FR2575760A1 - NEW ALKALINE PHOSPHATASE EXERCRETING ESCHERICHIA COLR STRAINS, PROCESS FOR OBTAINING THESE STRAINS, PROCESS FOR PRODUCING ALKALINE PHOSPHATASE AND DERIVED HYBRID PROTEINS - Google Patents
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Abstract
Description
Nouvelles souches d'Escherichia coli excrétrices de phosphatase alcaline, procédé d'obtention de ces souches, procédé de production de phosphatase alcaline et de protéines hybrides dérivées. New strains of Escherichia coli excretory alkaline phosphatase, process for obtaining these strains, process for producing alkaline phosphatase and derived hybrid proteins.
La présente invention a trait à de nouvelles souches d'Escherichia coli excrétrices de phosphatase alcaline (PA) ainsi qu'à un procédé d'obtention de ces souches. The present invention relates to novel strains of Escherichia coli excretory alkaline phosphatase (AP) as well as a method for obtaining these strains.
L'invention a également trait à l'application de ces souches à la production de phosphatase alcaline et de protéines hybrides dérivées de la phosphatase alcaline, lesquelles protéines peuvent être scindées pour l'obtention de protéines normales. The invention also relates to the application of these strains to the production of alkaline phosphatase and hybrid proteins derived from alkaline phosphatase, which proteins can be cleaved to obtain normal proteins.
On sait que le gène de structure, pho A, qui code pour la phosphatase alcaline, et qui est localisé à la minute 8,5 de la carte génétique d'E. coli fait partie d'un système de régulation complexe, le régulon phosphate (pho) qui n'est qu'imparfaitement connu et qui se trouve décrit dans : TOMMASSEN J., LUGTENBERG B.,1982, Pho regulon of Escherichia coli K 12 : a minireview, Ann. Microbiol. It is known that the structural gene, pho A, which codes for alkaline phosphatase, is located at the 8.5 minute mark of the genetic map of E. coli. coli is part of a complex regulatory system, the phosphate regulon (pho) which is only imperfectly known and which is described in: TOMMASSEN J., LUGTENBERG B., 1982, Pho regulon of Escherichia coli K 12: at minireview, Ann. Microbiol.
(Inst.Pasteur) 133 A, 243-249. Dans ce régulon l'expression d'un gène tel que pho A dépend du contrôle positif exercé par une protéine activatrice Pho B codée par le gène régulateur pho B. L'expression de ce dernier gène est placée sous le contrôle de plusieurs protéines régulatrices dont Pho M et Pho R. La protéine Pho M exerce uniquement un rôle positif tandis que la protéine Pho R joue un rôle négatif ou positif selon que la croissance a lieu en présence ou en l'absence de phosphate. (Inst.Pasteur) 133 A, 243-249. In this regulon the expression of a gene such as pho A depends on the positive control exerted by a Pho B activator protein encoded by the regulatory gene pho B. The expression of this latter gene is placed under the control of several regulatory proteins of which Pho M and Pho R. The Pho M protein only plays a positive role while the Pho R protein plays a negative or positive role depending on whether growth occurs in the presence or absence of phosphate.
Chez la souche "sauvage" -l'expression des différents gènes de structure appartenant au régulon pho est réprimée en présence d'un excès de phosphate dans le milieu de culture et déréprimée en carence de cet ion. Une grande partie de la phosphatase alcaline ainsi synthétisée est exportée dans le périplasme inter-membranaire situé entre la membrane interne et la membrane externe, la phosphatase alcaline, pas plus qu'aucune autre protéine, n'étant d'ailleurs libérée dtns le milieu de culture par cette bactérie. In the "wild-type" strain, the expression of the various structural genes belonging to the regulon pho is repressed in the presence of an excess of phosphate in the culture medium and derepressed in the absence of this ion. A large part of the alkaline phosphatase thus synthesized is exported into the inter-membrane periplasm situated between the inner membrane and the outer membrane, the alkaline phosphatase, no more than any other protein, being moreover released in the middle of the membrane. cultured by this bacteria.
On sait qu'il est possible d'obtenir une synthèse de phosphatase alcaline même en présence d'un excès de phosphate chez des mutants dont le gène pho R est modifié, ce qui a également été observé chez les mutants de type pho S, pho T, pho U ou pst qui portent une mutation dans ces gènes dont les produits interviennent dans l'un des deux systèmes de transport du phosphate. It is known that it is possible to obtain an alkaline phosphatase synthesis even in the presence of an excess of phosphate in mutants whose pho R gene is modified, which has also been observed in the pho S, pho mutants. T, pho U or pst that carry a mutation in these genes whose products are involved in one of the two phosphate transport systems.
Par ailleurs, on sait que le taux de synthèse de la phosphatase alcaline peut être augmenté après amplification du gène pho A porté par un plasmide multicopies. Furthermore, it is known that the synthesis rate of alkaline phosphatase can be increased after amplification of the pho A gene carried by a multicopy plasmid.
Cependant, bien que l'on dispose ainsi d'un certain nombre de données qui permettent d'accroître notablement la synthèse de la phosphatase alcaline chez E. coli, cet enzyme reste localisé dans le périplasme intermembranaire, et n'est pas excrété. However, although a number of data are available that significantly increase alkaline phosphatase synthesis in E. coli, this enzyme remains localized in the intermembrane periplasm and is not excreted.
II est certes possible d'induire l'excrétion de la phosphatase alcaline en utilisant- des mutants exc ou Iky récemment isolés par les inventeurs et décrits dans FOGNINI-LEFEBVRE, N., PORTALIER R. It is certainly possible to induce the excretion of alkaline phosphatase using mutants exc or Iky recently isolated by the inventors and described in FOGNINI-LEFEBVRE, N., PORTALIER R.
