FR2601035A1 - Process for the preparation of L-lysine - Google Patents
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
Abstract
Description
PROCEDE DE PREPARATION DE L-LYSEWE DOXAIJE DE L'IIVBXTI0
La présente invention a trait à un procédé pour la préparation de L-lysine par fermentation.PROCESS FOR THE PREPARATION OF L-LYSEWE DOXAIJE FOR IIVBXTI0
The present invention relates to a process for the preparation of L-lysine by fermentation.
ART AXTERIBUR
La L-lysine est un aminoacide essentiel qui est largement utilisé dans de nombreuses applications telles que, par exemple, la préparation de médicaments, d'additifs pour l'alimentation et la diététique et analogues. Il est connu de fabriquer la L-lysine par fermentation de souches de mutants obtenues à partir de certains microorganismes appartenant, par exemple, aux genres
Corynebacterium, Brevibacterlum, Àrthrobacter, Bacillus, etc. De telles souches de mutants comprennent des souches de mutants requérant, par exemple, (1) de l'homosérine ou (2) de la méthionine et thréonine, etc. pour leur croissance et des souches de mutants résistantes à diverses substances.ART AXTERIBUR
L-lysine is an essential amino acid which is widely used in many applications such as, for example, the preparation of drugs, food and diet additives and the like. It is known to manufacture L-lysine by fermentation of mutant strains obtained from certain microorganisms belonging, for example, to the genera
Corynebacterium, Brevibacterlum, Àrthrobacter, Bacillus, etc. Such mutant strains include mutant strains requiring, for example, (1) homoserine or (2) methionine and threonine, etc. for their growth and strains of mutants resistant to various substances.
Parmi les procédés connus pour la fabrication de la Lysine, la publication de brevet Japonais 4993/84 décrit un procédé de fabrication de L-lysine caractérisé par la culture d'une souche.de mutant producteur de L-lysine du genre Brevibacterluin ou Corynebacterfum, dans un milieu de culture -pour former et accumuler la L-lysine et isoler la L-lysine résultante du milieu, ladite souche de mutant étant résistante aux analogues de la lysine ainsi qu'à au moins un composé ayant un squelette quinone ou quinoléine. Among the known processes for the manufacture of Lysine, the Japanese patent publication 4993/84 describes a process for the manufacture of L-lysine characterized by the culture of a strain of mutant producer of L-lysine of the genus Brevibacterluin or Corynebacterfum, in a culture medium -to form and accumulate L-lysine and isolate the resulting L-lysine from the medium, said mutant strain being resistant to lysine analogs as well as to at least one compound having a quinone or quinoline skeleton.
Dans cet art antérieur, (A) l'expression "analogues de la lysine" désigne, par exemple, les
S-(2-aminoéthyl)-L-cystéine, a- halogénocaprolactame, ;-méthyllysine et analogues, ayant les caractéristiques suivantes
(1) leur structure chimique est similaire à la structure
chimique de la lysine;
(2) ils sont capables d'inhiber la croissance des micro
organismes des genres Brevibacterium, Corynebacterium
et analogues; et
(3) l'inhibition sus-mentionnée est supprimée par addition
de L-lysine au milieu de culture; (B) les composés ayant un squelette quinone ou quinoléine sont exemplifiés par la 8-hydroxyquinoléine, l'acide 8-hydroxyquinoléine- 5-sulfonique, la 5,8-dioxy-6-amino-7-chloroquinoléine, la 1,4naphtoquinone, la 1,2-naphtoquinone, la 2,3-dichloronaphtoquinone, la 5-carboxy-3'-thia-6'-aza-2,3-cyclohéxènonenaphtalène-1,4-quinone, la B,,B,-bis Q-chloro-1,4- naphto- 2- qu inonyl) -L- lysine etla granaticine, qui présentent les caractéristiques suivantes
(1) ils sont capables d'inhiber la croissance de micro
organismes des genres Brevibacterfum et Corynebacterium; et
(2) l'inhibition sus-mentionnée est au moins partiellement
supprimée par addition de L-leucine au milieu de culture. In this prior art, (A) the expression "lysine analogs" denotes, for example, the
S- (2-aminoethyl) -L-cysteine, a- halogenocaprolactam,; -methyllysine and the like, having the following characteristics
(1) their chemical structure is similar to the structure
lysine chemical;
(2) they are able to inhibit the growth of micro
organisms of the genera Brevibacterium, Corynebacterium
and the like; and
(3) the above-mentioned inhibition is removed by addition
L-lysine in the culture medium; (B) the compounds having a quinone or quinoline skeleton are exemplified by 8-hydroxyquinoline, 8-hydroxyquinoline-5-sulfonic acid, 5,8-dioxy-6-amino-7-chloroquinoline, 1,4naphthoquinone, 1,2-naphthoquinone, 2,3-dichloronaphthoquinone, 5-carboxy-3'-thia-6'-aza-2,3-cyclohexenonenaphthalene-1,4-quinone, B ,, B, -bis Q -chloro-1,4- naphtho- 2- qu inonyl) -L- lysine and granaticin, which have the following characteristics
(1) they are able to inhibit micro growth
organisms of the genera Brevibacterfum and Corynebacterium; and
(2) the above-mentioned inhibition is at least partially
suppressed by adding L-leucine to the culture medium.
