FR2555605A1

FR2555605A1 - PROCESS FOR INCREASING THE RESISTANCE TO ASIII AND ASV OF BACTERIAL STRAINS IN PARTICULAR THIOBACILLUS FERROOXIDANS

Info

Publication number: FR2555605A1
Application number: FR8318728A
Authority: FR
Inventors: Claude Nicolau; Jacques Raimond; Francoise Fargette
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 1983-11-24
Filing date: 1983-11-24
Publication date: 1985-05-31
Also published as: AU3620084A; WO1985002412A1; ZA849020B; FR2555605B1

Abstract

The process intended to enhance the resistance of a bacterial strain to As<III> and As<V> is characterized in that said strain which is either resistant or not to As<III> and As<V> is transformed by the plasmids carrying the genes which code for the resistance to As<III> and As<V> and the elements providing for their expression in said bacterium.

Description

La présente invention concerne un procédé destiné a accroître la résistance des souches bactériennes en particulier
Thiobacillus ferrooxidansA AsIII et AsV ainsi que les bactéries ainsi obtenues et leur application notamment dans l'extraction de l'or à partir de gisements arsenopyritiques.The present invention relates to a method for increasing the resistance of bacterial strains in particular
Thiobacillus ferrooxidansA AsIII and AsV as well as the bacteria thus obtained and their application in particular in the extraction of gold from arsenopyritic deposits.

Les bactéries Thiobacillus ferrooxidans sont les principaux microorganismes lixiviant les sulfures métalliques pyrites et CuS, par exemple, ainsi que les minerais d'uranium. The bacteria Thiobacillus ferrooxidans are the main microorganisms leaching metal sulphides, pyrites and CuS, for example, as well as uranium ores.

Ce sont des bactéries autotrpphes lorsqu'elles croissent en présence d'ions Fe++ et hétérotrophes lorsqu'elles croissent sur un milieu organique (par exemple le glucose). Il existe déjà quelques installations industrielles mettant en oeuvre cette technique.de lixiviation bactérienne, essentiellement pour le cuivre (USA) et pour l'uranium (Afrique du Sud,
Canada).They are autotrophic bacteria when they grow in the presence of Fe ++ ions and heterotrophic when they grow on an organic medium (for example glucose). There are already a few industrial installations using this bacterial leaching technique, mainly for copper (USA) and for uranium (South Africa,
Canada).

Les techniques industrielles de lixiviation de l'uranium ont pour but de transformer l'uranium qui est présent dans les minerais sous forme d'oxyde insoluble en sel d'uranium soluble dans l'eau. Le minerai d'uranium contient fréquemment de la pyrite (FeS2) et l'action de Thiobacillus ferrooxidans s'exerce de la façon suivante

et

UO2SO4 est soluble dans l'eau.The aim of industrial uranium leaching techniques is to transform the uranium which is present in ores in the form of insoluble oxide into a water soluble uranium salt. Uranium ore frequently contains pyrite (FeS2) and the action of Thiobacillus ferrooxidans is exerted as follows

and

UO2SO4 is soluble in water.

L'oxydation de UIV à UVI étant plus rapide en présence des bactéries qu'en présence d'ions Fie3+ seuls, des études récentes suggèrent une action directe de Thiobacillus ferrooxidans sur UIV :

As the oxidation of UIV to UVI is faster in the presence of bacteria than in the presence of Fie3 + ions alone, recent studies suggest a direct action of Thiobacillus ferrooxidans on UIV:

En utilisant les capacités oxydantes de cette bactérie, 85 % de l'uranium d'un minerai pauvre (200 à 300 ppm d'uranium) peuvent être lixlvlés en 20 semaines. Si le minerai est plus finement broyé (dimension particulaire : 0,8 à 1,2 mm) en 9 semaines 60 à 70 % de l'uranium peuvent être lixiviés par les bactéries. Using the oxidative capacities of this bacterium, 85% of the uranium in a poor ore (200 to 300 ppm uranium) can be lixivlated in 20 weeks. If the ore is more finely ground (particle size: 0.8 to 1.2 mm) in 9 weeks 60 to 70% of the uranium can be leached by bacteria.

La réaction (2) est la base du procédé de lixiviation bactérienne de l'uranium. Reaction (2) is the basis of the bacterial uranium leaching process.

