FR2566426A1

FR2566426A1 - DNA fragment from Spiroplasma, recombinant plasmids and microorganisms containing them

Info

Publication number: FR2566426A1
Application number: FR8409913A
Authority: FR
Inventors: Claude Mouches; Thierry Candresses; Gerard Barroso; Colette Saillard; Joseph Bove
Original assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Current assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date: 1984-06-22
Filing date: 1984-06-22
Publication date: 1985-12-27
Also published as: FR2566426B1

Abstract

DNA fragment extracted from Spiroplasma citri by the action of the restriction enconuclease HindIII. The fragment is introduced into E. coli using a plasmid vector pBR328 and bacteria expressing the gene for spiraline, a protein antigen from Spiroplasma citri, are selected. The isolated DNA fragment hybridises to DNAs from other Spiroplasmas and Mollicutes. Recombinant plasmids incorporating these DNA fragments and microorganisms, especially E. coli, in which these fragments are expressed.

Description

La présente invention concerne un fragment d'ADN de Spiroplasma citri, codant pour un polypeptide qui contient notamment la séquence d'aminoacides correspondant à la spiraline, les plasmides recombinants contenant ce fragment, et les microorganismes dans lesquels ce fragment s'exprime. The present invention relates to a DNA fragment of Spiroplasma citri, coding for a polypeptide which contains in particular the amino acid sequence corresponding to spiraline, the recombinant plasmids containing this fragment, and the microorganisms in which this fragment is expressed.

Les mollicutes-, primitivement décrits sous le nom de mycoplasmes,sont des germes de plus en plusincriminés en pathologie humaine, vétérinaire et en phytopathologie. Parmi eux les spiroplasmes ont été découverts vers 1970 et font actllement l'objet de diverses recherches. Spiroplasma ce est le premier de ces mollicutes qui a été cultivé et caractérisé comme le décrit SAGLIO et coll. dans Int. J. Mollicutes-, originally described as mycoplasmas, are more and more incriminated germs in human, veterinary and phytopathology. Among them spiroplasms were discovered around 1970 and are currently the subject of various researches. Spiroplasma is the first of these mollicutes which has been cultivated and characterized as described by SAGLIO et al. in Int. J.

Syst. Bacteriol. 23 191-204; il estnotamment à l'origine d'une maladie des agrumes connue sous le nom de "stubborn disease".Syst. Bacteriol. 23 191-204; it is in particular at the origin of a citrus disease known under the name of "stubborn disease".

La spiraline est la plus abondante des protéines de la membrane de S.citri, de masse moléculaire comprise entre 26 et 28 kDa, c'est le principal antigène de ce microorganisme, spécifique de l'espèce S.ctt
L'obtention de quantités importantes de spiraline, antigène de microorganismes pathologiques est donc utile, notamment pour la préparation des réactifs de diagnostic et c'est un des avantages de l'invention de permettre la préparation microbiologique d'un polypeptide contenant les aminoacides de la spiraline. D'autres avantages de l'invention seront mentionnés dans ce qui suit.Spiralin is the most abundant of the proteins of the membrane of S.citri, with a molecular mass between 26 and 28 kDa, it is the main antigen of this microorganism, specific to the species S.ctt
Obtaining large quantities of spiralin, an antigen of pathological microorganisms is therefore useful, in particular for the preparation of diagnostic reagents and it is one of the advantages of the invention to allow the microbiological preparation of a polypeptide containing the amino acids of the spiral. Other advantages of the invention will be mentioned in the following.

Un premier objet de l'invention est le procédé d'isolement d'une souche d'Escherichia coli transformée et sécrétant un polypeptide présentant les caractères immunogéniques d'un antigène de S.cetoe, la spiraline. Ce procédé consiste à
1 ) - traiter le plasmide pBR 328, isolé et. dé- crit par SOBERON X., COVARRUBIUS L. et BOLIVAR F., dans
Gene 9 p. 287-305 (1980), par une endonucléase de restriction comme Eco R@,Hind III et analogues; on préfère tout particulièrement Hind III. A first object of the invention is the method of isolating a strain of Escherichia coli transformed and secreting a polypeptide exhibiting the immunogenic characteristics of an antigen of S. cetoe, spiraline. This process consists of
1) - treat the plasmid pBR 328, isolated and. described by SOBERON X., COVARRUBIUS L. and BOLIVAR F., in
Gene 9 p. 287-305 (1980), by a restriction endonuclease such as Eco R @, Hind III and the like; Hind III is particularly preferred.

