FR2632526A1 - Pharmaceutical composition having an action on the glucose residues of the gp150 glycoprotein - Google Patents
Pharmaceutical composition having an action on the glucose residues of the gp150 glycoprotein Download PDFInfo
- Publication number
- FR2632526A1 FR2632526A1 FR8817142A FR8817142A FR2632526A1 FR 2632526 A1 FR2632526 A1 FR 2632526A1 FR 8817142 A FR8817142 A FR 8817142A FR 8817142 A FR8817142 A FR 8817142A FR 2632526 A1 FR2632526 A1 FR 2632526A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- hiv
- glycoprotein
- cells
- glycoproteins
- proteins
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 title claims abstract description 97
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 title claims abstract description 97
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 title claims abstract description 17
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 title description 6
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 claims abstract description 30
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims abstract description 24
- JDVVGAQPNNXQDW-WCMLQCRESA-N Castanospermine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H]2[C@@H](O)CCN2C[C@H]1O JDVVGAQPNNXQDW-WCMLQCRESA-N 0.000 claims abstract description 19
- JDVVGAQPNNXQDW-TVNFTVLESA-N Castinospermine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]2[C@@H](O)CCN21 JDVVGAQPNNXQDW-TVNFTVLESA-N 0.000 claims abstract description 19
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 16
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims abstract description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 claims description 10
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 claims description 10
- 108010029607 4-nitrophenyl-alpha-glucosidase Proteins 0.000 claims description 3
- 102100025315 Mannosyl-oligosaccharide glucosidase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010050669 glucosidase I Proteins 0.000 claims description 3
- 108010056771 Glucosidases Proteins 0.000 abstract description 7
- 102000004366 Glucosidases Human genes 0.000 abstract description 7
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 137
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 description 137
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 112
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 85
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 84
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 84
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 71
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 56
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 51
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 49
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 38
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 27
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 27
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 25
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 23
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 21
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 20
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 20
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 19
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- YJQCOFNZVFGCAF-UHFFFAOYSA-N Tunicamycin II Natural products O1C(CC(O)C2C(C(O)C(O2)N2C(NC(=O)C=C2)=O)O)C(O)C(O)C(NC(=O)C=CCCCCCCCCC(C)C)C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1NC(C)=O YJQCOFNZVFGCAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 18
- ZHSGGJXRNHWHRS-VIDYELAYSA-N tunicamycin Chemical compound O([C@H]1[C@@H]([C@H]([C@@H](O)[C@@H](CC(O)[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C(NC(=O)C=C2)=O)O)O1)O)NC(=O)/C=C/CC(C)C)[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1NC(C)=O ZHSGGJXRNHWHRS-VIDYELAYSA-N 0.000 description 18
- MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N tunicamycin Natural products CC(C)CCCCCCCCCC=CC(=O)NC1C(O)C(O)C(CC(O)C2OC(C(O)C2O)N3C=CC(=O)NC3=O)OC1OC4OC(CO)C(O)C(O)C4NC(=O)C MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 17
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 17
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 16
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 15
- LXBIFEVIBLOUGU-UHFFFAOYSA-N Deoxymannojirimycin Natural products OCC1NCC(O)C(O)C1O LXBIFEVIBLOUGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 229930191564 Monensin Natural products 0.000 description 14
- GAOZTHIDHYLHMS-UHFFFAOYSA-N Monensin A Natural products O1C(CC)(C2C(CC(O2)C2C(CC(C)C(O)(CO)O2)C)C)CCC1C(O1)(C)CCC21CC(O)C(C)C(C(C)C(OC)C(C)C(O)=O)O2 GAOZTHIDHYLHMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 description 14
- 229960005358 monensin Drugs 0.000 description 14
- GAOZTHIDHYLHMS-KEOBGNEYSA-N monensin A Chemical compound C([C@@](O1)(C)[C@H]2CC[C@@](O2)(CC)[C@H]2[C@H](C[C@@H](O2)[C@@H]2[C@H](C[C@@H](C)[C@](O)(CO)O2)C)C)C[C@@]21C[C@H](O)[C@@H](C)[C@@H]([C@@H](C)[C@@H](OC)[C@H](C)C(O)=O)O2 GAOZTHIDHYLHMS-KEOBGNEYSA-N 0.000 description 14
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 13
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 13
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 13
- 108010054377 Mannosidases Proteins 0.000 description 12
- 102000001696 Mannosidases Human genes 0.000 description 12
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 12
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 12
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 12
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 12
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 12
- LXBIFEVIBLOUGU-JGWLITMVSA-N duvoglustat Chemical compound OC[C@H]1NC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O LXBIFEVIBLOUGU-JGWLITMVSA-N 0.000 description 12
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 101000895926 Streptomyces plicatus Endo-beta-N-acetylglucosaminidase H Proteins 0.000 description 11
- 101800000385 Transmembrane protein Proteins 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 11
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 11
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 10
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 9
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 9
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 8
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 8
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 7
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 7
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 7
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 7
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 7
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 7
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 7
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 6
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 6
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 6
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 6
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 6
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- SUCAFEYLYXXTPF-SSGXUJNVSA-N (1r,2s,3r)-6-bromocyclohex-4-ene-1,2,3-triol Chemical compound O[C@@H]1C=CC(Br)[C@H](O)[C@H]1O SUCAFEYLYXXTPF-SSGXUJNVSA-N 0.000 description 5
- 102100025994 Brefeldin A-inhibited guanine nucleotide-exchange protein 1 Human genes 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 101000900206 Hantaan virus (strain 76-118) Envelopment polyprotein Proteins 0.000 description 5
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 101710127944 Non-structural polyprotein p200 Proteins 0.000 description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 5
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 5
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 5
- MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N beta-D-glucosamine Chemical compound N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N 0.000 description 5
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 5
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 5
- 101150030339 env gene Proteins 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 210000004366 CD4-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 4
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 4
- 150000004676 glycans Polymers 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 229960005566 swainsonine Drugs 0.000 description 4
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 3
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 3
- FLNVBBPBGKOJHN-KKAOYSRWSA-N sivmac Chemical compound O=C([C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O FLNVBBPBGKOJHN-KKAOYSRWSA-N 0.000 description 3
- FXUAIOOAOAVCGD-UHFFFAOYSA-N swainsonine Natural products C1CCC(O)C2C(O)C(O)CN21 FXUAIOOAOAVCGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FXUAIOOAOAVCGD-FKSUSPILSA-N swainsonine Chemical compound C1CC[C@H](O)[C@H]2[C@H](O)[C@H](O)CN21 FXUAIOOAOAVCGD-FKSUSPILSA-N 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- LXBIFEVIBLOUGU-KVTDHHQDSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-(hydroxymethyl)piperidine-3,4,5-triol Chemical compound OC[C@H]1NC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O LXBIFEVIBLOUGU-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 206010001513 AIDS related complex Diseases 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000004656 cell transport Effects 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 2
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 125000000311 mannosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 2
- 238000001466 metabolic labeling Methods 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 210000003935 rough endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LXBIFEVIBLOUGU-FSIIMWSLSA-N 1-Deoxymannojirimycin Natural products OC[C@@H]1NC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O LXBIFEVIBLOUGU-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-FOEKBKJKSA-N 3654-96-4 Chemical compound C[35S]CC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-FOEKBKJKSA-N 0.000 description 1
- SUCAFEYLYXXTPF-UHFFFAOYSA-N 6-bromocyclohex-4-ene-1,2,3-triol Chemical compound OC1C=CC(Br)C(O)C1O SUCAFEYLYXXTPF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BUADUHVXMFJVLH-UHFFFAOYSA-N 7-chloro-3-imidazol-1-yl-2H-1,2,4-benzotriazin-1-ium 1-oxide Chemical compound N1[N+](=O)C2=CC(Cl)=CC=C2N=C1N1C=CN=C1 BUADUHVXMFJVLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 229920001757 Castalin Polymers 0.000 description 1
- 108010087195 Contactin 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100024326 Contactin-1 Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108700010908 HIV-1 proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100034353 Integrase Human genes 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 1
- 108010090665 Mannosyl-Glycoprotein Endo-beta-N-Acetylglucosaminidase Proteins 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000713311 Simian immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 150000003797 alkaloid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 108010078428 env Gene Products Proteins 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000000720 eyelash Anatomy 0.000 description 1
- 150000002303 glucose derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- HAJKHJOABGFIGP-UHFFFAOYSA-N indolizidine Chemical class C1CCCN2CCCC21 HAJKHJOABGFIGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930005307 indolizidine alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000037041 intracellular level Effects 0.000 description 1
- 239000002555 ionophore Substances 0.000 description 1
- 230000000236 ionophoric effect Effects 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002703 mannose derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000002603 mannosidase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 108010083819 mannosyl-oligosaccharide 1,3 - 1,6-alpha-mannosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000020342 negative regulation of protein transport Effects 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 230000036647 reaction Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004217 thyroid hormone receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000721 thyroid hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000003412 trans-golgi network Anatomy 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 230000002477 vacuolizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000028973 vesicle-mediated transport Effects 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
- A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
- A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Description
COMPOSITION PHARMACEUTIQUE ACTIVE SUR LES RESIDUS GLUCOSE
DE LA GLYCOPROTEINE GP 150
Cette demande de brevet est une demande divisionnaire de la demande n 8807817 déposée le .10 juin 1988.PHARMACEUTICAL COMPOSITION ACTIVE ON GLUCOSE RESIDUES
GLYCOPROTEIN GP 150
This patent application is a divisional application of application No. 8807817 filed on June 10, 1988.
L invention est relative à des antigènes précurseurs des glycoprotéines d'enveloppe d'un rétrovirus humain HIV-2 et à des antigènes croisant immuno logiquement avec des anticorps monoclonaux spécifiques reconnaissant les antigènes ci-dessus, précurseurs des glycoprotéines d'enveloppe du rétrovirus HIV-2. The invention relates to antigens that are precursors of the envelope glycoproteins of a human HIV-2 retrovirus and to antigens that immunologically cross with specific monoclonal antibodies recognizing the above antigens, precursors of the envelope glycoproteins of the HIV- retrovirus. 2.
L'invention concerne plus précisément des antigènes présents exclusivement lors de certaines phases de l'évolution in vivo d'une infection due à un rétrovirus humain HIV-2. Ces antigènes sont caractéristiques du processus de formation -et de maturation de la glycoprotéine d'enveloppe de ce rétrovirus, et sont en conséquence impliqués dans le développement et la prolifération du rétrovirus HIV-2 et partant dans la propagation de l'infection. The invention relates more precisely to antigens present exclusively during certain phases of the in vivo evolution of an infection due to a human HIV-2 retrovirus. These antigens are characteristic of the process of formation and maturation of the envelope glycoprotein of this retrovirus, and are consequently involved in the development and proliferation of the HIV-2 retrovirus and therefore in the spread of the infection.
L'invention a également trait à des anticorps reconnaissant ces antigènes, ainsi qu'à des compositions immunogènes contenant ces anticorps. The invention also relates to antibodies recognizing these antigens, as well as to immunogenic compositions containing these antibodies.
L'invention concerne en outre la préparation des antigènes prédédents, aidai que leur utilisation pour le diagnostic d'une infection par un rétrovirus humain HIV-2. The invention further relates to the preparation of the above antigens, as well as their use in the diagnosis of infection by a human HIV-2 retrovirus.
Des agents étiologiques responsables du développement de syndrômes de lymphadénopathies (dont l'abréviation anglaise est' SLA) ou concourant au développement de ces syndromes ou responsables du développement de syndromes d immunodéficience acquise (SIDA) ont été isolés, identifiés et caractérisés. Etiological agents responsible for the development of lymphadenopathy syndromes (whose English abbreviation is 'ALS') or contributing to the development of these syndromes or responsible for the development of acquired immunodeficiency syndromes (AIDS) have been isolated, identified and characterized.
On a désigné par HIV (abréviation anglaise de
Human Immunodéficiency Virus) plusieurs rétrovirus humains susceptibles, dans certaines conditions, de provoquer un SLA éventuellement relayé par un SIDA chez l'homme,
Ainsi un premier virus dénommé LAV-1 ou HIV-1 a été isolé et décrit dans la demande de brevet GB.83/24.800 et une demande EP.84/401.834 du 14/09/84.We designated by HIV (English abbreviation of
Human Immunodeficiency Virus) several human retroviruses capable, under certain conditions, of causing ALS possibly relayed by AIDS in humans,
Thus a first virus called LAV-1 or HIV-1 has been isolated and described in patent application GB.83 / 24.800 and application EP.84 / 401.834 of 09/14/84.
Ce virus a également été décrit par F.Barre Sinoussi et al. dans Science, 220 n' 45-99, 20, pages 868-871,
Des variantes de ce virus HIV-1 désignés par
LAV ELI et LAV MAL, ont également été isolés, caractérisés et décrits dans la demande de brevet EP.84/401 .834. This virus has also been described by F. Barre Sinoussi et al. in Science, 220 n '45-99, 20, pages 868-871,
Variants of this HIV-1 virus designated by
LAV ELI and LAV MAL were also isolated, characterized and described in patent application EP.84 / 401 .834.
L'isolement et la caractérisation de rétrovirus appartenant à une classe distincte et n'ayant qu'uné parenté immunologique réduite avec les précédents, ont été décrits dans la demande de brevet européen n' 87/400.151.4. publiée sous le n' 239.425. Ces rétrovirus qui ont été regroupés sous la désignation
HIV-2, ont été isolés chez plusieurs malades africains présentant des symptômes d'une lymphadénopathie ou d'un
SIDA.The isolation and characterization of retroviruses belonging to a distinct class and having only a reduced immunological kinship with the preceding ones, have been described in European patent application No. 87 / 400,151.4. published under No. 239.425. These retroviruses that have been grouped under the designation
HIV-2, have been isolated from several African patients with symptoms of lymphadenopathy or
AIDS.
L'étude de ces rétrovirus HIV l'isolement et l'analyse de leurs séquences nucléotidiques, ainsi que la caractérisation de leurs protéines antigéniques a permis d'effectuer des études de comparaison entre les différentes souches obtenues au niveau de leur parenté ou au contraire de leur spécicité tant structurales que fonctionnelles. The study of these HIV retroviruses, the isolation and analysis of their nucleotide sequences, as well as the characterization of their antigenic proteins has made it possible to carry out comparative studies between the different strains obtained in terms of their kinship or, conversely, their specificity, both structural and functional.
Ces rétrovirus HIV-1 et HIV-2 ont également été étudiés en comparaison avec un rétrovirus d'origine simienne (désigné par l'abréviation SIV ou STLV-III) et cette étude a permis de montrer une certaine parenté entre les protéines et glycoprotéines du rétrovirus
HIV-2 et de ses variants et celles du rétrovirus SIV. These HIV-1 and HIV-2 retroviruses were also studied in comparison with a retrovirus of simian origin (designated by the abbreviation SIV or STLV-III) and this study made it possible to show a certain relationship between the proteins and glycoproteins of the retrovirus
HIV-2 and its variants and those of the SIV retrovirus.
Une parenté est notamment remarquée au niveau de la protéine d'enveloppe de chacun de ces virus. On a en effet mis en évidence des réactions immunologiques croisées entre la glycoprotéine d'enveloppe du rétrovirus SIV et des anticorps dirigés contre la glycoprotéine d'enveloppe du rétrovirus HIV-2, alors que cette réaction de croisement immunologique ne se produit pas entre le rétrovirus SIV et le rétrovirus HIV-1 ni entre les rétrovirus HIV-1 et RlV-?. A kinship is notably noted in the envelope protein of each of these viruses. We have indeed demonstrated cross immunological reactions between the envelope glycoprotein of the retrovirus SIV and antibodies directed against the envelope glycoprotein of the HIV-2 retrovirus, whereas this immunological cross-reaction reaction does not occur between the retrovirus SIV and the HIV-1 retrovirus nor between the HIV-1 and RlV- retroviruses.
Des résultats concernant la glycoprotéine d'enveloppe du rétrovirus HIV-2 codée par le gène env du génome de ce rétrovirus ont été donnés dans la demande de brevet européen n 87/400.151.4 précitée. Dans cette demande de brevet EP, cette glycoprotéine a été désignée par l'abréviation gp140 par référence à son poids moléculaire d'environ 140.000d. Il était précisé toutefois que le calcul du poids moléculaire était apprécié à + 10%. Dans une demande de brevet France précédente (no 86/03881 publiée sous le n 2.596.063) un précurseur de la gp140 désigné par gap160 (poids moléculaire de 160bd + 10%) avait également été décrit. Results concerning the envelope glycoprotein of the HIV-2 retrovirus encoded by the env gene of the genome of this retrovirus were given in the aforementioned European patent application No. 87 / 400,151.4. In this EP patent application, this glycoprotein has been designated by the abbreviation gp140 by reference to its molecular weight of approximately 140,000 d. It was specified however that the calculation of the molecular weight was appreciated at + 10%. In a previous French patent application (no. 86/03881 published under no. 2.596.063) a precursor of gp140 designated by gap160 (molecular weight of 160bd + 10%) had also been described.
Des investigations plus poussées relatives à la glycoprotéine d'enveloppe du rétrovirus HIV-2 ont été conduites et ont permis aux inventeurs de réaliser d'autres mesures des poids moléculaires donnés jusqu'à présent et en conséquence d'affiner les résultats, à partir des intervalles de poids moléculaires décrits ci-dessus. La glycoprotéine externe d'enveloppe présente, dans les particules virales de HIV-2 - dans les conditions opératoires de la présente invention - un PM d'environ 125000d (elle sera désignée par gp125). Dans ces memes conditions opératoires, le précurseur déjà mis en évidence et désigné par gp160 dans la demande de brevet FR 86/03881 a, selon les derniers résultats obtenus, un poids moléculaire d'environ 140000d. Further investigations relating to the envelope glycoprotein of the HIV-2 retrovirus were carried out and enabled the inventors to carry out other measurements of the molecular weights given so far and consequently to refine the results, starting from molecular weight ranges described above. The outer envelope glycoprotein present, in the HIV-2 viral particles - under the operating conditions of the present invention - a MW of approximately 125000 d (it will be designated by gp125). Under these same operating conditions, the precursor already identified and designated by gp160 in patent application FR 86/03881 has, according to the latest results obtained, a molecular weight of approximately 140000d.
Il sera donc mentionné par "gap140" dans la présente demande de brevet.It will therefore be mentioned by "gap140" in the present patent application.
Dans le cadre de l'invention, les inventeurs ont mis en évidence l'existence de plusieurs phases de développement conduisant à l'obtention de glycoprotéines d'enveloppe sous une forme mature, ces glycoprotéines d'enveloppe matures comprenant une glycoprotéine gp125 et une glycoprotéine gp36. Les inventeurs ont donc identifié différents stades dans le déroulement du cycle de réplication virale apparaissant lorsque des troubles pathogènes se développent à la suite d'une infection par un rétrovirus humain HIV-2. Les inventeurs ont souligné à ce propos l'importance de plusieurs étapes se déroulant dans les cellules infectées par le rétrovirus HIV-2 notamment dans les lymphocytes T4 humains. In the context of the invention, the inventors have demonstrated the existence of several development phases leading to the production of envelope glycoproteins in a mature form, these mature envelope glycoproteins comprising a glycoprotein gp125 and a glycoprotein gp36. The inventors have therefore identified different stages in the course of the cycle of viral replication appearing when pathogenic disorders develop as a result of infection with a human HIV-2 retrovirus. The inventors have stressed in this connection the importance of several stages taking place in cells infected with the HIV-2 retrovirus, in particular in human T4 lymphocytes.
