FR2530818A1 - Method for preparing a terminal oligopeptide specific for the surface antigen of an infectious microorganism, determination of this microorganism and device for its identification - Google Patents
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Abstract
Description
PROCEDE DE PREPARATION D'UN OLIGOPEPTIDE TERMINAL SPECIFIQUE DE
L'ANTIGENE DE SURFACE D'UN GERME INFECTIEUX, DETERMINATIONDE
CE GERME ET DISPOSITIF POUR SON IDENTIFICATION.PROCESS FOR THE PREPARATION OF A SPECIFIC TERMINAL OLIGOPEPTIDE
THE DETERMINATION OF THE SURFACE ANTIGEN OF AN INFECTIOUS GERM
THIS GERM AND DEVICE FOR ITS IDENTIFICATION.
La présente invention a pour objet un procéde de preparation d'un oligopeptid terminal de type Fab spécifique de l'antigène de surface dun germe infectieux Elle se rapporte également à une méthod pour la détermination de la présence d'un immunocomplexe spécifique d'un germe infectieux dans un liquide physiologique Elle se rapporte en outre à un dispositif pour I 'identification d'un immunocomplexe circulant spécifique infectieux dans un liquide physiologique. The subject of the present invention is a process for the preparation of a terminal oligopeptid of the Fab type specific for the surface antigen of an infectious germ. It also relates to a method for determining the presence of an immunocomplex specific for a germ. infectious in a physiological fluid It also relates to a device for the identification of a specific infectious circulating immunocomplex in a physiological fluid.
Les interactions specifiques globales entre une molécule protéique, tel un anticorps, et une substance présentant des sites actifs ayant une affinité pour la proteine, tel antigene ou haptène, sont bièn connues. Le complexe ré- sultant de ces interactions, ainsi qu'il est connu, peut être caractérisé par fixation sur un support solide de l'anticorps ou d'une molecule portant un site antigenique. La combinaison du complexe forme avec une autre molécule spécifique portant un marqueur enzymatique ou radioactif permet de mettre en évidence ou de déterminer la molécule initiale recherchée. The specific overall interactions between a protein molecule, such as an antibody, and a substance presenting active sites having an affinity for the protein, such as antigen or hapten, are well known. The complex resulting from these interactions, as is known, can be characterized by attachment to a solid support of the antibody or of a molecule carrying an antigenic site. The combination of the complex formed with another specific molecule carrying an enzymatic or radioactive marker makes it possible to highlight or determine the initial molecule sought.
Les procedés décrits jusqu'à présent mettant en oeuvre ces interactions, exploitent l'affinité globale entre une protéine de type anticorps et les sites antigèniques correspondants d'une molécule particulière (antigène totaux ou haptènes). L'une des molécules etant fixée chimiquement sur un support solide l'immunocomplexe forme est "revole" par combinaison avec une autre protéine, d'activité anticorps vis-à-vis du complexe, sur laquelle on a substitué un marqueur actif (enzyme ou isotope radioactif), la molecule ou le complexe à caractériser sont ainsi pris en "sandwich" entre une molécule piège fixée sur le support solide et une molécule de révélation portant le marqueur. The processes described so far implementing these interactions, exploit the overall affinity between an antibody type protein and the corresponding antigenic sites of a particular molecule (total antigen or haptens). One of the molecules being chemically fixed on a solid support, the immunocomplex formed is "revolves" by combination with another protein, of antibody activity vis-à-vis the complex, on which an active marker (enzyme or radioactive isotope), the molecule or complex to be characterized are thus sandwiched between a trap molecule fixed on the solid support and a development molecule carrying the marker.
Ce procédé général présente de nombreux inconvénients:
- les complexes ainsi réalisés font intervenir des protéines totales de
type anticorps, dont il est connu que leurs molécules sont constituées
d'un ensemble non specifique, appele Fc, et de régions très précises,
appelées Fab, correspondant aux seuls sites actifs responsables de l'in
teraction spécifique avec les sites antigeniques correspondant. L'utili
sation de la protéine totale dans le sandwich introduit donc nécessairemeni
des risques nombreux et régulièrement constatés d'intéractions parasites
entre les fractions Fc des anticorps intervenant dans le complexe et la
protéine totale utilisée comme marqueur (anticorps total conjugué avec
l'enzyme ou l'isotope radioactif).Cet inconvénient se trouve considéra
blement renforcé dans le cas où le procédé est utilisé pour détecter un
immunocomplexe soluble, qui est constitué d'une fraction anticorps pré
existante. I1 s'ensuit donc de faux résultats par interactions non spe
cifiques qui conduisent souvent à de fausses réactions croises.This general process has many drawbacks:
- the complexes thus produced involve total proteins of
antibody type, of which their molecules are known to consist
a non-specific set, called Fc, and very specific regions,
called Fab, corresponding to the only active sites responsible for the in
specific teraction with the corresponding antigenic sites. The utility
sation of the total protein in the sandwich introduced therefore necessarily
numerous and regularly observed risks of parasitic interactions
between the Fc fractions of the antibodies involved in the complex and the
total protein used as a marker (total antibody conjugated with
enzyme or radioactive isotope).
strongly reinforced in the case where the method is used to detect a
soluble immunocomplex, which consists of an antibody fraction pre
existing. I1 thus follows false results by interactions not spe
which often lead to false cross reactions.
- I1 est également établi que le greffage (par voie chimique ou par simple
adsorption physique) de la molécule totale utilisée comme piège ne per
met pas d'éviter de très nombreuses interactions physicochimiques non
specifiques entre la surface même du support solide et les protéines
solubles qui doivent être complexées, ainsi que vis-à-vis des marqueurs
(anticorps conjugues avec l'enzyme ou l'iostope radioactif). Ces interac
tions non spécifiques du support vis- -vis à la fois des fractions solu
bles à complexer et des anticorps marqueurs introduisent également de
nombreuses erreurs d'interprétation dans les résultats.- It is also established that grafting (chemically or by simple
physical adsorption) of the total molecule used as a trap does not per
does not avoid very many physicochemical interactions not
specific between the surface of the solid support and the proteins
soluble which must be complexed, as well as towards the markers
(antibodies conjugated with the radioactive enzyme or iostope). These interac
nonspecific conditions of the support vis-a-vis both solu fractions
wheat to be complexed and marker antibodies also introduce
many interpretation errors in the results.
