FR2624613A1 - Microspheric support for the immunoenzymatic, fluorescent, chemiluminescent or radioactive detection of microdetermined quantities of substances in biological media - Google Patents
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Abstract
Description
La présente invention est relative à une phase solide utile pour la réalisation de tests biologiques rapides utilisant le principe de la réaction antigène-anticorps pour révéler par coloration d'un substrat, la présence de substances en quantités infinitesimales (inférieures au nanogramme > ; ces tests biologiques ont pour but de dépister de nombreuses affections mettant en Cause un agent (l'antigène) et la réaction de l'organisme vis-à-vis de cet agent, c'est-à-dire la révélation et le dosage des anticorps contre cet agent, à partir d'une goutte de tout liquide provenant du corps humain (sang, serum, plasma, urines, salive, larmes, liquide céphalo-rachidien, humeurs urétrales, vaginales, lait maternel, liquides prélevés en per-opératoire ou sur des organes- à greffer pour détecter le Sida par exemple), ou bien encore fragments de solides quelconques solubilisés au préalable ou simplement agités avec un peu d'eau. The present invention relates to a solid phase useful for carrying out rapid biological tests using the principle of the antigen-antibody reaction to reveal by coloring a substrate, the presence of substances in infinitesimal quantities (below nanogram); The purpose of these biological tests is to detect a number of conditions involving an agent (the antigen) and the reaction of the organism to that agent, ie, the revelation and assay of antibodies against this agent, from a drop of any liquid coming from the human body (blood, serum, plasma, urine, saliva, tears, cerebrospinal fluid, urethral humors, vaginal fluid, breast milk, liquids collected during surgery or on organs-to graft to detect AIDS for example), or even fragments of solids any previously solubilized or simply stirred with a little water.
Il existe des dispositifs de détection immunoenzymatique utilisant des antigènes ou des anticorps mais nécessitant d'une part du personnel pour prise de sang, manipulations et d'autre part utilisant un système complexe, coûteux et surtout très long (3 heures) en raison de la-vages répétés suivant des périodes d'incubation d'une demiheure entre chaque phase. There are immunoenzymatic detection devices using antigens or antibodies but requiring on the one hand staff for blood sampling, manipulations and on the other hand using a complex system, expensive and especially very long (3 hours) because of the repeated cycles following incubation periods of half an hour between each phase.
Le dispositif selon l'invention permet de remédier à ces inconvénients et de mettre à la disposition de patients, de médeciùs, de petits Centres de Soins, de
Transfusion, de Services d'Urgences, etc... toute une gamme de tests rapides, puisque ce dispositif qui ne nécessite qu'une goutte de liquide à analyser, permet un diagnostic dans les quelques minutes suivantes en lisant la réaction antigène-anticorps révélée par une réaction colorée ou par mesure de la radio-activité (RIA) liée & un marquage radioactif.The device according to the invention makes it possible to remedy these drawbacks and to make available to patients, medioles, small health centers,
Transfusion, Emergency Services, etc ... a whole range of rapid tests, since this device that requires only a drop of liquid to analyze, allows a diagnosis in the next few minutes by reading the antigen-antibody reaction revealed by a color reaction or by measurement of radioactivity (RIA) linked to radioactive labeling.
Pour détecter la présence d'un antigène ou anticorps dans un liquide biologique, il faut fixer l'antigène ou l'anticorps correspondant sur une phase so- lide, mettre en contact le liquide biologique avec cette phase solide. Si l'antigène est présent dans ce liquide, il se fixe par l'un de ses épitopes à l'anticorps fixé sur la phase solide, puis il est révélé, dans une seconde étape, par un anticorps marqué (enzyme + colorant ou radioactivité). Si l'anticorps est présent dans le liquide biologique, il se fixe par ses extrémités Fab (NH2) à l'antigène préalablement fixé sur la phase solide, puis est révélé par un second anticorps marqué. To detect the presence of an antigen or antibody in a biological fluid, the corresponding antigen or antibody must be fixed on a solid phase, bringing the biological fluid into contact with this solid phase. If the antigen is present in this liquid, it is fixed by one of its epitopes to the antibody fixed on the solid phase, then it is revealed, in a second step, by a labeled antibody (enzyme + dye or radioactivity ). If the antibody is present in the biological fluid, it binds by its ends Fab (NH2) to the antigen previously fixed on the solid phase, then is revealed by a second labeled antibody.
Le schéma reproduit & la figure 1 des dessins annexés illustre les réactions qui viennent d'être décrites. The diagram reproduced in FIG. 1 of the attached drawings illustrates the reactions which have just been described.