1984, Isolation and preliminary characterization of ss - lactamase excretary mutants of Escherichia coli k-12, FEMS Microbiology Letters 21, 323-328 et LAZZARONI, J-C. PORTALIER, R., 1981, Genetic and biochemical characterization of periplasmic-leaky mutants of Escherichia coli K-12, J. Bacteriol., 145, 1351-1358. Ces mutants se caractérisent par un phénotype d'excrétion pléiotrope libérant simultanément plusieurs types de protéines périplasmiques, de sorte que pour produire de la phosphatase alcaline purifiée il faut mettre en oeuvre plusieurs étapes de séparation protéique.1984, Isolation and preliminary characterization of ss-lactamase excretary mutants of Escherichia coli k-12, FEMS Microbiology Letters 21, 323-328 and LAZZARONI, J-C. PORTALIER, R., 1981, Genetic and Biochemical Characterization of Periplasmic-Leaky Mutants of Escherichia coli K-12, J. Bacteriol., 145, 1351-1358. These mutants are characterized by a pleiotropic excretion phenotype simultaneously releasing several types of periplasmic proteins, so that to produce purified alkaline phosphatase several protein separation steps have to be performed.
La présente invention possède un avantage évident sur la méthode précédente et se propose de fournir de nouvelles souches d'E. The present invention has an obvious advantage over the previous method and proposes to provide new strains of E. coli.
coli excrétrices spécifiques de phosphatase alcaline.coli specific excretions of alkaline phosphatase.
Il est ainsi possible d'obtenir de la phosphatase alcaline dans le milieu de culture et, par des opérations de purification simple, d'isoler l'enzyme totalement purifié. It is thus possible to obtain alkaline phosphatase in the culture medium and, by simple purification operations, to isolate the fully purified enzyme.
Un autre objectif de l'invention est de fournir des souches capables d'excréter de façon sélective des protéines hybrides phosphatase alcaline - dans lesquelles la protéine peut être avantageusement une hormone, un antigène, un anticorps etc. Another object of the invention is to provide strains capable of selectively excreting hybrid alkaline phosphatase proteins - in which the protein can be advantageously a hormone, an antigen, an antibody etc.
L'invention a pour objet de nouvelles souches d'E. coli excrétrices spécifiques de phosphatase alcaline ou de protéines hybrides phosphatase alcaline - protéine caractérisées en ce qu'elles comportent une mutation du régulon pho dans la région pho (S,T,U), et notamment une mutation de pho S et j ou pstB, et sont transformées par un plasmide recombiné possédant un fragment d'ADN d'E. coli correspondant à la région de la minute 8,5 de la carte génétique, incluant le gène de structure pho A, ainsi qu'un système participant à l'excrétion de la phosphatase alcaline. The subject of the invention is new strains of E. coli. specific excretory alkaline phosphatase or protein phosphatase alkaline phosphatase proteins characterized in that they comprise a pho regulon mutation in the pho region (S, T, U), and in particular a mutation of pho S and j or pstB, and are transformed with a recombinant plasmid having an E. coli corresponding to the 8.5 minute region of the genetic map, including the pho A structural gene, as well as a system involved in the excretion of alkaline phosphatase.
De façon avantageuse la mutation pho S ou pst B est portée par le chromosome bactérien. Advantageously, the pho S or pst B mutation is carried by the bacterial chromosome.
Des souches conformes à l'invention ont été déposées auprès de la collection de l'lnstitut Pasteur sous les numéros suivants : 1-375 (LEA 768), 1-376 (LEA 768 transformée) 1-377 (LEA S 65) et 1-378 (LEA S 65 transformée). Strains according to the invention have been deposited with the collection of the Institut Pasteur under the following numbers: 1-375 (LEA 768), 1-376 (LEA 768 transformed) 1-377 (LEA S 65) and 1 -378 (LEA S 65 transformed).
Si les mutants excréteurs plélotropes de type exc ou iky sont caractérisés par une résistance accrue à l'égard de certaines colicines (E1 E2, E3, A) ou de bactériophages (Tua, Mel) et par une sensibilité exaltée vis-à-vis d'agents toxiques comme l'acide cholique ou l'EDTA connus pour inhiber la croissance des bactéries, les souches
LEA 768 ou LEA S 65 transformées par le plasmide pJC 719 ne manifestent aucun de ces phénotypes et se comportent comme la souche parentale Iky+ LEA 145.If the excotropic excretory mutants of exc type or iky are characterized by an increased resistance towards certain colicins (E1 E2, E3, A) or bacteriophages (Tua, Mel) and by an exalted sensitivity towards toxic agents such as cholic acid or EDTA known to inhibit the growth of bacteria,
LEA 768 or LEA S 65 transformed with the plasmid pJC 719 do not show any of these phenotypes and behave like the parental strain Iky + LEA 145.
Les essais comparatifs montrent que l'absence soit de la mutation pho S ou pst, soit du plasmide tel qu'il est défini ne permet pas d'obtenir une bactérie excrétant la phosphatase alcaline. The comparative tests show that the absence of either the pho S or pst mutation or of the plasmid as defined does not make it possible to obtain a bacterium excreting alkaline phosphatase.
Le plasmide mis en oeuvre dans l'invention est du type défini, à titre d'exemple, par le plasmide pJC 719 qui a été récemment décrit (LAZZARONI- J.C., PORTALIER R.C., 1982, Production of extracellular alkaline phosphatase by Escherichia coli K-12 periplasmic-leaky mutants -carrying pho A+ plasmids, Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 16,
146-150).The plasmid used in the invention is of the type defined, for example, by the plasmid pJC 719 which has recently been described (LAZZARONI-JC, PORTALIER RC, 1982, Production of Extracellular Alkaline Phosphatase by Escherichia coli K- 12 periplasmic-leaky mutants-carrying pho A + plasmids, Eur J. Appl Microbiol Biotechnol 16,
146-150).