En parallèle, ils ont conduit des études similaires sur les cycles viraux des rétrovirus HIV-1 et
SIV. Ces dernières études ont révélé des propriétés très spécifiques communes aux rétrovirus HIV-2 et SIV et au contraire apparemment inexistentes lors du cycle de réplication virale de HIV-1.In parallel, they conducted similar studies on the viral cycles of the HIV-1 retroviruses and
IF V. These latest studies have revealed very specific properties common to HIV-2 and SIV retroviruses and, on the contrary, apparently nonexistent during the HIV-1 viral replication cycle.
L'invention fournit donc de nouveaux moyens pour détecter une infection spécifiquement attribuable à un rétrovirus humain HIV-2. The invention therefore provides new means for detecting an infection specifically attributable to a human HIV-2 retrovirus.
Au vu des derniers résultats obtenus, le cycle viral propre aux rétrovirus HIV-2 et SIV apparait comme un processus complexe de réactions en chaîne dont l'ensemble seul pourrait conduire à la formation de la glycoprotéine externe présente dans l'enveloppe du rétrovirus HIV-2 sous sa forme définitive. Lors de ce processus, différents précurseurs antigéniques ont pu être reconnus, isolés et identifiés. Tous possèdent notamment une parenté structurale fondée sur l'ossature peptidique de la glycoprotéine d'enveloppe codée par le gène env du rétrovirus HIV-2 décrit dans la demande de brevet EP. In view of the latest results obtained, the viral cycle specific to HIV-2 and SIV retroviruses appears to be a complex process of chain reactions the whole of which could lead to the formation of the external glycoprotein present in the envelope of the HIV- 2 in its final form. During this process, various antigenic precursors could be recognized, isolated and identified. All of them have in particular a structural relationship based on the peptide framework of the envelope glycoprotein encoded by the env gene of the HIV-2 retrovirus described in the patent application EP.
précitée. cited above.
L'invention est donc relative à des protéines ou à des glycoprotéines produites à la suite d'une infection par un rétrovirus humain HIV-2 lors des différentes étapes du cycle de formation et de maturation de la glycoprotéine externe d'enveloppe gp125 de
HIV-2, ayant en commun l'ossature peptidique de la glycoprotéine externe d'enveloppe du rétrovirus humain
HIV-2 ou d'une glycoprotéine présentant une réaction immunologique croisée avec la susdite gp125 et diffèrant au niveau de la présence et/ou de la composition des chaines d'oligosaccharides éventuelles.The invention therefore relates to proteins or glycoproteins produced following an infection with a human HIV-2 retrovirus during the various stages of the formation and maturation cycle of the external envelope glycoprotein gp125 of
HIV-2, having in common the peptide backbone of the outer envelope glycoprotein of the human retrovirus
HIV-2 or a glycoprotein exhibiting a cross-immunological reaction with the abovementioned gp125 and differing in terms of the presence and / or of the composition of the possible oligosaccharide chains.
Les caractéristiques spécifiques des protéines et glycoprotéines de l'invention sont acquises lors de chaque étape indispensable à la formation et à la maturation de la glycoprotéine externe d'enveloppe mature du rétrovirus humain HIV-2. The specific characteristics of the proteins and glycoproteins of the invention are acquired during each step essential for the formation and maturation of the external glycoprotein of mature envelope of the human retrovirus HIV-2.
Grâce à l'étude du cycle viral, les inventeurs ont suggéré la possibilité d'intervenir lors d'étapes particulières de la formation des glycoprotéines d'enveloppe mature du rétrovirus humain HIV-2, donnant ainsi des moyens pour interrompre le déroulement normal du cycle viral et remédier à la propagation du rétrovirus infectieux pour l'homme et pathogène dans certaines conditions. Thanks to the study of the viral cycle, the inventors have suggested the possibility of intervening during particular stages of the formation of glycoproteins of mature envelope of the human retrovirus HIV-2, thus giving means to interrupt the normal course of the cycle. viral and remedy the spread of the infectious retrovirus for humans and pathogens under certain conditions.
En accord avec ce qui précède, l'invention concerne une protéine gp300 antigénique caractérisée par: - un poids moléculaire (PM) d'environ 300Kd, - l'association de deux unités d'une glycoprotéine gp140 précurseur notamment de la glycoprotéine d'enveloppe gp125 codée par le gène env du génome d'un-rétrovirus humain HIV-2 susceptible de provoquer un SLA ou un SIDA, ou la protéine d'un rétrovirus qui croise immunologiquement avec des anticorps dirigés contre ladite protéine gp300 du rétrovirus HIV-2. In accordance with the above, the invention relates to an antigenic gp300 protein characterized by: - a molecular weight (MW) of approximately 300Kd, - the association of two units of a gp140 glycoprotein precursor, in particular of the envelope glycoprotein gp125 encoded by the env gene of the genome of a human HIV-2 retrovirus capable of causing ALS or AIDS, or the protein of a retrovirus which crosses immunologically with antibodies directed against said protein gp300 of the HIV-2 retrovirus.
Il est remarqué que le précurseur gp140 est également le précurseur de la gp36 de HIV-2. Les inven- teurs ont constaté que l'association précitée des deux unités de gp140 est une propriété intrinsèque de leur ossature peptidique. It is noted that the precursor gp140 is also the precursor of the gp36 of HIV-2. The inventors have found that the above-mentioned association of the two units of gp140 is an intrinsic property of their peptide framework.
La protéine antigénique gp300 est encore caractérisée par les propriétés suivantes - elle est présente dans les cellules d'un échantillon biologique d'un malade infecté par un rétrovirus de la famille de HIV-2, notamment dans les lymphocytes T4 humains ou dans des lignées permanentes dérivées de ces lymphocytes T4, - son point isoélectrique (pi) est obtenu pour un pH appartenant à l'intervalle [6,8 - 7,8], - elle est glycosylée par des chaînes oligosaccharidiques liées à l'azote, - elle est stable dans les détergents ioniques, notamment le SDS 1%, dans les détergents non-ioniques, notamment le Triton X-100 25, dans l'urée 4M, dans les sels forts et les agents réducteurs, - elle se dissocie spontanément in vitro en deux glycoprotéines d'un poids moléculaire d'environ 140Kd entre pH 4-5, - après isolement et purification sur gel d'électrophorèse, elle se dissocie dans un tampon acétate in vitro en deux glycoprotéines d'un poids moléculaire d'environ 140Kd pour des valeurs du pH égales ou inférieures à 6, - elle présente une bande d'électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS 7,5E en présence d'urée 6M, correspondant à un poids moléculaire de 300Kd après purification sur colonne d'immunoaffinité en présence d'anticorps spécifiques obtenus à partir du sérum d'un patient infecté par le rétrovirus humain HIV-2. The gp300 antigenic protein is further characterized by the following properties - it is present in the cells of a biological sample from a patient infected with a retrovirus of the HIV-2 family, in particular in human T4 lymphocytes or in permanent lines. derived from these T4 lymphocytes, - its isoelectric point (pi) is obtained for a pH belonging to the interval [6.8 - 7.8], - it is glycosylated by oligosaccharide chains linked to nitrogen, - it is stable in ionic detergents, in particular SDS 1%, in non-ionic detergents, in particular Triton X-100 25, in 4M urea, in strong salts and reducing agents, - it dissociates spontaneously in vitro in two glycoproteins with a molecular weight of approximately 140Kd between pH 4-5, - after isolation and purification on electrophoresis gel, it dissociates in an acetate buffer in vitro into two glycoproteins with a molecular weight of approximately 140Kd for equal pH values or less than 6, - it has an electrophoresis band on SDS 7.5E polyacrylamide gel in the presence of 6M urea, corresponding to a molecular weight of 300Kd after purification on an immunoaffinity column in the presence of specific antibodies obtained from serum from a patient infected with the human retrovirus HIV-2.
Les inventeurs ont remarqué que la formation du dimère consistant en la gp300 est une étape transitoire du cycle viral et vraisemblablement nécessaire à la maturation des glycoprotéines d'enveloppe du rétrovirus HIV-2. En effet, la protéine antigénique gp300 ci-dessus est caractérisêe en ce qu'elle n'est apparemment pas révélée par analyse en électrophorèse d'un milieu biologique constitué de particules virales présentes dans le milieu de culture spécifique des cellules infectées par le rétrovirus HIV-2 après marquage avec de la 35S-méthionine (200pCi/ml ; 4 x 106 cellules /ml) pendant 18 heures et purification des extraits obtenus, contenant les cellules infectées et leur milieu de culture correspondant, alors qu'elle est révélée dans les mêmes conditions dans les susdites cellules infectées. The inventors have noticed that the formation of the dimer consisting of gp300 is a transient step in the viral cycle and probably necessary for the maturation of the envelope glycoproteins of the HIV-2 retrovirus. Indeed, the antigenic protein gp300 above is characterized in that it is apparently not revealed by electrophoresis analysis of a biological medium consisting of viral particles present in the specific culture medium of cells infected with the HIV retrovirus -2 after labeling with 35S-methionine (200pCi / ml; 4 x 10 6 cells / ml) for 18 hours and purification of the extracts obtained, containing the infected cells and their corresponding culture medium, while it is revealed in the same conditions in the above infected cells.
Ceci les a amenés à considérer la gp300 comme un précurseur transitoire spécifique des glycoprotéines d'enveloppe finales. Cette -propriété du cycle viral du rétrovirus HIV-2 résultant dans l'obtention d'une protéine gp300, est originale et inhabituelle par rapport aux connaissances acquises sur les mécanismes généraux de formation de glycoprotéines contenant des chaines de glycosylation oligosaccharidiques liées sur 1' azote,
Par ailleurs, les inventeurs ont remarqué de façon tout à fait intéressante que la formation et la maturation des glycoprotéines d'enveloppe du rétrovirus SIVmaC fait également intervenir une étape de dimérisation conduisant à l'obtention d'une glycoprotéine du type de la gp300 précisément caractérisée pour HIV-2.Au contraire, l'observation parallèle du cycle viral du rétrovirus humain HIV-1 n'a permis de constater aucune étape de dimérisation résultant dans la formation d'une glycoprotéine apparentée à la gp300.This led them to consider gp300 as a specific transient precursor of the final envelope glycoproteins. This -property of the viral cycle of the HIV-2 retrovirus resulting in obtaining a protein gp300, is original and unusual compared to the knowledge acquired on the general mechanisms of formation of glycoproteins containing oligosaccharide glycosylation chains linked on nitrogen. ,
Furthermore, the inventors have remarked in an entirely interesting manner that the formation and maturation of the envelope glycoproteins of the SIVmaC retrovirus also involves a dimerization step leading to the production of a glycoprotein of the gp300 type, precisely characterized. On the contrary, the parallel observation of the viral cycle of the human retrovirus HIV-1 did not make it possible to note any step of dimerization resulting in the formation of a glycoprotein related to gp300.
Ces résultats indiquent de façon tout à fait surprenante que la formation d'un doublet (ou dimère) à partir du précurseur gp140 de la glycoprotéine de l'enveloppe du rétrovirus HIV-2 est une propriété spécifique de l'expression du gène env des rétrovirus HIV-2 et SIV. These results quite surprisingly indicate that the formation of a doublet (or dimer) from the gp140 precursor of the HIV-2 retrovirus envelope glycoprotein is a specific property of the expression of the retrovirus env gene. HIV-2 and SIV.
Cette constatation peut être mise à profit dans la recherche et le développement de moyens pour le diagnostic sélectif d'une infection due à un rétrovirus
HIV-2 capable de provoquer un SLA ou un SIDA dans certaines conditions. On reviendra dans la suite sur ces moyens de diagnostic appropriés.This observation can be used in research and development of means for the selective diagnosis of an infection due to a retrovirus.
HIV-2 capable of causing ALS or AIDS under certain conditions. We will come back to these appropriate diagnostic means in the following.
L'invention concerne également une protéine présentant des caractéristiques identiques à celles de la gp300 au niveau de l'ossature peptidique caractérisée en ce qu'elle est sous forme non glycosylée et en ce que son poids moléculaire est d'environ 200Kd. The invention also relates to a protein having characteristics identical to those of gp300 at the level of the peptide framework, characterized in that it is in non-glycosylated form and in that its molecular weight is approximately 200Kd.
Cette protéine p200 sur laquelle on reviendra au cours des exemples qui suivent a été mise en évidence lors d'une expérience de digestion avec l'endo-ss-N- acétylglucosaminidase H (désignée encore par "endoHN). This p200 protein, to which we will return in the examples which follow, was demonstrated during a digestion experiment with endo-ss-N-acetylglucosaminidase H (also designated by "endoHN).
Cette protéine qui représente la forme non glycosylée de la gp300 pourrait avoir un intérêt particulier du fait de l'existence éventuelle d'un épitope commun à la gp300 et à la p200, qui s'avèrerait peu antigénique dans la gp300 du fait de la présence de chaines oligosaccharidiques importantes pour la conformation finale de la gp300 mais néanmoins gênante pour l'accessibilité à un épitope intéressant.This protein which represents the non-glycosylated form of gp300 could be of particular interest because of the possible existence of an epitope common to gp300 and to p200, which would prove to be not very antigenic in gp300 because of the presence of oligosaccharide chains important for the final conformation of gp300 but nevertheless troublesome for the accessibility to an interesting epitope.
Lors de l'étude du cycle viral, une autre glycoprotéine a été détectée ; il s'agit d'une glycoprotéine purifiée gp150, caractérisée en ce qu'elle est détectée in vitro (uniquement dans des cellules d'un patient infecté par un rétrovirus humain du type HIV-2) après marquage de ces cellules avec un traceur radioactif ajoute pendant une brève période, en présence d'un inhibiteur - des enzymes glucosdases, notamment la castanospermine-, puis élimination de ce traceur radioactif par lavage et remplacement par des molécules non radioactives préalablement à une étape de détermination de la radioactivité sur des échantillons prélevés à différents intervalles de temps, étape qui permet de répérer ce traceur dans les protéines et glycoprotéines formées après ledit marquage.L'observation de la gp150 est réalisée après un temps égal ou voisin de celui nécessaire à la détection de la gp300. During the viral cycle study, another glycoprotein was detected; it is a purified glycoprotein gp150, characterized in that it is detected in vitro (only in cells of a patient infected with a human retrovirus of the HIV-2 type) after labeling of these cells with a radioactive tracer adds for a brief period, in the presence of an inhibitor - glucosdase enzymes, in particular castanospermine-, then elimination of this radioactive tracer by washing and replacement with non-radioactive molecules prior to a step of determining the radioactivity on samples taken at different time intervals, a step which makes it possible to locate this tracer in the proteins and glycoproteins formed after said labeling. The observation of gp150 is carried out after a time equal to or close to that necessary for the detection of gp300.
La glycoprotéine gp150 est encore caractérisée par - un poids moléculaire d'environ 150Kd, - l'ossature peptidique du précurseur de la glycoprotéine d'enveloppe gap125, codée par le gène env au génome d'un rétrovirus humain HIV-2 ou d'un rétrovirus dont la glycoprotéine externe d'enveloppe est reconnue par les anticorps d'un sérum de patient infecté par ledit rétrovirus HIV-2, notamment les anticorps dirigés contre la gp125, - des résidus glucose terminaux sur une chaine d'oligosaccharides. The gp150 glycoprotein is further characterized by - a molecular weight of approximately 150Kd, - the peptide backbone of the gap125 envelope glycoprotein precursor, encoded by the env gene to the genome of a human HIV-2 retrovirus or of a retrovirus whose outer envelope glycoprotein is recognized by the antibodies of a serum of a patient infected with said HIV-2 retrovirus, in particular the antibodies directed against gp125, - terminal glucose residues on a chain of oligosaccharides.
Les protéines et glycoprotéines précédemment décrites et- de préférence la gp300, se sont avérées avantageuses pour l'utilisation dans des compositions antigéniques pour le diagnostic de la présence d'anticorps dans les cellules d'un échantillon biologique d'un patient infecté par un rétrovirus humain du type
HIV-2, ces compositions étant caractérisées en ce qu'elles comprennent une protéine ou une glycoprotéine antigénique définie plus haut;
Ces compositions sont particulièrement intéressantes dans la mesure où elles permettent la formation de complexes immunologiques du type antigèneanticorps avec des anticorps du sérum d'un patient infecté par un rétrovirus HIV-2.En conséquence ces compositions et/ou les antigènes qu'elles contiennent seraient avantageusement mises en oeuvre pour effectuer le diagnostic spécifique d'une infection due à un rétrovirus du type HIV-2.The proteins and glycoproteins previously described, and preferably gp300, have proved advantageous for use in antigenic compositions for the diagnosis of the presence of antibodies in the cells of a biological sample from a patient infected with a retrovirus. human type
HIV-2, these compositions being characterized in that they comprise an antigenic protein or glycoprotein defined above;
These compositions are particularly advantageous insofar as they allow the formation of immunological complexes of the antigen-antibody type with antibodies from the serum of a patient infected with an HIV-2 retrovirus. Consequently these compositions and / or the antigens which they contain would be advantageously used to make the specific diagnosis of an infection due to a retrovirus of the HIV-2 type.
En outre, l'invention se rapporte à des anticorps monoclonaux caractérisés en ce qu'ils reconnaissent la gp300 définie dans les pages précédentes et en ce qu'ils ne reconnaissent pas la glycoprotéine d'enveloppe gp125 mature et la gp36 mature. In addition, the invention relates to monoclonal antibodies characterized in that they recognize the gp300 defined in the preceding pages and in that they do not recognize the mature envelope glycoprotein gp125 and the mature gp36.
D'autres anticorps monoclonaux sont caractérisés en ce qu'ils reconnaissent un épitope qui, dans la gp300 ci-dessus, est exposé et accessible à l'anticorps cet épitope étant, cependant, soit non-exposé, soit masqué dans les gp125 et gp36 matures dans leur conformation naturelle. Other monoclonal antibodies are characterized in that they recognize an epitope which, in the gp300 above, is exposed and accessible to the antibody, this epitope being, however, either unexposed or masked in gp125 and gp36 mature in their natural conformation.
De tels anticorps monoclonaux peuvent aussi être neutralisants, notamment en empêchant la fixation du rétrovirus HIV-2 sur son récepteur, en particulier sur le récepteur T4 des lymphocytes humains qui le comportent. Such monoclonal antibodies can also be neutralizing, in particular by preventing the binding of the HIV-2 retrovirus to its receptor, in particular to the T4 receptor of human lymphocytes which contain it.
D'autres anticorps monoclonaux intéressants dans le cadre de l'invention reconnaissent la p200 définie ci-dessus et ne reconnaissent pas les glycoprotéines gp125 et gp36 matures. Other monoclonal antibodies of interest in the context of the invention recognize the p200 defined above and do not recognize the mature gp125 and gp36 glycoproteins.
