFADDEN JJ et al., Mol. Microbiol., 1987, 1,283-291; PAO
CC et al., Tubercle, 1988,69,27-36; PATEL R, J. Gen. Microbiol., 1986, 132, 541-551; SAIKI RK et al., Science, 1988, 239, 487-491; SANGER F. et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 1977, 74, 5463-5467 ; SMIDA J. et al., Int. J. Leprosy, 1988, 56, 449-454; THEIN St. et al., in Human Genetic Diseases, 1986, IRL Press, 33-50;
THOLE J.E.R. et al., Infect. Immun., 1985, 50, 800-806; WATSON E.A., Canad. J.Acad. Sci. USA, 1977, 74, 5463-5467; SMIDA J. et al., Int. J. Leprosy, 1988, 56, 449-454; THEIN St. et al., In Human Genetic Diseases, 1986, IRL Press, 33-50;
THOLE JER et al., Infect. Immun., 1985, 50, 800-806; WATSON EA, Canad. J.
Pub. Health, 1935, 26, 268-275; WOLINSKY E., Am. Rev. Respir. Dis, 1979, 119, 107-159.Pub. Health, 1935, 26, 268-275; WOLINSKY E., Am. Rev. Breathe. Dis, 1979, 119, 107-159.
Récemment un procédé de détection de faibles quantités de myco bactéries par amplification et hybridation directement sur des échantillons biologiques a été mis au point; ledit procédé utilise le polymorphisme des séquences nucléotidiques d'un fragment de gène commun à toutes les mycobactéries, et notamment un fragment du gène codant pour la protéine 65 kD (Demande de Brevet français n0 89 05057). Recently a method for detecting small amounts of myco bacteria by amplification and hybridization directly on biological samples has been developed; said method uses the polymorphism of the nucleotide sequences of a gene fragment common to all mycobacteria, and in particular a fragment of the gene coding for the 65 kD protein (French Patent Application No. 89,05057).
Poursuivant les travaux sur les mycobactéries dans cette voie, les
Inventeurs ont mis au point un procédé de détection spécifique et encore plus rapide car permettant d'identifier dans un échantillon biologique une mycobactérie d'un groupe donné en moins de 24 heures.Continuing work on mycobacteria along this path,
The inventors have developed a specific and even faster detection method since it makes it possible to identify in a biological sample a mycobacterium from a given group in less than 24 hours.
La présente invention s'est, en conséquence, donné pour but de pourvoir à un procédé de détection et/ou d'identification spécifique d'au moins un groupe de mycobactéries, notamment spécifique du groupe du bacille de la tuberculose permettant de détecter de faibles quantités d'ADN extrait des germes eux-mêmes en nombre restreint et de révéler la présence des mycobactéries du/des groupes à détecter directement dans les échantillons pathologiques. The present invention therefore has as its object to provide a method of detection and / or specific identification of at least one group of mycobacteria, in particular specific of the group of the bacillus of tuberculosis making it possible to detect weak quantities of DNA extracted from the germs themselves in a limited number and reveal the presence of the mycobacteria of the group (s) to be detected directly in the pathological samples.
C'est également un but de l'invention de pourvoir à des réactifs de diagnostic spécifiques de groupe de mycobactéries et notamment du groupe du bacille de la tuberculose. It is also an object of the invention to provide diagnostic reagents specific to the group of mycobacteria and in particular to the group of the bacillus of tuberculosis.
La présente invention a pour objet une séquence nucléotidique issue de mycobactéries, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une séquence nucléotidique répétée dans le génome d'une mycobactérie et spécifique du groupe du bacille de la tuberculose et en ce qu'elle s'hybride très fortement avec M. tuberculosis. The subject of the present invention is a nucleotide sequence derived from mycobacteria, characterized in that it is constituted by a nucleotide sequence repeated in the genome of a mycobacterium and specific for the tuberculosis bacillus group and in that it is very strongly hybridizes with M. tuberculosis.
Dans la présente invention, on appelle groupe du bacille de la tuberculose, le groupe qui comprend M. bovis-BCG, M. bovis, M. tuberculosis, M. ca- num. In the present invention, the group of the bacillus of tuberculosis is called the group which comprises M. bovis-BCG, M. bovis, M. tuberculosis, M. cannon.
On entend par séquence nucléotidique, dans la présente invention, aussi bien une séquence d'ADN double brin, une séquence d'ADN simple que les produits de transcription desdites séquences. In the present invention, the term “nucleotide sequence” means both a double-stranded DNA sequence, a simple DNA sequence and the transcripts of said sequences.
On entend par forte hybridation, au sens de la présente invention, une hybridation donnant un signal important lié au nombre de séquences répétées présentes sur 1'ADN génomique ; un signal important permet d'obtenir une tache visible facilement à l'oeil nu après une autoradiographie d'une durée courte, réalisée dans les conditions définies à l'exemple 1 ci-après, notamment inférieure ou égale à une heure ; on obtient, par exemple, une tache très importante après une autoradiographie d'une heure environ, lorsque l'on utilise une sonde marquée ayant une activité spécifique voisine de 109 cpm par g d'ADN, avec M. ruberculosis, alors que pour M. bovis BCG, on obtient un signal faible, et ce, seulement après un délai de 48 heures. By strong hybridization is understood, within the meaning of the present invention, a hybridization giving an important signal linked to the number of repeated sequences present on the genomic DNA; an important signal makes it possible to obtain a spot easily visible to the naked eye after a autoradiography of a short duration, carried out under the conditions defined in Example 1 below, in particular less than or equal to one hour; for example, a very large spot is obtained after an autoradiography of approximately one hour, when a labeled probe having a specific activity close to 109 cpm per g of DNA is used, with M. ruberculosis, whereas for M bovis BCG, a weak signal is obtained only after 48 hours.