20) - à isoler 1'ADN de Spiroplasma cette et à le fragmenter par l'endonucléase de restriction utilisée à l'étape 1 )
30) - à lier les différents fragments d'ADN obtenus selon 20) sur le vecteur plasmidique linéarisé, par action d'une ligase,
40) - à introduire les plasmides recombinants obtenus dans des bactéries de type E.eote par transformation,
50) à cultiver les bactéries de façon à sélectionner celles ayant incorporé un plasmide recombinant en
tenant compte des marqueurs apportés par le plasmide pBR 328 puis parmi celles-ci à isoler celles qui sécrètent un polypeptide donnant une réaction immunologique avec les anticorps dirigés contre les cellules de S. ce et la spiraline
Les bactéries transformées obtenues par ce procédé sont un autre objet de l'invention.20) - to isolate DNA from Spiroplasma ce and to fragment it with the restriction endonuclease used in step 1)
30) - to link the different DNA fragments obtained according to 20) to the linearized plasmid vector, by the action of a ligase,
40) - to introduce the recombinant plasmids obtained in E.eote type bacteria by transformation,
50) to cultivate the bacteria so as to select those which have incorporated a recombinant plasmid into
taking into account the markers provided by the plasmid pBR 328 then among these to isolate those which secrete a polypeptide giving an immunological reaction with the antibodies directed against the cells of S. ce and spiraline
Another object of the invention is the transformed bacteria obtained by this process.

Les plasmides recombinants comportant l'information génétique, codant pour ce polypeptide donnant une réaction immunologique définie ci-dessus sont extraits des bactéries ainsi sélectionnées par des moyens classiques; ils sont un objet de l'invention ainsi que le fragment d'ADN contenu dans ces plasmides, qui provient du Spiroplasma ce et codant pour ce polypeptide antigénique,et qui est fixé au vecteur dérivé du pBR 328. The recombinant plasmids containing the genetic information, coding for this polypeptide giving an immunological reaction defined above are extracted from the bacteria thus selected by conventional means; they are an object of the invention as well as the DNA fragment contained in these plasmids, which originates from Spiroplasma ce and coding for this antigenic polypeptide, and which is attached to the vector derived from pBR 328.

L'invention concerne aussi l'utilisation de fragments d'ADN et/ou plasmides selon l'invention à la préparation par clonage de nouveaux microorganismes modifiés et plasmides recombinants contenant ces fragments d'ADN; les fragments d'ADN isolés, les plasmides recombinants préparés avec ceux-ci et les microorganismes contenant au moins un plasmide recombinant ou ayant intégré un fragment d'ADN entrent aussi dans le cadre de l'invention. On préfère tout particulièrement les plasmides dérivés du pBR 328 et un microorganisme de type Escherichia coli; mais on peut aussi envisager d'autres vecteurs comme les phages, les autres plasmides connus, les cosmides.Il n'est pas nécessaire que que ces vecteurs soient pourvus d'un promoteur qui favorise l'expression des génes de 1'ADN cloné puisque l'on a montré que le fragment d'ADN selon l'invention porte un promoteur, actif non seulement chez SpewopEazma ce mais aussi chez E. Cote et donc chez des spiroplasmes comme des bactéries. The invention also relates to the use of DNA fragments and / or plasmids according to the invention in the preparation by cloning of new modified microorganisms and recombinant plasmids containing these DNA fragments; isolated DNA fragments, recombinant plasmids prepared with them and microorganisms containing at least one recombinant plasmid or having integrated a DNA fragment also fall within the scope of the invention. Particularly preferred are plasmids derived from pBR 328 and a microorganism of the Escherichia coli type; but we can also consider other vectors such as phages, other known plasmids, cosmids. It is not necessary that these vectors be provided with a promoter which promotes the expression of the genes of the cloned DNA since it has been shown that the DNA fragment according to the invention carries a promoter, active not only in SpewopEazma ce but also in E. Cote and therefore in spiroplasms such as bacteria.

Un autre microorganisme modifiab.le selon l'invention pourrait être Bacillus subtilis ou saccharomyces cervisiae. Another modifiable microorganism according to the invention could be Bacillus subtilis or saccharomyces cervisiae.

L'invention concerne aussi l'application des microorganismes m-odifiés,comportant un fragment d'ADN de la présente invention : a) pour l'obtention de polypeptides qui contiennent la séquence d'aminoacides correspondant à la spiraline par culture de ces microorganismes dans des conditions connues, ainsi que b) l'utilisation des fragments d'ADN comme sonde d'hybridation aux ADN d'autres spiroplasmes et mollicutes utilisable pour, notamment, la détection de ces microorganismes, y compris dans les hâtes, ou c) comme source d'un promoteur de mollicute. C'est en effet un autre avantage surprenant de l'invention, que le fragment d'ADN isolé de S. citri s'hybride aux ADN d'autres spiro- plasmes et de mollicutes qui ne comportent pourtant pas une protéine sérologiquement reliée à la spiraline de Sp to- plasma citri. The invention also relates to the application of m-odified microorganisms comprising a DNA fragment of the present invention: a) for obtaining polypeptides which contain the amino acid sequence corresponding to spiralin by culturing these microorganisms in known conditions, as well as b) the use of DNA fragments as DNA hybridization probe of other spiroplasms and mollicutes usable for, in particular, the detection of these microorganisms, including in haste, or c) as source of a mollicute promoter. It is indeed another surprising advantage of the invention, that the DNA fragment isolated from S. citri hybridizes to the DNA of other spiroplasm and mollicutes which do not, however, contain a protein serologically linked to the spiral from Sp to-plasma citri.