Les souches portant ce plasmide ont été déposées auprès de -la collection de l'lnstitut Pasteur sous les nOs 1-376 et 1-378. Strains bearing this plasmid were deposited with the collection of the Institut Pasteur under Nos. 1-376 and 1-378.
La fraction chromosomique d'E. coli portée par le plasmide
pJC 719 a été analysée. Elle correspond à la région de la minute 8,5 de la carte génétique et la présence des marqueurs suivants a été démontrée à l'aide de souches hôtes déficientes pour ces marqueurs pho A+ ,pro C+ Par contre les marqueurs lac+ et tsx+ situés à l'extérieur et de part et d'autre du segment pho A - pro C en sont absents
Pour identifier la nature des gènes dont la présence sur le plasmide amplifié est une condition nécessaire ou suffisante à l'induction de l'excrétion de la PA chez la souche LEA 768, on a entrepris une analyse génétique en amplifiant spécifiquement un fragment de restriction.The chromosomal fraction of E. coli carried by the plasmid
pJC 719 was analyzed. It corresponds to the 8.5 minute region of the genetic map and the presence of the following markers has been demonstrated using host strains deficient for these pho markers A +, pro C + By the lac + and tsx + markers located at the outside and on both sides of the pho A - pro C segment are absent
To identify the nature of genes whose presence on the amplified plasmid is a necessary or sufficient condition for the induction of PA excretion in the LEA 768 strain, genetic analysis was undertaken by specifically amplifying a restriction fragment.
Les résultats présentés dans le tableau 3 montrent que l'amplification du seul gène pho A ne suffit pas à déclencher l'excrétion de la PA chez les souches LEA S 65 ou LEA 768. The results presented in Table 3 show that the amplification of the single pho A gene is not sufficient to trigger the excretion of PA in the LEA S 65 or LEA 768 strains.
L'invention a également pour objet un procédé d'obtention de ces souches, ledit procédé étant caractérisé en ce que l'on prépare une bactérie possédant la mutation chromosomique pho (S, T, U), ou pst, ou que l'on choisit une telle bactérie lorsqu'elle est connue, et en ce que l'on introduit le plasmide recombiné dans la bactérie. The subject of the invention is also a process for obtaining these strains, said process being characterized in that a bacterium having the chromosomal mutation pho (S, T, U) or pst is prepared, or that one chooses such a bacterium when it is known, and in that the recombinant plasmid is introduced into the bacterium.
L'invention a également pour objet l'application de ces souches à la production de phosphatase alcaline par culture desdites souches dans des milieux convenables, notamment par croissance en milieu à pH basique. The invention also relates to the application of these strains to the production of alkaline phosphatase by culturing said strains in suitable media, in particular by growth in a basic pH medium.
L'invention a également pour objet les souches ainsi définies dans lesquelles le gène pho A est fusionné avec le gène de structure ou l'ADN complémentaire d'une seconde protéine d'origine bactérienne, virale ou eucaryotique, telle qu'une hormone, un anticorps ou un facteur plasmatique, par exemple, ainsi que l'application de ses souches à la synthèse et à l'excrétion spécifique d'une protéine hybride possédant l'extrémité NH2 - terminale de la phosphatase alcaline et la fraction - COOH terminale de la seconde protéine. The subject of the invention is also the strains thus defined in which the pho A gene is fused with the structural gene or the complementary DNA of a second protein of bacterial, viral or eukaryotic origin, such as a hormone, a antibodies or a plasma factor, for example, as well as the application of its strains to the synthesis and specific excretion of a hybrid protein having the NH 2 - terminal end of alkaline phosphatase and the terminal - COOH moiety of second protein.
L'invention sera maintenant décrite plus en détail à propos de formes de réalisations particulières non limitatives. The invention will now be described in more detail with respect to particular non-limiting embodiments.
1) Obtention d'une bactérie E. coli LEA 768 transformée. 1) Obtaining a transformed E. coli LEA 768 bacterium.
La souche parentale est la souche E. coli K 12 LEA 145 (F-proC34, trp, lac, xyl, mtl, rpsL109, thi 1). The parental strain is E. coli strain K12 LEA 145 (F-proC34, trp, lac, xyl, mt1, rpsL109, thi 1).
La mutation spontanée pstB 768 a été obtenue par sélection de clones résistant à l'arséniate selon la technique décrite dans : YAGIL
E., BEERI H., 1977, Arsenate-resistànt alkaline K phosphatase- constitutive mutants of Escherichia coli, Molec. Gen. Genet. 154, 185-189. En effet, les produits des gènes phoS, phoT, phoU et pstB jouent un rôle dans le transport du phosphate et de ses analogues structuraux comme l'arséniate, inhibiteur de la croissance cellulaire par son action découplante sur la phosphorylation oxydative.Des mutants spontanés ont été sélectionnés sur un milieu contenant de l'arséniate (lOmM), du glucose et une faible concentration de phosphate apportée sous forme d' - glycérol-phosphate (0,5mM), qui possede un système de transport indépendant. 50 % des mutants résistants à l'arséniate synthétisent la -phosphatase alcaline de façon constitutive. La mutation 768 isolée a été identifiée comme affectant ie gène pstB et retenue (pstB768). Cette mutation est co-transductible avec le marqueur ilvA comme le sont les gènes pho S, pho T, pho U ou pst.The spontaneous mutation pstB 768 was obtained by selection of arsenate-resistant clones according to the technique described in: YAGIL
E., BEERI H., 1977, Arsenate-Resistant alkaline K phosphatase-constitutive mutants of Escherichia coli, Molec. Gen. Broom. 154, 185-189. In fact, the products of the phoS, phoT, phoU and pstB genes play a role in the transport of phosphate and its structural analogues such as arsenate, an inhibitor of cell growth by its decoupling action on oxidative phosphorylation.Spontaneous mutants have were selected on a medium containing arsenate (10mM), glucose and a low concentration of phosphate provided in the form of - glycerol phosphate (0.5mM), which has an independent transport system. 50% of the arsenate-resistant mutants synthesize the alkaline phosphatase constitutively. The isolated 768 mutation was identified as affecting the pstB gene and retained (pstB768). This mutation is co-transductible with the ilvA marker as are the pho S, pho T, pho U or pst genes.
