FR2623817A1

FR2623817A1 - Probes for detecting enteroviruses by molecular hybridisation and for discriminating between polioviruses and other enteroviruses

Info

Publication number: FR2623817A1
Application number: FR8716434A
Authority: FR
Inventors: Helena Kopecka; Lucyna Cova; Michele Aymard; Marc Girard
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Pasteur de Lille; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Pasteur de Lille; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 1987-11-26
Filing date: 1987-11-26
Publication date: 1989-06-02
Anticipated expiration: 2007-11-26
Also published as: FR2623817B1

Abstract

The invention relates to probes for molecular hybridisation which permit the detection of an enterovirus in a biological sample, especially of human origin, such as stools. These probes consist of cRNAs resulting especially from the enzymatic transcription of cDNAs, which are themselves transcribed from enterovirus RNA.

Description

SONDES POUR LA DETECTION D'ENTEROVIRUS PAR HYBRIDATION
MOLECULAIRE ET POUR LA DISCRIMINATION ENTRE DES POLIO
VIRUS ET D'AUTRES ENTEROVIRUS.PROBES FOR DETECTION OF ENTEROVIRUSES BY HYBRIDIZATION
MOLECULAR AND FOR DISCRIMINATION BETWEEN POLIO
VIRUSES AND OTHER ENTEROVIRUSES.

Les entérovirus comportent des virus dont un certain nombre provoquent de graves maladies chez l'homme. Parmi les entérovirus, les plus étudiés sont les trois types de poliovirus ; les autres membres, comme les coxsackievirus, le virus de l'hépatite A < HAV), les Echovirus, posent toujours un problème médical sérieux tant dans les pays développés que dans les pays en voie de développement. Enteroviruses contain viruses, a number of which cause serious illness in humans. Among the enteroviruses, the most studied are the three types of poliovirus; the other members, such as coxsackieviruses, the hepatitis A virus (HAV), the Echoviruses, still pose a serious medical problem in both developed and developing countries.

Les laboratoires de diagnostic utilisent des tests immunologiques assez simples (micro-tests de neutralisation, ELISA..) pour caractériser les entérovirus isolés. Dans la majorité des cas, si on dispose d'une batterie d'anticorps de spécificité étroite (il n'existe pas de spécificité de groupe), on parvient à distinguer sans équivoque différentes souches virales. Dans quelques cas cependant, les méthodes sérologiques sont en défaut car elles n'explorent que les protéines de capside et uniquement sous l'-angle de leurs épitopes. The diagnostic laboratories use fairly simple immunological tests (neutralization micro-tests, ELISA, etc.) to characterize the isolated enteroviruses. In the majority of cases, if one has a battery of antibodies of narrow specificity (there is no group specificity), one succeeds in unequivocally distinguishing different viral strains. In some cases, however, serological methods are lacking because they only explore capsid proteins and only from the angle of their epitopes.

L'analyse du génome viral réalisée par les méthodes biochimiques apparait comme un outil complémentaire sinon plus sensible. The analysis of the viral genome carried out by biochemical methods appears to be a complementary tool if not more sensitive.

Les hybridations moléculaires des acides nucléiques ont été appliquées avec succès dans la détection rapide de différents virus à DNA ou'RNA. Dans les tests d'hybridation, les acides nucléiques sont fixés sur le support solide et détectés par les sondes radioactives ou non radioactives, alors dites 'froides". On a ainsi développé comme sondes l'utilisation des fragments de restriction du cDNA des virus à RNA, que l'on peut hautement marquer par "nick-translation" (translation de coupure) ou encore des oligonucléotides de synthèse marqués en 5' ou 3'. Molecular hybridizations of nucleic acids have been successfully applied in the rapid detection of various DNA or RNA viruses. In the hybridization tests, the nucleic acids are fixed on the solid support and detected by radioactive or non-radioactive probes, then called "cold". We have thus developed as probes the use of restriction fragments of the cDNA of viruses with RNA, which can be highly marked by "nick-translation" or synthetic oligonucleotides labeled in 5 'or 3'.

Ceci étant, les sondes obtenues ne permettent pas, dans de nombreux cas, soit d'identifier un entérovirus dans les échantillons ou prélèvements biologiques en raison d'une sensibilité insuffisante de la sonde, soit d'identifier la catégorie d'entérovirus à laquelle l'espèce identifiée appartient dans le cas où une hybridation est détectée. However, the probes obtained do not allow, in many cases, either to identify an enterovirus in biological samples or samples due to insufficient sensitivity of the probe, or to identify the category of enterovirus to which the he identified species belongs in the event that hybridization is detected.