I1 est aussi inattendu et particulièrement utile que le fragment d'ADN selon l'invention comporte un promoteur d'expression des gènes qui ne soit pas actif uniquement chez S.ce ou même chez les spiroplasmes ou mollicutes mais aussi~ chez une bactérie. L'isolement de ce promoteur, par des méthodes connues, après sous-clonage du fragment d'ADN pourra servir à -la préparation d'un vecteur navette entre un mollicute et une bactérie ou d'autres micr-oorga- nismes. It is also unexpected and particularly useful for the DNA fragment according to the invention to include a gene expression promoter which is not active only in S. ce or even in spiroplasms or mollicutes but also in a bacterium. The isolation of this promoter, by known methods, after subcloning the DNA fragment may be used for the preparation of a shuttle vector between a mollicute and a bacterium or other microorganisms.

Dans les exemples qui suivent, on décrit une mise en oeuvre des procédés selon l'invention et certains des produits obtenus selon l'invention. In the examples which follow, an implementation of the methods according to the invention and some of the products obtained according to the invention are described.

Parmi les objets de l'invention, une souche de E.coQt transformée, dénommée E.C.pES1,contenant un plasmide de dénommé p ES1 constitué par un fragment d'ADN selon l'invention inséré dans le vecteur plasmidique pBR 328 a fait l'objet d'un dépôt le 19 Juin 1984, dans la Collection Nationale de cultures de Microorganismes de l'INSTITUT
PASTEUR (CNCM) à Paris sous le NO I-311.Among the objects of the invention, a strain of transformed E.coQt, called ECpES1, containing a plasmid called p ES1 consisting of a DNA fragment according to the invention inserted into the plasmid vector pBR 328 was the subject of '' a deposit on June 19, 1984, in the National Collection of cultures of Microorganisms of the INSTITUTE
PASTEUR (CNCM) in Paris under the NO I-311.

EXEMPLE 1
PREPARATION D'UNE BACTERIE TRANSFORMEE 1) Isolation de 1'ADN de Spiroplasma citri
La souche de S. ce R8A2 déposée à 1'ATCC sous le numéro 27556 a été cultivée à 32 C en milieu aérobie.EXAMPLE 1
PREPARATION OF A TRANSFORMED BACTERIA 1) Isolation of DNA from Spiroplasma citri
The strain of S. ce R8A2 deposited at ATCC under the number 27556 was cultivated at 32 ° C. in an aerobic medium.

A lafin de la période de croissance exponentielle 50 ml de milieu de culture ont été centrifugés à 150000 tours par minute, à 4 C, pendant 20 minutes Le culot d'organismes a été remis en suspension dans une solution aqueuse 100 mM chlorhydrate de tris-hydroxyméthylaminométhane (TRIS HCl) à pH@9, 150 mM de NaCl, 35 mM de dodécylsulfate de sodium, 10 mM de sel disodique de l'acide éthylènediami- ne tétraacétique (EDTA) et 50 mM de ss -mercaptoéthanol;; après addition de 0,1 ml d'une solution de protéine K à 10 mg/ml, la suspension a été doucement agitée pendant 20 minutes avant d'en extraire les acides nucléiques, par un traitement au phénol puis par un mélange chloroforme al- coo-l isoamylique ( 24/1 V/V), et enfin par précipitation à lréthanol. At the end of the exponential growth period, 50 ml of culture medium were centrifuged at 150,000 rpm at 4 ° C. for 20 minutes. The pellet of organisms was resuspended in a 100 mM aqueous solution of tris- hydrochloride. hydroxymethylaminomethane (TRIS HCl) at pH @ 9, 150 mM NaCl, 35 mM sodium dodecylsulfate, 10 mM disodium salt of ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and 50 mM ss-mercaptoethanol; after adding 0.1 ml of a protein K solution at 10 mg / ml, the suspension was gently stirred for 20 minutes before extracting the nucleic acids therefrom, by treatment with phenol and then with a chloroform mixture isoamyl coo-l (24/1 V / V), and finally by precipitation with lhanol.

