FR2641463A1 - Cosmetic preparations intended for oxygenation of the skin - Google Patents

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Abstract

The invention relates to the use in cosmetology of proteins extracted from the haemolymph of invertebrates, possessing oxygen-transporting properties.

Description

La respiration cellulaire nécessite un apport d'oxygène chez les animaux aquatiques les plus primitifs (Protozoaires,
Coelentérés ...). Ce gaz est prélevé par chaque cellule directement dans l'eau environnante ou par diffusion à travers les cellules voisines. Chez les organismes plus complexes, un certain nombre d'organes sont trop éloignés du milieu extérieur pour pouvoir y puiser directement l'oxygène qui leur est nécessaire.Cellular respiration requires an oxygen supply in the most primitive aquatic animals (Protozoa,
Co-centered ...). This gas is taken up by each cell directly in the surrounding water or by diffusion through the neighboring cells. In more complex organisms, a certain number of organs are too far from the external environment to be able to draw directly from them the oxygen they need.

Ces organismes ont donc développé des systèmes de transport capables de véhiculer ce gaz entre un lieu d'absorption présentant une grande surface d'échanges avec l'extérieur (branchies, poumons) et les cellules des différents organes.These organisms have therefore developed transport systems capable of transporting this gas between a place of absorption having a large area of exchange with the outside (gills, lungs) and the cells of the various organs.

Le système le plus connu est celui des Vertébrés chez qui l'oxygène est véhiculé dans le sang par l'hémoglobine, protéine globulaire d'un poids moléculaire de 64.500 daltons, composée de quatre chaines polypeptidiques contenant chacune un groupement prosthétiques ou hème (protoporphyrine) sur lequel est fixé un atome de fer (Fe II). Cet atome présente une liaison libre perpendiculaire au plan de l'hème, sur laquelle vient se fixer une molécule d'oxygène. Chaque molécule d'hémoglobine peut donc transporter quatre molécules d'oxygène.The best known system is that of Vertebrates in which oxygen is transported in the blood by hemoglobin, globular protein with a molecular weight of 64,500 daltons, composed of four polypeptide chains each containing a prosthetic or heme group (protoporphyrin) on which is fixed an iron atom (Fe II). This atom has a free bond perpendicular to the plane of the heme, on which is fixed an oxygen molecule. Each hemoglobin molecule can therefore carry four oxygen molecules.

Un autre système, fonctionnant selon un principe analogue, s'eut développé chez les Invertébrés les plus évolués tels que les Mollusques et les Arthropodes. Chez, ces derniers le fluide analogue au sang est constitué par llhémolymphe qui contient en solution une protéine jouant le même rôle que l'hémoglobine : 1'hémocyanine. Cependant, tandis que l'hémoglobine des Vertébrés est une protéine de taille moyenne et de structure relativement homogène entre les différentes classes zoologiques, le terme hémocyanine recouvre au contraire un ensemble de protéines de haut poids moléculaire et de structure tres hétérogène.Le seul point commun entre les différentes formes d'hémocyanine réside dans le fait que toutes renferment des atomes de cuivre sur lesquels se fixent l'oxygène. Chez les Arthropodes, les hémocyanines sont composées de sous-unités d'un poids moléculaire d'environ 75.000 daltons chacune, assemblées en hexamètres. Selon son origine, chaque molécule est constituée de 6, 12, 24 ou 48 sous-unités. Chaque sous-unité contient un site de fixation pour l'oxygène comportant 2 atomes de cuivre (Cu II) situés à une distance d'environ 3,7 A l'un de l'autre, et liés à la
Chez les Gastéropodes, la molécule d'hémocyanine a une structure totalement différente.Il s'agit cette fois-ci d'une macromolécule d'un poids moléculaire d'environ 9.000.000 de daltons, ayant la forme d'un cylindre creux de 38 nm de long et de 35 nm de diamètre. Cette molécule est composée de 20 sous-unités d'un poids moléculaire de 450.000 daltons. Chacune de ces sous-unités est elle-même formée de 8 unités fonctionnelles globulaires contenant chacune un site de fixation pour une molécule d'oxygène. Comme chez les Arthropodes, cette fixation est réalisée par l'intermédiaire de deux atomes de cuivre. Les sous-unités élémentaires sont distinctes les unes des autres et leurs poids moléculaires sont compris entre 45.000 et 65.000 daltons.Another system, operating on a similar principle, would have developed in the most advanced Invertebrates such as Molluscs and Arthropods. In the latter, the blood-like fluid consists of the hemolymph which contains in solution a protein playing the same role as hemoglobin: hemocyanin. However, while the vertebrate hemoglobin is a medium-sized protein with a relatively homogeneous structure between the different zoological classes, the term hemocyanin, on the contrary, covers a set of proteins of high molecular weight and very heterogeneous structure. between the different forms of hemocyanin lies in the fact that all of them contain copper atoms on which oxygen is attached. In Arthropods, hemocyanins are composed of subunits with a molecular weight of about 75,000 daltons each, assembled in hexameters. Depending on its origin, each molecule consists of 6, 12, 24 or 48 subunits. Each subunit contains an oxygen binding site comprising 2 copper atoms (Cu II) located at a distance of approximately 3.7 A from each other, and linked to the
In gastropods, the hemocyanin molecule has a completely different structure, this time a macromolecule with a molecular weight of about 9,000,000 daltons, in the shape of a hollow cylinder of 38 nm long and 35 nm in diameter. This molecule is composed of 20 subunits with a molecular weight of 450,000 daltons. Each of these subunits is itself formed of 8 globular functional units each containing a binding site for an oxygen molecule. As in Arthropods, this fixation is carried out by means of two copper atoms. The elementary subunits are distinct from each other and their molecular weights are between 45,000 and 65,000 daltons.