L'invention a pour but de remédier à ces inconvénients, notamment de fournir des sondes à la fois plus sensibles et plus spécifiques. The invention aims to remedy these drawbacks, in particular to provide probes that are both more sensitive and more specific.

Les sondes d'hybridation moléculaire selon l'invention sont caractérisées en ce qu'elles sont constituées par des ARN (acides ribonucléiques aussi désignées ci-après par l'abréviation RNA) résultant notamment de la transcription des cDNA correspondants (eux-mêmes dérivés de RNA d'entérovirus) en présence d'une RNApolymérase, en présence des quatre ribonucléotides. Ces derniers RNA sont ci-après désignés "cRNA". The molecular hybridization probes according to the invention are characterized in that they consist of RNAs (ribonucleic acids also designated below by the abbreviation RNA) resulting in particular from the transcription of the corresponding cDNAs (themselves derived from Enterovirus RNA) in the presence of an RNApolymerase, in the presence of the four ribonucleotides. These latter RNA are hereinafter referred to as "cRNA".

Bien que le HAV (dont le génome a été séquencé : voir demande de brevet européen n 86.302465.9/199 480) ne constitue pas à proprement parler un entérovirus, il sera considéré comme en faisant partie, pour les besoins de la présente description. A titre d'autres exemples d'entérovirus pris en considération dans le cadre de la présente invention, on mentionnera - le poliovirus de type 1 (PV1),notamment les sondes de la souche Mahoney, - les poliovirus de types.2 et 3 (PV2 et PV3), - les Coxsackievirus, notamment les Coxsackievirus A, par exemple de types 7, 9 et 21 (CA7, CA9 et CA21) et les Coxsackievirus B, par exemple de types 1, 3 et 4 (CB1, CB3 et CB4), - les échovirus, par exemple de types 9, 11 et 33 (ECHO9, ECHO1? et ECHO33), - les rhinovirus, par exemple de type 2 (HRV2) etc... Although HAV (whose genome has been sequenced: see European patent application No. 86.302465.9 / 199,480) does not strictly speaking constitute an enterovirus, it will be considered to be part of it, for the purposes of the present description. As other examples of enteroviruses taken into consideration in the context of the present invention, mention will be made of - type 1 poliovirus (PV1), in particular probes of the Mahoney strain, - types 2 and 3 ( PV2 and PV3), - Coxsackieviruses, in particular Coxsackievirus A, for example of types 7, 9 and 21 (CA7, CA9 and CA21) and Coxsackievirus B, for example of types 1, 3 and 4 (CB1, CB3 and CB4 ), - echoviruses, for example of types 9, 11 and 33 (ECHO9, ECHO1? and ECHO33), - rhinoviruses, for example of type 2 (HRV2) etc ...

L'invention concerne plus particulièrement - les cRNA correspondant à la région de VPl des poliovirus, - les cRNA correspondant aux régions 5' non codantes des génomes des entérovirus, plus particulièrement des poliovirus de types 1, 2 et 3, et - les cRNA de HAV, correspondant aux régions 5' non codante, centrale et 3' terminale. The invention relates more particularly to - the cRNAs corresponding to the VP1 region of the polioviruses, - the cRNAs corresponding to the 5 ′ non-coding regions of the genomes of enteroviruses, more particularly of type 1, 2 and 3 polioviruses, and - the cRNAs of HAV, corresponding to the 5 'non-coding, central and 3' terminal regions.

Les sondes cRNA selon l'invention se sont avérées non seulement plus sensibles que les cDNA correspondant dans des essais d'hybridation moléculaire appliqués à la détection de la présence d'ARN d'entérovirus dans des échantillons biologiques, notamment des selles de sujets infectés, mais également capables, du moins pour certains d'entre eux, de discriminer certaines catégories d'entérovirusentre elles. The cRNA probes according to the invention have proved not only more sensitive than the corresponding cDNAs in molecular hybridization tests applied to the detection of the presence of enterovirus RNA in biological samples, in particular the stools of infected subjects, but also capable, at least for some of them, of discriminating certain categories of enterovirus between them.