Remis en solution dans 10 mi d'une solution 30 mM
TRIS HC1/500 mM NaCl/5 mM d'ETDA, ils ont été incubés pendant 30 minutes à 20 C en présence de 0,5 mg de ribonuclé- ase L'ADN a été finalement déprotéinisé et isolé par des extractions au phénol et chloroforme suivies d'une prXei- pitation à l'éthanol.Resolved in 10 mi of 30 mM solution
TRIS HC1 / 500 mM NaCl / 5 mM ETDA, they were incubated for 30 minutes at 20 ° C. in the presence of 0.5 mg of ribonuclease The DNA was finally deproteinized and isolated by phenol and chloroform extractions followed by ethanol precipitation.

2) Préparation des fragments d'ADN
4 g d'ADN purifiés comme décrit ci-dessus ont été traités par 400 unités de l'endonucléase de restriction
Hind III dans 0,3 ml d'une solution tamponnée de TRIS HCl pH 7,5 (100 mM)/NaCl (50 mM)/MgC12 (10 mM) pendant 2 heures à 370C. Les fragments obtenus ont été purifiés par des extractions au phénol et le mélange chloroforme/alcool isoamylique (24/1-V/V) suivies d'une précipitation par ltéthanol. 2) Preparation of DNA fragments
4 g of DNA purified as described above were treated with 400 units of the restriction endonuclease
Hind III in 0.3 ml of a buffer solution of TRIS HCl pH 7.5 (100 mM) / NaCl (50 mM) / MgC12 (10 mM) for 2 hours at 370C. The fragments obtained were purified by extractions with phenol and the chloroform / isoamyl alcohol mixture (24/1-V / V) followed by precipitation with ethanol.

3) - Préparation du vecteur plasmidigue 5 ss 9 du plasmide pBR 328 ont été linéarisés par
Hind III puis traités par la phosphatase alcaline selon le protocole décrit par MANIATIS et coll. dans Molecular cloning" (1982) p.75-85 édité par Cold Spring Harbor NY.3) - Preparation of the plasmid vector 5 ss 9 of the plasmid pBR 328 were linearized by
Hind III then treated with alkaline phosphatase according to the protocol described by MANIATIS et al. in Molecular cloning "(1982) p.75-85 edited by Cold Spring Harbor NY.

4) - Préparation des plasmides recombinants et transformation de bactéries E.cote
5 g de vecteur plasmidique et 4 ssg de fragments d'ADN préparés selon 2 ont été incubés pendant 14 heures à 140C en présence de 20 unités de ligase pour ADN du phage
T4 dans 0,1 ml d'une solution de 50 mM de TRIS HC1 (pH 7,4) 10 mM de MgCl2, 20 mM de dithiothréitol, 1 mM d'adénosine trisphosphate (ATP) . Les produits obtenus ont été utilisés pour transformer la souche de E. cote HB 101. 4) - Preparation of the recombinant plasmids and transformation of E.cote bacteria
5 g of plasmid vector and 4 ssg of DNA fragments prepared according to 2 were incubated for 14 hours at 140C in the presence of 20 units of phage DNA ligase
T4 in 0.1 ml of a 50 mM solution of TRIS HCl (pH 7.4) 10 mM of MgCl2, 20 mM of dithiothreitol, 1 mM of adenosine trisphosphate (ATP). The products obtained were used to transform the strain of E. code HB 101.

selon une méthode connue en elle-même, décrite notamment par VILLA-KOMAROFF L. et coll. dans Proc. Natl. Acad Sci.according to a method known in itself, described in particular by VILLA-KOMAROFF L. et al. in Proc. Natl. Acad Sci.

USA 75 3727-3731 (1978); elle consiste essentiellement à traiter les bactéries par du chlorure de calcium à pH 5,8, puis à les incuber avec les produits de la ligation, à 40C pendant 1 heure. On fait ensuite subir un choc thermique à 42oC de 2 minutes au mélange, et on l'étale sur un milieu de culture solide contenant-du chlor-amphénicol. Le plasmide pBR 328 comporte en particulier un gène codant pour la résistance au chloroamphénicol et un gène codant pour la résistance à la tétracycline; ces propriétés sont connues comme s'exprimant dans E.coti. Le site Hind III est loca-lisé dans le promoteur du gène codant pour la résistance à la tétracycline; dès lors l'introduction d'un fragment d'ADN exogène dans le site inactive généralement ce gène.USA 75 3727-3731 (1978); it essentially consists in treating the bacteria with calcium chloride at pH 5.8, then in incubating them with the ligation products, at 40C for 1 hour. The mixture is then subjected to a thermal shock at 42oC for 2 minutes, and it is spread on a solid culture medium containing chlor-amphenicol. The plasmid pBR 328 comprises in particular a gene coding for resistance to chloroamphenicol and a gene coding for resistance to tetracycline; these properties are known to be expressed in E.coti. The Hind III site is located in the promoter of the gene coding for resistance to tetracycline; therefore the introduction of an exogenous DNA fragment into the site generally inactivates this gene.