Cette technique présente cependant les inconvénients suivants
- fragilité de la fixation d'anticorps ou d'antigènes sur la phase solide, que ce soit par des liaisons physiques (électrostatiques, forces de Van der Vaals, hydrogène ou hydrophobes) ou par des liaisons chimiques (covalentes - COOH,-SH ou -NH2)
- encombrement stérique sur la phase solide l'accumulation de matériel immunologique sur cette phase provoque des réactions électrostatiques de promiscuité (rejet du matériel à doser, faussant le dosage) par des configurations moléculaires et d'électrostatisme, qui interdisent la promiscuité, comme le montre la figure 2 des dessins annexés
- bruit de fond (background) : limite inférieure de la technique de dosage : en dessous d'une certaine concentration, la réponse de cette technique est toujours la même, comme l'illustre, à titre d'exemple, la figure 3 des dessins annexés
- limites de lecture dues & la faiblesse de la coloration ou du comptage RIA
- mauvais rendement : Une réaction antigène fixé-anticorps à doser ne peut descendre au-dessous de 10 nanogrammes par millilitre
- nécessité d'une agitation pour mettre en contact le matériel fixé avec son correspondant dans le liquide testé ;
- éloignement trop important du matériel fixé par rapport à son correspondant dans le liquide à tester, comme le montre le schéma représenté å la figure 4 des dessins annexés ; les puits d'une plaque ont un volume de 0,25 ml en sorte que sion on y introduit 0,25 ml de microbilles, la mise en contact est facilitée
- Dernier inconvénient : ces phases solides exigent de nombreuses manipulations, des lavages multiples et ne sont pas mobilisables (plaques de 96 puits ou tubes).This technique, however, has the following disadvantages
- fragility of the binding of antibodies or antigens on the solid phase, whether by physical bonds (electrostatic, Van der Vaals forces, hydrogen or hydrophobic) or by chemical bonds (covalent - COOH, -SH or NH2)
- steric hindrance on the solid phase the accumulation of immunological material on this phase causes electrostatic promiscuous reactions (rejection of the material to be assayed, biasing the assay) by molecular and electrostatic configurations, which forbid promiscuity, as shown Figure 2 of the accompanying drawings
background noise (bottom): the lower limit of the assay technique: below a certain concentration, the response of this technique is always the same, as illustrated by, for example, Figure 3 of the drawings. appended
- reading limits due to weak staining or RIA counting
poor performance: A fixed antigen-antibody reaction to be assayed can not fall below 10 nanograms per milliliter
- need for agitation to bring the fixed material in contact with its correspondent in the test liquid;
- Too much distance of the fixed material relative to its corresponding in the test liquid, as shown in the diagram shown in Figure 4 of the accompanying drawings; the wells of a plate have a volume of 0.25 ml so that 0.25 ml of microbeads are introduced therein, the bringing into contact is facilitated.
- Last disadvantage: these solid phases require many manipulations, multiple washes and can not be mobilized (96-well plates or tubes).
La courbe représentée à la figure 5 des dessins annexés montre les pertes de matériel immunologique en fonction des lavages.The curve shown in FIG. 5 of the appended drawings shows the losses of immunological material as a function of the washes.
La présente invention a pour but de remédier à ces inconvénients en pourvoyant à une phase solide mobile constituée par des microsphères de diamètre -moyen de 100 microns qui peuvent supporter à leur surface du matériel -immunologique dont la fixation est solide, qui sont stables dans une large fourchette de pH et de températures, qui évitent la gêne et l'encombrement stérique, permettent de diminuer le bruit de fond, d'amplifier la lecture des faibles dosages, d'augmenter le rendement de la réaction antigène -anticorps, réduisent considérablement le temps d'agitation et de lecture, et enfin réduisent à zéro l & distance matériel fixé - matériel à doser. The object of the present invention is to remedy these drawbacks by providing a mobile solid phase consisting of microspheres with a mean diameter of 100 microns which can withstand on their surface solid immunological material which is stable in a medium. wide range of pH and temperature, which avoid annoyance and steric hindrance, help to reduce background noise, amplify the reading of low dosages, increase the efficiency of the antigen-antibody reaction, significantly reduce the stirring and reading time, and finally zero to the fixed material distance - material to be dosed.
La présente invention a pour objet une phase solide mobile constituée par des microbilles-dont chacune comprend
- une matrice présentant à sa surface des fonctions chimiques susceptibles de fixer solidement un revêtement d'activation
- un revêtement d'activation apte à fixer un ligand
- un ligand propre à capturer la molécule à -do- ser dans un milieu liquide.The subject of the present invention is a mobile solid phase consisting of microbeads-each of which comprises
a matrix having, at its surface, chemical functions capable of securely fixing an activation coating
an activation coating capable of fixing a ligand
a ligand capable of capturing the molecule to be dissolved in a liquid medium.
Conformément à la présente invention, la matrice doit répondre aux critères suivants : porosité, solidité, fiabilité (ne pas provoquer d'intéractions non spécifiques), rigidité et surtout doit présenter à sa surface des fonctions chimiques (-OH, Amide, -CONH2) susceptibles de fixer solidement le revêtement désiré (c'est l'activation). Le verre poreux a été éliminé, tous les essais ayant conclu à une activation très difficile. La cellulose présente de nombreux avantages mais est responsable de nombreuses intéractions non spécifiques. According to the present invention, the matrix must satisfy the following criteria: porosity, solidity, reliability (not to cause nonspecific interactions), rigidity and especially must have on its surface chemical functions (-OH, Amide, -CONH2) likely to firmly fix the desired coating (this is activation). Porous glass was discarded, all tests finding very difficult activation. Cellulose has many advantages but is responsible for many nonspecific interactions.
Le polystyrène, malgré de notables progrès dans son activation, ne fixe pas plus de 100 nanogrammes de protéines par cm2 et a présenté au cours des essais un très mauvais WRE (Washing Reduce Effect) : les lavages nécessaires après fixation des protéines immunologiques, emportent une grande partie de ces protéines. Polystyrene, despite significant progress in its activation, does not fix more than 100 nanograms of protein per cm2 and has presented during the tests a very bad WRE (Washing Reduce Effect): the necessary washings after immunological protein binding, carry a much of these proteins.