Si la fonction des hémocyanines est la même que celle de l'hémoglobine, on constate donc que leur structure est par contre totalement différente, y compris au niveau des sites de fixation de l'oxygène qui ne contiennent pas d'hume et dans lesquels le fer est remplacé par du cuivre. De plus, tandis qu' une molécule d'hémoglobine ne possède que 4 sites de fixation pour une molécule d'oxygene, une molécule d'hémocyanine en possède entre 6 et 48 chez les Arthropodes et 160 chez les
Gastéropodes.If the function of hemocyanins is the same as that of hemoglobin, it can therefore be seen that their structure is, on the other hand, completely different, including at the level of the oxygen-binding sites which do not contain humus and in which the iron is replaced by copper. In addition, while a hemoglobin molecule has only 4 binding sites for an oxygen molecule, a hemocyanin molecule has between 6 and 48 in Arthropods and 160 in
Gastropods.

Au niveau de la peau, l'apport d'oxygène aux cellules cutanées est réalisé par un fin réseau de capillaires situés dans le derme. I1 est également complété au niveau des cellules épidermiques par un apport direct à partir de l'oxygène atmosphérique qui diffuse à travers le stratum corneum.At the skin level, the oxygen supply to the skin cells is carried out by a fine network of capillaries located in the dermis. It is also supplemented at the epidermal cell level by a direct supply from atmospheric oxygen which diffuses through the stratum corneum.

On pourrait donc penser a priori que ce double flux d'oxygène est largement suffisant pour assurer la respiration des kératinocytes et des fibroblastes.One might therefore think a priori that this double oxygen flow is largely sufficient to ensure the respiration of keratinocytes and fibroblasts.

Toutefois, il est apparu de façon tout à fait inattendue au cours d'essais systématiques que l'application d'hémocyanine de
Gastéropodes à la surface de la peau exerçait une action bénéfique à long terme. Plus précisément, une étude a été réalisée sur des sujets traités sur une moitié du visage avec une composition contenant 0,04 % d'hémocyanine pure et, sur l'autre moitié, avec l'excipient seul. Cette étude a révélé après 30 jours de traitement un meilleur renouvellement du. However, it appeared quite unexpectedly during systematic testing that the application of hemocyanin from
Gastropods on the surface of the skin had a long-term beneficial effect. More specifically, a study was carried out on subjects treated on one half of the face with a composition containing 0.04% of pure hemocyanin and, on the other half, with the excipient alone. This study revealed after 30 days of treatment better renewal of the.