Il existe un besoin constant de fournir un procède pour la production de L-lysine à faible coût et à l'échelle industrielle eu égard au fait que la L-lysine est très importante dans divers buts. There is a constant need to provide a process for the production of L-lysine at low cost and on an industrial scale having regard to the fact that L-lysine is very important for various purposes.
La présente invention repose sur la découverte de la
Demanderesse que la L-lysine peut être obtenue avec un rendement plus élevé en utilisant une souche de mutant du genre Corynebac=terium, Brevibacterium, Xicrobacterlum ou Artbrobacter, qui a été rendue résistante à la ss-naphtoquinoléine. The present invention is based on the discovery of the
Applicant that L-lysine can be obtained in a higher yield by using a mutant strain of the genus Corynebac = terium, Brevibacterium, Xicrobacterlum or Artbrobacter, which has been made resistant to ss-naphthoquinoline.
OMET DE L'IJVEJTIOJ
La présente invention concerne un procédé pour la préparation. de L-lysine par fermentation d'un microorganisme capable de procure de la lysine et choisi parmi l'ensemble comprenant les genres Corynebacterium, Brevfbacterfum, Xlorobacteriuin et Artnrobacter, dans un milieu de culture, suivant lequel on forme et accumule la L-lysine dans le milieu de culture et isole la L-lysine résultante dudit milieu de culture, caractérisé en ce que ledit microorganisme est résistant å la B-naphtoquinoléine. OMET FROM IJVEJTIOJ
The present invention relates to a process for the preparation. of L-lysine by fermentation of a microorganism capable of providing lysine and chosen from the group comprising the genera Corynebacterium, Brevfbacterfum, Xlorobacteriuin and Artnrobacter, in a culture medium, according to which L-lysine is formed and accumulated in the culture medium and isolates the resulting L-lysine from said culture medium, characterized in that said microorganism is resistant to B-naphthoquinoline.
On a trouvé que l'inhibition de la croissance du microorganisme peut ne pas être éliminée même par addition de Lleucine au milieu de culture à la différence des composés quinones et quinoléines décrits dans ladite publication de brevet japonais 4993/84 précitée, å partir de laquelle il est clair que la ss- naphtoquinoléine n'est pas équivalente aux diverses quinanes et quinoléines des types connus décrits dans ladite publication japonaise en ce qui concerne l'inhibition de la croissance de microorganismes producteurs de L-lysine. It has been found that the inhibition of the growth of the microorganism may not be eliminated even by adding Lleucine to the culture medium, unlike the quinone and quinoline compounds described in said abovementioned Japanese patent publication 4993/84, from which it is clear that ss-naphthoquinoline is not equivalent to the various quinanes and quinolines of the known types described in said Japanese publication as regards the inhibition of the growth of microorganisms producing L-lysine.
