FR2544742A1

FR2544742A1 - Process for selecting phenol derivatives which are capable of forming a stable mixture with urease in aqueous solution and application to the assay of urea

Info

Publication number: FR2544742A1
Application number: FR8306690A
Authority: FR
Inventors: Gilberte Cam; Jean-Luc Barrier; Francois Lawny
Original assignee: Laboratoires Biotrol SA
Current assignee: Laboratoires Biotrol SA
Priority date: 1983-04-22
Filing date: 1983-04-22
Publication date: 1984-10-26
Also published as: FR2544742B1

Abstract

The invention consists in selecting phenol derivatives which are capable of allowing the enzymatic assay of urea in two stages instead of three. These derivatives should be stable in the presence of the urease and should provide a satisfactory colorimetric reading. The use of thymol, meta-cresol, 2-phenylphenol, 2,3-dichlorophenol or tricresol, among others, is thus proposed. Application to the assay of urea in blood serum.

Description

L'invention a pour objet un procédé de sélection de dérivés phénoliques capables de former un mélange stable avec l'uréase en solution aqueuse. Elle concerne également 1 appli- cation de ce procédé au dosage de l'urée par voie enzymatique et notamment des procédé et réactifs convenant pour un tel dosage. The subject of the invention is a process for the selection of phenolic derivatives capable of forming a stable mixture with urease in aqueous solution. It also relates to the application of this method to the determination of urea enzymatically and in particular to processes and reagents suitable for such an assay.

La réaction de BERTHELOT pour le dosage de l'ammoniac, conduisant à un produit coloré du type indophénol, est très ancienne (M. BERTHELOT, Répertoire de Chimie Appliquée, édité par la Société Chimique de PARIS 1, 284, (1859))
Cette réaction est couramment appliquée à la détermination de l'urée par voie enzymatique (FAWC7ETT J.K., SCOUT J.E.The BERTHELOT reaction for the determination of ammonia, leading to a colored product of the indophenol type, is very old (M. BERTHELOT, Directory of Applied Chemistry, published by the Chemical Society of PARIS 1, 284, (1859))
This reaction is commonly applied to the enzymatic determination of urea (FAWC7ETT JK, SCOUT JE

J. Clin. Path., 1960, 13, 156). En effet, l'hydrolyse de l'u rée par l'uréase libère de façon stoechiométrique de l'ammoni ac
La séquence des réactions peut etre illustrée comme suit : (PATTON et al - Anal. Chem. 49, 464, 1977)

J. Clin. Path., 1960, 13, 156). In fact, the hydrolysis of urea by urease liberates stoichiometrically from ammonia.
The sequence of reactions can be illustrated as follows (PATTON et al., Anal Chem 49, 464, 1977).

Le nitroprussiate qui sert de catalyseur au cours de la réaction II. peut également être remplacé par de l'aquopentacyanoferrate.Classiquement cette réaction est faite en trois étapes, matérialisées par trois réactifs séparés
- une étape impliquant l'action de 1'uréase, avec libération quantitative d'ammoniac (réaction I)
- une étape impliquant l'utilisation d'un phénol et de nitroprussiate (ou catalyseur équivalent) (réaction III),
- une étape de coloration avec addition d'ions hypoch lorite et OR - (réaction II).The nitroprusside which serves as a catalyst during the reaction II. can also be replaced by aquopentacyanoferrate.Classically this reaction is made in three steps, materialized by three separate reagents
a step involving the action of the urease, with quantitative release of ammonia (reaction I)
a step involving the use of a phenol and nitroprusside (or equivalent catalyst) (reaction III),
a staining step with addition of hypochlorite and OR ions (reaction II).

Dans la pratique, le nonbre des étapes (et des réactifs correspondants)ne peut pas entre réduit autant qu'on le désire en raison des risques d'interaction et d'inactivation des ré actifs. Ainsi, l'uréase peut être facilement dénaturée en présence de phénol et/ou d'hypochlorite de sodium --e glus, le mélange phénol-hypochlorite per très rapidement son poutoir de réaction, et ces réactifs doivent etre ajoutés séparément, et dans l'ordre phénol - hypochiorite. In practice, the number of steps (and corresponding reagents) can not be reduced as much as desired because of the risks of interaction and inactivation of the reagents. Thus, the urease can easily be denatured in the presence of phenol and / or sodium hypochlorite, the phenol-hypochlorite mixture very rapidly has its reaction pusher, and these reagents must be added separately, and Phenol - hypochlorite order.

Le choix d'un dérivé phénolique approprié est donc important, dès lors qu'il est souhaité de diminuer le nombre d'étapes du dosage de l'urée, en particulier en passant de trois à deux étapes en vue de mieux satisfaire notamment au: exigences des équipements automatiques d'analyse. The choice of a suitable phenol derivative is therefore important, since it is desired to reduce the number of steps of the urea assay, in particular by going from three to two stages in order to better satisfy in particular: requirements of automatic analysis equipment.

Le brevet français 79 22994 (publication 2.436.185) décri. déjà un procédé de détermination de l'urée, qui utilise la technique générale décrite précédemment mais qui, grâce au choix d-un dérivé phénolique particulier, à savoir d'un dérivé aromatique portant en plus du groupement OH du phénol, au moins une fonction acide carboxylique sur le noyau, permet de réduire à deux le nombre de réactifs et d'étapes nécessaires au dosage.Des exemples représentatifs de tels phénols sont l'acide salicylique et ses dérivés,
L'enseignement du brevet français publié sous le n0 2,436.185 est limité à l'utilisation de dérivés phénoliques déterminés, Cependant, de nombreux phénols substitués sont envisageables pour la réaction de BERTHELCT. On peut également observer que la mise en oeuvre d'acide salicylique en vue du dosage de l'urée avait déjà été proposée - il est vrai dans une réaction en trois étapes - voir (SEARCY R.L., REARDON JE. French patent 79 22994 (publication 2.436.185) decri. already a method for determining urea, which uses the general technique described above but which, thanks to the choice of a particular phenolic derivative, namely an aromatic derivative bearing in addition to the OH group of phenol, at least one function carboxylic acid on the ring, reduces to two the number of reagents and steps required for the dosage. Representative examples of such phenols are salicylic acid and its derivatives,
The teaching of the French patent published under No. 2,436,185 is limited to the use of specific phenolic derivatives. However, many substituted phenols are conceivable for the BERTHELCT reaction. It can also be observed that the use of salicylic acid for the determination of urea has already been proposed - it is true in a three-step reaction - see (SEARCY RL, REARDON JE.

et FOREUSE JA., Am. J. of ed. Techn. - 1967, 33, 151. and JA FOREUSE, Am. J. of ed. Techn. - 1967, 33, 151.