Certains sucres (polysaccharides) apparemment intéressants par le très grand nombre de groupements -OH (6 par molécule) se sont révélés fragiles (cassants), peu poreux et peu rigides. Some sugars (polysaccharides) apparently interesting by the very large number of -OH groups (6 per molecule) have proved fragile (brittle), not very porous and not rigid.
Selon un mode de réalisation avantageux des microbilles conformes à la présente invention, leur matrice est constituée par une association de limaille d'aluminium, magnétite, floquet acrylique et hydroxyapatite en quantités sensiblement égales
- La limaille d'aluminium apporte la rigidité, la stabilité aux variations de température et de pH, ainsi qu'une neutralité chimique et électrostatique, évitant ainsi les intéractions indésirables.According to an advantageous embodiment of the microbeads according to the present invention, their matrix is constituted by a combination of aluminum filings, magnetite, acrylic float and hydroxyapatite in substantially equal amounts.
- Aluminum filings provide rigidity, stability to temperature and pH variations, as well as chemical and electrostatic neutrality, thus avoiding unwanted interactions.
- La limaille de magnétite, n'apporte qu'une facilité 4e manipulation : elle permet de séparer à l'aide d'un aimant collé contre le tube, les microbilles du li quide du lavage ou du liquide biologique à tester. Ses défauts (cassante, ionisée Fe2o3++ instable,..) sont neutralisés par un revêtement périphérique.approprié, qui est le floquet acrylique. The magnetite filings provide only an easy handling: they make it possible to separate, using a magnet glued against the tube, the microbeads of the liquid of the wash or of the biological liquid to be tested. Its defects (brittle, ionized Fe2o3 ++ unstable, ..) are neutralized by a suitable peripheral coating, which is the acrylic float.
- Le floquet acrylique apporte un élément précieux : un grand nombre de fonctions amides -CONH2 qui vont fixer solidement le revêtement des microbilles. - The acrylic float brings a precious element: a large number of amide -CONH2 functions that will firmly fix the coating of microbeads.
- L'hydroxyapatite est un phosphate cristal lisé (Cas (PO4)2)3 Ca(OH) 2 présentant un intérêt considé- rable : elle présente à sa surface des ions positifs (Ca++) et négatifs (PO1") permettant une fixation chimique de première qualité du ligand. - Hydroxyapatite is a crystalline phosphate (Cas (PO4) 2) 3 Ca (OH) 2 of considerable interest: it has on its surface positive ions (Ca ++) and negative ions (PO1 ") allowing a chemical fixation first quality ligand.
D'autre part, les essais ont permis de constater que les molécules de poids moléculaire très élevé, et qui posent pour cela des problèmes de fixation, sont si so- lidement fixées, qu'il est impossible de les éluer malgré un tampon phosphate 2 M, alors qu'une élution normale se fait avec des tampons compris entre 0,001 et 0,25 M. On the other hand, the tests have shown that molecules of very high molecular weight, which pose fixing problems, are so firmly fixed that it is impossible to elute them in spite of a phosphate buffer. M, whereas a normal elution is done with buffers between 0.001 and 0.25 M.
Selon un autre mode de réalisation avantageux des microbilles conformes à la présente invention, le revêtement d'activation qui recouvre la surface de leur matrice et est propre à fixer un ligand approprié est constitué par un activateur dont la molécule comprend un groupe -CH=C- réactif et notamment par le glutaraldéhyde. According to another advantageous embodiment of the microbeads according to the present invention, the activation coating which covers the surface of their matrix and is capable of fixing a suitable ligand is constituted by an activator whose molecule comprises a group -CH = C - Reagent and in particular with glutaraldehyde.
En effet pour permettre à ces microbilles de fixer un ligand, il faut les activer pour plusieurs raisons
- nécessité d'un intermédiaire entre la surface des billes et l'a molécule à doser, intermédiaire solide et stable réagissant par une face avec la microbille et par l'autre face avec la molécule à doser
- nécessité d'espacer les sites de liaison pour éviter l'empêchement stérique.Indeed to allow these microbeads to fix a ligand, it is necessary to activate them for several reasons
the need for an intermediate between the surface of the beads and the molecule to be determined, a solid and stable intermediate reacting on one side with the microbead and on the other side with the molecule to be assayed
- need to space the binding sites to avoid steric hindrance.
L'activation qui présente le meilleur rapport qualité, facilité / toxicité, instabilit6, est l'activation au glutaraldéhyde selon le schéma représenté à la figure 9 des dessins annexés. The activation with the best quality, ease / toxicity, instability, is glutaraldehyde activation according to the scheme shown in Figure 9 of the accompanying drawings.
Elle est suffisante pour fixer toute protéine par sa fonction amine -NH2 sur le site -CH=C- du glutaraldéhyde selon le schéma
It is sufficient to bind any protein by its amine function -NH2 on the site -CH = C- glutaraldehyde according to the scheme
Protéine.Protein.