Il a en particulier été constaté que: - les cRNA correspondant aux régions 5' non codantes des poliovirus permettent la détection de la présence d'entérovirus dans des échantillons biologiques, notamment de selles, avec un grand degré de sensibilité, néanmoins sans les distinguer entre eux. In particular, it was noted that: the cRNAs corresponding to the 5 ′ non-coding regions of the polioviruses allow the detection of the presence of enteroviruses in biological samples, in particular of stool, with a high degree of sensitivity, nevertheless without distinguishing them between them.

- en revanche, les cRNA correspondant à la région VP1 du poliovirus permettent de différencier en cas de réponse positive les poliovirus des autres entérovirus, à l'exception de CA21 du fait de sa grande homologie de séquence avec les poliovirus.- on the other hand, the cRNAs corresponding to the VP1 region of the poliovirus make it possible to differentiate, in the event of a positive response, the polioviruses from the other enteroviruses, with the exception of CA21 due to its great sequence homology with the polioviruses.

- les cRNA de HAV permettent la détection des HAV et leur discrimination avec d'autres entérovirus, là où les techniques antérieures échouaient souvent dans des opérations de diagnostic visant à identifier une hépatite A ou une infection à entérovirus chez les malades infectés avec les virus correspondants. - HAV cRNAs allow the detection of HAVs and their discrimination with other enteroviruses, where prior techniques often failed in diagnostic operations aimed at identifying hepatitis A or enterovirus infection in patients infected with the corresponding viruses .

Les constatations qui précèdent découlent en particulier des essais dont une description est donnée ci-après à titre d'exemples. The foregoing observations arise in particular from the tests, a description of which is given below by way of examples.

Auparavant l'on indique brièvement les conditions dans lesquelles les différentes sondes cRNA ont été obtenues. Previously, the conditions under which the various cRNA probes were obtained are briefly indicated.

1/ Synthèse des sondes cRNA
Les fragments de cDNA du poliovirus de type 1 (souche Mahoney) corespondant aux régions génomiques 5' non codantes (nucléotides 221-670), régions de protéines de la capside VP1 (nucléotides 3064-3417), VP3 (nucléotides 1809-2243), de la région centrale 2C (nucléotides 4601-4886) et de la région 3' (nucléotides 6500-7443), ont été insérés dans les vecteurs Gemini 1 ou 2 commercialisés par la société PROMEGA-BIOTECH, entre les promoteurs SP6 et T7 de ces vecteurs.1 / Synthesis of cRNA probes
The cDNA fragments of type 1 poliovirus (Mahoney strain) corresponding to the 5 'non-coding genomic regions (nucleotides 221-670), capsid protein regions VP1 (nucleotides 3064-3417), VP3 (nucleotides 1809-2243), of the central region 2C (nucleotides 4601-4886) and of the region 3 '(nucleotides 6500-7443), were inserted into the Gemini 1 or 2 vectors marketed by the company PROMEGA-BIOTECH, between the promoters SP6 and T7 of these vectors.

Le plasmide contenant l'insérat de cDNA est linéarisé par un enzyme de restriction approprié. La séquence du cDNA inséré est alors transcrite en cRNA à l'aide de la SP6 - ou T7-RNA-polymérase, en présence de 4 nucléotides triphosphate, dont l'un est marqué par un radioélément l'a 32P-UTP. On obtient une sonde hautement radioactive (activité spécifique > à 2 x 108 cpm/pg). The plasmid containing the cDNA insert is linearized with an appropriate restriction enzyme. The sequence of the inserted cDNA is then transcribed into cRNA using SP6 - or T7-RNA-polymerase, in the presence of 4 nucleotide triphosphate, one of which is labeled with a radioelement a 32P-UTP. A highly radioactive probe is obtained (specific activity> at 2 × 108 cpm / pg).

Selon l'orientation de l'insérat par rapport aux promoteurs de SP6 ou T7, on synthétise des cRNA de polarité négative ou positive. Depending on the orientation of the insert relative to the SP6 or T7 promoters, cRNAs of negative or positive polarity are synthesized.

Les exemples qui suivent illustrent plus complètement encore les conditions dans lesquelles les sondes cRNA selon l'invention peuvent être utilisées. The examples which follow illustrate more fully the conditions under which the cRNA probes according to the invention can be used.

2/ Test d'hybridation Par taches (Dot-hvbridation).2 / Spot hybridization test (Dot-hybridization).