stratum corneum, une peau plus souple et plus élastique ainsi qu'une diminution des rides du côté traité par rapport au côté témoin n'ayant reçu que l'excipient. L'explication de ces observations n'est pas évidente. On peut penser qu'elle fait intervenir une augmentation de la respiration, et par conséquent du Dbtabolisme des kératinocytes et des fibroblastes due à un apport d'oxygène véhiculé par l'hémocyanine. Toutefois, cette hypothèse doit être nuancée par deux remarques : d'une part, comme nous l'avons mentionné précédemment, les cellules cutanées sont correctement oxygénées dans les conditions physiologiques norrlales, d'autre part, la taille des molécules d'hémocyanine et de leurs sous-unités leur interdit de franchir la barrière constituée par le stratum corneum.Le mode d'action de 1'hiDocyanine est donc probablement complexe et il se peut qu'il fasse intervenir une diffusion progressive, régulée, de l'oxygène à travers le stratum corneum.stratum corneum, softer and more elastic skin as well as a reduction in wrinkles on the treated side compared to the control side having received only the excipient. The explanation for these observations is not obvious. It may be thought that it involves an increase in respiration, and therefore in the Dbtabolism of keratinocytes and fibroblasts due to an oxygen supply carried by the hemocyanin. However, this hypothesis must be qualified by two remarks: on the one hand, as we mentioned previously, the skin cells are correctly oxygenated under normal physiological conditions, on the other hand, the size of the molecules of hemocyanin and of their subunits prevent them from crossing the barrier formed by the stratum corneum. The mode of action of hiDocyanine is therefore probably complex and it may involve a gradual, regulated diffusion of oxygen through the stratum corneum.

Des essais complémentaires ont montré que l'activité cosmétique décrite ci-dessus pouvait être obtenue aussi bien avec les hémocyanines d'Arthropodes qu'avec celles de Mollusques. De même, le fait que les protéines soient sous forme native ou sous forme dénaturée, à l'état de sous-unités libres, n'a pas d'itportance. Les hémocyanines peuvent être employées sous forme pure ou en mélange avec d'autres substances. En particulier, l'activité revendiquée a également été observée avec de l'hèiolymphe brute.Additional tests have shown that the cosmetic activity described above could be obtained both with the hemocyanins of Arthropods and those of Molluscs. Likewise, the fact that the proteins are in native form or in denatured form, in the form of free subunits, is of no importance. Hemocyanins can be used in pure form or as a mixture with other substances. In particular, the claimed activity has also been observed with crude heiymph.

Toutefois, l'activité est plus élevée avec de l'hémocyanine purifiée. Globalement, une activité cosmétique intéressante peut être obtenue avec des concentrations comprises entre 0,004 et 0,4 t d'hémocyanine pure. L'hémocyanine peut être extraite de
Mollusques ou d'Arthropodes. Par exemple, et de façon non limitative, l'extraction et la purification peuvent être réalisées avantageusement sur des animaux appartenant aux classes des Gastéropodes, des Céphalopodes ou des Crustacés au soyen des techniques décrites par HEIRWEGH et al. (Biochim.However, the activity is higher with purified hemocyanin. Overall, an attractive cosmetic activity can be obtained with concentrations of between 0.004 and 0.4 t of pure hemocyanin. Hemocyanin can be extracted from
Molluscs or Arthropods. For example, and without limitation, extraction and purification can be advantageously carried out on animals belonging to the classes of gastropods, cephalopods or crustaceans using the techniques described by HEIRWEGH et al. (Biochim.

Biophys. Acta 1961,- 48:517-526), ELLIOTT et VAN BAELEN (Bull.Biophys. Acta 1961, - 48: 517-526), ELLIOTT and VAN BAELEN (Bull.

Soc. Chia, Biol. 1965, 47:1979-1986), GHIRETTI-MAGALDI et al.Soc. Chia, Biol. 1965, 47: 1979-1986), GHIRETTI-MAGALDI et al.

(Biochemistry 1966, 5:1943-1948), ROCHU et FINE (Comp. Biochem. (Biochemistry 1966, 5: 1943-1948), ROCHU and FINE (Comp. Biochem.

Physiol. 1978, 59A:145-152). Ces méthodes font intervenir une extraction de l'hémolymphe par ponction dans le coeur, l'aorte, 1'héocoele ou le sinus des periopodes, selon les espèces utilisées. L'hémocyanine est ensuite précipitée par le sulfate d'ammonium, ou décantée par ultracentrifugation. Les phases ultérieures de la purification font intervenir des centrifugations différentielles, des chromatographies ou des électrophorèses préparatives. Pour une préparation industrielle, on pourrait avantageusement remplacer ces étapes par des ultrafiltrations et des chromatographies.Physiol. 1978, 59A: 145-152). These methods involve an extraction of the hemolymph by puncture in the heart, the aorta, the heocoele or the sinus of the periopods, according to the species used. The hemocyanin is then precipitated by ammonium sulfate, or decanted by ultracentrifugation. The subsequent stages of purification involve differential centrifugation, chromatography or preparative electrophoresis. For industrial preparation, these steps could advantageously be replaced by ultrafiltration and chromatography.

