FR2525902A1 - Multivalent meningococcal vaccine prodn. - by growing separate serotype(s) on solid protein deficient media - Google Patents
Multivalent meningococcal vaccine prodn. - by growing separate serotype(s) on solid protein deficient media Download PDFInfo
- Publication number
- FR2525902A1 FR2525902A1 FR8207557A FR8207557A FR2525902A1 FR 2525902 A1 FR2525902 A1 FR 2525902A1 FR 8207557 A FR8207557 A FR 8207557A FR 8207557 A FR8207557 A FR 8207557A FR 2525902 A1 FR2525902 A1 FR 2525902A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- vaccine
- acetone
- sero
- culture
- dry
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/095—Neisseria
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Description
La présente invention concerne la médecine et a notamment pour objet un procédé de préparation d'un vaccin chimique méningococcique à composants multiples ou "poly- composant", qui trouve une application notamment dans l'immunoprophylaxie vis-à-vis des affections dues à la méningite cérébro-spinale méningococcique et aux méningosepticémies, affections provoquées par les méningocoques de tous les séro-groupes connus : A, B, C, D, X, Y, Z, 29 E, W-135, ainsi que le vaccin obtenu par ledit procédé. The present invention relates to medicine and in particular relates to a process for the preparation of a multi-component or "poly-component" meningococcal chemical vaccine, which finds application in particular in immunoprophylaxis with regard to conditions due to meningococcal and meningococcal meningococcal meningitis, conditions caused by meningococci of all known sero-groups: A, B, C, D, X, Y, Z, 29 E, W-135, as well as the vaccine obtained by said process.
On connait à l'heure actuelle des procédés de préparation de vaccins méningococciques chimiques, par exemple un procédé de fabrication d'un vaccin méningococcique à polysaccharides (brevet Etats-Unis NO 3636192), dont l'action est dirigée contre les méningocoques des séro-groupes A et C. Le principe actif de ce vaccin est constitué par les polysaccharides antigènes à groupements spécifiques des méningocoques des groupes A et C. Le procédé de préparation consiste à cultiver sur un milieu nutritif liquide une culture de méningocoques, en qualité de laquelle on utilise les souches Neisseria meningitidis A-l, Neisseria meningitidis C-11, puis on la précipite par un détergent cationique, le bromure d'hexadécyltriméthylammonium.On isole le demi-produit brut par centrifugation, puis on sépare l'agent précipitant et le demi-produit brut et on soumet celui-ci à une épuration préliminaire en le débarrassant des acides nucléiques par précipitation avec l'éthanol. Ensuite on concentre le demi-produit brut par précipitation avec de l'éthanol, après la précipitation on purifie le demi-produit en en éliminant la protéine par ultracentrifugation, on malaxe le centrifugat avec un mélange de chloroforme-butanol et on recueille la phase aqueuse. On effectue au moins 6 cycles d'une telle purification.Puis on précipite plusieurs fois le polysaccharide avec de lléthanol, on dissout le résidu dans une solution saturée d'acétate de sodium, on le reprécipite par ltéthanol, on dissout le résidu dans l'eau et on le soumet à un ultracentrifugeage , on recueille le centrigugat, on le précipite par l'éthanol. On obtient le polysaccharide méningococcique purifié des séro-groupes A et E. Le vaccin obtenu par ce procédé possède une stricte spécificité du groupe A et/ou C et ne protège pas contre les méningocoques d'autres séro-groupes, particulièrement du séro-groupe B. Processes for the preparation of chemical meningococcal vaccines are known at the present time, for example a process for manufacturing a meningococcal polysaccharide vaccine (United States patent NO 3636192), the action of which is directed against the meningococci of sero- groups A and C. The active principle of this vaccine consists of antigenic polysaccharides with specific groups of meningococci from groups A and C. The preparation process consists in cultivating a culture of meningococcus on a liquid nutritive medium, in the quality of which use the Neisseria meningitidis Al, Neisseria meningitidis C-11 strains, then precipitate it with a cationic detergent, hexadecyltrimethylammonium bromide. The crude semi-finished product is isolated by centrifugation, then the precipitating agent and the semi-finished product are separated. crude and subjected to a preliminary purification by removing it from the nucleic acids by precipitation with ethanol. Then the crude semi-finished product is concentrated by precipitation with ethanol, after the precipitation the semi-finished product is purified by removing the protein by ultracentrifugation, the centrifugate is kneaded with a mixture of chloroform-butanol and the aqueous phase is collected. . At least 6 cycles of such purification are carried out. Then the polysaccharide is precipitated several times with ethanol, the residue is dissolved in a saturated solution of sodium acetate, it is reprecipitated with ethanol, the residue is dissolved in water and subjected to ultracentrifuging, collecting the centrigugat, precipitating it with ethanol. The purified meningococcal polysaccharide of sero-groups A and E is obtained. The vaccine obtained by this process has a strict specificity for group A and / or C and does not protect against meningococci from other sero-groups, particularly from the sero-group B.
