FR2623505A1 - Process for the attachment and separation of molecules comprising at least one natural or synthetic DNA fragment - Google Patents
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Abstract
Description
La présente invention a pour objet un procédé de séparation d'ADN ou de molécules contenant des fragments d'ADN. The subject of the present invention is a method of separating DNA or molecules containing DNA fragments.
On sait que l'ADN est soluble presqu'exclusivement dans l'eau, ce qui rend très difficile, voire impossible, de lui faire subir des transformations chimiques faisant intervenir des réactions dans des solvants non miscibles à l'eau. It is known that DNA is soluble almost exclusively in water, which makes it very difficult, if not impossible, to subject it to chemical transformations involving reactions in solvents immiscible with water.
On connaît également les difficultés rencontrées dans l'obtention d'ADN purifié, les procédés mis au point à ce jour faisant appel à une succession d'extractions en phases liquides qui présentent l'inconvénient d'être longues, délicates et difficilement automatisables. The difficulties encountered in obtaining purified DNA are also known, the methods developed to date using a succession of liquid phase extractions which have the drawback of being long, delicate and difficult to automate.
Parmi ces procédés, l'un des plus récents consiste à fixer l'ADN en solution aqueuse sur les particules d'une poudre de verre au moyen d'un agent chaiotropique tel que l'iodure de sodium ou le perchlorate de potassium. Cette fixation se faisant sélectivement permet de séparer l'ADN des protéines et de l'AkN en solution qui l'accompagnent généralement, et conduit à l'obtention d'un produit de fixation de l'ADN sur la poudre de verre, dont on sépare l'ADN par une élution pratiquée au moyen d'une solution aqueuse. La solution d'ADN ainsi obtenue doit être ensuite soumise à une succession d'opérations de purification, qui consistent généralement en des traitements successifs à la RNase, à la protéinase K, au phénol et au chloroforme, tous opérés en phases liquides. Among these methods, one of the most recent consists in fixing the DNA in aqueous solution on the particles of a glass powder by means of a chaiotropic agent such as sodium iodide or potassium perchlorate. This fixation being done selectively makes it possible to separate the DNA from the proteins and the AkN in solution which generally accompany it, and leads to the production of a DNA fixing product on the glass powder, of which separates the DNA by an elution carried out using an aqueous solution. The DNA solution thus obtained must then be subjected to a succession of purification operations, which generally consist of successive treatments with RNase, proteinase K, phenol and chloroform, all operated in liquid phases.
Le traitement de l'ADN et sa purification se heurtent à de nombreuses difficultés, en particulier compte tenu du grand nombre d'opérations successives à mettre en oeuvre, ce qui nuit à la rentabilité du traitement, empêchant en particulier la mise au point d'appareillages automatiques. The processing of DNA and its purification face many difficulties, in particular in view of the large number of successive operations to be carried out, which harms the profitability of the treatment, preventing in particular the development of automatic devices.
Dans le but d'améliorer le traitement, en particulier la mise en réaction chimique ou physique de l'ADN, la Demanderesse a mis au point récemment un procédé qui consiste à mettre en oeuvre ladite réaction sur l'ADN fixé de façon réversible et non covalente sur un support insoluble, à la fois dans le solvant de la réaction et dans l'eau. Selon ce procédé, le support utilisé peut être un support finement divisé, tel que la poudre de verre par exemple, dont les particules sont de dimension égale ou inférieure à 5 llm. On obtient alors, par addition de solvant, une suspension
ADN fixé sur poudre de verre, ce qui permet de traiter directement l'ADN en phase hétérogène dans le solvant choisi, sans avoir à effectuer de séparation de phase liquide-liquide.In order to improve the treatment, in particular the chemical or physical reaction of DNA, the Applicant has recently developed a process which consists in carrying out said reaction on DNA which is fixed in a reversible and not reversible manner. covalent on an insoluble support, both in the reaction solvent and in water. According to this method, the support used can be a finely divided support, such as glass powder for example, the particles of which are of size equal to or less than 5 μm. A suspension is then obtained by adding solvent
DNA fixed on glass powder, which makes it possible to directly treat DNA in the heterogeneous phase in the chosen solvent, without having to carry out liquid-liquid phase separation.