- Les procédés connus jusqu'alors utilisent enfin couramment des extraits
non purifiés correspondant à des mélanges hétérogènes de molécules pre-
sentant des interactions immunochimiques diverses, parmi lesquelles la
protéine d'activité anticorps spécifique du site antigénique recherché se
trouve en concentration faible et en mélange avec de nombreuses autres
molecules de structures voisines apportant de grands risques de réactions
croisées et d'interactions physicochimiques non spécifiques.- The processes hitherto known finally commonly use extracts
unpurified corresponding to heterogeneous mixtures of pre-
sensing various immunochemical interactions, including
antibody activity protein specific for the antigenic site sought
found in low concentration and mixed with many others
molecules of neighboring structures bringing great risks of reactions
and non-specific physicochemical interactions.
-- Pour le diagnostic de nombreuses maladies provoquées par des germes pa
thogènes infectants, la réponse immunitaire se caractérise par la pré
sence dans le sérum des malades, d'immunocomplexes circulants, formes
entre des- antigènes solubilises provenant des membranes du germe et des
anticorps formes par la reaction de l'individu.- For the diagnosis of many diseases caused by germs pa
infectious thogens, the immune response is characterized by the pre
in the serum of patients, circulating immunocomplexes, forms
between solubilized antigens from the germ membranes and
antibodies formed by the reaction of the individual.
I1 est donc important de pouvoir disposer d'un procedé rigoureusement spécifique permettant de mettre en évidence ces immunocomplexes solubles sans risques de réactions croisées ou d'interactions non specifiques. It is therefore important to be able to have a rigorously specific process making it possible to demonstrate these soluble immunocomplexes without the risk of cross-reactions or non-specific interactions.
La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'un oligopeptide terminal de type Fab spécifique de l'antigène de surface d'un germe infectieux, suivant lequel on extrait de la membrane du germe des antigenes de surface, on purifie les antigenes par toute méthode connue, on provoque la formation d'anticorps, on hydrolyse ces anticorps par des enzymes puis isole la fraction oligopeptide terminale de type Fab. The subject of the present invention is a process for the preparation of a terminal oligopeptide of Fab type specific for the surface antigen of an infectious germ, according to which surface antigens are extracted from the germ membrane, the antigens are purified by any known method, the formation of antibodies is provoked, these antibodies are hydrolyzed by enzymes and then the terminal oligopeptide fraction of Fab type is isolated.
Selon une forme d'exécution de ce procédé, le germe infectieux est le
Trypanosoma Cruzi. According to one embodiment of this process, the infectious germ is the
Trypanosoma Cruzi.
La présente invention a également pour objet une méthode de détermination de la présence d'un immunocomplexe soluble spécifique d'un germe infectant contenu dans un liquide physiologique préleve sur un malade, cette méthode consistant à traiter ledit liquide par un oligopeptide terminal de type Fab spécifique de l'antigène d'un germe infectieux déterminé, obtenu par le procédé précité, puis à isoler, fixer ou mettre en évidence le produit résultant de la réaction si le liquide physiologique précité contient l'immunocomplexe spécifique du Fab employé. The present invention also relates to a method for determining the presence of a soluble immunocomplex specific for an infecting germ contained in a physiological fluid taken from a patient, this method consisting in treating said liquid with a specific terminal oligopeptide of Fab type of the antigen of a given infectious germ, obtained by the aforementioned process, then in isolating, fixing or highlighting the product resulting from the reaction if the aforementioned physiological liquid contains the specific immunocomplex of the Fab used.
De preference, l'oligogeptide terminal d.e type Fab a etc fixé préalablement sur uns proteine non spécifique du complexe (la sérumalbumine,p.e.ci-apresdésignée SAH).Preferably, the terminal oligogeptide d.e type Fab has been previously fixed on a non-specific protein of the complex (serum albumin, p.e.ci-after-designated SAH).
Selon une autre forme d'exécution de l'invention, l'oligopeptide de type Fab est préalablement fixé sur une masse réactionnelle, par exemple une toile de nylon: une plaquette à microcupule(s), etc. According to another embodiment of the invention, the Fab type oligopeptide is previously fixed on a reaction mass, for example a nylon fabric: a microcupule (s) plate, etc.
De préférence, dans le cas ou l'immunocomplexe fixé sur la fraction terminale Fab est présent dans le liquide physiologique, il est isolé par précipitation. Il peut également être révélé par des anti-IgG, par la fraction C1.q ducomplément, par de la protéine A ou par- un polytryptophane marquespar un enzyme-et conduisant à Une réaction colorée selon des moyens connus.Preferably, in the case where the immunocomplex fixed on the terminal fraction Fab is present in the physiological fluid, it is isolated by precipitation. It can also be revealed by anti-IgGs, by the C1.q fraction of the supplement, by protein A or by a polytryptophan marked by an enzyme - and leading to a colored reaction according to known means.
Selon un mode de réalisation de l'invention, la précipitation de lrimmunocom. According to one embodiment of the invention, the precipitation of lrimmunocom.
plexe est effectuée par réaction de Fab-SAH et d'anti-IgG marque à la peroxydase.plex is performed by reaction of Fab-SAH and anti-IgG brand with peroxidase.
Selon un autre mode de realisation, 1 'immunocomplexe est fixe sur du polytryptophane insolubilisé puis révélé par l'ogigopeptide terminal de type Fab marque
Selon une autre variante encore, l'immunocomplexe est révélé par immunoprécipitati' en présence du mélange de l'oligopeptide terminal de type Fab et du polytryptophan marqué.According to another embodiment, the immunocomplex is fixed on insoluble polytryptophan and then revealed by the brand-type terminal igigopeptide
According to yet another variant, the immunocomplex is revealed by immunoprecipitation in the presence of the mixture of the terminal oligopeptide of Fab type and of the labeled polytryptophan.