5) - Sélection des bactéries selon l'invention
Les bactéries transformées, présentant une résistance au chloramphénicol, ont été isolées sur milieu solide, contenant par litre 37g d'infusion de coeur et cer veau , commercialisé par Bio-Mérieux, 10 g de 8acto-agar des Laboratoires DIFCO (Détroit - USA) et 25 ,gg/ml de chloramphénicol. On a ainsi isolé 920 colonies pour lesquelles on á recherché la sensibilité à la tétracycline sur le même milieu solide mais contenant cette fois 15 ss g/ml de tétracycline au lieu de chloramphénicol on a isolé ainsi 565 clones résistants au chlonamphéni- col et sensibles à la tétracycline.5) - Selection of bacteria according to the invention
The transformed bacteria, having a resistance to chloramphenicol, were isolated on solid medium, containing per liter 37g of infusion of heart and deer, marketed by Bio-Mérieux, 10 g of 8acto-agar from DIFCO Laboratories (Detroit - USA) and 25, gg / ml chloramphenicol. We thus isolated 920 colonies for which we looked for the sensitivity to tetracycline on the same solid medium but this time containing 15 ss g / ml of tetracycline instead of chloramphenicol we thus isolated 565 clones resistant to chlonamphenicol and sensitive to tetracycline.

Parmi ces clones, on a recherché ceux qui sécrétaient des antigènes de S.cetoe par une méthode de type ELISA, c'est-à-dire par fixation sur antigène immobilisé et révélation par un conjugué immunoenzymatique, comme décrit par SAILLARD et cois. dans C.R. Acad. Sci. Paris, 286 1245-1248. Les anticorps de lapin utilisés étaient dirigés contre les cellules entières de S. citri. Among these clones, those which secreted S.cetoe antigens were sought by an ELISA type method, that is to say by fixation on immobilized antigen and revelation by an immunoenzymatic conjugate, as described by SAILLARD and cois. in C.R. Acad. Sci. Paris, 286 1245-1248. The rabbit antibodies used were directed against whole cells of S. citri.

Pour cela des bactéries transformées E.tote issues de chaque clone ont été introduites dans des puits d'une plaque de microtritration contenant un bouillon de culture constitué par 10 g de tryptone, 5 g d'extrait de levure et 5 g de NaCl par litre d'eau, ainsi que du chloramphénicol à la concentration de 25 9 par mi. Les piaques ont été incubées à 37 C pendant une nuit puis 0,02 ml de solution de lysozyme (5 mg par ml d'une solution 25 mM de TRIS HCl à pH 8) ont été ajoutés dans chaque puits, avant de les laisser incuber 30 minutes à température ambiante puis de les soumettre à 3 cycles de congélation ( - 800C)/décongélation, suivis d'une incubation 10 minutes à 37 C. Les bactéries lysées alors obtenues ont été transférées dans de nouvelles plaques de microtitration revêtues d'immoglobulines de lapin dirigées contre la souche R8A2 de S.cetoe. Les immunoglobulines, purifiées comme décrit par SAILLARD et coll. dans C.R. Acad. Sc. For this, transformed E.tote bacteria from each clone were introduced into the wells of a microtritration plate containing a culture broth consisting of 10 g of tryptone, 5 g of yeast extract and 5 g of NaCl per liter. of water, as well as chloramphenicol at a concentration of 25 9 per mi. The plates were incubated at 37 ° C. overnight, then 0.02 ml of lysozyme solution (5 mg per ml of a 25 mM solution of TRIS HCl at pH 8) were added to each well, before allowing them to incubate. 30 minutes at room temperature and then subject to 3 cycles of freezing (-800C) / thawing, followed by an incubation for 10 minutes at 37 C. The lysed bacteria then obtained were transferred to new microtiter plates coated with immoglobulins of rabbits against the R8A2 strain of S. cetoe. Immunoglobulins, purified as described by SAILLARD et al. in C.R. Acad. Sc.

Paris 286 1245-48 (1978), ont été déposées àpartir d'une solution tamponnée à la concentration de 12 > 9 par ml; ces IgG réagissent fortement avec la spiraline et d'autres protéines de membrane de S.citri . Après incubation des plaques pendant une nuit à 4 C, les complexes anticorpsantigènes spécifiques ont été décelés après addition d'un conjugué d'immunoglobulines de lapin anti-S.cette et de phosphatase alcaline, par révélation au p-nitrophényl phosphate, substrat de l'enzyme; les mesures de l'absorption ont été effectuées à 405 nm après 30 minutes à température ambiante.Paris 286 1245-48 (1978), were deposited starting from a solution buffered to the concentration of 12> 9 per ml; these IgG react strongly with spiralin and other membrane proteins of S.citri. After incubation of the plates overnight at 4 ° C., the specific antibody-antigen complexes were detected after addition of a conjugate of rabbit anti-S. immunoglobulin and this alkaline phosphatase, by revelation with p-nitrophenyl phosphate, substrate of the 'enzyme; absorption measurements were made at 405 nm after 30 minutes at room temperature.