Par contre, pour fixer une immunoglobuline par son fragment Fc (COOH), il faut
- soit ajouter un bras d'espacement se terminant par -NH2 pour se lier à -COOH. Le meilleur se révèle être le HMD (hexaméthylènediamine) NH2-(CH2)6-NH2
- soit suractiver la surface des billes.On the other hand, to fix an immunoglobulin by its Fc (COOH) fragment, it is necessary to
- or add a spacer arm ending in -NH2 to bind to -COOH. The best is HMD (hexamethylenediamine) NH2- (CH2) 6 -NH2
- or overactivate the surface of the balls.
Selon encore un autre mode de réalisation avantageux des microbilles conformes à la présente invention, celles-ci comportent un agent de suractivation de leur surface lié à l'agent de revêtement d'activation. According to yet another advantageous embodiment of the microbeads according to the present invention, these comprise an agent for superactivation of their surface bound to the activating coating agent.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit agent de suractivation est constitué par la protéine A, pour la fixation des IgG. According to an advantageous arrangement of this embodiment, said overactivation agent consists of protein A for the binding of IgG.
Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit agent de suractivation est constitué par la protéine G, pour la fixation des IgG. According to another advantageous arrangement of this embodiment, said overactivation agent is constituted by the G protein for the binding of IgG.
Selon encore une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit agent de suractivation est constitué par la protéine A et la protéine G fixées au revêtement d'activation de la matrice des microbilles. According to yet another advantageous arrangement of this embodiment, said overactivation agent consists of protein A and protein G attached to the activation coating of the matrix of microbeads.
Selon un autre mode de réalisation avantageux des microbilles conformes à la présente invention, le ligand est pris dans le groupe qui comprend les anticorps, les antigènes, les immunoglobulines, les antigènes fixés sur des sites appropriés d'immunoglobulines elles-mêmes, fixées selon le cas, au revêtement d'activation ou à l'agent de suractivation porté par la matrice de chacune des microbilles. According to another advantageous embodiment of the microbeads according to the present invention, the ligand is taken from the group which comprises the antibodies, the antigens, the immunoglobulins, the antigens fixed on appropriate sites of immunoglobulins themselves, fixed according to the invention. case, the activation coating or the overactivation agent carried by the matrix of each of the microbeads.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. In addition to the foregoing, the invention also comprises other provisions, which will emerge from the description which follows.
L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère aux dessins annexés et à des exemples de réalisation de ltob- jet de la présente invention
il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples et dessins et les parties descriptives correspondantes, sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.The invention will be better understood with the aid of the additional description which follows, which refers to the accompanying drawings and to embodiments of the invention of the present invention.
it should be understood, however, that these examples and drawings and the corresponding descriptive parts are given solely by way of illustration of the subject of the invention, of which they in no way constitute a limitation.
La figure 6 illustre la composition des microbilles conformes å la présente invention, tandis que la figure 7 illustre la suractivation par les protéines A et- G d'une microbille activée par du glutaraldéhyde. Figure 6 illustrates the composition of microbeads according to the present invention, while Figure 7 illustrates overactivation by A and G proteins of a glutaraldehyde-activated microbead.
Exemple 1 : production des microbilles. Example 1: production of microbeads.
1.1 Production de la matrice
On fait bouillir 100 cm3 d'eau dans un réci- pient approprié dans lequel on verse 100 cm3 de CaCl2 et 100 cm3 de Na2HPO4. On agite doucemment. I1 se forme de la brushite CaHPO4 et 2 NaCl. On jette l'eau et on laisse refroidir en ajoutant de la soude NaOH et agitant 1 minute.1.1 Production of the matrix
100 cm3 of water are boiled in a suitable container into which 100 cm 3 of CaCl 2 and 100 cm 3 of Na 2 HPO 4 are poured. We shake gently. CaHPO4 and 2 NaCl brushite are formed. The water is discarded and allowed to cool by adding sodium hydroxide NaOH and stirring for 1 minute.
Puis on verse 100 cm3 de limaille d'aluminium mélangée auparavant à 100 cm3 de limaille de magnétite, en agitant continuellement pour bien mélanger les composants. On laisse refroidir. On passe à l'eau froide pour éliminer toutes les impuretés. On décolle la plaque formée.et on la place dans un concasseur électrique. On tamise à 100 microns. On lave cette poudre et on la place dans un vase en verre posé sur un aimant puissant. Toutes les billes incom plètes, les débris d'aluminium et les impuretés flottent alors que les microbilles de qualité se collent au fond.On sépare les microbilles et on les rince avec la solution suivante : Tampon 0,01 M acétate d'ammonium pH 4
1 M, chlorure de sodium pH 7
0,01 M Tampon TRIS-HC1 pH 8,5
1.2 Mise en place du revêtement d'activation
On place les billes de matrice obtenues, dans un tampon phosphate 100 mM pH 6,8 pour éliminer toutes les interférences. Les tampons doivent être préparés avec de l'eau 3 fois distillée et stérile. On ajoute 100 cm3 de glutaraldéhyde à 25 % et on incube 24 heures à 37 C, on rince avec un tampon phosphate pH 7,6 , 0,5 M et on maintient à 4 C en présence d'un bactériostatique & 0,015 % type Merthiolate ou azide de sodium.Then poured 100 cm3 of aluminum filings previously mixed with 100 cm3 of magnetite filings, stirring continuously to mix the components well. Let cool. Cold water is used to remove all impurities. The plate is removed and placed in an electric crusher. Sieve at 100 microns. This powder is washed and placed in a glass vase placed on a strong magnet. All incomplete beads, aluminum scrap and impurities float while the quality microbeads stick to the bottom. The microbeads are separated and rinsed with the following solution: Buffer 0.01 M ammonium acetate pH 4
1M sodium chloride pH 7
0.01 M TRIS-HC1 buffer pH 8.5
1.2 Activation coating placement
The obtained matrix beads are placed in 100 mM phosphate buffer pH 6.8 to eliminate all interference. Buffers should be prepared with distilled, sterile 3 times water. 100 cm3 of 25% glutaraldehyde are added and the mixture is incubated for 24 hours at 37 ° C., rinsed with a pH 7.6, 0.5 M phosphate buffer and maintained at 4 ° C. in the presence of a bacteriostatic agent and 0.015% Merthiolate type. or sodium azide.