Selon un mode de réalisation préféré de ladite séquence, elle comporte à son extrémité 5' la séquence 5' TGAACCGCCCCGG 3'de formule I et à son extrémité 3' la séquence 5'CCGG(3GoeGTrCA 3' de formule 11, ladite séquence contenant en outre au moins un fragment d'une séquence de formule m suivante::
10 20 30 40 50 60
GTCGACACGC CTTCTGCACG GGAAGTCCTT CTGCGGCCAT CGTTGCTATG GCCGCTTACT
CAGCTGTGCG GAAGACGTGC CCTTCAGGAA GACGCCGGTA GCAACGATAC CGGCGAATGA
70 80 90 100 110 120
GCCTTCTAGT CCGTGCGGCT CTCGCAACAG CTCACGGGAC CTTTTTGAGG ATCGCCACTT
CGGAAGATCA GGCACGCCGA GAGCGTTGTC GAGTGCCCTG GAAAAACTCC TAGCGGTGAA
130 140 150 160 170 180
CAGGTCTTGA ACTCGCGGAT GCCCTCATTG GCAACGTTTG CGCCCTGCCT TGGGGCGGCC
GTCCAGAAGT TGAGCGCCTA CGGGAGTAAC CGTTGCAAAC GCGGGACGGA ACCCCGCCGG
190 100 210 220 230 240
GGCAGCCACC AAGTCGAGCA CTTTGCGGCG GAACTACTCG GGGTAACACT TCGGCACGGA
CCGTCGGTGG TTCAGCTCGT GAAACGCCGC CTTGATGAGC CCGATTGTGA AGCCGTGCCT
250 260 270 280 290 300
CACGGCTCGT TCGACGGACG TCGTGACCAG AAGTCGAGCA AACCGACTCC ACTCTAGCTA
GTGCCGAGCA AGCTGCCTGC AGCACTGGTC TTCAGCTCGT TTGGCTGAGG TGAGATCGAT
310 320 330 340 350 360
GTGATACAAG CTTTTTTGTA GCCGCGCGAT GAACCGCCCC GGCATGTCCG GAGACTCCAG
CACTATGTTC GAAAAAACAT CGGCGCGCTA CTTGGCGGGG CCGTACAGGC CTCTGAGGTC
370 380 390 400 410 420
TTCTTGGAAA GGATGGGGTC ATGTCAGGTG GTTCATCGAG GAGGTACCCG CCGGAGCTGC
AAGAACCTTT CCTACCCCAG TACAGTCCAC CAAGTAGCTC CTCCATGGGC GGCCTCGACG
430 440 450 460 470 480
GTGACGGGGC GGTGCGGATG GTCGCAGAGA TCCGCGGTCA GCACGATTCG GAGTGGGCAG
CACTGCCCCG CCACGCCTAC CAGCGTCTCT AGGCGCCAGT CGTGCTAAGC CTCACCCGTC
490 500 510 520 530 540
CGATCAGTGA GGTCGCCCGT GTACTTGGTG TTGGCTGCGG AGACGGTGCG TAAGTGGGTG
GCTAGTCACT CCAGCGGGCA CATGAACCAC AACCGACGCC TCTGCCACGC ATTCACCCAC
550 560 570 580 590 600
CGCCAGGCGC AGGTCGATGC CGGCGCACGG CCCGGGACCA CGACCGAAGA ATCCGCTGAG
GCGGTCCGCG TCCAGCTACG GCCGCGTGCC GGGCCCTGGT GCTGGCTTCT TAGGCGACTC
610 620 630 640 650 660
CTGAAGCGCT TCGGCGGGAC AACGCGAATT GCGAAGGGCG AACGCGATTT TAAAGACCGC
GACTTCGCGA AGCCGCCCTG TTGCGCTTAA CGCTTCCCGC TTGCGCTAAA ATTTCTGGCC
670 680 690 700 710 720
GTCGGCTTTC TTCGCGGCCG AGCTCGACCG GCCAGCACGC TAATTACCCG GTTCATCGCC
CAGCCGAAAG AAGCGCCGGC TCGAGCTGGC CGGTCGTGCG ATTAATGGGC CAAGTAGCGG
730 740 750 760 770 780
GATCATCAGG GCCACCGCGA GGGCCCCGAT GGTTTGCGGT GGGGTGTCGA GTCGATCTGC
CTAGTAGTCC CGGTGGCGCT CCCGGGGCTA CCAAACGCCA CCCCACAGCT CAGCTAGACG
790 800 810 820 830 840
ACACAGCTGA CCGAGCTGGG TGTGCCGATC GCCCATCGAC CTACTACGAC CACATCAACC
TGTGTCGACT GGCTCGACCC ACACGGCTAG CGGGTAGCTG GATGATGCTG GTGTAGTTGG
850 860 870 880 890 900
GGGAGCCCAG CCGCGCGAGC TGCGCGATGG CGAACTCAAG GAGCACATCA GCCGCGTCCA
CCCTCGGGTC GGCGCGCTCG ACGCGCTACC GCTTGAGTTC CTCGTGTAGT CGGCGCAGGT
910 920 930 940 950 960
CGCCGCCAAC TACGGTGTTT ACCGTGCCCG CAAAGTGTGG CTAACCCTGA ACCGTGAGGG
GCGGCGGTTG ATGCCACAAA TGGCACGGGC GTTTCACACC GATTGGGACT TGGCACTCCC
970 980 990 1000 1010 1020
CATCGAGGTG GCCAGATGCA CCGTCGAACG GCTGATGACC AAACTCGGCC TGTCCGGGAC
GTAGCTCCAC CGGTCTACGT GGCAGCTTGC CGACTACTGG TTTGAGCCGG ACAGGCCCTG
1030 1040 1050 1060 1070 1080
CACCCGCGGC AAAGCCCGCA GGACCACGAT CGCTGATCCG GCCACAGCCC GTCCCGCCGA
GTGGGCGCCG TTTCGGGCGT CCTGGTGCTA GCGACTAGGC CGGTGTCGGG CAGGGCGGCT
1090 1100 1110 1120 1130 1140
TCTCGTCCAG CGCCGCTTCG GACCACCAGC ACCTAACCGG CTGTGGGTAG CAGACCTCAC
AGAGCAGGTC GCGGCGAAGC CTGGTGGTCG TGGATTGGCC GACACCCATC GTCTGGAGTG
1150
CTATGTGTCG AC
GATACACAGC TG
Ladite séquence a été dénommée IS6020 par les Inventeurs et comprend notamment les sites de restriction suivants : SalI, SmaI, KpnI, Hindi. According to a preferred embodiment of said sequence, it comprises at its 5 'end the 5' sequence TGAACCGCCCCGG 3 'of formula I and at its 3' end the sequence 5'CCGG (3GoeGTrCA 3 'of formula 11, said sequence containing in in addition to at least one fragment of a sequence of formula m below:
10 20 30 40 50 60