L'invention a également pour objet un dispositif pour l'identification d'un germe infectieux dans un liquide physiologique consistant en un support en un matériau inerte, au moins semi-rigide et en masse réactionnelle fixée sur une, par tie au moins de ce support, ladite masse réactionnelle étant formée d'une toile de nylon ou d'une plaquette à microcupules sur laquelle est immobilisé par un procédé connu l'oligopeptide terminal de type Fab spécifique de l'antigène de surface d'un germe infectieux. The invention also relates to a device for the identification of an infectious germ in a physiological liquid consisting of a support made of an inert material, at least semi-rigid and in reaction mass fixed on one, at least part of this support, said reaction mass being formed of a nylon cloth or a microcupule wafer on which is immobilized by a known method the terminal oligopeptide of Fab type specific for the surface antigen of an infectious germ.
D'autres buts et avantages de l'invention apparaitront à la lecture de la description suivante donnée à titre non limitatif. Other objects and advantages of the invention will appear on reading the following description given without limitation.
En fait, sont décrits ci-dessous differentes variante permettant de résoudr le problème exposé. In fact, various variants are described below making it possible to solve the problem exposed.
Selon une premiere variante de l'invention, l'immunocomplexe à mettre en évidence réagit par sa partie antigénique avec 1 'oligopeptide terminal de type
Fab, prépare par dégradation enzymatique récurrente d'un anticorps spécifique obtenu par des moyens immunologiques connus, à partir d'un antigène ou d'un déterminant haptênique caractéristique du germe infectant, extrait à partir de la membrane dudit germe. Les caractéristiques Smnunologiques de la fraction antigénique de membrane sont identiques à celle de l'antigène circulant présent dans l'immunocomplexe.L'oligopeptide terminal de type Fab peut indifféremment être conjugue chimiquement, par des moyens connus, avec une molécule non antigénique, qu'elle soit solide ou soluble; on peut en particulier greffer le peptide terminal de type Fab par les fonctions carboxyliques libres sur une protéine homologue des proteines du sérum dans lequel se trouve l'immunocomplexe à déterminer.Dans le cas d'un sérum humain, par exemple, on utilise avantageusement un greffage avec la sérum albumine humaine (SAH); le complexe Fab-SAH pourra alors, à l'aide de moyens connus, soit être fixé par covalence sur de nombreux types connus de support solide, soit être réticulé entre les résidus de SAH à l'aide d'agents bifonctionnels connus, comme par exemple le glutaraldéhyde, pour former un revêtement actif non antigenique sur un support solide, de quelque type que ce soit.According to a first variant of the invention, the immunocomplex to be detected reacts by its antigenic part with the terminal oligopeptide of the type
Fab, prepared by recurrent enzymatic degradation of a specific antibody obtained by known immunological means, from an antigen or a haptenic determinant characteristic of the infecting germ, extracted from the membrane of said germ. The Smnunological characteristics of the membrane antigen fraction are identical to that of the circulating antigen present in the immunocomplex. The terminal oligopeptide of Fab type can indifferently be chemically conjugated, by known means, with a non-antigenic molecule, that it is solid or soluble; it is possible in particular to graft the terminal peptide of the Fab type by the free carboxylic functions on a protein homologous to the proteins of the serum in which the immunocomplex to be determined is found. In the case of a human serum, for example, a grafting with human serum albumin (SAH); the Fab-SAH complex can then, using known means, either be covalently attached to many known types of solid support, or be crosslinked between SAH residues using known bifunctional agents, such as glutaraldehyde, for example, to form an active non-antigenic coating on a solid support, of any type.
L'immunocomplexe pourra alors se fixer-sur le support solide ainsi activé, grace à une interaction rigoureusement spécifique entre sa partie anti géni que et les fractions Fab, à l'exclusion de toute autre interaction non spécifique.The immunocomplex can then be fixed on the solid support thus activated, thanks to a rigorously specific interaction between its anti-genic part and the Fab fractions, to the exclusion of any other non-specific interaction.
Selon une autre variante de l'invention > 1 'oligopeptide terminal de type Fab peut etre conjugue par l'intermediaire de ses fonctions carboxyliques avec une molécule marquée (enzyme ou isotope radioactif); l'immunocomplexe pourra ainsi être révélé par le marquage rigoureusement spécifique de sa fraction antigénique; la fraction
Fab marquée sera alors utilisée en phase soluble, pour l'identification spéci- fique de 1 'immunocomplexe soluble.According to another variant of the invention> the terminal oligopeptide of the Fab type can be conjugated through its carboxylic functions with a labeled molecule (enzyme or radioactive isotope); the immunocomplex can thus be revealed by the rigorously specific labeling of its antigenic fraction; fraction
Labeled Fab will then be used in the soluble phase, for the specific identification of the soluble immunocomplex.
Selon encore une autre variante de l'invention, on peut également utiliser avantageusement une forme soluble du type Fab-SAx, pour réaliser une combinaison spécifique en.phase soluble à l'aide d'une sérum albumine d'une espèce differente X de celle du sérum contenant l'immunocomplexe (sérum albumine de lapin, par exemple, pour un immunocomplexe d'origine humaine). Par une voie immunoprépa rative,à l'aide de supports substitués par des anticorps anti-SAx, on pourra ainsi isoler spécifiquement 1 'immunocomplexe circulant, permettant avantageusement l'obtention d'anticorps spécifique à une échelle préparative. According to yet another variant of the invention, it is also possible advantageously to use a soluble form of the Fab-SAx type, to produce a specific combination of soluble phase using an albumin serum of a different species X from that serum containing the immunocomplex (rabbit albumin serum, for example, for an immunocomplex of human origin). By an immuno-preparative route, using supports substituted by anti-SAx antibodies, it will thus be possible to specifically isolate the circulating immunocomplex, advantageously making it possible to obtain specific antibodies on a preparative scale.