1.3 Fixation du ligand
1.3.1 fixation d'un antigène
On place les microbilles activées, dans une so- lution de 100 ml de tampon phosphate 0,5 M, pH 7,6 + 5 mg d'un antigène. On soumet à agitation pendant 18 heures à +4"C, puis on lave avec 10 volumes du tampon phosphate susdit.1.3 Ligand fixation
1.3.1 antigen binding
The activated microbeads are placed in a solution of 100 ml of 0.5 M phosphate buffer, pH 7.6 + 5 mg of antigen. The mixture is stirred for 18 hours at +4 ° C. and then washed with 10 volumes of the above-mentioned phosphate buffer.
1.3.2. Fixation d'un anticorps. 1.3.2. Fixing an antibody.
Pour fixer 1 mg d'anticorps, on utilise 0,25 ml de microbilles activées, que l'on rince avec 10 volumes d'eau désionisée stérile, après quoi l'on ajoute 3 volumes de tampon phosphate 0,5 M, pH 7,6 dans lesquels a été ajouté 1 mg d'immunoglobulines lyophilisées ou en solution. To fix 1 mg of antibody, 0.25 ml of activated microbeads is used, which is rinsed with 10 volumes of sterile deionized water, after which 3 volumes of 0.5 M phosphate buffer, pH 7, are added. , In which 1 mg of freeze-dried or dissolved immunoglobulins was added.
Après agitation pendant toute une nuit, en maintenant à +4 C, on rince avec le tampon précité pour éliminer les Ig non fixées, puis on traite par un même volume d'un tampon à pH 7,5-8,5 , à +4 C, on rince, on ajoute un bactériostatique et on maintient à +4 C. Les microbilles obtenues sont prêtes à l'emploi ; leur diamètre est avantageusement de 100 microns, leur surface de 0,0314 mm2 et leur volume de 0,0005236 mm3. After stirring overnight, keeping at +4 ° C., the above-mentioned buffer is rinsed to remove non-fixed Ig, and then treated with the same volume of a pH 7.5-8.5 buffer, + 4 C, rinsed, added a bacteriostatic and maintained at +4 C. The microbeads obtained are ready for use; their diameter is advantageously 100 microns, their area of 0.0314 mm 2 and their volume of 0.0005236 mm 3.
Cette solution semble, en effet la plus performante : on fixe en premier lieu une Ig x en profitant des fortes capacités de fixation des Ig. L'antigène à doser se fixera sur les sites Fab et sera révélé par une Ig y dirigée contre l'epitope y encore libre sur l'antigène. This solution seems to be the most efficient: we first fix an Ig x taking advantage of strong Ig binding capacity. The antigen to be assayed will bind to the Fab sites and will be revealed by an Ig against the epitope still free on the antigen.
Pour doser une Ig, il suffira de fixer préalablement un antigène sur les Ig déjO fixées. L'Ig recherchée se fixe par ses sites Fab sur l'antigène. Elle sera révélée par une Ig anti-Fragment Fc, marquée. To assay an Ig, it will suffice to fix an antigen on IgO fixed. The Ig sought is fixed by its Fab sites on the antigen. It will be revealed by a labeled anti-Fragment Ig Fc.
La longueur et la grande masse de ce convoi ne posent aucun problème. La détectabilité est multipliée par 10, tandis que tous les inconvénients de la fixation directe d'antigènes (bruit de fond, gène stérique,...) sont considérablement diminués, les Ig fixées se comportant comme d'excellents bras d'espacement. The length and the great mass of this convoy pose no problem. The detectability is multiplied by 10, while all the disadvantages of the direct fixation of antigens (background, steric gene, ...) are considerably diminished, the fixed Ig behaving like excellent spacing arms.
Les figures 10 et 11 illustre respectivement un ligand pour la recherche d'antigène et un ligand pour la recherche d'anticorps. Figures 10 and 11 illustrate a ligand for antigen detection and a ligand for antibody screening, respectively.
Exemple 2 : Préparatlon de microbilles suractivés
Les microbilles activées obtenues conformément à l'exemple 1.2, sont placées dans une solution de 100 ml de tampon phosphate 0,5 M, pH 7,6 contenant 5 mg -de protéine A lyophilisée. On soumet à agitation (sur Titertek force 4 par exemple) pendant 18 heures à +4 C, on lave avec 10 volumes du tampon ci-dessus.Example 2 Preparation of Overactivated Microbeads
The activated microbeads obtained according to Example 1.2 are placed in a solution of 100 ml of 0.5 M phosphate buffer, pH 7.6, containing 5 mg of freeze-dried protein A. The mixture is stirred (on Titertek force 4, for example) for 18 hours at +4 ° C., and washed with 10 volumes of the buffer above.