GTCGACACGC CTTCTGCACG GGAAGTCCTT CTGCGGCCAT CGTTGCTATG GCCGCTTACT
CAGCTGTGCG GAAGACGTGC CCTTCAGGAA GACGCCGGTA GCAACGATAC CGGCGAATGA
70 80 90 100 110 120
GCCTTCTAGT CCGTGCGGCT CTCGCAACAG CTCACGGGAC CTTTTTGAGG ATCGCCACTT
CGGAAGATCA GGCACGCCGA GAGCGTTGTC GAGTGCCCTG GAAAAACTCC TAGCGGTGAA
130 140 150 160 170 180
CAGGTCTTGA ACTCGCGGAT GCCCTCATTG GCAACGTTTG CGCCCTGCCT TGGGGCGGCC
GTCCAGAAGT TGAGCGCCTA CGGGAGTAAC CGTTGCAAAC GCGGGACGGA ACCCCGCCGG
190 100 210 220 230 240
GGCAGCCACC AAGTCGAGCA CTTTGCGGCG GAACTACTCG GGGTAACACT TCGGCACGGA
CCGTCGGTGG TTCAGCTCGT GAAACGCCGC CTTGATGAGC CCGATTGTGA AGCCGTGCCT
250 260 270 280 290 300
CACGGCTCGT TCGACGGACG TCGTGACCAG AAGTCGAGCA AACCGACTCC ACTCTAGCTA
GTGCCGAGCA AGCTGCCTGC AGCACTGGTC TTCAGCTCGT TTGGCTGAGG TGAGATCGAT
310 320 330 340 350 360
GTGATACAAG CTTTTTTGTA GCCGCGCGAT GAACCGCCCC GGCATGTCCG GAGACTCCAG
CACTATGTTC GAAAAAACAT CGGCGCGCTA CTTGGCGGGG CCGTACAGGC CTCTGAGGTC
370 380 390 400 410 420
TTCTTGGAAA GGATGGGGTC ATGTCAGGTG GTTCATCGAG GAGGTACCCG CCGGAGCTGC
AAGAACCTTT CCTACCCCAG TACAGTCCAC CAAGTAGCTC CTCCATGGGC GGCCTCGACG
430 440 450 460 470 480
GTGACGGGGC GGTGCGGATG GTCGCAGAGA TCCGCGGTCA GCACGATTCG GAGTGGGCAG
CACTGCCCCG CCACGCCTAC CAGCGTCTCT AGGCGCCAGT CGTGCTAAGC CTCACCCGTC
490 500 510 520 530 540
CGATCAGTGA GGTCGCCCGT GTACTTGGTG TTGGCTGCGG AGACGGTGCG TAAGTGGGTG
GCTAGTCACT CCAGCGGGCA CATGAACCAC AACCGACGCC TCTGCCACGC ATTCACCCAC
550 560 570 580 590 600
CGCCAGGCGC AGGTCGATGC CGGCGCACGG CCCGGGACCA CGACCGAAGA ATCCGCTGAG
GCGGTCCGCG TCCAGCTACG GCCGCGTGCC GGGCCCTGGT GCTGGCTTCT TAGGCGACTC
610 620 630 640 650 660
CTGAAGCGCT TCGGCGGGAC AACGCGAATT GCGAAGGGCG AACGCGATTT TAAAGACCGC
GACTTCGCGA AGCCGCCCTG TTGCGCTTAA CGCTTCCCGC TTGCGCTAAA ATTTCTGGCC
670 680 690 700 710 720
GTCGGCTTTC TTCGCGGCCG AGCTCGACCG GCCAGCACGC TAATTACCCG GTTCATCGCC
CAGCCGAAAG AAGCGCCGGC TCGAGCTGGC CGGTCGTGCG ATTAATGGGC CAAGTAGCGG
730 740 750 760 770 780
GATCATCAGG GCCACCGCGA GGGCCCCGAT GGTTTGCGGT GGGGTGTCGA GTCGATCTGC
CTAGTAGTCC CGGTGGCGCT CCCGGGGCTA CCAAACGCCA CCCCACAGCT CAGCTAGACG
790 800 810 820 830 840
ACACAGCTGA CCGAGCTGGG TGTGCCGATC GCCCATCGAC CTACTACGAC CACATCAACC
TGTGTCGACT GGCTCGACCC ACACGGCTAG CGGGTAGCTG GATGATGCTG GTGTAGTTGG
850 860 870 880 890 900
GGGAGCCCAG CCGCGCGAGC TGCGCGATGG CGAACTCAAG GAGCACATCA GCCGCGTCCA
CCCTCGGGTC GGCGCGCTCG ACGCGCTACC GCTTGAGTTC CTCGTGTAGT CGGCGCAGGT
910 920 930 940 950 960
CGCCGCCAAC TACGGTGTTT ACCGTGCCCG CAAAGTGTGG CTAACCCTGA ACCGTGAGGG
GCGGCGGTTG ATGCCACAAA TGGCACGGGC GTTTCACACC GATTGGGACT TGGCACTCCC
970 980 990 1000 1010 1020
CATCGAGGTG GCCAGATGCA CCGTCGAACG GCTGATGACC AAACTCGGCC TGTCCGGGAC
GTAGCTCCAC CGGTCTACGT GGCAGCTTGC CGACTACTGG TTTGAGCCGG ACAGGCCCTG
1030 1040 1050 1060 1070 1080
CACCCGCGGC AAAGCCCGCA GGACCACGAT CGCTGATCCG GCCACAGCCC GTCCCGCCGA
GTGGGCGCCG TTTCGGGCGT CCTGGTGCTA GCGACTAGGC CGGTGTCGGG CAGGGCGGCT
1090 1100 1110 1120 1130 1140
TCTCGTCCAG CGCCGCTTCG GACCACCAGC ACCTAACCGG CTGTGGGTAG CAGACCTCAC
AGAGCAGGTC GCGGCGAAGC CTGGTGGTCG TGGATTGGCC GACACCCATC GTCTGGAGTG
1150
CTATGTGTCG AC
GATACACAGC TG
Said sequence has been named IS6020 by the inventors and in particular includes the following restriction sites: SalI, SmaI, KpnI, Hindi.
Selon une modalité avantageuse de cette disposition, ladite séquence comprend les nucléotides 343-1152 de la séquence de formule m ci-dessus et les fragments de celle-ci. According to an advantageous modality of this arrangement, said sequence comprises nucleotides 343-1152 of the sequence of formula m above and the fragments thereof.
La présente invention englobe également des fragments nucléotidiques, notamment des oligonucléotides, dérivés des séquences nucléotidiques telles que définies ci-dessus. The present invention also encompasses nucleotide fragments, in particular oligonucleotides, derived from the nucleotide sequences as defined above.