Des échantillons de lysats cellulaires ou de surnageants d'échantillons de selles reprises dans un milieu nutritif (BME de Eagle) ont été incubés en présence de protéinase K (100 pg/ml) pendant 1 heure à 37ex. Les aliquots d'échantillons ont été dilués avec 20 x SSC et directement appliqués sur un filtre de cellulose (0,45 pm SCLEICHER AND SCHUE) en utilisant un appareil permettant le dépôt d'échantillon par aspiration sous vide (hybridot manifold apparatus de BRL par exemple). Samples of cell lysates or of supernatants from stool samples taken up in a nutrient medium (BME from Eagle) were incubated in the presence of proteinase K (100 μg / ml) for 1 hour at 37 ×. The aliquots of samples were diluted with 20 x SSC and directly applied to a cellulose filter (0.45 pm SCLEICHER AND SCHUE) using an apparatus allowing the deposition of the sample by vacuum aspiration (hybridot manifold apparatus of BRL by example).

100 pl de lysat de cellules infectées avec des entérovirus avec un titre infectieux connu (5 x 106-107-
TCID50/ml) ou 100 pl d'une suspension brute de selles ont été introduits dans les puits de l'appareil. Les filtres ont été chauffés au four pendant 2 heures à 80-C. L'hybridation a été réalisée pendant la nuit à 42iC dans une solution : 50 % de formamide, 5xSSC, 3xDenhardt, 0.05 M tampon de phosphate de sodium pH 7,2;
EDTA 0,001 MT et 100 pg/ml de DNA dénaturé de sperme de saumon et 106 cpm/ml de cRNA radioactif.Les filtres ont été lavés à 65vC dans une solution 2xSSC, SDS 0,1 %, puis dans une solution 1xSSC, SDS 0,1 % et enfin deux fois dans une solution O,5xSSC, SDS 0,1 %. Les filtres ont été séchés à l'air et exposés avec un film de marque
FUJI RX pendant 20-48 heures à -70-C 3/ Etude comparée de sondes cDNA et cRNA
La sensibilité des sondes cDNA. marquées par "nick translation" et celle de sondes cRNA synthétisées et marquées in vitro sont comparées.100 μl of lysate of cells infected with enteroviruses with a known infectious titre (5 × 10 6-107-
TCID50 / ml) or 100 μl of a crude suspension of stool was introduced into the wells of the apparatus. The filters were heated in the oven for 2 hours at 80 ° C. Hybridization was carried out overnight at 42 ° C. in a solution: 50% formamide, 5 × SSC, 3 × Denhardt, 0.05 M sodium phosphate buffer pH 7.2;
EDTA 0.001 MT and 100 pg / ml denatured DNA from salmon sperm and 106 cpm / ml radioactive cRNA. Filters were washed at 65vC in 2xSSC, 0.1% SDS solution, then in 1xSSC, SDS 0 solution , 1% and finally twice in a solution 0.5xSSC, SDS 0.1%. Filters were air dried and exposed with branded film
FUJI RX for 20-48 hours at -70-C 3 / Comparative study of cDNA and cRNA probes
The sensitivity of cDNA probes. marked by "nick translation" and that of cRNA probes synthesized and labeled in vitro are compared.

Les RNA purifiés ont été hybridés avec les sondes cDNA et cRNA marquées au P32 correspondant à la séquence de VP3 du poliovirus. The purified RNAs were hybridized with the cDNA and cRNA probes labeled with P32 corresponding to the VP3 sequence of the poliovirus.

Les résultats (figures 1 et 2) montrent que la sonde cDNA détecte très spécifiquement le RNA de la souche homologue (PVî), beaucoup plus faiblement les poliovirus 2 et 3 et pas du tout les RNA des autres entérovirus testés. The results (FIGS. 1 and 2) show that the cDNA probe very specifically detects the RNA of the homologous strain (PVi), much more weakly the polioviruses 2 and 3 and not at all the RNAs of the other enteroviruses tested.

En revanche, la sonde cRNA de polarité négative, de la même région VP3, donne un signal d'hybridation beaucoup plus fort avec les trois types de poliovirus, bien que dans les dilutions successives de
RNA, on puisse déceler des différentes homologies entre les trois types de virus.On the other hand, the negative polarity cRNA probe, from the same VP3 region, gives a much stronger hybridization signal with the three types of poliovirus, although in successive dilutions of
RNA, we can detect different homologies between the three types of virus.