Thiobacillus ferrooxidans peut être utilisé aussi afin d'extraire l'or de gisements arsenopyritiques. La bactérie autotrophe digère l'arsenopyrite et permet l'extraction du métal sans devoir griller le minerai. Thiobacillus ferrooxidans can also be used to extract gold from arsenopyritic deposits. The autotrophic bacteria digests the arsenopyrite and allows the extraction of the metal without having to roast the ore.

Malheureusement, la majorité des souches des
Thiobacillus ferrooxidans sont très sensibles à la toxicité de l?AsIII et de l'AsV. Unfortunately, the majority of strains of
Thiobacillus ferrooxidans are very sensitive to the toxicity of AsIII and AsV.

La présente invention se propose de remédier à cet inconvénient grace à un procédé destiné à accroitre la résistance d'une souche bactérienne à As111et AsV caractérisé en ce qu'on transforme ladite souche résistante ou non à As V et AsV par des plasmides portant les gênes qui codent pour la résistance à AsIIIet l'AsV et les éléments assurant leur expression dans ladite bactérie. The present invention proposes to remedy this drawback by means of a method intended to increase the resistance of a bacterial strain to As111 and AsV, characterized in that said strain resistant or not to As V and AsV is transformed by plasmids carrying the genes. which encode resistance to AsIII and AsV and the elements ensuring their expression in said bacterium.

Il a en effet été mis en évidence que la résistance à As et AsV était codée par des gênes portés d'origine plasmidiques et que la transformation de souches bactériennes par ces plasmides leur conférait une résistance à AsIIIet AsV lorsqu'elles en étaient dépourvues et augmentait leur III à III V résistance à et As lorsque les souches en cause présentaient déjà une certaine résistance à AsIII et AsV. It has in fact been demonstrated that resistance to As and AsV was encoded by genes carried of plasmid origin and that the transformation of bacterial strains by these plasmids gave them resistance to AsIII and AsV when they were devoid of them and increased. their III to III V resistance to and As when the strains in question already exhibited some resistance to AsIII and AsV.

De façon tout à fait inattendue, on a mis en évidence que la transformation d'une souche de T. ferrooxidans résistait à AsIIIet AsV par tout l'ADN plasmidique de cette même souche augmentait de manière très significative la résistance du transformant par rapport à la souche d'origine. Quite unexpectedly, it was demonstrated that the transformation of a strain of T. ferrooxidans was resistant to AsIII and AsV by all the plasmid DNA of this same strain very significantly increased the resistance of the transformant compared to the original strain.

La transformation de la souche bactérienne peut être effectuée par l'une quelconque des techniques connues dans le donaine du génie génétique notamment en fonction de la dimension du ou des plasmide(s) utilisé(s) pour la transformation. Ainsi pour de grand plasmide on utilisera de préférence la technique utilisant les liposomes. Dans ce procédé des protoplastes des bactéries à transformer sont incubés avec des liposomes incorporant lesdits plasmides puis apres incubation la paroi cellulaire est regénérée. The transformation of the bacterial strain can be carried out by any one of the techniques known in the field of genetic engineering, in particular according to the size of the plasmid (s) used (s) for the transformation. Thus, for large plasmids, the technique using liposomes will preferably be used. In this process, the protoplasts of the bacteria to be transformed are incubated with liposomes incorporating said plasmids and then after incubation the cell wall is regenerated.

Les plasmides utilisables dans ce procédé sont de préférence extraits d'une souche bactérienne en particulier de T. ferrooxidans résistant à As111et AsV, et utilisés tels quels mais ils peuvent également être en partie synthétique. The plasmids which can be used in this process are preferably extracted from a bacterial strain, in particular T. ferrooxidans resistant to As111 and AsV, and used as such, but they can also be partly synthetic.

Compte tenu de ce qui a été dit dans l'introduction, on préfèrera bien entendu transformer des souches de Thiobacil et en particulier de T. ferrooxidanSmais comme cela sera démontré il est possible de transformer d'autres bactéries comn
Bacillus subtils et de leur conférer une résistance à As et As V
Les Thiobacillus ferrooxidans transformes selon la présente invention sont plus particulièrement applicables à la lixiviation des minerais métalliques et en particulier des minerais arsenopyritiques contenant de l'or.In view of what has been said in the introduction, it will of course be preferable to transform strains of Thiobacil and in particular of T. ferrooxidan, but as will be demonstrated it is possible to transform other bacteria into
Subtle bacillus and give them resistance to As and As V
The Thiobacillus ferrooxidans transformed according to the present invention are more particularly applicable to the leaching of metal ores and in particular of arsenopyritic ores containing gold.