L'un des problèmes auquel on se heurte toutefois lors du traitement de l'ADN par ce procédé est que lorsque l'on souhaite automatiser le processus ou bien lorsque l'on souhaite le présenter sous forme de trousse de diagnostic par exempe, la poudre de verre présente de nombreux inconvénients. One of the problems which one encounters however during the treatment of DNA by this process is that when one wishes to automate the process or else when one wishes to present it in the form of a diagnostic kit for example, the powder glass has many disadvantages.
La poudre de verre peut être utilisée en suspension où elle ne présente aucun inconvénient mais si on souhaite l'utiliser sous forme de garnissage pour une colonne, alors on se heurte à de grandes difficultés. Glass powder can be used in suspension where it has no drawbacks, but if it is desired to use it as a packing for a column, then great difficulties are encountered.
En effet, la taille des particules de verre actives (5 pm maximum) et leur nature anguleuse font qu'elles présentent un coefficient de vide très faible ce qui impose l'utilisation de pressions énormes pour passer des fluides au travers de colonnes de poudre de verre (HPLC) et l'ADN est alors rapidement dégradé par les pressions appliquées et les forces de cisaillement. In fact, the size of the active glass particles (5 μm maximum) and their angular nature mean that they have a very low vacuum coefficient which requires the use of enormous pressures to pass fluids through columns of powder of glass (HPLC) and DNA is rapidly degraded by the pressures applied and the shear forces.
La présente invention a pour but de proposer un procédé de traitement de l'ADN qui rende aisée la manipulation de l'ADN à des fins de purification ou de modification chimique ou enzymatique de la molécule d'ADN, ledit procédé pouvant être applicable à des techniques facilement automatisables, par exemple des techniques de type technique chromatographie basse pression. The object of the present invention is to provide a method of DNA treatment which makes it easy to manipulate DNA for the purpose of purification or chemical or enzymatic modification of the DNA molecule, said method being able to be applicable to techniques that can be easily automated, for example techniques of the low pressure chromatography technical type.
La présente invention concerne un procédé de fixation et de séparation de molécules comportant au moins un fragment d'ADN naturel ou synthétique à partir d'un mélange liquide contenant lesdites molécules, caractérisé en ce que a) ledit mélange liquide est mis en présence d'un substrat présentant une
composition et une structure telle qu'il assure avec l'ADN une liaison
non covalente, réversible et sélective, ledit substrat pouvant être
utilisé en chromatographie basse pression, b) en ce que, après liaison de 1'ADN, le mélange résiduel est éliminé, c) l'ADN lié est ensuite élué, éventuellement après avoir été soumis à une
ou plusieurs réactions physiques et/ou chimiques. The present invention relates to a method for fixing and separating molecules comprising at least one fragment of natural or synthetic DNA from a liquid mixture containing said molecules, characterized in that a) said liquid mixture is brought into contact with a substrate having a
composition and structure such that it binds to DNA
non-covalent, reversible and selective, said substrate possibly being
used in low pressure chromatography, b) in that, after binding of the DNA, the residual mixture is eliminated, c) the bound DNA is then eluted, optionally after having been subjected to a
or several physical and / or chemical reactions.
Parmi les molécules comportant au moins un fragment d'ADN naturel ou synthétique, il faut citer 1'ADN cellulaire lui-même, mais également les oligonucléotides naturels ou synthétiques ainsi que les ADN ayant subi des modifications chimiques ou physiques telles que marquage chimique, présence d'agent intercalant ou liaison physico-chimique telle qu'une fixation par le couple avidine-biotine. Among the molecules comprising at least one fragment of natural or synthetic DNA, mention must be made of cellular DNA itself, but also natural or synthetic oligonucleotides as well as DNA having undergone chemical or physical modifications such as chemical labeling, presence intercalating agent or physicochemical bond such as fixation by the avidin-biotin pair.
