FR2575834A1

FR2575834A1 - Antigenic composition for the immunoenzymatic detection of antibodies to Leptospira, a method for preparing it and the application of the said antigenic composition to the diagnosis of leptospirosis

Info

Publication number: FR2575834A1
Application number: FR8500161A
Authority: FR
Inventors: Marcel Mailloux; Yvette Dufresne
Original assignee: Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Institut Pasteur de Lille
Priority date: 1985-01-08
Filing date: 1985-01-08
Publication date: 1986-07-11
Also published as: FR2575834B1

Abstract

The present invention relates to an antigenic composition for the detection of antibodies to Leptospira. This thermoresistant composition is characterised in that it is obtained from at least one L. biflexa strain and at least one L. andamana strain. Application to the diagnosis of leptospiroses.

Description

La présente invention est relative à une nouvelle composition antigénique leptospirosique propre à être utilisée dans les tests de diagnostic de leptospirose par des méthodes immunoenzymatiques telles, notamment, que la méthode
ELISA et au procédé de préparation d'une telle composition antigénique.The present invention relates to a novel leptospirosis antigenic composition suitable for use in diagnostic tests for leptospirosis by immunoenzymatic methods such that, in particular, the method
ELISA and the process for preparing such an antigenic composition.

Comme on le sait, les infections par leptospires chez l'homme peuvent être diagnostiquées au laboratoire soit par isolement du germe responsable à partir du sang, de l'urine ou du liquide céphalorachidien, soit par la détection d'une augmentation des anticorps spécifiques dans le sérum. As is known, leptospiral infections in humans can be diagnosed in the laboratory either by isolating the causative organism from blood, urine, or cerebrospinal fluid, or by detecting an increase in specific antibodies in the laboratory. the serum.

Toutefois, bien que les cultures qu'il est nécessaire de réaliser pour isoler le germe responsable, présentent une importance épidémiologique certaine, néanmoins le temps que re quièrent de telles cultures et l'identification de l'organisme infectant, ne permettent de réaliser que des tests dont la réponse est trop tardive pour être utilisée efficacement. Au contraire, les tests de diagnostic immunologique qui détectent les anticorps spécifiques constituent des réactions de dépistage ou de référence propres à affirmer ou confirmer de façon suffisamment précoce le diagnostic d'une infection leptospirosique.However, although the cultures needed to isolate the causative organism are of definite epidemiological importance, however, the time required for such cultures and the identification of the infecting organism make it possible tests whose response is too late to be used effectively. On the contrary, immunological diagnostic tests that detect specific antibodies are screening or reference reactions that can confirm or confirm the diagnosis of leptospirosis infection early enough.

Le premier test de détection des anticorps proposé dans l'Art antérieur est la réaction d'agglutination lyse de
MARTIN et PETTIT mise au point en 1918, qui utilise les propriétés agglutinantes et lytiques du sérum de malade pour le sérotype spécifique utilisé, ou sa variante plus récente mise au point par KOLOCHINE-ERBER, plus connue sous le nom de "RAL" (réaction d'agglutination et de lyse) ou de "NAT" (microscopic agglutination test), dans laquelle les anticorps apparaissent au 1Oè-12è jour Jf. B. KOLOCHINE-ERBER et M.The first antibody detection test proposed in the prior art is the lysis agglutination reaction of
MARTIN and PETTIT developed in 1918, using the agglutinating and lytic properties of patient serum for the specific serotype used, or its more recent variant developed by KOLOCHINE-ERBER, better known as "RAL" (reaction agglutination and lysis) or "NAT" (microscopic agglutination test), in which the antibodies appear on the 10th-12th day Jf. B. KOLOCHINE-ERBER and M.

MAILLOUX : "Physiologie et Métabolisme des leptospires11,
Masson Ed., Septembre 1962 ; TURNER "LEPTOSPIROSIS II". Trans
Royal Soc. Trop. Med. Hyg., 1968, 62, pages 880-899ç
Cependant ce test, qui constitue actuellement le test de ré férence standard pour le diagnostic de la leptospirose, présente un certain nombre d'inconvénients techniques qui en font un test spécialisé, qui n'est pas réalisé dans les laboratoires de diagnostic de routine ; en effet ce test RAL requiert l'utilisation de cultures vivantes de leptospires virulentes et réalise la détermination à l'aide d'un microscope à fond noir que ne possèdent pas tous les laboratoires ; de plus, le test RAL n'est pas capable de distinguer l'une de l'autre les deux classes d'anticorps IgM et IgG et n'est donc pas en mesure de donner, par une seule réaction, des renseignements sur lefait de savoir, dans un cas donné, s'il s'agit d'une infection aigüe ou ancienne.MAILLOUX: "Physiology and Metabolism of Leptospires,"
Masson Ed., September 1962; TURNER "LEPTOSPIROSIS II". Trans
Royal Soc. Too much. Med. Hyg., 1968, 62, pp. 880-899.
However, this test, which is currently the standard reference test for the diagnosis of leptospirosis, has a number of technical drawbacks that make it a specialized test that is not performed in routine diagnostic laboratories; indeed this RAL test requires the use of live cultures of virulent leptospires and realizes the determination using a dark-field microscope that do not have all the laboratories; moreover, the RAL test is not capable of distinguishing between the two classes of IgM and IgG antibodies and is therefore not able to give, by a single reaction, information on the namely, in a given case, whether it is an acute infection or old.

Il est en outre connu d'utiliser l'antigène Leptospira biflexa Patoc, qui est un leptospire aquicole, non pathogène, pour réaliser le sérodiagnostic de leptospirose par la méthode d'agglutination-lyse Ccf. M. MAILLOUX, Annales de l'institut Pasteur, Janvier 1967, Tome 112, pages 121-1257 sans requérir la mise en jeu d'un grand nombre de sérotypes ou antigènes, attendu que Leptospira biflexa Patoc est un "antigène de groupe" qui détecte la présence de leptospires dans des sérums de malades, quel que soit le sérotype auquel appartiennent ces sérums. It is further known to use the Leptospira biflexa Patoc antigen, which is a nonpathogenic, leptospira, to carry out the serodiagnosis of leptospirosis by the Ccf agglutination-lysis method. Mr. MAILLOUX, Annals of the Pasteur Institute, January 1967, Volume 112, pages 121-1257 without requiring the introduction of a large number of serotypes or antigens, since Leptospira biflexa Patoc is a "group antigen" which detects the presence of leptospires in sera of patients, regardless of the serotype to which these sera belong.

TERPSTRA et Al. ÈZbl. Bakt. Hyg., I. Abt. Orig. A 247, 400-405 (1980L7 ont proposé de remplacer le test RAL compliqué et qui implique l'utilisation d'une batterie de leptospires de structures antigéniques très différentes et, par voie de conséquence, l'entretien de cultures-mères, par un test ELISA (enzyme-linked-immunosorbent assay) utilisant un antigène préparé à partir d'une souche de leptospire, la souche WIJNBERG sérotype ictérohaemorrhagiae, qui, selon ses
Auteurs, a permis de mettre en évidence la présence d'anticorps dans le sérum de patients atteints de leptospirose provoquée par des leptospires de 11 sérogroupes différents.TERPSTRA and Al. ÈZbl. Bakt. Hyg., I. Abt. Orig. A 247, 400-405 (1980L7) proposed to replace the complicated RAL test which involves the use of a battery of leptospires of very different antigenic structures and, consequently, the maintenance of parent cultures, by a ELISA test (enzyme-linked-immunosorbent assay) using an antigen prepared from a leptospiral strain, strain WIJNBERG serotype ictérohaemorrhagiae, which according to its
Authors, allowed to highlight the presence of antibodies in the serum of patients with leptospirosis caused by leptospires of 11 different serogroups.

Bien que la mise en oeuvre du test ELISA constitue un progrès important par rapport aux méthodes précédemment préconisées, en raison de sa sensibilité et de sa précocité sensiblement plus grandes, néanmoins TERPSTRA et Al. font appel à une souche pathogène, la souche de L. icterohaemorrhagiae Wijnberg, (la souche de L. interrogans Wijnberg, pathogène elle aussi, étant également citée dans cet Article, sans toutefois le support d'une expérimentatLon) et si la souche de L. biflexa Patoc I, qui n'est pas pathogène, est également citée, cette citation n'est pas supportée par une expérimentation, de sorte que l'on n'a aucune indication au sujet.de sa sensibilité. De plus TERPSTRA et Al. n'ont pas établi de distinction entre les anticorps IgM et IgG, distinction qui a été faite par ADLER et Al. /cf.Journal of Clinical Microbiology, Mai 1980, Vol. 11, N" 5, pages 452-457/ qui ont détecté dans les sérums de patients infectés par les sérovars de leptospires hardjo, pomona ou copenhageni, des IgM et des
IgG antileptospires spécifiques, par le test ELISA en phase solide, en présence de conjugués d'immunoglobulines M et d'immunoglobulines G, respectivement, et de peroxydase de raifort.Although the implementation of the ELISA test is an important advance over previously recommended methods, because of its substantially greater sensitivity and precocity, nevertheless TERPSTRA et al. Use a pathogenic strain, the L. strain. icterohaemorrhagiae Wijnberg, (the strain of L. interrogans Wijnberg, a pathogen too, is also mentioned in this article, but without the support of an experiment) and if the L. biflexa Patoc I strain, which is not pathogenic, This quotation is also not supported by experimentation, so there is no indication of its sensitivity. In addition, TERPSTRA et al. Did not distinguish between IgM and IgG antibodies, a distinction made by ADLER and Al. / Cf. Journal of Clinical Microbiology, May 1980, Vol. 11, No. 5, pages 452-457 / which detected in the sera of patients infected with hardjo, pomona or copenhageni leptospires, IgM and
Specific antileptospiral IgG, by solid phase ELISA, in the presence of immunoglobulin M and immunoglobulin G conjugates, respectively, and horseradish peroxidase.

Toutefois, les tests ELISA de sérodiagnostic de la leptospirose décrits dans l'Art antérieur, font appel à des souches de leptospires pathogènes dangereuses à manipuler par les personnels chargés des analyses et, d'autre part, ils ne procurent pas une sûreté de diagnostic de 100 %, ce qui constitue un handicap sérieux, s'agissant d'une affection aussi grave que la leptospirose, propre à empecher dans certains cas, la mise en place précoce d'une thérapie efficace. However, the ELISA serodiagnostic tests for leptospirosis described in the prior art, use pathogenic leptospiral strains dangerous to handle by the staff responsible for the analyzes and, on the other hand, they do not provide a diagnostic safety of 100%, which constitutes a serious handicap, in the case of a condition as serious as leptospirosis, which can prevent in certain cases the early establishment of an effective therapy.

La présente invention s'est en conséquence donné pour but de pourvoir à une composition antigénique leptospirosique, qui part de souches de leptospires aquicoles, non pathogènes, qui est, par conséquent sans danger pour les manipulateurs, et qui procure une sûreté de diagnostic de l'ordre de 100 8 avec le test ELISA, tout en étant apte à détecter chez l'homme ou l'animal, des anticorps de leptospiroses provoquées par tous les sérotypes de leptospires, quels qu'ils soient. It has therefore been the object of the present invention to provide a leptospirosis antigenic composition which is based on non-pathogenic aquaculture leptospiral strains which is therefore safe for the manipulator and which provides a diagnostic safety of the animal. The order of 100 8 with the ELISA test, while being able to detect in humans or animals, leptospirosis antibodies caused by all serotypes of leptospires, whatever they are.