Les micro-organismes mis en oeuvre peuvent comporter
des profils plasmidiques très différents, ainsi ces micro
organismes peuvent comporter par exemple les plasmides décrits
dans le brevet français A-8116232 du 25.08.1981.The microorganisms used may include
very different plasmid profiles, so these micro
organisms can include, for example, the plasmids described
in French patent A-8116232 of 08.25.1981.

D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront des exemples suivants. Other characteristics and advantages of the present invention will emerge from the following examples.

Souches et conditions de culture
La souche de Thiobacillus ferrooxidans Tf80 a été obtenue des Laboratoires de General Mining, Johannesburg,
R.S.A. Elle est résistante à l'arsenite de sodium 6 mM. La souche est cultivée dans le milieu liquide défini par Tuovinen (7) auquel est additionné de l'arsenite de sodium 3 mM. Le pH est ajusté à 1,5. 20 litres de culture sont réalisés dans un cylindre de verre, avec agitation et aération. La température est maintenue à 28-300C. Les cellules sont récoltées quand 50 % du Fe++ sont oxydés en Fie+++. Bacillus subtilis est cultivé en milieu liquide LB (6) sauf quand des milieux spéciaux sont nécessaires pour la transformation. Strains and culture conditions
Thiobacillus ferrooxidans strain Tf80 was obtained from General Mining Laboratories, Johannesburg,
RSA It is resistant to 6 mM sodium arsenite. The strain is cultured in the liquid medium defined by Tuovinen (7) to which is added 3 mM sodium arsenite. The pH is adjusted to 1.5. 20 liters of culture are produced in a glass cylinder, with stirring and aeration. The temperature is maintained at 28-300C. The cells are harvested when 50% of the Fe ++ is oxidized to Fie +++. Bacillus subtilis is grown in LB liquid medium (6) except when special media are required for transformation.

Préparation de plaimides à partir de Thiobacillus ferrooxidans
Ce protocole mis au point au laboratoire pour
Thiobacillus ferrooxidans est adapté à partir de diverses sources (3-6) (TfI29, TfI32, TfI35, TfI-RF-35, Tf 80). Les cellules récoltées par centrifugation sont lavées avec deux fois 50 ml de milieu salin de culture. Le culot, environ 4 ml, est resuspendu dans 40 ml de SET (Saccharose 25 %, Tris 50 mM,
EDTA 2 mM, pH 8). Cette suspension est congelée 90 minutes à - 800C, puis rapidement décongelée et chauffée à 37 C. On additionne alors 8 ml de pronase prédigérée en tampon TE (20 mg/ml de Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 1,4 incubé 60 minutes à 370C). Preparation of plaimides from Thiobacillus ferrooxidans
This protocol developed in the laboratory for
Thiobacillus ferrooxidans is adapted from various sources (3-6) (TfI29, TfI32, TfI35, TfI-RF-35, Tf 80). The cells harvested by centrifugation are washed with twice 50 ml of saline culture medium. The pellet, approximately 4 ml, is resuspended in 40 ml of SET (25% Sucrose, 50 mM Tris,
2 mM EDTA, pH 8). This suspension is frozen for 90 minutes at -800 ° C., then rapidly thawed and heated to 37 C. 8 ml of predigested pronase in TE buffer are then added (20 mg / ml of 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 1.4 incubated 60 minutes at 370C).