Parmi ces fragments, on peut citer en particulier:
- un oligonucléotide, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule IV suivante:
ATGTCAGGTGGTTCATCGAG (IV); ledit oligonucléotide a été dénommé ISTB1 par les Inventeurs;
- un oligonucléotide, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule V suivante:
ACAGGCCGAGTTTGGTCATC (V); ledit oligonucléotide a été dénommé ISTB2 par les Inventeurs. Among these fragments, there may be mentioned in particular:
an oligonucleotide, characterized in that it has the following sequence of formula IV:
ATGTCAGGTGGTTCATCGAG (IV); said oligonucleotide was designated ISTB1 by the inventors;
- an oligonucleotide, characterized in that it has the sequence of formula V as follows:
ACAGGCCGAGTTTGGTCATC (V); said oligonucleotide was designated ISTB2 by the inventors.
La présente invention a également pour objet des produits de traduction et/ou des fragments de ceux-ci, caractérisés en ce qu'ils sont codés par une séquence ou un fragment de séquence nucléotidique conforme à l'invention. The subject of the present invention is also translation products and / or fragments thereof, characterized in that they are coded by a sequence or a fragment of nucleotide sequence in accordance with the invention.
La présente invention a, de plus, pour objet un procédé de détection d'une séquence répétée spécifique du groupe du bacille de la tuberculose, caractérisé en ce qu'il comprend:
(1) une étape dans laquelle on réalise une banque de cosmides recombinants comprenant des fragments d'ADN d'une mycobactérie appropriée supé rieurs à 30 kb; et
(2) une étape dans laquelle on détecte le/les clones cosmidiques contenant au moins une séquence répétée, par hybridation avec un ADN génomique total de mycobactérie appropriée, marqué de manière convenable.The present invention further relates to a method for detecting a repeated sequence specific for the group of the bacillus of tuberculosis, characterized in that it comprises:
(1) a step in which a library of recombinant cosmids is produced comprising DNA fragments of an appropriate mycobacterium greater than 30 kb; and
(2) a step in which the cosmid clone (s) containing at least one repeat sequence are detected, by hybridization with a suitable genomic total DNA of suitable mycobacterium.
La révélation des hybrides formés permet la détection rapide des séquences répétées présentes sur le génome desdites mycobactéries. The revelation of the hybrids formed allows rapid detection of the repeated sequences present on the genome of said mycobacteria.
La présente invention a également pour objet des réactifs de diagnostic pour la détection d'au moins un groupe de mycobactéries, caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins une séquence nucléotidique ou un fragment de celle-ci, telle que définie ci-dessus, pour la détection des mycobactéries du groupe du bacille de la tuberculose, éventuellement associée à au moins une autre séquence nucléotidique appropriée à la détection d'un autre groupe de mycobactéries et/ou au moins un marqueur approprié. The present invention also relates to diagnostic reagents for the detection of at least one group of mycobacteria, characterized in that they comprise at least one nucleotide sequence or a fragment thereof, as defined above, for the detection of mycobacteria from the tuberculosis bacillus group, possibly associated with at least one other nucleotide sequence suitable for the detection of another group of mycobacteria and / or at least one suitable marker.
Un tel réactif permet, par exemple, la détection simultanée d'une mycobactérie du groupe du bacille de la tuberculose et d'une mycobactérie du groupe
MAIP (M. avium; M. intracellulare, M. paratuberculosis)
Selon un mode de réalisation avantageux desdits réactifs, ils correspondent à des paires d'amorces pour la synthèse d'un fragment d'ADN ou d'ARN du groupe du bacille de la tuberculose, chaque amorce comprenant une séquence ou un fragment de séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus.Such a reagent allows, for example, the simultaneous detection of a mycobacterium from the tuberculosis bacillus group and a mycobacterium from the group
MAIP (M. avium; M. intracellulare, M. paratuberculosis)
According to an advantageous embodiment of said reagents, they correspond to pairs of primers for the synthesis of a DNA or RNA fragment from the tuberculosis bacillus group, each primer comprising a sequence or a fragment of nucleotide sequence as defined above.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, une paire d'amorces conforme à l'invention est notamment constituée par un oligonucléotide de formule W apparié à un oligonucléotide de formule V. According to an advantageous arrangement of this embodiment, a pair of primers according to the invention is in particular constituted by an oligonucleotide of formula W paired with an oligonucleotide of formula V.
Ces amorces permettent notamment la synthèse de la séquence nucléotidique de formule ffi ci-dessus et/ou de son brin complémentaire et/ou de la séquence IS6020. These primers allow in particular the synthesis of the nucleotide sequence of formula ffi above and / or of its complementary strand and / or of the sequence IS6020.
Selon un autre mode de réalisation avantageux desdits réactifs, ils correspondent à une sonde de détection d'un fragment d'ADN ou d'ARN du groupe du bacille de la tuberculose. According to another advantageous embodiment of said reagents, they correspond to a probe for detecting a DNA or RNA fragment from the group of the tuberculosis bacillus.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite
sonde de détection comprend avantageusement une séquence nucléotidique de for -mule m, pour la détection d'une mycobactérie du groupe du bacille de la tuberculose.According to an advantageous arrangement of this embodiment, said
detection probe advantageously comprises a nucleotide sequence of formula -m, for the detection of a mycobacterium from the group of the bacillus of tuberculosis.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, le marqueur est choisi dans le groupe qui comprend notamment les isotopes radioactifs, les enzymes
appropriées, les fluorochromes, les marqueurs chimiques appropriés, les haptènes et les anticorps ou les analogues de base tels que ceux décrits dans le brevet français n' 2 518755 ou la demande de brevet européen n 158758. According to another advantageous embodiment, the marker is chosen from the group which notably comprises radioactive isotopes, enzymes
appropriate, fluorochromes, appropriate chemical markers, haptens and antibodies or basic analogs such as those described in French Patent No. 2,518,755 or European Patent Application No. 158758.
Lesdits réactifs peuvent être utilisés dans un très grand nombre de
techniques de diagnostic basées sur la détection d'acides nucléiques par hybridation; en particulier, une sonde conforme à l'invention telle que la séquence de formule m permet notamment de détecter spécifiquement l'ADN d'une mycobactérie du groupe
du bacille de la tuberculose et en particulier Mycobactenum tubercuiosis. Said reagents can be used in a very large number of
diagnostic techniques based on the detection of nucleic acids by hybridization; in particular, a probe according to the invention such as the sequence of formula m makes it possible in particular to specifically detect the DNA of a mycobacterium of the group
of the bacillus of tuberculosis and in particular Mycobactenum tubercuiosis.