Cette sonde permet, par ailleurs, la détection de RNA, de Coxsackie B4 et d'ECHOvirus 9 montrant ainsi les homologies des séquences de cette région entre certains entérovirus. Toutefois, le RNA de Coxsackie B3 ne donne aucun signal, comme les témoins (extraits des cellules non infectées). This probe also allows the detection of RNA, Coxsackie B4 and ECHOvirus 9, thus showing the homologies of the sequences of this region between certain enteroviruses. However, the Coxsackie B3 RNA does not give any signal, like the controls (extracts from uninfected cells).

Ces résultats, conformes avec d'autres sondes, conduisent à la conclusion que les sondes cRNA synthétisées et marquées in vitro, de polarité négatives, sont plus sensibles dans les hybridations moléculaires avec les RNAs viraux que les sondes cDNA homologues. These results, consistent with other probes, lead to the conclusion that the synthesized and labeled in vitro cRNA probes, of negative polarity, are more sensitive in molecular hybridizations with viral RNAs than the homologous cDNA probes.

4/ Détection des entérovirus dans les lysats cellulaires
La présence de RNA de différents entérovirus dans les lysats de cellules infectées a été recherchée par hybridation moléculaire.4 / Detection of enteroviruses in cell lysates
The presence of RNA from different enteroviruses in the lysates of infected cells was investigated by molecular hybridization.

1s) Avec la sonde cRNA de VP1, on détecte les 3 types de poliovirus et, bien que plus faiblement, le coxsackievirus A 21. 1s) With the VP1 cRNA probe, the 3 types of poliovirus and, although more weakly, coxsackievirus A 21 are detected.

Cette sonde VP1 spécifique de poliovirus n'a pas été capable de détecter d'autres entérovirus cependant présents dans les lysats cellulaires étudiés (mise en évidence par séroneutralisation). Ces résultats (fig. This specific poliovirus VP1 probe was not able to detect other enteroviruses, however, present in the cell lysates studied (demonstrated by seroneutralization). These results (fig.

3) montrent la faible homologie de la séquence VP1 avec le RNA de ces virus. Cette "sonde VP1" est donc spécifique des poliovirus.3) show the poor homology of the VP1 sequence with the RNA of these viruses. This "VP1 probe" is therefore specific for polioviruses.

2') En revanche, la sonde cRNA de la région 5' non codante de PV1 est capable de détecter les 3 types de poliovirus, Coxsackie virus B1, B4, A7, A9, A21,
ECHOvirus 9, ECHOvirus 11, ECHOvirus 33 et le rhinovirus type 2. Cette sonde n'hybride pas avec certains autres entérovirus : ni avec le virus Theiler de l'encéphalite murine (TMEV), ni avec le HAV, (fig. 4). D'ailleurs, aucune sonde cRNA, PV1 n'a hybridé avec le HAV, confirmant ainsi l'absence d'homologie nucléotidique entre ces deux virus : la sonde 5' non-codante du PV1 peut être utilisée comme sonde à large spectre dans la détection des entérovirus.2 ') On the other hand, the cRNA probe of the 5' non-coding region of PV1 is capable of detecting the 3 types of poliovirus, Coxsackie virus B1, B4, A7, A9, A21,
ECHOvirus 9, ECHOvirus 11, ECHOvirus 33 and rhinovirus type 2. This probe does not hybridize with certain other enteroviruses: neither with Theiler virus of murine encephalitis (TMEV), nor with HAV, (fig. 4). Moreover, no cRNA, PV1 probe hybridized with HAV, thus confirming the absence of nucleotide homology between these two viruses: the 5 ′ non-coding probe of PV1 can be used as a broad spectrum probe in the detection of enteroviruses.

5/ Détection des entérovirus dans des extraits de selles.5 / Detection of enteroviruses in stool extracts.

La présence de certains entérovirus (fig. 5) dans des extraits bruts (PO), ou après un premier (P1) ou deuxième passage (P2) dans des cellules permissives a pu être montrée. L'utilisation de la SONDE 2C ou 5' noncodante a permis de mettre en évidence la présence des poliovirus type 3, Coxsackie B5 et ECHO 1 dans des extraits de selles et lors de passages successifs sur des cellules permissives. Certains virus n'ont été détectés qu'après le premier ou le deuxième passage. The presence of certain enteroviruses (fig. 5) in crude extracts (PO), or after a first (P1) or second passage (P2) in permissive cells has been shown. The use of the noncoding 2C or 5 'PROBE has made it possible to demonstrate the presence of type 3 poliovirus, Coxsackie B5 and ECHO 1 in stool extracts and during successive passages on permissive cells. Some viruses were only detected after the first or second pass.