Il est souhaitable de trouver d'autres dérivés phénoli ques permettant de réduire de trois à deux le nombre d'étapes de la réaction de dosage et conduisant à des résultats meilleurs que l'acide salicylique ou ses dérivés. It is desirable to find other phenolic derivatives which reduce the number of steps in the assay reaction from three to two and lead to better results than salicylic acid or its derivatives.

invention a donc pour premier objet un procédé géné- ral de sélection de dérivés phénoliques capables de former un mélange stable avec l'uréase en solution aqueuse et, par conséquent, capables d'entre utilisés dans un procédé en deux étapes de dosage de l'urée par voie enzymatique selon la technique connue. The invention therefore has as its first object a general process for the selection of phenolic derivatives capable of forming a stable mixture with urease in aqueous solution and, therefore, capable of being used in a two-step process for the determination of urea enzymatically according to the known technique.

L'invention concerne donc un tel procédé de sélection caractérisé en ce qu'on prépare un certain nombre de solutions d'essai constituées chacune d'une solution aqueuse du dérivé phénolique à essayer, la gamme de solutions d'essai étant réa lisée à diverses concentrations du dérivé phénolique à partir de 0,1 g/l, encre qu'on ajuste le pH desdites solutions d'essai à une valeur faiblement basique, en ce qu'on ajoute aux solutions d'essai une quantité déterminée d'uréase, cette quantité étant la même pour chaque solution d'essai, en ce qu'on constitue des échantillons en prélevant un volume déterminé et identique de chaque solution d'essai. en ce qu'on ajoute à chaque échantillon une merle quantité d'une solution d'urée à une concentration correspondant à celle habituellement rencontrée dans les fluides biologiques, en ce qu'on ajoute ensuite à chaque échantillon une mime quantité d'une solution capable de libérer des ions ClO dans le milieu aqueux et de provoquer la coloration de celui-ci, et en ce qu'on apprécis l'importance de la coloration par une technique colorimétrique connue, en ce qu'on sélectionne, dans la gamme d'échantillons de solutions d'essai, celui qui donne la plus forte absorbance et en ce que, en partant de cet échantillon sélectionné et en appliquant le mme mode opératoire avec diverses concentrations d'urée, on vérifie que l'intensité de la coloration obtenue varie linéairement avec la concentration d'urée, et en ce qu'on vérifie enfin que sensiblement les m8- mes résultats sont obtenus après vieillissement des échantil- lons contenant simultanément le dérivé phénolique et l'uréase, après quoi on sélectionne le dérivé phénolique qui a satisfait à tous les essais précédents. The invention therefore relates to such a selection process characterized in that a number of test solutions are prepared, each consisting of an aqueous solution of the phenolic derivative to be tested, the range of test solutions being made to various concentrations of the phenol derivative from 0.1 g / l, in which the pH of said test solutions is adjusted to a weakly basic value, in that a determined amount of urease is added to the test solutions, this amount being the same for each test solution, in that samples are formed by taking a determined and identical volume of each test solution. in that a quantity of a solution of urea at a concentration corresponding to that usually encountered in the biological fluids is added to each sample, in that a similar quantity of a solution capable of to release ClO ions in the aqueous medium and to cause the coloration thereof, and in that the importance of the coloration is appreciated by a known colorimetric technique, in that one selects, in the range of samples of test solutions, the one which gives the highest absorbance and in that, starting from this selected sample and applying the same procedure with various concentrations of urea, it is verified that the intensity of the coloration obtained varies linearly with the concentration of urea, and in that finally it is verified that substantially the same results are obtained after aging of the samples containing simultaneously the phenolic derivative and urease, after which the phenol derivative is selected which has satisfied all previous tests.

Selon l'invention, --on commence par préparer un certain nombre de solutions d'essai en dissolvant dans l'eau des quantités variables du dérivé phénolique à essayer. Les dérivés phénoliques trop faiblement solubles dans l'eau sont à éliminer d'emblée. C'est pourquoi il convient de partir d'une concentration minimale de 0,1 g/l de dérivé phénolique. Dans la pratique, une gamme de concentrations satisfaisantes en dérivé phénolique se situe entre 0,1 g/l et 10 g/l. Il se peut toutefois que certains dérivés phénoliques ne soient pas solubles dans l'eau jusqu'à 10 g/l. Dans ce cas, il convient de se limiter à la concentration de saturation à + 4 C en solution aqueuse. According to the invention, a number of test solutions are first prepared by dissolving variable amounts of the phenolic derivative to be tested in water. Phenolic derivatives too poorly soluble in water are to be eliminated immediately. This is why it is necessary to start from a minimum concentration of 0.1 g / l of phenol derivative. In practice, a range of satisfactory concentrations of phenolic derivative is between 0.1 g / l and 10 g / l. However, some phenol derivatives may not be soluble in water up to 10 g / l. In this case, it is appropriate to limit the saturation concentration to + 4 C in aqueous solution.

On ajuste ensuite chacune des solutions d'essai à un pH faiblement basique, de préférence compris entre 7 et 8 en viron. On peut utiliser à cet effet tous moyens connus de 1'homme du métier. Il suffit de tamponner chaque solution par addition de sels de phosphates, en quantité appropriée pour assurer le pH. Each of the test solutions is then adjusted to a weakly basic pH, preferably between 7 and 8, in the water. Any means known to those skilled in the art can be used for this purpose. It suffices to buffer each solution by addition of phosphate salts, in an amount appropriate to ensure the pH.

Chaque solution d'essai est alors additionnée d'une quantité déterminée d'uréase. La quantité d'uréase n'est pas critique. On peut par exemple mettre en oeuvre 2.000 à 10.000 et notamment 5.000 unités d'uréase par litre de solution pour chaque solution d'essai. L'essentiel est d'obtenir des résultats comparables pour toute la gamme de solutions d'essai contenant des concentrations variées de dérivé phénolique. Each test solution is then supplemented with a determined amount of urease. The amount of urease is not critical. For example, it is possible to use 2,000 to 10,000 and in particular 5,000 units of urease per liter of solution for each test solution. The key is to obtain comparable results for the entire range of test solutions containing varying concentrations of phenol derivative.

A partir des solutions d'essai, contenant simultanément le dérivé phénolique et 1' uréase, on prélève un volume déterminé pour constituer des échantillons correspondant à chaque solution. On ajoute alors à chaque échantillon une mebme quantité d'une solution d'urée à une concentration correspondant à celle habituellement rencontrée dans les fluides biologiques. From the test solutions, containing simultaneously the phenolic derivative and the urease, a determined volume is taken to form samples corresponding to each solution. Each sample is then added the same quantity of a urea solution at a concentration corresponding to that usually encountered in biological fluids.

La concentration d'urée mise en oeuvre n'est pas critique Etant donné que les dérivés phénoliques à sélectionner seront avantageusement utilisés pour le dosage de l'urée dans le sang,
il convient de mettre en oeuvre des concentrations d'urée de l'ordre de 0,2 g/l à 5 g/l, et par exemple de I g/l.The concentration of urea used is not critical Since the phenolic derivatives to be selected will be advantageously used for the determination of urea in the blood,
it is appropriate to use urea concentrations of the order of 0.2 g / l to 5 g / l, and for example 1 g / l.

