FR2546755A1 - Method for preserving sperm, especially horse sperm - Google Patents
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Abstract
Description
Procedé pour la conservation de sperme notamment des chevaux
La présente invention concerne un procédé pour la conservation du sperme des espèces animales et notamment du sperme des chevaux.Process for the conservation of sperm, especially of horses
The present invention relates to a method for preserving the sperm of animal species and in particular the sperm of horses.
Dépuis de nombreuses années les spécialistes ont mis au point divers procédés permettant la conservation de sperme de certaines espèces animales en vue de réaliser des inséminations artificielles. Le succès de cette opération de conservation, donc le succès de I'insémination artificielle à l'aide du produit conservé, dépend,d'une part,de la méthode utilisée pour réaliser ladite conservation et,d'autre part, de la race animale choisie. C1 est ainsi que si pour la race bovine par exemple il existe des procédés de conservation qui sont considérés comme satisfaisants, on constate que pour la race chevaline les procédés actuellement connus sont encore très aléatoires. For many years, specialists have developed various procedures allowing the conservation of sperm of certain animal species in order to carry out artificial inseminations. The success of this conservation operation, therefore the success of artificial insemination using the preserved product, depends, on the one hand, on the method used to achieve said conservation and, on the other hand, on the animal breed chosen. C1 is thus that if for the bovine breed for example there are conservation methods which are considered satisfactory, it can be seen that for the horse breed the methods currently known are still very uncertain.
La présente invention vise à résoudre les problèmes posés par la conservation du sperme en vue d'une insémination artificielle; elle parait améliorer les résultats obtenus en mettant en oeuvre les procédés actuels connus, quelle que soit la race à laquelle lesdits procédés sont appliqués,mais elle est parmi culièrement intéressante pour améliorer les résultats actuellement obtenus ave-c la race chevaline. The present invention aims to solve the problems posed by the conservation of sperm for artificial insemination; it seems to improve the results obtained by implementing the current known methods, whatever the breed to which said methods are applied, but it is particularly useful for improving the results currently obtained with the horse breed.
Le procédé de base à partir duquel la présente invention a été réalisée consiste dans une congélation des spermatozoxdas à très basse tempéra11lre, plus précisément à la température de l'air (ou l';lzotc) liquide. Ce procédé est connu et peut etre schématiquement décrit comme suit - le sperme de l'animal prélevé dans des conditions
optimales est tout d'abord dilué puis soumis à une
centrifugation afin de séparer le liquide de l'ensemble
des spermatozoldes - lesdits spermatozoides sont alors; admis dans un
liquide de congélation, et la suspension obtenue,
après avoir été admise dans des paillettes, est conge
lée puis conservée dans l'azote liquide.The basic process from which the present invention has been made consists in freezing the spermatozoa at a very low temperature, more precisely at the temperature of the air (or lzotc) liquid. This process is known and can be schematically described as follows - the sperm of the animal taken under conditions
is first diluted and then subjected to a
centrifugation to separate the liquid from the assembly
sperm - said sperm are then; admitted to a
freezing liquid, and the suspension obtained,
after being admitted into glitter, is discharged
lée then preserved in the liquid nitrogen.
- enfin lors de l'utilisation1 les paillettes sont ré
chauffées, ouvertes et leur contenu est dilué dans
un milieu liquide convenable.- finally during use1 the glitter is re
heated, open and their content is diluted in
a suitable liquid medium.
I1 a été trouvé,et cela constitue la base de l'invention, que la composition des milieux dans lesquels on effectue la première dilution du sperme frais (en vue de sa centrifugation) et surtout dans lesquels on réalise la suspension des spermatozoides en vue de leur congélation et de leur conservation, joue un rôle très important pour le succès de cette con- servation. It has been found, and this constitutes the basis of the invention, that the composition of the media in which the first dilution of the fresh sperm is carried out (with a view to its centrifugation) and especially in which the suspension of the spermatozoa is carried out with a view to their freezing and storage plays a very important role in the success of this preservation.