Des exemples de microorganismes appartenant aux genres
Corynebacterium, Brevibacterium, ETicrobacterlum ou Arthrobacter en tant que microorganismes de départ pour induire la souche mutante suivant l'invention, peuvent être les souches naturelles ou mutantes et comprennent, par exemple, des microorganismes qui requièrent divers nutriments (par exemple, au moins un élément choisi parmi l'homosérine, la méthionine, la thréonine, l'histidine, la proline, l'alanine, la leucine, l'isoleucine, la valine, la sérine, l'acide glutamique, l'acide pantothénique, le nicotinamide, l'acide acétique, l'adènine, l'hypoxanthine et l'inositol), des microorganismes qui sont résistants à divers aminoacides analogues (par exemple, au moins un élément choisi parmi les analogues de la lysine, de la thréonine, de la méthionine, de la leucine, de l'isoleucine, de la valine, de l'acide aspartique, du tryptophane et de l'histidine) et des microorganismes qui sont résistants à diverses autres substances (par exemple, au moins un élément choisi parmi les divers antibiotiques, les drogues "sulfa", divers aminoacides, composés quinone et quinoléine des types connus).Examples of microorganisms belonging to the genera
Corynebacterium, Brevibacterium, ETicrobacterlum or Arthrobacter as starting microorganisms for inducing the mutant strain according to the invention, can be the natural or mutant strains and include, for example, microorganisms which require various nutrients (for example, at least one element chosen from homoserine, methionine, threonine, histidine, proline, alanine, leucine, isoleucine, valine, serine, glutamic acid, pantothenic acid, nicotinamide, l acetic acid, adenine, hypoxanthine and inositol), microorganisms which are resistant to various analogous amino acids (for example, at least one element chosen from analogues of lysine, threonine, methionine, leucine, isoleucine, valine, aspartic acid, tryptophan and histidine) and microorganisms that are resistant to a variety of other substances (for example, at least one of the various antibiotics ticks, "sulfa" drugs, various amino acids, quinone and quinoline compounds of known types).
Il est possible d'obtenir . une souche mutante qui peut être utilisée pour le but de la présente invention en conférant une résistance vis-à-vis de la 8-naphtoquinoléine aux souches parentes sus-mentionnées capables de produire la L-lysine. En variante, il est possible d'obtenir la souche mutante désirée capable de produire la
L-lysine suivant l'invention en conférant la résistance sus-visée à divers nutriments, la résistance à divers analogues d'aminoacides ou la résistance à divers autres substances à un microorganisme résistant à la ss-naphtoquinoleine. It is possible to get. a mutant strain which can be used for the purpose of the present invention by conferring resistance against 8-naphthoquinoline to the above-mentioned parent strains capable of producing L-lysine. Alternatively, it is possible to obtain the desired mutant strain capable of producing the
L-lysine according to the invention by conferring the above-mentioned resistance to various nutrients, resistance to various amino acid analogs or resistance to various other substances to a microorganism resistant to ss-naphthoquinoleine.
Des exemples préférés de microorganismes qui peuvent être utilisés en tant que souches parentes pour l'obtention de la souche mutante de la présente invention comprennent les Corynebacterium glutamique ATCC 13032, Corynebacterfum glutamfcum H-9149 (FERS
BP-158), Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870, Brevfbacterium lactofennentum ATCC 13869 et Brevibacterluni flavum ATCC 14067, tous étant capables de produire de la L-lysine par fermentation.Preferred examples of microorganisms which can be used as parent strains for obtaining the mutant strain of the present invention include Corynebacterium glutamic ATCC 13032, Corynebacterfum glutamfcum H-9149 (FERS
BP-158), Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870, Brevfbacterium lactoferontum ATCC 13869 and Brevibacterluni flavum ATCC 14067, all capable of producing L-lysine by fermentation.