La présente invention a pour objet une composition antigénique obtenue à partir d'au moins une souche de L. biflexa et d1au moins une souche de L. andamana. The present invention relates to an antigenic composition obtained from at least one strain of L. biflexa and at least one strain of L. andamana.

Selon un mode de réalisation avantageux de la composition antigénique conforme à la présente invention, la souche de L. biflexa est une souche de L. biflexa Patoc et/ou une souche de L. biflexa Sao Paulo et/ou une souche de L. biflexa C-41. According to an advantageous embodiment of the antigenic composition according to the present invention, the strain of L. biflexa is a strain of L. biflexa Patoc and / or a strain of L. biflexa Sao Paulo and / or a strain of L. biflexa C-41.

Comme on le sait, la souche C-41 est une nouvelle souche appartenant à l'espèce L. biflexa, qui a été déposée le 29 Mai 1984 sous le n" I-309 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par l'institut
Pasteur.As is known, strain C-41 is a new strain belonging to the species L. biflexa, which was deposited on May 29, 1984 under No. I-309 in the National Collection of Cultures of Microorganisms held by Dr. 'institute
Pastor.

Selon un autre mode de réalisation avantageux de la composition antigénique conforme à la présente invention, la souche de L. andamana est une souche de L. andamana CH 11 et/ou une souche de L. andamana Bovedo. According to another advantageous embodiment of the antigenic composition according to the present invention, the L. andamana strain is a strain of L. andamana CH 11 and / or a L. andamana Bovedo strain.

Selon un autre mode de réalisation avantageux de la composition antigénique conforme à la présente invention, celle-ci est une composition antigénique thermorésistante (TR) obtenue à partir d'au moins une souche de L. biflexa et d'au moins une souche de L. andamana, dans laquelle la souche de L. bîflexa a été traitée en mettant en oeuvre le procédé décrit dans la Demande de Brevet français déposée au nom de la Demanderesse sous le numéro d'enregistrement 84 09324 en date du 14 Juin 1984, pour obtenir un antigène TR. According to another advantageous embodiment of the antigenic composition according to the present invention, it is a heat-resistant antigenic composition (TR) obtained from at least one strain of L. biflexa and at least one strain of L. andamana, in which the strain of L. biflexa was treated by carrying out the process described in the French patent application filed in the name of the Applicant under the registration number 84 09324 dated June 14, 1984, to obtain an antigen TR.

Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, la ou les souche(s) de L. biflexa mise(s) en oeuvre pour la préparation de la composition antigénique thermorésistante (TR) est ou sont prise(s) dans le groupe qui comprend non seulement la souche de L. biflexa C 41, comme dans la Demande de Brevet précitée, mais également la souche de L. biflexa Patoc et la souche de L. biflexa Sao Paulo. According to an advantageous arrangement of this embodiment, the strain (s) of L. biflexa used for the preparation of the heat-resistant antigenic composition (TR) is or are taken in the group which comprises not only the strain of L. biflexa C 41, as in the aforementioned Patent Application, but also the strain of L. biflexa Patoc and the strain of L. biflexa Sao Paulo.

Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux de la composition antigénique conforme à la présente invention, celle-ci est constituée par le mélange des surnageants de culture des quatre souches de leptospires suivantes : L. biflexa Patoc, L. biflexa Sao Paulo, L. andamana
CH 11, L. andamana Bovedo.According to a particularly advantageous embodiment of the antigenic composition according to the present invention, it consists of mixing the culture supernatants of the following four leptospiral strains: L. biflexa Patoc, L. biflexa Sao Paulo, L. andamana
CH 11, L. andamana Bovedo.

La présente invention a également pour objet un procédé de préparation de la composition antigénique conforme à la présente invention qui consiste - à cultiver chacune des souches de L. biflexa et de L. anda
mana mises en oeuvre, à une température et pendant une du
rée appropriée, dans un milieu approprié, qui peut être le
même pour chacune des souches cultivées - à tuer les leptospires des cultures obtenues et - à récupérer les surnageants de ces cultures tuées, résul
tant de la centrifugation desdites cultures préalablement
chauffées et dont le pH a été ajusté avant de les centrifu
ger, pour obtenir un mélange de surnageants qui constitue
la composition antigénique conforme à la présente inven
tion.The present invention also relates to a process for preparing the antigenic composition according to the present invention which consists in cultivating each of the L. biflexa and L. anda strains.
mana implemented, at a temperature and during one of
appropriate, in a suitable environment, which may be the
even for each of the strains cultured - to kill the leptospires of the cultures obtained and - to recover the supernatants of these killed cultures, results
both of the centrifugation of said cultures previously
heated and whose pH has been adjusted before the centrifuges
ger, to obtain a mixture of supernatants which constitutes
the antigenic composition according to the present invention
tion.

Selon un mode de réalisation avantageux du procédé de préparation de ladite composition antigénique conforme à l'invention, - chacune des souches de L. biflexa et de L. andamana est
cultivée séparément dans un milieu approprié, pendant 8-10
jours, à une température de l'ordre de 28"C, à l'étuve,
jusqu'à obtention d'une concentration moyenne de l'ordre de
1.108 à 2.108 leptospires/ml de culture - après vérification de la non-contamination de chacune des
cultures obtenues, les cultures obtenues sont réunies - le mélange desdites cultures est soumis à l'action de for
maldéhyde pur, introduit de préférence à raison d'environ
1,5 ml/100 ml de mélange de cultures, et maintenu en con
tact avec ledit mélange pendant environ 20 à 40 minutes - le mélange de cultures tuées est ensuite chauffé au bain
marie bouillant pendant environ 30 minutes, puis complète
ment refroidi jusqu'à la température ambiante - le pH du mélange de cultures tuées refroidi est alors ajus
té à pH compris entre 9 et 10 et de préférence à pH 9,6 - le mélange ainsi traité est alors centrifugé à 10000 g pen
dant 45 minutes à 1h15 ; puis, - après décantation, le surnageant est recueilli, pour être
utilisé en tant que composition antigénique conforme à
l'invention.According to an advantageous embodiment of the process for preparing said antigenic composition according to the invention, each of the L. biflexa and L. andamana strains is
grown separately in a suitable medium, during 8-10
days, at a temperature of about 28 ° C, in an oven,
until an average concentration of about
1.108 to 2.108 leptospires / ml of culture - after verifying the non-contamination of each of the
obtained cultures, the cultures obtained are combined - the mixture of said cultures is subjected to the action of for
pure maldehyde, preferably introduced at approximately
1.5 ml / 100 ml of mixture of cultures, and kept in con
tact with said mixture for about 20 to 40 minutes - the mixture of killed cultures is then heated in the bath
boiling for about 30 minutes, then complete
cooled to room temperature - the pH of the cooled killed cultures mixture is then
at a pH of between 9 and 10 and preferably at pH 9.6, the mixture thus treated is then centrifuged at 10,000 g.
45 minutes to 1:15; then, - after decantation, the supernatant is collected, to be
used as an antigenic composition according to
the invention.

Selon un autre mode de réalisation avantageux du procédé de préparation de ladite composition antigénique conforme à l'invention - chacune des souches de L. biflexa et de L. andamana est
cultivée séparément dans un milieu approprié, pendant 8-10
jours à une température de l'ordre de 28"C, à l'étuve, jus
qu'à obtention d'une concentration en leptospires de l'or
dre de 1.108 à 2.108 leptospires/ml de culture ; - chacune des cultures obtenue est traitée, après vérifica
tion de sa non-contamination, par du formaldéhyde pur, in
troduit dans ladite culture de préférence à raison de
1,5 ml/100 ml de culture et maintenu en contact avec ladite
culture pendant environ 20 à 40 minutes, pour tuer les
leptospires de ladite culture ;; - chacune des cultures est ensuite chauffée au bain-marie
bouillant pendant environ 30 minutes - puis, après complet refroidissement, le pH de chacune des
cultures est ajusté à 9-10 et de préférence à 9,6 ; - chacune des cultures est centrifugée séparément à 10000 g
pendant environ 45 minutes à lh15, - les surnageants de chacune des cultures, sont mélangés pour
former la composition antigénique conforme à l'invention.According to another advantageous embodiment of the process for preparing said antigenic composition according to the invention - each of the L. biflexa and L. andamana strains is
grown separately in a suitable medium, during 8-10
days at a temperature of about 28 ° C, in an oven, juice
than to obtain a concentration of gold leptospires
from 1.108 to 2.108 leptospires / ml of culture; - each of the cultures obtained is treated, after verification
of its non-contamination, with pure formaldehyde, in
troduced in said culture preferably at the rate of
1.5 ml / 100 ml of culture and kept in contact with said
culture for about 20 to 40 minutes, to kill the
leptospires of said culture; - each of the cultures is then heated in a bain-marie
boiling for about 30 minutes - then, after complete cooling, the pH of each of the
cultures is adjusted to 9-10 and preferably 9.6; - each of the cultures is centrifuged separately at 10000 g
for about 45 minutes at lh15, - the supernatants of each of the cultures, are mixed for
to form the antigenic composition according to the invention.

Selon un mode de réalisation avantageux du procédé de préparation de la composition antigénique conforme à l'invention, le milieu de culture des leptospires est un milieu 55955 à base de sels minéraux, oligo-éléments, vitamines,
Tween, BSA.According to an advantageous embodiment of the process for preparing the antigenic composition in accordance with the invention, the culture medium for leptospires is a 55955 medium based on mineral salts, trace elements, vitamins,
Tween, BSA.

Selon un autre mode de réalisation avantageux du procédé de préparation de la composition antigénique conforme à l'invention, le milieu de culture des leptospires est un milieu sans protéines, à base de sels minéraux, oligo-éléments, vitamine B1, vitamine B121 "Tween" 60 détoxifié, tampon TES (acide tris-méthyl-2-amino-éthane sulfonique), actuellement également désigné sous le n" 55955, tel que décrit et revendiqué dans la Demande de Brevet français n" 84 09324 citée plus haut, de la Demanderesse. According to another advantageous embodiment of the process for preparing the antigenic composition according to the invention, the culture medium of leptospires is a protein-free medium, based on mineral salts, trace elements, vitamin B1, vitamin B121 "Tween Detoxified 60, TES (tris-methyl-2-aminoethane sulfonic acid) buffer, currently also referred to as No. 55955, as described and claimed in French Patent Application No. 84 09324 cited above, Applicant.

Il s'est avéré que la composition antigénique conforme à la présente invention présente une très grande sensibilité et que son application dans un test ELISA permet d'obtenir une sûreté de diagnostic de 100 %, à un stade particulièrement précoce, puisqu'on est en mesure d'obtenir un diagnostic à partir du 4è jour de la maladie, ctest à-dire imme- diatement dès l'apparition des anticorps ; une telle précoce té du test présente une importance considérable pour le diagnostic et l'instauration du traitement thérapeutique appro- prie. It has been found that the antigenic composition according to the present invention has a very high sensitivity and that its application in an ELISA test makes it possible to obtain a diagnostic safety of 100%, at a particularly early stage, since it is possible to able to obtain a diagnosis from the 4th day of the disease, that is immediately after the appearance of the antibodies; such early testing is of considerable importance for the diagnosis and initiation of appropriate therapeutic treatment.