Le substrat mis en oeuvre peut être composé de matériaux divers, notamment des verres, des céramiques ou des métaux ou bien des composés mixtes tels que vitro-céramiques pourvu qu'ils soient capables de fixer l'ADN par une liaison non covalente, réversible et sélective. The substrate used can be composed of various materials, in particular glasses, ceramics or metals or else mixed compounds such as vitro-ceramics provided that they are capable of fixing the DNA by a non-covalent, reversible bond and selective.
Parmi ces matériaux, il faut citer les matériaux contenant du bore tels que les verres borosilicatés, notamment le verre Pyrex 732-01 commercialisé par Corning France. Among these materials, mention should be made of materials containing boron such as borosilicate glasses, in particular Pyrex 732-01 glass sold by Corning France.
Dans le cas de la technique antérieure, les études ont montré l'influence de granulométrie de la poudre de verre sur sa sélectivité, dans le cas présent la porosité du substrat doit être supérieure à 1 micron, les éléments du substrat étant éventuellement jointifs, mais on utilisera de préférence des porosités de l'ordre de 2 à 10 microns, par exemple de 2 à 5 microns. In the case of the prior art, studies have shown the influence of particle size of the glass powder on its selectivity, in the present case the porosity of the substrate must be greater than 1 micron, the elements of the substrate possibly being joined, but porosities of the order of 2 to 10 microns, for example 2 to 5 microns, will preferably be used.
Ce substrat peut se présenter sous une forme unitaire ou sous une forme divisée. This substrate can be in a unitary form or in a divided form.
Lorsqu'il est sous forme unitaire, il s'agira de préférence d'un produit sous forme frittée, par exemple un fritté de verre ou métallique. When it is in unit form, it will preferably be a product in sintered form, for example a glass or metallic sinter.
Lorsqu'il s'agira d'un substrat divisé, celui-ci sera sous forme de fibres ou de billes. Les fibres pourront être enchevêtrées comme dans une laine type laine de verre, ou bien réunies en tresses par exemple. Dans le cas de billes, les diamètres seront adaptés à la mise en oeuvre envisagée. When it is a divided substrate, it will be in the form of fibers or beads. The fibers can be entangled as in a wool type glass wool, or combined in braids for example. In the case of beads, the diameters will be adapted to the implementation envisaged.
L'utilisation de fritté est particulièrement avantageuse dans la réalisation de trousse de diagnostic ou bien pour des usages uniques. En effet, un fritté à base de particules de verre comprimées et soudées entre elles présente une résistance mécanique qui permet de l'utiliser directement comme colonne. The use of frit is particularly advantageous in the production of diagnostic kits or for single uses. Indeed, a sinter based on compressed glass particles and welded together has a mechanical strength which allows it to be used directly as a column.
Bien que la porosité d'un tel support soit faible (inférieure à 10 clam), elle permet cependant de faire passer des fluides avec des pressions très faibles et des débits de plusieurs millilitres par minute, par exemple il est possible d'utiliser une trompe à vide. Although the porosity of such a support is low (less than 10 clam), it nevertheless makes it possible to pass fluids with very low pressures and flow rates of several milliliters per minute, for example it is possible to use a tube empty.
Le mélange liquide mis en présence du substrat peut être d'origine quelconque, il peut s'agir d'un milieu obtenu après craquage de cellule ou bien un milieu d'origine synthétique par exemple ; de préférence, ce milieu sera un milieu aqueux contenant un agent chaiotropique tel que l'iodure de sodium ou le perchlorate de potassium. The liquid mixture brought into contact with the substrate may be of any origin, it may be a medium obtained after cell cracking or else a medium of synthetic origin for example; preferably, this medium will be an aqueous medium containing a chaiotropic agent such as sodium iodide or potassium perchlorate.
Bien entendu, le substrat utilisé devra être insoluble dans ledit milieu. Of course, the substrate used must be insoluble in said medium.
L'élution des molécules fixées à partir du substrat est effectuée de préférence avec une solution aqueuse qui pourra, éventuellement contenir au moins un sel minéral, un agent tampon, un agent chélatant et/ou un agent antioxydant. The elution of the fixed molecules from the substrate is preferably carried out with an aqueous solution which may optionally contain at least one mineral salt, a buffering agent, a chelating agent and / or an antioxidant agent.