Ce mélange incubé 5 minutes à 370C est rapidement refroidi à 0 C, 3,6 ml de dodécylsulfate de sodium à 10 % sont ajoutés. Après avoir laissé séjourner 30 minutes dans un bain de glace, 28 ml d'acétate de potassium 3 M sont ajoutés, le mélange est vigoureusement agite 10 minutes à 00C, puis centrifugé 30 minutes à 19000 g (Rotor GSA Sorvaîl). Le surnageant mesuré est additionné de deux volumes d'éthanol, la solution est conservée 15 minutes à OOC. L'ADN précipité est récolté par centrifugation (5 min. 19000 g). Le culot d'ADN est dissout dans 5 ml de tampon TBS (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5) reprécipité avec 10 ml d'éthanol, conservé 5 minutes à température ambiante et récolta par centrifugation 10 minutes à 12000 g (Rotor SS34 Sorvall). Le culot séché, remis en suspension dans du TE est analysé en réalisant un gradient de chlorure de césium en présence de bromure d'éthidium (40 h, 44000 rpm, Rotor Beckman 70 TI). La bande extraite et purifiée est analysée par électrophorèse en gel d'agarose 0,6 %, à 30 volts pendant 18 heures dans un tampon
TEB (Tris 18 mM, EDTA 0,5 mM, acide borique 18 mM pH 8,25). This mixture, incubated for 5 minutes at 370 ° C., is rapidly cooled to 0 ° C., 3.6 ml of 10% sodium dodecyl sulphate are added. After leaving to stay for 30 minutes in an ice bath, 28 ml of 3M potassium acetate are added, the mixture is vigorously stirred for 10 minutes at 00C, then centrifuged for 30 minutes at 19000 g (Rotor GSA Sorvaïl). Two volumes of ethanol are added to the measured supernatant, the solution is stored for 15 minutes at OOC. The precipitated DNA is harvested by centrifugation (5 min. 19000 g). The DNA pellet is dissolved in 5 ml of TBS buffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.5) reprecipitated with 10 ml of ethanol, stored for 5 minutes at room temperature and harvested by centrifugation for 10 minutes at 12,000 g (Rotor SS34 Sorvall). The dried pellet, resuspended in TE, is analyzed by performing a cesium chloride gradient in the presence of ethidium bromide (40 h, 44,000 rpm, Rotor Beckman 70 TI). The extracted and purified band is analyzed by electrophoresis in 0.6% agarose gel, at 30 volts for 18 hours in a buffer.
BER (18mM Tris, 0.5mM EDTA, 18mM boric acid pH 8.25).

Préparation et transformation des protoplastes de
Bacillus subtilis
Bacillus subtilis 168 est utilisé comme souche réceptrice. Les protoplastes sont prépares et transformés selon la proédure de Chang et Cohen (8). Les protoplastes transformés sont incubés 90 minutes à 370C dans le milieu d'expression préconisé, puis 90 minutes à 370C dans le même milieu additioni d'arsenite de sodium 0,2 mM.Preparation and transformation of protoplasts from
Bacillus subtilis
Bacillus subtilis 168 is used as the recipient strain. The protoplasts are prepared and transformed according to the procedure of Chang and Cohen (8). The transformed protoplasts are incubated for 90 minutes at 370C in the recommended expression medium, then 90 minutes at 370C in the same medium with the addition of 0.2 mM sodium arsenite.

Les protoplastes ainsi traités sont étalés sur le milieu solide de régénération tel qu'il est décrit par les auteurs mais additionné d'arsenite de sodium 5 mM pour sélectionner les transformés Après 48 à 72 heures d'incubatio à 379C des colonies se développent a la surface. The protoplasts thus treated are spread on the solid regeneration medium as described by the authors but supplemented with 5 mM sodium arsenite to select the transformants. After 48 to 72 hours of incubation at 379C, colonies develop at the area.

Une transformation témoin est réalisée en transférant à la souche initiale le plasmide pC 194 qui confère à cette dernière la résistance au chloramphénicol. A control transformation is carried out by transferring the plasmid pC 194 which confers resistance to chloramphenicol to the initial strain.

EXEMPLE 1 : Transformation de Bacillus subtilis
1.1. Le profil plasmidique de la souche de ThiobacilluE ferrooxidans Tf 80 obtenu sur gel d'agarose montre plusieurs bandes, mais on ignore laquelle confère la résistance à l'arsenite.EXAMPLE 1: Transformation of Bacillus subtilis
1.1. The plasmid profile of the ThiobacilluE ferrooxidans strain Tf 80 obtained on agarose gel shows several bands, but it is not known which confers arsenite resistance.

Avant de tenter de transférer ce caractère a la souche de Bacillus subtilis 168, choisie pour son aptitude à donner facilement des protoplastes avec une bonne efficacité de transformation par les plasmides (8), on a étudié l'effet de l'arsenite de sodium sur cette souche. Before attempting to transfer this trait to the strain of Bacillus subtilis 168, chosen for its ability to easily give protoplasts with good transformation efficiency by plasmids (8), we studied the effect of sodium arsenite on this strain.

1.2. On étudie la croissance de Bacillus subtilis 168 en présence d'arsenite de sodium. Bacillus subtilis 168 est cultivé une nuit en milieu LB. 1.2. The growth of Bacillus subtilis 168 is studied in the presence of sodium arsenite. Bacillus subtilis 168 is cultured overnight in LB medium.