La souche mutante utilisable selon le but de itinvention peut être obtenue selon une méthode classique utilisée pour l'induction de souches mutantes telles que, par exemple, irradiation par rayonnements UV, traitement chimique, notamment au moyen de - méthyl-N'-nitro-s-nitrosoguanidine et analogues. La souche mutante désirée du microorganisme soumis à mutation - par isolation de la souche mutante que l'on a fait croître sur un milieu approprié, par exemple, un milieu minimal sur plaque d'agar contenant de la ss- naphtoquinoléine à une concentration suffisante pour inhiber la croissance de la souche parente ( par exemple, plus de 40 ug/ml), eu égard à la résistance A la ss-naphtoquinolline et à la production de
L-lysine.La souche microbienne mutante Corynebacterium glutamfoum
H-4412 résistante a la ss-naphtoquinoléine, induite par mutation de la souche parente naturelle H-3149 a été déposée auprès du Bikoken (Fermentation Research Institut, Agency of Industrial Science and
Technology), qui est un organisme gouvernemental japonais, et a reçu le numéro de dépôt FERA 3P-1O69 le 27 mai 1986.The mutant strain which can be used according to the object of the invention can be obtained according to a conventional method used for the induction of mutant strains such as, for example, irradiation by UV radiation, chemical treatment, in particular by means of - methyl-N'-nitro- s-nitrosoguanidine and the like. The desired mutant strain of the mutated microorganism - by isolation of the mutant strain which has been grown on an appropriate medium, for example, a minimal medium on an agar plate containing ss-naphthoquinoline at a concentration sufficient to inhibit the growth of the parent strain (for example, more than 40 µg / ml), having regard to resistance to ss-naphthoquinolline and to the production of
L-lysine.The mutant microbial strain Corynebacterium glutamfoum
H-4412 resistant to ss-naphthoquinoline, induced by mutation of the natural parent strain H-3149 has been deposited with the Bikoken (Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and
Technology), which is a Japanese government agency, and received filing number FERA 3P-1O69 on May 27, 1986.
Comme milieu pour mettre en oeuvre le procédé suivant l'invention, il est possible d'utiliser des milieux synthétiques et organiques contenant des quantités appropriées de sources assimilables de carbone et d'azote, des substances minérales et divers autres nutriments requis pour la croissance du microorganisme. As a medium for carrying out the process according to the invention, it is possible to use synthetic and organic media containing appropriate amounts of assimilable sources of carbon and nitrogen, mineral substances and various other nutrients required for the growth of the microorganism.
Les sources préférées de carbone comprennent, par exemple, le glucose, le fructose, le sorbitol, le glycérol, le saccharose, l'amidon, les hydrolysats d'amidon, les molasses, les Jus de fruits et divers autres carbohydrates, l'acide acétique, l'acide fumarique, l'acide lactique, l'acide maléique, et d'autres acides organiques, bien qu'il soit possible d'utiliser, si cela est souhaité, l'éthanol, le méthanol et d'autres alcools. Preferred sources of carbon include, for example, glucose, fructose, sorbitol, glycerol, sucrose, starch, starch hydrolysates, molasses, fruit juices and various other carbohydrates, acid acetic, fumaric acid, lactic acid, maleic acid, and other organic acids, although it is possible to use, if desired, ethanol, methanol and other alcohols .
Les sources préférées d'azote comprennent, par exemple, l'ammoniac, le chlorure d'ammonium, le sulfate d'ammonium, l'acétate d'ammonium, le phosphate d'ammonium et divers autres sels d'ammonium d'acide mineraux, l'urée, les amines et autres composés contenant de l'azote les peptones, extrait de viande, extrait de levure, extrait de céréales ("corn steep liquor"), les hydrolysats de caséine, les hydrolysats de farine de soJa, corps cellulaires microbiens de microorganismes fermentés et leur hydrolysat, et analogues. Preferred sources of nitrogen include, for example, ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate and various other ammonium salts of mineral acids , urea, amines and other nitrogen-containing compounds peptones, meat extract, yeast extract, cereal extract ("corn steep liquor"), casein hydrolysates, soy flour hydrolysates, body microbial cells of fermented microorganisms and their hydrolyzate, and the like.
Les substances minérales préférées sont notamment le monophosphate de potassium, le diphosphate de potassium, le phosphate de magnésium, le sulfate de magnésium, le chlorure de sodium, le sulfate ferreux, le sulfate de manganèse, le carbonate de calcium, etc. The preferred mineral substances are in particular potassium monophosphate, potassium diphosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, calcium carbonate, etc.