L'utilisation, selon les variantes ci-dessus, des fractions Fab obtenues 5 partir des sites antigéniques de membrane permet d'éliminer les risques d'interactions non spécifiques (aussi bien celles des supports que celles des fragments Fc de l'anticorps total) et d'accroître l'activité et la sensibilité en augmentant de façon importante la densité des sites spécifiques accessibles. Les expérimentations démontrent, par ailleurs, qu'il est nécessaire de greffer la fraction Fab par les fonctions carboxyliques accessibles, afin de laisser les groupements aminés libres; cette condition est nécessaire pour préserver les interactions spécifiques entre la fraction Fab et la partie antigénique de 1 'immunocomplexe. The use, according to the above variants, of the Fab fractions obtained from the membrane antigenic sites makes it possible to eliminate the risks of non-specific interactions (both those of the supports and those of the Fc fragments of the total antibody) and increase activity and sensitivity by significantly increasing the density of specific accessible sites. The experiments demonstrate, moreover, that it is necessary to graft the Fab fraction with the accessible carboxylic functions, in order to leave the amino groups free; this condition is necessary to preserve the specific interactions between the Fab fraction and the antigenic part of the immunocomplex.
De façon combinée avec les variantes précédemment décrites, l'immunocomplexe à mettre en évidence peut réagi-r par sa partie anticorps, avec différents types de molécules qui pourront avantageusement être utilisées selon les différentes variantes de l'invention. In combination with the variants described above, the immunocomplex to be detected can react with its antibody part, with different types of molecules which can advantageously be used according to the different variants of the invention.
On pourra ainsi réaliser une interaction globale entre la fraction anticorps de l'imiuunocomplexe et les anti-lg G du sérum correspondant, les anti-Ig G pouvant indifféremment être fixés sur un support ou être conjugués avec des molécules solubles ou des marqueurs (enzymatiques ou radioactifs).It will thus be possible to achieve a global interaction between the antibody fraction of the immunocomplex and the anti-IgG G of the corresponding serum, the anti-Ig G can indifferently be fixed on a support or be conjugated with soluble molecules or markers (enzymatic or radioactive).
En relation avec les points particuliers précisés dans les variantes ci-dessus, la combinaison des anti-Ig G avec la fraction anticorps de l'immunocomplexe supprime les risques d'interactions non spécifiques qui auraient pQ intervenir sur les fractions Fc qui sont absentes du côté antigenique du fait de 1 'utili- sation de l'oligopeptide de type Fab.In relation to the particular points specified in the above variants, the combination of anti-Ig G with the antibody fraction of the immunocomplex eliminates the risks of non-specific interactions which could have intervened on the Fc fractions which are absent on the side. antigenic due to the use of the Fab type oligopeptide.
Dans une autre variante, on peut avantageusement utiliser la fraction Ci.q du complément qui se combine sélectivement avec les anticorps engagés dans l'immunocomplexe; ladite fraction Ci.q pourra être mise en-oeuvre selon les cas, soit sous forme soluble, conjuguée ou non avec un marqueur (enzymatique ou radioactif), soit sous forme fixee sur un support solide ou une macromolécule de quelque nature qu'elle soit. In another variant, it is advantageous to use the Ci.q fraction of the complement which selectively combines with the antibodies engaged in the immunocomplex; said fraction Ci.q may be used depending on the case, either in soluble form, conjugated or not with a marker (enzymatic or radioactive), or in form fixed on a solid support or a macromolecule of any kind .
Dans une autre variante encore, les éléments décrits dans les variantes cidessus rendent possible sans risque d'interactions parasites non spécifiques du côte antigénique, la reconnaissance directe de la fraction anticorps de l'immunocomplexe par une molécule du type de la protéine A (fixée sur un support ou conjuguée avec An marqueur enzymatique ou radioactif), de telles molécules étant capables de se combiner avec les Ig G, engagés ou non dans un immunocomplexe (Ig G = immunoglobuline G). In yet another variant, the elements described in the above variants make it possible, without risk of non-specific parasitic interactions on the antigenic side, direct recognition of the antibody fraction of the immunocomplex by a molecule of the type of protein A (fixed on a support or conjugate with an enzymatic or radioactive marker), such molecules being capable of combining with Ig G, whether or not engaged in an immunocomplex (Ig G = immunoglobulin G).
Selon encore une autre variante, il a été établi expérimentalement dans le cadre de l'invention que l'interaction spécifique par un fragment Fab telle qu'ell-e est decrite dans les variantes ci-dessus pour le côté antigénique de l'immunocomplexe, rend possible tres avantageusement sans risques d'interactio non spécifiques parasites, la combinaison spécifique de la partie anticorps de l'immunocomplexe avec un polypeptide de synthèse présentant des enchaîne- ments d'acides amines aromatiques et, plus particulièrement, d'enchaînements polytryptophane. Les expérimentations ont, en effets démontré que des enchaine- ments peptidiques polyaromatiques présentent des interactions sélectives du type transfert de charges avec les Ig G, engagées ou non dans un immunocomplexe. According to yet another variant, it has been established experimentally within the framework of the invention that the specific interaction with a Fab fragment as it is described in the above variants for the antigenic side of the immunocomplex, makes it possible very advantageously without the risk of non-specific parasitic interaction, the specific combination of the antibody part of the immunocomplex with a synthetic polypeptide exhibiting sequences of aromatic amino acids and, more particularly, polytryptophan sequences. The experiments have, in fact, demonstrated that polyaromatic peptide sequences exhibit selective interactions of the charge transfer type with Ig G, whether or not involved in an immunocomplex.
En association avec les variantes décrites ci-dessus, 1 'immunocomplexe peut donc être combiné avantageusement avec un peptide de synthèse polyaromatique, en particulier, riche en polytryptophane, qu'il soit greffé sur un support ou employé sous forme soluble conjuguée avec un marqueur enzymatique ou radioactif. In combination with the variants described above, the immunocomplex can therefore be advantageously combined with a polyaromatic synthetic peptide, in particular, rich in polytryptophan, whether it is grafted onto a support or used in soluble form conjugated with an enzymatic marker. or radioactive.