Un seul clone a donné une réaction nettement positive à ce test; l'absorption obtenue en traitant 0,2 mi de culture de ce clone était supérieure à 2 unités,résul- tat obtenu avec environ Os3pg de protéines de S.citri. Only one clone gave a clearly positive reaction to this test; the absorption obtained by treating 0.2 mi of culture of this clone was greater than 2 units, a result obtained with approximately Os3pg of S.citri proteins.

15 autres clones ont donné une légère absorption correspondant à 0,25 unités, alors que la plupart donnaient des absorptions inférieures à 0,1 unité, valeur obtenue avec les bactéries témoins, ne contenant que le plasmide pBR 328, non recombiné. 15 other clones gave a slight absorption corresponding to 0.25 units, while most gave absorptions of less than 0.1 unit, a value obtained with the control bacteria, containing only the plasmid pBR 328, not recombined.

EXEMPLE 2
ISOLEMENT ET CARACTERISATION DU PLASMIDE pESl
Les bactéries du clone sélectionné selon le procédé décrit dans irexempie i contiennent un plasmide recombinant, appelé pESl. Celui-ci a été isolé et purifié comme décrit par MANIATIS et colt. dans l'ouvrage précédemment cité.EXAMPLE 2
ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF THE PLASMID pESl
The bacteria of the clone selected according to the method described in irexempie i contain a recombinant plasmid, called pES1. This was isolated and purified as described by MANIATIS et colt. in the work cited above.

Ce plasmide est composé d'environ 11,4 kpaires de bases nucléotidiques,et son traitement par des endonucléases de restriction a montré qu'un fragment d'ADN provenant du spiroplasme et composé d'environ- 6,5 kpaires de bases avait été inséré dans le site Hind III du vecteur de départ pBR 328. This plasmid is composed of approximately 11.4 kpairs of nucleotide bases, and its processing with restriction endonucleases has shown that a DNA fragment from the spiroplasm and composed of approximately 6.5 kpairs of bases had been inserted in the Hind III site of the starting vector pBR 328.

Une carte de restriction sommaire est représentée Fig. 1, sur laquelle le fragment d'ADN du spiroplasme figure en clair. A summary restriction map is shown in Fig. 1, in which the DNA fragment of the spiroplasm appears in clear.

EXEMPLE 3
ISOLEMENT ET CARACTERISATION DU FRAGMENT D'ADN DE
Spiroplasma citri PRESENT DANS LE PLASMIDE pESl. EXAMPLE 3
ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF THE DNA FRAGMENT OF
Spiroplasma citri PRESENT IN THE PLASMID pESl.

Le fragment d'ADN de spiroplasme est obtenu par action d'endonucléase Hind III sur le plasmide pESl à raison d'environ 2 unités d'endonucléase par ,g de plasmide,comme il est habituel. The DNA fragment of spiroplasm is obtained by the action of endonuclease Hind III on the plasmid pES1 in an amount of approximately 2 units of endonuclease per g of plasmid, as is usual.

On a montré par des techniques classiques que le fragment d'ADN de Spiroplasma citri compris dans le plasmide recombinant pESl contient environ 6,5 paires de bases, Il n'a pas de site Bam H1 ou Hind III interne. Il contient beaucoup plus de bases que le fragment de 0,8 kpaire de bases, nécessaire pour coder la spiraline. Il contient,au moins,outre le gène de la spiraline, un promoteur d'expression des gènes de spiroplasme, actif également chez une bactérie comme E.coli. It has been shown by conventional techniques that the DNA fragment of Spiroplasma citri included in the recombinant plasmid pES1 contains approximately 6.5 base pairs. It has no internal Bam H1 or Hind III site. It contains many more bases than the 0.8 kp base fragment necessary to encode spiralin. It contains, at least, in addition to the spiraline gene, a promoter of expression of the spiroplasm genes, also active in a bacterium such as E. coli.

La présence du promoteur a été montrée de maniè- re indirecte en préparant un plasmide recombinant pES2, contenant le fragment d'ADN, inséré dans le sens inverse à celui dans lequel il se trouvait dans le pESls le fait que le gène codant pour la séquence d'amino-acides correspondant à la spiraline s'exprime dans la -bactérie transformée par ce nouveau plasmide recombinant pES2 démontre que le fragment comporte un promoteur à partir duquel le gène de la spiraline est exprimé chez E. cote. The presence of the promoter has been shown indirectly by preparing a recombinant plasmid pES2, containing the DNA fragment, inserted in the opposite direction to that in which it was found in pESls the fact that the gene coding for the sequence of amino acids corresponding to spiralin is expressed in the bacteria transformed by this new recombinant plasmid pES2 demonstrates that the fragment contains a promoter from which the spiralin gene is expressed in E. cote.