I1 a été trouvé également de façon subsidiaire - que le liquide de dilution que lton utilise après
décongélation des paillettes avait une certaine
importance pour améliorer la vitalité et la vélocité
des spermatozoldes. It has also been found in the alternative - that the dilution liquid which is used after
thawing the glitter had some
importance for improving vitality and velocity
sperm.
- et que certaines précautions devaient être prises
lors de la réfrigération (ou congélation) des
spermatozodes de façon à optimiser les résultats obtenus -
L'invention de base se situe donc au niveau de la composition du liquide, ajouté au centrifugeat de sperme, avant la congélation du produit.- and that certain precautions should be taken
when refrigerating (or freezing) the
sperm in order to optimize the results obtained -
The basic invention therefore lies in the composition of the liquid, added to the sperm centrifugeat, before the product is frozen.
Dans les techniques actuellement utilisées ce liquide comporte essentiellement, outre de l'eau distillée, des sucres,à savoir un mélange de glucose, lactose et raffinoseX un produit connu sous le nom de Tris et contenant du trihydroxyméthylaminoéthane et de l'acide citrique, du glycérol et une certaine quantité de jaune d'oeuf. I1 a été trouvé que lorsque le liquide ajouté au centrifugeat du sperme avant l'opération de congélation, contenait entre 1,5 et 3,5,0 en volume d'un composé choisi parmi-la méthylfor- mamide et la méthylacétamide, on obtenait une conservation optimale de vitalité et de la vélocité des spermatozoides soumis à la congélation et à la conservation à froid. In the techniques currently used this liquid essentially comprises, in addition to distilled water, sugars, namely a mixture of glucose, lactose and raffinoseX a product known under the name of Tris and containing trihydroxymethylaminoethane and citric acid, glycerol and a certain amount of egg yolk. It has been found that when the liquid added to the centrifuge of the sperm before the freezing operation contains between 1.5 and 3.5.0 by volume of a compound chosen from -methylformamide and methylacetamide, one obtains optimal conservation of vitality and velocity of sperm subjected to freezing and cold storage.
Le liquide utilisé est constitué de préférence, comme coimu : - d'un dilueur de base constitué, pour 100cc, de 68cc
d'un mélangesucré, de 27 cc de tris et de 5 cc de
glycérol, et de 2cc de jaune d'oeuf. Le mélange
sucré connu est très généralement composé de
glucose 2,4 g
lactose 3,2 g
raffinose' 5,4 g
l'ensemble étant dissout dans 100 cc d'eau distillée.The liquid used preferably consists, as coimu: - of a basic diluent consisting, for 100cc, of 68cc
of a sweet mix, 27 cc of sorting and 5 cc of
glycerol, and 2cc of egg yolk. The mixture
known sweet is very generally composed of
glucose 2.4 g
lactose 3.2 g
raffinose '5.4 g
the whole being dissolved in 100 cc of distilled water.
Le tris également connu est composé de
trishydroxyméthylaminoéthane 3 g
acide citrique 1,67 g
l'ensemble étant dissout dans 100 cc d'eau distillée - et d'un liquide cryoprotecteur qui est constitué
pour 100 cc, de 90 cc du dilueur de base décrit
ci-dessus, de 5 cc de glycérol, de 2 cc de jaune
d'oeuf et d'un produit selon l'invention, à savoir
de méthylformamide ou de méthylacétamide. The sort also known is composed of
trishydroxymethylaminoethane 3 g
citric acid 1.67 g
the whole being dissolved in 100 cc of distilled water - and a cryoprotective liquid which is made up
for 100 cc, 90 cc of the basic diluent described
above, 5 cc of glycerol, 2 cc of yellow
egg and a product according to the invention, namely
methylformamide or methylacetamide.