En outre la sensibilité du test permet de réaliser un diagnostic rétrospectif d'infections anciennes, susceptible d'orienter le traitement thérapeutique en cas d'atteinte infectieuse nouvelle. De plus, cette grande sensibilité permet de réaliser le contrôle immunologique des sérums utilisés pour la préparation des vaccins antileptospirosiques à l'aide du conjugué d'Ig et de peroxydase de raifort dont il a été question dans le préambule. In addition, the sensitivity of the test makes it possible to carry out a retrospective diagnosis of old infections, likely to guide the therapeutic treatment in case of new infectious disease. In addition, this high sensitivity makes it possible to carry out the immunological control of the sera used for the preparation of antileptospirosic vaccines with the aid of the conjugate of Ig and horseradish peroxidase which has been mentioned in the preamble.

Enfin, la nouvelle composition antigénique conforme à la présente invention permet de détecter dans les serums de patients, quel que soit le sérovar de leptospire dont ils sont infectés, la présence d'IgM antileptospires spécifiques, en présence du conjugué d'Ig et de peroxydase mentionné plus haut. Finally, the new antigenic composition according to the present invention makes it possible to detect in the sera of patients, regardless of the leptospiral serovar of which they are infected, the presence of specific antileptospiral IgM, in the presence of the conjugate of Ig and peroxidase. mentioned above.

La présente invention a en conséquence également pour objet un procédé de diagnostic de leptospiroses qui consilt a détecter les anticorps antileptospirosiques présents dans un sérum à contrôler, à l'aide de la composition antigénique conforme à l'invention, qui est telle qu'elle est apte à réagir avec le sérum à contrôler, prélevé chez un malade, quel que soit le sérotype infectant, en mettant en incubation ledit sérum avec ladite composition antigénique, à laquelle se lient les anticorps du groupe Leptospirosa, quels qu'ils soient, si de tels anticorps sont présents dans i 'é- chantillon de sérum à contrôler. The subject of the present invention is therefore also a method for the diagnosis of leptospirosis which aims to detect the antileptospirosis antibodies present in a serum to be checked, using the antigenic composition according to the invention, which is such that it is capable of reacting with the serum to be tested, taken from a patient, whatever the infective serotype, by incubating said serum with said antigenic composition, to which the antibodies of the Leptospirosa group bind, whatever they may be, if such antibodies are present in the serum sample to be tested.

Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du procédé de diagnostic de leptospiroses conforme à la présente invention, les anticorps liés obtenus au cours du mode de mise en oeuvre précédent, qui est alors à considérer comme une première étape du procédé de diagnostic conforme à l'invention, sont additionnés d'une quantité appropriée d'un conjugué (anticorps anti-IgM Chaîne p humains marqués à la peroxydase), provoquant ainsi la fixation des IgM sur lesdits anticorps liés, cette seconde étape du procédé de diagnostic étant suivie d'une troisième étape qui consiste à introduire un substrat constitué par de l'acide 5-aminosalicylique avantageusement additionné, juste avant son introduction dans le milieu réactionnel, d'eau oxygénée, pour provoquer, en présence d'anticorps antileptospirosiques, l'apparition d'une couleur marron/bordeaux plus ou moins intense résultant de la réaction de l'enzyme du conjugué avec le substrat susdit. According to an advantageous embodiment of the method of diagnosis of leptospirosis according to the present invention, the bound antibodies obtained during the preceding embodiment, which is then to be regarded as a first step of the diagnostic method according to the invention. to the invention are added a suitable amount of a conjugate (peroxidase-labeled anti-human IgM chain antibody), thereby causing IgM binding to said bound antibodies, this second step of the diagnostic method being followed by a third step of introducing a substrate consisting of 5-aminosalicylic acid advantageously added, just before its introduction into the reaction medium, hydrogen peroxide, to cause, in the presence of antileptospirosic antibodies, the appearance of a more or less intense brown / burgundy color resulting from the reaction of the enzyme of the conjugate with the aforesaid substrate.

Selon une modalité avantageuse de mise en oeuvre du procédé de diagnostic conforme à la présente invention, la composition antigénique conforme à l'invention est fixée aux parois des cupules, ou puits, de plaques de microtitration utiles pour la réalisation du test ELISA. According to an advantageous embodiment of the diagnostic method according to the present invention, the antigenic composition in accordance with the invention is attached to the walls of the wells, or wells, microtiter plates useful for carrying out the ELISA test.

La présente invention a en outre pour objet un kit, ou coffret, ou ensemble coordonné, prêt à l'emploi pour la mise en oeuvre du procédé de diagnostic de leptospiroses conforme à la présente invention, qui est caractérisé en ce qu'il comprend - une quantité appropriée de la composition antigénique- con
forme à l'invention, contenue dans un récipient convenable; - une quantité appropriée de sérum humain positif de contrô
le, contenu dans un récipient convenable - une quantité appropriée de conjugué d'anticorps anti-IgM
(chaîne p) humains marqués à la peroxydase, dans un réci
pient convenable - une quantité appropriée de substrat tel que l'acide amino
5-hydroxy-2-benzoïque dans un récipient convenable - une quantité appropriée d'H202 dans un récipient convena
ble ;; - une solution concentrée de tampon phosphate-PBS, dans un
récipient convenable, destinée à être diluée au 1/10è lors
de son utilisation - une solution de tampon PBS-"TWEEN" à pH 7,2 8 0,1 - une solution de tampon PBS-Tween-Albumine à pH 7,2 i 0,1 - une pluralité de plaques de microtitration utiles dans le
test ELISA - éventuellement une pluralité de pipettes automatiques de
50 pl, de 100 pl, de 200 pl, de 1000 pi, etc... à un seul
canal ou à canaux multiples.The present invention further relates to a kit, or kit, or coordinated set, ready to use for the implementation of the method of diagnosis of leptospirosis according to the present invention, which is characterized in that it comprises: an appropriate amount of the antigenic composition
form to the invention, contained in a suitable container; - an appropriate amount of positive control human serum
contained in a suitable container - an appropriate amount of anti-IgM antibody conjugate
peroxidase-labeled human (p chain), in a recipe
suitably - a suitable amount of substrate such as amino acid
5-hydroxy-2-benzoic acid in a suitable container - an appropriate amount of H 2 O 2 in a suitable container
corn ;; a concentrated solution of phosphate-PBS buffer, in a
suitable container, intended to be diluted 1/10
of its use - a solution of PBS-"TWEEN" buffer at pH 7.2 8 0.1 - a solution of PBS-Tween-Albumin buffer at pH 7.2 0.1 - a plurality of microtiter plates useful in the
ELISA test - possibly a plurality of automatic pipettes
50 pl, 100 pl, 200 pl, 1000 ft, etc ... to a single
channel or multiple channels.

Selon un mode de réalisation simplifié du kit de diagnostic prêt à l'emploi conforme à la présente invention, ledit kit est caractérisé en ce qu'il contient - une pluralité de plaques de microtitration utiles pour la
réalisation du test ELISA - éventuellement des pipettes automatiques de 50 pl, 100 pl,
200 pl et 1000 pl à un ou plusieurs canaux - les réactifs aptes à se conserver dans des conditions de
température ne dépassant pas + 8"C, à savoir
une quantité appropriée de la composition antigéni
que conforme à l'invention contenue dans un réci
pient convenable
une quantité appropriée de sérum humain positif de
contrôle, contenue dans un récipient convenable
une quantité appropriée de solution concentrée de
tampon phosphate-PBS stérilisée.According to a simplified embodiment of the ready-to-use diagnostic kit according to the present invention, said kit is characterized in that it contains - a plurality of microtiter plates useful for the
performing the ELISA test - possibly automatic pipettes of 50 pl, 100 pl,
200 μl and 1000 μl to one or more channels - reagents suitable for storage under
temperature not exceeding + 8 ° C, namely
an appropriate amount of the antigenic composition
that conforms to the invention contained in a recital
suitably
an appropriate amount of human serum positive from
control, contained in a suitable container
an appropriate amount of concentrated solution of
sterilized phosphate-PBS buffer.

Selon encore un autre mode de réalisation avantageux du kit de diagnostic prêt à l'emploi conforme à la présente invention, les plaques de microtitration sont constituées par des microplaques à fond plat comprenant chacune 12 rangées de chacune 8 cupules, ou puits, de 300 pl de contenance ou par des microplaques à fond plat constituées chacune par une seule rangée de 8 cupules ou puits qui sont caractérisées en ce qu'elles sont revêtues de la composition antigénique conforme à l'invention par adsorption de cette dernière sur la surface intérieure des cupules de chaque microplaque. According to yet another advantageous embodiment of the ready-to-use diagnostic kit according to the present invention, the microtiter plates consist of flat-bottom microplates each comprising 12 rows of each 8 wells, or well, of 300 μl. of capacity or by flat-bottom microplates each consisting of a single row of 8 wells or wells which are characterized in that they are coated with the antigenic composition according to the invention by adsorption of the latter on the inner surface of the wells of each microplate.

Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. In addition to the foregoing, the invention further comprises other provisions, which will emerge from the description which follows.

L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de préparation de la composition antigénique conforme à l'invention, un exemple de mise en oeuvre du test de détection immunoenzymatique des anticorps antileptospirosiques dans un échantillon de sérum à contrôler, et un compte-rendu d'une série de sérodiagnostics de leptospirose humaine effectués à l'aide de la technique ELISA et, à titre comparatif à l'aide des tests RAL, à l'aide d'antigène thermorésistant préparé conformément à la Demande de Brevet mentionnée plus haut et par hémagglutination. The invention will be better understood with the aid of the additional description which follows, which refers to examples of preparation of the antigenic composition according to the invention, an example of implementation of the immunoenzymatic detection test of antileptospirosic antibodies. in a serum sample to be tested, and a review of a series of human leptospirosis serodiagnostics performed using the ELISA technique and, by way of comparison using RAL tests, with the help of heat-resistant antigen prepared according to the aforementioned Patent Application and by haemagglutination.

Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples et les parties descriptives correspondantes, sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. It should be understood, however, that these examples and the corresponding descriptive parts are given solely by way of illustration of the object of the invention, of which they in no way constitute a limitation.

I - Exemples de préparation de la composition antigénique
conforme à l'invention.I - Examples of preparation of the antigenic composition
according to the invention.

EXEMPLE 1 - Préparation d'une composition antigénique
contenant des leptospires de Leptospira bi
flexa Patoc, de L. biflexa Sao Paulo, de L. EXAMPLE 1 - Preparation of an antigenic composition
containing leptospires of Leptospira bi
flexa Patoc, L. biflexa Sao Paulo, L.

andamana CH 11 et de L. andamana Bovedo. andamana CH 11 and L. andamana Bovedo.