On laisse en contact l'urée et l'échantillon contenant le dérivé phénolique et l'uréase pendant une durée suffisante pour que l'urée soit décomposée totalement par l'uréase. Psur accélérer la réaction, il est intéressant mais non indispensable de chauffer modérément les échantillons. par exemple à 37 C. Les conditions de température doivent entre identiques pour tous les échantillons essayés. Cependant, il est également possible de travailler à la température ambiante. The urea and the sample containing the phenolic derivative and the urease are left in contact for a time sufficient for the urea to be completely decomposed by the urease. To accelerate the reaction, it is interesting but not necessary to heat the samples moderately. for example at 37 C. The temperature conditions must be identical for all the samples tested. However, it is also possible to work at room temperature.

Lorsque la réaction entre l'urée et l'uréase est terminée, on ajoute à chaque échantillon une meme quantité d'une solution capable de libérer des ions ClO . Une telle solution peut être une solution d'hypochlorite de sodium, par exemple à une concentration de 6 à 60 sol/l. On peut également faire appel à une solution ayant une fonction similaire, par exemple une solution de dichloro-isocyanurate de sodium dans de l'hy- droxyde de sodium, par exemple une solution de dichloro-iso- cyanurate de sodium à 3 à 30 mmol/1 dans de l'hydroxyde de sodium en solution à 150 à 750 mmol/l. D'une manière connue, l'- addition d'une telle solution provoque l'apparition d'une co- loration dans le milieu. Selon l'invention, il faut que le dé- rive phénolique à sélectionner procure une coloration satis-
faisante. On sélectionne donc2 dans la gamme d'échantillons de solutions d'essai, celui qui donne la plus forte absorbance
lors des mesures colorimétriques.Dans la pratique, on apprécie par rapport à un échantillon de référence, l'apparition d'une coloration supérieure à 0,1 unité d'absorbance au sommet du pic d'absorption, pour un échantillon correspondant à une concentration d'urée de 1 g/l. Dans ces conditions, la coloration peut être appréciée d'une manière quantitative, pour des valeurs inférieures à 0,1 unité d'absorbance, l'appréciation pourrait n'être que qualitative.When the reaction between urea and urease is complete, a same amount of a solution capable of releasing ClO ions is added to each sample. Such a solution may be a solution of sodium hypochlorite, for example at a concentration of 6 to 60 sol / l. It is also possible to use a solution having a similar function, for example a solution of sodium dichloroisocyanurate in sodium hydroxide, for example a solution of sodium dichloroisocyanurate at 3 to 30 mmol. / 1 in sodium hydroxide in solution at 150 to 750 mmol / l. In a known manner, the addition of such a solution causes the appearance of a coloration in the medium. According to the invention, it is necessary that the phenolic derivative to be selected provides a satisfactory coloration.
tory. Thus, in the range of test solution samples, the one that gives the highest absorbance is selected.
in colorimetric measurements. In practice, the appearance of a coloration greater than 0.1 absorbance units at the peak of the absorption peak, for a sample corresponding to a concentration, is preferred with respect to a reference sample. urea of 1 g / l. Under these conditions, the coloration can be assessed in a quantitative manner, for values less than 0.1 absorbance unit, the assessment could be only qualitative.

Une fois que l'on a constaté que le dérivé phénolique à essayer fournissait une intensité de coloration satisfaisant aux exigences précitées, on soumet ce même dérivé phénolique à une vérification complémentaire en appliquant le mme mode opératoire que ci-dessus, mais avec diverses concentrations d'urée, pour s assurer que l'intensité de la coloration obtenue varie linéairement avec la concentration d'urée. Il s'agit là, en effet, d'une condition importante pour réaliser des dosages d'urée dans le sang. Once it has been found that the phenol derivative to be tested provides a coloration intensity satisfying the above requirements, the same phenol derivative is subjected to further verification by applying the same procedure as above, but with various concentrations of the same. urea, to ensure that the intensity of the coloration obtained varies linearly with the concentration of urea. This is, indeed, an important condition for performing dosages of urea in the blood.

Le dernier critère de sélection est que le dérivé phénolique soit stable en présence d'uréase. Pour cette raison on vérifie enfin que l'on obtient sensiblement les mêmes résultats après vieillissement des échantillons contenant simul tanément le dérivé phénolique et l'uréase. Il suffit pour cela de laisser par exemple vieillir l'échantillon à concentration optimale pendant 24 heures b 37 C. On sélectionne seulement les dérivés phénoliques qui permettent la conservation des performances à '.'issue de cette période de vieillissement. The last selection criterion is that the phenolic derivative is stable in the presence of urease. For this reason it is finally verified that one obtains substantially the same results after aging of the samples simultaneously containing the phenolic derivative and the urease. For this purpose, it suffices for example to leave the sample at optimum concentration for 24 hours at 37 ° C. Only the phenolic derivatives which allow the conservation of the performances at the end of this period of aging are selected.

Grâce au procédé de l'invention, on a pu déterminer que de nombreux dérivés phénolîques peuvent etre selectionnés pour servir au dosage enzymatique de l'urée, en permettant de réduire à deux le nombre d'étapes et de réactifs, dès lors que cr dérivés phénoliques formaient un mélange stable avec l'u- réase. On peut ainsi constituer un coffret de réactifs de dosage de l'urée dans lequel le premier réactif coni @@ simul tanément le dérivé phénolique considéré, l'uréase et le catalyseur, en particulier le nitroprussiate. On a constaté égale- ment que certains phénols sélectionnés conformément au procédé de l'invention, fournissaient des résultats meilleurs que i'a- cide salicylique ou ses dérivés, lorsqu'on les utilise comme réactifs pour le dosage enzymatique de l'urée. Il en est ainsi notamment du thymol, du méta-crésol et du phényl-2-phénol. i'- autres phénols satisfaisants sont par exemple le 2-3-dichloro- phénol, et le tricrésol, qui fournissent des résultats au moins équivalents à l'acide salicylique. Thanks to the method of the invention, it has been determined that many phenol derivatives can be selected for use in the enzymatic assay of urea, allowing to reduce to two the number of stages and reagents, since cr derivatives phenolic compounds formed a stable mixture with the uasease. It is thus possible to constitute a set of urea assay reagents in which the first reagent simultaneously simulates the phenolic derivative in question, the urease and the catalyst, in particular nitroprusside. It has also been found that certain phenols selected according to the process of the invention provide better results than salicylic acid or its derivatives when used as reagents for the enzymatic determination of urea. This is particularly the case of thymol, meta-cresol and phenyl-2-phenol. Other suitable phenols are, for example, 2, 3-dichlorophenol, and tricresol, which give results at least equivalent to salicylic acid.