Le plasmide pJC 719, porteur du gène de structure pho A codant pour la phosphatase alcaline est porté par une souche mâle F+ et est introduit dans une souche femelle F la bactérie LEA 768 par conjugaison à haut rendement et sélection de conjugants Pro C+. Plasmid pJC 719, carrying the pho A structural gene coding for alkaline phosphatase is carried by a F + male strain and is introduced into a female strain F LEA 768 bacteria by high efficiency conjugation and selection of Pro C + conjugates.
2) Obtention de la souche E. coli LEA S 65 transformée. 2) Obtaining the E. coli strain LEA S 65 transformed.
La souche LEA S 65 a été construite en laboratoire par transduction à l'aide du bactériophage P1kC (voir MAILLER J.M., 1972, in Experiments in molecular genetics, Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, N.Y.) à partir de la même souche parentale il coli K-12 LEA 145. Les lysats de bactériophage P1 sont préparés en infectant une souche sensible avec une multiplicité d'infection de 1 phagell0 bactéries, en présence de CaC12 (5.10 3A4). The LEA S 65 strain was constructed in the laboratory by transduction using bacteriophage P1kC (see MAILLER JM, 1972, in Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, NY) from the same parental strain he coli K-12 LEA 145. P1 bacteriophage lysates are prepared by infecting a susceptible strain with a multiplicity of infection of 1 phagell0 bacteria, in the presence of CaCl2 (5.10 3A4).
Le plasmide pJC 719 est introduit dans la souche également par conjugaison dans les souches F et sélection de conjugants Pro C+ comme précédemment. The plasmid pJC 719 is introduced into the strain also by conjugation in the F strains and selection of Pro C + conjugates as previously.
3) Culture
La culture est effectuée successivement en milieu riche L (MILLER 1972) et synthétique T (WORCEL A., BURGE E.,- 1974,
Properties of a membrane-attached Form of the folded chromosome of
Escherichia coli, J. Mol. Biol., 82, 91-105) additionné de protéose peptone Difco à 0,2 % et équilibré à pH 8,3, à température de 370C.3) Culture
The culture is carried out successively in rich medium L (MILLER 1972) and synthetic T (WORCEL A., BURGE E., - 1974,
Properties of a membrane-attached Form of the folded chromosome of
Escherichia coli, J. Mol. Biol., 82, 91-105) supplemented with Difco peptone proteose at 0.2% and equilibrated at pH 8.3, at 370C.
Les bactéries ont été cultivées pendant huit heures en milieu
L additionné de colicine E 1 ou d'ampicilline. Après centrifugation des cellules, ces précultures sont utilisées comme inoculum (ensemencement au 1110) pour les cultures en milieu synthétique ajusté étroitement aux besoins des bactéries, notamment le milieu T.The bacteria were grown for eight hours in medium
L supplemented with colicin E 1 or ampicillin. After centrifugation of the cells, these precultures are used as inoculum (1110 seeding) for the cultures in synthetic medium tightly adjusted to the needs of the bacteria, in particular the T medium.
On voit, sur le tableau 1, que lorsque les souches LEA 768 transformées ou non sont cultivées à un pH proche de la neutralité (7,2 - 7,3) aucune excrétion de phosphatase alcaline n'est observée. It can be seen in Table 1 that when the LEA 768 strains transformed or not are cultured at a pH close to neutral (7.2 - 7.3), no excretion of alkaline phosphatase is observed.
Par contre le taux maximum d'excrétion est observé lorsque le pH initial du milieu T est ajusté à la valeur basique 8,3. Les quantités excrétées sont également à leur valeur maximale à ce pH.On the other hand, the maximum rate of excretion is observed when the initial pH of the medium T is adjusted to the basic value 8.3. The quantities excreted are also at their maximum value at this pH.
On voit également sur ce tableau une diminution corrélative de l'activité spécifique de la phosphatase alcaline et du taux d'excrétion de la souche LEA 768 transformée, lorsque la concentration en phosphate augmente dans le milieu T. This table also shows a correlative decrease in the specific activity of alkaline phosphatase and in the excretion rate of the transformed LEA 768 strain, as the phosphate concentration increases in the T medium.
Enfin on voit que, quel que soit le pH, aucune excrétion nlest présente lorsque la culture s'effectue en milieu riche BL composé de solutions complexes d'hydrolysats de protéines, de vitamines et de cofacteu rs. Finally, it can be seen that, whatever the pH, no excretion is present when the culture is carried out in a rich medium BL composed of complex solutions of hydrolysates of proteins, vitamins and co-factors.
Des résultats similaires ont été obtenus avec les souches LEA
S 65 et LEA S 65 transformée.Similar results were obtained with LEA strains
S 65 and LEA S 65 transformed.