1.a) On cultive une souche de L. biflexa Patoc à l'étuve à
28 C dans un milieu sans protéines, actuellement désigné
sous le n 55955 et dont la composition est la suivan
te
Constituants Quantités par litre de milieu
TES 1,2 g
NaCl 0,9g
Pyruvate de sodium 0,2 g
Glycérol à 1.0 g % 1,0 mi
CaCl2, 2H20 à 1,5 g % 1,0 ml
MgCl2, 6H20 à 1,5 g % 1,0 ml
ZnSO4, 7H20 à 0,1 g % 0,5 ml
*FeSO4, 7H20 à 0,1 g % 0,5 ml
Thiamine HCl (B1) à 0,5 g % 1,0 ml
NH4Cl à 25 g % 0,9 ml
Vitamine B12 à 0,02 g % 1,0 ml
MnSO4, H20 à 0,1 g % 1,0 ml
KH2PO4 1,0 g 8 1,0 mi
"Tween" 60 1110 g % 13 ml
pH 7,2 * à préparer extemporanément.1.a) A strain of L. biflexa Patoc is cultured in the oven at
28 C in protein-free medium, currently designated
55955 and whose composition is as follows
you
Constituents Quantities per liter of medium
TES 1.2 g
NaCl 0.9g
Sodium pyruvate 0.2 g
Glycerol at 1.0 g% 1.0 mi
CaCl2, 2H2O at 1.5 g% 1.0 ml
MgCl 2, 6H 2 O at 1.5 g, 1.0 ml
ZnSO4, 7H2O 0.1 g% 0.5 ml
* FeSO4, 7H20 at 0.1 g% 0.5 ml
Thiamine HCl (B1) at 0.5 g% 1.0 ml
NH4Cl at 25 g% 0.9 ml
Vitamin B12 at 0.02 g% 1.0 ml
MnSO4, 0.1 g H 2 0% 1.0 ml
KH2PO4 1.0 g 8 1.0 mi
"Tween" 60 1110 g% 13 ml
pH 7.2 * to be prepared extemporaneously.

La culture est stoppée, à l'aide de formol par
exemple, lorsque sa concentration en leptospires est au
moins égale à 1.108 leptospires/ml de culture et est de
préférence supérieure à ce nombre et avantageusement de
l'ordre de 1.108 à 2.108 leptospires/ml de culture ; une
telle concentration est atteinte au bout de 8 à 10 jours
de culture dans le milieu précité.The culture is stopped, using formalin by
example, when its concentration in leptospires is at
less than 1,108 leptospires / ml of culture and is
preferably greater than this number and advantageously of
in the order of 1.108 to 2.108 leptospires / ml of culture; a
such concentration is reached after 8 to 10 days
of culture in the aforementioned medium.

Avant de stopper la culture on vérifie qu'elle
n'est pas contaminée.Before stopping the culture we check that it
is not contaminated.

b) On procède comme décrit en 1.a) ci-dessus, en réalisant
une culture de L. biflexa Sao Paulo.b) We proceed as described in 1.a) above, realizing
a culture of L. biflexa Sao Paulo.

c) On procède comme décrit en 1.a) ci-dessus, en réalisant
une culture de L. andamana CH 11. c) We proceed as described in 1.a) above, realizing
a culture of L. andamana CH 11.

d) On procède comme décrit en 1.a) ci-dessus, en réalisant
une culture de L. andamana Bovedo.d) We proceed as described in 1.a) above, realizing
a culture of L. andamana Bovedo.

2. On mélange alors en proportions égales les quatre cultu
res obtenues en 1. ci-dessus et on tue le mélange de
cultures par adjonction de formaldéhyde pur, à raison de
1,5 ml pour 100 ml du mélange de cultures, et l'on main
tient en contact pendant environ 30 minutes.2. The four cultures are then mixed in equal proportions
are obtained in 1. above and kill the mixture of
cultures by the addition of pure formaldehyde, at the rate of
1.5 ml per 100 ml of the mixture of cultures, and one hand
keeps in touch for about 30 minutes.

3. Le mélange de cultures est alors immergé dans un bain
marie bouillant, pendant 30 minutes au bout desquelles
le mélange est sorti du-bain-marie et est abandonné jus
qu'à refroidissement complet à la température ambiante.3. The mixture of cultures is then immersed in a bath
marie boiling, for 30 minutes after which
the mixture has come out of the water bath and is abandoned jus
than at full cooling at room temperature.

4. On ajuste alors le pH du mélange de cultures tuées, dû
ment refroidi, à pH 9,6 t 0,1.4. The pH of the mixture of cultures killed is then adjusted.
cooled to pH 9.6 t 0.1.

5. Le mélange ainsi traité est alors centrifugé à 10000 g
pendant une heure, après quoi l'on recueille, après dé
cantation, le surnageant qui est la composition anti
génique conforme à l'invention.5. The mixture thus treated is then centrifuged at 10000 g
for an hour, after which we collect, after
cantation, the supernatant which is the anti
gene according to the invention.

A noter que pour 100 ml de culture en flacons, on obtient un volume d'antigène égal au volume de la culture, soit 100 ml. It should be noted that for 100 ml of culture in flasks, one obtains a volume of antigen equal to the volume of the culture, ie 100 ml.

EXEMPLE 2 - Préparation d'une composition antigénique
contenant des leptospires de Leptospira bi
flexa Patoc,-de L. biflexa Sao Paulo, de L.EXAMPLE 2 - Preparation of an antigenic composition
containing leptospires of Leptospira bi
flexa Patoc, from L. biflexa Sao Paulo, L.

andamana CH 11 et de L. andamana Bovedo. andamana CH 11 and L. andamana Bovedo.

1.a) On cultive une souche de L. biflexa Patoc à ltétuve à
28 C, dans un milieu de 55955 dont la composition est la
suivante :
Phosphate disodique Na2 H PO4, 12H20 ....... 1 g
Phosphate monopotassique K H2 PO4 .......... 0,3 g
Chlorure de sodium NaCl .................... 1 g
Chlorure d'ammonium à 25 8 ............... 1 ml
Chlorure de calcium à 1 % ................ 1 ml
Chlorure de magnésium à 1 % .................. 1 ml
Sulfate de fer à 0,5 % ................... 10 ml
Sulfate de zinc à 0,4 % ....................... 1 ml
Sulfate de cuivre à 0,3 % ................... 0,1 ml
Thiamine à 0,5 % ............................. 1 ml
Vitamine B12 à 0,02 % .................. 1 ml
Tween 80 solution à 10 % ! 12,5 ml
Bovine Serum Albumine (Fraction V) ........... 10 g
Eau distillée q.s.p. 1.000 ml
pour 1 litre de milieu.1.a) A strain of L. biflexa Patoc is cultured in the oven at
28 C, in an environment of 55955 whose composition is the
next :
Disodium phosphate Na2 H PO4, 12H20 ....... 1 g
K2 PO4 monopotassium phosphate .......... 0.3 g
Sodium chloride NaCl .................... 1 g
Ammonium chloride at 25 8 ............... 1 ml
Calcium chloride 1% ............... 1 ml
Magnesium chloride 1% .................. 1 ml
0.5% iron sulphate ................... 10 ml
Zinc sulphate 0.4% ....................... 1 ml
0.3% copper sulphate ................... 0.1 ml
Thiamine at 0.5% ............................. 1 ml
Vitamin B12 at 0.02% .................. 1 ml
Tween 80 10% solution! 12.5 ml
Bovine Serum Albumin (Fraction V) ........... 10 g
Distilled water qs 1.000 ml
for 1 liter of medium.

La culture est stoppée, à l'aide de formol par exemple, lorsque sa concentration en leptospires est au moins égale à 1.108 leptospires/ml de culture et est de préférence supérieure à ce nombre et avantageusement de l'ordre de 1.108 à 2.108 leptospires/ml de culture ; une telle concentration est atteinte au bout de 8 à 10 jours de culture dans le milieu précité. The culture is stopped, using formalin, for example, when its concentration in leptospires is at least equal to 1.108 leptospires / ml of culture and is preferably greater than this number and advantageously of the order of 1.108 to 2.108 leptospires / ml of culture; such a concentration is reached after 8 to 10 days of culture in the aforementioned medium.

Avant de stopper la culture on vérifie qu'elle n'est pas contaminée. Before stopping the crop, check that it is not contaminated.

c) On procède comme décrit en 1.a) ci-dessus, en réalisant
une culture de L. andamana CH 11.c) We proceed as described in 1.a) above, realizing
a culture of L. andamana CH 11.

3. Le mélange de cultures est alors immergé dans un bain
marie bouillant, pendant 30 minutes au bout desquelles
le mélange est sorti du bain-marie et est abandonné jus
qu'à refroidissement complet à la température ambiante.3. The mixture of cultures is then immersed in a bath
marie boiling, for 30 minutes after which
the mixture has come out of the water bath and is abandoned jus
than at full cooling at room temperature.

4. On ajuste alors le pH du mélange de cultures tuées, dû
ment refroidi, à pH 9,6 1 0,1.4. The pH of the mixture of cultures killed is then adjusted.
cooled to pH 9.6 ± 0.1.

5. Le mélange ainsi traité est alors centrifugé à 10000 g
pendant une heure, après quoi l'on recueille, après dé
cantation, le surnageant qui est la composition anti
génique conforme à l'invehtion. 5. The mixture thus treated is then centrifuged at 10000 g
for an hour, after which we collect, after
cantation, the supernatant which is the anti
gene consistent with the invention.

EXEMPLE 3 - Préparation d'une composition antigénique
contenant des leptospires de Leptospira bi
flexa Patoc, de L. biflexa Sao Paulo, de L.EXAMPLE 3 - Preparation of an antigenic composition
containing leptospires of Leptospira bi
flexa Patoc, L. biflexa Sao Paulo, L.

andamana CH 11 et de L. andamana Bovedo. andamana CH 11 and L. andamana Bovedo.

1. Les quatre souches de Leptospira sont cultivées séparé
ment comme décrit à l'Exemple 1.1 ci-dessus.1. The four strains of Leptospira are grown separately
as described in Example 1.1 above.

2. Toutefois, au lieu de les mélanger une fois la concen
tration en leptospires voulue atteinte, on poursuit leur
traitement séparément, ce qui signifie que
a) chacune des cultures est tuée par adjonction de for
maldéhyde pur à raison de 1,5 ml/100 ml de culture et
maintien en contact pendant 30 minutes ;
b) chacune des cultures tuées est chauffée au bain-marie
bouillant pendant 30 minutes, au bout desquelles elle
est refroidie et son pH est ajusté à pH 9,6 ss 0,1
c) chacune des cultures est alors centrifugée pendant
une heure à 10000 g.2. However, instead of mixing them once the concen
the leptospires desired, we continue their
treatment separately, which means that
(a) each crop is killed by the addition of
pure maldehyde at a rate of 1.5 ml / 100 ml of culture and
keeping in contact for 30 minutes;
(b) each of the killed crops is heated in a water-bath
boiling for 30 minutes, after which she
is cooled and its pH is adjusted to pH 9.6 ss 0.1
(c) each of the cultures is then centrifuged for
one hour at 10000 g.

d) On recueille, après décantation, le surnageant des
quatre cultures et on mélange les quatre surnageants
obtenus : le mélange forme la composition antigénique
conforme à l'invention.d) After decantation, the supernatant of
four cultures and mix the four supernatants
obtained: the mixture forms the antigenic composition
according to the invention.

EXEMPLE 4 - Préparation d'une composition antigénique
contenant des leptospires de Leptospira bi
flexa Patoc, de L. biflexa C 41 TR, de L. an
damana CH 11 et de L. andamana Bovedo.EXAMPLE 4 - Preparation of an antigenic composition
containing leptospires of Leptospira bi
flexa Patoc, from L. biflexa C 41 TR, from L. an
damana CH 11 and L. andamana Bovedo.