L'hémocyanine ainsi obtenue peut être utilisée soit sous forme native, soit sous forme dénaturée ou hydrolysée. Cette dernière étape peut être réalisée, par exemple et de façon non limitative, par hydrolyse enzymatique au moyen d'une protéase, par augmentation de la force ionique ou par action d'agents dénaturants tels que le sodium dodécyl sulfate, le mercaptoéthanol, l'urée ...The hemocyanin thus obtained can be used either in native form, or in denatured or hydrolyzed form. This last step can be carried out, for example and without limitation, by enzymatic hydrolysis using a protease, by increasing the ionic strength or by the action of denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate, mercaptoethanol, urea ...

Les préparations cosmétiques contenant l'hémocyanine peuvent être formulées sous n'importe quelle forme classique telle que crèmes, laits, gels, lotions, shampooings. L'hémocyanine peut être introduite dans ces formulations directement en solution dans la phase aqueuse, ou encapsulée dans des vecteurs permettant d'obtenir un relargage lent et progressif de l'hémocyanine ou permettant sa pénétration, au moins partielle, à l'intérieur du stratum corneum. De tels vecteurs peuvent être constitués, de façon non limitative, par des vésicules lipidiques de type liposomes ou par des particules ou des vésicules de polymères naturels ou synthétiques d'un diamètre compris entre 10 nm et 2 mm connus sous les noms de nanoparticules, nanocapsules, microparticules, microcapsules.Cosmetic preparations containing hemocyanin can be formulated in any conventional form such as creams, milks, gels, lotions, shampoos. Hemocyanin can be introduced into these formulations directly in solution in the aqueous phase, or encapsulated in vectors making it possible to obtain a slow and gradual release of the hemocyanin or allowing its penetration, at least partially, inside the stratum corneum. Such vectors can be constituted, without limitation, by lipid vesicles of the liposome type or by particles or vesicles of natural or synthetic polymers with a diameter between 10 nm and 2 mm known under the names of nanoparticles, nanocapsules , microparticles, microcapsules.

L'emploi d'hémocyanine en cosmétologie peut être illustré par les exemples suivants
Crème de jour :
Stéarine 5,00
Stéarate de glycérol ..................... 5,00
Octyl dodecanol ......................... 5,50
Huile de vaseline ........................... 10,00
Eau ...................................... 73,15
Trièthanolamine .......................... 1,00
p-hydroxybenzoate de méthyle ............. 0,20
p-hydroxybenzoate de propyle 0,10
Hémocyanine .............................. 0,05
Crème antirides
Polysorbate 60 ........................... 3,00
Stéarate de sorbitan ................... 2,80
Alcool cétylique ......................... 2,00
Huile de vaseline ......................... 15,00
Eau ...................................... 75,88
Sorbitol ................................. 1,00 p-hydroxybenzoate de méthyle ............. 0,30
Hémolymphe ............................... 0,20
Lait corporel
Polysorbate 60 ............................. 1,50
Alcool oléique ............................. 0,50
Cire d'abeille ............................. 1,50 Myristate d'isopropyle ................... 3,00
Huile de lanoline ........................ 2,00
Eau ...................................... 86,77
Carbopol 940 ............................. 0,20
Trièthanolamine .......................... 0,20
Glycérine ................................ 4,00 p-hydroxybenzoate de méthyle ............. 0,30
Hémocyanine .............................. 0,03 The use of hemocyanin in cosmetology can be illustrated by the following examples
Day cream :
Stearin 5.00
Glycerol stearate ..................... 5.00
Octyl dodecanol ......................... 5.50
Vaseline oil ........................... 10.00
Water ...................................... 73.15
Triethanolamine .......................... 1.00
methyl p-hydroxybenzoate ............. 0.20
propyl p-hydroxybenzoate 0.10
Hemocyanin .............................. 0.05
Anti-wrinkle cream
Polysorbate 60 ........................... 3.00
Sorbitan stearate ................... 2.80
Cetyl alcohol ......................... 2.00
Vaseline oil ......................... 15.00
Water ...................................... 75.88
Sorbitol ................................. 1.00 methyl p-hydroxybenzoate ........ ..... 0.30
Hemolymph ............................... 0.20
Body lotion
Polysorbate 60 ............................. 1.50
Oleic alcohol ............................. 0.50
Beeswax ............................. 1.50 Isopropyl myristate .......... ......... 3.00
Lanolin oil ........................ 2.00
Water ...................................... 86.77
Carbopol 940 ............................. 0.20
Triethanolamine .......................... 0.20
Glycerin ................................ 4.00 methyl p-hydroxybenzoate ......... .... 0.30
Hemocyanin .............................. 0.03

Claims (16)