4) Dosage enzymatique
On a utilisé les méthodes standard pour doser les activités phosphatase alcaline (TORRIANI A.M., 1960, Influence of inorganic phosphatase in the formation of phosphates in Escherichia coli,
Biochim. Biophys. Acta 38, 460-469) et glucose-6-phosphate déshydrogénase (MALAMY M.H., MORECKER B.L., 1961, The localization of alkaline phosphatase in Escherichia coli K-12, Biochem.4) Enzyme assay
Standard methods for assaying alkaline phosphatase activities have been used (TORRIANI AM, 1960, Influence of inorganic phosphatase in the formation of phosphates in Escherichia coli,
Biochim. Biophys. Acta 38, 460-469) and glucose-6-phosphate dehydrogenase (MALAMY MH, MORECKER BL, 1961, The localization of alkaline phosphatase in Escherichia coli K-12, Biochem.
Biophys. Res. Comm. 5, 104-108).-La glucose-6-P déshydrogénase a été utilisée comme marqueur cytoplasmique de référence. Une unité de phosphatase alcaline est définie comme la quantité d'enzyme qui hydrolyse une nanomole de substrat par minute et par ml d'extrait.Biophys. Res. Comm. 5, 104-108). Glucose-6-P dehydrogenase was used as the standard cytoplasmic marker. An alkaline phosphatase unit is defined as the amount of enzyme that hydrolyzes one nanomole of substrate per minute per ml of extract.
Une unité de glucose-6-phosphate déshydrogénase correspondant à la réduction d'une micromole de substrat par heure et par ml d'extrait.A unit of glucose-6-phosphate dehydrogenase corresponding to the reduction of one micromole of substrate per hour per ml of extract.
Les activités spécifiques sont exprimées en unité par mg de poids sec bactérien.Specific activities are expressed in units per mg of bacterial dry weight.
5) Synthèse et compartimentation de la phosphatase alcaline dans les différentes souches isogéniques d'E coli étudiées
Les propriétés des souches transformées LEA 768 et LEA S 65 ont été comparées à celles des mêmes souches non transformées, c'est-à-dire ne contenant pas le plasmide pJC 719, ainsi qu'aux souches (non transformées et transformées) suivantes : parentale LEA 145, mutante pho R 69, mutante pho U 35 (les souches pho R 69 et pho U 35 ont été construites par transduction à l'aide du bactériophage PlkC), et mutante LEA 145-207,
On se réfère au tableau 2.5) Synthesis and compartmentalisation of alkaline phosphatase in the different isogenic strains of E coli studied
The properties of the transformed strains LEA 768 and LEA S 65 were compared with those of the same nontransformed strains, that is to say not containing the plasmid pJC 719, as well as with the strains (non transformed and transformed) following: parental LEA 145, mutant pho R 69, mutant pho U 35 (strains pho R 69 and pho U 35 were constructed by transduction using bacteriophage PlkC), and mutant LEA 145-207,
We refer to Table 2.
On a effectué dans ce tableau une comparaison de la production et de l'excrétion de la phosphatase alcaline dans les différentes souches indiquées. Pour chaque souche on a étudié les activités enzymatiques d'une part pour la souche haplolde et d'autre part pour la souche transformée c'est-à-dire contenant le plasmide pJC 719. This table compares the production and the excretion of alkaline phosphatase in the various strains indicated. For each strain the enzymatic activities were studied on the one hand for the haploid strain and on the other hand for the transformed strain that is to say containing the plasmid pJC 719.
Comme cela est connu, la présence du plasmide a pour conséquence une augmentation de la quantité de phosphatase alcaline synthétisée. As is known, the presence of the plasmid results in an increase in the amount of synthesized alkaline phosphatase.
Chez la souche parentale LEA 145 (pho"), la synthèse de la phosphatase alcaline est normalement réprimée après croissance en présence d'un excès de phosphate, et ce, indépendamment de la présence ou l'absence du plasmide pJC 719 qui porte le gène pho A+. In parental strain LEA 145 (pho "), the synthesis of alkaline phosphatase is normally repressed after growth in the presence of an excess of phosphate, independently of the presence or absence of plasmid pJC 719 which carries the gene. pho A +.
Après croissance en milieu bas phosphatase, la phosphatase alcaline est synthétisée et son taux de synthèse est multiplié par un facteur 8 lorsque le plasmide est présent. L'excrétion reste limitée à une valeur très faible. After growth in medium low phosphatase, the alkaline phosphatase is synthesized and its synthesis rate is multiplied by a factor 8 when the plasmid is present. Excretion remains limited to a very low value.
Chez les dérivés portant les mutations pho R (LEA R 69), pho S 65 (LEA S 65), pho U (LEA U 35) ou pst B768 (LEA 768), la phosphatase alcaline est synthétisée après croissance, que ce soit en milieu bas ou haut phosphate, et la présence du plasmide provoque un accroissement de l'activité spécifique de l'enzyme, à l'exception de la souche LEA U 35. Chez les souches LEA R 69 et LEA U 35, l'excrétion est très faible. In derivatives carrying the pho R (LEA R 69), pho S 65 (LEA S 65), pho U (LEA U 35) or pst B768 (LEA 768) mutations, the alkaline phosphatase is synthesized after growth, whether in medium low or high phosphate, and the presence of the plasmid causes an increase in the specific activity of the enzyme, with the exception of the strain LEA U 35. In strains LEA R 69 and LEA U 35, the excretion is very weak.
Par contre on constate que les souches LEA S 65 et LEA 768, qui sous forme haploïde ne possèdent qu'un taux d'excrétion faible, du même ordre que la souche parentale, excrètent de façon spécifique la phosphase alcaline avec un pourcentage respectivement de 44 et 82 % de la quantité totale d'enzyme synthétisée, dans le milieu de culture. On the other hand, it is found that the LEA S 65 and LEA 768 strains, which in haploid form have only a low excretion rate, of the same order as the parental strain, specifically excrete alkaline phosphase with a percentage of 44%. and 82% of the total amount of enzyme synthesized in the culture medium.