La culture est diluée 20 fois dans du milieu frais additionné d'arsenite de sodium, aux concentrations indiquées. The culture is diluted 20 times in fresh medium supplemented with sodium arsenite, at the concentrations indicated.

Les cultures sont incubées à 370C avec agitation et la croissance est suivie en mesurant l'absorbance à 650 nm.The cultures are incubated at 370C with shaking and the growth is followed by measuring the absorbance at 650 nm.

Les résultats mesurés sont représentés sur la figure 1.The measured results are shown in Figure 1.

Les courbes de la figure 1 montrent que la croissance de Bacillus subtilis 168 est limitée par l'arsenite de sodium aux concentrations de 1 et 2 mM. Le temps de doublement de 30 minutes qui caractérise la souche dans le milieu considéré à 370C, passe respectivement à 50 minutes et 110 minutes. En présence d'arsenite 5 mM, la croissance est immédiatement et définitivement inhibée. The curves in FIG. 1 show that the growth of Bacillus subtilis 168 is limited by sodium arsenite at concentrations of 1 and 2 mM. The doubling time of 30 minutes which characterizes the strain in the medium considered at 370C, passes respectively to 50 minutes and 110 minutes. In the presence of 5 mM arsenite, growth is immediately and definitively inhibited.

1.3. On réalise ensuite une tentative d'induction de la résistance à l'arsenite chez Bacillus subtilis 168. Une culture de la nuit est diluée 20 fois dans du milieu frais. 1.3. An attempt is then made to induce arsenite resistance in Bacillus subtilis 168. An overnight culture is diluted 20 times in fresh medium.

Dès que la croissance est exponentielle, de l'arsenite de sodium est additionné a la concentration finale de 0,2 mM (temps 0 de l'expérience). Après une heure d'incubation, la concentration d'arsenite est élevée à 1 mM et une heure plus tard à 5 mM. La croissance à 370C avec aération est déterminée par la mesure de l'absorbance à 650 nm. Les résultats mesurés sont représentés sur la figure 2.As soon as the growth is exponential, sodium arsenite is added to the final concentration of 0.2 mM (time 0 of the experiment). After one hour of incubation, the arsenite concentration is raised to 1 mM and one hour later to 5 mM. The growth at 370C with aeration is determined by measuring the absorbance at 650 nm. The measured results are shown in Figure 2.

Les faibles concentrations sont sans effet significatif immédiat alors que la plus forte concentration d'arsenite a un effet inhibiteur immédiat. On peut conclure que la résistance à l1arsenite chez cette souche n'est pas inductible. Une inductibilité du système de résistance a été mise en évidence chez une souche de Staphylococcus aureus porteuse d'un plasmide déterminant une résistance à l'arsenic (4). A l'issue de ce résultat on a adopté la concentration de 5 mM pour sélectionner les cellules transformées. Low concentrations have no immediate significant effect while the highest concentration of arsenite has an immediate inhibitory effect. It can be concluded that resistance to arsenite in this strain is not inducible. Inducibility of the resistance system has been demonstrated in a strain of Staphylococcus aureus carrying a plasmid determining resistance to arsenic (4). At the end of this result, the concentration of 5 mM was adopted to select the transformed cells.

1.4. Les protoplaste-s sont préparés et transformés comme cela est décrit. Des boItes avec arsenite de sodium, sur lesquelles on étale des protoplastes non transformés restent stériles, tandis que des protoplastes traités avec 1'ADN plasmidique donnent des colonies sur ce même milieu. 1.4. Protoplast-s are prepared and processed as described. Plates with sodium arsenite, on which untransformed protoplasts are spread, remain sterile, while protoplasts treated with plasmid DNA give colonies on the same medium.

Une centaine de colonies a été prélevée sur différentes boites et remise en culture en milieu liquide en présence d'arsenite de sodium 6 mM. Quinze clones ont redonné une relativement bonne croissance, un seul donne régulièrement une culture similaire à la souche non transformée cultivée sans arsenite. Cette souche, nommée Bacillus subtilis 44 a été étudiée plus en détail. On étudie la croissance de la souche transformée de Bacillus subtilis 44 en présence d'arsenite de sodium. La culture de la souche transformée est réalisée en présence d'arsenite de sodium 5 mM pendant une nuit. Cette culture est ensuite diluée 20 fois dans du milieu frais et pour chaque sous culture, la concentration d'arsenite est ajustée comme indiqué sur les courbes. Ces cultures sont incubées à 370C avec agitation et leur évolution est suivie par mesure de l'absorbance à 650 nm.About a hundred colonies were taken from different dishes and returned to culture in liquid medium in the presence of 6 mM sodium arsenite. Fifteen clones gave relatively good growth, only one regularly gives a culture similar to the untransformed strain grown without arsenite. This strain, named Bacillus subtilis 44, has been studied in more detail. The growth of the transformed strain of Bacillus subtilis 44 was studied in the presence of sodium arsenite. The culture of the transformed strain is carried out in the presence of 5 mM sodium arsenite overnight. This culture is then diluted 20 times in fresh medium and for each subculture, the arsenite concentration is adjusted as indicated on the curves. These cultures are incubated at 370C with agitation and their development is followed by measuring the absorbance at 650 nm.