On procède comme décrit à l'Exemple 1 ou à l'Exemple 2, en remplaçant toutefois la culture de L. biflexa Sao
Paulo par une culture de L. biflexa C 41.The procedure is as described in Example 1 or in Example 2, however replacing the culture of L. biflexa Sao
Paulo by a culture of L. biflexa C 41.

EXEMPLE 5 - Préparation d'une composition antigénique
contenant des leptospires de L. biflexa
Patoc, de L. biflexa C 41, de L. andamana
CH 11 et de L. andamana Bovedo.EXAMPLE 5 - Preparation of an antigenic composition
containing leptospires of L. biflexa
Patoc, L. biflexa C 41, L. andamana
CH 11 and L. andamana Bovedo.

1. On cultive séparément comme décrit en 1.a), 1.c) et 1.d)
de l'Exemple 1 des souches de L. biflexa Patoc, de L.1. We cultivate separately as described in 1.a), 1.c) and 1.d)
of Example 1 strains of L. biflexa Patoc, L.

andamana CH 11 et de L. andamana Bovedo. andamana CH 11 and L. andamana Bovedo.

2. D'autre part on cultive une souche de L. biflexa C 41
comme décrit dans la Demande de Brevet français numéro
84 09324 du 14 Juin 1984, déjà mentionnée plus haut et
l'on centrifuge la culture decL. biflexa C 41 ainsi ob
tenue, à 10000 g pendant une heure, pour recueillir un
surnageant de culture.2. On the other hand, a strain of L. biflexa C 41 is grown.
as described in the French patent application number
84 09324 of June 14, 1984, already mentioned above and
the culture decL is centrifuged. biflexa C 41 so ob
holding, at 10000 g for one hour, to collect a
culture supernatant.

3. Ce surnageant de culture thermorésistant (TR) est mélan
gé aux surnageants des trois autres cultures, obtenus en
mettant en oeuvre l'Exemple 1 ou l'Exemple 2 ci-dessus
EXEMPLE 6 - Préparation d'une composition antigénique
contenant des leptospires de L. biflexa Patoc
I TR, de L. biflexa Sao Paulo, de L andamana
CH 11 et de L. andamana Bovedo.3. This heat-resistant (TR) culture supernatant is melan
to the supernatants of the other three cultures, obtained in
using Example 1 or Example 2 above
EXAMPLE 6 - Preparation of an antigenic composition
containing leptospires of L. biflexa Patoc
I TR, by L. biflexa Sao Paulo, from L andamana
CH 11 and L. andamana Bovedo.

1. On cultive des souches de L. biflexa Sao Paulo, de L.1. Strains of L. biflexa Sao Paulo, L. are grown.

andamana CH 11 et de L. andamana Bovedo en procédant
comme décrit à l'Exemple 1.1. ci-dessus.andamana CH 11 and L. andamana Bovedo proceeding
as described in Example 1.1. above.

2. On cultive une souche de L. biflexa Patoc I, serogroupe
semaranga pendant 10 jours en milieu de Reiter-Ramme
tamponné et additionné de peptone puis traité corme dé
crit dans "TROPENMEDIZIN UND PARASITOLOGIE" (Band 26,
Heft 1, 1975, pages 35-42, "Recherches sur les antigènes
des leptospires", J. MAZZONELLI, G. DORTA de MAZZONELLI
et M. MAILLOUX).2. A strain of L. biflexa Patoc I, serogroup
semaranga for 10 days in the middle of Reiter-Ramme
buffered and supplemented with peptone then treated as
written in "TROPENMEDIZIN UND PARASITOLOGY" (Band 26,
Heft 1, 1975, pp. 35-42, "Antigen Investigation
leptospires ", J. MAZZONELLI, G. DORTA from MAZZONELLI
and M. MAILLOUX).

3. Le surnageant recueilli, contenant un antigène thermo
résistant pour L. biflexa Patoc I, est mélange aux sur-
nageants des trois autres cultures que ceux-ci aient été
obtenus, comme décrit aux Exemples 1 et 2, ou comme dé
crit à l'Exemple 3, la composition antigénique conforme
à l'invention résultante étant thermorésistante. 3. The supernatant collected, containing a thermo antigen
resistant to L. biflexa Patoc I, is a mixture with
swimmers from the other three cultures that these have been
obtained, as described in Examples 1 and 2, or as
written in Example 3, the antigenic composition according to
to the resulting invention being heat-resistant.

II - DETECTION IMMUNOENZYMATIQUE D'ANTICORPS ANTI-LEPTO
SPIROSIQUES PAR LA TECHNIQUE ELISA.II - IMMUNOENZYMATIC DETECTION OF ANTI-LEPTO ANTIBODIES
SPIROSIQUES BY THE ELISA TECHNIQUE.

Le test de diagnostic de leptospirose qui fait
l'objet de la présente invention est un test simple
et sensible qui permet de détecter les anticorps
anti-leptospirosiques à l'aide d'une composition
antigénique leptospirosique nouvelle, qui fait éga
lement l'objet de la présente invention, qui réagit
avec le sérum de malade quel que soit le sérotype
infectant.The diagnostic test of leptospirosis that makes
the object of the present invention is a simple test
and sensitive that can detect antibodies
anti-leptospirosis using a composition
antigenic leptospirosis new, which makes
object of the present invention, which reacts
with the patient's serum regardless of the serotype
infective.

A. Ce test de diagnostic repose sur les principes suivants
Le sérum à contrôler est mis en incubation dans les cupules d'une plaque de microtitration en matière plastique (PVC ou polystyrène notamment) prévue pour la technique
ELISA, qu'il s'agisse d'une plaque de microtitration à 96 cupules à fond plat ou d'une plaque comprenant une seule rangée de 8 cupules à fond plat, lesquelles cupules sont sensibilisées par adsorption sur leur paroi de la composition antigénique conforme à l'invention.A. This diagnostic test is based on the following principles
The serum to be tested is incubated in the wells of a plastic microtitration plate (PVC or polystyrene in particular) provided for the technique.
ELISA, whether it is a 96-well flat-bottomed microtitre plate or a plate comprising a single row of 8 flat-bottomed wells, which wells are sensitized by adsorption on their wall of the compliant antigenic composition to the invention.

Si des anticorps de groupe sont présents dans i 'é- chantillon, ils se lient aux antigènes reliés à la phase solide. Ce qui n'est pas fixé est éliminé par lavages. If group antibodies are present in the sample, they bind to the antigens bound to the solid phase. What is not fixed is removed by washing.

Le conjugué (anticorps anti-IgM - chaîne p - humaines marqués à la peroxydase) est ajouté dans un deuxième temps. Les IgM se fixent sur les fragments des anticorps retenus sur les cupules. Ceux qui ne sont pas fixés sont à nouveau éliminés par lavages. The conjugate (anti-IgM - p-chain - human antibodies labeled with peroxidase) is added in a second step. IgM binds to antibody fragments retained on the wells. Those that are not fixed are washed out again.

L'addition du substrat de l'enzyme peroxydase dans un dernier stade est suivie de l'apparition d'une couleur marron/bordeaux plus ou moins intense, résultant de la réaction enzymatique si l'échantillon contient des anticorps anti-leptospirosiques. Au contraire, si l'échantillon testé ne contient pas d'anticorps anti-leptospirosiques, le conjugué n est pas retenu et aucune coloration ne se développe. The addition of the substrate of the peroxidase enzyme in a final stage is followed by the appearance of a more or less intense brown / burgundy color, resulting from the enzymatic reaction if the sample contains anti-leptospirosic antibodies. On the contrary, if the tested sample does not contain anti-leptospirosic antibodies, the conjugate is not retained and no coloration develops.

En cas de réaction positive, voire douteuse, il est absolument nécessaire d'adresser le sérum examiné au Centre
National des Leptospires pour confirmation et détermination du sérotype en cause.In the case of a positive or even doubtful reaction, it is absolutely necessary to send the serum examined to the Center.
National Leptospires for confirmation and determination of the serotype in question.

REACTIFS 1. Composition antigénique conforme à l'invention prête à
l'emploi.REAGENTS 1. Antigen composition according to the invention ready to
employment.

2. Sérum humain de contrôle, positif.2. Human control serum, positive.

Conservation : + 2 C à + 8 C jusqu'à la date indiquée sur
le conditionnement.Conservation: + 2 C to + 8 C until the date indicated on
the conditioning.

3. Conjugué IgM - Anticorps ANTI-IgM (chaîne p) HUMAINES mar
qués à la peroxydase (chèvre ou mouton).3. IgM Conjugate - ANTI-IgM Antibody (p chain) HUMAN
peroxidase (goat or sheep).

4. Substrat - Acide amino 5 - hydroxy 2 -benzoïque.4. Substrate - 5-hydroxy-2-benzoic amino acid.

5. Peroxyde d'hydrogène
H202 PM 34,01 (solution aqueuse).5. Hydrogen peroxide
H202 PM 34.01 (aqueous solution).

6. Tampons
6.1. Tampon phosphate - PBS (solution mère 10 fois concen
trée)
NaCl ....................................... 80 g
KCl ..................................... 2 g
Na2HPO412H2O ............................ 11,33 g
KH2PO4 .................................. 2 g
H20 distillée q.s.p. .................... 1000 ml
Conservation : peut être stérilisé par autoclavage - stable à + 4 C sous forme concentrée.6. Buffers
6.1. Phosphate buffer - PBS (stock solution 10 times concen
Tree)
NaCl ....................................... 80 g
KCl ..................................... 2 g
Na2HPO412H2O ............................ 11.33 g
KH2PO4 .................................. 2 g
Distilled H20 qs .................... 1000 ml
Storage: can be sterilized by autoclaving - stable at +4 C in concentrated form.

6.2. Tampon PBS - TWEEN pH 7,2 * 0,1
PBS (10 fois concentré) .............. 100 ml
Tween 20 ............................... 0,5 ml
H20 distillée q.s.p. ...................... 1000 ml
Conservation : 24 heures à + 4 C.6.2. Buffer PBS - TWEEN pH 7.2 * 0.1
PBS (10 times concentrated) .............. 100 ml
Tween 20 ............................... 0,5 ml
Distilled H20 qsp ...................... 1000 ml
Preservation: 24 hours at + 4 C.

Utilisation : Lavages. Use: Washes.

6.3. Tampon PBS - TWEEN - ALBUMINE à pH 7,2 i 0,1
PBS (10 fois concentré) .............. 10 ml
Tween 20 ................................ 0,05 ml
Albumine bovine (fraction V) v ou 0,5 g
H20 distillée q.s.p. O eoo 100 ml
Conservation : 24 heures à + 4C. 6.3. Buffer PBS - TWEEN - ALBUMIN pH 7.2 i 0.1
PBS (10 times concentrated) .............. 10 ml
Tween 20 ................................ 0.05 ml
Bovine albumin (fraction V) v or 0.5 g
Distilled H20 qsp O eoo 100 ml
Preservation: 24 hours at + 4C.

Utilisation : Dilution des sérums et
dilution du conjugué IgM peroxydase.Use: Dilution of sera and
dilution of IgM peroxidase conjugate.

REMARQUES concernant 6. ci-dessus
Seul le tampon phosphate-PBS (6.1. ci-dessus) peut être préparé à l'avance et est donc susceptible d'être inclus dans un kit de diagnostic de leptospirose prêt à l'emploi.NOTES on 6. above
Only phosphate-PBS buffer (6.1 above) can be prepared in advance and is therefore likely to be included in a ready-to-use leptospirosis diagnostic kit.