L'extension du diapason sérologique de l'action du vaccin exige une introduction complémentaire des médicaments d'autres antigènes des méningocoques, dont l'obtention nécessite l'utilisation de méthodes spéciales et un accroissement approprié de la dose par introduction de composants additionnels. De plus, les anticorps formés après l'introduction du vaccin ne sont dirigés que contre les polysaccharides en capsules à groupes spécifiques A et/ou C, mais ils n'agissent pas contre les autres substances de la paroi cellulaire des méningocoques.The extension of the serological range of the action of the vaccine requires a complementary introduction of the drugs of other antigens of the meningococci, the obtaining of which requires the use of special methods and an appropriate increase in the dose by introduction of additional components. In addition, the antibodies formed after the introduction of the vaccine are only directed against polysaccharides in capsules with specific groups A and / or C, but they do not act against the other substances of the cell wall of the meningococci.
On connatt aussi un procédé de préparation d'un vaccin méningococcique protéique du séro-type 2 (Jour. We also know a process for the preparation of a meningococcal protein vaccine of sero type 2 (Day.
Expérim. Med. 1978, 147, 629-644), contenant une substance active, la protéine de la membrane externe des méningocoques du séro-type 2, des séro-groupes B, C, Y, W-135. L'action de ce vaccin est dirigée contre les méningocoques du séro-type 2 des séro-groupes B, C, Y, W-I 35. Le procédé de préparation du vaccin consiste à cultiver une culture de méningocoques sur un milieu nutritif liquide exempt de protéine. On utilise les souches N.meningitidis M-986 et M-986-NCV-I. On effectue la culture sous secouage, on recueille la masse microbienne sous forme de précipité à la suite de la centrifugation du milieu liquide .On extrait la masse microbienne , on recueille ensuite le centrifugat par ultracentrifugation, on soumet le centrifugat à une filtration sur gel et on récolte une fraction macromoléculaire # 7000000 daltons. Puis on additionne le désoxycholate de sodium jusqu'à la concentration de 5% et on chauffe à la température de 560C pendant 30 minutes, ou on ajoute le prouit connu sous la décomSSS comerclale "Triton X-100" et on mairtient 30 minutes à la température ambiante, ou on ajoute le produit connu sous la dénominaüon commerclale "Emulphogère BC-720".On centrifuge le mélagne du dami-produit et l'un des dCtergents, on précipite avec l'éthanol, on dissout et on sépare de la solution
une fraction de volume libre pendant la filtration sur gel à travers le séphadex G-150. On précipite avec l'éthanol la fraction macromoléculaire. La préparation obtenue de protéine séro-typique protège seulement contre les méningocoques du type homologue. Le vaccin indiqué est doté d'une spécificité stricte typique et ne forme pas des anticorps contre les polysaccharides de groupe.L'extension du diapason sérologique de l'action du vaccin exige une introduction additionnelle d'autres antigènes des méningocoques, dont l'obtention nécessite l'utilisation de méthodes spéciales et une augmentation appropriée de la dose par administration de composants additionnels. Les anticorps formés après l'introduction du vaccin ne sont dirigés que contre la protéine du séro-type 2 de la membrane externe des méningocoques et n'agissent pas contre les autres substances de la paroi cellulaire des méningocoques.Experimental. Med. 1978, 147, 629-644), containing an active substance, the outer membrane protein of sero-type 2 meningococci, sero-groups B, C, Y, W-135. The action of this vaccine is directed against the meningococci of the sero type 2 of the sero groups B, C, Y, WI 35. The method of preparation of the vaccine consists in cultivating a culture of meningococci on a liquid nutritive medium free of protein . The N. meningitidis M-986 and M-986-NCV-I strains are used. The culture is carried out with shaking, the microbial mass is collected in the form of a precipitate following the centrifugation of the liquid medium. The microbial mass is extracted, the centrifugate is then collected by ultracentrifugation, the centrifugate is subjected to gel filtration and we collect a macromolecular fraction # 7000000 daltons. Then add the sodium deoxycholate to a concentration of 5% and heat to the temperature of 560C for 30 minutes, or add the product known as the decomSSS comerclale "Triton X-100" and stay in the water for 30 minutes. room temperature, where the product known under the trade name "Emulphogère BC-720" is added. The mixture of dami-product and one of the detergents is centrifuged, precipitated with ethanol, dissolved and separated from the solution