En revanche, le procédé de l'invention a permis de constater que certains dérivés phénoliques ne conviennent pas du tout pour le dosage enzymatique de l'urée. Par exemple, le 3-chlorophénol dénature l'uréase en quelques heures. D'autres phénols sont à écarter car ils ne produisent pas une coloration satisfaisante. C'est le cas par exemple du 3-4-dîchlorophénol ou du 3-5-dichlorophénol. On a indiqué dans un tableau annexe des exemples illustratifs de dérivés phénoliques qui ont été sélectionnés par le procédé de l'invention ou, au contraire. In contrast, the process of the invention has shown that certain phenol derivatives are not suitable at all for the enzymatic determination of urea. For example, 3-chlorophenol denatures urease in a few hours. Other phenols are to be discarded because they do not produce a satisfactory coloration. This is the case for example 3-4-dichlorophenol or 3-5-dichlorophenol. Illustrative examples of phenolic derivatives which have been selected by the process of the invention or, conversely, are indicated in an accompanying table.

écartés par la mise en oeuvre dudit procédé.separated by the implementation of said method.

L'invention a également pour objet l'application du procédé de sélection de dérivés phénoliques, décrit précédemment, au dosage enzymatique de l'urée par la technique généra- le de colorimétrie. L'invention concerne en particulier une composition de réactifs comprenant un dérivé phénolique, autre qu'un dérivé portant au moins une fonction acide carboxylique sur le noyau, de l'uréase, un composé capable de faire fonction de catalyseur au cours de la réaction ultérieure avec des ions hypochlorites, et au besoin un tampon. Cette composition de réactifs est destinée à être mélangée avec le produit à analyser contenant de l'urée, pour etre ensuite additionnée d- hypochlorite de sodium ou de solution équivalente, par exemple de solution de dichloro-isocyanurate de sodium dans de l'hy- droxyde de sodium, ce qui donne naissance à une coloration qui peut être lue de manière connue par une technique photométri- que. Les conditions de mise en oeuvre d'un tel procédé de dosage enzymatique de l'urée n'ont pas besoin d'entre décrites
plus en détail car elles sont bien connues de l'homme du mé-
tie et accessibles à lui grace aux différentes références
bibliographiques mentionnées au début du présent mémoire des
criptif.The invention also relates to the application of the method for selecting phenolic derivatives, described above, to the enzymatic determination of urea by the general technique of colorimetry. In particular, the invention relates to a reagent composition comprising a phenolic derivative, other than a derivative carrying at least one carboxylic acid function on the ring, of urease, a compound capable of acting as a catalyst during the subsequent reaction. with hypochlorite ions, and if necessary a buffer. This reagent composition is intended to be mixed with the analyte containing urea, followed by the addition of sodium hypochlorite or equivalent solution, for example sodium dichloroisocyanurate solution in water. sodium hydroxide, which gives rise to a coloration which can be read in a known manner by a photometric technique. The conditions for implementing such a method for the enzymatic determination of urea do not need to be described.
in more detail because they are well known to the man of the
accessible to him thanks to the different references
bibliographical references mentioned at the beginning of this
scriptive.

L'invention sera illustrée sans être aucunement limitée
par les exemples suivants. Dans ces exemples, le procédé de
l'invention a été mis en oeuvre selon le protocole expérimen
tal précis ci aprbs. Dans la suite de la description, les ex-
pressions '1dérivés phénolés" et "dérivés phénoliques" ont été
employées indifféremment et sont complètement interchangeables
On prépare une gamme de concentrations en dérivés phé-
nolés de 0,1 gZl à 10 g/l dans l'eau. Il se peut que certains
dérivés ne soient pas solubles dans l'eau jusqu'à 10 g/1. Dans
ce cas, on se limite à la concentration saturante à + 40C en j solution aqueuse.On tamponne chaque solution à un pH compris
entre 7 et 8 par addition de sels de phosphates, en quantités
simplement suffisantes pour assurer le pH. On ajoute alors
5000 unités d'uréase par litre de solution pour chaque point
de la gamme.The invention will be illustrated without being limited in any way
by the following examples. In these examples, the method of
the invention was implemented according to the experimental protocol
precise after this. In the rest of the description, the ex-
"Phenol derivatives" and "Phenolic derivatives" have been
used interchangeably and are completely interchangeable
A range of concentrations of ph
0.1 gZl to 10 g / l in water. It may be that some
derivatives are not soluble in water up to 10 g / 1. In
in this case, it is limited to the saturating concentration at + 40C in aqueous solution. Each solution is buffered at pH inclusive
between 7 and 8 by addition of phosphate salts, in
simply sufficient to ensure the pH. We then add
5000 units of urease per liter of solution for each point
from the range.

On prépare par ailleurs une solution de dichloro-iso
cyanurate de sodium à 5 g/l dans de la soude 0,45 N. On prend
1 mi de chaque solution contenant de l'uréase et on porte à
37 C. On ajoute 10/ul de solution d'urée à 1 g/l. Deux minutes
plus tard exactement, on ajoute 0,2 ml de dichloro-isocyanura-
te.In addition, a dichloro-iso solution is prepared.
sodium cyanurate at 5 g / l in 0.45 N sodium hydroxide.
1 ml of each solution containing urease and
C. 10 μl of 1 g / l urea solution are added. Two minutes
later, 0.2 ml of dichloroisocyanurate is added
you.

On apprécie, par rapport à un blanc échantillon, l'ap
parition d'une coloration supérieure à 0,1 unité d'absorbance
au sommet du pic d'absorption. On sélectionne, dans la gamme
de concentrations, celle qui donne la plus forte absorbance.We appreciate, compared to a white sample, the ap
coloration greater than 0.1 absorbance units
at the peak of the absorption peak. We select, in the range
concentrations, the one that gives the highest absorbance.

On vérifie alors, en utilisant le même mode opératoire
(37 C, dilution de l'échantillon au 1/10 1, volume de dichlo
ro-isocyanurate égal au 1/5 du volume du premier réactif),
que la coloration obtenue est linéaire par rapport à la con
centration d'urée de l'échantillon, au moins jusqu'à la con
centration d'urée de 1 g/l dans l'échantillon.We then check, using the same procedure
(37 C, dilution of the sample to 1/10 1, volume of dichlo
ro-isocyanurate equal to 1/5 of the volume of the first reagent),
that the coloration obtained is linear with respect to the con
Urea concentration of the sample, at least until the con
urea concentration of 1 g / l in the sample.

Le mélange à une concentration optimale contenant l'u
réase est encore mis en vieillissement 24 h à 37 C. Seuls les
dérivés phénols, mélangés à l'uréase et permettant la con
servation des performances suivant le même mode opératoire a près 24 h à 37 C, sont sélectionnés pour être utilisables pour la constitution d'un coffret de dosage de l'urée.The mixture at an optimal concentration containing the
is still aging for 24 hours at 37 C. Only the
derivatives phenols, mixed with urease and allowing con
performance service following the same procedure at 24 h to 37 C, are selected to be used for the constitution of a urea dosing cabinet.