En fait, l'invention fournit donc des moyens à employer en association qui permettent l'isolement ou la mise en évidence et la détermination rigoureusement spécifique d'un immunocomplexe antigène-anticorps grâce à une double reconnaissance éliminant les risques d'interactions parasites. On utilise, pour la partie antigenique du complexe, un oligopeptide de type Fab préparé à partir des anticorps spécifiques des si tes antioeniques de surface, caractéristiques du germe infectant; l'oligopeptide Fab est conjugue avec une molécule non anti génique qui peut, indifféremment, être déposée en revêtement ou être greffée sur un support solide, ou encore être utilisé sous forme soluble, conjuguée ou non avec un marqueur.L'absence de fragments non specifiques de type rc sur la partie antigénique du complexe permet de reconnaitre la partie anticorps dudit complexe sans risques d'interactions parasites, en utilisant (sous forme greffée sur un support solide, ou sous forme soluble conjuguée ou non avec un marqueur) soit des anti Ig G, soit des fractions Ci.q du complément (carac éristique des anticorps complexés) soit des fractions de type protéine AX soit des polypeptides de synthese, riches en enchaînements polytryptophane. In fact, the invention therefore provides means to be used in combination which allow the isolation or the detection and the rigorously specific determination of an antigen-antibody immunocomplex by virtue of a double recognition eliminating the risks of parasitic interactions. Use is made, for the antigenic part of the complex, of a Fab type oligopeptide prepared from antibodies specific to the surface antioenic agents, characteristic of the infecting germ; the oligopeptide Fab is conjugated with a non-anti-gene molecule which can, indifferently, be deposited as a coating or be grafted on a solid support, or else be used in soluble form, conjugated or not with a marker. specific type rc on the antigenic part of the complex allows to recognize the antibody part of said complex without risk of parasitic interactions, using (in form grafted on a solid support, or in soluble form conjugated or not with a marker) or anti Ig G, either Ci.q fractions of the complement (characteristic of complexed antibodies) or AX protein type fractions or synthetic polypeptides, rich in polytryptophan sequences.
Différentes variantes du procédé permettent des utilisations soit pour l'identification et le dosage d'immunsérum circulants provoqués par des germes infectants (diagnostic) soit pour l'isolement à des fins preparatives des immunocomplexes (fabrication de vaccins ou d'hyperimmunosérums). Different variants of the process allow uses either for the identification and the assay of circulating immunsera caused by infecting germs (diagnosis) or for the isolation for preparative purposes of the immunocomplexes (manufacture of vaccines or hyperimmunosera).
On peut en fait considérer que l'invention décrit les moyens permettant de réaliser la mise en évidence et la détermination d'un immunocomplexe par une double reconnaissapce rigoureusement spécifique qui porte d'une part sur la partie antigénique ét, d'autre part, sur la partie anticorps du complexe, en excluant l'utilisation de protéines totales d'activité anticorps.Le procédé se caractérise par la mise en oeuvre sous différentes formes d'une fraction peptidique préparée à partir d'anticorps spécifiques du site antigénique des membranes du germe infectant (reconnaissance de la partie antigène circulant de l'immunocomplexe) et de molécules reconnaissant spécifiquement la fraction complexée de l'anticorps soluble, en excluant les interactions non specifiques avec les supports solides éventuels ou avec l'anticorps complexant la partie antigénique de 1 'immunocomplexe. We can in fact consider that the invention describes the means making it possible to demonstrate and determine an immunocomplex by a rigorously specific double recognition which relates on the one hand to the antigenic part and, on the other hand, to the antibody part of the complex, excluding the use of total proteins of antibody activity. The process is characterized by the use in different forms of a peptide fraction prepared from antibodies specific for the antigenic site of the membranes of the germ. infecting (recognition of the circulating antigen part of the immunocomplex) and of molecules specifically recognizing the complexed fraction of the soluble antibody, excluding non-specific interactions with possible solid supports or with the antibody complexing the antigenic part of 1 ' immunocomplex.
A titre d'exemple et sans qu'en aucun cas cela puisse être considéré comme limitatif, on décrira ci-dessous différentes variantes du procédé appliqué pour le cas des immunocomplexes spécifiques du Trypanosoma Cruzi, agent pathogène de la maladie de Chagas. By way of example and without in any case being able to be considered as limiting, various variants of the method applied for the case of the immunocomplexes specific for Trypanosoma Cruzi, a pathogenic agent of Chagas disease, will be described below.
EXEMPLE 1. EXAMPLE 1.
Préparation de la fraction Fab, spécifique de la partie antigénique de
l immunocomplexe soluble présent dans les sérums de patients affectés de La
maladie de Chagas:
La fraction Fab est préparée à partir d'anticorps obtenus par l'immunisatior de chèvres à l'aide d'injections de préparations d'extraits antigéniques, obtenue à partir de membranes de Trypanosoma Cruzi.Preparation of the Fab fraction, specific for the antigenic part of
the soluble immunocomplex present in the sera of patients affected by
Chagas disease:
The Fab fraction is prepared from antibodies obtained by goat immunisatior using injections of preparations of antigenic extracts, obtained from membranes of Trypanosoma Cruzi.
La succession des opérations est la suivante:
1.1. Production de Biomasse de Trypanosoma Cruzi et extraction des
sites antigéniques de membrane.The sequence of operations is as follows:
1.1. Production of Trypanosoma Cruzi biomass and extraction of
membrane antigenic sites.