a fraction of free volume during gel filtration through Sephadex G-150. The macromolecular fraction is precipitated with ethanol. The preparation obtained from sero-typical protein protects only against homologous type meningococci. The indicated vaccine has a typical strict specificity and does not form antibodies against group polysaccharides. Extending the serological range of vaccine action requires additional introduction of other meningococcal antigens, including obtaining requires the use of special methods and an appropriate dose increase by administration of additional components. The antibodies formed after the introduction of the vaccine are only directed against the sero-type 2 protein of the meningococcal outer membrane and do not act against the other substances of the meningococcal cell wall.
On connait également un procédé de préparation d'un vaccin méningococcique, contenant en tant que principe actif un composé hydrophobe du polysaccharide méningococcique du groupe B et de la protéine principale du sérotype 2 de la membrane externe des méningocoques (Jour.Clin. There is also known a process for the preparation of a meningococcal vaccine, containing as active ingredient a hydrophobic compound of the meningococcal polysaccharide of group B and of the main protein of serotype 2 of the outer membrane of the meningococci (Jour.Clin.
Invest. 1979, 63, N05, 836-848). L'action du vaccin est dirigée contre les méningocoques du séro-groupe B des séro-types 2, 4, 6, 7, 11, 14. Le procédé de préparation du vaccin consiste à réaliser une culture des souches
N.meningitidis M îooe (B:Pi1:L3,4,7,8); M 981 (B:P 14:L5);
M 136 (B:P 4,7:L4), sur un milieu liquide sans protéine sous secouage.On isole le polysaccharide du groupe B par la méthode de Gotschlich, suivant laquelle la culture liquide est additionnée de 0,1,' de bromure dthexadécyl- triméthylammonium, on recueille le résidu par centrifugation, on sépare l'agent précipitant et le demi-produit brut, on effectue une purification préalable par précipitation à l'éthanol, on dissout le précipité, on reprécipite, on lave à l'éthanol, on dissout et on obtient un produit de polysaccharide du groupe B. On isole la protéine de la membrane externe par traitement de la masse microbienne au phénol à 0,5 % pendant 2 heures.On recueille le précipité microbien par centrifugation-du milieu liquide, on le suspend dans la solution tampon, on centrifuge trois fois le mélange, on recueille le centrifugat, qu'on soumet à l'ultracentritu- geage, et on recueille le précipité qu'on dissout et élimine par des lipopolysaccharides par filtration sur gel à travers le produit connu sous la dénomination commerciale "Séphadex G-lOO", puis on centrifuge, on isole par filtration sur gel une fraction macromoléculaire d'un volume libre du centrifugat, qu'on précipite avec de l'éthanol, on lave à l!éthanol et on dissout dans l'eau. On obtient une solution de protéine des séro-types 2, 4, 6, 7, 11, 14.On prépare le vaccin par combinaison d'un polysaccharide du groupe B et une protéine des séro-types 2, 4, 6, 7, 11, 14 de la membrane externe des méningocoques. Le vaccin obtenu n'est pas capable de former les anticorps à gard d'un composant important de la paroi cellulaire des méningocoques tel que le lipopolyvaccharide. Invest. 1979, 63, N05, 836-848). The action of the vaccine is directed against the meningococci of the sero-group B of the serotypes 2, 4, 6, 7, 11, 14. The method of preparation of the vaccine consists in carrying out a culture of the strains
N. meningitidis Mooe (B: Pi1: L3,4,7,8); M 981 (B: P 14: L5);
M 136 (B: P 4.7: L4), on a liquid medium without protein under shaking. The polysaccharide of group B is isolated by the Gotschlich method, according to which the liquid culture is added with 0.1% bromide. dthexadecyltrimethylammonium, the residue is collected by centrifugation, the precipitating agent is separated from the crude semi-product, purification is carried out beforehand with ethanol precipitation, the precipitate is dissolved, reprecipitated, washed with ethanol , it is dissolved and a group B polysaccharide product is obtained. The protein is isolated from the outer membrane by treatment of the microbial mass with 0.5% phenol for 2 hours. The microbial precipitate is collected by centrifugation - from the liquid medium. , it is suspended in the buffer solution, the mixture is centrifuged three times, the centrifugate is collected, which is subjected to ultra-centering, and the precipitate is collected which is dissolved and eliminated by lipopolysaccharides by gel filtration. through the product t known under the trade name "Sephadex G-100", then centrifuged, isolated by gel filtration a macromolecular fraction of a free volume of the centrifugate, which is precipitated with ethanol, washed with ethanol! and dissolve in water. A protein solution of serotypes 2, 4, 6, 7, 11, 14 is obtained. The vaccine is prepared by combining a group B polysaccharide and a protein of serotypes 2, 4, 6, 7, 11, 14 of the outer membrane of the meningococci. The vaccine obtained is not capable of forming antibodies against an important component of the meningococcal cell wall such as the lipopolyvaccharide.