La présente invention a également pour objet une famille de plas
mides recombinants, caractérisés en ce qu'ils contiennent au moins une séquence nucléotidique conforme à l'invention.The present invention also relates to a family of plas
recombinant mides, characterized in that they contain at least one nucleotide sequence according to the invention.
Selon un mode de réalisation avantageux dudit plasmide, il comprend la séquence nucléotidique de formule m ou un fragment de celle-ci. According to an advantageous embodiment of said plasmid, it comprises the nucleotide sequence of formula m or a fragment thereof.
Selon une disposition préférée dudit mode de réalisation, ledit plas
mide comprend ladite séquence associée à un vecteur pUC18.According to a preferred arrangement of said embodiment, said plas
mide comprises said sequence associated with a vector pUC18.
Ce plasmide recombinant a été dénommé pMT01 par les Inventeurs. This recombinant plasmid was named pMT01 by the inventors.
Conformément à l'invention, ledit plasmide recombinant est déposé
sous le n" I-900, en date du 25 août 1989, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur.According to the invention, said recombinant plasmid is deposited
under number I-900, dated August 25, 1989, from the National Collection of Cultures of Microorganisms held by the Institut Pasteur.
La présente invention a également pour objet un procédé de détection et d'identification rapide d'au moins un groupe etlou une espèce de mycobactéries dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend:
(1) une étape dans laquelle l'on met en contact l'échantillon biolo
gique avec au moins un réactif de diagnostic conforme à l'invention et
(2) une étape dans laquelle on détecte par tout moyen approprié le ou les produits résultant de l'interaction séquence nucléotidique de mycobactérie éventuellement présente-réactif de diagnostic. The present invention also relates to a method for rapid detection and identification of at least one group and / or one species of mycobacteria in a biological sample, characterized in that it comprises:
(1) a step in which the biological sample is brought into contact
icing with at least one diagnostic reagent according to the invention and
(2) a step in which the product or products resulting from the nucleotide sequence interaction of mycobacterium possibly present-diagnostic reagent are detected by any appropriate means.
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux de ce procédé, le/les réactifs de diagnostic de l'étape (1) sont une/des paire d'amorces conformes à l'invention et permettent l'obtention de produits d'amplification de la séquence nucléotidique à détecter. According to an advantageous embodiment of this method, the diagnostic reagent (s) of step (1) are one / several pairs of primers in accordance with the invention and allow obtaining amplification products of the nucleotide sequence to be detected.
L'étape d'amplification est notamment l'une des techniques d'amplification génétique telles que la méthode dite Qss réplicase (LE;ARDI P.M. et al., Biotechnol., 1988, 6) ou la méthode dite P.C.R (polymerase chain reaction) décrite dans les demandes de brevet européens ne 200 363, ne 201184 et ne 229701 déposées par CETUS CO.. The amplification step is in particular one of the genetic amplification techniques such as the so-called Qss replicase method (LE; ARDI PM et al., Biotechnol., 1988, 6) or the so-called PCR (polymerase chain reaction) method described in European patent applications no 200 363, no 201184 and no 229701 filed by CETUS CO ..
Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, les produits d'amplification obtenus en (1) sont détectés par séparation électrophorétique. According to an advantageous arrangement of this embodiment, the amplification products obtained in (1) are detected by electrophoretic separation.
Par exemple, si l'on observe la présence d'un fragment d'ADN migrant à l'endroit attendu, on peut conclure que l'échantillon analysé contient de l'ADN du groupe de mycobactéries à détecter. For example, if we observe the presence of a DNA fragment migrating to the expected location, we can conclude that the analyzed sample contains DNA from the group of mycobacteria to be detected.
Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, les produits d'amplification obtenus en (1) sont détectés par hybridation entre lesdits produits d'amplification et un réactif de diagnostic conforme à l'invention marqué de manière appropriée. According to another advantageous arrangement of this embodiment, the amplification products obtained in (1) are detected by hybridization between said amplification products and a diagnostic reagent according to the invention marked appropriately.
Un tel procédé a l'avantage de permettre de réaliser un test sensible et spécifique, direct et rapide (moins de 24 heures) de détection d'au moins un groupe de mycobactéries. Such a method has the advantage of making it possible to carry out a sensitive and specific, direct and rapid test (less than 24 hours) for detection of at least one group of mycobacteria.
Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux du procédé conforme à l'invention, le réactif de diagnostic de l'étape (1) est une sonde de détection conforme à l'invention et permet l'obtention d'hybrides entre la séquence nucléotidique à détecter et ladite sonde. According to another advantageous embodiment of the method according to the invention, the diagnostic reagent of step (1) is a detection probe according to the invention and makes it possible to obtain hybrids between the nucleotide sequence to be detected and said probe.
Une telle séquence permet également d'identifier l'espèce d'une mycobactérie à l'intérieur du groupe du bacille de la tuberculose, en partant d'une culture pure. Such a sequence also makes it possible to identify the species of a mycobacterium within the group of the bacillus of tuberculosis, starting from a pure culture.
La présente invention a, en outre, pour objet un kit, coffret ou ensemble coordonné prêt à l'emploi pour la mise en oeuvre du procédé de détection d'au moins un groupe de mycobactéries conforme à l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend outre des quantités utiles de tampons et de réactifs appropriés pour la mise en oeuvre de ladite détection:
- des doses appropriées d'au moins une paire d'amorces conforme à l'invention; et/ou
- des doses appropriées d'au moins une sonde ou un fragment de
sonde nucléotidique conforme à l'invention.The present invention further relates to a kit, kit or coordinated assembly ready for use for implementing the method for detecting at least one group of mycobacteria according to the invention, characterized in that it also includes useful quantities of buffers and reagents suitable for carrying out said detection:
- appropriate doses of at least one pair of primers according to the invention; and or
- appropriate doses of at least one probe or a fragment of
nucleotide probe according to the invention.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention. In addition to the foregoing arrangements, the invention also comprises other arrangements which will emerge from the description which follows, which refers to examples of implementation of the process which is the subject of the present invention.
ll doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière unelimitation. It should be understood, however, that these examples are given only by way of illustration of the subject of the invention, of which they do not in any way constitute a limitation.