Des cultures en masse de T. Cruzi, souche Tehuantepec, sont
réalises sur milieu GLSH, par une transposition des conditions
préalablement décrites par AFCHAIN et al (J. of Parasitology,
1979, 65, 507). Les cellules sont lavées en solution de Hanks
Wallace, puis désintégrées par passage entre -25 et -30 > C amans une
X - Press (appareil fabriqué par la société suédoise A.B. Biose
à Járfalla, 'es cellules passent à l'état congelé, sous forte
pression, à travers un trou -d'environ 1 mm de diamètre) fonction
nant sous 1960 bars.Les membranes sont récupérées par centrifuga
tion à 20000 g et les membranes sont solubilisées par le diisosali
cylate de lithium (LIS) dans les conditions décrites par MARCHESI
et ANDREWS (Science9 1971, 174, 1247). L'extrait soluble des
membranes est fractionné dans les conditions décrites par BOT et
al (cf.Affinity Chromatography, J.M. EGLY ed, INSERM, 1979, 86, 63);
après extraction phénolique et gel filtration sur Sephadex G. 25,
on obtient une fraction glycoprotéidique totale, dénommée .T. Mass cultures of T. Cruzi, strain Tehuantepec, are
realized on GLSH medium, by a transposition of conditions
previously described by AFCHAIN et al (J. of Parasitology,
1979, 65, 507). The cells are washed in Hanks solution
Wallace, then disintegrated by passing between -25 and -30> C amans une
X - Press (device manufactured by the Swedish company AB Biose
in Járfalla, the cells go frozen, under strong
pressure, through a hole - about 1 mm in diameter) function
under 1960 bars. The membranes are recovered by centrifuga
tion at 20,000 g and the membranes are dissolved by diisosali
lithium cylate (LIS) under the conditions described by MARCHESI
and ANDREWS (Science9 1971, 174, 1247). The soluble extract of
membranes is fractionated under the conditions described by BOT and
al (cf. Affinity Chromatography, JM EGLY ed, INSERM, 1979, 86, 63);
after phenolic extraction and gel filtration on Sephadex G. 25,
a total glycoprotein fraction is obtained, called .T.
Une chromatographie d'affinité sur PNA (lectine des la cacahuète) fixé
Sepharose permet d'isoler, par solution avec le galactose une
fraction majeure glycopeptidique de comportement cathodique denommée
MCA (Major Cathodic Antigen). Les caractéristiques moléculaires
et immunologiques de cette fraction montrent qu'elle correspond à
un glycopeptide antigenique de membrane spécifique des trypanosomes
ricains et ne présentant pas de réactions croisées avec les antigènes
de plusieurs Leishmanioses et due Trypanosomiases africaines.Les
tests immunochimiques conduisent enfin à des identités réactionnelle
entre le site antigenique de membrane et les antigènes circulants
présents dans les sérums de patients atteints de la maladie de Chaga
1.2. Préparation d anti-MCA. An affinity chromatography on PNA (peanut lectin) fixed
Sepharose allows to isolate, by solution with galactose a
major glycopeptide fraction of cathodic behavior called
MCA (Major Cathodic Antigen). Molecular characteristics
and immunological results of this fraction show that it corresponds to
an antigenic membrane glycopeptide specific for trypanosomes
ricans and not showing cross reactions with antigens
of several Leishmaniasis and African Trypanosomiasis.
immunochemical tests finally lead to reactive identities
between the membrane antigenic site and the circulating antigens
present in the sera of patients with Chaga disease
1.2. Anti-MCA preparation.
Les extraits MCA sont injectes à des chevres par voie- intramusculair
en quatre injections hebdomadaires successives.MCA extracts are injected into goats intramuscularly
in four successive weekly injections.
Les teneurs maximales en anticorps sont obtenus après 8 à 10 semainE
Les anticorps sont homogènes vis-à-vis de la fraction MCA;Ellesréagissent
spécifiquement avec les immunocomplexes solubles presents dans les
sérums de patients atteints de la maladie de Chagas et ne donnent pas
de réactions croisées avec les extraits antigéniques totaux de
T. Rangeli, T. Dionisii, T. Gambiense, T. Brunet, L-. Donovani et
L. Braziliensis.Maximum antibody levels are obtained after 8-10 weeks
The antibodies are homogeneous with respect to the MCA fraction; they react
specifically with the soluble immunocomplexes present in
sera from patients with Chagas disease and do not give
cross-reactions with total antigenic extracts from
T. Rangeli, T. Dionisii, T. Gambiense, T. Brunet, L-. Donovani and
L. Braziliensis.
1.3. Preparation d oligopeptide de type Fab-SAH à partir d-anti-MCA. 1.3. Preparation of Fab-SAH type oligopeptide from anti-MCA.
Des solutions d'anti-MCA, ajustées à des teneurs en protéines
de l'ordre de 370, sont soumises à une première hydrolyse partiel
le par la papaïne, des 90 mon à 37"C; l'hydrolysat est passé sur
Séphadex G.25 et la fraction macromoléculaire exclue est soumise
à plusieurs hydrolyses successives identiques jusqu'à épuisement
de la fraction macromoléculaire exclue.Les trois fractions
recueillies par gel filtration sur Séphadex G.25 sont rassemblées
-et soumises à une nouvelle hydrolyse ménagée de 15 mn à 250C par la
Trypsine dans un rapport enzyme-substrat de l'ordure de 1/5.et
On isole les fractions peptidiques par passage sur Sephadex G.10,
les fractions exclues étant epuisees comme précédemment par de
nouvel les hydrolyses successives.Anti-MCA solutions, adjusted to protein contents
of the order of 370, are subjected to a first partial hydrolysis
papain, from 90 my to 37 "C; the hydrolyzate is passed on
Sephadex G.25 and the excluded macromolecular fraction is subject
to several identical successive hydrolysis until exhaustion
of the macromolecular fraction excluded. The three fractions
collected by gel filtration on Sephadex G.25 are collected
-and subjected to a new hydrolysis managed for 15 min at 250C by the
Trypsin in an enzyme-substrate ratio of the junk of 1 / 5.and
The peptide fractions are isolated by passage over Sephadex G.10,
the excluded fractions being exhausted as before by
new successive hydrolysis.