D'autres anticorps monoclonaux sont caractérisés, en ce qu'ils reconnaissent un épitope dans la p200, cet épitope étant cependant soit non-exposé, soit masqué sur la gp125 et la gp36 et/ou sur la gp300 telles qu'obtenues dans leurs conformations naturelles. Other monoclonal antibodies are characterized in that they recognize an epitope in p200, this epitope being however either unexposed, or masked on gp125 and gp36 and / or on gp300 as obtained in their conformations natural.
Les anticorps monoclonaux ci-dessus peuvent avoir des propriétés immunogènes et neutralisantes, et interrompre la prolifération du rétrovirus HIV-2. The above monoclonal antibodies can have immunogenic and neutralizing properties, and can stop the proliferation of the HIV-2 retrovirus.
Plusieurs méthodes pour la production des anticorps précédents peuvent convenir dans-le cadre de la réalisation de l'invention. Par exemple, on aura recours à des cultures en ascite .chez les animaux, notamment chez les rongeurs comme le murin. On pourra également produire les anticorps-à partir de cultures cellulaires soit - immobilisées ou encapsulées ou encore en suspension. On utilisera notamment la technique des hybridomes~ obtenus à partir de la fusion de lymphocytes d'un animal auquel on aura préalablement inoculé lerétrovirus HIV-2. Des lymphocytes de l'animal infecté sont alors prélevés et fusionnés avec des cellules myclomateuses choisies, pour former des hybrides sélectionnés ensuite pour leur capacité à produire des anticorps spécifiques dirigés contre les protéines et glycoprotéines antigéniques décrites plus haut. Several methods for the production of the above antibodies may be suitable in the context of carrying out the invention. For example, ascites cultures will be used in animals, especially in rodents such as murine. Antibodies can also be produced from cell cultures either - immobilized or encapsulated or even in suspension. We will use in particular the technique of hybridomas ~ obtained from the fusion of lymphocytes from an animal which has previously been inoculated with HIV-2 leretrovirus. Lymphocytes from the infected animal are then removed and fused with selected myclomatous cells, to form hybrids then selected for their ability to produce specific antibodies directed against the antigenic proteins and glycoproteins described above.
Ces anticorps monoclonaux produits seront par exemple utilisés pour inactiver les protéines et/ou glycoprotéines avec lesquelles ils forment un complexe immunologique ou encore pour leur capacité à empêcher le déroulement normal de la formation des glycoprotéines finales de~l'enveloppe de HIV-2. De plus, étant donné la parenté de l'ossature peptidique des protéines et glycoprotéines de l'invention, les anticorps- monoclonaux formés contre ces glycoprotéines, notamment contre la gp300, la p200 pourraient s'avérer efficaces contre la gp125. These monoclonal antibodies produced will, for example, be used to inactivate the proteins and / or glycoproteins with which they form an immunological complex or else for their capacity to prevent the normal course of the formation of the final glycoproteins of the ~ HIV-2 envelope. In addition, given the kinship of the peptide backbone of the proteins and glycoproteins of the invention, the monoclonal antibodies formed against these glycoproteins, in particular against gp300, p200 could prove to be effective against gp125.
Une autre asplication éventuelle de ces anticorps consisterait par exemple dans la détection d'antigènes viraux dans des préparations biologiques ou encore dans la purification de protéines et/ou glycoprotéines par exemple sur colonne d'affinité. Another possible application of these antibodies would consist, for example, in the detection of viral antigens in biological preparations or in the purification of proteins and / or glycoproteins, for example on an affinity column.
D'une façon générale, l'invention n'est pas limitée à des glycoprotéines et protéines telles que décrites précédemment lorsqu'elles sont obtenues à partir du seul rétrovirus humain HIV-2. Elle englobe au contraire des protéines et glycoprotéines présentant des propriétés antigéniques, immunologiques, voire immunogènes en commun avec les protéines et glycoprotéines ci-dessus décrites, ces protéines et glycoprotéines pouvant alors être définies par exemple par leur capacité à être reconnues par des anticorps dirigés spécifiquement contre les protéines correspondantes caractéristiques du rétrovirus HIV-2. In general, the invention is not limited to glycoproteins and proteins as described above when they are obtained from the only human retrovirus HIV-2. On the contrary, it includes proteins and glycoproteins having antigenic, immunological or even immunogenic properties in common with the proteins and glycoproteins described above, these proteins and glycoproteins can then be defined for example by their ability to be recognized by antibodies directed specifically against the corresponding proteins characteristic of the HIV-2 retrovirus.
Cette remarque s'applique par exemple aux glycoprotéines gp300 et autres précurseurs de la glycoprotéine externe d'enveloppe d'un rétrovirus SIVmac dont le cycle viral étudié par les inventeurs a montré des propriétés communes avec les protéines et glycoprotéines précitées du rétrovirus humain HIV-2. This remark applies for example to the gp300 glycoproteins and other precursors of the external envelope glycoprotein of an SIVmac retrovirus whose viral cycle studied by the inventors has shown properties common with the abovementioned proteins and glycoproteins of the human retrovirus HIV-2. .
L'invention est également relative à une composition immunogene contenant une glycoprotéine gp300 telle que définie ci-dessus en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable approprié pour la préparation de vaccins. The invention also relates to an immunogenic composition containing a gp300 glycoprotein as defined above in combination with a pharmaceutically acceptable vehicle suitable for the preparation of vaccines.
Une composition immunogène ainsi formée est dosée en protéines et/ou glycoprotéines antigéniques de façon à permettre l'administration d'une dose de 10 à 100pg par kilogramme. An immunogenic composition thus formed is dosed with antigenic proteins and / or glycoproteins so as to allow the administration of a dose of 10 to 100 μg per kilogram.
L'invention concerne encore un procédé de préparation de la glycoprotéine antigénique gp300 caractérisé par les étapes suivantes - lyse de cellules infectées par un rétrovirus humain
HIV-2 et séparation du surnageant et de 1' extrait cellulaire, - incubation de l'extrait cellulaire et/ou du surnageant sur une colonne d'immunoaffinité, sur laquelle' est déposé un immunoadsorbant renfermant des anticorps purifiés, tels qu'obtenus à partir du sérum d'un malade infecté par le rétrovirus humain HIV-2, fixés sur un support adapté, en présence d'un tampon et pendant un temps suffisamment long pour obtenir la formation d'un complexe immunologique antigène-anticorps, - lavage de la colonne avec un tampon pour éliminer les molécules non retenues, - résolution des protéines retenues par électrophorèsé et par électroélution, - récupération des protéines antigéniques recherchées.The invention also relates to a method for preparing the antigenic glycoprotein gp300 characterized by the following steps - lysis of cells infected with a human retrovirus
HIV-2 and separation of the supernatant and the cell extract, - incubation of the cell extract and / or of the supernatant on an immunoaffinity column, on which is deposited an immunoadsorbent containing purified antibodies, such as obtained at from the serum of a patient infected with the human retrovirus HIV-2, fixed on a suitable support, in the presence of a buffer and for a time long enough to obtain the formation of an immunological antigen-antibody complex, - washing of the column with a buffer to remove the molecules not retained, - resolution of the proteins retained by electrophoresis and by electroelution, - recovery of the antigenic proteins sought.
Les cellules infectées auront pu être prélevées chez un patient infecté par un rétrovirus
HIV-2. Elles auront également pu être obtenues in vitro à partir d'une culture de cellules infectées par HIV-2.Infected cells could have been removed from a patient infected with a retrovirus
HIV-2. They could also have been obtained in vitro from a culture of cells infected with HIV-2.
De telles cultures cellulaires peuvent être réalisées sur des lignées CEM.Such cell cultures can be carried out on CEM lines.
Un autre procédé pour la préparation de cette glycoprotéine est obtenu par analogie avec le précédent l'étape d'électroêlution étant cependant remplacée par les etapes suivantes - élution des protéines fixées sur la colonne d'immunoaffinité ci-dessus, - purification des produits ainsi élués sur une colonne de chromatographie contenant, fixés sur le support de séparation des anticorps monoclonaux dirigés contre la gp300,
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention la lyse des cellules infectées est réalisée dans une solution détergente, les anticorps compris dans l'immunoadsorbant sont fixés sur des billes d'agarose et on opère en présence d'un tampon d'accrochage.Another process for the preparation of this glycoprotein is obtained by analogy with the previous electroelution step, however being replaced by the following steps - elution of the proteins fixed on the immunoaffinity column above, - purification of the products thus eluted on a chromatography column containing, fixed to the separation support for the monoclonal antibodies directed against gp300,
In a particular embodiment of the invention, the lysis of the infected cells is carried out in a detergent solution, the antibodies included in the immunoadsorbent are fixed on agarose beads and the operation is carried out in the presence of an attachment buffer.
L'invention vise également un procédé pour le diagnostic de la présence d'anticorps dans les cellules d'un échantillon biologique d'un patient, en vue de vé- rifier une infection éventuelle par le rétrovirus humain HIV-2, caractérisé par - la mise en contact de cet échantillon biologique avec un antigène décrit ci-dessus, ou une composition antigénique de l'invention, dans des conditions autorisant la formation d'un complexe immunologique du type antigène-anticorps. The invention also relates to a method for diagnosing the presence of antibodies in the cells of a biological sample from a patient, with a view to checking for possible infection with the human retrovirus HIV-2, characterized by - the bringing this biological sample into contact with an antigen described above, or an antigenic composition of the invention, under conditions allowing the formation of an immunological complex of the antigen-antibody type.
- la détection du complexe antigène-anticorps formé.- detection of the antigen-antibody complex formed.
L'échantillon biologique sur lequel est effectué le diagnostic peut être un fluide biologique, notamment un sérum, un extrait de tissu biologique, dès lors qu'il est susceptible de contenir des cellules infectées par le rétrovirus HIV-2. The biological sample on which the diagnosis is carried out can be a biological fluid, in particular a serum, an extract of biological tissue, as soon as it is capable of containing cells infected with the HIV-2 retrovirus.
Un tel procédé peut être d'une mise en oeuvre particulièrement intéressante dans la mesure où il permettrait de détecter d'une façon précoce une- infection due à un rétrovirus humain HIV-2 ou à un rétrovirus apparenté, dès lors que les inventeurs ont mis en évidence l'apparition de la gp300 à un stade précoce du cyle de réplication virale du rétrovirus responsable de l'infection. Such a method can be of particularly advantageous implementation insofar as it would allow an early detection of an infection due to a human retrovirus HIV-2 or to a related retrovirus, since the inventors have put evidence of the appearance of gp300 at an early stage of the viral replication cycle of the retrovirus responsible for the infection.
Pour la mise en oeuvre du procédé de diagnostic précédent, les inventeurs ont conçu un nécessaire ou kit pour la détection d'anticorps dans les cellules d'un échantillon biologique d'un patient susceptible d'être infecté par un rétrovirus humain HIV-2, caractérisé en ce qu'il comprend - au moins une protéine et/ou une glycoprotéine antigénique précédemment décrite ou
- une composition élaborée à partir de ces composants, ou encore un mélange de ces différents constituants et - des moyens permettant la réaction de formation du complexe immunologique entre les antigènes ci-dessus et les anticorps éventuellement présents dans l'échantillon biologique à tester, notamment si besoin un ou plusieurs tampons d'incubation, - un échantillon de contrôle négatif, - des moyens pour la révélation du complexe antigèneanticorps formé.For the implementation of the above diagnostic method, the inventors designed a kit or kit for the detection of antibodies in the cells of a biological sample from a patient likely to be infected with a human HIV-2 retrovirus, characterized in that it comprises - at least one protein and / or an antigenic glycoprotein previously described or
- a composition made from these components, or a mixture of these various constituents and - means allowing the reaction for the formation of the immunological complex between the above antigens and the antibodies possibly present in the biological sample to be tested, in particular if necessary one or more incubation buffers, - a negative control sample, - means for revealing the antigen-antibody complex formed.
Ayant maintenant déterminé les différentes étapes de la formation du rétrovirus infectieux HIV-2, ainsi que l'importance de certaines d'entre elles dans le développement de l'infection, les inventeurs ont suggéré l'élaboration d'une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un inhibiteur des glucosidases I et/ou Il, notamment la castanospermine ou la deoxyjirimicyne, ou un mélange de ces inhibiteurs en une dose suffisante pour bloquer l'élimination des résidus glucose terminaux des chaînes oligosaccharidiques de la glycoprotéine gp150 lors du cycle viral, en association avec un excipient physiologiquement acceptable. Having now determined the different stages of the formation of the infectious retrovirus HIV-2, as well as the importance of some of them in the development of the infection, the inventors have suggested the development of a pharmaceutical composition characterized in that it comprises at least one glucosidase I and / or II inhibitor, in particular castanospermine or deoxyjirimicyne, or a mixture of these inhibitors in a dose sufficient to block the elimination of terminal glucose residues from the oligosaccharide chains of the gp150 glycoprotein during of the viral cycle, in association with a physiologically acceptable excipient.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent ainsi que dans les figures dont la légende est donnée ci-après
La figure 1 composée des figures 1A'et lB représente les glycoprotéines d'enveloppe de HIV-2 - Figure 1A : Comparaison des Protéines de haut Poids moléculaire de HIV-1 et HIV-2.Other characteristics and advantages of the invention will appear on reading the examples which follow as well as in the figures, the legend of which is given below.
Figure 1 composed of Figures 1A 'and 1B represents the envelope glycoproteins of HIV-2 - Figure 1A: Comparison of high molecular weight proteins of HIV-1 and HIV-2.
Des cellules CEM infectées avec HIV-1 ou HIV-2 ont été- marquées avec la 35S-méthionine (200pCilml 4 x 106 cellules/ml) pendant 18 heures. Des extraits de cellules infectées (CELL) et leur milieu de culture correspondant (SN) ont -été purifiés sur des colonnes d'immunoaffinité spécifiques : colonne HIV-1 sérum
Sépharose, spécifique des protéines de HIV-1 (Krust et al.,1988) et colonne.^HIV-2 sérum-Sépharose, spécifique des protéines de HIV-2 (voir "procédures expérimentales"). Les protéines purifiées ont été analysées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS 7,5 contenant .de l'urée 6M.Un fluorographe du gel est présenté sur la figure lA. Les tailles des protéines de HIV-1 et de HIV-2 sont indiquées sur la gauche et sur la droite des lignes. La p68 et la p55 sont respectivement les transcriptase inverse et le précurseur de lig. La gp160 et la gp120 sont respectivement la glycoprotéine précurseur de l'enveloppe de HIV-1 et son produit de clivage. La gap300, la gp140 et la gap125 sont les précurseurs de la glycoprotéine et le produit de clivage de la protéine d'enveloppe de HIV-2.CEM cells infected with HIV-1 or HIV-2 were labeled with 35S-methionine (200pCilml 4 x 106 cells / ml) for 18 hours. Extracts from infected cells (CELL) and their corresponding culture medium (SN) were purified on specific immunoaffinity columns: HIV-1 serum column
Sepharose, specific for HIV-1 proteins (Krust et al., 1988) and column. ^ HIV-2 serum-Sepharose, specific for HIV-2 proteins (see "experimental procedures"). The purified proteins were analyzed by electrophoresis on polyacrylamide-SDS 7.5 gel containing .6M urea. A fluorograph of the gel is presented in FIG. 1A. The sizes of the HIV-1 and HIV-2 proteins are shown on the left and on the right of the lines. P68 and p55 are the reverse transcriptase and the ligand precursor, respectively. The gp160 and the gp120 are respectively the glycoprotein precursor of the envelope of HIV-1 and its cleavage product. Gap300, gp140 and gap125 are the precursors of glycoprotein and the cleavage product of the HIV-2 envelope protein.
- Figure 1 B : Identification des alvcorotéines de
HIV-2:
Des cellules CEM infectées par HIV-2 et des lymphocytes T ont été marquées avec de la 3H-glucosamine (200 pCi/ml ; 4 X 106 cellules/ml) pendant 18 heures.- Figure 1 B: Identification of alvcoroteins from
HIV-2:
CEM cells infected with HIV-2 and T lymphocytes were labeled with 3H-glucosamine (200 pCi / ml; 4 X 106 cells / ml) for 18 hours.
Des extraits de cellules infectées (ligne C) et le milieu de culture contenant le virus (ligne V) ont été purifiés sur colonne HIV-2 sérum-Sépharose et les protéines marquées ont été analysées par électrophorèse des glycoprotéines de HIV-2 synthétisées dans les cellules CEM sur gel 7,5. Dans la ligne la plus à gauche, l'électrophorèse sur gel d'acrylamide 12,5 montre la présence de la gp36. Cette partie de la figure a dû être surexposée pour mettre en évidence la gp36, c'est pourquoi la gp140/125 est résolue sous forme d'une bande épaisse.Extracts of infected cells (line C) and the culture medium containing the virus (line V) were purified on an HIV-2 serum-Sepharose column and the labeled proteins were analyzed by electrophoresis of the HIV-2 glycoproteins synthesized in the CEM cells on gel 7.5. In the leftmost line, 12.5 acrylamide gel electrophoresis shows the presence of gp36. This part of the figure had to be overexposed to highlight the gp36, this is why the gp140 / 125 is resolved in the form of a thick stripe.
- Figure 2 : Analvse de l'électroPhorèse sur ael en deux dimensions, des qlvcoprotéines de HIV-2. - Figure 2: Analysis of electrophoresis on ael in two dimensions, qlvcoproteins of HIV-2.
Les glycoprotéines gp300, gp140 et gp125 purifiées à partir de cellules CEM infectées par HIV-2 (CELL) ont été marquées avec la 35S-méthionine. Les glycoprotéines, ainsi que le milieu de culture contenant le virus, ont été analysés (SN représente le résultat obtenu avec le milieu de culture ; les conditions de préparation sont semblables à celles de la figure lA pour l'électrophorèse sur gel en deux dimensions (voir "procédures expérimentales"). Le gradient de pH de la focalisation isoélectrique (première dimension) correspond à celui qui a été donné. En seconde dimension, les protéines ont été résolues sur gel de polyacrylamide-SDS à 7,58 contenant de l'urée 6M. Des fluorographes des gels sont représentés sur la figure 2. The gp300, gp140 and gp125 glycoproteins purified from CEM cells infected with HIV-2 (CELL) were labeled with 35S-methionine. The glycoproteins, as well as the culture medium containing the virus, were analyzed (SN represents the result obtained with the culture medium; the preparation conditions are similar to those of FIG. 1A for two-dimensional gel electrophoresis ( see "experimental procedures"). The pH gradient of the isoelectric focusing (first dimension) corresponds to that given. In the second dimension, the proteins were resolved on 7.58 polyacrylamide-SDS gel containing 6M urea. Fluorographs of the gels are shown in FIG. 2.