Les courbes de la figure 3 montrent l'évolution de la croissance de cette souche en présence de diverses concentrations d'arsenite de sodium. A l'évidence, les cellules transformées résistent à une concentration de 5 mM d'inhibiteu3 alors que la souche originale est totalement inhibée dans les mêmes conditions. Des concentrations plus élevées d'inhibiteur sont nocives pour la souche 44. The curves in FIG. 3 show the evolution of the growth of this strain in the presence of various concentrations of sodium arsenite. Obviously, the transformed cells resist a concentration of 5 mM of inhibitor, whereas the original strain is totally inhibited under the same conditions. Higher concentrations of inhibitor are harmful to strain 44.

EXEMPLE 2 : Transformation de Thiobacillus ferrooxidans
Dans la souche Tf35 on a trouvé un seul plasmide de 13.5x106d. On l'a appelé pBP-1. Le plasmide a été séparé par les méthodes décrites précédemment.EXAMPLE 2: Transformation of Thiobacillus ferrooxidans
In strain Tf35 a single 13.5x106d plasmid was found. It has been called pBP-1. The plasmid was separated by the methods described above.

Ce plasmide a été nick-translaté au 32p, selon les procédés usuels et on a obtenu une radioactivité de 0.44 x 106 cpm/g DNA. Le plasmide radioactif ainsi obtenu a été encapsulé dans des liposomes selon la méthode de Sené et
Nicolau (9). 10 pM de phosphatidyléthanolamine (Sigma) et 3 pM de phosphatidylglycérol d'oeuf ont été dissous en chloroforme et évapore sous azote dans un évaporateur rotatif.This plasmid was nick-translated to 32p, according to the usual methods and a radioactivity of 0.44 × 106 cpm / g DNA was obtained. The radioactive plasmid thus obtained was encapsulated in liposomes according to the method of Sené and
Nicolau (9). 10 µM phosphatidylethanolamine (Sigma) and 3 µM egg phosphatidylglycerol were dissolved in chloroform and evaporated under nitrogen in a rotary evaporator.

Les lipides ont été ensuite dissous dans 1,5 ml d'éther éthylique distillé. La solution éthérique a été injectée lentement dans une solution aqueuse de plasmide pBP-1 2 vg/ml en PBS (tampon phosphate - 0,145 M NaCl) à un pH = 7,4 chauffée a 600C. The lipids were then dissolved in 1.5 ml of distilled ethyl ether. The etheric solution was injected slowly into an aqueous solution of plasmid pBP-1 2 vg / ml in PBS (phosphate buffer - 0.145 M NaCl) at a pH = 7.4 heated at 600C.

La suspension de liposomes ainsi obtenue a été barbotée à l'azote pendant 15 minutes, afin d'éliminer les restes d'éther presents. Afin de séparer le plasmide encapsulé dans les liposomes du plasmide libre, la suspension a été incubée pendant 30 minutes a 370C avec une solution de DNAse
I en présence de 10 SM de MgCl2. La suspension a été ensuite chromatographieesur une colonne de Sepharose 4B et les liposomes contenant le DNA séparés du DNA hydrolysé. 1.1 pg de plasmide ont été encapsulé dans les liposomes (- 9 % de l'ADN présent en solution). The suspension of liposomes thus obtained was bubbled with nitrogen for 15 minutes, in order to remove the ether residues present. In order to separate the plasmid encapsulated in the liposomes from the free plasmid, the suspension was incubated for 30 minutes at 370 ° C. with a DNAse solution.
I in the presence of 10 MS of MgCl2. The suspension was then chromatographed on a column of Sepharose 4B and the liposomes containing the DNA separated from the hydrolyzed DNA. 1.1 μg of plasmid were encapsulated in the liposomes (- 9% of the DNA present in solution).