Le mélange des fractions peptidiques isolées par gel filtration
est passé sur une colonne de Sephadex G.25-MCA ou sur une colonne
contenant des membranes de T. Cruzi (préparées comme au 1.1.)
réticulées par le glutaraldéhyde selon le principe de LAWNY et al
(cf. "Affinity Chromatography, HOFFMAN-OSTENHOF éd., Pergamon Press,
N.Y., 1978, p. 299). On isole la fraction peptidique spécifique
ment retenue sur la colonne, qui correspond à l'extrait peptidique
de type Fab.The mixture of peptide fractions isolated by gel filtration
passed over a column of Sephadex G.25-MCA or over a column
containing T. Cruzi membranes (prepared as in 1.1.)
crosslinked with glutaraldehyde according to the principle of LAWNY et al
(cf. "Affinity Chromatography, HOFFMAN-OSTENHOF ed., Pergamon Press,
NY, 1978, p. 299). We isolate the specific peptide fraction
ment retained on the column, which corresponds to the peptide extract
Fab type.
L'oligopeptide de type Fab,d'un poids moléculaire moyen compris entre
2000 et 5000, se combine spécifiquement avec la fraction MCA ou
l'extrait GT décrit au 1.1. L'extrait est acétyle par la méthode
classique de N-acetylation; le peptide Fab N-acétyle est classique
ment condensé par ses fonctions carboxyliques avec la serum albumine
humaine et l'on obtient, après désacetylation le complexe Fab-SAH
par plusieurs précipitations éthanoliques à froid, à partir des
conditions classiques de COHN.On verifie les interactions spécifiques
de la fraction Fab-SAH vis-à-vis des sites antigéniques de membranes
(à l'aide de dérivés fluorescents), vis-à-vis des extraits GT et MCA
(à l'aide de Fab-SAH marqués à la peroxydase, contre des extraits
GT et MCA immobilisés sur des toiles de nylon 6.6! et vis- -vis
des immunocomplexes circulants, par des immunoélectrophorèses
classiques. Une fraction Fab-SAH prépare dans les mêmes conditions,
sans une N-acétylation préalable de l'extrait Fab, ne présente aucune
interaction spécifique avec les fractions antigéniques correspondantes.The oligopeptide of Fab type, with an average molecular weight of between
2000 and 5000, specifically combines with the MCA fraction or
the GT extract described in 1.1. The extract is acetylated by the method
classic N-acetylation; the Fab N-acetyl peptide is classic
mentally condensed by its carboxylic functions with serum albumin
human and, after deacetylation, the Fab-SAH complex is obtained
by several cold ethanolic precipitations, from
COHN classic conditions. We check the specific interactions
of the Fab-SAH fraction vis-à-vis the antigenic sites of membranes
(using fluorescent derivatives), with respect to the GT and MCA extracts
(using Fab-SAH labeled with peroxidase, against extracts
GT and MCA immobilized on nylon canvas 6.6! and vis-a-vis
circulating immunocomplexes, by immunoelectrophoresis
classics. A Fab-SAH fraction prepares under the same conditions,
without prior N-acetylation of the Fab extract, has no
specific interaction with the corresponding antigenic fractions.
EXEMPLE 2. EXAMPLE 2.
Mise en évidence et détermination spécifique d immunocomplexes circu
liants à laide de plaquettes à revêtements de type Fab-SAH.Detection and specific determination of circu immunocomplexes
binders using Fab-SAH type coated plates.
Des plaquettes à microcupules, du modèle classiquement employé pour les microtitrations en hématologies sont utilisées pour une des variantes de mise en oeuvre du procédé. On introduit dans le fond de chaque microcupule 5Q microlitres d'une solution de Fab-SAH, additionnée de 0,3% de glutaraldehyde comme agent de rétîculation; les plaquettes sont placées horizontalement sur un plateau animé d'un mouvement rotatif9 on laisse sécher spontanément sous agitation pour former un revêtement en film mince sous l'action de la réticulation. Des cupules temoins sont réalisées à partir de SAH pure. On peut avantageusement ajouter de la gélatine chaulée à la solution de Fab-SAH, à une concentration comprise entre 5 et 10 g pour 100 ml. Microcupule plates, of the model conventionally used for microtitrations in hematology are used for one of the variants of implementation of the method. 5Q microliters of a Fab-SAH solution, added with 0.3% of glutaraldehyde as crosslinking agent, are introduced into the bottom of each microcupule; the plates are placed horizontally on a plate animated by a rotary movement9 allowed to dry spontaneously with stirring to form a thin film coating under the action of crosslinking. Control wells are made from pure SAH. It is advantageous to add limed gelatin to the Fab-SAH solution, at a concentration of between 5 and 10 g per 100 ml.
On introduit dans les cupules des dilutions d'extraits GT, d'extraits
MCA et de sérums de patients atteints de la maladie de Chagas. Après 10 à 15 mn d'incubation, on élimine les solutions à tester, on lave par un tampon classique et on ajoute.des solutions d'anti GT marqués à la péroxydase pour les extraits GT et,MCB et d'anti Ig G humaines marquées à la péroxydase pour les sérums chagasiques. Les révelations-colorees classiques permettant de vérifier les déterminations et les témoins SAH pure ne montrent aucune adsorption non spécifique.Des tests comparatifs à partir de différentes dilutions de sérums chagasiques, utilisant des Anti Ig humaines marquées à la péroxydasea des fractions Ci.q marquées à la péroxydase, des extraits de protéine A marqués à la péroxydase ou des polytryptophanes marqués à la péroxydase montrent, après coloration, des corrélations strictes entre les différents tests.Dilutions of GT extracts, extracts are introduced into the wells
MCA and sera from patients with Chagas disease. After 10 to 15 min of incubation, the solutions to be tested are eliminated, washed with a conventional buffer and added. Solutions of anti GT marked with peroxidase for the extracts GT and, MCB and of anti Ig G human labeled with peroxidase for chagasic sera. The classic colored revelations making it possible to verify the determinations and the pure SAH controls do not show any non-specific adsorption. Comparative tests using different dilutions of chagasic sera, using human anti Ig labeled with peroxydasea of the Ci.q fractions labeled with peroxidase, extracts of protein A labeled with peroxidase or polytryptophans labeled with peroxidase show, after staining, strict correlations between the different tests.