Ce procédé permet également de soumettre les molécules fixées à une ou plusieurs réactions physiques et/ou chimiques dans un solvant dans lequel 1'ADN et le substrat sont insolubles. This method also makes it possible to subject the fixed molecules to one or more physical and / or chemical reactions in a solvent in which the DNA and the substrate are insoluble.
Le solvant mis en oeuvre, dans ce cas, peut être n'importe quel solvant organique ou minéral présentant la particularité de ne pas solubiliser l'ADN ou le substrat. I1 peut être additionné d'eau ou d'une solution aqueuse d'au moins un sel minéral pouvant renfermer également au moins un agent tampon, un agent chélatant et/ou un agent antioxydant. The solvent used, in this case, can be any organic or mineral solvent having the particularity of not dissolving the DNA or the substrate. It can be added with water or an aqueous solution of at least one mineral salt which may also contain at least one buffering agent, a chelating agent and / or an antioxidant agent.
A titre d'exemple de solvants utilisables dans le procédé selon l'invention, on peut citer le chloroforme, l'éthanol, I'isopropanol, le butanol ou encore une solution de phénol saturé d'eau. By way of example of solvents which can be used in the process according to the invention, mention may be made of chloroform, ethanol, isopropanol, butanol or also a solution of phenol saturated with water.
L'eau susceptible d'être ajoutée au solvant peut être additionnée, par exemple, d'une faible quantité de chlorure de sodium, d'EDTA ou de Tris HCI. The water capable of being added to the solvent can be added, for example, a small amount of sodium chloride, EDTA or Tris HCl.
Dans un mode de mise en oeuvre du procédé, le complexe
ADN-substrat est soumis à un traitement dans un solvant en vue d'une modification chimique ou enzymatique de la molécule au moyen d'un réactif convenable.In one embodiment of the method, the complex
DNA-substrate is subjected to a treatment in a solvent for a chemical or enzymatic modification of the molecule by means of a suitable reagent.
Dans un autre mode de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, le complexe ADN-substrat est soumis à un traitement en vue de l'obtention d'ADN ou de molécules purifiés. Dans ce cas, le traitement à l'aide de solvants vise essentiellement à séparer de 1'ADN les molécules contaminantes qui s'y trouvent fixées. Ces molécules contaminantes peuvent être entre autres des protéines, de l'agrose, des corps gras ou des agents fluorescents tels que le bromure d'éthidium, utilisés pour le marquage des molécules d'ADN. In another embodiment of the method according to the invention, the DNA-substrate complex is subjected to a treatment with a view to obtaining DNA or purified molecules. In this case, the treatment with solvents essentially aims at separating from the DNA the contaminating molecules which are attached thereto. These contaminating molecules can be among others proteins, agrose, fatty substances or fluorescent agents such as ethidium bromide, used for the labeling of DNA molecules.
Le choix du solvant est, dans ce cas, fonction de l'origine de l'ADN à purifier : ainsi dans le cas où 1'ADN est contaminé en majeure partie par des protéines, on utilisera avantageusement du phénol saturé d'eau, tandis que dans le cas où le contaminant est essentiellement constitué de corps gras, le solvant sera de préférence du chloroforme. The choice of solvent is, in this case, a function of the origin of the DNA to be purified: thus in the case where the DNA is contaminated for the most part with proteins, phenol saturated with water will advantageously be used, while that in the case where the contaminant consists essentially of fatty substances, the solvent will preferably be chloroform.
L'invention concerne, enfin, l'application desdits substrats en chromatographie à basse pression, ainsi que lesdits substrats comportant une molécule d'ADN fixée. Finally, the invention relates to the application of said substrates in low pressure chromatography, as well as said substrates comprising a fixed DNA molecule.
L'exemple ci-après est destiné à mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages du procédé selon la présente invention. The example below is intended to demonstrate other characteristics and advantages of the method according to the present invention.