Les tampons PBS-Tween pH 7,2 1 0,1 (6.2... ci-dessus) et PBS
Tween-Albumine pH 7,2 + 0,1 (6.3.-ci-dessus) doivent être des tampons frais.PBS-Tween buffers pH 7.2 1 0.1 (6.2 ... above) and PBS
Tween-albumin pH 7.2 + 0.1 (6.3.-above) should be fresh buffers.

concernant 3. ci-dessus
Quant au conjugué IgM, il est mis en solution dans le tampon PBS-Tween-albumine extemporanément, juste avant le test ; toutefois, il peut être-conservé quelques heures à l'abri de la lumière et à + 4 C.concerning 3. above
As for the IgM conjugate, it is dissolved in the PBS-Tween-Albumin buffer extemporaneously, just before the test; however, it can be kept for a few hours away from light and + 4 C.

Les propositions pour une microplaque de 96 cupules sont les suivantes
Tampon PBS-Tween-albumine ................ 15 ml
Conjugué IgM ............................. 0,03 ml concernant 4. ci-dessus
La solution de substrat se prépare extemporanément, juste avant de procéder au test. Il est en outre recommandé de protéger la solution de la lumière en entourant le bécher qui la contient de papier d'aluminium.Proposals for a 96-well microplate are as follows
PBS-Tween-albumin buffer ................ 15 ml
IgM Conjugate ............................. 0.03 ml concerning 4. above
The substrate solution is prepared extemporaneously, just before testing. It is further recommended to protect the solution from light by surrounding the beaker containing it with aluminum foil.

Les proportions pour une microplaque de 96 cupules sont les suivantes
acide amino-5-hydroxy-2-benzoïque ..... 12 mg
H2O bidistillée ...................... 15 ml le pH étant ajusté à 6 par addition de NaOH N et N/10 puis au moment de la répartition dans les cupules, on ajoute
H2O2 à 10 volumes ........................ 0,150 ml (on dilue 11 fois i'H2O2 à 110 volumes dans de l'eau distillée pour obtenir de l'H2O2 à 10 volumes).The proportions for a 96-well microplate are as follows
amino-5-hydroxy-2-benzoic acid ..... 12 mg
H2O bidistilled ...................... 15 ml the pH being adjusted to 6 by addition of NaOH N and N / 10 and at the time of distribution in the wells , we add
H2O2 at 10 volumes ........................ 0.150 ml (diluted 11 times the H 2 O 2 to 110 volumes in distilled water to obtain H2O2 at 10 volumes).

B. La technique mise en oeuvre est décrite ci-après a) L'adsorption de l'antigène sur les microplaques (ou ran
gées de 8 cupules) se fait
- soit par évaporation à 37"C environ,
- soit à la température ambiante (par évaporation égale-
ment),
- soit à 37"C pendant 16 à 18 heures, la plaque étant re
couverte d'un papier aluminium pour éviter l'évapora-
tion.B. The technique used is described below: a) The adsorption of the antigen on the microplates (or
8 cups) is
either by evaporation at 37 ° C.,
- at room temperature (by evaporation also
is lying),
- at 37 ° C for 16 to 18 hours, the plate being re
covered with aluminum foil to prevent evaporation
tion.

Il est préférable de scotcher les cupules destinées à recevoir la dilution témoin des sérums à tester, pour éviter qu'elles reçoivent des projections d'antigène lors de sa répartition dans les puits. It is preferable to tape the wells intended to receive the control dilution of the sera to be tested, so that they do not receive antigen projections when it is distributed in the wells.

b) Dilution des échantillons dans le tampon
PBS-Tween-Albumine

b) Dilution of the samples in the buffer
PBS-Tween-Albumin

<tb> <SEP> 1/50 <SEP> 1/100 <SEP> 1/200 <SEP> etc
<tb> PBS-Tween-Albumine <SEP> 980 <SEP> pl <SEP> 350 <SEP> pl <SEP> 350 <SEP> p <SEP>
<tb> (préparé <SEP> comme <SEP> décrit
<tb> en <SEP> A.6.3. <SEP> ci-dessus)
<tb> Sérum <SEP> à <SEP> tester <SEP> 20 <SEP> pl <SEP> O <SEP> 0
<tb> de <SEP> la- <SEP> dilution <SEP> au <SEP> 1/50 <SEP> 0 <SEP> 350 <SEP> pl <SEP> 0
<tb> de <SEP> la <SEP> dilution <SEP> au <SEP> 1/100 <SEP> 0 <SEP> O <SEP> <SEP> 350 <SEP> pi
<tb> (N.B. On peut pousser les dilutions aussi loin qu'on le désire).<tb><SEP> 1/50 <SEP> 1/100 <SEP> 1/200 <SEP> etc
<tb> PBS-Tween-albumin <SEP> 980 <SEP> pl <SEP> 350 <SEP> pl <SEP> 350 <SEP> p <SEP>
<tb> (prepared <SEP> as <SEP> describes
<tb> in <SEP> A.6.3. <SEP> above)
<tb> Serum <SEP> to <SEP> test <SEP> 20 <SEP> pl <SEP> O <SEP> 0
<tb><SEP><SEP> Dilution <SEP> to <SEP> 1/50 <SEP> 0 <SEP> 350 <SEP> Pl <SEP> 0
<tb> of <SEP><SEP> dilution <SEP> at <SEP> 1/100 <SEP> 0 <SEP> O <SEP><SEP> 350 <SEP> pi
<tb> (NB We can push the dilutions as far as we want).

c. Réalisation du titrage.c. Realization of the titration.

c. 1. Après avoir retiré le scotch obturant les cupules des
tinées à recevoir les dilutions des témoins sérums, on
effectue le lavage de la microplaque. A l'aide d'une
pissette contenant du tampon PBS-TWEEN, on remplit cha
que cupule ; on laisse en contact 1 à 2 minutes et on
vidange par retournement de la microplaque (ou aspira
tion, si on dispose d'un dispositif de vidange des mi
crocuves pas aspiration). On répète 4 ou 5 fois cette
opération. c. 1. After removing the scotch sealing the cups of
intended to receive the dilutions of the serum
wash the microplate. With the help of
bottle containing PBS-TWEEN buffer, fill
that cupule; we leave in contact 1 to 2 minutes and we
emptying by turning the microplate (or aspira
if a disposal device is available for the
crocuves not aspiration). We repeat 4 or 5 times this
surgery.

c. 2. Après le dernier lavage, on secoue bien la plaque pour
éliminer le tampon de lavage et on la pose retournée
sur du papier absorbant pour qu'elle finisse de s'é-
goutter.c. 2. After the last wash, shake the plate well
remove the wash buffer and return it
on absorbent paper so that it finishes
drip.

c. 3. On distribue 150 pl de la dilution du sérum à tester
Témoin sérum
Dilutions au 1 1 1 au 1
50 100 200 50
Sérum à tester 150 pl 150 pl 150 pl 150 pi
Sérum témoin + 150 pl 150 pl 150 pl 150 pi c. 4. On incube une heure à 37-C. c. 3. 150 μl of the serum dilution to be tested is dispensed
Serum control
Dilutions at 1 1 1 to 1
50 100 200 50
Serum to test 150 pl 150 pl 150 pl 150 ft
Serum control + 150 pl 150 pl 150 pl 150 c. 4. Incubate for one hour at 37-C.

c. 5. On vide les cupules par retournement ou aspiration et
on lave 4 fois comme décrit en c.1. ; c. 6. On distribue 150 pl de la solution du conjugué anti-IgM
préparée comme décrit sous A "REMARQUES", "concernant
3. ci-dessus" ; c. 7. On incube une heure à 37-C. c. 5. The cups are emptied by inversion or aspiration and
washed 4 times as described in c.1. ; c. 6. 150 μl of the anti-IgM conjugate solution is dispensed
prepared as described under "REMARKS", "concerning
3. above "C. 7. One hour incubated at 37 ° C.

c. 8. On vide les cupules par retournement ou aspiration et
on lave 4 fois comme décrit en c.1.c. 8. The cups are emptied by inversion or aspiration and
washed 4 times as described in c.1.

c. 9. On distribue 150 pl de la solution de substrat préparée
comme décrit sous A "REMARQUES" "concernant 4. ci
dessus" et on laisse la coloration se développer à la
température ambiante, à l'abri de la lumière.c. 9. 150 μl of the prepared substrate solution is dispensed
as described under A "REMARKS""concerning 4. ci
above "and let the color develop at
ambient temperature, protected from light.

c.10. On effectue la lecture par appréciation visuelle, après
30 minutes à une heure.c.10. We perform the reading by visual appreciation, after
30 minutes to an hour.

La lecture par appréciation visuelle est rapide et souvent suffisante. Reading by visual appreciation is fast and often sufficient.

On considère comme positif, c'est-à-dire contenant des anticorps anti-leptospirosiques, tout sérum ayant conduit à l'observation d'une couleur marron - bordeaux plus intense que celle du témoin sérum à tester (cupule n'ayant pas reçu d'antigène). It is considered as positive, that is to say containing anti-leptospirosic antibodies, any serum having led to the observation of a brown-bordeaux color more intense than that of the control serum to be tested (cupule which has not received antigen).

III - COMPTE-RENDU DE SERODIAGNOSTICS DE LEPTOSPIROSE REALI
SES A L'AIDE DES TESTS ELISA, RAL ET A L'AIDE D'ANTI
GENE TR , AINSI QUE PAR HEMAGGLUTINATION.III - SUMMARY OF SERODIAGNOSTICS OF LEPTOSPIROSE REALI
SES USING ELISA, RAL AND ANTI TESTS
GENE TR, AS WELL AS BY HEMAGGLUTINATION.

Les sérodiagnostics dont il est rendu compte ciaprès ont été réalisés au cours de la période comprise entre fin Août 1983 et fin Août 1984. Ils concernent 400 patients. The serodiagnostics reported below were carried out during the period between the end of August 1983 and the end of August 1984. They concern 400 patients.

Le sérum prélevé chez les patients examinés, a été fractionné pour être soumis aux techniques de sérodiagnostic suivantes 1. Test ELISA avec
la composition antigénique
conforme à l'Exemple 1.The serum taken from the patients examined was fractionated to be subjected to the following serodiagnostic techniques: 1. ELISA test with
antigenic composition
according to Example 1.

2. Test RAL.2. RAL test.

3. Test avec
l'antigène thermorésistant
TR selon la Demande de Brevet français
précitée, avec examen
macroscopique sur lame (TR).3. Test with
heat-resistant antigen
TR according to the French patent application
above, with examination
macroscopic slide (TR).

4. Test par hémagglutination(HA). 4. Haemagglutination test (HA).

TABLEAU I
Etude comparative des résultats des sérodiagnostics de leptospiroses, effectués par 4 techniques différentes sur des sérums de malades suspectés cliniquement de cette affection et prélevés entre le jour J 1 et le jour J 60.

TABLE I
Comparative study of the results of the serodiagnostics of leptospirosis, carried out by 4 different techniques on serums of patients suspected clinically of this affection and taken between the day D 1 and the day D 60.