Les protoplastes de Tuf 35 ont été préparés par une modification de la méthode de Chang et Cohen (10). Les protoplastes ont été régénérés par une méthode de culture sur gel de silice imprégné des sels minéraux nécessaires à la croissance
MgSO4.7H2O 0.4 g/l
X2HPO4 0.4 g/l
tNH4)2SO4 0.4 g/l
Fe2(SO4)3.7H2O 33.3 g/l
Cette méthode permet la régénération des protoplastes avant une remise en culture en milieu liquide.Tuf protoplasts were prepared by a modification of the method of Chang and Cohen (10). The protoplasts were regenerated by a culture method on silica gel impregnated with the mineral salts necessary for growth.
MgSO4.7H2O 0.4 g / l
X2HPO4 0.4 g / l
tNH4) 2SO4 0.4 g / l
Fe2 (SO4) 3.7H2O 33.3 g / l
This method allows the regeneration of protoplasts before recultivation in liquid medium.

Les protoplastes obtenus à partir de Tf35 en phase semi-logarithmique (DO440 = 0.25) cultivé dans le milieu
Xelly-Tuovinen (7) ont été incubés pendant 1 heure à 340C avec les liposomes contenant le plasmide pBP-1. Après incubation, la suspension liposomes-protoplaste a été centrifugee a 2600 g pendant 10 minutes.The protoplasts obtained from Tf35 in semi-logarithmic phase (OD440 = 0.25) cultured in the medium
Xelly-Tuovinen (7) were incubated for 1 hour at 340C with the liposomes containing the plasmid pBP-1. After incubation, the liposome-protoplast suspension was centrifuged at 2600 xg for 10 minutes.

Les protoplastes ont été lavés à plusieurs reprises (3 fois) avec le milieu Kelly-Tuovinen (7) et une aliquote a été prélevée et sa radioactivité comptée. Selon le comptage radioactif, les protoplastes auraient incorporé # 0.8-1.0 % du plasmide encapsulé dans les liposomes. The protoplasts were washed several times (3 times) with Kelly-Tuovinen medium (7) and an aliquot was taken and its radioactivity counted. According to the radioactive count, the protoplasts would have incorporated # 0.8-1.0% of the plasmid encapsulated in the liposomes.

Les protoplastes ont été régénérés en présence de 2.5 mM d'arsenite de sodium. La capacité d'oxydation du Fe+2 de ces bactéries régénérées a été ensuite mesurée et comparée à celle des témoins Tf35 ainsi qu'à deux souches de Thiobacillus ferrooxidans dépourvues de plasmide, Tf29 et Tf32. The protoplasts were regenerated in the presence of 2.5 mM sodium arsenite. The Fe + 2 oxidation capacity of these regenerated bacteria was then measured and compared with that of the Tf35 controls as well as with two strains of Thiobacillus ferrooxidans lacking a plasmid, Tf29 and Tf32.

Les résultats sont présentés dans le Tableau I. The results are shown in Table I.