EXEMPLES 1 à 3.EXAMPLES 1 to 3

On a préparé les solutions suivantes
Composants de la solution pour 1 litre
Exemple 1
- Phosphate hydrogénodipotassique, anhydre ... 2,14 g
- Thymol 0. 0,5 g
- Nitroprussiate de sodium ................ 1 g
- Uréase 0 5000 unités
(1 unité d'uréase transforme i umole d'urée
par minute à 250C).The following solutions have been prepared
Components of the solution for 1 liter
Example 1
- Hydrogenodipotassic phosphate, anhydrous ... 2.14 g
- Thymol 0.5 g
- Sodium nitroprusside ............... 1 g
- Urease 0 5000 units
(1 unit of urease transforms i umole of urea
per minute at 250C).

Exemple 2
- Phosphate hydrogénodipotassique, anhydre ... 1,05 g
- Méta-crésol , 0,5 ml
- Nitroprussiate de sodium .................. s g
- Uréase .................................. 5000 unités
Exemple 3
- Phosphate hydrogénodipotassique, anhydre ... 2,50 g
- 3-chlorophénol ......................... 6,5 ml
- Nitroprussiate de sodium .................... 1 g
- Uréase .................................. 5000 unités
On prépare par ailleurs la solution suivante (solution S)
- Hydroxyde de sodium .................. 18 g/l
- Dichloro-isocyanure de sodium 0. 5 g/l.Example 2
- Hydrogenodipotassium phosphate, anhydrous ... 1.05 g
- Meta-cresol, 0.5 ml
- Sodium nitroprusside .................. sg
- Urease .................................. 5000 units
Example 3
- Hydrogenodipotassic phosphate, anhydrous ... 2.50 g
- 3-chlorophenol ......................... 6.5 ml
- Sodium nitroprusside .................... 1 g
- Urease .................................. 5000 units
The following solution is also prepared (solution S)
- Sodium hydroxide .................. 18 g / l
Sodium dichloroisocyanide 0.5 g / l.

On mélange 1 ml des solutions de chacun des Exemples I à 3 à 10/ul d'un échantillon d'urée à 1 g/l, et on incube 2 mn à 37 C. Puis on ajoute 0,2 ml de solution S à chacun des mélan- ges, et on incube 3 mn à 37 C.1 ml of the solutions of each of Examples I is mixed with 3 to 10 μl of a 1 g / l urea sample and incubated for 2 minutes at 37 ° C. Then 0.2 ml of solution S is added to each of the mixtures, and incubated for 3 minutes at 37.degree.

L'absorbance des mélanges est lue à 600 nm, et l'on obtient
1,02 (Ex. 1), 1,05 (Ex. 2), 1,1 (Ex. 3).The absorbance of the mixtures is read at 600 nm, and we obtain
1.02 (Ex 1), 1.05 (Ex 2), 1.1 (Ex 3).

Les solutions des Ex. 1, 2 et 3 sont conserves alors 24 h à 37 C et les essais sont recommencés dans les memes conditions. Les absorbances lues sont alors
1,05 (Ex. 1), 1,05 (Ex. 2), 0,2 (Ex. 3).The solutions of Ex. 1, 2 and 3 are then stored for 24 hours at 37 ° C. and the tests are repeated under the same conditions. The absorbances read are then
1.05 (Ex 1), 1.05 (Ex 2), 0.2 (Ex 3).

On constate l'effondrement des performances de la solution de l'Ex. 3. There is a collapse in the performance of the Ex solution. 3.

le Tabieau I qui suit résume les constatations expérimentales relatives à divers dérivés phénolés, y compris ceux des Exemples 1 à 3 précédents. Table I below summarizes the experimental findings relating to various phenol derivatives, including those of Examples 1 to 3 above.

On a également comparé l'aptitude à la conservation des dérivés phénolés, sélectionnés selon l'invention, au salicylate de sodium. Chaque dérivé a été mélangé au nitroprus- siate de sodium et à l'uréase comme dans les Ex. 1 à 3 précé dents. On a effectué les mesures immédiatement (temps O)et après vieillissement de 72 heures à 37C Les résultats sont consignés dans le Tableau II qui suit. The preservability of the phenol derivatives selected according to the invention was also compared with sodium salicylate. Each derivative was mixed with sodium nitroprusate and urease as in Ex. 1-3 above. The measurements were taken immediately (time O) and after aging for 72 hours at 37 ° C. The results are shown in Table II which follows.

On voit que la plupart des dérivés phénols sélection nés selon l'invention sont supérieures au salicylate, en particulier le phényl-2-pbénol, le méta-crésol et le thymol
Pour les essais dont les résultats sont rapportés dans le tableau II, on a opéré conformément au protocole précédent en utilisant une concentration d'urée de 1 g/l dans l'échan- tillon. La notation D.O. désigne l'absorbance. It can be seen that most of the selected phenol derivatives born according to the invention are superior to salicylate, in particular phenyl-2-phenol, meta-cresol and thymol.
For the tests whose results are reported in Table II, the procedure was carried out in accordance with the previous protocol using a urea concentration of 1 g / l in the sample. The notation DO denotes the absorbance.

TABLEAU I.

TABLE I.