L'opération de dilution du sperme centrifugé à l'aide du liquide selon l'invention consiste - tout d'abord à diluer sensiblement volume par volume
le sperme centrifugé avec le dilueur de base - puis à ajouter au mélange ainsi obtenu, sensiblement
volume par volume, le liquide cryoproteeteur. The dilution operation of the centrifuged sperm using the liquid according to the invention consists - first of all in substantially diluting volume by volume
the sperm centrifuged with the basic diluent - then to be added to the mixture thus obtained, substantially
volume by volume, the cryoprotective liquid.
Ainsi, si i'on veut diluer environ 100 cc de sperme centrifugé,on ajoutera tout d'sabord environ 100 cc du dilueur de base puis, au mélange obtenue, environ 200 cc de liquide cryogénique. Ce sont ces 500 cc de liquide de dilution qui devront contenir de 1,-5 à 3,5 Qe en volume eau moins un produit choisi parmi le méthylformamide et le méthylacétamide. Si la proportion de méthylformamide et de méthylacétamide est trop faible, la protection des spermatozoides lors de la congélation et du stockage au froid sera insuffisante; lorsque au contraire la proportion desdits produits est trop importante, il semble apparaître une certaine nocivité du liquide vis-à-vis des spermatozoides. Thus, if one wishes to dilute approximately 100 cc of centrifuged sperm, one will first add approximately 100 cc of the basic diluent then, to the mixture obtained, approximately 200 cc of cryogenic liquid. It is these 500 cc of dilution liquid which should contain from 1.5 to 3.5 Qe by volume of water minus a product chosen from methylformamide and methylacetamide. If the proportion of methylformamide and methylacetamide is too low, the protection of sperm during freezing and cold storage will be insufficient; when, on the contrary, the proportion of said products is too large, there appears to be a certain harmfulness of the liquid vis-à-vis the spermatozoa.
I1 a été trouvé de plus que la composition du liquide dans lequel on diluait le sperme fraichement recueilli pour soumettre le mélange obtenu à l'opération de centrifugation,pouvait avoir une taine importance pour le maintien des qualités des spermatozoîdes. It has also been found that the composition of the liquid in which the freshly collected sperm is diluted in order to subject the mixture obtained to the centrifugation operation, could be of great importance for the maintenance of the qualities of the spermatozoa.
On sait qu?il existe de nombreuses solutions préconisées à cet effet; la solution la plus utilisée parait être une solution commerciale contenant (solution A)
glucose 6g
citrate de sodium 0,375 g
acétate de tétraéthylene
diamine 0,370
hydrocarbonate de sodium 0,125 g
eau distillée q.s.p. 100 cc.We know that there are many solutions recommended for this purpose; the most used solution seems to be a commercial solution containing (solution A)
glucose 6g
sodium citrate 0.375 g
tetraethylene acetate
diamine 0.370
sodium hydrocarbonate 0.125 g
distilled water qs 100 cc.
I1 a été trouvé que cette solution, qui possède une pression osmotique élevée, était très efficace pour la conservation (pendant l'opération de centrifugation) de la vélocité des spermatozoides recueillis; cependant cette solution ne permet pas de maintenir, notamment dans le cas de la race équine, la vitalié desdits spermatozoïdes à un niveau suffisant. It has been found that this solution, which has a high osmotic pressure, is very effective for the conservation (during the centrifugation operation) of the velocity of the sperm collected; however, this solution does not make it possible to maintain, particularly in the case of the equine breed, the vitality of said sperm at a sufficient level.
Il a eté trouvé qu'il était souhaitable d'utiliser à la place de la solution décrite ci-dessus, un mélange sensiblement volume à volume (à + 10% près) de - ladite solution A - et d'une solution contenant, pour 100cc, de solution dans liteau environ:
1 g de bromure de potassium
0,45 g de citrate de sodium
et 1,8 g de glucose.It was found that it was desirable to use, in place of the solution described above, a substantially volume-to-volume mixture (to within + 10%) of - said solution A - and of a solution containing, for 100cc, of solution in approximately batten:
1 g potassium bromide
0.45 g sodium citrate
and 1.8 g of glucose.