Le vaccin ne provoque pas la formation d'anticorps contre les méningocoques du séro-groupe A, et exige par conséquent l'introduction de composants additionnel pour l'extension du diapason de son action, en particulier l'introduction de polysaccharide du groupe A. Le mélange obtenu de polysaccharide du groupe B et de protéine des sero-types 2, 4, 6, 7, 11, 14 n'est pas une combinaison naturelle, mais une combo naison artificielle secondaire hydrophobe non covalent dè préparations individuelles.The vaccine does not cause the formation of antibodies against the meningococci of sero group A, and therefore requires the introduction of additional components for the extension of the range of its action, in particular the introduction of group A polysaccharide. The resulting mixture of Group B polysaccharide and serotype 2, 4, 6, 7, 11, 14 protein is not a natural combination, but a non-covalent hydrophobic secondary artificial combination of individual preparations.
On connait également un procédé de préparation d'un vaccin ménkypcoccique, renfermant à titre de principe actif la protéine de la membrane des méningocoques du séro-groupe
B, du séro-type 2 (brevet R.F.A. N 2848965). L'action du vaccin est dirigée contre les méningocoques du séro-groupe 2.There is also known a process for the preparation of a menkypcoccal vaccine, containing as active ingredient the membrane protein of the meningococci of the sero-group.
B, sero-type 2 (RFA patent N 2848965). The action of the vaccine is directed against meningococci of sero-group 2.
Le procédé consiste à cultiver la souche N.meningitidis
B-986 sur un milieu nutritif liquide. On traite la masse microbienne par un détergent, en qualité duquel on utilise le désoxycholate de sodium ou l'urée à 4 M, ou l "'Emulphogèner (dénomination commerciale) à 1 46, ou le Tween (dénomination commerciale)à 1 %, ou le (dénomination commerciale) "Triton X-1OO" à 1 %. On centrifuge la suspension defnicrobes dans une solution de détergent, on recueille le centrifugat, on traite le résidu microbien une seconde fois pour augmenter le rendement.On soumet la solution à 1 'ultra-centrifugation, on recueille le précipité, qu'on dissout encore une fois dans une solution tampon de détergent par traitement aux ultrasons. On clarifie la solution par centrifugation. On précipite la protéine et on lave à l'éthanol. On dissout le précipité protéique dans le raffinose à 5 %, on prépare le vaccin de la solution obtenue. On prépare le vaccin seulement à la protéine du séro-type 2, c'est pourquoi le vaccin ne protège pas contre l'infection méningococcique du séro-groupe A, ainsi que contre d'autres séro-types, sauf le séro-type 2. Le vaccin ne provoque pas la formation d'anticorps à l'égard de certains facteurs pathogéniques importants des méningocoques, tels que les polysaccharides et les lipopolysaccharides de groupe.The method consists in cultivating the N. meningitidis strain
B-986 on a liquid nutrient medium. The microbial mass is treated with a detergent, in the quality of which sodium deoxycholate or 4 M urea is used, or the "Emulphogener (trade name) at 146, or Tween (trade name) at 1%, or the (trade name) "Triton X-1OO" at 1%. The suspension of microbes is centrifuged in a detergent solution, the centrifugate is collected, the microbial residue is treated a second time to increase the yield. The solution is subjected to Ultra-centrifugation, the precipitate is collected, which is again dissolved in a detergent buffer solution by ultrasound treatment, the solution is clarified by centrifugation, the protein is precipitated and washed with ethanol. the protein precipitate in 5% raffinose, the vaccine of the solution obtained is prepared. The vaccine is prepared only with the sero-type 2 protein, that is why the vaccine does not protect against meningococcal infection of the sero-type group A, as well as against others res serotypes, except serotype 2. The vaccine does not cause the formation of antibodies against certain important pathogenic factors of meningococci, such as polysaccharides and group lipopolysaccharides.