EXEMPLE 3. EXAMPLE 3.
Caractérisation de l immunocomplexe spécifique de T. Cruzi par fixation
sur des toiles de nylon substituées par du poLytryptophane, par le
Ca ou par la protéine A et par révélation à L aide d Ig G spécifique
du site antigénique de membrane.Characterization of the specific immunocomplex of T. Cruzi by fixation
on nylon fabrics substituted by polyLytryptophan, by
Ca or by protein A and by revelation using specific Ig G
of the membrane antigenic site.
Sur une toile de nylon 6.6, on greffe de façon covalente à l'aide de moyens connus (dicyano-1,6-hexane, carbodiitnides, etc.) du polytryptophane, une prëparation de fraction C1.q ou de protéine A. La toile de nylon est formée d'un fil de 40 de diamètre; elle présente un pourcentage de vide de 30% et con- porte 100 fils au centimètre linéaire, l'épaisseur du tissu étant de 70 .Après lavage et séchage, la toile peut être conditionnée pour être indifféremment utilisée soit sous forne de pastilles ou de disques à introduire dans des tubes réactionnels, soit sous forme de bandelettes montées par thermosoudage sur des supports unitaires utilisables par trempage ou sur des plaquettes comportant des cupules reactionnelles. La toile réactionnelle est mise au contact du sérum à tester; après 10 à 15 mn de contact, on effectue trois lavages successifs. L'irnnunocomplexe, foxé sur la toile de nylon par son extrémité anticorps, est ensuite révélé spécifiquement à l'aide d'anti-MCA, ou d'oligopeptide de type Fab-SAH, préparé dans les conditions décrites à l'exemple l (1.1. et 1.2.) et conjugue avec de la péroxydase. Polytryptophan, a preparation of fraction C1.q or protein A, is covalently grafted onto nylon 6.6 mesh covalently using known means (dicyano-1,6-hexane, carbodiitnides, etc.). nylon is formed from a wire 40 in diameter; it has a void percentage of 30% and contains 100 threads per linear centimeter, the fabric thickness being 70. After washing and drying, the fabric can be conditioned to be used either in the form of pellets or discs to be introduced into reaction tubes, either in the form of strips mounted by heat sealing on unitary supports usable by dipping or on plates comprising reaction wells. The reaction fabric is brought into contact with the serum to be tested; after 10 to 15 minutes of contact, three successive washes are carried out. The immunocomplex, foxed on the nylon fabric by its antibody end, is then revealed specifically using anti-MCA, or of oligopeptide of the Fab-SAH type, prepared under the conditions described in Example 1 ( 1.1. And 1.2.) And conjugates with peroxidase.
EXEMPLE 4. EXAMPLE 4.
Révélation directe de l'immunocomplexe par immunoprécipitation en pré
sence d'un mélange d oligopeptide de type Fab-SAH et d'Anti-Ig G marqué
à la péroxydase.Direct revelation of the immunocomplex by pre immunoprecipitation
presence of a mixture of oligopeptide type Fab-SAH and labeled Anti-Ig G
with peroxidase.
Pour des dilutions du sérum à tester placées dans des tubes à hémolyse, on introduit directement un mélange en solution d'oligopeptide de type
Fab-SAH préparé dans les conditions de l'exemple 1 et d'anti-Ig G humaine, marqué à la péroxydase
Les tubes sont incubés sur plateau vibrant pendant 10 mn à la température ordinaire. Cn centrifuge 15 mn à 2000g et on lave plusieurs fois le préci- pite par de l'eau physiologique. On révèle ensuite classiquement l'immunocomplexe marque à la péroxydase. For dilutions of the test serum placed in hemolysis tubes, a mixture of oligopeptide solution of the type is directly introduced
Fab-SAH prepared under the conditions of Example 1 and of human anti-Ig G, labeled with peroxidase
The tubes are incubated on a vibrating plate for 10 min at ordinary temperature. Centrifuge for 15 min at 2000 g and the precipitate is washed several times with physiological water. The peroxidase-labeled immunocomplex is then conventionally revealed.
Bien entendu, la présente invention n'est nullement limitée aux modes de réalisation décrits et représentés; elle est susceptible de nombreuses variantes accessibles à l'homme de l'art, suivant les applications envisagées et sans que l'on ne s'écarte de l'esprit de l'invention. Of course, the present invention is in no way limited to the embodiments described and shown; it is susceptible of numerous variants accessible to those skilled in the art, depending on the applications envisaged and without departing from the spirit of the invention.
Claims (20)
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8122363A FR2530818B1 (en) | 1981-11-30 | 1981-11-30 | PROCESS FOR PREPARING A TERMINAL OLIGOPEPTIDE SPECIFIC TO THE SURFACE ANTIGEN OF AN INFECTIOUS GERM, DETERMINATION OF THIS GERM AND DEVICE FOR IDENTIFYING IT |
| AR29138282A AR229481A1 (en) | 1981-11-30 | 1982-11-23 | PROCEDURE FOR THE PREPARATION OF A TERMINAL OLIGOPEPTIDE OF THE FAB TYPE, SPECIFIC OF THE SURFACE ANTIGEN OF TRYPANOSOMA CRUZI AND DEVICE FOR ITS IDENTIFICATION |
| BR8207035A BR8207035A (en) | 1981-11-30 | 1982-11-30 | DEVICE FOR THE INDECIFICATION OF A SPECIFIC IMMUNOCOMPLEX OF AN INFECTIOUS GERM, PROCESS OF PREPARATION OF A SPECIFIC TERMINAL OLIGOPEPTIDE OF THIS SURGERY ANTIGEN AND METHOD OF DETERMINING THE PRESENCE OF A SPECIFIC GERM IMMUNOCOMPLEXE |
Applications Claiming Priority (1)
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ID=9264487
Family Applications (1)
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