Purification d'ADN sur fritté de verre
Dans le protocole décrit ci-dessous, I'ADN à purifier peut être contaminé notamment par des protéines, de l'agarose et/ou de L'ART par exemple.DNA purification on glass frit
In the protocol described below, the DNA to be purified can be contaminated in particular by proteins, agarose and / or ART for example.
Le fritté utilisé est obtenu à partir de poudre de verre 732.01
Pyrex commercialisé notamment par Corning France, broyée jusqu'à une granulométrie moyenne de 5 microns.The frit used is obtained from glass powder 732.01
Pyrex sold in particular by Corning France, ground to an average particle size of 5 microns.
Dans L'exemple donné ci-dessous, 1'ADN est essentiellement contaminé par des protéines et de L'ART (80 % d'ARN, ribonucléotide, ribonucléoside). In the example given below, DNA is essentially contaminated with proteins and ART (80% RNA, ribonucleotide, ribonucleoside).
A la solution d'ADN sont ajoutés 2 volumes de NaI 8 M (volume final 3 ml, ADN 315 llg). To the DNA solution are added 2 volumes of 8 M NaI (final volume 3 ml, DNA 315 μg).
Cette solution est passée sur le fritté (diamètre 3 cm, épaisseur 2 mm, porosité inférieure à 2 llm) (aspiration sous vide à la trompe à eau). This solution is passed over the frit (diameter 3 cm, thickness 2 mm, porosity less than 2 μm) (vacuum suction with a water pump).
Le fritté est lavé avec 10 ml de NaI 8 M puis par - 50 ml de phénol saturé en H2O (ceci pour décrocher les protéines
fixées à l'ADN, - 50 ml de chloroforme, - 50 ml de solution d'éthanol à 50 %, NaCI 0,3 M.The frit is washed with 10 ml of 8 M NaI then with - 50 ml of phenol saturated with H2O (this to detach the proteins
attached to DNA, - 50 ml of chloroform, - 50 ml of 50% ethanol solution, 0.3 M NaCl.
Le fritté est légèrement séché par aspiration 2 à 3 minutes. The frit is lightly dried by suction for 2 to 3 minutes.
L'ADN est alors élué par 2 fois 2 ml de Tris HCl 10 mM pH 8,
EDTA 1 mM pH 8. The DNA is then eluted with 2 times 2 ml of 10 mM Tris HCl pH 8,
1 mM EDTA pH 8.
Des échantillons sont déposés sur gel d'agarose 1 %. Samples are deposited on 1% agarose gel.
- piste 1 : échantillon de l'ADN à purifier, on voit bien l'ARN (au niveau
de la flèche), - piste 2 : 1ère élution, - piste 3 : 2ème élution.- track 1: DNA sample to be purified, we can clearly see the RNA (at
arrow), - track 2: 1st elution, - track 3: 2nd elution.
On retrouve 70 % de l'ADN dans la 1ère élution (220 pg) 25 % de 1'ADN dans la 2ème élution (80 pg). We find 70% of the DNA in the 1st elution (220 pg) 25% of the DNA in the 2nd elution (80 pg).
Sur la photo on note bien la disparition de l'ARN des élutions 1 et 2. On the photo we note the disappearance of RNA from elutions 1 and 2.
L'ARN ne s'est pas fixé, seul l'ADN s'est fixé et a été élué. The RNA did not bind, only the DNA fixed and was eluted.
Les protéines solubles n'ont pas été fixées et celles qui étaient accrochées à l'ADN ont été décrochées par les traitements au phénol. Soluble proteins were not fixed and those which were attached to DNA were released by phenol treatments.
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| JPS59227744A (en) * | 1983-06-08 | 1984-12-21 | Rikaken Kk | Granular and powdery glass for recovering dna |
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1987
- 1987-11-25 FR FR8716338A patent/FR2623505B1/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59227744A (en) * | 1983-06-08 | 1984-12-21 | Rikaken Kk | Granular and powdery glass for recovering dna |
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Also Published As
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|---|---|
| FR2623505B1 (en) | 1991-04-26 |
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