<SEP> Nombre <SEP> de <SEP> P <SEP> O <SEP> S <SEP> I <SEP> T <SEP> I <SEP> F <SEP> S <SEP> Par <SEP> rapport <SEP> au <SEP> nombre <SEP> de <SEP> sérums
<tb> TEST <SEP> sérums <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> Dilutions <SEP> DOUTEUX <SEP> NEGATIFS <SEP> traités
<tb> <SEP> traités <SEP> sérums <SEP> POSITIFS <SEP> DOUTEUX <SEP> NEGATIFS
<tb> <SEP> % <SEP> % <SEP> %
<tb> 1. <SEP> E <SEP> 400 <SEP> 374 <SEP> 1/50 <SEP> 32 <SEP> 12 <SEP> 14 <SEP> 93,50 <SEP> % <SEP> 3,00 <SEP> % <SEP> 3,50 <SEP> %
<tb> <SEP> L <SEP> 1/100 <SEP> 65
<tb> <SEP> I <SEP> 1/200 <SEP> 80
<tb> <SEP> S <SEP> 1/400 <SEP> 68
<tb> <SEP> A <SEP> 1/800 <SEP> 57
<tb> <SEP> 1/1600 <SEP> 31
<tb> <SEP> 1/3200 <SEP> et <SEP> > <SEP> 41
<tb> 2.<SEP> R <SEP> 400 <SEP> 181 <SEP> 1/10 <SEP> et <SEP> 20 <SEP> 39 <SEP> 2 <SEP> 217 <SEP> 45,25 <SEP> % <SEP> 0,50 <SEP> % <SEP> 54,25 <SEP> %
<tb> <SEP> A <SEP> 1/50 <SEP> et <SEP> 80 <SEP> 32
<tb> <SEP> L <SEP> 1/100 <SEP> et <SEP> 200 <SEP> 33
<tb> <SEP> 1/500 <SEP> et <SEP> 800 <SEP> 22
<tb> <SEP> 1/1000 <SEP> à <SEP> 8000 <SEP> 37
<tb> <SEP> 1/10000 <SEP> à <SEP> 20000 <SEP> 18
<tb> 3. <SEP> TR <SEP> 350 <SEP> 63 <SEP> 3 <SEP> 284 <SEP> 18,00 <SEP> % <SEP> 0,86 <SEP> % <SEP> 81,14 <SEP> %
<tb> 4.<SEP> H <SEP> 216 <SEP> 38 <SEP> 1/10 <SEP> 7 <SEP> 4 <SEP> 174 <SEP> 17,59 <SEP> % <SEP> 1,85 <SEP> % <SEP> 80,56 <SEP> %
<tb> <SEP> A <SEP> 1/20 <SEP> 7
<tb> <SEP> 1/40 <SEP> 6
<tb> <SEP> 1/80 <SEP> 9
<tb> <SEP> 1/160 <SEP> 8
<tb> <SEP> 1/320 <SEP> 1
<tb>
N.B. au Tableau I 1") Les résultats qui figurent dans le Tableau I ci-dessus
concernent 400 malades.Sur les 400 sérums traités, 374
ont donné lieu à des résultats positifs qui se répartis
sent comme suit
PRELEVEMENT NOMBRE DE POSITIFS
du ler au 11ème jour 88
du 12ème au 21ème jour 52
du 22ème au 44ème jour 39
du 45eme au 60ème jour 3
182
Date du début de la maladie
inconnue + 192
374 2") Les 3 % de douteux et les 3,50 % de négatifs obtenus avec
le test ELISA correspondent à des prélèvements effectués
très précocement, à savoir entre le jour J 1 et le jour
J 4 du début de la maladie.<SEP> Number <SEP> of <SEP> P <SEP> O <SEP> S <SEP> I <SEP> T <SEP> I <SEP> F <SEP> S <SEP> By <SEP> report <SEP > at <SEP> number <SEP> of <SEP> sera
<tb> TEST <SEP> sera <SEP> Number <SEP> of <SEP> Dilutions <SEP> DOUBT <SEP> NEGATIVE <SEP> treated
<tb><SEP> treated <SEP> sera <SEP> POSITIVE <SEP> SOFT <SEP> NEGATIVE
<tb><SEP>%<SEP>%<SEP>%
<tb> 1. <SEP> E <SEP> 400 <SEP> 374 <SEP> 1/50 <SEP> 32 <SEP> 12 <SEP> 14 <SEP> 93.50 <SEP>% <SEP> 3, 00 <SEP>% <SEP> 3.50 <SEP>%
<tb><SEP> L <SEP> 1/100 <SEP> 65
<tb><SEP> I <SEP> 1/200 <SEP> 80
<tb><SEP> S <SEP> 1/400 <SEP> 68
<tb><SEP> A <SEP> 1/800 <SEP> 57
<tb><SEP> 1/1600 <SEP> 31
<tb><SEP> 1/3200 <SEP> and <SEP>><SEP> 41
<tb> 2. <SEP> R <SEP> 400 <SEP> 181 <SEP> 1/10 <SEP> and <SEP> 20 <SEP> 39 <SEP> 2 <SEP> 217 <SEP> 45.25 <SEP>%<SEP> 0.50 <SEP>% <SEP> 54.25 <SEP>%
<tb><SEP> A <SEP> 1/50 <SEP> and <SEP> 80 <SEP> 32
<tb><SEP> L <SEP> 1/100 <SEP> and <SEP> 200 <SEP> 33
<tb><SEP> 1/500 <SEP> and <SEP> 800 <SEP> 22
<tb><SEP> 1/1000 <SEP> to <SEP> 8000 <SEP> 37
<tb><SEP> 1/10000 <SEP> to <SEP> 20000 <SEP> 18
<tb> 3. <SEP> TR <SEP> 350 <SEP> 63 <SEP> 3 <SEP> 284 <SEP> 18.00 <SEP>% <SEP> 0.86 <SEP>% <SEP> 81, 14 <SEP>%
<tb> 4. <SEP> H <SEP> 216 <SEP> 38 <SEP> 1/10 <SEP> 7 <SEP> 4 <SEP> 174 <SEP> 17.59 <SEP>% <SEP> 1, 85 <SEP>% <SEP> 80.56 <SEP>%
<tb><SEP> A <SEP> 1/20 <SEP> 7
<tb><SEP> 1/40 <SEP> 6
<tb><SEP> 1/80 <SEP> 9
<tb><SEP> 1/160 <SEP> 8
<tb><SEP> 1/320 <SEP> 1
<Tb>
NB in Table I 1 ") The results shown in Table I above
about 400 patients.Of the 400 sera treated, 374
gave rise to positive results that are distributed
feel as follows
TAKING NUMBER OF POSITIVES
1st to 11th day 88
from the 12th to the 21st day 52
from the 22nd to the 44th day 39
from 45th to 60th day 3
182
Date of onset of illness
unknown + 192
374 2 ") The 3% of doubtful and the 3.50% of negatives obtained with
the ELISA test correspond to samples taken
very early, namely between day 1 and day
Day 4 of the beginning of the disease.

3 ) Les figures 1 et 2 annexées illustrent
- en ce qui concerne la figure 1, la répartition des ré
sultats en fonction des dilutions, le graphique repré
senté à la figure 1 portant en abscisse les dilutions
et en ordonnée le nombre de sérums analysés ;
- en ce qui concerne la figure 2, la répartition des ré
sultats négatifs, douteux et positifs en fonction de la
technique des tests (ELISA, RAL, TR ou HA) mise en oeu
vre. 3) Figures 1 and 2 attached illustrate
- as regards Figure 1, the distribution of the
results according to the dilutions, the graph
Figure 1 shows the dilutions on the x-axis
and on the ordinate the number of sera analyzed;
- with regard to Figure 2, the distribution of re
negative, doubtful and positive results depending on the
technical tests (ELISA, RAL, TR or HA) implemented
fever.

TABLEAU @@
Etude comparative des résultats des sérodiagnostics de leptospiroses,
effectués par 4 techniques différentes, sur des sérums de malades, suspectés cliniquement de cette affection et prélevés entre le jour J 1 et le jour J 11 du début de la maladie.

BOARD @@
Comparative study of the results of serodiagnostics of leptospirosis,
performed by 4 different techniques, on serums of patients, clinically suspected of this disease and collected between the day 1 and the day 11 of the beginning of the disease.

<SEP> Nombre <SEP> de <SEP> P <SEP> O <SEP> S <SEP> I <SEP> T <SEP> I <SEP> F <SEP> S <SEP> Par <SEP> rapport <SEP> au <SEP> nombre <SEP> de <SEP> sérums
<tb> TEST <SEP> sérums <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> Dilutions <SEP> DOUTEUX <SEP> NEGATIFS <SEP> traités
<tb> <SEP> traités <SEP> sérums <SEP> POSITIFS <SEP> DOUTEUX <SEP> NEGATIFS
<tb> <SEP> % <SEP> % <SEP> %
<tb> 1. <SEP> E <SEP> 88 <SEP> 76 <SEP> 1/50 <SEP> 9 <SEP> 6 <SEP> 6 <SEP> 86,36 <SEP> % <SEP> 6,82 <SEP> % <SEP> 6,82 <SEP> %
<tb> <SEP> L <SEP> 1/100 <SEP> 29
<tb> <SEP> I <SEP> 1/200 <SEP> 12
<tb> <SEP> S <SEP> 1/400 <SEP> 12
<tb> <SEP> A <SEP> 1/800 <SEP> 9
<tb> <SEP> 1/1600 <SEP> 4
<tb> <SEP> 1/3200 <SEP> et <SEP> > <SEP> 1
<tb> 2. <SEP> R <SEP> 88 <SEP> 2 <SEP> 1/10 <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 86 <SEP> 2,27 <SEP> % <SEP> 0 <SEP> % <SEP> 97,73 <SEP> %
<tb> <SEP> A
<tb> <SEP> L
<tb> 3.<SEP> TR <SEP> 76 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 73 <SEP> 2,63 <SEP> % <SEP> 1,32 <SEP> % <SEP> 96,05 <SEP> %
<tb> 4. <SEP> H <SEP> 42 <SEP> 2 <SEP> 1/20 <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 40 <SEP> 4,76 <SEP> % <SEP> 0 <SEP> % <SEP> 95,24 <SEP> %
<tb> <SEP> A <SEP> 1/160 <SEP> 2
<tb>
N.B. au Tableau Il
Les 6,82 % de négatifs et de douteux obtenus avec le test ELISA correspondent à des prélèvements effectués très précocement, à savoir entre le jour J 1 et le jour J 3 du début de la maladie.<SEP> Number <SEP> of <SEP> P <SEP> O <SEP> S <SEP> I <SEP> T <SEP> I <SEP> F <SEP> S <SEP> By <SEP> report <SEP > at <SEP> number <SEP> of <SEP> sera
<tb> TEST <SEP> sera <SEP> Number <SEP> of <SEP> Dilutions <SEP> DOUBT <SEP> NEGATIVE <SEP> treated
<tb><SEP> treated <SEP> sera <SEP> POSITIVE <SEP> SOFT <SEP> NEGATIVE
<tb><SEP>%<SEP>%<SEP>%
<tb> 1. <SEP> E <SEP> 88 <SEP> 76 <SEP> 1/50 <SEP> 9 <SEP> 6 <SEP> 6 <SEP> 86.36 <SEP>% <SEP> 6, 82 <SEP>% <SEP> 6.82 <SEP>%
<tb><SEP> L <SEP> 1/100 <SEP> 29
<tb><SEP> I <SEP> 1/200 <SEP> 12
<tb><SEP> S <SEP> 1/400 <SEP> 12
<tb><SEP> A <SEP> 1/800 <SEP> 9
<tb><SEP> 1/1600 <SEP> 4
<tb><SEP> 1/3200 <SEP> and <SEP>><SEP> 1
<tb> 2. <SEP> R <SEP> 88 <SEP> 2 <SEP> 1/10 <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 86 <SEP> 2.27 <SEP>% <SEP> 0 <SEP>%<SEP> 97.73 <SEP>%
<tb><SEP> A
<tb><SEP> L
<tb> 3. <SEP> TR <SEP> 76 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 73 <SEP> 2.63 <SEP>% <SEP> 1.32 <SEP>% <SEP> 96, 05 <SEP>%
<tb> 4. <SEP> H <SEP> 42 <SEP> 2 <SEP> 1/20 <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 40 <SEP> 4.76 <SEP>% <SEP> 0 <SEP>%<SEP> 95.24 <SEP>%
<tb><SEP> A <SEP> 1/160 <SEP> 2
<Tb>
NB in Table II
The 6.82% of negatives and doubtful ones obtained with the ELISA test correspond to samples taken very early, namely between day 1 and day 3 of the beginning of the disease.