EXEMPLE 4
UTILISATION DU FRAGMENT D'ADN de S.citri COMME SONDE
Une sonde marquée au P32 a été préparée par
réparation de coupure du pESI par i'ADN polymérise de
S.- cote en présence d'uridine triphosphate radioactive.EXAMPLE 4
USE OF THE S.citri DNA FRAGMENT AS A PROBE
A P32-labeled probe was prepared by
repair of cut of the PESI by DNA polymerizes
S.- odds in the presence of radioactive uridine triphosphate.

La sonde a été hybridée avec des fragments d'ADN digérés par Hind III, séparés par électrophorèse en gel d'agarose et transférés par buvardage (Southern blot) à des feuilles de nitrate de cellulose Par ces expériences d'hybridation, on a mis en évidence la présence de séquences,correspondant au fragment d'ADN de S.citri présent dans le pESi, dans les ADN d'autres souches de spiroplasmes et mollicutes.The probe was hybridized with DNA fragments digested with Hind III, separated by agarose gel electrophoresis and transferred by blotting (Southern blot) to sheets of cellulose nitrate. By these hybridization experiments, evidence of the presence of sequences, corresponding to the DNA fragment of S.citri present in pESi, in the DNA of other strains of spiroplasmas and mollicutes.

En effet, on a constaté que la sonde s'hybridait avec les fragments d'ADN chromosomique obtenus par action de Hind
III sur les ADN de trois souches différentes de S.citri,
bien qu'on ait montré par ailleurs que la spiraline de
S.citri est un antigène spécifique des souches de spiro
plasme de cette espèce. On a constaté aussi que la sonde s'hy
bridait avec un ou plusieurs fragments d'ADN provenant de
l'action de Hind III sur les ADN chromosomiques d'autres
espèces de spiroplasmes et mollicutes tels que S.flori-
cola, S. mirum, Mycoplasma mycoïdes (souche PC50) et
Acholeplasma laidlawii.Indeed, it was found that the probe hybridized with the fragments of chromosomal DNA obtained by the action of Hind
III on the DNAs of three different strains of S.citri,
although it has also been shown that the spiral of
S.citri is a specific antigen of spiro strains
plasma of this species. It was also found that the probe gets hy
bridged with one or more DNA fragments from
the action of Hind III on other chromosomal DNAs
species of spiroplasmas and mollicutes such as S. flori-
cola, S. mirum, Mycoplasma mycoids (strain PC50) and
Acholeplasma laidlawii.

Donc,malgré l'absence du même antigène chez les autres espèces de spiroplasmes et de mollicutes que S.citri le fragment d'ADN de 3 ce inséré dans pESl peut être utilisé comme sonde pour la mise en évidence d'autres spiroplasmes. Therefore, despite the absence of the same antigen in the other species of spiroplasms and mollicutes as S.citri, the DNA fragment of 3 ce inserted in pES1 can be used as a probe for the detection of other spiroplasms.

EXEMPLE 5
OBTENTION ET CARACTERISATION DU POLYPEPTIDE RESULTANT DE
L'EXPRESSION DANS E.cote DU FRAGMENT D'ADN de S.citri
CONTENU DANS pESl
On a cultivé des bactéries E.cote transformées, contenant le plasmide pESl et des bactéries comportant le plasmide pBR 328. Les polypeptides de ces deux transformants et de la souche de S.Citri R8A2 ont été séparés par électrophorèse dans un gel de polyacrylamide contenant du dodécylsulfate de Na, puis transférés par buvardage sur deux feuilles de nitrate de cellulose disposées de part et d'autre du gel. L'une des feuilles a été incubée avec des anticorps de lapin dirigés contre les cellules de
S. cette entières, tandis que l'autre a été testée avec un antisérum de lapin spécifique dirigé contre la spiraline purifiée.Les complexes antigènes/anticorps formés ont
été mis en évidence par un conjugué immunoenzymatique constitué par des anticorps de mouton antiwimmunoglobuline de lapin couplés à de la peroxyda-se en utilisant comme substrat le 4-chloro-l-naphtol.On a montré ainsi que les immunoglobulines de lapin dirigées contre les cellules de
S.citri reconnaissent plusieurs polypeptides provenant de ces cellules, y compris la spiraline de 28 kDa et que dans polypeptides synthétisés par E.cote transformée par pESl, une protéine de 30,5 kDa fixe les immunoglobulines anti
S. ce et anti-spiralines; celle-ci est absente des milieux ob ont été cultivées les E.coli contenant le seul plasmide pBR328.EXAMPLE 5
OBTAINING AND CHARACTERIZING THE POLYPEPTIDE RESULTING FROM
THE EXPRESSION IN E.cote OF THE DNA FRAGMENT of S.citri
CONTENT IN pESl
Transformed E. coli bacteria containing the plasmid pES1 and bacteria comprising the plasmid pBR 328 were cultivated. The polypeptides of these two transformants and of the S. Citri strain R8A2 were separated by electrophoresis in a polyacrylamide gel containing Na dodecyl sulfate, then transferred by blotting to two sheets of cellulose nitrate arranged on either side of the gel. One of the leaves was incubated with rabbit antibodies to the cells of
This whole, while the other was tested with a specific rabbit antiserum directed against purified spiraline. The antigen / antibody complexes formed have
was demonstrated by an immunoenzymatic conjugate consisting of rabbit antiwimmunoglobulin sheep antibodies coupled to peroxyda-se using as substrate 4-chloro-l-naphthol. It has been shown as well as rabbit immunoglobulins directed against cells of
S.citri recognize several polypeptides originating from these cells, including 28 kDa spiralin and that in polypeptides synthesized by E.cote transformed by pES1, a 30.5 kDa protein binds the anti immunoglobulins
S. ce and anti-spiralines; this is absent from the media where the E.coli containing the only plasmid pBR328 were cultivated.