~ Figure 3 : Dissociation de la Protéine qp300 native (a) et dénaturée (b et c). ~ Figure 3: Dissociation of the native qp300 protein (a) and denatured (b and c).
a/ - Des extraits de cellules CEM infectées par
HIV-2 et marquées à la 35S-méthionine ont été purifiés sur colonne HIV-2 sérum-Sépharose. Cet échantillon a ensuite été divisé en deux parties aliquotes égales l'une a été incubée dans un tampon d'accrochage (ligne 1) alors que l'autre a été incubée dans un tampon contenant 30mM d'acétate de sodium à pH4,0, 0,2mM PMSF, 100 unités/ml d'aprotinine et 5mM de ss-mercaptoéthanol (ligne 2). Après 1 heure à 37 C, le milieu acide a été neutralisé et les deux échantillons ont été analysés par électrophorèse.a / - Extracts of CEM cells infected with
HIV-2 and labeled with 35S-methionine were purified on an HIV-2 serum-Sepharose column. This sample was then divided into two equal aliquots, one was incubated in an attachment buffer (line 1) while the other was incubated in a buffer containing 30 mM sodium acetate at pH 4.0, 0.2mM PMSF, 100 units / ml aprotinin and 5mM ss-mercaptoethanol (lane 2). After 1 hour at 37 ° C., the acid medium was neutralized and the two samples were analyzed by electrophoresis.
b/ - La gp300 marquée à la 35S-méthionine, purifiée et lyophilisée a été suspendue dans un tampon d'acétate de sodium (100 pl) à pH 4 comme indiqué plus haut (ligne 2). Des incubations ont été conduites pendant 30 minutes à 37 C avant l'addition à deux reprises d'un tampon d ' électrophorèse contenant de l'urée 2M. Les résultats de la ligne 1, correspondent à la gp300 lyophylisée directement suspendue dans le tampon d'électrophorèse.b / - The purified and lyophilized gS00 labeled with 35S-methionine was suspended in a sodium acetate buffer (100 μl) at pH 4 as indicated above (line 2). Incubations were carried out for 30 minutes at 37 ° C. before the addition twice of an electrophoresis buffer containing 2M urea. The results of line 1, correspond to the lyophilized gp300 directly suspended in the electrophoresis buffer.
35
la - La gp300 marquée par la 35S-méthionine, purifiée et lyophilisée a été suspendue dans une solution contenant 30mM Tris-HCl, 0,2mM PMSF et 100 unités/ml d'aprotinine et tamponnée avec HCl à pH 7,5 7,0 ; 6,5 ; et 6,0 (comme indiqué sur la figure). Après 60 minutes à 37"C on a ajouté à deux reprises un tampon d'électrophorèse et les échantillons ont été analysés par électrophorèse.35
the - The purified and lyophilized 35S-methionine-labeled gp300 was suspended in a solution containing 30mM Tris-HCl, 0.2mM PMSF and 100 units / ml of aprotinin and buffered with HCl at pH 7.5 7.0 ; 6.5; and 6.0 (as shown in the figure). After 60 minutes at 37 ° C an electrophoresis buffer was added twice and the samples were analyzed by electrophoresis.
Des fluorographes de ces gels sont montrés en a, b et c. Dans la section c, la bande caractéristique de la gp300 est dissociée en gp140 cette dissociation pouvant être quantifiée par réalisation d'un scanner densitométrique de ce fluorographe. Fluorographs of these gels are shown in a, b and c. In section c, the characteristic band of the gp300 is dissociated into gp140, this dissociation being able to be quantified by carrying out a densitometric scanner of this fluorograph.
- Figure 4 : Gestion des alvcorotéines de HIV-2 avec
Endo-H.- Figure 4: Management of HIV-2 alvcoroteins with
Endo-H.
Les glycoprotéines gp300, gp140/gp125 et gp125, purifiées et lyophylisées (voir "procédures expérimentales") ont été suspendues dans un tampon contenant du citrate de sodium 150mM à pH 5,5 ; 0,1\ SDS (w/v), 0,5mM PMSF avant d'être chauffées pendant 2 minutes à 90 c. Des parties aliquotes de ces échantillons ont été incubées (2 heures 30'C) sans endo-H (ligne 1) ou avec 0,4 (ligne 2), 2 (ligne 3) et 10 (ligne 4) milli-unités de Endo-H. The purified and lyophylized gp300, gp140 / gp125 and gp125 glycoproteins (see "experimental procedures") were suspended in a buffer containing 150 mM sodium citrate at pH 5.5; 0.1 \ SDS (w / v), 0.5mM PMSF before being heated for 2 minutes at 90 c. Aliquots of these samples were incubated (2 hours 30'C) without endo-H (line 1) or with 0.4 (line 2), 2 (line 3) and 10 (line 4) milli-units of Endo -H.
Toutes ces réactions ont été arrêtées par addition de tampon d'électrophorèse à deux reprises. All of these reactions were stopped by adding electrophoresis buffer twice.
L'électrophorèse était réalisée comme décrit pour la figure 1. Des fluorographes des différents gels ont été présentés. Les flèches p90 et p80 sur la droite indiquent la position du produit de digestion. Les conditions pour la digestion endo-H ont été décrites par
Tarentino et al. 1974.The electrophoresis was carried out as described for FIG. 1. Fluorographs of the different gels were presented. The arrows p90 and p80 on the right indicate the position of the digestion product. The conditions for endo-H digestion have been described by
Tarentino et al. 1974.
- Figure 5 : Marquage isotopique des alycoprotéines de
HIV-2 avec le 14a-mannose ou le -3X-fucose. - Figure 5: Isotopic labeling of alycoproteins of
HIV-2 with 14a-mannose or -3X-fucose.
Des cellules infectées par HIV-2 ont été marquées pendant 18 heures avec du 14C-mannose (25 pCi/ml ; 4 X 106 cellules/ml) ou 3H-fucose (200 pCi/ml 4 X 106 cellules/ml). Des extraits des cellules infectées (ligne C) et du milieu de culture contenant le virus (ligne V) ont été purifiés sur colonne HIV-2 sérum-Sépharose. Les glycoprotéines marquées ont été ensuite analysées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Le fluorographe est présenté à la figure 5. Cells infected with HIV-2 were labeled for 18 hours with 14C-mannose (25 pCi / ml; 4 X 106 cells / ml) or 3H-fucose (200 pCi / ml 4 X 106 cells / ml). Extracts of the infected cells (line C) and of the culture medium containing the virus (line V) were purified on an HIV-2 serum-Sepharose column. The labeled glycoproteins were then analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis. The fluorograph is shown in Figure 5.
- Figure 6 : Inhibition de la alvcosvlation liée à l'azote par la tunicamycine.- Figure 6: Inhibition of nitrogen-linked alvcosvlation by tunicamycin.
Des cellules infectées par HIV-2 en l'absence de tunicamycine (ligne C) ou en présence (ligne TM) de tunicamycine (2 ug/ml) ont été marquées avec la 35S-méthionine (cadre intitulé 35S-met ; 200 pCi/ml ; 4
X 106 cellules/ml) .ou avec la 3H-glucosamine (cadre intitulé 3H-GLcNAc ; 200 pCi/ml ; 4 X 106 cellules/ml) pendant 16 heures. Les cellules traitées avec la tunicamycine ont tout d'abord été incubées (37"C) avec l'antibiotique (2 ijg/ml)'pendant 2 heures avant d'être 3 marquées avec la 35S-méthionine ou la 3H-glucosamine. Cells infected with HIV-2 in the absence of tunicamycin (line C) or in the presence (line TM) of tunicamycin (2 ug / ml) were labeled with 35S-methionine (box entitled 35S-met; 200 pCi / ml; 4
X 106 cells / ml) or with 3H-glucosamine (box entitled 3H-GLcNAc; 200 pCi / ml; 4 X 106 cells / ml) for 16 hours. Cells treated with tunicamycin were first incubated (37 "C) with the antibiotic (2 µg / ml) for 2 hours before being labeled with 35S-methionine or 3H-glucosamine.
Des extraits de cellules infectées (CELL) et du milieu de culture contenant le virus (SN) ont été purifiés sur colonne HIv-2 sérum-Sépharose et analysés par electrophorèse sur gel de polyacrylamide 7,5%. Des fluorographes de ces gels sont présentés. Les positions du précurseur non glycosylé de l'enveloppe (p90/80) et du dimère non glycosylé (200Kd) sont indiquées par de petites flèches sur-la droite. Les protéines 90/80Kd et 200Kd n'incorporent pas la 3H-glucosamine (cadre 3H-GlcNAc, CELL ligne TM).Extracts of infected cells (CELL) and of the culture medium containing the virus (SN) were purified on a HIv-2 serum-Sepharose column and analyzed by electrophoresis on 7.5% polyacrylamide gel. Fluorographs of these gels are presented. The positions of the non-glycosylated precursor of the envelope (p90 / 80) and of the non-glycosylated dimer (200Kd) are indicated by small arrows on the right. The 90 / 80Kd and 200Kd proteins do not incorporate 3H-glucosamine (3H-GlcNAc frame, CELL line TM).
- Figure 7 : Effet des inhibiteurs de couDures d'oliqosaccharides sur le processus de formation de. la alvcorotéine d 'enveloppe de HIV-2.- Figure 7: Effect of oliquosaccharide streak inhibitors on the formation process. the envelope alvcorotein of HIV-2.
Des cellules CEM infectées par HIV-2 ont été marquées (16 heures, 37 C) avec la 35S-méthionine (200 pCi/ml ; 4 X 106 cellules/ml) en l'absence d'inhibiteur de coupure (lignes T) ou en présence d'un inhibiteur de coupure des -oligosaccharides : lmM bromoconduritol alignes Bro) ; lmM castanospermine (lignes Cast.) ; 10 pg/ml swainsonine (lignes 5w) ; 3mM deoxynojirimycine (lignes dNH) et 1mM deoxymannojirimycine (lignes dMM). CEM cells infected with HIV-2 were labeled (16 hours, 37 C) with 35S-methionine (200 pCi / ml; 4 X 106 cells / ml) in the absence of cleavage inhibitor (T lines) or in the presence of an inhibitor of cleavage of -oligosaccharides: lmM bromoconduritol aligns Bro); lmM castanospermine (Cast lines); 10 pg / ml swainsonine (lines 5w); 3mM deoxynojirimycin (dNH lines) and 1mM deoxymannojirimycin (dMM lines).
Des extraits des cellules infectées (cadre intitulé
CELL) et du milieu de culture contenant les particules virales (cadre SN) ont été purifiés sur colonne HIV-2 sérum-Sépharose pour identifier les glycoprotéines virales gp125, gap140, gp300 dans les cellules infectées et gap125 dans les milieux de culture. Tous les échantillons ont été analysés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide 7,5k. Afin de montrer que l'inhibition de la production de la gp125 par les cellules traitées avec différents inhibiteurs est spécifique de la glycoprotéine virale, le milieu de culture a été testé, conduisant à la détection de la présence de la protéine du noyau, p26, par un test d'immunoprécipitation faisant intervenir un sérum séropositif pour HIV-2 (Clavel et al.,1986a, 1987).La p26 a été analysée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (12,5%). Les figures représentent le fluorographe montrant seulement une seule partie de chaque gel.Extracts from infected cells (box entitled
CELL) and of the culture medium containing the viral particles (SN frame) were purified on an HIV-2 serum-Sepharose column to identify the viral glycoproteins gp125, gap140, gp300 in the infected cells and gap125 in the culture media. All samples were analyzed by electrophoresis on 7.5k polyacrylamide gel. In order to show that the inhibition of gp125 production by cells treated with different inhibitors is specific for viral glycoprotein, the culture medium was tested, leading to the detection of the presence of the nucleus protein, p26, by an immunoprecipitation test involving an HIV-2 seropositive serum (Clavel et al., 1986a, 1987). P26 was analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis (12.5%). The figures represent the fluorograph showing only a single part of each gel.
- Figure 8 : Effet de la castanossermine et de la monensine sur le processus de formation des alyco- protéines de HIV-2.- Figure 8: Effect of castanossermine and monensin on the formation process of HIV-2 alyco-proteins.
a/ - Des expériences de marquage par un traceur radioactif pendant un temps court suivi d'une élimination de ce traceur et de son remplacement par des molécules non radioactives (expérience de "pulse-chase") ont été conduites à partir de cellules CEM infectées par
HIV-2 en l'absence de castanosperme (contrôle) ou en présence de castanospermine lmM (Cast.).a / - Labeling experiments with a radioactive tracer for a short time followed by elimination of this tracer and its replacement with non-radioactive molecules ("pulse-chase" experiment) were carried out using infected CEM cells by
HIV-2 in the absence of castanosperm (control) or in the presence of lmM castanospermine (Cast.).
Contrôle : Les cellules infectées ont été incubées pendant 1 heure à 37"C dans un milieu dépourvu de méthionine avant un marquage pendant une période brève de 15 minutes avec la 35S-méthionine (200 pCi/ml ; 4 X 105 cellules/ml ligne 1). Le traceur radioactif éliminé et remplacé par le milieu de culture contenant de la méthionine froide 5mM pendant 0,5 ; 1,5 et 3 heures (résultat rapporté dans les.lignes 2, 3 et 4, respectivement). Cast. : Les cellules CEM infectées par HIV-2 ont été incubées (uné heure à 37 C) dans un milieu dépourvu de méthionine contenant de la castanospermine, avant un marquage rapide pendant 30 minutes avec de la 35 5-methionine).Ces cellules ont ensuite été suivies après élimination du traceur radioactif et remplacement par des molécules non radioactives comme décrit plus haut, mais en présence de castanospermine pendant 0,5 1,5 et 3 heures (lignes 2, 3 et 4, respectivement).Control: The infected cells were incubated for 1 hour at 37 "C in a medium devoid of methionine before labeling for a brief period of 15 minutes with 35S-methionine (200 pCi / ml; 4 X 105 cells / ml line 1 The radioactive tracer eliminated and replaced by the culture medium containing cold methionine 5 mM for 0.5, 1.5 and 3 hours (result reported in lines 2, 3 and 4, respectively). CEM cells infected with HIV-2 were incubated (one hour at 37 ° C.) in a methionine-free medium containing castanospermine, before rapid labeling for 30 minutes with 5-methionine). These cells were then followed after elimination of the radioactive tracer and replacement with non-radioactive molecules as described above, but in the presence of castanospermine for 0.5 1.5 and 3 hours (lines 2, 3 and 4, respectively).
b/ - Des expériences de marquage par un traceur radioactif et suivi de ce traceur dans les conditions décrites ci-dessus dans les cellules infectées par HIV-2 en l'absence de monensine (contrôle) ou en présence de monensine 1 M ont été réalisées. Des cellules infectées avec ou sans la monensine ont été incubées (1 heure, 37 C) dans un milieu dépourvu de méthionine avant- dêtre marquées pendant une période brève (30 minutes).avec la 35S-méthionine (ligne tel. Les cellules marquées ont été ensuite suivies dans le milieu de culture contenant de la méthionine froide 5mM pendant 0,5 ; 1,5 et 3 heures (lignes 2, 3 et 4 respectivement). b / - Labeling experiments with a radioactive tracer and monitoring of this tracer under the conditions described above in cells infected with HIV-2 in the absence of monensin (control) or in the presence of 1 M monensin were carried out . Cells infected with or without monensin were incubated (1 hour, 37 ° C) in methionine-free medium before being labeled for a brief period (30 minutes). With 35S-methionine (line such. Labeled cells were was then followed in the culture medium containing 5 mM cold methionine for 0.5, 1.5 and 3 hours (lines 2, 3 and 4 respectively).
Des extraits ont été purifiés sur colonne
HIV-2 sérum-Sépharose et les protéines marquées ont été analysées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide 7,5%. Les résultats sont présentés sur des fluorographes. La p55 représente le précurseur de vaq dans la section A, ligne 1.Extracts were purified on a column
HIV-2 serum-Sepharose and the labeled proteins were analyzed by electrophoresis on 7.5% polyacrylamide gel. The results are presented on fluorographs. P55 represents the vaq precursor in section A, line 1.
- Figure 9 : Précurseurs des alvcorotéines de SIV.- Figure 9: Precursors of SIV alvcoroteins.
Des cellules HUT-78 infectées par SIV ont été marquées (t6 heures, 37'C) avec la 35S-méthionine (200 pCi/pl ; 4 X to6 cellules/ml), 3H-fucose (200 pCi/pl ; 4 4 X 106 cellules/ml), et 14C-mannose (25 pCi/pl; 4 X 106 cellules/ml). Des extraits de cellules infectées (lignes C) et de milieu de culture contenant
SIV (lignes V) ont été purifiés sur colonne de HIV-2 sérum-Sépharose. Un sérum positif pour HIV-2 a été utilisé pour effectuer la réaction d'immunoprécipitation des protéines de SIV, puisque les protéines de
HIV-2 et de SIV présentent des réactions immunologiques croisées.Tous les échantillons ont été analysés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (7,5a) (voir "Procédures expérimentales"). Un fluorographe des différents gels est présenté. La mobilité électrophorétique de la gP3005Iv et de la gpl40SIV correspond à celle des glycoprotéines gp300 et gp140 de HIV-2. La gpl 30S1V a une mobilité légèrement supérieure à celle de 35 la gp125 de HIV-2. La p55 marquée avec la 35S-méthionine est probablement le précurseur de saa de SIV.HUT-78 cells infected with SIV were labeled (t6 hours, 37 ° C.) with 35S-methionine (200 pCi / pl; 4 X to 6 cells / ml), 3H-fucose (200 pCi / pl; 4 4 X 106 cells / ml), and 14C-mannose (25 pCi / pl; 4 X 106 cells / ml). Extracts from infected cells (lines C) and culture medium containing
SIV (lines V) were purified on a column of HIV-2 serum-Sepharose. An HIV-2 positive serum was used to perform the immunoprecipitation reaction of the SIV proteins, since the proteins of
HIV-2 and SIV show crossed immunological reactions. All the samples were analyzed by electrophoresis on polyacrylamide gel (7.5a) (see "Experimental procedures"). A fluorograph of the different gels is presented. The electrophoretic mobility of gP3005Iv and gpl40SIV corresponds to that of the glycoproteins gp300 and gp140 of HIV-2. Gpl 30S1V has slightly higher mobility than gp125 of HIV-2. P55 labeled with 35S-methionine is probably the precursor of SIV saa.
- Figure 10 : Représentation schématiaue des étapes de formation de la alvcoProtéine d'enveloppe de HIV-2.- Figure 10: Schematic representation of the stages of formation of the HIV-2 envelope alvcoProtein.