REVENDICATIONS 1. Préparations cosmétiques caractérisées en ce qu'elles 1. Cosmetic preparations characterized in that they renferment de l'hémocyanine. contain hemocyanin. 2. Préparations cosmétiques selon la revendication 1 2. Cosmetic preparations according to claim 1 caractérisées en ce que l'hémocyanine est introduite à characterized in that hemocyanin is introduced to l'état brut, en solution dans l'hémolymphe. unprocessed, in solution in the hemolymph. 3. Préparations cosmétiques selon la revendication 1 3. Cosmetic preparations according to claim 1 caractérisées en ce que l'hémocyanine est introduite sous characterized in that hemocyanin is introduced under une forme purifiée. a purified form. 4. Préparations cosmétiques selon l'une quelconque des 4. Cosmetic preparations according to any one of revendications 1 à 3, caractérisées en ce que l'hémocyanine Claims 1 to 3, characterized in that hemocyanin est présente sous forme native. is present in native form. 5. Préparations cosmétiques selon l'une quelconque des 5. Cosmetic preparations according to any one of revendications 1 à 3, caractrérisées en ce que l'hémocyanine Claims 1 to 3, characterized in that hemocyanin est présente sous forme dénaturée. is present in denatured form. 6. Préparations cosmétiques selon la revendication 5, 6. Cosmetic preparations according to claim 5, caractérisées en ce que l'Hémocyanine est présente sous characterized in that the hemocyanin is present under forme de sous-unités isolées. form of isolated subunits. 7. Préparations cosmétiques selon l'une quelconque des 7. Cosmetic preparations according to any one of revendications 1 à 6, caractérisées en ce que l'hèmocyanine  Claims 1 to 6, characterized in that the hemocyanin est extraite d'Arthropodes. is extracted from Arthropods. 8. Préparations cosmétiques selon la revendication 7, 8. Cosmetic preparations according to claim 7, caractérisées en ce que l'hémocyanine est extraite de characterized in that hemocyanin is extracted from Crustacés. Shellfish. 9. Préparations cosmétiques selon l'une quelconque des 9. Cosmetic preparations according to any one of revendications 1 à 6, caractérisées en ce que l'hémocyanine claims 1 to 6, characterized in that hemocyanin est extraite de Mollusques. is extracted from Molluscs. 10. Préparations cosmétiques selon la revendication 9,10. Cosmetic preparations according to claim 9, caractérisées en ce que l'hémocyanine est extraite de characterized in that hemocyanin is extracted from Gastéropodes.  Gastropods. 11. Préparations cosmétiques selon la revendication 9,11. Cosmetic preparations according to claim 9, caractérisées en ce que l'hémocyanine est extraite de characterized in that hemocyanin is extracted from Céphalopodes. Cephalopods. 12. Préparations cosmétiques selon l'une quelconque des12. Cosmetic preparations according to any one of revendications 1 à 11, caractérisées en ce que l'hémocyanine claims 1 to 11, characterized in that hemocyanin est introduite à une concentration comprise entre 0,004 et is introduced at a concentration between 0.004 and 0,4 %. 0.4%. 13. Préparations cosmétiques selon l'une quelconque des13. Cosmetic preparations according to any one of revendications 1 à 12, caractérisées en ce qu'elles se Claims 1 to 12, characterized in that they are présentent sous la forme d'une crème, d'un lait, d'un gel are in the form of a cream, milk, gel d'une lotion ou d'un shampooing. a lotion or shampoo. 14. Préparations cosmétiques selon la revendication 13,14. Cosmetic preparations according to claim 13, caractérisées en ce que l'hémocyanine est présente en characterized in that hemocyanin is present in solution dans la phase aqueuse. solution in the aqueous phase. 15. Préparations cosmétiques selon l'une quelconque des15. Cosmetic preparations according to any one of revendications 13 et 14, caractérisées en ce que claims 13 and 14, characterized in that l'hécocyanine est encapsulée dans des vésicules lipidiques hecocyanin is encapsulated in lipid vesicles de type liposomes. liposome type. 16. Préparations cosmétiques selon l'une quelconque des16. Cosmetic preparations according to any one of revendications 13 et 14, caractérisées en ce que claims 13 and 14, characterized in that l'hémocyanine est encapsulée dans des particules ou des hemocyanin is encapsulated in particles or vésicules de polymères synthétiques ou naturels de diamètre vesicles of synthetic or natural polymers of diameter compris entre 10 nm et 2 mm, connus sous le nom de between 10 nm and 2 mm, known as nanoparticules, nanocapsules, microparticules, nanoparticles, nanocapsules, microparticles, microcapsules.  microcapsules.
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