Pour bloquer les groupes aldéhyde libres res- tants du glutaraldéhyde, on traite avec un tampon d'éthanolamine ou de Tris 0,1 M, pH 7,5-8,5 pendant .3 heures à +4 C, puis on rince avec 10 volumes de tampon phosphate 0,5 M, pH 7,6 contenant 0,15 M NaCl ; on équilibre ensuite avec 1 volume de tampon phosphate 0,5 M, pH 7,6 contenant un bactériostatique approprié. To block the remaining free aldehyde groups of glutaraldehyde, treated with a buffer of ethanolamine or 0.1M Tris pH 7.5-8.5 for 3 hours at +4 C, then rinsed with 10 volumes of 0.5 M phosphate buffer, pH 7.6, containing 0.15 M NaCl; then equilibrated with 1 volume of 0.5M phosphate buffer, pH 7.6 containing a suitable bacteriostatic.
Sur ces microbilles suractivées, on fixe le ligand comme décrit à l'Exemple 1.3 et l'on obtient des microbilles prêtes à l'emploi, comme représenté à la figure 8 des dessins annexés. On these hyperactivated microbeads, the ligand is fixed as described in Example 1.3 and microbeads are obtained ready for use, as shown in Figure 8 of the accompanying drawings.
Exemple 3 : Dssaoe d'antiaenes
On place 0,25 ml de microbilles prêtes à l'emploi, clest-à-dire revêtues de protéines A et de l'anticorps spécifique de l'antigène, dans un tube minisorb de NUNC (qui n'adsorbe que très peu de matériel immunologique) ou dans un tube en verre déjd préparé par des blo quants de surface. On y ajoute 0,75 ml de tampon phosphate 0,5 M, pH 7,6 et 1 ml du sérum à analyser, on ferme le tube et on agite horizontalement 3 minutes à la main ou sur agitateur en cas de séries. On place un aimant contre les parois du tube et on jette tous les liquides.Example 3: Dssaoe of antiaenes
0.25 ml of ready-to-use microspheres, i.e. coated with protein A and antigen-specific antibody, are placed in a NUNC minisorb tube (which absorbs only very little material). immunological) or in a glass tube already prepared by surface blocking agents. 0.75 ml of 0.5 M phosphate buffer, pH 7.6 and 1 ml of the test serum are added thereto, the tube is closed and the mixture is stirred horizontally for 3 minutes by hand or on a stirrer in case of series. A magnet is placed against the walls of the tube and all the liquids are thrown away.
On ajoute 1 ml de l'Ig marquée spécifique de l'antigène et on agite 3 minutes. On place l'aimant contre le tube et on jette tous les liquides. On rince avec le même tampon. Si le marquage est radioactif, on compte les coups. S''il est enzymatique, on ajoute 1 ml de substrat + chromogène et on mesure la réaction colorée en D.O. 1 ml of the labeled antigen-specific Ig is added and stirred for 3 minutes. The magnet is placed against the tube and all liquids are thrown away. Rinse with the same buffer. If the marking is radioactive, the counts are counted. If it is enzymatic, 1 ml of substrate + chromogen is added and the color reaction is measured in D.O.
ExemPle 4 : Dosaae d'anticorps
On place 0,25 ml de microbilles suractivées comme décrit à l'Exemple 2 et préparées comme décrit à l'Exemple 1, avec un antigène correspondant à l'anticorps recherché. On ajoute 1 ml de sérum à analyser, l'anticorps recherché se fixe sur l'antigène. On jette les liquides, on rince et on ajoute 1 ml à 1/2000 d'une Ig marquée, spécifique du segment Fc de l'anticorps recherché. On rince plusieurs fois et on lit la réaction.EXAMPLE 4 Antibody Dosaae
0.25 ml of overactivated microbeads are placed as described in Example 2 and prepared as described in Example 1, with an antigen corresponding to the desired antibody. 1 ml of serum is added to analyze, the desired antibody is fixed on the antigen. The liquids are discarded, rinsed and 1 ml to 1/2000 of a labeled Ig specific for the Fc segment of the desired antibody is added. Rinsed several times and read the reaction.
Les performances constatées sont les suivantes
- 1 ml de microbilles, présentant une surface réactive de 600 cm2 fixe 3,3 mg de protéine A
- Comme 1 mg de protéine A fixe 12 mg d'IgG, 600 cm2 de microbilles fixent 40 mg d'IgG, soit 0,066667 mg ou 66667 nanoaramme~pv 33
par comparaison : Les mêmes microbilles sans protéine A ne fixent que 4333 ng/cm2.The performances observed are as follows
- 1 ml of microbeads, having a reactive surface of 600 cm 2 fixed 3.3 mg of protein A
- As 1 mg of fixed protein A 12 mg of IgG, 600 cm 2 of microbeads set 40 mg of IgG, or 0.066667 mg or 66667 nanoaramme ~ pv 33
by comparison: The same microbeads without protein A fix only 4333 ng / cm2.