Ce phénomène ne s'accompagne pas d'une lyse cellullaire significative ainsi qu'en atteste l'absence d'activité extra-cellullaire de la glucose-6-phosphate déshydrogénase qui a été prise comme marqueur cytoplasmique de référence.This phenomenon is not accompanied by significant cellullary lysis as evidenced by the absence of extra-cellular activity of glucose-6-phosphate dehydrogenase which has been taken as a reference cytoplasmic marker.
On obtient ainsi des taux d'excrétion comparables à ceux de la souche isogénique LEA 145-207 portant la mutation Iky 207 et connue pour sa propriété d'excrétion plélotrope de protéines périplasmiques et notamment de phosphatase alcaline, la présence du plasmide pJC 719 se traduisant simplement par une - amplification de la synthèse et non par une excrétion spécifique. Excretion rates comparable to those of the isogenic strain LEA 145-207 carrying the Iky 207 mutation and known for its property of pleotropic excretion of periplasmic proteins and in particular of alkaline phosphatase, are thus obtained, the presence of the plasmid pJC 719 being translated. simply by an amplification of the synthesis and not by a specific excretion.
Afin de démontrer l'importance de la présence dans le plasmide participant aux nouvelles souches selon l'invention, d'un système autre que celui du gène de structure pho A+, pour obtenir l'excrétion de la phosphatase alcaline, on a représenté, sur le tableau 3, les résultats de cultures dans lesquelles les souches haploldes LEA 145, LEA R 69, LEA S 65, et LEA 768 ont été respectivement transformées par le plasmide pJC 2431, porteur du seul gène de structure pho A+ et qui porte un fragment Hind lll-Xho I de 2,7 Kb provenant du plasmide pJC 721 (LAZZARONI and PORTALIER, 1982) et sous-cloné dans le gène kanamycine du plasmide pACYC 177 selon BERG (BERG P., t981, Cloning and characterization of the Escherichia coli gene coding for alkaline phosphatase, J. Bacteriol. 146, 660-667). In order to demonstrate the importance of the presence in the plasmid participating in the new strains according to the invention, of a system other than that of the pho A + structural gene, for obtaining the excretion of alkaline phosphatase, there is shown, on Table 3, the results of cultures in which the LEA 145, LEA R 69, LEA S 65, and LEA 768 haploid strains were respectively transformed with the plasmid pJC 2431, carrying the only pho A + structural gene and carrying a fragment 2.7 kb Hind III-Xho I from plasmid pJC 721 (LAZZARONI and PORTALIER, 1982) and subcloned into the kanamycin gene of plasmid pACYC 177 according to BERG (BERG P., t981, Cloning and characterization of Escherichia coli gene coding for alkaline phosphatase, J. Bacteriol 146, 660-667).
On voit que ce plasmide amplifie la synthèse, comme prévu, dans toutes les bactéries considérées mais ne provoque aucune excrétion importante malgré l'augmentation de la synthèse.It is seen that this plasmid amplifies the synthesis, as expected, in all the bacteria considered but does not cause any significant excretion despite the increase in synthesis.
En se référant à la figure 1 on voit les résultats de i'analyse électrophorétique de la composition protéique d'un surnageant de culture obtenu à partir de la souche haploïde LEA 768 qui montrent qu'aucune protéine n'est excrétée durant la croissance (puits 1). Des résultats analogues caractérisent les souches LEA 145 et LEA S 65. Referring to FIG. 1, the results of the electrophoretic analysis of the protein composition of a culture supernatant obtained from the haploid strain LEA 768 show that no protein is excreted during growth (well 1). Similar results characterize the LEA 145 and LEA S 65 strains.
Le puits 2 correspond à la souche LEA 768 transformée et l'on voit que cette souche excrète la phosphatase alcaline de façon très spécifique. Le puits 3 correspond à la souche mutante LEA 145 Iky 207 dont le mode d'excrétion est largement aspécifique. Well 2 corresponds to the transformed LEA 768 strain and it can be seen that this strain excretes alkaline phosphatase very specifically. Well 3 corresponds to the mutant strain LEA 145 Iky 207 whose mode of excretion is largely nonspecific.
TABLEAU 1
INFLUENCE DU MILIEU DE CULTURE SUR LA PRODUCTION
ET L'EXCRETION DE PHOSPHATASE ALCALINE, PAR LA
SOUCHE LEA 768 (transformée ou non)
INFLUENCE OF THE CULTURE ENVIRONMENT ON PRODUCTION
AND THE EXCRETION OF ALKALINE PHOSPHATASE BY
LEA 768 STRAIN (transformed or not)
<tb> Milieu <SEP> Souches
<tb> LEA <SEP> 768 <SEP> LEA <SEP> 768/ <SEP> pJC <SEP> 719
<tb> Nature <SEP> pH <SEP> PO4 <SEP>
<tb> M <SEP> Phosphatase <SEP> alcaline
<tb> <SEP> Activité <SEP> Excrétion <SEP> Activité <SEP> Excrétion
<tb> spécifique <SEP> % <SEP> spécifique
<tb> T <SEP> 7,3 <SEP> 10-6 <SEP> 560 <SEP> 1 <SEP> 3 <SEP> 815 <SEP> 1
<tb> 10-6 <SEP> 490 <SEP> 6 <SEP> 3 <SEP> 300 <SEP> 82
<tb> T <SEP> 8,3 <SEP> 10-3 <SEP> <SEP> 336 <SEP> 6 <SEP> 1541 <SEP> 46
<tb> 10-1 <SEP> 168 <SEP> 0,5 <SEP> 796 <SEP> 6
<tb> BL <SEP> 7,3 <SEP> #10-3 <SEP> 20 <SEP> 12 <SEP> 456 <SEP> 5
<tb> BL <SEP> 8,3 <SEP> #10-3 <SEP> <SEP> 18 <SEP> 6 <SEP> 300 <SEP> 7
<tb>
Les bactéries ont été cultivées durant 16 h. à 370C. <tb> Medium <SEP> Strains
<tb> LEA <SEP> 768 <SEP> LEA <SEP> 768 / <SEP> pJC <SEP> 719
<tb> Nature <SEP> pH <SEP> PO4 <SEP>
<tb> M <SEP> Phosphatase <SEP> Alkaline
<tb><SEP> Activity <SEP> Excretion <SEP> Activity <SEP> Excretion
<tb> specific <SEP>% <SEP> specific
<tb> T <SEP> 7.3 <SEP> 10-6 <SEP> 560 <SEP> 1 <SEP> 3 <SEP> 815 <SEP> 1
<tb> 10-6 <SEP> 490 <SEP> 6 <SEP> 3 <SEP> 300 <SEP> 82
<tb> T <SEP> 8.3 <SEP> 10-3 <SEP><SEP> 336 <SEP> 6 <SEP> 1541 <SEP> 46
<tb> 10-1 <SEP> 168 <SEP> 0.5 <SE> 796 <SEP> 6
<tb> BL <SEP> 7.3 <SEP># 10-3 <SEP> 20 <SEP> 12 <SEP> 456 <SEP> 5
<tb> BL <SEP> 8.3 <SEP># 10-3 <SEP><SEP> 18 <SEP> 6 <SEP> 300 <SEP> 7
<Tb>
The bacteria were cultured for 16 hours. at 370C.