On ajoutera comme connu à la solution utilisée une faible quantité de jaune d'oeuf. As known, a small amount of egg yolk will be added to the solution used.
Grâce à l'utilisation, lors de la dilution du sperme avant centrifugation, du mélange décrit ci-dessus, il apparaît que l'on conserve à la fois la vélocité et la vitalité desspermatozoldes. Thanks to the use, during the dilution of the sperm before centrifugation, of the mixture described above, it appears that both the velocity and the vitality of the sperm are preserved.
Comme autre amélioration à la technique de conservation et de réutilisation du sperme pour insémination artificielle, il a été trouvé que le liquide dans lequel le produit conservé au froid peut avantageusement être dilue lors de 1' insémination, est avantageusement constitué d'un mélange d'environ 20cc d'un mélange sucré analogue à celui décrit ci-dessus (ctest-à-dire contenant pour 100 cc, 2,4 g de glucose, 3,2 g de lactose et 5,4 g de raffinose) et d'environ 80 cc de solution tris (décrite ci-dessus), l'ensemble étant dilué dans du lait écrémé. As another improvement to the technique for preserving and reusing sperm for artificial insemination, it has been found that the liquid in which the product kept cold can advantageously be diluted during insemination, advantageously consists of a mixture of about 20cc of a sweet mixture similar to that described above (that is to say containing per 100 cc, 2.4 g of glucose, 3.2 g of lactose and 5.4 g of raffinose) and about 80 cc of tris solution (described above), the whole being diluted in skimmed milk.
Dans ce qui précède,les proportions des divers composés doivent être respectées avec une précision d'environ 10 ó; ctest ainsi par exemple que lorsque l'on mentionne que la solution de dilution pour le sperme décongelé, doit comporter environ 20 cc de solution sucrée pour environ 80 cc de solution tris,cela veut dire que l'on utilisera, pour 100 cc, de 18 à 22 cc de solution sucrée pour 82 à 78 cc de solution tris. In the foregoing, the proportions of the various compounds must be observed with an accuracy of approximately 10%; ctest thus for example that when it is mentioned that the dilution solution for the thawed sperm, must comprise approximately 20 cc of sugar solution for approximately 80 cc of tris solution, this means that one will use, for 100 cc, 18 to 22 cc of sugar solution for 82 to 78 cc of tris solution.
Enfin, il a été trouvé que lors de la congélation des spermatozoides, la vitesse de congé- ration pouvait avoir une importance sur la qualité des produits conservés. Bien entendu, comme la température effective de la solution soumise à refroidissement dépend en partie de la forme physique (volume, état de dispersion...) dans laquelle se trouve ladite dilution, il convient de préciser que cette vitesse de congélation optimale a été déterminée pour des paillettes qui constituent une méthode très connue de conditionnement du sperme en vue de l'opération de congélation.La vitesse de congélation àla température étant mesurée dans l'enceinte refroidie dans laquelle les paillettes de sperme sont disposées, doit être la suivante
- 50C/minute + 10C pour les températures allant de 0 a - 100 C. Finally, it was found that when freezing sperm, the rate of congestion could have an importance on the quality of the products stored. Of course, as the effective temperature of the solution subjected to cooling partly depends on the physical form (volume, state of dispersion, etc.) in which said dilution is found, it should be noted that this optimal freezing speed has been determined for flakes which constitute a well-known method of conditioning the sperm for the freezing operation.The speed of freezing at temperature being measured in the cooled enclosure in which the sperm flakes are placed, must be as follows
- 50C / minute + 10C for temperatures from 0 to - 100 C.
- 150Clminute + 2 C pour les températures allant de -100C à - 300C,
et 60 C/minute 6 C pour les températures allant de -30 jusqu'à - 140 C. - 150Clminute + 2 C for temperatures ranging from -100C to - 300C,
and 60 C / minute 6 C for temperatures from -30 to - 140 C.