Le polypeptide de 80Kd synthétisé et glycosylé donne lieu à la formation d'un précurseur immature de glycoprotéines" gp150 qui est rapidement déglycosylé par les glucosidases du réticulum endoplasmique granuleux (RER). Une transformation de l'environnement (notamment du pH) entraîne alors la dimérisation donnant lieu à la formation de la gp300, "précurseur intermédiaire sous forme de dimère". La gp300 est coupée par les mannosidases du RER avant d'être transportée dans l'appareil de Golgi. D'autres coupures de la gp300 sont effectuées par les mannosidases du Golgi avant le transfert de fucose et de résidus d'acides sialiques dans le Golgimédial et dans le trans-Golgi.Enfin, le dimère est dissocié en un précurseur mature" gp135, en raison du pH acide règnant dans le compartiment du réseau trans
Golgi (TGN). La gp135 est transportée dans la membrane plasmique et clivée par la protéase cellulaire pour conduire à des glycoprotéines d'enveloppe matures de
HIV-2, gp125 et gp36. La Tunicamycine (TM) inhibe l'assemblage des résidus dolichol-P-P-glycane ; la castanospermine (Cast.) et la déoxynojirimycine (dNM) inhibent les glucosidases du RER ; la déoxymannojurimycine (dMM) inhibe les mannosidases de coupures dans le RER et dans le cis-Golgi et dans lesGolgi-médial ; la monensine inhibe le transport des glycoprotéines de membrane et des protéines de sécrition à partir de l'appareil de Golgi. The synthesized and glycosylated 80Kd polypeptide gives rise to the formation of an immature glycoprotein precursor "gp150 which is rapidly deglycosylated by the glucosidases of the granular endoplasmic reticulum (RER). A transformation of the environment (in particular of the pH) then results in the dimerization giving rise to the formation of the gp300, "intermediate precursor in the form of dimer". The gp300 is cut by the mannosidases of the RER before being transported in the Golgi apparatus. Other cuts of the gp300 are carried out by the Golgi mannosidases before the transfer of fucose and sialic acid residues in the Golgimedial and in the trans-Golgi. Finally, the dimer is dissociated into a mature precursor "gp135, due to the acid pH prevailing in the network compartment trans
Golgi (TGN). The gp135 is transported in the plasma membrane and cleaved by the cellular protease to lead to mature envelope glycoproteins of
HIV-2, gp125 and gp36. Tunicamycin (TM) inhibits the assembly of dolichol-PP-glycan residues; castanospermine (Cast.) and deoxynojirimycin (dNM) inhibit RER glucosidases; deoxymannojurimycin (dMM) inhibits cut mannosidases in the RER and in the cis-Golgi and in the Golgi-medial; monensin inhibits the transport of membrane glycoproteins and securing proteins from the Golgi apparatus.
EXEMPLES
PROCEDURES EXPERIMENTALES
I - MATERIELS
L-(35S)Methionine (activité spécifique) 1000
Ci/mmol, L-(6- 3H) Fucose (activité spécifique : 45-70 Ci/mmol), D-(6-3H)Glucosamine (activité spécifique 20-40 Ci/mmol) et D-(U-14C)Mannose (activité spécifique: 200-300 mCi/mmol) obtenus de Amersham (Amersham, UK).EXAMPLES
EXPERIMENTAL PROCEDURES
I - MATERIALS
L- (35S) Methionine (specific activity) 1000
Ci / mmol, L- (6- 3H) Fucose (specific activity: 45-70 Ci / mmol), D- (6-3H) Glucosamine (specific activity 20-40 Ci / mmol) and D- (U-14C) Mannose (specific activity: 200-300 mCi / mmol) obtained from Amersham (Amersham, UK).
Le bromoconduritol, la castanospermine, la 1-deoxymannojirimycine (dMM), la 1-deoxynojirimycyne (dNM), la swainsonine et la tunicamycine ont été obtenus de Boehringer-Mannheim (Mannheim, RFA). Bromoconduritol, castanospermine, 1-deoxymannojirimycin (dMM), 1-deoxynojirimycyne (dNM), swainsonine and tunicamycin were obtained from Boehringer-Mannheim (Mannheim, FRG).
L'endo6-N-acetylglucosaminidase H a été obtenue chez Calbiochem (San Diego, USA). Endo6-N-acetylglucosaminidase H was obtained from Calbiochem (San Diego, USA).
Les Ampholines proviennent de Pharmacia (Uppsala, Suède). The Ampholines come from Pharmacia (Uppsala, Sweden).
Il - VIRUS ET CELLULES
Un isolat HIV-1BRU du virus d'immunodéficience humaine de type 1 (décrit par Montagnier et al. 1984), un isolat de HIV-2RoD du virus d'immunodéficience humaine du type 2 (décrit par Clavel et al. 1986a) et un virus d'immunodéficience simien SIVmac142 (décrit par
Daniel et al. 1985) ont été utilisés dans cette étude.It - VIRUSES AND CELLS
An HIV-1BRU isolate from human immunodeficiency virus type 1 (described by Montagnier et al. 1984), an HIV-2RoD isolate from human immunodeficiency virus type 2 (described by Clavel et al. 1986a) and a simian immunodeficiency virus SIVmac142 (described by
Daniel et al. 1985) were used in this study.
Les différentes lignées cellulaires et les lymphocytes humains ont été cultivés dans un milieu de suspension RPMI-1640 (GIBCO-BRL, Cergy-Pontoise France) contenant 10*s (v/v) de sérum de veau foetal ; 2pg/ml de polybrene (SIGMA) ont été ajoutés aux cultures cellulaires infectées par HIV.Les cellules du clone CEM13 dérivent de la lignée CEM de cellules lymphoides humaines (déposée à l'ATCC sous le n CCL119) et expriment l'antigène T4 à un haut niveau. 5 jours après l'infection avec l'isolat HIV-l BRU ou avec l'isolat HIV-2ROD, environ 80-90% des cellules produisent des particules virales et peuvent être identifiées par des effets cytopathogènes correspondant à- la vacuolisation des cellules et à l'apparition de syncitia de petite taille. The various cell lines and human lymphocytes were cultured in a RPMI-1640 suspension medium (GIBCO-BRL, Cergy-Pontoise France) containing 10 * s (v / v) of fetal calf serum; 2pg / ml of polybrene (SIGMA) were added to the cell cultures infected with HIV. The cells of the clone CEM13 derive from the CEM line of human lymphoid cells (deposited at ATCC under the number CCL119) and express the T4 antigen a high level. 5 days after infection with the HIV-1 BRU isolate or with the HIV-2ROD isolate, approximately 80-90% of the cells produce viral particles and can be identified by cytopathogenic effects corresponding to the vacuolation of the cells and at the appearance of small syncitia.
La lignée cellulaire HUT-78 est une autre lignée cellulaire de lymphocytes T4 humains positifs (Gadzdar et al. 1980), hautement permissive pour la réplication de SIVmac142 (Daniel et ai- 1985). Des lymphocytes périphériques du sang de donneurs de sang sains ont été stimulés pendant 3 jours avec 0,02 < w/v) de fraction P de phytohémagglutinine (DIFCO, Detroit,
USA) dans un milieu RPMI-1640, complété avec 10% de sérum de veau foetal. Les cellules ont ensuite été cultivées sur un milieu RPMI-1640 contenant 10% (v/v) de facteur de croissance de cellules T-(TCGF,Biotest).The HUT-78 cell line is another cell line of positive human T4 lymphocytes (Gadzdar et al. 1980), highly permissive for the replication of SIVmac142 (Daniel et al. 1985). Peripheral lymphocytes from the blood of healthy blood donors were stimulated for 3 days with 0.02 <w / v) of fraction P of phytohemagglutinin (DIFCO, Detroit,
USA) in RPMI-1640 medium, supplemented with 10% fetal calf serum. The cells were then cultured on RPMI-1640 medium containing 10% (v / v) of T- cell growth factor (TCGF, Biotest).
Après l'infection avec HIV-2, des lymphocytes ont été cultivés en présence de 10% (v/v) TCGF et 2pg/ml de
Polybrene.After infection with HIV-2, lymphocytes were cultured in the presence of 10% (v / v) TCGF and 2pg / ml of
Polybrene.
III - MAROUAGE METABOLIOUE DES CELLULES.III - METABOLIOUE MAROUAGE OF CELLS.
Pour le marquage métabolique des protéines, des cellules infectées ont été incubées pendant t6 heures à 37sC dans un milieu de culture MEM (abréviation anglaise de Minimum Essentiel Medium) sans L-methionine ni sérum, mais complété par 200pCi/ml de L(355) méthio- nine. Pour le marquage métabolique des glycoprotéines, des cellules infectées ont été incubées pendant. 16 heures à 37'C dans un milieu de culture MEM sans sérum ni glucose, mais complété par 200 Ci/ml H3-fucose et 200uCi/ml de D-(6-H]-glucosamine ou 25pCilml de mannose. For the metabolic labeling of proteins, infected cells were incubated for t6 hours at 37sC in a MEM culture medium (English abbreviation for Minimum Essential Medium) without L-methionine or serum, but supplemented with 200pCi / ml of L (355) methionine. For the metabolic labeling of glycoproteins, infected cells were incubated for. 16 hours at 37 ° C. in a MEM culture medium without serum or glucose, but supplemented with 200 Ci / ml H3-fucose and 200uCi / ml of D- (6-H] -glucosamine or 25pCilml of mannose.
IV - CELLULES ET EXTRAITS VIRAUX
Des culots cellulaires correspondant à cellules ont été resuspendus dans 100 l du tampon suivant : l0mM Tris-HCl pH 7,6, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 100 unités par ml d'aprotinine < Iniprol,
CHOAY) avant l'addition de 100pu du meme tampon contenant 2a (v/v) de Triton X-100. Des extraits cellulaires ont été centrifugés à 12.000g pendant 10 minutes et le surnageant a été conservé à -80'C jusqu'à utilisation.Pour les préparations d'extrait viral, 100pu de lOX tampon de lyse (100mM Tris-HCl pH 7,6, 1,5M
NaCl, lOmM EDTA, 10% (v/v) Triton X-100, 100 unités/ml aprotinine) ont été ajoutés par ml de surnageant clarifié de cellules CEM infectées. Ces préparations ont été utilisées comme suit.IV - CELLS AND VIRAL EXTRACTS
Cell pellets corresponding to cells were resuspended in 100 l of the following buffer: 10 mM Tris-HCl pH 7.6, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.2 mM PMSF, 100 units per ml of aprotinin <Iniprol,
CHOAY) before the addition of 100pu of the same buffer containing 2a (v / v) of Triton X-100. Cell extracts were centrifuged at 12,000 g for 10 minutes and the supernatant was stored at -80 ° C. until use. For the viral extract preparations, 100 μl of lOX lysis buffer (100 mM Tris-HCl pH 7, 6, 1.5M
NaCl, 10 mM EDTA, 10% (v / v) Triton X-100, 100 units / ml aprotinin) were added per ml of clarified supernatant from infected CEM cells. These preparations were used as follows.
V - PREPARATION D'UN IMMUNOABSORBANT AVEC DES ANTICORPS
PRESENTS DANS LE SERUM D'UN PATIENT SEROPOSITIF POUR LE
VIRUS HIV-2.V - PREPARATION OF AN IMMUNOABSORBENT WITH ANTIBODIES
PRESENT IN THE SERUM OF A SEROPOSITIVE PATIENT FOR
HIV-2 VIRUS.
Des immunoglobulines d'un sérum d'un patient séropostifif pour HIV-2 ont été précipitées avec 50% de (NH4)2S04, dissous dans 20mM de phosphate de sodium (pH 8,0) puis purifiées sur une colonne de cellulose DEAE (DE 52,Whatman) par élution avec 20mM de phosphate de sodium (pH 8,0). Ces immunoglobulines ainsi purifiées ont été jugées pures à 90%. Les anticorps ont été ensuite couplés sur SEPHAROSER CL 4B activé par CNBr conformément à la technique décrite par Berg (1977). Immunoglobulins from a serum from an HIV-2 seropositive patient were precipitated with 50% (NH4) 2SO4, dissolved in 20 mM sodium phosphate (pH 8.0) and then purified on a DEAE cellulose column (DE 52, Whatman) by elution with 20 mM sodium phosphate (pH 8.0). These immunoglobulins thus purified were considered to be 90% pure. The antibodies were then coupled to CNBr activated SEPHAROSER CL 4B according to the technique described by Berg (1977).
Deux milligrames d'IgG ont été couplés par ml de
SEPHAROSER CL 4B. Cet immunoabsorbant est désigné sous la référence wHIV-2 sérum Sépharose".Two milligrams of IgG were coupled per ml of
SEPHAROSER CL 4B. This immunoabsorbent is designated under the reference wHIV-2 Sepharose serum ".
VI - LIAISONS DES PROTEINES HIV-2 SUR UNE COLONNE D'IMMUNOAFFINITE. VI - LINKS OF HIV-2 PROTEINS ON AN IMMUNOAFFINITY COLUMN.
Des extraits cellulaires de cellules CEM produisant HIV-2 ont tout d'abord été dilués dans deux volumes de tampon d'accrochage (20mM Tris-HCl pH 7,6, 50mM KCl, 150mM NaCl, lmM EDTA, 1 (v/v) Triton X-100, 20 (v/v) glycérol, 7mM mercaptoethanol, 0,2mM PMSF, 100 unités/ml d'aprotinine) avant incubation avec un volume de "HIV-2 sérum-Sépharose". Des surnageants de cellules produisant le virus HIV-2 ont été traités de la même façon que les extraits cellulaires excepté qu'l/l0ème de tampon d'accrochage concentré 10X a été ajouté par volume de surnageant. L'étape -d'accrochage a été conduite pendant 1 nuit, puis la colonne a été lavée suffisamment dans le tampon d'accrochage.Les protéines liées sur la colonne ont été éluées en les faisant bouillir dans un tampon d'électrophorèse (125mM Tris-HCl pH 6,8, 1% (w/v) SDS, 2M urea, 20e glycerol, 1% 8-mer- captoethanol). Les protéines éluées ont été analysées sur gels d'électrophorèse SDS-.polyacrylamide 7,5% contenant de l'urée 6M et 0,1% de bis-acrylamide au lieu de 0,25. (w/v). Cell extracts of CEM cells producing HIV-2 were first diluted in two volumes of attachment buffer (20mM Tris-HCl pH 7.6, 50mM KCl, 150mM NaCl, lmM EDTA, 1 (v / v) Triton X-100, 20 (v / v) glycerol, 7mM mercaptoethanol, 0.2mM PMSF, 100 units / ml aprotinin) before incubation with a volume of "HIV-2 serum-Sepharose". Supernatants from cells producing the HIV-2 virus were treated in the same way as the cell extracts except that 1/10 of 10X concentrated hook buffer was added per volume of supernatant. The attachment step was carried out for 1 night, then the column was washed sufficiently in the attachment buffer. The proteins bound to the column were eluted by boiling in an electrophoresis buffer (125 mM Tris -HCl pH 6.8, 1% (w / v) SDS, 2M urea, 20th glycerol, 1% 8-mer- captoethanol). The eluted proteins were analyzed on SDS-.polyacrylamide 7.5% electrophoresis gels containing 6M urea and 0.1% bis-acrylamide instead of 0.25. (w / v).
VII - ELECTROPHORESE PREPARATIVE.VII - PREPARATIVE ELECTROPHORESIS.
Les glycoprotéines de HIV-2 éluées à partir de la colonne d'affinité ont été analysées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide comme décrit précédemment et les régions du gel contenant les glycoprotéines virales ont été coupées par référence à la position des marqueurs protéiniques de poids moléculaire pré-établi (BRL). The HIV-2 glycoproteins eluted from the affinity column were analyzed by electrophoresis on polyacrylamide gel as described previously and the regions of the gel containing the viral glycoproteins were cut by reference to the position of the molecular weight protein markers. pre-established (BRL).
Les glycoprotéines ont été éluées par incubation pendant 16 heures à 4C dans un tampon d'élution (0,lu NaHC03, 0,5mM EDTA, 0.05h (w/v) SDS, 0,2mM PMSF). The glycoproteins were eluted by incubation for 16 hours at 4C in an elution buffer (0, read NaHC03, 0.5mM EDTA, 0.05h (w / v) SDS, 0.2mM PMSF).
Les fractions de glycoprotéines ainsi obtenues ont été lyophilisées et gardées au réfrigérateur jusqu'à leur utilisation.The glycoprotein fractions thus obtained were lyophilized and kept in the refrigerator until they were used.
VIII - ELECTROPHORESE SUR GEL EN DEUX DIMENSIONS.VIII - ELECTROPHORESIS ON GEL IN TWO DIMENSIONS.
Une électrophorèse sur gel en deux dimensions a été réalisée de la façon décrite par O'Farrel (1975) avec les modifications suivantes : des protéines marquées par la Lt355)-méthionine liées sur une colonne de "HIV-2 sérum-Sépharose" ont été éluées en les faisant bouillir dans un tampon d'électrophorèse tel que décrit précédemment, avant dilution dans un volume de tampon contenant 9,5M d'urée, 8% (v/v)-mercap-toéthanol, 1,6t (w/v) d'ampholines à un pH situé dans l'intervalle 6,5-9, 0,4s (w/v) d'ampholines à un pH situé dans l'intervalle 3-10 et 100 unités/ml d'aprotinine. Two-dimensional gel electrophoresis was carried out as described by O'Farrel (1975) with the following modifications: proteins labeled with Lt355) -methionine linked on a column of "HIV-2 serum-Sepharose" were eluted by boiling in an electrophoresis buffer as described above, before dilution in a volume of buffer containing 9.5M of urea, 8% (v / v) -mercap-toethanol, 1.6t (w / v ) of ampholines at a pH in the range 6.5-9, 0.4s (w / v) of ampholines at a pH in the range 3-10 and 100 units / ml of aprotinin.
EXEMPLE 1 - CARACTERISATION DES GLYCOPROTEINES (ru300 et anal40. EXAMPLE 1 - CHARACTERIZATION OF GLYCOPROTEINS (ru300 and anal40.
Le schéma de résolution obtenu à partir de l'analyse électrophorétique sur gel en 2 dimensions des glycoprotéines gp300, gp140 et gp125, marqué à la S35- méthionine, montre que la gp300 et la g*p140 sont apparentées. Ces deux protéines présentent des dépôts distincts sur le gel mais elles possèdent un point isoélectrique (pI) identique pour un pH variant de 6,8 à 7,8. Ces résultats sont rapportés sur la figure 2. Cette similitude entre les protéines gp140 et gp300 suggère que la gp300 est une forme dimérique de la gp140. The resolution scheme obtained from the 2-dimensional gel electrophoretic analysis of the glycoproteins gp300, gp140 and gp125, labeled with S35-methionine, shows that gp300 and g * p140 are related. These two proteins have distinct deposits on the gel but they have an identical isoelectric point (pI) for a pH varying from 6.8 to 7.8. These results are reported in Figure 2. This similarity between the proteins gp140 and gp300 suggests that gp300 is a dimeric form of gp140.
La gp125 présente moins d'hétérogénéité à la fois dans les cellules infectées et dans les particules virales et migre à un point isoélectrique par des valeurs de pH situées entre 6,2 et 6,5. Gp125 exhibits less heterogeneity both in infected cells and in viral particles and migrates to an isoelectric point by pH values between 6.2 and 6.5.
Dans les cellules infectées on a remarqué la présence de sous-entités mineures de la protéine gp125 ayant un point isoélectrique pour des valeurs de pH situées entre 7,2 et 7,3. Cette dernière catégorie de protéines n'est pas présente dans le virion HIV-2, c'est pourquoi elle représente vraisemblablement une glycoprotéine non définitivement constituée. In the infected cells, the presence of minor sub-entities of the protein gp125 having an isoelectric point has been observed for pH values situated between 7.2 and 7.3. This last category of proteins is not present in the HIV-2 virion, which is why it probably represents a glycoprotein which is not definitively constituted.
La nature acide de la gp125 mature peut être due à l'acide sialique au niveau de certaines chaînes carbohydrates ajoutées lors de la maturation de la glycoprotéine d'enveloppe. The acidic nature of mature gp125 may be due to sialic acid at the level of certain carbohydrate chains added during the maturation of the envelope glycoprotein.