TABLEAU 2
PRODUCTION ET EXCRETION DE LA PHOSPHATASE
ALCALINE CHEZ DIFFERENTES SOUCHES D'E. coli
PRODUCTION AND EXCRETION OF PHOSPHATASE
ALKALINE IN DIFFERENT STRAINS OF E. coli
<tb> <SEP> Activités <SEP> enzymatiques
<tb> <SEP> Souche <SEP> Génotype <SEP> Plasmide
<tb> <SEP> pJC <SEP> 719 <SEP> Phosphatase <SEP> alcaline <SEP> Glucose <SEP> 6P <SEP> déshydrogénase
<tb> <SEP> Activité <SEP> Excrétion <SEP> Exaltation <SEP> Activité <SEP> Excretion
<tb> <SEP> spécifique <SEP> % <SEP> <SEP> la <SEP> synthèse <SEP> spécifique
<tb> LEA <SEP> 145 <SEP> parent <SEP> - <SEP> 370 <SEP> 4 <SEP> 5,6 <SEP> <SEP> NI) <SEP>
<tb> <SEP> + <SEP> 3 <SEP> 070 <SEP> 11 <SEP> 8 <SEP> 5,4 <SEP> ND <SEP>
<tb> LEA <SEP> R <SEP> 69 <SEP> pho <SEP> R <SEP> 69 <SEP> - <SEP> 370 <SEP> 6 <SEP> / <SEP> <SEP> / <SEP>
<tb> <SEP> + <SEP> 3 <SEP> 500 <SEP> 9 <SEP> 9,5 <SEP> / <SEP> /
<tb> LEA <SEP> S <SEP> 65 <SEP> pho <SEP> S <SEP> 65 <SEP> - <SEP> 700 <SEP> 6 <SEP> 7,3 <SEP> ND
<tb> <SEP> + <SEP> 2 <SEP> 830 <SEP> 44 <SEP> 4 <SEP> 7 <SEP> ND
<tb> LEA <SEP> 768 <SEP> pstB <SEP> 768 <SEP> - <SEP> 490 <SEP> 6 <SEP> 6 <SEP> ND <SEP>
<tb> <SEP> + <SEP> 3 <SEP> 300 <SEP> 82 <SEP> 7 <SEP> 5,4 <SEP> ND <SEP>
<tb> LEA <SEP> U <SEP> 35 <SEP> pho <SEP> U <SEP> 35 <SEP> - <SEP> 700 <SEP> 3 <SEP> / <SEP> / <SEP>
<tb> <SEP> + <SEP> 700 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> / <SEP> / <SEP>
<tb> LEA <SEP> 145 <SEP> lky <SEP> 207 <SEP> - <SEP> 1200 <SEP> 24 <SEP> 7 <SEP> ND
<tb> <SEP> 207 <SEP> + <SEP> 3 <SEP> 500 <SEP> 86 <SEP> 3 <SEP> 6,4 <SEP> NO <SEP>
<tb> -1+ : absence ou présence du plasmide / : non estimé ; ND : non détectable - les bactéries ont été cultivées durant 16 h. en milieu T (pH 8,3) à 37 C.<tb><SEP> Enzymatic <SEP> Activities
<tb><SEP> Strain <SEP> Genotype <SEP> Plasmid
<tb><SEP> pJC <SEP> 719 <SEP> Phosphatase <SEP> Alkaline <SEP> Glucose <SEP> 6P <SEP> Dehydrogenase
<tb><SEP> Activity <SEP> Excretion <SEP> Exaltation <SEP> Activity <SEP> Excretion
<tb><SEP> specific <SEP>% <SEP><SEP> the <SEP> specific <SEP> synthesis
<tb> LEA <SEP> 145 <SEP> parent <SEP> - <SEP> 370 <SEP> 4 <SEP> 5.6 <SEP><SEP> NI) <SEP>
<tb><SEP> + <SEP> 3 <SEP> 070 <SEP> 11 <SEP> 8 <SEP> 5.4 <SEP> ND <SEP>
<tb> LEA <SEP> R <SEP> 69 <SEP> pho <SEP> R <SEP> 69 <SEP> - <SEP> 370 <SEP> 6 <SEP> / <SEP><SEP> / <SEP>
<tb><SEP> + <SEP> 3 <SEP> 500 <SEP> 9 <SEP> 9.5 <SEP> / <SEP> /
<tb> LEA <SEP> S <SEP> 65 <SEP> pho <SEP> S <SEP> 65 <SEP> - <SEP> 700 <SEP> 6 <SEP> 7.3 <SEP> ND
<tb><SEP> + <SEP> 2 <SEP> 830 <SEP> 44 <SEP> 4 <SEP> 7 <SEP> ND
<tb> LEA <SEP> 768 <SEP> pstB <SEP> 768 <SEP> - <SEP> 490 <SEP> 6 <SEP> 6 <SEP> NS <SEP>
<tb><SEP> + <SEP> 3 <SEP> 300 <SEP> 82 <SEP> 7 <SEP> 5.4 <SEP> ND <SEP>
<tb> LEA <SEP> U <SEP> 35 <SEP> pho <SEP> U <SEP> 35 <SEP> - <SEP> 700 <SEP> 3 <SEP> / <SEP> / <SEP>
<tb><SEP> + <SEP> 700 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> / <SEP> / <SEP>
<tb> LEA <SEP> 145 <SEP> lky <SEP> 207 <SEP> - <SEP> 1200 <SEP> 24 <SEP> 7 <SEP> ND
<tb><SEP> 207 <SEP> + <SEP> 3 <SEP> 500 <SEP> 86 <SEP> 3 <SEP> 6.4 <SE> NO <SEP>
<tb> -1+: absence or presence of the plasmid /: not estimated; ND: not detectable - the bacteria were cultured for 16 h. in T medium (pH 8.3) at 37 C.