L'exemple non limitatif suivant illustre l'invention. Le sperme d'un cheval est recueilli puis filtré; le filtrat est dilué en utilisant, pour lOOcc de filtrat, un volume d'environ 100 cc d'un mélange constitué de 503o en volume dfune solution commerciale contenant, pour 100 cc, 6 g de glucose, 0,375 g de citrate de sodium, 0,370 g d'ac-étate de tétraéthylène diamine et 0,125 g d'hydrocarbonate de sodium et 50% en volume d'une solution contenant, pour 100 cc, 1 g de bromure de potassium,- 0,45 g de citrate de sodium et 1,8 g de glucose, mélange auquel on ajoute lcc de jaune d'oeuf frais. The following nonlimiting example illustrates the invention. A horse's sperm is collected and then filtered; the filtrate is diluted using, for 100 cc of filtrate, a volume of approximately 100 cc of a mixture consisting of 503o by volume of a commercial solution containing, for 100 cc, 6 g of glucose, 0.375 g of sodium citrate, 0.370 g of tetraethylene diamine acetate and 0.125 g of sodium hydrocarbon and 50% by volume of a solution containing, for 100 cc, 1 g of potassium bromide, - 0.45 g of sodium citrate and 1 , 8 g of glucose, mixture to which 1 cc of fresh egg yolk is added.
La température à laquelle cette dilution est réalisée,est d'environ 25 à 30 C. The temperature at which this dilution is carried out is approximately 25 to 30 C.
Le mélange ainsi obtenu est soumis à une centrifugation, à température ambiante la vitesse de centrifugation étant telle que le mélange soit soumis une force de 400 à 500g pendant une durée de 7 à 10 minutes environ. The mixture thus obtained is subjected to centrifugation, at room temperature the centrifugation speed being such that the mixture is subjected to a force of 400 to 500 g for a period of approximately 7 to 10 minutes.
Le culot de centrifugation (contenant les spermatozosdes) est recueill et dilué. The centrifugation pellet (containing the sperm) is collected and diluted.
Cette dilution s'effectue endeux étapes,à savoir première étape : à 100 cc de sperme centrifugé
on ajoute environ 100 cc d'un dilue-ur de base
contenant, pour.100 cc,
solution sucrée (A) 68 cc
tris (B) 27 cc
glycérol 5 cc
jaune d'oeuf 2 cc
La solution sucree contient, pour 100 cc d'eau distillée, 2,4 g de glucose, 3,3 g de lactose et 5,4 de raffinose.This dilution is carried out in two stages, namely first stage: at 100 cc of centrifuged sperm
about 100 cc of a basic diluent is added
containing, for 100 cc,
sugar solution (A) 68 cc
tris (B) 27 cc
5 cc glycerol
2 cc egg yolk
The sugar solution contains, per 100 cc of distilled water, 2.4 g of glucose, 3.3 g of lactose and 5.4 of raffinose.
La solution tris contient, pour 100 cc d'eau distillée, trishydroxyméthylaminoéthane 3 g, acide citrique l,67g. The tris solution contains, per 100 cc of distilled water, trishydroxymethylaminoethane 3 g, citric acid 1.67 g.
deuxième étape : à 100 cc de la solution obtenue
dans la première étape de dilution, on ajoute environ
100 cc d'une solution contenant,
- 90Q,A0 en volume d'un mélange à 70,6
en volume de la solution sucrée A
décrite ci-dessus et 30% en volume
de la solution tris décrite ci-dessus
- 5% en volume de glycérol
- 2% en volume de jaune d'oeuf
- et soit environ 3% en volume de
méthylformamide soit environ 4% en
volume de méthyl acétamide.second step: 100 cc of the solution obtained
in the first dilution step, we add about
100 cc of a solution containing,
- 90Q, A0 by volume of a mixture at 70.6
by volume of sugar solution A
described above and 30% by volume
of the sorted solution described above
- 5% by volume of glycerol
- 2% by volume of egg yolk
- and about 3% by volume of
methylformamide or about 4% in
volume of methyl acetamide.