Une surface de polystyrène, même activée, ne fixe que 400 ng/cm2 et seulement 100 ng/cm après 6 la- yages. A polystyrene surface, even when activated, sets only 400 ng / cm2 and only 100 ng / cm after 6 wipes.
.- On augmente encore les performances de détectabilité de cette méthode notamment par chauffage des IgG à fixer, à 135'C pendant quelques minutes. Le segment Pc est dénaturé à cette température et se fixe encore plus solide ment à la protéine A. Le segment Fab reste intact à cette température
- I1 est possible d'effectuer un dosage par cette méthode avec seulement une goutte de sang de 50 til, les seuils de détectabilité très bas enregistrés, permettant le microdosage sur sang total
- Un problème peut se poser pour les très faibles concentrations : cf schéma gène stérique. L'Ig mar.- quée est bivalente (se fixant à 2 antigènes) mais peut se fixer par un seul antigène.The detection performance of this method is further increased, in particular by heating the IgG to be fixed at 135 ° C. for a few minutes. The Pc segment is denatured at this temperature and binds even more firmly to protein A. The Fab segment remains intact at this temperature
- It is possible to perform an assay by this method with only a drop of blood of 50 til, the thresholds of detectability very low recorded, allowing the microdosing on whole blood
- A problem can arise for very low concentrations: cf steric gene diagram. Mar-Ig is bivalent (binding to 2 antigens) but can be fixed by a single antigen.
La mesure indiquera alors le double de la concentration réelle. Pour y remédier, la meilleure solution est d'utiliser des fragments Fab marqués, comme représenté à la figure 12 des dessins annexés. The measurement will then show twice the actual concentration. To remedy this, the best solution is to use labeled Fab fragments, as shown in Figure 12 of the accompanying drawings.
Avantages : UN segment Fab pour UN antigène. Advantages: A Fab segment for AN antigen.
Inconvénients : Les segments Fab ont une détectabilité inférieure aux Ig complètes. Disadvantages: Fab segments have lower detectability than full Ig.
Pour y remédier-: choisir des Fab de très haute affinité et au besoin, amplifier la réponse avec un second
Fab marqué dirigé contre le précédent.To remedy this: choose very high affinity Fabs and, if necessary, amplify the response with a second one.
Marked Fab directed against the previous.
- il est en outre possible de placer dans le tube des microbilles activées contre différentes affections par exemple : 0,25 ml de billes pour HIV1, 0,25 pour HIV2, 0,25 l'hépatite. Une réaction positive indiquera qu'une des trois infections est présente, permettant d'orienter les examens suivants. - It is also possible to place in the tube activated microbeads against different conditions for example: 0.25 ml of beads for HIV1, 0.25 for HIV2, 0.25 hepatitis. A positive reaction will indicate that one of the three infections is present, making it possible to guide the following examinations.
Il sera intéressant de fixer un groupe de marqueurs tumoraux de la sphère digestive, ou gynécologique ou respiratoire. En cas de réaction positive, il est procédé & une exploration organe par organe avec des tests identiques mais ne supportant que les marqueurs de l'organe exploré. It will be interesting to set a group of tumoral markers of the digestive or gynecological or respiratory sphere. In the case of a positive reaction, organ-by-organ exploration is carried out with identical tests but supporting only the markers of the organ explored.
Une réaction positive orientera les examens spécialisés (Fibroscopie, Biopsies,...). L'utilisation des microbilles conformes à l'invention a permis, lors des essais, de franchir des seuils de détectabilité nouveaux. A positive reaction will guide the specialized examinations (Fibroscopy, Biopsies, ...). The use of the microbeads in accordance with the invention has made it possible, during the tests, to cross new detectability thresholds.
Elle procure de nouvelles perspectives en hormonologie, do sages des marqueurs tumoraux, et de l'antigène HIV qui est virtuellement indétectable, complétant ainsi le dépistage des anticorps dont -la négativité est fréquente et la positivité tardive chez un nombre de plus en plus grand de personnes contaminées. Si le seuil de détectabilité de l'antigène HIV est atteint par cette méthode, elle intéressera toute la virologie.It provides new insights into hormonology, tumor markers, and HIV antigen that is virtually undetectable, thus completing antibody screening, of which negativity is frequent and late positivity in a growing number of patients. infected people. If the threshold of detectability of the HIV antigen is reached by this method, it will interest the whole virology.
Elle est également destinée à la détection précoce et rapide de nombreuses affections (Syphilis, Hépatites,...) et à obtenir des indications biologiques rapides telles les groupages sanguins, l'évaluation d'Enzymes circulants et enfin le diagnostic d''affections difficiles å apprécier (Rage, Paludisme,...). It is also intended for the early and rapid detection of many conditions (Syphilis, Hepatitis, ...) and to obtain rapid biological indications such as blood groupings, the evaluation of circulating enzymes and finally the diagnosis of difficult affections. to appreciate (Rabies, Malaria, ...).