Tableau I

Table I

<tb> <SEP> Arsenite <SEP> de <SEP> Na <SEP> Fie <SEP> oxydé <SEP> à <SEP> F+3 <SEP>
<tb> <SEP> Souche <SEP> mg/l <SEP> en <SEP> 40 <SEP> heures
<tb> <SEP> (%)
<tb> Tf29 <SEP> 500 <SEP> 0
<tb> (sans <SEP> plasmide) <SEP> 2500 <SEP> 0
<tb> Tf32 <SEP> 500 <SEP> 0
<tb> (sans <SEP> plasmide) <SEP> 2500 <SEP> 0
<tb> Tf35 <SEP> 500 <SEP> 10
<tb> <SEP> 2500 <SEP> 4
<tb> TfI-35 <SEP> 500 <SEP> 20
<tb> <SEP> 2500 <SEP> 17
<tb> (enrichie <SEP> en <SEP> plas- <SEP> 0 <SEP> 22
<tb> mide <SEP> par <SEP> interac
<tb> tion <SEP> avec <SEP> les
<tb> liposomes)
<tb> Concentration initiale du Fe+2 = 6.15 g/l
Tandis que la capacité d'oxydation du Fe+2 par Tf sans plasmides ou de la souche Tf35 est soit complètement, soit sévèrement inhibée par l'arsenite de Na t la bactérie
TfI-35 enrichie en plasmide est beaucoup moins inhibée par les mêmes concentrations d'arsenite de Na
Le milieu contenant l'arsenite agit comme milieu sélectif pour les bactéries "enrichies.<tb><SEP> Arsenite <SEP> of <SEP> Na <SEP> Fie <SEP> oxidized <SEP> to <SEP> F + 3 <SEP>
<tb><SEP> Strain <SEP> mg / l <SEP> in <SEP> 40 <SEP> hours
<tb><SEP> (%)
<tb> Tf29 <SEP> 500 <SEP> 0
<tb> (without <SEP> plasmid) <SEP> 2500 <SEP> 0
<tb> Tf32 <SEP> 500 <SEP> 0
<tb> (without <SEP> plasmid) <SEP> 2500 <SEP> 0
<tb> Tf35 <SEP> 500 <SEP> 10
<tb><SEP> 2500 <SEP> 4
<tb> TfI-35 <SEP> 500 <SEP> 20
<tb><SEP> 2500 <SEP> 17
<tb> (enriched <SEP> in <SEP> plas- <SEP> 0 <SEP> 22
<tb> mide <SEP> by <SEP> interac
<tb> tion <SEP> with <SEP> the
<tb> liposomes)
<tb> Initial concentration of Fe + 2 = 6.15 g / l
While the oxidation capacity of Fe + 2 by Tf without plasmids or of the Tf35 strain is either completely or severely inhibited by the arsenite of Na t the bacteria
Plasmid-enriched TfI-35 is much less inhibited by the same concentrations of Na arsenite
The arsenite-containing medium acts as a selective medium for "enriched bacteria."

De cette manière, des bactéries sensibles à l'As111/
AsV - la vaste majorité des souches de Thiobacillus ferrooxidans - en acquérant une résistance élevée à l'arsenite/ arsenate peuvent être utilisées à la lixiviation des gisements contenant des arséno-pyrites; In this way, bacteria sensitive to As111 /
AsV - the vast majority of strains of Thiobacillus ferrooxidans - by acquiring high resistance to arsenite / arsenate can be used to leach deposits containing arsenopyrites;

Claims

Bibliography Oct. 1978, 2-4. 1. Bosecker, K., Kursten, M., Process Biochemistry, O.H., FEMS Microbiol. Letters 1980, 8, 121-125. 2. Mao, M.W.H., Dugan, P.R., Martin, P.A.W., Tuovinen, 3. Martin, P.A.W., Dugan, P.R., Tuovinen, O.H., Can. J. Microbiol. 1981, 27, 850-853. H., J. Bacteriol. 1981, 146, 983-996. D., Novick, RP, Willsky, GR, Malamy, MH, Rosenberg, 4. Silver, S., Budd, K., Leahy, M., Shaw, WV, Hammond, 5. Curtin, ME, Biotechnology, May 1983 , 229-235 cloning (A laboratory Manual) CHS Laboratory, 1982. 6. Maniatis, T, Fritsch, EF, Sambrook, J., Molecular 285-298. 7. Tuovinen, O.H., Kelly, D.P., Arch. Mikrobiol. 1973, 88, 111-115. 8. Chang, S., Cohen, S.N., Molec. Gen. Broom. 1979, 168, pp. 67-79. competent Cell Functions, Academic Press, London 1981, 9. Sené, C. and Nicolau, C. in "Liposomes, Drugs and Immuno 111-115. 10. Chang, T. and Cohen, P., 1979, Molec. Cell. Genetics 168, CLAIMS

1. Method for increasing resistance to a bacterial strain to AsIII and AsV characterized in that III V transforms said strain resistant or not to As and As by plasmids carrying the genes which code for resistance to As111 and AsV and the elements ensuring their expression in said bacterium.

2. Method according to claim 1 characterized in that said plasmid is extracted from a bacterial strain resistant to AsIII and AsV.

3. Method according to one of claims 1 and 2 characterized in that the transformation is carried out by incubation of the protoplasts of the strain to be transformed with liposomes incorporating said plasmids.

4. Method according to one of claims 1 to 3 characterized in that the bacterial strain is a strain of Thiobacillus.

5. Method according to claim 4 characterized in that it is a strain of Thiobacillus ferrooxidans.

6. Bacterial strain resistant to AsIII and As V obtained by carrying out the method according to one of claims 1 to 5.

7. Thiobacillus ferrooxidans strain resistant to

AsIII and AsV according to claim 6.

8. Application of the strains according to claim 7 to the leaching of arsenopyritic gold ores.