Le mélange obtenu est introduit, de façon connue, dans des paillettes qui sont bouchées et lesdites paillettes sont réfrigérées vers 40C pendant environ 3 à 60 minutes. The mixture obtained is introduced, in a known manner, into flakes which are capped and said flakes are refrigerated at around 40C for approximately 3 to 60 minutes.
Les paillettes sont introduites dans une enceinte que l'on va refroidir avec la vitesse suivante
- diminution de la température de 50C/
minute entre les températures de
O et de -100C
- diminution de la température de 150C/
minute entre les températures de
- 100C à - 300C
- diminution de la température de 600C/
minute entre les températures de
- 30 C à - 1400C. The flakes are introduced into an enclosure which will be cooled with the following speed
- decrease in temperature by 50C /
minute between temperatures of
O and from -100C
- decrease in temperature by 150C /
minute between temperatures of
- 100C to - 300C
- decrease in temperature by 600C /
minute between temperatures of
- 30 C to - 1400C.
Les paillettes ainsi congélées sont conservées à la température de l'air ou de l'azote liquide. Le réchauffement des paillettes s'effectue par trempage des dites paillettes dans un bain marie à environ 400C et le contenu des-paillettes est dilué. The straws thus frozen are stored at the temperature of air or liquid nitrogen. The flakes are heated by soaking the flakes in a water bath at around 400C and the contents of the flakes are diluted.
Cette dilution, réalisée en une ou plusieurs étapes, est effectuée à l'aide d'un mélange composé de
Z0 cc de la solution sucrée (A)
décrite ci-dessus
80 cc de la solution tris (B) décrite
ci-dessus et
100 cc de lait écrémé.This dilution, carried out in one or more stages, is carried out using a mixture composed of
Z0 cc of the sugar solution (A)
described above
80 cc of the described tris solution (B)
above and
100 cc of skim milk.
I1 a été trouvé que grâce à l'invention on pouvait améliorer les résultats des opérations d'insémination arçioicielle obtenus avec de nombreuses races d'animaux (bovins, ovins, porcins, caprins, volailles et surtout équidés). Dans tous les cas l'amélioration obtenu est de l'ordre de 10 à 15% environ, ce chiffre étant obtenu par des mesures comparées de la vitalité et de la mobilité des spermatozoldes au moment de leur utilisation, c'est-à-dire après conservation. I1 was found that thanks to the invention we could improve the results of archaeological insemination operations obtained with many breeds of animals (cattle, sheep, pigs, goats, poultry and especially horses). In all cases the improvement obtained is around 10 to 15% approximately, this figure being obtained by comparative measurements of the vitality and the mobility of the sperm at the time of their use, that is to say after conservation.
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8309099A FR2546755B1 (en) | 1983-06-01 | 1983-06-01 | PROCESS FOR THE PRESERVATION OF SEMEN ESPECIALLY HORSES |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8309099A FR2546755B1 (en) | 1983-06-01 | 1983-06-01 | PROCESS FOR THE PRESERVATION OF SEMEN ESPECIALLY HORSES |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2546755A1 true FR2546755A1 (en) | 1984-12-07 |
| FR2546755B1 FR2546755B1 (en) | 1986-04-25 |
Family
ID=9289392
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR8309099A Expired FR2546755B1 (en) | 1983-06-01 | 1983-06-01 | PROCESS FOR THE PRESERVATION OF SEMEN ESPECIALLY HORSES |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2546755B1 (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2664156A1 (en) * | 1990-07-06 | 1992-01-10 | Siam 2000 | Device for treating and packing of animal semen intended for artificial insemination |
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| FR2746591A1 (en) * | 1996-03-28 | 1997-10-03 | Envt Toulouse | Medium for preserving donkey sperm |
| EP0966196A1 (en) * | 1995-12-15 | 1999-12-29 | Cryopreservation Technologies CC | Composition for organ cryopreservation and treatment of viral and bacterial infections |
-
1983
- 1983-06-01 FR FR8309099A patent/FR2546755B1/en not_active Expired
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2546755B1 (en) | 1986-04-25 |
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