Le milieu peut, si cela est souhaité, contenir une quantité appropriée des nutriments spécialement requis pour la croissance des microorganismes utilisés. Dans quelques cas, ces nutriments seront présents dans les sources sus-mentionnées contenant naturellement de l'azote. Dans d'autres cas, la production en L-lysine peut être améliorée par addition au milieu de certains additifs tels que, par exemple, divers antibiotiques, l'acide a-aminolactique, la cystine, la leucine, la liqueur de fermentation de la leucine, l'acide aspartique, l'acide glutamique et analogues. The medium may, if desired, contain an appropriate amount of the nutrients specially required for the growth of the microorganisms used. In some cases, these nutrients will be present in the above-mentioned sources that naturally contain nitrogen. In other cases, the production of L-lysine can be improved by adding to the medium certain additives such as, for example, various antibiotics, α-aminolactic acid, cystine, leucine, the fermentation liquor of the leucine, aspartic acid, glutamic acid and the like.
La culture peut être réalisée dans des conditions aérobies, par exemple, sous agitation ou par culture immergée avec aération et agitation, généralement à une température de 20-40- C à un pH de 3-9 (de préférence à pH sensiblement neutre) bien qu'il soit possible de mettre en oeuvre la culture selon d'autres conditions pour autant que le microorganisme puisse croître. Le pH du milieu peut etre ajusté, par exemple, par addition de carbonate de calcium, d'urée d'une solution d'un acide ou d'une base, d'un agent régulateur de pH et analogues. De façon usuelle, la culture est mise en oeuvre pendant une durée de 1 à 6 Jours qui est suffisante pour former et accumuler la L-lysine dans le milieu de culture. The culture can be carried out under aerobic conditions, for example, with stirring or by immersed culture with aeration and stirring, generally at a temperature of 20-40- C at a pH of 3-9 (preferably at substantially neutral pH) although that it is possible to carry out the culture according to other conditions provided that the microorganism can grow. The pH of the medium can be adjusted, for example, by adding calcium carbonate, urea from an acid or base solution, a pH regulating agent and the like. Usually, the culture is carried out for a period of 1 to 6 days which is sufficient to form and accumulate L-lysine in the culture medium.
Quand la culture est achevée, on préfère écarter les corps cellulaires microbiens et autres précipités du milieu de culture. La
L-lysine peut être isolée du surnageant selon une méthode classique, par exemple, par traitement au moyen d'une résine échangeuse d'ions, par concentration, par adsorption, par relargage, etc. Si désiré, on peut isoler la L-lysine des corps cellulaires microbiens selon uneméthode conventionnelle.When the culture is complete, it is preferred to remove the microbial cell bodies and other precipitates from the culture medium. The
L-lysine can be isolated from the supernatant by a conventional method, for example, by treatment with an ion-exchange resin, by concentration, by adsorption, by salting-out, etc. If desired, L-lysine can be isolated from microbial cell bodies using a conventional method.
De nombreux essais ont mis en évidence que l'on peut obtenir une augmentation du rendement de la production en L-lysine d'environ 10-25 % suivant le procédé de l'invention. Numerous tests have demonstrated that an increase in the yield of L-lysine production of approximately 10-25% can be obtained according to the process of the invention.
Les exemples donnés ci-après illustrent l'invention de façon nullement limitative. The examples given below illustrate the invention in no way limiting.
EXEMPLE 1
On obtient la souche mutante Corynebacterivia glutamicum H4412 productrice de L-lysine et résistante à la ss-naphtoquinoléine selon la méthode suivante.EXAMPLE 1
The mutant strain Corynebacterivia glutamicum H4412 producing L-lysine and resistant to ss-naphthoquinoline is obtained according to the following method.