6/ Détection du virus HAV
L'utilisation d'une sonde cRNA spécifique HAV permet la détection de ce virus.6 / Detection of the HAV virus
The use of a specific HAV cRNA probe allows the detection of this virus.

Des cRNA peuvent être produits à partir de vecteurs de transcription (Gemini)avec des insérats de cDNA du HAV. Le RNA de polarité négative et hautement radioactif peut être synthétisé selon le même procédé que celui décrit ci-dessus pour les cRNA de PV1. Elle permet la détection par hybridation du RNA de HAV. Le virus- éventuellement présent, dans des cellules infectées, dans des selles ou dans des échantillons d'eaux polluées peut être recherché avec cette méthode. CRNAs can be produced from transcription vectors (Gemini) with cDNA inserts from HAV. The RNA of negative and highly radioactive polarity can be synthesized according to the same method as that described above for the cRNAs of PV1. It allows the detection by hybridization of the RNA of HAV. The virus - possibly present in infected cells, in feces or in polluted water samples can be tested with this method.

L'intérêt d'une nouvelle technique utilisable pour le diagnostic rapide d'une hépatite ou d'une gastroentérite sur des échantillons de selles n'est pas à souligner surtout si cette recherche de virus HAV est couplée avec celles d'autres entérovirus (virus de la poliomyélite, Coxsackies, ECHO) à l'aide de sonde cRNA spécifiques et sensibles correspondantes. The advantage of a new technique which can be used for the rapid diagnosis of hepatitis or gastroenteritis on stool samples should not be emphasized, especially if this search for HAV virus is coupled with that of other enteroviruses (virus polio, Coxsackies, ECHO) using specific and sensitive cRNA probes.

Il est important de connaitre combien la technique d'isolement des virus sur cultures cellulaires est longue et aléatoire. L'isolement des Coxsackies A mais surtout celui de l'hépatite A en sont des exemples : la réplication de l'HAV en culture n'entraine pas d'effet cytopathogène et l'apparition de virions complets intracellulaires ne survient jamais avant la troisième ou la quatrième semaine après l'inoculation de l'échantillon clinique sur cellules PLC/PRF/5, qui sont actuellement les plus sensibles. It is important to know how long and random the technique of virus isolation from cell cultures is. The isolation of Coxsackies A but especially that of hepatitis A are examples: replication of HAV in culture does not cause a cytopathogenic effect and the appearance of complete intracellular virions never occurs before the third or the fourth week after inoculation of the clinical sample on PLC / PRF / 5 cells, which are currently the most sensitive.

Cette technique de détection de virus par hybridation sur nitrate de cellulose est aussi extrêmement utile pour détecter dans les surnageants de cultures infectées la présence éventuelle d'HAV. This virus detection technique by hybridization on cellulose nitrate is also extremely useful for detecting in the supernatants of infected cultures the possible presence of HAV.

Actuellement, seule une technique immunoenzymatique ou radioimmunologique peut être utilisée. La spécificité de la réaction doit toujours être confirmée par réaction du blocage par compétition (utilisation d'un anticorps monoclonal par exemple). L'utilisation des sondes cRNA selon l'invention permet une détection plus rapide, significative et précoce d'une infection par HAV. Currently, only an immunoenzymatic or radioimmunological technique can be used. The specificity of the reaction must always be confirmed by reaction to the blocking by competition (use of a monoclonal antibody for example). The use of the cRNA probes according to the invention allows faster, significant and early detection of a HAV infection.

Il résulte donc de ce qui précède que les sondes cRNA selon l'invention permettent - une détection plus sensible de la présence d'entérovirus dans un échantillon biologique, notamment grace à l'utilisation de sondes cRNA correspondant à la région 5' du génome des entérovirus, et en particulier du poliovirus. It therefore follows from the above that the cRNA probes according to the invention allow - a more sensitive detection of the presence of enterovirus in a biological sample, in particular thanks to the use of cRNA probes corresponding to the 5 ′ region of the genome of the enterovirus, and in particular poliovirus.