Exemple 1: Dépistage des mycobactéries du groupe du bacille de la tuberculose.Example 1: Screening for mycobacteria of the tuberculosis bacillus group.
a) Construction de la banque génomique M. tuberculosis:
L'ADN génomique de M. tuberculosis H37rv est digéré partiellement par l'endonuciéase de restriction SalI en faisant agir 0,03U d'enzyme par g d'ADN dans un tampon 100 mM NaCl, 50 mM MgCI2, 1 mM dithiothréitol pendant 1 heure à 37 C. L'ADN génomique ainsi digéré est séparé par électrophorèse sur gel d'agarose à 0,6 %, les fragments entre 30 et 40 kb électruélués et précipités en éthanol après extraction au phénol/chloroforme (1/1).a) Construction of the M. tuberculosis genomic library:
The genomic DNA of M. tuberculosis H37rv is partially digested with the restriction endonuciasis SalI by causing 0.03U of enzyme per g of DNA to act in a 100 mM NaCl buffer, 50 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol for 1 hour. at 37 C. The genomic DNA thus digested is separated by electrophoresis on 0.6% agarose gel, the fragments between 30 and 40 kb electrueluted and precipitated in ethanol after extraction with phenol / chloroform (1/1).
Le vecteur est le cosmide pHC79. R est digéré de la même manière et déphosphorylé pour éviter toute autoligation. The vector is the cosmid pHC79. R is digested in the same way and dephosphorylated to avoid any autoligation.
La ligation s'effectue en mélangeant 700 ng de vecteur et 1,5 g de fragments d'ADN 30/40 kb (soit un rapport molaire vecteurfinsert de 1/2) et la réaction est laissée à 140C pendant 18 h après avoir ajouté 2,5U de T4 DNA ligase dans un tampon 0,066 M Tris-HCl pH 7,5,5 mM MgC12, 5 mM dithiothréitol, 1 mM ATP. The ligation is carried out by mixing 700 ng of vector and 1.5 g of DNA fragments 30/40 kb (i.e. a vector-to-insert molar ratio of 1/2) and the reaction is left at 140C for 18 h after adding 2 , 5U of T4 DNA ligase in 0.066 M Tris-HCl buffer pH 7.5.5 mM MgCl2, 5 mM dithiothreitol, 1 mM ATP.
Les cosmides recombinants sont encapsidés in vitro et utilisés pour transformer les bactéries HB101. Les bactéries transformées sont incubées 1 h à 370C en milieu LB puis étalées sur milieu sélectif Agar contenant 25 g/ml d'ampicilline. The recombinant cosmids are packaged in vitro and used to transform the HB101 bacteria. The transformed bacteria are incubated for 1 hour at 370C in LB medium and then spread on selective Agar medium containing 25 g / ml of ampicillin.
Les colonies résistantes à l'ampicilline sont toutes testées pour leur sensibilité à la tétracycline; en effet le fragment d'ADN de 30/40 kb est inséré dans le vecteur de manière à inactiver le gène de résistance à la tétracycline (ret) et à conserver le gène de résistance à l'ampicilline (Amp).Colonies resistant to ampicillin are all tested for their sensitivity to tetracycline; indeed, the 30/40 kb DNA fragment is inserted into the vector so as to inactivate the tetracycline resistance gene (ret) and to conserve the ampicillin resistance gene (Amp).
b) Criblage de la banque et détermination de la séquence:
R est effectué une mini préparation d'ADN des 150 premières colonies transformantes résistantes à l'ampicilline (Ampr) et sensibles à la tétracycline (tets) selon la technique de lyse alcaline. L'ADN de ces préparations est ensuite digéré par l'endonuciéase de restriction SalI, analysé en électrophorèse sur gel d'agarose à 0,6 % puis transféré sur filtre de nylon. L'ADN est fixé de façon irréversible par 5 mn d'exposition aux UV à 254 nm. b) Screening of the library and determination of the sequence:
R is carried out a mini DNA preparation of the first 150 transforming colonies resistant to ampicillin (Ampr) and sensitive to tetracycline (tets) according to the alkaline lysis technique. The DNA of these preparations is then digested with the restriction endonuciasis SalI, analyzed by electrophoresis on 0.6% agarose gel and then transferred to a nylon filter. DNA is fixed irreversibly by 5 min of UV exposure at 254 nm.
Ces différents filtres sont hybridés 16 à 18 heures à 68 C dans un mélange contenant un tampon 6X SSC (1X SSC correspond à 0,15M NaCI et 0,015M citrate de Na), 10 % dextran sulfate, 5X Denhardt's (une solution 1X Denhardt's correspondant à 0,02 % de Ficoll, 0,02 % de polyvinylpyrrolidone et 0,02 % de sérum albumine bovine), 10 mM EDTA, 0,5 % SDS, 100 Rglml d'ADN de sperme de saumon; à ce mélange, on ajoute soit 1'ADN génomique total de M. tuberculosis H37rv, soit l'ADN génomique total de M. bovis-BCG radiomarqué au phosphore 32 par multiamorçage. These different filters are hybridized for 16 to 18 hours at 68 ° C. in a mixture containing a 6X SSC buffer (1X SSC corresponds to 0.15M NaCl and 0.015M Na citrate), 10% dextran sulfate, 5X Denhardt's (a 1X Denhardt's solution corresponding 0.02% Ficoll, 0.02% polyvinylpyrrolidone and 0.02% bovine serum albumin), 10 mM EDTA, 0.5% SDS, 100 Rglml of salmon sperm DNA; either the total genomic DNA of M. tuberculosis H37rv or the total genomic DNA of M. bovis-BCG radiolabelled with phosphorus 32 by multi-priming is added to this mixture.
Après hybridation, les filtres sont lavés deux fois 10 mn avec du tampon 2X SSC à 65eC, une fois 30 mn avec du tampon 2X SSC+O,1 % SDS à 65CC et enfin une fois 10 mn avec du tampon 0,1X SSC à 65 C. Les filtres encore humides sont mis en autoradiographie à -80'C avec écran intensifiant de 1 h à 2 jours. After hybridization, the filters are washed twice 10 min with 2X SSC buffer at 65 ° C., once 30 min with 2X SSC + O buffer, 1% SDS at 65 ° C. and finally once 10 min with 0.1X SSC buffer at 65 ° C. 65 C. The filters that are still wet are put into autoradiography at -80 ° C with an intensifying screen from 1 h to 2 days.