Le Corynebacterium glutamicum H-3149 (FERS BP-158; souche naturelle de microorganisme résistante aux thialysine, rifampicine, streptomycine et 6-azauracil) que l'on utilise comme souche parente dans une solution tamponnée (pH 6,0) de 0,1E Tris-acide maléique à la concentration de 108 cellulestml, à laquelle on aJoute la N- méthyl-N'-nitro-F-nitrosoguanidine Jusqu'à une concentration finale de 0,2 mg/ml.On laisse la suspension cellulaire reposer à la température ambiante pendant 0,5 h, puis on l'enduit sur une plaque d'agar ayant un milieu minimal de composition suivante qui contient de la ss-naphtoquinoléine A une concentration suffisante pour inhiber la croissance de la souche parente (40 pg/ml). Corynebacterium glutamicum H-3149 (FERS BP-158; natural strain of microorganism resistant to thialysin, rifampicin, streptomycin and 6-azauracil) which is used as parent strain in a buffered solution (pH 6.0) of 0.1E Tris-maleic acid at a concentration of 108 cellulestml, to which is added N-methyl-N'-nitro-F-nitrosoguanidine Up to a final concentration of 0.2 mg / ml. The cell suspension is left to stand at room temperature for 0.5 h, then it is coated on an agar plate having a minimum medium of the following composition which contains ss-naphthoquinoline At a concentration sufficient to inhibit the growth of the parent strain (40 pg / ml ).
Après culture à 30' C pendant 3 jours, la souche mutante désirée est séparée des colonies, qui se sont developpées, par rapport à la résistance à la ss-naphtoquinoléine. Elle a été identifiée en tant que Corynebacterlum glutamicuin H-4412. Cette souche mutante est nettement différente de la souche parente H-3149 eu égard à la résistance d la ss-naphtoquinoléine et à une meilleure productibilité en L-lysine comme indiqué dans le tableau I ci-après. After culturing at 30 ° C for 3 days, the desired mutant strain is separated from the colonies, which have grown, with respect to resistance to ss-naphthoquinoline. It has been identified as Corynebacterlum glutamicuin H-4412. This mutant strain is clearly different from the parent strain H-3149 with regard to the resistance of ss-naphthoquinoline and to a better producibility in L-lysine as indicated in Table I below.
Composition du milieu minimal (plaque d'agar) :
Glucose 10 g/l; NH4Cl 1 g/l; urée 2 g/l; KH2PO4 1 g/l; K2HPOd 3 g/l; XgSO4,7H=O 0,4 g/l; FeSO4,7H2O 10 mg/l; MnSO4,4H2O 4 mg/l; biotine 50 pg/l; acide nicotinique 5 mg/l; ZnSO4,7H20 1 mg/l; CuSO4, 5H2O lmg/l; (NH4)6Mo7O24,4H2O lmg/l; agar 2X (pH 7,0).Composition of the minimum medium (agar plate):
Glucose 10 g / l; NH4Cl 1 g / l; urea 2 g / l; KH2PO4 1 g / l; K2HPOd 3 g / l; XgSO4.7H = O 0.4 g / l; FeSO4.7H2O 10 mg / l; MnSO4.4H2O 4 mg / l; biotin 50 pg / l; nicotinic acid 5 mg / l; ZnSO4.7H20 1 mg / l; CuSO4, 5H2O lmg / l; (NH4) 6Mo7O24.4H2O 1 mg / l; 2X agar (pH 7.0).
TABLEAU I ss-naphtoquinone ( g/ml) O 30 40
Souche H-3149 ++ +
Souche H-4412 ++ ++ +
Notes : ++ = croissance complète + = croissance faible - = pas de croissance
Exemple 2
On place la souche Corynebacterium glutamlcum H-4412 (FERM BP-1069) sur un milieu d'ensemencement (20 ml) dans un Erlenmeyer de 300 ml, ledit milieu ayant la composition suivante : glucose 40 g/l, urée 3 g/l, KH2PO4 1,5 g/l, K2HPO4 0,5 g/l, XgS04î7H-0 0,5 g/l, biotine 50 ug/l, peptone 20 g/l et extrait de levure 5 g/l (pK 7,2).TABLE I ss-naphthoquinone (g / ml) O 30 40
H-3149 ++ + strain
H-4412 ++ ++ +
Notes: ++ = full growth + = weak growth - = no growth
Example 2
The strain Corynebacterium glutamlcum H-4412 (FERM BP-1069) is placed on a seeding medium (20 ml) in a 300 ml Erlenmeyer flask, said medium having the following composition: glucose 40 g / l, urea 3 g / l , KH2PO4 1.5 g / l, K2HPO4 0.5 g / l, XgS04î7H-0 0.5 g / l, biotin 50 ug / l, peptone 20 g / l and yeast extract 5 g / l (pK 7, 2).