- une discrimination plus facile des poliovirus et entérovirus qui leur sont étroitement apparentés, (notamment grâce à l'utilisation de sondes cRNA correspondant à une région VP1 de l'un des poliovirus PV1, PV2 ou PV3, plus particulièrement PV1), - une identification plus sensible et spécifique des
HAV, gracie à l'utilisation de sondes cRNA dérivées de
HAV.- easier discrimination of polioviruses and enteroviruses which are closely related to them, (in particular through the use of cRNA probes corresponding to a VP1 region of one of the PV1, PV2 or PV3 polioviruses, more particularly PV1), - identification more sensitive and specific of
HAV, thanks to the use of cRNA probes derived from
HAV.

L'invention concerne encore les kits ou nécessaires de diagnostic in vitro contenant - des sondes de cRNA correspondant aux régions 5' des génomes d'un entérovirus, notamment d'un poliovirus, - des sondes cRNA correspondant à la région VP1 d'un poliovirus, plus particulièrement et, le cas échéant - des sondes cRNA dérivées du génome de HAV, et - le cas échéant, les tampons ou constituants de ces tampons nécessaires à des réactions d'hybridation mettant en oeuvre lesdits cRNA. The invention also relates to in vitro diagnostic kits or kits containing - cRNA probes corresponding to the 5 ′ regions of the genomes of an enterovirus, in particular of a poliovirus, - cRNA probes corresponding to the VP1 region of a poliovirus , more particularly and, where appropriate - cRNA probes derived from the HAV genome, and - where appropriate, the buffers or constituents of these buffers necessary for hybridization reactions using said cRNAs.

Dans ce qui précède les sondes utilisées étaient des sondes radioactives. Il va de soi que tout autre type de marqueur peut être mis en oeuvre, par exemple un marqueur enzymatique détectable par son action sur un substrat spécifique de l'enzyme ou un marqueur fluorescent. Les techniques de marquage enzymatique ou fluorescent sont suffisamment connues pour qu'il ne soit pas nécessaire d'insister davantage sur le sujet. In the above the probes used were radioactive probes. It goes without saying that any other type of marker can be used, for example an enzymatic marker detectable by its action on a specific substrate for the enzyme or a fluorescent marker. Enzymatic or fluorescent labeling techniques are sufficiently known that it is not necessary to insist further on the subject.

Claims

1. cRNA probe of an enterovirus

2. Probe according to claim 1, characterized in that it is derived from a poliovirus

3. Probe according to claim 2, characterized in that it corresponds to the 5 'end region, non-coding, of the genome of a poliovirus.

4. Probe according to claim 2, characterized in that it corresponds to a VP1 region of a poliovirus, such as PVî.

5. A probe according to claim 1, characterized in that it is derived from a HAV.

6. A probe according to claim 5, characterized in that it is derived from the 5 'non-coding central and 3' terminal region.

7. A method of detecting an enterovirus in a biological sample, in particular of stool, characterized in that the DNA and RNA contained in the sample are brought into contact, these RNA having, if necessary, previously been brought into a state in which they are accessible to hybridization, with a hybridization probe constituted by a probe according to any one of claims 1 to 6, and this under conditions allowing hybridization between the probe and the RNA of enterovirus possibly present in the biological sample, and in that the hybridization product between the probe and the enterovirus RNA is detected.

8. Detection method according to claim 7, characterized in that the probe is a cRNA corresponding to the 5 'end of the genome of a poliovirus.

9. Detection method according to claim 7, characterized in that the probe is a cRNA corresponding to the VP1 region of a poliovirus, in particular of the PV1 type.

10. Method according to claim 7, characterized in that, in a first step, the detection test is carried out with a cRNA corresponding to the 5 'end of the genome of a poliovirus and, in the event of a positive response, repeat the detection test with a cRNA corresponding to the VP1 region of a poliovirus, in particular of the PV1 type, so that in the event of a renewed positive response, it can be concluded that the enterovirus detected at the end of the first step is a poliovirus or enterovirus related to a poliovirus.

11. Method according to claim 7, characterized in that the cRNA probe used is derived from HAV.

12. Kit or kit for in vitro diagnosis of the presence of enterovirus in a sample or biological sample, characterized in that it contains - at least one cRNA probe corresponding to the 5 ′ region of the genome of a poliovirus, in particular of type PV1, - at least one cRNA probe corresponding either to the VP1 region of a poliovirus, in particular of the PVi type, - if appropriate, a cRNA probe derived from HAV - if necessary also, the buffers or constituents necessary for the production buffers allowing the implementation of a hybridization reaction between these probes and the RNA of a retrovirus contained in a biological sample or sample presumed to contain an enterovirus.