La souche de E.coli transformée selon l'invention,synthétise donc une protéine, sérologiquement identique à la spiraline (fixation des anticorps spécifiques anti-spiraline) mais qui est de masse légèrement supérieure. Elle contient ainsi l'ensemble des amino acides de la spiraline, à côté d'autres amino-acides. The strain of E.coli transformed according to the invention therefore synthesizes a protein, serologically identical to spiralin (binding of specific anti-spiralin antibodies) but which is of slightly greater mass. It thus contains all of the amino acids of spiralin, alongside other amino acids.

Claims

1. Folypepti-de prepared by microbiology characterized in that it contains the amino acid sequence corresponding to spiraline, antigen of Spiroplasma ce

2. DNA fragment characterized in that it codes for the polypeptide according to claim 1.

3. DNA fragment according to claim 2-, characterized in that it further comprises the sequence of a functional spiroplasmg promoter in bacteria.

4. DNA fragment according to claim 2 characterized in that it hybridizes to the DNA of spiroplasms and other mollicutes.

5. DNA fragment according to one of claims 2 to 4, characterized in that it is obtained by the action of restriction endonuclease Hind III on the DNA of Spiroplasma citri.

6. Recombinant plasmid characterized in that it comprises a DNA fragment of spiroplasm according to any one of claims 2 to 5.

7. Recombinant plasmid characterized in that it is obtained from the plasmid vector pBR 328 and the DNA fragment according to one of claims 2 to 5 by the action of the restriction endonuclease

Hind III.

8. Microorganism, in particular E. dimension characterized in that it contains the genetic information for the biosynthesis of the polypeptide according to claim i.

9. Bacterium according to claim 8, ca acterized in that a plasmid according to one of claims 6 or 7 was introduced there.

10. Microorganisin according to claim 8, characterized in that the DNA fragment according to one of claims 2 to 5 is Xtd introduced by transformation with a plasmid according to claim 6 or by another vector.

11. Strain of Escherichia coli deposited in the National Collection of Cultures of Microorganisms of the Pasteur Institute under the N 1-311.

12. Plasmid according to claim 6, called pES, characterized in that it appears in the richia coli strain according to claim 11.

13. DNA fragment according to one of claims 2 to 4, characterized in that it is induced at the Hind III site in the recombinant plasmid according to claim 12.

14. Probe for. the detection of spiroplasmas and other mollicutes, characterized in that it contains a DNA fragment according to any one of claims 2 to 5 or 13.

15. Process for the preparation of a bacterium according to claim 9, characterized in that it consists of-

- 10) treat the plasmid pBR328 with 1 '

Hind restriction endonuclease

III,

- 20) isolate the DNA of Spiroplasma Ce

and treat it with said endonucleus

ase,

- 30) link the different DNA fragments

trained-in the linearized plasmid for

obtain recombinant plasmids,

- 40) introduce by transformation these

recombinant plasmids in E. coli

- 50) cultivate bacteria and select

the ones that incorporated the

recombinant plasmid with

the immunogenic characteristics of the

spiral.

16. Method according to claim 15, characterized in that the detection of the bacteria containing the DNA fragment coding for spiraline according to one of claims 2 to 5 is carried out by fixation on immobilized antigen and revelation by a conjugate immunoenzymatic.

17. Method for preparing the DNA fragment according to one of claims 2 to 4, characterized in that a plasmid according to one of claims 6 and 7 and 11 is treated with the Hind III restriction endonuclease and the polynucleotide fragment isolated by a known method.

18. A process for obtaining a polypeptide according to claim 1, characterized in that the microorganisms according to any one of claims 8 to 11 are cultivated in a known manner in order to isolate said polypeptide.