Après 24 h sous agitation (200 tours par minute) à 30' C la culture (2 ml) est transféree dans un Erlenmeyer de 300 ml contenant un milieu (20 ml; pH 7,2) ayant la composition suivante molasses (100 g/l; concentration calculée en glucose), sulfate d'ammonium (40 g/l), KH2POo (0,5 g/l), MgSO4,7H2O (0,5 g/l) et CaCO (30 g/l) pour nouvelle culture à 32' C pendant 4 jours sous agitation (220 tours par minute). Après la fin de la culture, la Llysine qui s'est accumulée dans le milieu représente 52 g/l de chlorhydrate de L-lysine (détermination selon la méthode par réaction colorée au moyen de cuivre/ninhydrine). Par comparaison, la souche parente H-3149 cultivée comme décrit ci-dessus donne 44 g/l de chlorhydrate de L-lysine. After 24 h with stirring (200 revolutions per minute) at 30 ° C. the culture (2 ml) is transferred to a 300 ml Erlenmeyer flask containing a medium (20 ml; pH 7.2) having the following molasses composition (100 g / l; calculated concentration of glucose), ammonium sulfate (40 g / l), KH2POo (0.5 g / l), MgSO4,7H2O (0.5 g / l) and CaCO (30 g / l) for new culture at 32 ° C for 4 days with stirring (220 rpm). After the end of the culture, the Llysine which has accumulated in the medium represents 52 g / l of L-lysine hydrochloride (determination according to the method by color reaction using copper / ninhydrin). By comparison, the parent strain H-3149 cultivated as described above gives 44 g / l of L-lysine hydrochloride.
Le bouillon de culture résultant (1 litre) est centrifugé pour obtenir le surnageant. Après ajustement du pH à 1,5 au moyen d'acide sulfurique, on fait passer le surnageant à travers une colonne garnie de Diaion SK-1B (sous forme H-; il s'agit d'une résine échangeuse d'ions fortement acide fabriquée par la société dite XITSUBISHI KASEI KOGYO K.K. de Tokyo) pour adsorber la L-lysine sur la résine. On lave la colonne à l'eau et élue au moyen d'ammoniaque 2N pour obtenir des fractions contenant de la lysine qui sont recueillies, combinées et concentrées. Après ajustement du pH à 2,0 au moyen d'acide chlorhydrique, on refroidit la solution concentrée tout en ajoutant de l'méthanol de façon à obtenir des cristaux de L- lysine (41 g). The resulting culture broth (1 liter) is centrifuged to obtain the supernatant. After adjusting the pH to 1.5 using sulfuric acid, the supernatant is passed through a column packed with Diaion SK-1B (in H form; it is a strongly acidic ion exchange resin manufactured by the company known as XITSUBISHI KASEI KOGYO KK from Tokyo) to adsorb L-lysine on the resin. The column is washed with water and eluted with 2N ammonia to obtain fractions containing lysine which are collected, combined and concentrated. After adjusting the pH to 2.0 using hydrochloric acid, the concentrated solution is cooled while adding methanol so as to obtain crystals of L-lysine (41 g).
Claims (3)
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Patent Citations (2)
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Non-Patent Citations (2)
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| CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 89, no.21, novembre 1978, page 456, résumé no. 178091f, Columbus, Ohio, US; & JP-A-78 86 089 (AJINOMOTO CO., INC.) 29-07-1978 * |
| PATENT ABSTRACTS OF JAPAN, page 2404 C 78; & JP-A-53 86 089 (AJINOMOTO K.K.) 29-07-1978 * |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| US5302521A (en) * | 1991-10-21 | 1994-04-12 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for producing L-lysine by iodothyronine resistant strains of Mucorynebacterium glutamicum |
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