Les figures 3 et 4 annexées illustrent graphiquement les résultats réunis dans le Tableau II ci-dessus et en particulier - a figure 3 représente la répartition des résultats néga
tifs, douteux et positifs obtenus par les quatre techniques
différentes mises en oeuvre (tests ELISA, RAL, TR et HA)
sur des sérums prélevés du jour J 1 au jour J 11 du debut
de la maladie, les leptospiroses ayant été confirmées par
la suite dans tous les cas, ce qui met très nettement en
évidence la détection précoce des anticorps en mettant en
oeuvre le test ELISA conformément à la présente invention.Figures 3 and 4 attached graphically illustrate the results in Table II above and in particular - Figure 3 represents the distribution of the results nega
positive, dubious and positive results obtained by the four techniques
different implementations (ELISA, RAL, TR and HA tests)
on sera taken from day 1 to day 11 of the beginning
of the disease, leptospirosis having been confirmed by
the following in all cases, which puts very clearly in
evidence of early detection of antibodies by
the ELISA test according to the present invention.

- la figure 4 fait apparaître la répartition des résultats
obtenus avec les 88 sérums analysés dans le Tableau II, en
fonction des dilutions.- Figure 4 shows the distribution of results
obtained with the 88 sera analyzed in Table II,
function of the dilutions.

La figure 5 représente la superposition de la représentation graphique des résultats telle qu'elle figure respectivement dans le Tableau I et dans le Tableau II, cette superposition montrant la fiabilité et l'absence de dispertion des résultats obtenus à l'aide du test ELISA réalisé conformément à la présente invention. FIG. 5 represents the superposition of the graphical representation of the results as it appears respectively in Table I and in Table II, this superposition showing the reliability and the absence of dispersion of the results obtained using the ELISA test carried out according to the present invention.

Il résulte des tableaux I et II qui précèdent que l'on obtient avec la composition antigénique conforme à l'invention appliquée au test ELISA des résultats positifs dès le premier prélèvement, dans des cas de leptospiroses, alors que les résultats sont négatifs dans les autres réactions mises en oeuvre conformément à l'Art antérieur, dans lesquels les résultats deviennent positifs ultérieurement, lors de prélèvements plus tardifs. Ceci montre l'importance du diagnostic précoce pour le traitement thérapeutique du malade. It follows from the above Tables I and II that with the antigenic composition in accordance with the invention applied to the ELISA test, positive results are obtained from the first sample in cases of leptospirosis, whereas the results are negative in the other samples. reactions carried out according to the prior art, in which the results become positive later, in later samples. This shows the importance of early diagnosis for the therapeutic treatment of the patient.

Claims

1 ") Antigenic composition characterized in that it is obtained from at least one strain of L. biflexa and at least one strain of L. andamana Paulo and / or a strain of L. biflexa C 41 2 ") Antigenic composition according to claim 1, characterized in that the strain of L. biflexa is a strain of L. biflexa Patoc and / or a strain of L. biflexa Sao 3) Antigenic composition according to any one of the claims 1 and 2, characterized in that the L. andamana strain is a strain of L. andamana CH 11 and / or a L. andamana Bovedo strain. L. andamana, in which the strain of L. biflexa was treated to obtain a TR antigen. 4) antigenic composition according to claim 1, characterized in that it consists of a heat-resistant antigenic composition (TR) obtained from at least one strain of L. biflexa and at least one strain of 5) antigenic composition according to claim 4, characterized in that the L. biflexa strain (s) used for the preparation of the heat-resistant antigenic composition (TR) is or are taken in the group comprising the L strain. biflexa C 41, the L. biflexa Patoc strain and the L. biflexa Sao Paulo strain. 6) antigenic composition according to any one of claims 1 to 5, characterized in that it consists of the mixture of culture supernatants of the following four leptospiral strains: L. biflexa Patoc, L. biflexa Sao Paulo, L. andamana CH 11, L. andamana Bovedo. 1 to 6, the antigenic composition according to any of the regimens, to obtain a mixture of supernatants which are heated and whose pH has been adjusted before the centrifuges of the centrifugation of said cultures and even for each of the cultivated strains. ; to kill the leptospires of the cultures obtained and to recover the supernatants of these killed cultures, obtained appropriately, in a suitable medium, which can be mana used, at a temperature and during one of the 7) Process for the preparation of the antigenic composition according to any one of claims 1 to 6, characterized in that it consists - to cultivate each of the L. biflexa and L. anda strains until an average concentration of the garbage of at a temperature of the order of 28 ° C, in an oven, grown separately in a suitable medium, for 8-10 8) A method according to claim 7, characterized in that - each of the strains of L. biflexa and L. andamana is

1.108 to 2.108 leptospires / ml of culture; after verification of the non-contamination of each of the

obtained cultures, the cultures obtained are combined - the mixture of said cultures is subjected to the action of for

pure maldehyde, preferably introduced at approximately

1.5 ml / 100 ml of mixture of cultures, and kept in con

tact with said mixture for about 20 to 40 minutes; - the mixture of killed cultures is then heated in the bath

boiling for about 30 minutes, then complete

cooled to room temperature; the pH of the mixture of cooled killed cultures is then adjusted

at a pH of between 9 and 10, and preferably at pH 9.6, the mixture thus treated is then centrifuged at 10,000 g.

45 minutes to 1:15; then, - after decantation, the collected supernatant is the

antigenic composition according to any of the claims

1 to 6.

Claims 1 to 6.

form the antigenic composition according to any one

for about 45 minutes at 1:15, - the supernatants of each of the cultures, are mixed for

cultures is adjusted to 9-10 and preferably 9.6; - each of the cultures is centrifuged separately at 10000 g

boiling for about 30 minutes - then, after complete cooling, the pH of each of the

tospires of said culture; - each of the cultures is then heated in a bain-marie

culture for about 20 to 40 minutes, to kill the lep

1.5 ml / 100 ml of culture and kept in contact with said

troduced in said culture preferably at the rate of

of its non-contamination, with pure formaldehyde, in

from 1.108 to 2.108 leptospires / ml of culture; - each of the cultures obtained is treated, after verification

than to obtain a concentration - in leptospires of gold

days at a temperature of about 28 ° C, in the oven, juice

grown separately in a suitable medium, during 8-10

9) Process according to claim 7, characterized in that each of the L. biflexa and L. andamana strains is

10-) Process according to any one of claims 7 to 9, characterized in that the culture medium of the leptospires is a medium 55955 based on mineral salts, trace elements, vitamins, Tween, BSA.

110) Method according to any one of claims 7 to 9, characterized in that the culture medium of leptospires is a protein-free medium, based on mineral salts, trace elements, vitamin B1, vitamin B12, "Tween" 60 detoxified, TES (tris-methyl-2-aminoethane sulphonic acid) buffer, currently also referred to as # 55955.

12-) A method for the diagnosis of leptospirosis which consists in detecting the antileptospirosic antibodies present in a serum to be tested with the aid of a leptospirosis antigen, characterized in that said antibodies are detected using the antigenic composition according to the invention. any one of claims 1 to 6, which is capable of reacting with the test serum taken from a patient, regardless of the infecting serotype, by incubating said serum with said antigenic composition, to which the antibodies of the Leptospirosa group bind. whatever they are, if such antibodies are present in the serum sample to be tested.

13) A method of diagnosis according to claim 12, characterized in that the bound antibodies obtained according to claim 12, which then constitutes the first step of the diagnostic method according to the present claim, are added with an appropriate amount of a conjugate ( peroxidase labeled anti-IgM Achain p7), thereby causing IgM binding to said bound antibodies, this second step of the diagnostic process being followed by a third step of introducing a substrate consisting of 5-aminosalicylic advantageously added, just before its introduction into the reaction medium, hydrogen peroxide, to cause, in the presence of antileptospirosic antibodies, the appearance of a brown / burgundy color more or less intense resulting from the reaction of the conjugate enzyme with the aforesaid substrate.

14 ") Diagnostic method according to any one of claims 12 and 13, characterized in that the antigenic composition according to any one of claims 1 to 6 is attached to the walls of the wells, or well, of microtitration plates useful for performing the ELISA test.

channel or multiple channels.

50 pl, 100 pl, 200 pl, 1000 pl, etc ... to a single

ELISA test; optionally a plurality of automatic pipettes

at 1 / 10th when using it; a solution of PBS-TWEEN buffer at pH 7.2 '0.1 - a solution of PBS-Tween-Albumin buffer - a plurality of microtiter plates which are useful in the

0.1, in a suitable container, to be diluted

ble - a concentrated solution of phosphate buffer-PBS pH 7.2 t

5-hydroxy-2-benzoic acid in a suitable container; an appropriate amount of H 2 O 2 in a suitable container

suitably; an appropriate amount of substrate such as amino acid

(p chain) human labeled with peroxidase; in a rec-

contained in a suitable container - an appropriate amount of anti-IgM antibody conjugate

form to the invention, contained in a suitable container; - an appropriate amount of positive control human serum

15) Kit, or box, or coordinated set, ready to use for the implementation of the method of diagnosis of leptospirosis according to any one of claims 12 to 14, characterized in that it comprises - an appropriate amount of the antigenic composition con

sterilized phosphate-PBS buffer.

an appropriate amount of concentrated solution of

control, contained in a suitable container; ;

an appropriate amount of human serum positive from

6, contained in a suitable container

that according to any one of claims 1 to

an appropriate amount of the antigenic composition

temperature not exceeding + 8 ° C, namely

200 μl and 1000 μl to one or more channels - reagents suitable for storage under

performing the ELISA test; - possibly automatic pipettes of 50 pl, 100 pl,

16) Diagnostic kit according to claim 15, characterized in that according to a simplified embodiment, it comprises: - a plurality of microtiter plates useful for the

17) Diagnostic kit according to any one of claims 15 or 16, characterized in that the microtitre plates it comprises are constituted by flat-bottomed microplates each comprising 12 rows of each 8 wells, or well, 300 pl of capacity or by flat-bottomed microplates each consisting of a single row of 8 wells or wells which are coated with the antigenic composition according to any one of claims 1 to 6, by adsorption of the latter on the inner surface of cups of each microplate.