La glycoprotéine d'enveloppe gp300 est très stable puisqu'elle résiste à des détergents ioniques < 1% SDS) et non-ionique (2\ Triton X-100), à l'urée (2-6M), à des sels forts (1M NaCl) età des agents réducteurs (1t 6-mercaptoethanol). Cependant, on a pu établir que la gp300 peut être dissociée dans un milieu à pH acide en formant deux glycoprotéines gp140. Dans ces expériences, des protéines liées sur une colonne d'immunoaffinité ont été incubées dans un tampon d'acétate à des valeurs de pH variant entre 4 et 7. Ces échantillons ont-ensuite été analysés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide.La figure 3A sur laquelle sont rapportés les résultats montre qu'une bande de gp300 est convertie en une bande correspondant à la position de la gap140 lorsque l'échantillon est incubé à pH4. D'autres expériences ont été mises en oeuvre en utilisant des préparations purifiées de gp300 obtenues à partir des gels d'électrophorèse préparative comme précédemment décrit. De tels échantillons dénaturés de la gp3OÔ ont été dissociés complètement dans un tampon acétate à pH 6,0. Les résultats de ces essais sont rapportés sur la figure 3-B.L'efficacité de la dissociation de la glycoprotéine gp300 purifiée est vraisemblablement due à l'abaissement du pH et à la présence de résidus SDS dans l'échantillon lyophilisé, étant donné que la glycoprotéine gp300 native liée sur colonne n'était pas- dissociable dans le même tampon à des valeurs de pH plus élevées que pH5. The envelope glycoprotein gp300 is very stable since it resists detergents ionic <1% SDS) and non-ionic (2 \ Triton X-100), urea (2-6M), strong salts ( 1M NaCl) and reducing agents (1t 6-mercaptoethanol). However, it has been established that gp300 can be dissociated in an acidic pH medium by forming two gp140 glycoproteins. In these experiments, proteins bound on an immunoaffinity column were incubated in an acetate buffer at pH values varying between 4 and 7. These samples were then analyzed by electrophoresis on polyacrylamide gel. Figure 3A on which the results are reported shows that a band of gp300 is converted into a band corresponding to the position of the gap140 when the sample is incubated at pH4. Other experiments were carried out using purified preparations of gp300 obtained from the preparative electrophoresis gels as previously described. Such denatured samples of gp3OÔ were completely dissociated in an acetate buffer at pH 6.0. The results of these tests are reported on figure 3-B. The efficiency of the dissociation of the purified gp300 glycoprotein is probably due to the lowering of the pH and to the presence of SDS residues in the lyophilized sample, since native column-linked gp300 glycoprotein was not dissociable in the same buffer at pH values higher than pH5.
Dans un tampon Tris-HCl la dissociation est moins efficace. A- pH 7,5 on remarque seulement une dissociation faible de la gp300 sous forme de gp140, ceci augmentant toutefois avec l'abaissement des valeurs du pH. Dans un tampon Tris à pH 6,0, la dissociation était d'environ 80t. comme le montre la figure 3C. Lors de la dissociation de la gp300 pure, dans un autre tampon acétate ou Tris-HCl aucune autre protéine que la gap140 n'a pu être détectée (les expériences ont été conduites sur gel de polyacrylamide 15%). Ces résultats indiquent que la gp300 est une forme dimérique de la gp140, elle-meme précurseur de la glycoprotéine d'enveloppe de HIV-2. En conséquence, il apparaît vraisemblable que lors de la constitution de la glycoprotéine d'enveloppe, deux molécules de gp140 participent à un mécanisme de fusion'dépendant du pH. In a Tris-HCl buffer, the dissociation is less effective. At pH 7.5, only a weak dissociation of gp300 in the form of gp140 is noted, this increasing however with the lowering of the pH values. In a Tris buffer at pH 6.0, the dissociation was approximately 80t. as shown in Figure 3C. During the dissociation of pure gp300, in another acetate or Tris-HCl buffer, no other protein than gap140 could be detected (the experiments were carried out on 15% polyacrylamide gel). These results indicate that gp300 is a dimeric form of gp140, itself a precursor of the HIV-2 envelope glycoprotein. Consequently, it seems likely that during the constitution of the envelope glycoprotein, two molecules of gp140 participate in a fusion mechanism dependent on pH.
EXEMPLE 2 - CARACTERISATION DES CHAINES LATERALES D' OLIGOSACCHARIDESDES GLYCOPROTEINES DE HIV-2.EXAMPLE 2 - CHARACTERIZATION OF THE SIDE CHAINS OF OLIGOSACCHARIDES OF HIV-2 GLYCOPROTEINS.
Une digestion avec l'endo B-N-acetylglu- cosaminidase H (endo H) a permis de mettre en évidence pour les glycoprotéines de HIV-2 la présence d'oligosaccharides liés sur l'azote (Tarentino et al 1974). La gp300, le mélange de (gp140, gp125) et la gel 25 seule ont été purifiés par chromatographie d'affinité et électrophorèse préparative (voir les procédures expérimentales). Les échantillons lyophilisés ont été suspendus dans un tampon de digestion endo H qui ne favorise pas la dissociation de gp300 en gp140. Digestion with endo B-N-acetylglucosaminidase H (endo H) has made it possible to demonstrate for the glycoproteins of HIV-2 the presence of oligosaccharides bound on nitrogen (Tarentino et al 1974). The gp300, the mixture of (gp140, gp125) and the gel alone were purified by affinity chromatography and preparative electrophoresis (see experimental procedures). The lyophilized samples were suspended in an endo H digestion buffer which does not promote the dissociation of gp300 into gp140.
Après digestion avec l'endo H, la mobilité électrophorétique de la gp300 correspond à celle plus faible d'une protéine de 200-250Kd. Une petite fraction de gp300 dissociée en gp140 a été digérée en donnant lieu à une protéine de 80Kd. Les résultats sont rapportés à la figure 4, section gp300. L'échantillon contenant le mélange de gp140, gp125 a été digéré par endo
H en donnant des protéines de 90 et 80Kd, alors que la gp125 seule était convertie en une protéine de 90Kd lors de cette digestion comme le montrent les sections gp140/125 et gp125 de la figure 4. Une digestion avec l'endo H de la gp140 et de la gp125 conduit à des produits de poids moléculaires 80 et 90Kd respectivement.After digestion with endo H, the electrophoretic mobility of gp300 corresponds to that of a protein of 200-250Kd. A small fraction of gp300 dissociated into gp140 was digested, giving rise to an 80Kd protein. The results are reported in Figure 4, section gp300. The sample containing the mixture of gp140, gp125 was digested by endo
H by giving proteins of 90 and 80Kd, while gp125 alone was converted into a protein of 90Kd during this digestion as shown in sections gp140 / 125 and gp125 in FIG. 4. Digestion with the endo H of the gp140 and gp125 leads to products with molecular weights 80 and 90Kd respectively.
En effet, en marquant métaboliquement les cellules avec du 14C-mannose et du 3H-fucose on a montré l'incorporation de mannose dans la gp300, la gap140 et la gp125 alors que seules la gp300 et la gp125 étaient capables d'incorporer du fucose (figure 5). Les résidus fucose sont normalement transférés sur des chaines d'oligosaccharides lors d'un stade avancé du. cycle de glycosylation, après l'action d'enzymes de cohésion du réticulum endoplasmique et de l'appareil de Golgi (Kornfeld et Kornfeld, 1985 ; Fuhrmann et al 1985). In fact, by metabolically labeling cells with 14C-mannose and 3H-fucose, incorporation of mannose into gp300, gap140 and gp125 has been shown, while only gp300 and gp125 were capable of incorporating fucose. (figure 5). Fucose residues are normally transferred to oligosaccharide chains at an advanced stage. glycosylation cycle, after the action of cohesion enzymes of the endoplasmic reticulum and the Golgi apparatus (Kornfeld and Kornfeld, 1985; Fuhrmann et al 1985).
Pour ces raisons on peut penser que selon toute yraisemblance, la faible résistance à la digestion avec l'endo H de la gp125 par rapport à la gp140 est due à la convertion de certaines chaines latérales d'oligosaccharides du type mannose en des oligosaccharides complexes lors de la transformation de la glycoprotéine d'enveloppe (Kornfeld et Kornfeld, 1985). Le fait que la gp140 ne contienne aucun résidu fucose est en accord avec le fait qu'elle constitue un précurseur de la gp300 et de la gp125. For these reasons, it may be thought that, in all likelihood, the low resistance to digestion with endo H of gp125 compared to gp140 is due to the conversion of certain side chains of mannose-type oligosaccharides into complex oligosaccharides during of the transformation of the envelope glycoprotein (Kornfeld and Kornfeld, 1985). The fact that gp140 does not contain any fucose residue is in agreement with the fact that it constitutes a precursor of gp300 and of gp125.
EXEMPLE 3 - EFFET DE LA TUNICAMYCINE. INHIBITEUR DE LA
GLYCOSYLATION SUR LA FORMATION DES GLYCOPROTEINES DE
HIV-2.EXAMPLE 3 - EFFECT OF TUNICAMYCIN. INHIBITOR OF
GLYCOSYLATION ON THE FORMATION OF GLYCOPROTEINS FROM
HIV-2.
Toutes les glycoprotéines porteuses d'oligosaccharides liés sur ltazote reçoivent leur chaîne oligosaccharidique Glc3Mang-GlcNAc2-pp-Dolichol, grâce à une réaction réalisée par la protéine-oligosaccharidyl transférase qui catalyse le transfert en bloc des chaînes d'oligosaccharides sur des résidus d'asparagine (voir les références Kornfeld et Kornfeld 1985). La
Tunicamycine bloque une telle glycosylation liée à l'azote en inhibant la production de N-acétylglucosamine pyrophosphoryldolichol, première étape dans l'assemblage des oligosaccharides liés par les lipides (Li et al.All glycoproteins carrying oligosaccharides linked to nitrogen receive their oligosaccharide chain Glc3Mang-GlcNAc2-pp-Dolichol, thanks to a reaction carried out by the protein-oligosaccharidyl transferase which catalyzes the block transfer of the chains of oligosaccharides on asparagine residues (see references Kornfeld and Kornfeld 1985). The
Tunicamycin blocks such nitrogen-linked glycosylation by inhibiting the production of N-acetylglucosamine pyrophosphoryldolichol, the first step in the assembly of lipid-linked oligosaccharides (Li et al.
1978 ; Heifetz et al. 1979). En présence de 2 pg/ml de tunicamycine, la totalité de la glycosylation liée sur l'azote, des glycoprotéines d'enveloppe de HIV-2 dans les cellules infectées est bloquée. Ce résultat est démontré par l'absence d'incorporation de 3H-glucosamine dans les glycoprotéines virales gp300, gp140, gp125 (figure 6). Dans ces conditions expérimentales, la synthèse de protéine n'a toutefois pas été affectée dans les cellules infectées, traitées par de la tunicamycine.1978; Heifetz et al. 1979). In the presence of 2 μg / ml of tunicamycin, all of the nitrogen-linked glycosylation of the HIV-2 envelope glycoproteins in the infected cells is blocked. This result is demonstrated by the absence of incorporation of 3H-glucosamine in the viral glycoproteins gp300, gp140, gp125 (FIG. 6). Under these experimental conditions, protein synthesis was not affected in the infected cells, treated with tunicamycin.
De telles cultures marquées avec des isotopes de la 35S-méthionine présentent deux protéines majeures de poids apparent 200 et 80-9OKd, migrant en de larges bandes (figure 6). Le poids moléculaire de ces protéines coincide avec les produits de la digestion par l'endo H des gp300, gp140 et gp125 (figure 4), suggèrant que les protéines de poids moléculaire 200Kd, 80-90Kd correspondent à des formes non glycosylées des glycoprotéines d'enveloppe de HIV-2.Such cultures labeled with isotopes of 35S-methionine exhibit two major proteins of apparent weight 200 and 80-9OKd, migrating in wide bands (FIG. 6). The molecular weight of these proteins coincides with the endo H digestion products of gp300, gp140 and gp125 (Figure 4), suggesting that the proteins of molecular weight 200Kd, 80-90Kd correspond to non-glycosylated forms of the glycoproteins d HIV-2 envelope.
Le poids moléculaire de la protéine de 80-90Kd correspond au poids moléculaire attendu du précurseur de l'enveloppe de HIV-2 non glycosylé, estimé à partir de sa séquence d'acide nucléique (Guyader et al. 1987). La glycoprotéine de 200bd est probablement la forme dimérique du précurseur d'enveloppe non glycosylé. Ces résultats confirment que les protéines d'enveloppe de
HIV-2 contiennent des chaines polysaccharidiques liées à l'azote. Outre l'inhibition de la glycosylation, un traitement à la tunicamycine inhibe la formation et l'exportation de la glycoprotéine d'enveloppe puisque la protéine de 80-90Kd n'a pas été mise en évidence dans le milieu extra-cellulaire, comme le montre la figure 6, ligne SN.The molecular weight of the 80-90Kd protein corresponds to the expected molecular weight of the precursor of the non-glycosylated HIV-2 envelope, estimated from its nucleic acid sequence (Guyader et al. 1987). The 200bd glycoprotein is probably the dimeric form of the non-glycosylated envelope precursor. These results confirm that the envelope proteins of
HIV-2 contain polysaccharide chains linked to nitrogen. In addition to the inhibition of glycosylation, a treatment with tunicamycin inhibits the formation and export of the envelope glycoprotein since the protein of 80-90Kd has not been demonstrated in the extracellular medium, such as shows figure 6, line SN.
Les résultats de ces expériences nous permettent de supposer que les chaines de glycosaccharides des protéines d'enveloppe de HIV-2 sont vraisemblablement impliquées dans le transport cellulaire à travers l'appareil de Golgi. L'absence de formes non glycosylées de la protéine d'enveloppe dans le milieu extra-céllulaire de cellules traitées par la tunicamycine pourrait éventuellement etre due à sa dégradation rapide. De nombreux rapports ont suggéré que de façon générale, la forme-non-glycosylée d'une protéine est plus sensible à l'action des protéases que sa forme glycosylée (Olden et al. 1978 ; Schwartz et al. 1976). The results of these experiments allow us to assume that the glycosaccharide chains of the HIV-2 envelope proteins are probably involved in cell transport through the Golgi apparatus. The absence of non-glycosylated forms of the envelope protein in the extra-cellular medium of cells treated with tunicamycin could possibly be due to its rapid degradation. Numerous reports have suggested that, in general, the non-glycosylated form of a protein is more sensitive to the action of proteases than its glycosylated form (Olden et al. 1978; Schwartz et al. 1976).
En accord avec ces résultats, les protéines de petit poids moléculaire présentes dans les cellules marquées par la 35S-méthionine cultivées dans la tunicamycine représentent probablement des produits de dégradation partielle de la protéine d'enveloppe non glycosylée (figure 6).In agreement with these results, the low molecular weight proteins present in the cells labeled with 35S-methionine cultivated in tunicamycin probably represent products of partial degradation of the non-glycosylated envelope protein (FIG. 6).
EXEMPLE 4 - EFFETS DES INHIBITEURS DE COHESION D'OLIGO
SACCHARIDE SUR LA SYNTHESE ET LA TRANSFORMATION DE
GLYCOPROTEINES DE HIV-2.EXAMPLE 4 EFFECTS OF OLIGO COHESION INHIBITORS
SACCHARIDE ON THE SYNTHESIS AND TRANSFORMATION OF
HIV-2 GLYCOPROTEINS.
Des oligosaccharides liés par l'asparagine (Glc3MangGlcNAC2) des glycoprotéines subissent des modifications extensives ou une tranformation à la suite de leur attachement aux protéines (voir Kornfeld et
Kornfeld, 1985). Les réactions d'élimination des extrémités glucose et mannose par les enzymes ont lieu dans le lumen du réticulum endoplasmique granuleux (RER) et dans l'appareil de Golgi par action de mannosidases et de glucosidases spécifiques.Oligosaccharides linked by asparagine (Glc3MangGlcNAC2) glycoproteins undergo extensive modifications or transformation following their attachment to proteins (see Kornfeld and
Kornfeld, 1985). Reactions of elimination of the glucose and mannose ends by enzymes take place in the lumen of the granular endoplasmic reticulum (RER) and in the Golgi apparatus by the action of specific mannosidases and glucosidases.
On peut intervenir sur la transformation des chaînes d'oligosaccharides des glycoprotéines en utilisant des inhibiteurs spécifiques des glucosidases et des mannosidases (rapporté par Schwarz et Datema, 1984 ; Fuhrmann et al. 1985). Dans ces expériences, on a utilisé différents inhibiteurs de jonction pour investiger la localisation des précurseurs de la glycoprotéine de HIV-2 et aussi pour étudier le role de la glycosylation dans la transformation du précurseur de l'enveloppe.Les inhibiteurs utilisés sont les suivants: la castanospermine, alcalolde de plante qui inhibe la glucosidase I (Saul et al 1983) ; la déoxynojirimycine (dNM), analogue de glucose qui inhibe les glucosidases I et II assurant l'élimination des extrémités glucose (Lemansky et al. 1984) : un déoxymannojirimycine (dMM), analogue de mannose qui inhibe les réactions catalysées par la mannosidase (Fuhrmann et al, 1984) ; le bromoconduritol (6-bromo-3,4,5-trihydroxycyclohex-l-ene) qui inhibe la glucosidase Il (Datema et al, 1982) ; la swainsonine, alcaloïde indolizidine qui inhibe la mannosidase II de l'appareil de Golgi (Tulsiani et al. We can intervene on the transformation of the oligosaccharide chains of glycoproteins using specific inhibitors of glucosidases and mannosidases (reported by Schwarz and Datema, 1984; Fuhrmann et al. 1985). In these experiments, different junction inhibitors were used to investigate the localization of the precursors of the HIV-2 glycoprotein and also to study the role of glycosylation in the transformation of the precursor of the envelope. The inhibitors used are the following: castanospermine, a plant alkaloid that inhibits glucosidase I (Saul et al 1983); deoxynojirimycin (dNM), a glucose analogue which inhibits glucosidases I and II ensuring the elimination of the glucose ends (Lemansky et al. 1984): a deoxymannojirimycin (dMM), a mannose analogue which inhibits reactions catalyzed by mannosidase (Fuhrmann et al, 1984); bromoconduritol (6-bromo-3,4,5-trihydroxycyclohex-1-ene) which inhibits glucosidase II (Datema et al, 1982); swainsonine, an indolizidine alkaloid that inhibits mannosidase II from the Golgi apparatus (Tulsiani et al.
1982).1982).