Les résultats de ces hybridations ont permis d'isoler un clone cosmidique contenant un fragment d'environ 1 kb s'hybridant très fortement avec 1'ADN marqué de M. tuberculosis H37rv et faiblement avec l'ADN marqué de M. bovis-BCG (figure 1). The results of these hybridizations made it possible to isolate a cosmid clone containing a fragment of approximately 1 kb which hybridizes very strongly with the DNA labeled with M. tuberculosis H37rv and weakly with the DNA labeled with M. bovis-BCG ( figure 1).
La figure 1 représente une autoradiographie, après Southem Blot, du clone cosmidique, en utilisant les ADN marqués au 32p : la colonne A correspond à
M. bovis-BCG; la colonne B correspond d M. tuberculosis; la flèche montre le fragment spécifique M. tuberculosis.FIG. 1 represents an autoradiography, after Southem Blot, of the cosmid clone, using the DNAs labeled with 32p: column A corresponds to
M. bovis-BCG; column B corresponds to M. tuberculosis; the arrow shows the specific fragment M. tuberculosis.
Ce fragment a été cloné dans un vecteur pUC18 et préparé en grande quantité. Ce plasmide est dénommé pMT01. This fragment was cloned into a pUC18 vector and prepared in large quantities. This plasmid is called pMT01.
Ce fragment a été digéré par les enzymes Hindi, KpnI, SmaI et par une double digestion SmaVHindE puis cloné dans des phages M13tnp18 et
M13mp19 et séquencé selon la méthode de Sanger en utilisant la Taq polymérase en présence de d-azaGTP à la place du dGTP.This fragment was digested with the enzymes Hindi, KpnI, SmaI and by a double digestion SmaVHindE then cloned into phages M13tnp18 and
M13mp19 and sequenced according to the Sanger method using Taq polymerase in the presence of d-azaGTP in place of dGTP.
La séquence entière du fragment est représentée à la formule I cidessus. The entire sequence of the fragment is shown in Formula I above.
La comparaison des 1152 nucléotides ainsi déterminés avec l'ensemble de la banque de données de Les Alamos a fait ressortir des homologies de plus de 50 % avec la séquence d'insertion IS3411 (ISHIGURO et col J. Bacteriol 170, 198, 1902-1906). L'homologie a été détectée entre les nucléotides 330 et 1151. The comparison of the 1152 nucleotides thus determined with the entire Les Alamos database revealed homologies of more than 50% with the insertion sequence IS3411 (ISHIGURO and col J. Bacteriol 170, 198, 1902-1906 ). Homology was detected between nucleotides 330 and 1151.
Deux oligonucléotides de 20 mers à I'intérieur de cette séquence homologue ont été synthétisés: ISTB1: ATGTCAGGTC}GITCATCGAG (formule il ci-dessus)
ISTB2: ACAGGCCGAGTTTGGTCATC (formule III ci-dessus)
c) Marquage du plasmide pMT01 par 2-acétyl-amino-fluorène
(AAF):
25 g de plasmide pMT01 ont été marqués selon une procédure
adaptée de celle de TCHEN et col (PNAS 81:1984; 3466-3470). Le taux de substitution obtenu a été de 9,7 %.Two 20-mer oligonucleotides within this homologous sequence were synthesized: ISTB1: ATGTCAGGTC} GITCATCGAG (formula II above)
ISTB2: ACAGGCCGAGTTTGGTCATC (formula III above)
c) Labeling of the plasmid pMT01 with 2-acetyl-amino-fluorene
(AAF):
25 g of plasmid pMT01 were labeled according to a procedure
adapted from that of TCHEN et al. (PNAS 81: 1984; 3466-3470). The substitution rate obtained was 9.7%.
d) Isolement de l'ADN mycobactérien:
Les extraits biologiques sont traités de manière appropriée puis centrifugés. L'ADN est extrait par remise en suspension du culot avec 50 Il de NaOH 0,1 M contenant du NaCl 2M et du SDS 0,5 %.d) Isolation of mycobacterial DNA:
The biological extracts are treated appropriately and then centrifuged. The DNA is extracted by resuspending the pellet with 50 μl of 0.1 M NaOH containing 2M NaCl and 0.5% SDS.
Le mélange est incubé à 95 C 15 minutes ; au mélange réactionnel, on ajoute 400 1 de Tris-HCl 0,1M pH7. L'ADN est extrait trois fois au phénol/chloroforme, précipité à l'éthanol et repris dans 50 Ill de Tris 10 mM, EDTA 0,1 rnMpH 8. The mixture is incubated at 95 ° C. for 15 minutes; 400 l of 0.1M Tris-HCl pH7 are added to the reaction mixture. The DNA is extracted three times with phenol / chloroform, precipitated with ethanol and taken up in 50 μl of 10 mM Tris, 0.1 rnMpH 8 EDTA.
e) Amplification de 1'ADN:
L'amplification est réalise par la technique d'amplification in vitro selon SAIKI et ai (Science, 1988, 239, 487-491) en utilisant 12,5 pmoles des oligonucléotides ISTB1 et ISTB2 et 50 ng d'ADN de différentes souches de mycobactéries, notamment les oligonucléotides TE I et TB2 tels que décrits dans la Demande de Brevet 89 05057, avec 2 U de Taq polymérase dans un tampon 50 mM KCl, 10 mM Tris
HCl pH 8,3, 2,4 mM MgCl2, 300 CLM de désoxyribonucléotides et 100 llg/ml de gélatine, le volume final de la réaction étant de 100 lil. Les paramètres des étapes de
PCR ont été choisis de la façon suivante: 1,5 mn à 94 C, 2 mn à 50 C, 2mn à 72 C. 40 cycles sont réalisés en utilisant par exemple l'appareil décrit dans le Brevet français n 8808536 déposé par l'Institut Pasteur. Après le dernier cycle, les échantillons sont maintenus à 37 C 10 mn puis stockés à 4 C.e) Amplification of DNA:
Amplification is carried out by the in vitro amplification technique according to SAIKI et al (Science, 1988, 239, 487-491) using 12.5 pmol of the oligonucleotides ISTB1 and ISTB2 and 50 ng of DNA from different strains of mycobacteria. , in particular the oligonucleotides TE I and TB2 as described in Patent Application 89 05057, with 2 U of Taq polymerase in a 50 mM KCl, 10 mM Tris buffer
HCl pH 8.3, 2.4 mM MgCl2, 300 CLM of deoxyribonucleotides and 100 μg / ml of gelatin, the final volume of the reaction being 100 lil. The parameters of the stages of
PCR were chosen as follows: 1.5 min at 94 ° C., 2 min at 50 ° C., 2 min at 72 ° C. 40 cycles are carried out using, for example, the apparatus described in French Patent No. 8808536 filed by the Pastor Institute. After the last cycle, the samples are kept at 37 ° C. for 10 minutes and then stored at 4 ° C.