- tes pourcentages d'excrétion sont calculés sur la base du rapport
activité totale extracellulaire x 100
activité totale intra plus extracellulaire - Les augmentations des taux de synthèse. sont calculées sur la base du rapport
activité spécifique de la souche transformée
activité spécifique de la même souche haploïde
TABLEAU 3
EFFET DE L'AMPLIFICATION DU GENE pho A SUR LA
SYNTHESE ET L'EXCRETION DE LA PHOSPHATASE ALCALINE
extracellular total activity x 100
Total Intra Plus Extracellular Activity - Increases in synthesis rates. are calculated on the basis of the ratio
specific activity of the transformed strain
specific activity of the same haploid strain
TABLE 3
EFFECT OF AMPLIFICATION OF THE GENE pho A ON THE
SYNTHESIS AND EXCRETION OF ALKALINE PHOSPHATASE
<tb> <SEP> Phosphatase <SEP> alcaline
<tb> <SEP> Souche <SEP> Plasmide
<tb> <SEP> pJC <SEP> 2431
<tb> <SEP> (pho <SEP> A+) <SEP> Activité <SEP> Excrétion <SEP> Augmentation <SEP> de
<tb> <SEP> spécifique <SEP> % <SEP> la <SEP> synthèse
<tb> LEA <SEP> 145 <SEP> - <SEP> 390 <SEP> 2
<tb> <SEP> + <SEP> 3 <SEP> 300 <SEP> 1 <SEP> 8,5
<tb> LEA <SEP> R <SEP> 69 <SEP> - <SEP> 370 <SEP> 6 <SEP> 1 <SEP>
<tb> <SEP> + <SEP> 7 <SEP> 060 <SEP> 7 <SEP> 19
<tb> LEA <SEP> S <SEP> 65 <SEP> - <SEP> 650 <SEP> 2
<tb> <SEP> + <SEP> 1 <SEP> 360 <SEP> 1 <SEP> 2
<tb> LEA <SEP> 768 <SEP> - <SEP> 520 <SEP> 2
<tb> <SEP> + <SEP> 1 <SEP> 850 <SEP> 25 <SEP> 3,6
<tb>
Les bactéries ont été cultivées durant 16 h. en milieu T. (pH 8,3) à 370C. <tb><SEP> Phosphatase <SEP> Alkaline
<tb><SEP> Strain <SEP> Plasmid
<tb><SEP> pJC <SEP> 2431
<tb><SEP> (pho <SEP> A +) <SEP> Activity <SEP> Excretion <SEP> Increase <SEP> of
<tb><SEP> specific <SEP>% <SEP> the <SEP> summary
<tb> LEA <SEP> 145 <SEP> - <SEP> 390 <SEP> 2
<tb><SEP> + <SEP> 3 <SEP> 300 <SEP> 1 <SEP> 8.5
<tb> LEA <SEP> R <SEP> 69 <SEP> - <SEP> 370 <SEP> 6 <SEP> 1 <SEP>
<tb><SEP> + <SEP> 7 <SEP> 060 <SEP> 7 <SEP> 19
<tb> LEA <SEP> S <SEP> 65 <SEP> - <SEP> 650 <SEP> 2
<tb><SEP> + <SEP> 1 <SEP> 360 <SEP> 1 <SEP> 2
<tb> LEA <SEP> 768 <SEP> - <SEP> 520 <SEP> 2
<tb><SEP> + <SEP> 1 <SEP> 850 <SEP> 25 <SEP> 3,6
<Tb>
The bacteria were cultured for 16 hours. in T medium (pH 8.3) at 370C.
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| EP0023882A2 (en) * | 1979-08-03 | 1981-02-11 | Schering Aktiengesellschaft | Plasmid vectors, plasmids containing genes for alkaline phosphatases and bacteria containing the latter, their preparation and use |
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- 1985-01-04 FR FR8500087A patent/FR2575760A1/en active Pending
- 1985-12-26 JP JP50037585A patent/JPS62502583A/en active Pending
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- 1985-12-26 WO PCT/FR1985/000375 patent/WO1986004089A1/en not_active Application Discontinuation
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Also Published As
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| WO1986004089A1 (en) | 1986-07-17 |
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