Les microbilles conformes à la présente invention sont capables d'être utilises à' titre d'exemples non limitatifs pour
Le diagnostic des affections virales,
Le diagnostic des affections microbiennes,
Les dosages enzymatiques,
Les maladies auto-immunes et maladie d 'Alzheimer,
Les groupages sanguins rapides,
Le dépistage de cancers,
Le dosage de médicaments circulants,
La détection d'allergènes. Diagnostic d'allergies,
Les dosages des récepteurs membranaires,
Les dosages d'hormones,
Les dosages divers (Anions Cations de l'ionogramme, métaux, et d'une manière générale tous les éléments de la Classification de Mendeleieff).The microbeads according to the present invention are capable of being used as non-limiting examples for
The diagnosis of viral diseases,
Diagnosis of microbial diseases,
Enzymatic assays,
Autoimmune diseases and Alzheimer's disease,
Rapid blood grouping,
Cancer screening,
The dosage of circulating drugs,
The detection of allergens. Allergy diagnosis,
The membrane receptor assays,
Hormone dosages,
Various assays (Anions Cations of the ionogram, metals, and generally all elements of the Mendeleieff Classification).
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir å l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. As is apparent from the above, the invention is not limited to those of its modes of implementation, implementation and application which have just been described more explicitly; on the contrary, it embraces all the variants that may come to the mind of the technician in the field, without departing from the scope or scope of the present invention.
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Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0397113A2 (en) * | 1989-05-09 | 1990-11-14 | Roche Diagnostics GmbH | Method of detecting specific binding substances in body fluids |
EP1239284A1 (en) * | 2001-03-08 | 2002-09-11 | The Technology Partnership Public Limited Company | Non-separation assay method and system using opaque particles |
WO2006052924A2 (en) * | 2004-11-08 | 2006-05-18 | Nanobac Life Sciences | Methods and compositions for protein-hydroxy apatite complexes and their application in testing and modulating immunological system including a novel in vitro test for the detection of antibodies against calcium binding protein-hydroxy apatite complexes |
CN110736738A (en) * | 2018-07-18 | 2020-01-31 | 博阳生物科技(上海)有限公司 | microsphere composition for chemiluminescence detection and application thereof |
CN114212964A (en) * | 2021-12-13 | 2022-03-22 | 重庆德润环境有限公司 | Resource utilization method for river and lake dredging sediment |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0016552A1 (en) * | 1979-02-28 | 1980-10-01 | Kendrew Biosystems, Inc. | Method of magnetic separation of cells and the like, and microspheres for use therein |
EP0184710A2 (en) * | 1984-12-08 | 1986-06-18 | Bayer Ag | Magnetic microspheres |
EP0234083A2 (en) * | 1986-02-25 | 1987-09-02 | Tosoh Corporation | Carrier for a biologically active component for immunoassay or enzymatic reaction |
EP0240770A1 (en) * | 1986-03-18 | 1987-10-14 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Coated chromium dioxide particles |
-
1987
- 1987-12-15 FR FR8717616A patent/FR2624613B1/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0016552A1 (en) * | 1979-02-28 | 1980-10-01 | Kendrew Biosystems, Inc. | Method of magnetic separation of cells and the like, and microspheres for use therein |
EP0184710A2 (en) * | 1984-12-08 | 1986-06-18 | Bayer Ag | Magnetic microspheres |
EP0234083A2 (en) * | 1986-02-25 | 1987-09-02 | Tosoh Corporation | Carrier for a biologically active component for immunoassay or enzymatic reaction |
EP0240770A1 (en) * | 1986-03-18 | 1987-10-14 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Coated chromium dioxide particles |
Cited By (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0397113A2 (en) * | 1989-05-09 | 1990-11-14 | Roche Diagnostics GmbH | Method of detecting specific binding substances in body fluids |
EP0397113A3 (en) * | 1989-05-09 | 1991-05-29 | Roche Diagnostics GmbH | Method of detecting specific binding substances in body fluids |
US5212063A (en) * | 1989-05-09 | 1993-05-18 | Boehringer Mannheim Gmbh | Ligand trap useful in immunoassays of biotin or free biotin containing samples and improved immunoassays using these ligand traps |
EP1239284A1 (en) * | 2001-03-08 | 2002-09-11 | The Technology Partnership Public Limited Company | Non-separation assay method and system using opaque particles |
WO2002073198A2 (en) * | 2001-03-08 | 2002-09-19 | The Technology Partnership Plc | Non-separation assay and system using opaque particles |
WO2002073198A3 (en) * | 2001-03-08 | 2003-05-30 | The Technology Partnership Plc | Non-separation assay and system using opaque particles |
WO2006052924A2 (en) * | 2004-11-08 | 2006-05-18 | Nanobac Life Sciences | Methods and compositions for protein-hydroxy apatite complexes and their application in testing and modulating immunological system including a novel in vitro test for the detection of antibodies against calcium binding protein-hydroxy apatite complexes |
WO2006052924A3 (en) * | 2004-11-08 | 2006-09-14 | Nanobac Life Sciences | Methods and compositions for protein-hydroxy apatite complexes and their application in testing and modulating immunological system including a novel in vitro test for the detection of antibodies against calcium binding protein-hydroxy apatite complexes |
CN110736738A (en) * | 2018-07-18 | 2020-01-31 | 博阳生物科技(上海)有限公司 | microsphere composition for chemiluminescence detection and application thereof |
CN114212964A (en) * | 2021-12-13 | 2022-03-22 | 重庆德润环境有限公司 | Resource utilization method for river and lake dredging sediment |
CN114212964B (en) * | 2021-12-13 | 2024-03-15 | 重庆德润环境有限公司 | River and lake dredging sediment recycling method |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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FR2624613B1 (en) | 1994-08-26 |
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