f) Analyse des échantillons:
1. En gel d'agarose
10 ml des échantillons amplifiés sont déposés sur un gel d'agarose à 2 % dans un tampon TAE (0,04 M Tris-acétate, 0,001M EDTA) et contenant 1 mg/ml de bromure d'éthydium. Les bandes amplifiées sont visualisées sous UV. La figure 2 montre les différents profils obtenus selon les ADN de mycobactéries. Un fragment d'ADN correspondant à la taille attendue est observé avec les ADN des mycobactéries suivantes : M. tuberculosis (13), M. bovis-BCG (16). Par contre ce fragment n'est pas visible lorsque l'ADN analysé est extrait des souches suivantes : Mycobactenum asiattcum (1), M. avium (2), M.= chelonae (3), M. flavescens (4), M. gordonae (5), M.f) Analysis of the samples:
1. In agarose gel
10 ml of the amplified samples are deposited on a 2% agarose gel in a TAE buffer (0.04 M Tris-acetate, 0.001M EDTA) and containing 1 mg / ml of ethydium bromide. The amplified bands are visualized under UV. Figure 2 shows the different profiles obtained according to the DNA of mycobacteria. A DNA fragment corresponding to the expected size is observed with the DNAs of the following mycobacteria: M. tuberculosis (13), M. bovis-BCG (16). On the other hand, this fragment is not visible when the DNA analyzed is extracted from the following strains: Mycobactenum asiattcum (1), M. avium (2), M. = chelonae (3), M. flavescens (4), M. gordonae (5), M.
kansasii (6), M. malmoense (7), M. marinum (8), M. scrofulasceum (9), M. simiae
(10), M. szulgai (11), M. terrae (12), M. xenopi (14), Nocardia (15), Streptomyces antibioticus (17), S. lividans (18), S. viridochromogene (19), S. hydroscopicus (20), S.kansasii (6), M. malmoense (7), M. marinum (8), M. scrofulasceum (9), M. simiae
(10), M. szulgai (11), M. terrae (12), M. xenopi (14), Nocardia (15), Streptomyces antibioticus (17), S. lividans (18), S. viridochromogene (19), S. hydroscopicus (20), S.
fradiae (21), Micromonospora (22), Eschenchia coli (23).fradiae (21), Micromonospora (22), Eschenchia coli (23).
Ce fragment peut éventuellement être détecté par hybridation avec une sonde correspondant à tout ou partie de IS6020. L'ADN est alors transféré sur une membrane et l'on procède comme décrit en b) ci-dessus
2. En dot blot
10 Cll des échantillons amplifiés sont dénaturés par chauffage à 95 C pendant 2 mn dans 0,2 ml NaOH 0,4 M contenant 25 mM EDTA puis refroidis rapidement sur glace avant d'être déposés dans les puits d'un appareil à filtrer, ajusté avec une membrane de nitrocellulose.This fragment can optionally be detected by hybridization with a probe corresponding to all or part of IS6020. The DNA is then transferred to a membrane and the procedure is carried out as described in b) above.
2. In dot blot
10 Cll of the amplified samples are denatured by heating at 95 ° C. for 2 min in 0.2 ml 0.4 M NaOH containing 25 mM EDTA then quickly cooled on ice before being deposited in the wells of a filter apparatus, adjusted with a nitrocellulose membrane.
Après lavage des puits avec 100 pi de SSPE, la membrane est chauffée à 800C pendant 1 heure. Le filtre est hybridé 16 à 18 heures à 68'C avec le plasmide put01 marqué à 1'AAF. Après lavages la révélation immunoenzymatique s'effectue selon la technique décrite par MASSE et col (Annales de l'Institut
Pasteur/immunology 136D, 231-243). Seules les espèces appartenant au groupe du bacille de la tuberculose donnent un signal sur la membrane.After washing the wells with 100 μl of SSPE, the membrane is heated at 800C for 1 hour. The filter is hybridized 16 to 18 hours at 68 ° C. with the putaf plasmid A01-labeled. After washing the immunoenzymatic revelation is carried out according to the technique described by MASS et al (Annals of the Institute
Pasteur / immunology 136D, 231-243). Only species belonging to the tuberculosis bacillus group give a signal on the membrane.
Exemple 2 : Identification des différentes espèces à l'intérieur du groupe du bacille de la tuberculose.Example 2: Identification of the different species within the group of the tuberculosis bacillus.
Après culture selon des techniques appropriées, les ADN sont extraits comme décrit au paragraphe ld. Il est effectué une digestion totale par l'enzyme PstI. Ces ADN subissent ensuite une électrophorèse sur gel d'agarose à 0,6 % en TAE avant d'être transférés sur membrane de nitrocellulose selon la technique de Southern. After culture according to appropriate techniques, the DNAs are extracted as described in paragraph ld. It is carried out a total digestion by the enzyme PstI. These DNAs then undergo electrophoresis on an agarose gel at 0.6% in TAE before being transferred to a nitrocellulose membrane according to the Southern technique.
Une hybridation réalisée dans les conditions décrites di-dessus et utilisant le plasmide pMTO1, ou un plasmide dérivé de celui-ci, marqué par l'acétyl-amino-fluorène permet après immunodétection des hybrides formés d'identifier l'espèce de la mycobactérie comme le montre la figure 3 où l'on distingue 14 fragments pour une souche de M.Hybridization carried out under the conditions described above and using the plasmid pMTO1, or a plasmid derived therefrom, labeled with acetylamino-fluorene allows, after immunodetection of the hybrids formed, to identify the species of the mycobacterium as shown in Figure 3 where there are 14 fragments for a strain of M.
tuberculosis (sillon 1) et seulement 2 fragments pour M. bovis-BCG (sillon 2), alors que l'on ne distingue aucun fragment au niveau du sillon 3 (M. avium) .tuberculosis (furrow 1) and only 2 fragments for M. bovis-BCG (furrow 2), while no fragment can be distinguished at the level of furrow 3 (M. avium).
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. As is apparent from the above, the invention is in no way limited to those of its modes of implementation, embodiment and application which have just been described more explicitly; on the contrary, it embraces all the variants which may come to the mind of the technician in the matter, without departing from the framework, or the scope, of the present invention.
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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