<SEP> DERIVES <SEP> PHENOLES <SEP> TESTES <SEP> OBSERVATIONS
<tb> - <SEP> 4-chlorophénol <SEP> 10 <SEP> g/l <SEP> Couteur <SEP> vert <SEP> sale <SEP> à <SEP> rejeter
<tb> - <SEP> 4-chloro-3-méthyl <SEP> phénol <SEP> 10 <SEP> g/l <SEP> Couleur <SEP> vert <SEP> sale <SEP> à <SEP> rejeter
<tb> - <SEP> 3,4 <SEP> dichlorophénol <SEP> 10 <SEP> g/l <SEP> Couteur <SEP> jaune <SEP> c'est <SEP> la <SEP> couleur <SEP> du <SEP> "blanc" <SEP> #
<tb> - <SEP> 3-5 <SEP> dichlorophénol <SEP> 10 <SEP> g/l <SEP> Couleur <SEP> jaune <SEP> # <SEP> absence <SEP> de <SEP> coloration <SEP> spécifique
<tb> <SEP> (Nota <SEP> :<SEP> il <SEP> s'agit <SEP> d'ine <SEP> inhibi
<SEP> tion <SEP> de <SEP> l'uréase)
<tb> - <SEP> 2-3 <SEP> dichlorophénol <SEP> 10 <SEP> g/l <SEP> Couleur <SEP> vert <SEP> printemps
<tb> - <SEP> 3-5 <SEP> dichloro-4-hydroxybenzène <SEP> 10 <SEP> g/l <SEP> Couleur <SEP> jaune <SEP> non <SEP> spécifique <SEP> - <SEP> Inhibition <SEP> de
<tb> <SEP> sulfonate <SEP> l'uréase
<tb> - <SEP> 3-5 <SEP> dichloro-4-hydroxybenzène <SEP> 1 <SEP> g/l <SEP> Couleur <SEP> jaune <SEP> non <SEP> spécifique <SEP> - <SEP> Inhibition <SEP> de
<tb> <SEP> sulfonate <SEP> l'uréase
<tb> - <SEP> 2-3 <SEP> dichlorophénol <SEP> 0,5 <SEP> g/l <SEP> Résultat <SEP> optimum <SEP> a <SEP> la <SEP> con - <SEP> 2-3 <SEP> dichlorophénol <SEP> 1 <SEP> g/l <SEP> centration <SEP> de <SEP> 2 <SEP> g/1
<tb> - <SEP> 2-3 <SEP> dichlorophénol <SEP> 2 <SEP> g/l <SEP> # <SEP> Coloration <SEP> verte <SEP> Matheureusement <SEP> l'urénse <SEP> ne
<tb> - <SEP> 2-3 <SEP> dichlorophénol <SEP> 5 <SEP> g/l <SEP> se <SEP> conserve <SEP> pas <SEP> 24 <SEP> h <SEP> à <SEP> 37 C
<tb> - <SEP> 3-chlorophénol <SEP> 6,5 <SEP> g/l <SEP> Couleur <SEP> verte. <SEP> Trouble <SEP> du <SEP> réactif <SEP> après <SEP> addiion
<tb> <SEP> de <SEP> l'uréase, <SEP> mais <SEP> ce <SEP> trouble <SEP> dis
<SEP> paraît <SEP> avec <SEP> l'addition <SEP> du <SEP> dichlo
<SEP> roisocyanurate. <SEP> Mache <SEP> à <SEP> temps
<SEP> 0 <SEP> mais <SEP> ne <SEP> marche <SEP> plus <SEP> après <SEP> 24 <SEP> h
<tb> <SEP> à <SEP> + <SEP> 4 C.
<tb><SEP> DERIVATIVES <SEP> PHENOLAS <SEP> TESTS <SEP> OBSERVATIONS
<tb> - <SEP> 4-chlorophenol <SEP> 10 <SEP> g / l <SEP> Cutter <SEP> green <SEP> dirty <SEP> to <SEP> reject
<tb> - <SEP> 4-chloro-3-methyl <SEP> phenol <SEP> 10 <SEP> g / l <SEP> Color <SEP> green <SEP> dirty <SEP> to <SEP> reject
<tb> - <SEP> 3,4 <SEP> dichlorophenol <SEP> 10 <SEP> g / l <SEP> Cutter <SEP> yellow <SEP> it is <SEP> the <SEP> color <SEP> of <SEP>"white"<SEP>#
<tb> - <SEP> 3-5 <SEP> dichlorophenol <SEP> 10 <SEP> g / l <SEP> Color <SEP> yellow <SEP>#<SEP> absence <SEP> of <SEP> staining <SEP > specific
<tb><SEP> (Note <SEP>: <SEP> it <SEP> is <SEP> of ine <SEP> inhibited
<SEP> tion <SEP> of <SEP> urease)
<tb> - <SEP> 2-3 <SEP> dichlorophenol <SEP> 10 <SEP> g / l <SEP> Color <SEP> green <SEP> spring
<tb> - <SEP> 3-5 <SEP> dichloro-4-hydroxybenzene <SEP> 10 <SEP> g / l <SEP> Color <SEP> yellow <SEP> no <SEP> specific <SEP> - <SEP > Inhibition <SEP> of
<tb><SEP> sulfonate <SEP> urease
<tb> - <SEP> 3-5 <SEP> dichloro-4-hydroxybenzene <SEP> 1 <SEP> g / l <SEP> Color <SEP> yellow <SEP> no <SEP> specific <SEP> - <SEP > Inhibition <SEP> of
<tb><SEP> sulfonate <SEP> urease
<tb> - <SEP> 2-3 <SEP> dichlorophenol <SEP> 0.5 <SEP> g / l <SEP> Result <SEP> optimum <SEP> a <SEP> the <SEP> con - <SEP> 2-3 <SEP> dichlorophenol <SEP> 1 <SEP> g / l <SEP> centration <SEP> of <SEP> 2 <SEP> g / 1
<tb> - <SEP> 2-3 <SEP> dichlorophenol <SEP> 2 <SEP> g / l <SEP>#<SEP> Green <SEP> stain <SEP> Mathetically <SEP> urinase <SEP> does not
<tb> - <SEP> 2-3 <SEP> dichlorophenol <SEP> 5 <SEP> g / l <SEP> se <SEP> retains <SEP> not <SEP> 24 <SEP> h <SEP> to <SEP > 37 C
<tb> - <SEP> 3-chlorophenol <SEP> 6.5 <SEP> g / l <SEP> Green <SEP> color. <SEP><SEP><SEP><SEP>Reactive><SEP> Addiion
<tb><SEP> of <SEP> urease, <SEP> but <SEP> this <SEP> disorder <SEP> say
<SEP> appears <SEP> with <SEP> addition <SEP> of <SEP> dichlo
<SEP> roisocyanurate. <SEP> Mache <SEP> to <SEP> time
<SEP> 0 <SEP> but <SEP> no <SEP> on <SEP> over <SEP> after <SEP> 24 <SEP> h
<tb><SEP> to <SEP> + <SEP> 4 C.
<Tb>

- <SEP> 3-5 <SEP> dichloro-4-hydroxybenzène <SEP> 1 <SEP> g/l
<tb> <SEP> sulfonyl <SEP> chloride <SEP> # <SEP> Coloration <SEP> jaune <SEP> non <SEP> spécifique
<tb> - <SEP> 3-5 <SEP> dichloro-4-hydroxybenzène <SEP> 2 <SEP> g/l
<tb> TABLEAU I (Suite)

<SEP> 3-5 <SEP> dichloro-4-hydroxybenzene <SEP> 1 <SEP> g / l
<tb><SEP> sulfonyl <SEP> chloride <SEP>#<SEP> Specific <SEP> staining <SEP> yellow <SEP>
<tb> - <SEP> 3-5 <SEP> dichloro-4-hydroxybenzene <SEP> 2 <SEP> g / l
<tb> TABLE I (Continued)