Les cellules infectées par HIV-2 marquées par
35 des isotopes de la 5-méthionine en l'absence ou en présence de différents inhibiteurs de jonction et de protéines intra-cellulaires et extra-cellulaires ont été purifiées par chromatographie d'affinité (figure 7). On a vérifié que les cellules infectées contiennent la gp300, la gp140 et la gp125, alors que seule la gp125 est observée dans le milieu extra-cellulaire (les résultats sont rapportés sur la figure 7, sections "cellules" et SN, lignes T).Dans les cellules traitées avec la castanospermine ou le dNM, on a noté un taux normal de gp300, l'absence de gp125 et une petite quantité d'une protéine de 150Kd qui correspond probabblement à la forme glycosylée de la gp140. En conséquence, dans de telles cellules la transformation de la glycoprotéine d'enveloppe a été bloquée puisqu'aucune gp125 n'est détectée dans le milieu extra-cellulaire malgré la production de p26, protéine du noyau de HIV-2 (figure 7, lignes Cast. et dNM).HIV-2 infected cells labeled with
35 isotopes of 5-methionine in the absence or in the presence of different junction inhibitors and of intra-cellular and extra-cellular proteins were purified by affinity chromatography (FIG. 7). It has been verified that the infected cells contain gp300, gp140 and gp125, while only gp125 is observed in the extracellular medium (the results are reported in FIG. 7, sections "cells" and SN, lines T) In cells treated with castanospermine or dNM, there was a normal level of gp300, the absence of gp125 and a small amount of a protein of 150Kd which probably corresponds to the glycosylated form of gp140. Consequently, in such cells the transformation of the envelope glycoprotein has been blocked since no gp125 is detected in the extracellular medium despite the production of p26, protein of the HIV-2 nucleus (FIG. 7, lines Cast. And dNM).
Ces résultats montrent que l'enlèvement des résidus glucose terminal des chaînes d'oligosaccharides du précurseur de la glycoprotéine d'enveloppe est nécessaire pour sa transformation et le clivage par la protéase- cellulaire. Le bromoconduritol qui agit sur la glycosidase Il, inhibait aussi à 70-90% la production normale de gp125, mais les taux de gp140 et gap30 restaient normaux (figure 7, lignes Brio). Au contraire de la castanospermine et du dNM (qui inhibent l'enlèvement du résidu glucose terminal), le traitement au bromoconduritol (qui inhibe l'enlèvement des deux résidus glucose internes) ne bloque pas complètement la transformation de la glycoprotéine d'enveloppe de HIV-2. These results show that the removal of terminal glucose residues from the oligosaccharide chains of the envelope glycoprotein precursor is necessary for its transformation and cleavage by the cellular protease. Bromoconduritol, which acts on glycosidase II, also inhibited normal production of gp125 by 70-90%, but the levels of gp140 and gap30 remained normal (Figure 7, Brio lines). Unlike castanospermine and dNM (which inhibit the removal of the terminal glucose residue), treatment with bromoconduritol (which inhibits the removal of the two internal glucose residues) does not completely block the transformation of the HIV envelope glycoprotein -2.
En fait, un taux faible de gp125 peut être détecté dans les milieux intra-cellulaires et extra-cellulaires. Ce dernier résultat suggère qu'un faible niveau d'élimination de mannose peut avoir lieu sans l'enlèvement des deux résidus glucose internes.In fact, a low level of gp125 can be detected in the intra-cellular and extra-cellular media. This latter result suggests that a low level of mannose elimination can take place without the removal of the two internal glucose residues.
Des inhibiteurs de mannosidase, la-swainsonine et le dMM n'ont pas engendré de modifications apparentes dans le taux intra-cellulaire de gp300, de gp140 ou de gp125, mais le niveau extra-cellulaire de gp125 était de 50% inférieur à la forme correspondante dans les cellules de contrôle (figure 7, lignes Sw et dMM). Ainsi bien que la chaine d'oligosaccharides ait seulement subi une déglycosylation le précurseur de- la glycoprotéine est clivé grâce à des enzymes protéolytiques produisant une protéine similaire de la gp125, mais contenant plus de mannose, ce qui affecte probablement le transport cellulaire de la gel 25. Le poids moléculaire de la glycoprotéine extra-cellulaire produite en présence de dMM est légèrement plus élevé que celui de la protéine produite en l'absence de l'inhibiteur Ceci est vraisemblablement dù à une concentration supérieure en résidus mannose de la protéine extra-cellulaire synthétisée par les cellules traitées au dMM (figure 7, section SN). Mannosidase inhibitors, la-swainsonine and dMM did not cause apparent changes in the intra-cellular level of gp300, gp140 or gp125, but the extra-cellular level of gp125 was 50% lower than the form corresponding in the control cells (Figure 7, lines Sw and dMM). So although the oligosaccharide chain has only undergone deglycosylation the precursor of the glycoprotein is cleaved by proteolytic enzymes producing a protein similar to gp125, but containing more mannose, which probably affects the cell transport of the gel. 25. The molecular weight of the extracellular glycoprotein produced in the presence of dMM is slightly higher than that of the protein produced in the absence of the inhibitor. This is probably due to a higher concentration of mannose residues of the extra- cell synthesized by cells treated with dMM (Figure 7, section SN).
On peut en déduire que les effets des inhibiteurs d'enzymes d'élimination sur la transformation de la glycoprotéine d'enveloppe de HIV-2 sont spécifiques puisque la synthèse et la production de la p26 de HIV-2 ne sont pas affectées du tout (figure 7, section SN). It can be deduced that the effects of inhibitors of elimination enzymes on the transformation of the HIV-2 envelope glycoprotein are specific since the synthesis and production of p26 of HIV-2 are not affected at all ( Figure 7, section SN).
EXEMPLE 5 - EFFET DE LA CASTANOSPERMINE ET DE LA
MONENSINE SUR LA TRANSFORMATION DES GLYCOPROTEINES DE
HIV-2.EXAMPLE 5 EFFECT OF CASTANOSPERMIN AND OF
MONENSIN ON THE TRANSFORMATION OF GLYCOPROTEINS FROM
HIV-2.
Afin d'étudier la transformation intracellulaire des glycoprotéines de HIV-2, des expériences mettant en oeuvre des traceurs (pulse-chase) ont été réalisées. Les cellules infectées par HIV-2 ont été rapidement marquées par la 35S-méthionine radioactive pendant 15 minutes puis l'incorporation du traceur a été suivie (chase) pendant 0.5, 1.5 et 3 heures (figure 8, contrôle). La gp140 est la première protéine détectée 15 minutes après le marquage. Pendant le suivi de l'incorporation du traceur radioactif la gp300 peut être détectée après une demi-heure, alors que la gp125 n'est détectée qu'après 1,5 à 3 heures.Le fait que la gp300 est observée après la synthèse de la gp140, et que la gp125 n'est détectée qu'après formation de la gp300 (figure 8A, lignes 1-4) suggère que la dimérisation est un stade intermédiaire nécessaire à la transformation de l'oligosaccharide en une glycoprotéine parvenue à maturation, la gp125. Cette suggestion est confirmée par l'utilisation de castanospermine, qui inhibe la suppression du résidu glucose externe et des chaines polysaccharidiques. Après 30 minutes de marquage (pulse), en présence de castanospermine, une protéine de 150Kd est détectée avec la gp300 (figure 8, Cas., ligne 1). La protéine de 150Kd pourrait correspondre à la gap140 ; le faible accroissement du poids moléculaire du premier précurseur est attribué à la présence de résidus glucose dans les chaînes d'oligosaccharides.Ainsi, la gp140- synthétisée dans des cellules infectées par HIV-2, représente le précurseur de la glycoprotéine sans les résidus glucose. En accord avec ce résultat, la protéine de 150Kd (gap150) représente la première glycoprotéine de l'enveloppe de -HIV-2 non encore parvenue à maturation. In order to study the intracellular transformation of HIV-2 glycoproteins, experiments using tracers (pulse-chase) were carried out. The cells infected with HIV-2 were rapidly labeled with radioactive 35S-methionine for 15 minutes then the incorporation of the tracer was followed (chase) for 0.5, 1.5 and 3 hours (FIG. 8, control). Gp140 is the first protein detected 15 minutes after labeling. During the monitoring of the incorporation of the radioactive tracer gp300 can be detected after half an hour, while gp125 is detected only after 1.5 to 3 hours. The fact that gp300 is observed after the synthesis of gp140, and that gp125 is not detected until after the formation of gp300 (FIG. 8A, lines 1-4) suggests that dimerization is an intermediate stage necessary for the transformation of the oligosaccharide into a maturing glycoprotein, gp125. This suggestion is confirmed by the use of castanospermine, which inhibits the suppression of the external glucose residue and of the polysaccharide chains. After 30 minutes of labeling (pulse), in the presence of castanospermine, a 150Kd protein is detected with gp300 (Figure 8, Case, line 1). The 150Kd protein could correspond to the gap140; the slight increase in molecular weight of the first precursor is attributed to the presence of glucose residues in the oligosaccharide chains. Thus, gp140- synthesized in cells infected with HIV-2, represents the precursor of glycoprotein without the glucose residues. In agreement with this result, the 150Kd protein (gap150) represents the first glycoprotein of the -HIV-2 envelope which has not yet matured.
L'enlèvement des résidus glucose dans les cellules de contrôle correspond à une transformation rapide ayant lieu pendant ou immédiatement après la translocation cotranslationelle des précurseurs de glycoprotéines dans le réticulum endoplasmique (Lemansly et al, 1984). Après 30 minutes de marquage (pulse), et 3 heures de suivi de l'incorporation du traceur (chase), en présente de castanospermine, le niveau de gp150 est graduellement réduit alors que la quantité gp300 croit (figure 8,
Cast. lignes 1-4). Dans ces conditions expérimentales, le précurseur n'a pas été clivé en donnant la gp125. The removal of glucose residues in the control cells corresponds to a rapid transformation taking place during or immediately after the cotranslational translocation of the glycoprotein precursors in the endoplasmic reticulum (Lemansly et al, 1984). After 30 minutes of marking (pulse), and 3 hours of follow-up of the incorporation of the tracer (chase), in the presence of castanospermine, the level of gp150 is gradually reduced while the quantity gp300 increases (FIG. 8,
Cast. lines 1-4). Under these experimental conditions, the precursor was not cleaved to give gp125.
Une autre caractérisation de la glycoprotéine d'enveloppe de HIV-2 a été réalisée lors d'expériences relatives à lincorporation de traceur radioactif (pulse chase), en utilisant la monensine, ionophore cationique qui inhibe le transport des protéines de l'appareil de
Golgi vers la membrane plasmique ou dans certains cas, bloque le transport de protéines au niveau du cisternae de l'appareil de Golgi médian (Tartakoff et Vassali, 1977 ; Johnson et Schlesinger, 1980 ; Strous et Lodish, 1980 ; Griffiths et al. 1983). Des cellules infectées par HIV-2 d'une part en l'absence, d'autre part en présence de monensine ont été marquées avec un traceur radioactif (pulse) pendant 30 minutes puis l'incorporation du traceur a été suivie (chase) pendant 0,5, 1,5 et 3 heures (figure 8B).En présence de monensine, les cellules infectées par HIV-2 ont synthétisé la gp140 à un niveau normal, ainsi que sa forme dimérique. A l'inverse aucune trace de gp125 n'a pu être détectée dans les cellules traitées par la monensine. Après 1,5-3 heures de suivi de l'incorporation du traceur (chase), les cellules traitées par la monensine ont accumulé une protéine de 135Kd (gp135) qui est probablement le produit de dissociation du précurseur du dimère. Le poids moléculaire légèrement plus faible de la gap135 par rapport à la gp140 est du à l'enlèvement de certains résidus mannose par l'action des mannosidases du RER et de l'appareil de Golgi. Cette gp135 peut être ensuite transportée dans la membrane plasmatique et clivée par la protéase cellulaire.L'inhibition du transport de protéines par la monensine, bloque la glycoprotéine gp135 dans la partie ZtransW de l'appareil de Golgi (trans Golgi). Aucune glycoprotéine d'enveloppe à maturation n'est détectée dans les cellules traitées par la monensine, que ce soit intra-cellulairement ou extracellulairement, alors que la protéine du noyau (core) p.26 est synthétisée et excrétée.Another characterization of the HIV-2 envelope glycoprotein was carried out during experiments relating to the incorporation of radioactive tracer (pulse chase), using monensin, cationic ionophore which inhibits the transport of proteins from the apparatus of the
Golgi to the plasma membrane or in some cases blocks the transport of proteins to the cisternae of the median Golgi apparatus (Tartakoff and Vassali, 1977; Johnson and Schlesinger, 1980; Strous and Lodish, 1980; Griffiths et al. 1983 ). Cells infected with HIV-2 on the one hand in the absence, on the other hand in the presence of monensin were labeled with a radioactive tracer (pulse) for 30 minutes then the incorporation of the tracer was followed (chase) for 0.5, 1.5 and 3 hours (Figure 8B). In the presence of monensin, cells infected with HIV-2 synthesized gp140 at a normal level, as well as its dimeric form. Conversely, no trace of gp125 could be detected in the cells treated with monensin. After 1.5-3 hours of follow-up of the incorporation of the tracer (chase), the cells treated with monensin accumulated a protein of 135Kd (gp135) which is probably the dissociation product of the precursor of the dimer. The slightly lower molecular weight of the gap135 compared to gp140 is due to the removal of certain mannose residues by the action of the mannosidases of the RER and the Golgi apparatus. This gp135 can then be transported in the plasma membrane and cleaved by the cell protease. Inhibition of protein transport by monensin blocks the glycoprotein gp135 in the ZtransW part of the Golgi apparatus (trans Golgi). No maturing envelope glycoprotein is detected in monensin-treated cells, either intra-cellulally or extracellularly, while the core protein p.26 is synthesized and excreted.
EXEMPLE 6 - DIMERISATION DU PRECURSEUR DE GLYCOPROTEINES
DANS LES CELLULES INFECTEES PAR SIVmac.EXAMPLE 6 DIMERIZATION OF THE GLYCOPROTEIN PRECURSOR
IN CELLS INFECTED BY SIVmac.
La séquence nucléotidique de la glycoprotéine d'enveloppe de HIV-2 montre une homologie considérable (75% d'acides aminés identiques) avec celle de SIV (Guyader et al. 1987 ; Chakrabartî et al. 1987
Franchini et al. 1987). Pour ces raisons, des investigations ont été faites afin de déterminer si la dimérisation des glycoprotéines d'enveloppe peut être également détectée dans des cellules infectées par SIV.The nucleotide sequence of the HIV-2 envelope glycoprotein shows considerable homology (75% identical amino acids) with that of SIV (Guyader et al. 1987; Chakrabartî et al. 1987
Franchini et al. 1987). For these reasons, investigations have been made to determine whether the dimerization of the envelope glycoproteins can also be detected in cells infected with SIV.
Des protéines de SIV ont été purifiées sur colonne d'immunoaffinité contenant des anticorps spécifiques dirigés contre les protéines de HIV-2 dans la mesure où les protéines axa, Dol et env de HIV-2 et de SIV, présentent des réactions antigéniques croisées. La figure 9 montre que les cellules infectées par SIV synthétisent trois protéines de haut poids moléculaire, analogues à celles synthétisées~ dans les cellules infectées par HIV-2 : gp300, gp140 et gp130. La preuve que les glycoprotéines présentes dans les cellules infectées par SIV sont des glycoprotéines a été donnée par le marquage isotypique avec le 14C-mannose et le 3H-fucose. Ces trois protéines ont incorporé du mannose mais seules les gp300/SIV et la gpl 30151V ont incorporé le fucose.La gp300/SIV et la gp140/SIV sont- des protéines intra-cellulaires alors que la gp 130/SIV est une glycoprotéine extra-cellulaire. Le fait que la gp300/SIV et la gpl30/SIV sont capables d'incorporer le fucose montre que ces protéines sont des produits de transformation de la gp140/SIV. SIV proteins were purified on an immunoaffinity column containing specific antibodies directed against the HIV-2 proteins insofar as the axa, Dol and env proteins of HIV-2 and SIV show cross-antigenic reactions. FIG. 9 shows that cells infected with SIV synthesize three high molecular weight proteins, analogous to those synthesized in cells infected with HIV-2: gp300, gp140 and gp130. The proof that the glycoproteins present in cells infected with SIV are glycoproteins has been given by isotypic labeling with 14C-mannose and 3H-fucose. These three proteins have incorporated mannose but only gp300 / SIV and gpl 30151V have incorporated fucose. Gp300 / SIV and gp140 / SIV are intra-cellular proteins whereas gp 130 / SIV is an extra glycoprotein. cellular. The fact that gp300 / SIV and gpl30 / SIV are capable of incorporating fucose shows that these proteins are transformation products of gp140 / SIV.
Ces résultats indiquent qu'une formation en doublet (dimère) du précurseur de la glycoprotéine d'enveloppe est une propriété spécifique de l'expression du gène de l'enveloppe de HIV-2 et de SIV. On peut a l'inverse soutenir que la glycoprotéine d'enveloppe de
HIV-1 ne subit pas de dimérisation pendant sa transformation. Les cellules infectées par HIV-1 en présence de castanospermine ou de dNM n'accumulent pas de dimère d'enveloppe, comme c'est le cas pour HIV-2 ou SIV. These results indicate that a doublet (dimer) formation of the envelope glycoprotein precursor is a specific property of the expression of the envelope gene of HIV-2 and SIV. Conversely, it can be argued that the envelope glycoprotein
HIV-1 does not undergo dimerization during its transformation. Cells infected with HIV-1 in the presence of castanospermine or dNM do not accumulate an envelope dimer, as is the case for HIV-2 or SIV.
DISCUSSION
Comme le montrent les exemples les inventeurs sont parvenus à déterminer le processus de formation de la glycoprotéine d'enveloppe de HIV-2 et ils ont mis en évidence un mécanisme original dans la synthèse des glycoprotéines comprenant des chaînes oligosaccharidiques liées sur l'azote. Les glycoprotéines d'enveloppe de HIV-2, à savoir la glycoprotéine gel 25 extracellulaire, et la glycoprotéine gp36 transmembranaire, dérivent d'une glycoprotéine précurseur commune (Guyader et al., 1987). Un élément inattendu rapporté dans l'invention est que, pour être transporté et transformé dans l'appareil de Golgi, le précurseur de la glycoprotéine implique la formation d'un dimère homologue. Le mécanisme de dimérisation de la glycoprotéine d'enveloppe n'est pas encore totalement clair.Le fait que le dimère purifié dans le cadre de l'invention puisse être dissocié à un pH acide (pH 6,0) suggère que la dimérisation pourrait etre dépendante du pH.DISCUSSION
As the examples show, the inventors have succeeded in determining the process of formation of the HIV-2 envelope glycoprotein and they have demonstrated an original mechanism in the synthesis of glycoproteins comprising oligosaccharide chains linked on nitrogen. The HIV-2 envelope glycoproteins, namely the extracellular gel glycoprotein, and the transmembrane gp36 glycoprotein, are derived from a common precursor glycoprotein (Guyader et al., 1987). An unexpected element reported in the invention is that, to be transported and transformed in the Golgi apparatus, the glycoprotein precursor involves the formation of a homologous dimer. The dimerization mechanism of the envelope glycoprotein is not yet completely clear. The fact that the dimer purified in the context of the invention can be dissociated at an acidic pH (pH 6.0) suggests that dimerization could be dependent on pH.