<SEP> DERIVES <SEP> PHENOLES <SEP> TESTES
<tb> a <SEP> Thymol <SEP> 0,2 <SEP> g/l <SEP> Bouue <SEP> conservation <SEP> de <SEP> l'uréase
<tb> - <SEP> Thymol <SEP> 0,5 <SEP> g/l <SEP> #Dose <SEP> optimum <SEP> # <SEP> (jusqu'au <SEP> moins <SEP> 3 <SEP> jours <SEP> à <SEP> 37'C)
<tb> - <SEP> Thymol <SEP> 1 <SEP> g/l <SEP> Coloration <SEP> verte, <SEP> avec <SEP> une <SEP> teinte <SEP> bleue <SEP> de <SEP> plus
<tb> - <SEP> Thymol <SEP> 2 <SEP> g/l <SEP> # <SEP> en <SEP> plus <SEP> pronoucés <SEP> quand <SEP> la <SEP> dose <SEP> de <SEP> thymol <SEP> croît
<tb> - <SEP> Thymol <SEP> 5 <SEP> g/l
<tb> - <SEP> Thymol <SEP> 10 <SEP> g/l <SEP> #Apparition <SEP> d'un <SEP> trouble
<tb> <SEP> Tricrésol <SEP> 0,2 <SEP> ml/l <SEP> 0,2 <SEP> g/l <SEP> Pas <SEP> de <SEP> dose <SEP> optimale <SEP> très <SEP> nettement <SEP> définie
<tb> <SEP> 0,5 <SEP> ml/l <SEP> 0,5 <SEP> g/l <SEP> Coloration <SEP> verte <SEP> avec <SEP> angmentation <SEP> de <SEP> la
<tb> <SEP> 1 <SEP> ml/l <SEP> 1 <SEP> g/l <SEP> dominante <SEP> bleue <SEP> lorsque <SEP> la <SEP> dose <SEP> s'accoît.
<tb><SEP> DERIVATIVES <SEP> PHENOLAS <SEP> TESTS
<tb> a <SEP> Thymol <SEP> 0.2 <SEP> g / l <SEP> Stool <SEP> preservation <SEP> of <SEP> urease
<tb> - <SEP> Thymol <SEP> 0.5 <SEP> g / l <SEP>#Dose<SEP> optimum <SEP>#<SEP> (until <SEP> less <SEP> 3 <SEP > days <SEP> to <SEP>37'C)
<tb> - <SEP> Thymol <SEP> 1 <SEP> g / l <SEP> Green <SEP> staining, <SEP> with <SEP> one <SEP><SEP> blue <SEP> hue of <SEP> more
<tb> - <SEP> Thymol <SEP> 2 <SEP> g / l <SEP>#<SEP> in <SEP> plus <SEP> pronounced <SEP> when <SEP> the <SEP> dose <SEP> of <SEP> thymol <SEP> grows
<tb> - <SEP> Thymol <SEP> 5 <SEP> g / l
<tb> - <SEP> Thymol <SEP> 10 <SEP> g / l <SEP>#Apply<SEP> of a <SEP> disorder
<tb><SEP> Tricresol <SEP> 0.2 <SEP> ml / l <SEP> 0.2 <SEP> g / l <SEP> No <SEP> of <SEP> SEP <SEP> Optimal <SEP> very <SEP> clearly <SEP> defined
<tb><SEP> 0.5 <SEP> ml / l <SEP> 0.5 <SEP> g / l <SEP> Green <SEP> Staining <SEP> with <SEP><SEP> SEP Incrementation> the
<tb><SEP> 1 <SEP> ml / l <SEP> 1 <SEP> g / l <SEP> dominant <SEP> blue <SEP> when <SEP> the <SEP> dose <SEP> corrupts.
<Tb>

<SEP> 2 <SEP> ml/l <SEP> 2 <SEP> g/l <SEP> # <SEP> Dose <SEP> choisie.
<tb><SEP> 2 <SEP> ml / l <SEP> 2 <SEP> g / l <SEP>#<SEP> Dose <SEP> chosen.
<Tb>

<SEP> 5 <SEP> ml/l <SEP> 5 <SEP> g/l <SEP> Bonne <SEP> conservation <SEP> de <SEP> l'uréase <SEP> après <SEP> 24 <SEP> heures
<tb> <SEP> 10 <SEP> ml/l <SEP> 10 <SEP> g/l <SEP> à <SEP> 37 C
<tb> <SEP> Amino <SEP> 2 <SEP> phénol <SEP> 1 <SEP> g/l <SEP> Coloration <SEP> verte <SEP> noirâtre
<tb> <SEP> Phényl <SEP> 2 <SEP> phénol <SEP> 0,5 <SEP> g/l <SEP> # <SEP> Dose <SEP> sélectionnée
<tb> <SEP> Dissolution <SEP> préalable <SEP> 1 <SEP> g/l <SEP> Coloration <SEP> varte, <SEP> mais <SEP> apparition <SEP> d'un <SEP> trouble
<tb> <SEP> dans <SEP> du <SEP> méthanol <SEP> 2 <SEP> g/l <SEP> dans <SEP> le <SEP> réactif <SEP> econstitué <SEP> (qui <SEP> ne <SEP> paraît <SEP> pas
<tb> <SEP> 5 <SEP> g/l <SEP> # <SEP> être <SEP> un <SEP> précipité).<SEP> Ce <SEP> trouble <SEP> disparaît <SEP> après
<tb> <SEP> Méte <SEP> Crésol <SEP> 0,1 <SEP> ml/l <SEP> 0,1 <SEP> g/l <SEP> addition <SEP> des <SEP> ions <SEP> ClO-.
<tb><SEP> 5 <SEP> ml / l <SEP> 5 <SEP> g / l <SEP> Good <SEP> preservation <SEP> of <SEP> urease <SEP> after <SEP> 24 <SEP> hours
<tb><SEP> 10 <SEP> ml / l <SEP> 10 <SEP> g / l <SEP> to <SEP> 37 C
<tb><SEP> Amino <SEP> 2 <SEP> phenol <SEP> 1 <SEP> g / l <SEP> Green <SEP> staining <SEP> blackish
<tb><SEP> Phenyl <SEP> 2 <SEP> phenol <SEP> 0.5 <SEP> g / l <SEP>#<SEP> SEP <SEP> selected
<tb><SEP> Dissolution <SEP> previous <SEP> 1 <SEP> g / l <SEP> Staining <SEP> varte, <SEP> but <SEP> appearance <SEP> of a <SEP> disorder
<tb><SEP> in <SEP> of <SEP> methanol <SEP> 2 <SEP> g / l <SEP> in <SEP> the <SEP> reagent <SEP> formed <SEP> (which <SEP> does not) <SEP> appears <SEP> not
<tb><SEP> 5 <SEP> g / l <SEP>#<SEP> be <SEP> a <SEP> precipitated). <SEP> This <SEP> disorder <SEP> disappears <SEP> after
<tb><SEP> Mate <SEP> Cresol <SEP> 0.1 <SEP> ml / l <SEP> 0.1 <SEP> g / l <SEP> addition <SEP> of <SEP> ions <SEP> ClO.
<Tb>

<SEP> 0,5 <SEP> ml/l <SEP> 0,5 <SEP> g/l <SEP> # <SEP> Dose <SEP> sélectionnée
<tb> <SEP> 1 <SEP> ml/l <SEP> 1 <SEP> g/l <SEP> # <SEP> Coloration <SEP> verte
<tb> <SEP> 2 <SEP> ml/l <SEP> 2 <SEP> g/l <SEP> Bonne <SEP> conservation <SEP> de <SEP> l'uréas.
<tb><SEP> 0.5 <SEP> ml / l <SEP> 0.5 <SEP> g / l <SEP>#<SEP> Selected <SEP> Dose
<tb><SEP> 1 <SEP> ml / l <SEP> 1 <SEP> g / l <SEP>#<SEP> Green <SEP> staining
<tb><SEP> 2 <SEP> ml / l <SEP> 2 <SEP> g / l <SEP> Good <SEP> hold <SEP> of <SEP> the urease.
<Tb>

<SEP> 5 <SEP> ml/l <SEP> 5 <SEP> g/l
<tb>
TABLEAU II.<SEP> 5 <SEP> ml / l <SEP> 5 <SEP> g / l
<Tb>
TABLE II.

TABLEAU DE CONSERVATION DES DERIVES SELECTIONNES

TABLE OF PRESERVATION OF SELECTED DERIVATIVES

<tb> <SEP> D.O. <SEP> A <SEP> 600 <SEP> nm <SEP> : <SEP> D.O. <SEP> à <SEP> 600 <SEP> nm <SEP> du <SEP> réactif
<tb> <SEP> au <SEP> temps <SEP> 0 <SEP> : <SEP> conservé <SEP> 72 <SEP> heures <SEP> à <SEP> 37 C
<tb> Salicylate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 0,900 <SEP> : <SEP> 0,149
<tb> Tricrésol <SEP> ; <SEP> <SEP> 1,055 <SEP> : <SEP> 0,119
<tb> 2-3 <SEP> dichiorophénol <SEP> : <SEP> O,560 <SEP> : <SEP> 0-,202
<tb> Phényl <SEP> 2 <SEP> Phénol <SEP> : <SEP> 1,059 <SEP> : <SEP> 1,004
<tb> Méta <SEP> crésol <SEP> : <SEP> 0,972 <SEP> | <SEP> 0,961
<tb> Thymol <SEP> : <SEP> 0,914 <SEP> : <SEP> 0,871
<tb> <tb><SEP> DO <SEP><SEP> 600 <SEP> nm <SEP>: <SEP> DO <SEP> at <SEP> 600 <SEP> nm <SEP> of the <SEP> reagent
<tb><SEP> at <SEP> time <SEP> 0 <SEP>: <SEP> retained <SEP> 72 <SEP> hours <SEP> at <SEP> 37 C
<tb> Salicylate <SEP> of <SEP> sodium <SEP> 0.900 <SEP>: <SEQ> 0.149
<tb> Tricrésol <SEP>;<SEP><SEP> 1.055 <SEP>: <SEP> 0.119
<tb> 2-3 <SEP> dichiorophenol <SEP>: <SEP> O, 560 <SEP>: <SEP> 0-, 202
<tb> Phenyl <SEP> 2 <SEP> Phenol <SEP>: <SEP> 1,059 <SEP>: <SEP> 1,004
<tb> Meta <SEP> cresol <SEP>: <SEP> 0.972 <SEP> | <SEP> 0.961
<tb> Thymol <SEP>: <SEP> 0.914 <SEP>: <SEP> 0.871
<Tb>

Claims

1. A method for selecting phenolic derivatives capable of forming a stable mixture with urease in aqueous solution, characterized in that a number of test solutions are prepared, each consisting of an aqueous solution of the phenol derivative to be tested. range of test solutions being achieved at various concentrations of the phenol derivative from 0.1 g / l, in that the pH of said test solutions is adjusted to a weakly basic value, in that test solutions a determined quantity of urease, this quantity being the same for each test solution, in that samples are formed by taking a determined and identical volume of each test solution, in that add to each sample the same quantity of a solution of urea at a concentration corresponding to that usually encountered in the biological fluids, which is then added to each sample the same amount of u a solution capable of releasing ClO ions in the aqueous medium and causing the coloration thereof, and in that the importance of the coloration is appreciated by a known colorimetric technique, in that it is selected, in the sample range of test solutions, that which gives the highest absorbance and that, starting from this selected sample and applying the same procedure with various concentrations of urea, the intensity of the test is checked. The coloration obtained varies linearly with the concentration of urea, and finally it is verified that substantially the same results are obtained after aging of the samples simultaneously containing the phenolic derivative and the urease, after which the phenolic derivative which has satisfied all previous tests.

2.Procédé according to claim 1, characterized in that aqueous test solutions, whose phenolic derivative concentration varies from 0.1 g / l to 10 gil or between 0.1 g / l and the saturation concentration, are used. at + 40C.

3.Procédé according to one of claims 1 or 29characterized by adjusting the pH of the test solutions; a weakly basic value between about 7 and 8.

4.Procédé according to any one of claims 1 to 3, characterized in that each test solution is supplemented with an amount of urease ranging from 2000 to 10 000 units and in particular close to 5000 units per liter of solution.

5.Procédé according to any one of claims 1 to 4 characterized in that, for the purpose of the addition to the samples of test solutions, one uses concentrations: duration from 0.2 gil to 5 g / l, by example of igli.

6.Procédé according to any one of claims 1 to 5, characterized in that heated, in particular at 37 C, the samples containing the phenol derivative and urease and added urea.

7.Procédé according to any one of claims 1 to 6 characterized in that, as a solution capable of releasing C10- ions, using sodium hypochlorite, for example at a concentration of 6 to 60 mmol / 1, a solution of sodium dichloroisocyanurate for example between 3 and 30 mmol / l in sodium hydroxide solution between 150 and 750 mmol / l or equivalent solution.

8.Procédé according to any one of claims 1 to 7, characterized in that one selects the sample containing the phenolic derivative provoking, compared to a control sample, the appearance of a coloration greater than 0.1 unit of Absorbance at the peak of the absorption peak for a sample corresponding to a urea concentration of 1 g / l.

9. Application of the method according to any one of claims 1 to 8 to the selection of a phenolic derivative for the determination of urea enzymatically.

10.A reagent composition presented unitarily and comprising:

a phenolic derivative selected by the process according to any one of claims 1 to 8 and other than a derivative carrying, in addition to the OH group of the phenol, at least one carboxylic acid function on the ring,

a compound, such as nitroprusside, capable of acting as a catalyst during the subsequent reaction with hypochlorite ions,

and advantageously a buffer.

11. Method for the enzymatic determination of urea, said method being carried out in two steps consisting of successively bringing into contact with the analyte containing urea, (1) a reagent composition according to in claim 10 and (2) a solution of sodium hypochlorite or the like, to obtain a coloring of the medium capable of being quantitatively measured in a manner known per se by a photometric technique.

12.Application of the method according to claim 11 to the determination of urea in blood serum.

A reagent kit for carrying out the process of claim 11 comprising a reagent composition according to claim 10 and (2) a solution capable of releasing ClO ions in an aqueous medium.

14.Genol derivatives selected by the process according to any one of claims 1 to 8 and intended for carrying out the process according to claim 11, in particular thymol, meta-cresol, 2-phenylphenol, 2, 3 dichlorophenol or tricresol.