Les inventeurs ont mis en évidence le fait que les chaînes d'oligosaccharides présentes dans le précurseur naturel de la glycoprotéine ne sont pas essentielles pour la formation du dimère. Ceci a été démontré lors de deux expériences : (1) la digestion avec l'endo
H conduit à une modification de la mobilité électrophorétique du dimère sans dissociation de celui-ci ; (2) en présence de tunicamycine, les cellules infectées par HIV-2 synthétisent un précurseur d'enveloppe non glycosylé (80-9OKd) et capable de former un dimère (200Kd). Ces résultats attestent le fait que la formation d'un dimère est une propriété intrinsèque de l'ossature polypeptidique du précurseur de 1 'enveloppe. The inventors have demonstrated that the chains of oligosaccharides present in the natural precursor of the glycoprotein are not essential for the formation of the dimer. This was demonstrated in two experiments: (1) digestion with the endo
H leads to a modification of the electrophoretic mobility of the dimer without dissociation of the latter; (2) in the presence of tunicamycin, cells infected with HIV-2 synthesize a non-glycosylated envelope precursor (80-9OKd) and capable of forming a dimer (200Kd). These results attest to the fact that the formation of a dimer is an intrinsic property of the polypeptide framework of the precursor of the envelope.
Des expériences de marquage pendant une période courte (en anglais "pulse") avec un traceur radioactif, puis d'une étape d'élimination par lavage de ce traceur et de son remplacement par des molécules non radioactives et le suivi de la-- làcalisation de la radioactivité (en anglais "chase") à partir d'échantillons prélevés à différents intervalles de temps, avec ou sans castanospermine (figure 8) montrent que la dimérisation du précurseur de la glycoprotéine intervient normalement immédiatement après la suppression des résidus glucose. Labeling experiments for a short period (in English "pulse") with a radioactive tracer, then a step of elimination by washing of this tracer and its replacement by non-radioactive molecules and monitoring of the - localization radioactivity (in English "chase") from samples taken at different time intervals, with or without castanospermine (Figure 8) show that the dimerization of the precursor of glycoprotein normally occurs immediately after the removal of glucose residues.
Les glucosidases étant associées aux membranes du réticulum endoplasmique, on peut supposer que la dimérisation intervient dans le RER. En présence de castanospermine, le dimère est accumulé dans le RER et n'est pas transformé. Cependant, lorsque les résidus glucose sont supprimés, l'inhibition des mannosidases du RER n'empêche pas la transformation des glycoprotéines dimèrisées à travers l'appareil de Golgi (figure 7). 'Ceci permet de faire l'hypothèse que les résidus glucose des chaines oligosaccharidiques du précurseur dimérisé empechent son expulsion du RER.En accord avec ceci, l'hypothèse peut être émise que la coupure des résidus glucose est nécessaire pour un transport efficace du RER vers le Golgi, ceci étant éventuellement dû au fait que les oligosaccharides déglucosylés forment une partie du site de reconnaissance pour un récepteur du transport (Lodish et Kong, 1984; Lemansky et al.,1984).. Il est également possible que la suppression du glucose soit importante pour que le précurseur dimérisé prenne une configuration fonctionnelle correcte (Schlesinger et al., 1984). Cette configuration fonctionnelle favoriserait l'action des mannosidases de coupure.As glucosidases are associated with the membranes of the endoplasmic reticulum, we can assume that dimerization occurs in the RER. In the presence of castanospermine, the dimer is accumulated in the RER and is not transformed. However, when the glucose residues are removed, the inhibition of the mannosidases of the RER does not prevent the transformation of the dimerized glycoproteins through the Golgi apparatus (FIG. 7). 'This makes it possible to hypothesize that the glucose residues of the oligosaccharide chains of the dimerized precursor prevent its expulsion from the RER. In agreement with this, the hypothesis can be put forward that the cutting of the glucose residues is necessary for an efficient transport of the RER to Golgi, this possibly being due to the fact that the deglucosylated oligosaccharides form part of the recognition site for a transport receptor (Lodish and Kong, 1984; Lemansky et al., 1984). It is also possible that the suppression of glucose is important for the dimerized precursor to assume a correct functional configuration (Schlesinger et al., 1984). This functional configuration would favor the action of cut-off mannosidases.
Au vu de ces résultats, les inventeurs ont proposé un schéma de représentantion de la transformation des glycoprotéines d'enveloppe de HIV-2 (figure 10). La taille présumée de l'ossature polypeptidique du précurseur de la glycoprotéine d'enveloppe est d'environ 80Kd (figures 4 et 6). La chaîne oligosaccharidique est transférée du dolichol-P-P vers un précurseur d'enveloppe (80Kd) probablement sur des résidus amino-acides de type asparagine fonctionnant comme accepteurs (Kornfeld et Kornfeld 1985). La tunicamycine inhibe l'assemblage du dolichol-P-P et du glycane, et pour cette raison la protéine de 80Kd n'est pas glycosylée. In view of these results, the inventors have proposed a diagram of representation of the transformation of the envelope glycoproteins of HIV-2 (FIG. 10). The presumed size of the polypeptide backbone of the envelope glycoprotein precursor is approximately 80Kd (Figures 4 and 6). The oligosaccharide chain is transferred from dolichol-P-P to an envelope precursor (80Kd) probably on amino acid residues of the asparagine type functioning as acceptors (Kornfeld and Kornfeld 1985). Tunicamycin inhibits the assembly of dolichol-P-P and glycan, and for this reason the 80Kd protein is not glycosylated.
L'addition de chaînes oligosaccharidiques à la protéine de 8OXd conduit à l'obtention du premier précurseur de la glycoprotéine d'enveloppe, la gp150. Ce précurseur pourrait exister tel quel ou au contraire ne pas exister dans les cellules infectées, car l'addition de chaines polysaccharidiques et la coupure des résidus glucose a lieu probablement pendant la traduction du précurseur.The addition of oligosaccharide chains to the 8OXd protein leads to the production of the first precursor of the envelope glycoprotein, gp150. This precursor could exist as it is or, on the contrary, not exist in infected cells, since the addition of polysaccharide chains and the cutting of glucose residues probably takes place during the translation of the precursor.
Quoiqu'il en soit, la gp150 est rapidement déglucosylée pour aboutir à la gp140. A ce stade une différence dans l'environnement, peut être au niveau du pH, guiderait la- formation du dimère par fusion de 2 molécules de gp140. Anyway, the gp150 is quickly deglucosylated to lead to the gp140. At this stage, a difference in the environment, perhaps at the pH level, would guide the formation of the dimer by fusion of 2 molecules of gp140.
La gp300 résultant, peut alors être coupée par une mannosidase du RER, et transportée vers l'appareil de
Golgi. En présence de castanospermine ou de dNM, la gap150 est dimérisée et accumulée dans le RER. Ce dimère n'est pas transformé parce qu'il est glucosylé. Cependant, aussi longtemps que le dimère est présent dans une forme déglucosylée, il peut être transporté dans le
Golgi ; l'inhibition de la mannosidase du RER par le dMM ne bloque pas l'obtention du précurseur dimérisé.The resulting gp300 can then be cut by a RER mannosidase, and transported to the
Golgi. In the presence of castanospermine or dNM, the gap150 is dimerized and accumulated in the RER. This dimer is not transformed because it is glucosylated. However, as long as the dimer is present in a deglucosylated form, it can be transported in the
Golgi; the inhibition of mannosidase from the RER by dMM does not block the obtaining of the dimerized precursor.
Dans le Golgi, la gp300 traverse les différents compartiments probablement par transport vésiculaire (Griffiths et Simons, 1986). Pendant ce transport la chaîne oligosaccharidique est coupée par les mannosidases du Golgi avant l'addition d'autres sucres tels que le fucose et l'acide sialique. La démonstration de l'incorporation du fucose a été obtenue par marquage isotypique de la gp300 avec le 3H-fucose. La démonstration de l'incorporation de l'acide sialique a été obtenue indirectement par digestion de la gp300 avec la neuramidase, enzyme capable d'hydrolyser les acides
N-acétylneuraminiques, terminaux dans différentes glycoprotéines (Peyrieras et al. 1-983). La gp300 de
HIV-2 est susceptible d'être digérée avec la neuramidase, comme le montre la diminution significative de la mobilité électrophorétique du dimère.Les résultats sont en accord avec l'observation que le précurseur garde sa forme dimérisée tout au long de son transport et de sa transformation dans le Golgi cils, médial et trans cisternae avant d'être transporté dans le réseau du trans-Golgi (TGN ; Griffiths et Simons, 1986) où il est dissocié lors d'un abaissement du pH de ce compartiment. Le dimère dissocié conduit à des glycoprotéines (gp135) d'un poids moléculaire légèrement inférieur à celui du précurseur de la glycoprotéine le premier détecté (gp150-140). La gp135 pourrait être transportée vers la membrane plasmique et être ainsi clivée par la protéase cellulaire avant de conduire à des glycoprotéines matures de l'enveloppe de HIV-2, gp125 et gp36.In the Golgi, the gp300 crosses the different compartments probably by vesicular transport (Griffiths and Simons, 1986). During this transport the oligosaccharide chain is cut by the Golgi mannosidases before the addition of other sugars such as fucose and sialic acid. Demonstration of the incorporation of fucose was obtained by isotypic labeling of gp300 with 3H-fucose. The demonstration of the incorporation of sialic acid was obtained indirectly by digestion of gp300 with neuramidase, an enzyme capable of hydrolyzing acids.
N-acetylneuraminics, terminals in different glycoproteins (Peyrieras et al. 1-983). The gp300 of
HIV-2 is capable of being digested with neuramidase, as shown by the significant decrease in the electrophoretic mobility of the dimer. The results are in agreement with the observation that the precursor keeps its dimerized form throughout its transport and its transformation in the eyelash, medial and trans cisternae Golgi before being transported in the trans-Golgi network (TGN; Griffiths and Simons, 1986) where it is dissociated when the pH of this compartment is lowered. The dissociated dimer leads to glycoproteins (gp135) with a molecular weight slightly lower than that of the precursor of glycoprotein the first detected (gp150-140). The gp135 could be transported towards the plasma membrane and thus be cleaved by the cellular protease before leading to mature glycoproteins of the envelope of HIV-2, gp125 and gp36.
La monensine inhibe probablement le transport du Golgi vers la membrane plasmique; pour cette raison la gp135 est accumulée dans le Golgi.Monensin probably inhibits transport from the Golgi to the plasma membrane; for this reason gp135 is accumulated in the Golgi.
Il est connu que l'appareil de Golgi est impliqué dans le mécanisme du tri des protéines de secrétion et des protéines de la membrane plasmique. Ce mécanisme semble avoir lieu dans le compartiment terminal du Golgi désigné par TGN (Griffiths et Simons, 1986). Ce compartiment correspond au coté Ntrans" dès empilements de Golgi désigné parfois par lysosomes du réticulum endoplasmique de Golgi (GERL) et désigné récemment par post vacuoles du Golgi ou cisternae le plus interne du complexe de Golgi (Novikoff, 1976
Saraste et Kuismanen 1984 ; Orci et al. 1987). De façon tout à fait intéressante on a étudié le pH du TGN et on a remarqué qu'il était moyennement acide, c'est-à-dire d'environ 6 (Anderson et Pathak, 1985 ; Griffiths et
Simons, 1986). Le pH acide dans le TGN pourrait prendre part dans la dissociation du dimère formé.It is known that the Golgi apparatus is involved in the mechanism of sorting secretion proteins and proteins of the plasma membrane. This mechanism seems to take place in the terminal compartment of the Golgi designated by TGN (Griffiths and Simons, 1986). This compartment corresponds to the Ntrans side "from Golgi stacks sometimes designated by lysosomes of the Golgi endoplasmic reticulum (GERL) and recently designated by post vacuoles of the Golgi or most internal cisternae of the Golgi complex (Novikoff, 1976
Saraste and Kuisman in 1984; Orci et al. 1987). Quite interestingly, we studied the pH of TGN and we noticed that it was moderately acidic, that is to say about 6 (Anderson and Pathak, 1985; Griffiths and
Simons, 1986). The acid pH in the TGN could take part in the dissociation of the dimer formed.
Les résultats discutés précédemment illustrent le fait que la formation et la transformation des glycoprotéines d'enveloppe de HIV-2 entrent dans un processus comprenant plusieurs étapes et impliquant notamment la synthèse d'un précurseur immature gp150-140, la synthèse d'un précurseur dimérisé intermédaire ou gp300 et, finalement d'un précurseur mature la gp135. En dépit de leur parenté les rétrovirus HIV-1 et HIV-2 ont des mécanismes différents pour la formation de leurs glycoprotéines d'enveloppe, ce qui peut être une caractéristique tout à fait avantageuse pour distinguer entre une infection due à HIV-1 et une infection due à HIV-1 et une infection due à HIV-2. The results discussed above illustrate the fact that the formation and transformation of the HIV-2 envelope glycoproteins enter into a process comprising several stages and notably involving the synthesis of an immature precursor gp150-140, the synthesis of a dimerized precursor. intermediate or gp300 and, finally, a mature precursor gp135. Despite their kinship, the HIV-1 and HIV-2 retroviruses have different mechanisms for the formation of their envelope glycoproteins, which may be a very advantageous characteristic for distinguishing between an infection due to HIV-1 and a HIV-1 infection and HIV-2 infection.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8817142A FR2632526B1 (en) | 1988-06-10 | 1988-12-23 | PHARMACEUTICAL COMPOSITION ACTIVE ON THE GLUCOSE RESIDUES OF GLYCOPROTEIN GP 150 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8807817A FR2632644B1 (en) | 1988-06-10 | 1988-06-10 | PRECURSOR ANTIGENS OF HUMAN HIV-2 RETROVIRUS ENVELOPE GLYCOPROTEINS AND ANTIGENS HAVING AN IMMUNOLOGICAL PARENT TO THESE LATTERS. PREPARATION OF THESE ANTIGENS. APPLICATION TO DIAGNOSIS |
| FR8817142A FR2632526B1 (en) | 1988-06-10 | 1988-12-23 | PHARMACEUTICAL COMPOSITION ACTIVE ON THE GLUCOSE RESIDUES OF GLYCOPROTEIN GP 150 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2632526A1 true FR2632526A1 (en) | 1989-12-15 |
| FR2632526B1 FR2632526B1 (en) | 1994-05-13 |
Family
ID=26226718
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR8817142A Expired - Lifetime FR2632526B1 (en) | 1988-06-10 | 1988-12-23 | PHARMACEUTICAL COMPOSITION ACTIVE ON THE GLUCOSE RESIDUES OF GLYCOPROTEIN GP 150 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2632526B1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998003149A1 (en) * | 1996-07-18 | 1998-01-29 | Handelman, Joseph, H. | Reduction of hair growth |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1987003903A1 (en) * | 1985-12-23 | 1987-07-02 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Regulating retroviral replication, infection, and pathogenesis |
| EP0282618A1 (en) * | 1987-03-18 | 1988-09-21 | Vereniging Het Nederlands Kanker Instituut | 1-Deoxynojirimycin as an anti-HIV therapeutic |
| EP0295538A2 (en) * | 1987-06-08 | 1988-12-21 | Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. | Inhibitors of glycoprotein processing having anti retroviral activity |
-
1988
- 1988-12-23 FR FR8817142A patent/FR2632526B1/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1987003903A1 (en) * | 1985-12-23 | 1987-07-02 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Regulating retroviral replication, infection, and pathogenesis |
| EP0282618A1 (en) * | 1987-03-18 | 1988-09-21 | Vereniging Het Nederlands Kanker Instituut | 1-Deoxynojirimycin as an anti-HIV therapeutic |
| EP0295538A2 (en) * | 1987-06-08 | 1988-12-21 | Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. | Inhibitors of glycoprotein processing having anti retroviral activity |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 148, no. 1, 14 octobre 1987, pages 206-210, Academic Press, Inc.; P.S. SUNKARA et al.: "Antiretroviral activity of castanospermine and deoxynojirimycin, specific inhibitors of glycoprotein processing" * |
| NATURE, vol. 330, 5 novembre 1987, page 74; R.A. GRUTERS et al.: "Interference with HIV-induced syncytium formation and viral infectivity by inhibitors of trimming glucosidase" * |
| PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 84, novembre 1987, pages 8120-8124; B.D. WALKER et al.: "Inhibition of human immunodeficiency virus syncytium formation and virus replication by castanospermina" * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998003149A1 (en) * | 1996-07-18 | 1998-01-29 | Handelman, Joseph, H. | Reduction of hair growth |
| US5908867A (en) * | 1996-07-18 | 1999-06-01 | Henry; James P. | Reduction of hair growth |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2632526B1 (en) | 1994-05-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Fennie et al. | Model for intracellular folding of the human immunodeficiency virus type 1 gp120 | |
| TSAI et al. | Inhibition of human immunodeficiency virus infectivity by chloroquine | |
| US7507417B2 (en) | Immunogenic compositions comprising human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2) glycosylated and unglycosylated envelope proteins and their methods of preparation | |
| Bernstein et al. | Human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein is modified by O-linked oligosaccharides | |
| Scanlan et al. | The broadly neutralizing anti-human immunodeficiency virus type 1 antibody 2G12 recognizes a cluster of α1→ 2 mannose residues on the outer face of gp120 | |
| Kowalski et al. | Functional regions of the envelope glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1 | |
| US5807992A (en) | HIV-2 transmembrane glycoprotein homodimer (gp 80) | |
| JP2001502315A (en) | Compositions and methods for treating viral infection | |
| FR2580177A2 (en) | AIDS VIRUS ENVELOPE GLYCOPROTEIN-RELATED ANTIGENS, IN PARTICULAR PRECURSORS OF SUCH GLYCOPROTEIN, PROCESSES FOR OBTAINING SUCH ANTIGENS, AND MEANS USED IN SUCH PROCESSES, APPLICATIONS OF SUCH ANTIGENS TO THE PREPARATION OF IMMUNOGEN COMPOSITIONS AIDS OR RELATED CONDITIONS | |
| US5312902A (en) | Dimer of the precursor of HIV-2 envelope glycoprotein | |
| EP0354072B1 (en) | Precursors of the HIV-2 retrovirus envelope glycoprotein and related antigens | |
| FR2632526A1 (en) | Pharmaceutical composition having an action on the glucose residues of the gp150 glycoprotein | |
| FR2632644A1 (en) | Antigens which are precursors of the envelope glycoproteins of a human retrovirus HIV-2 and antigens which are immunologically related to the latter. Preparation of these antigens. Diagnostic application | |
| JP4423374B2 (en) | Antigen of transmembrane envelope glycoprotein of HIV-2 human retrovirus and antigen having immunological similarity to the antigen | |
| US6056963A (en) | Immunogenic compositions comprising glycosylated and deglycosylated monomeric and dimeric forms of HIV-2 enveloped glycoproteins | |
| KR20090103939A (en) | Sugar immunogens | |
| JP2810179B2 (en) | Method for producing natural HIV GP160 | |
| JPH05506565A (en) | Agents and methods for the treatment of acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) and AIDS-related syndromes (ARC) using anti-carbohydrate antibodies and carbohydrate antigens | |
| EP0400245B1 (en) | Proteins and glycoproteins of the HIV-2 EHO retrovirus antibodies directed against them - application for the diagnosis | |
| FR2646854A1 (en) | Antigens of the envelope transmembrane glycoprotein of a HIV-2 type human retrovirus, antigens exhibiting an immunological relationship with them | |
| JPH03505668A (en) | Specific antibody against Gp48 | |
| SHIMIZU et al. | Effect of N-(3-phenyl-2-propenyl)-1-deoxynojirimycin on the lectin binding to HIV-1 glycoproteins | |
| Spiro et al. | The mechanism of action of iminosugars as antiretrovirals | |
| HU211505A9 (en) | Vaccine composition for the treatment of hiv infections |