Dans tous les procédés indiqués de préparation du vaccin méningococcique, on utilise des milieux nutritifs liquides, qui crient des conditions favexables pour la culture aesméningocoques, c'est pourquoi les microbes sont doués de propriétés physiologiques de valeur requise et sont plus toxiques. Cela nécessite l'utilisation, dans le procédé de préparation du vaccin, d'une séquence de procédures technologiques de purification vis-à-vis des lipopolysaccharides. L'emploi, dans les procédés indiqués, de détergents pour l'isolement des principes actifs du vaccin, rend la technologie complexe, puisqu'il exige l'introduction d'opérations additionnelles pour l'élimina- tion du détergent.De plus, l'isolement, par les procédés indiqués, du principe actif consistant en un seul produit parmi l'ensemble des substances contenues dans la paroi cellulaire des méningocoques exige des opérations supplémentaires de purification, ce qui rend plus compliqué le processus et nécessite l'utilisation d'un équipement plus complexe. In all the methods indicated for the preparation of the meningococcal vaccine, liquid nutritive media are used, which cry out favorable conditions for the aesmenococcal culture, this is why the microbes are endowed with physiological properties of required value and are more toxic. This requires the use, in the vaccine preparation process, of a sequence of technological purification procedures vis-à-vis the lipopolysaccharides. The use, in the processes indicated, of detergents for the isolation of the active principles of the vaccine, makes the technology complex, since it requires the introduction of additional operations for the elimination of the detergent. isolation, by the methods indicated, of the active principle consisting of a single product among all of the substances contained in the cell wall of the meningococci requires additional purification operations, which makes the process more complicated and requires the use of more complex equipment.
On s'est donc proposé, en modifiant les opérations technologiques, de créer un procédé permettant d'obtenir un vaccin méningococcique chimique polycomposant à action dirigée contre les méningocoques de tous les séro-groupes connus, inoffensif, faiblement réactogène, qui trouverait application dans la vaccination aussi bien des adultes que des enfants et permettrait également de simplifier la technologie du processus et de l'équipement. It has therefore been proposed, by modifying the technological operations, to create a process making it possible to obtain a multi-component chemical meningococcal vaccine with action directed against meningococci of all known sero-groups, harmless, weakly reactogenic, which would find application in the immunization of both adults and children and would also simplify process and equipment technology.
La solution consiste en ce que dans le procédé de préparation d'un vaccin méningococcique chimique polycomposant, par culture de méningocoques sur un milieu nutritif exempt de protéines, avec isolement subséquent d'une fraction macromoléculaire polymère, suivant l'invention on effectue séparément les cultures de méningocoques des séro-groupes A, B et C sur un milieu nutritif solide exempt de protéines, on élue séparément la masse microbienne obtenue de chaque séro-groupe avec une solution isotonique de chlorure de sodium à pH de 7,0 à 7,6, on neutralise la liqueur ds culture obtenue par l'acétone, on dissout le précipité sec indiqué dans une solution tampon à pH = 7,6, non supérieure à 0,2 M, et on le soumet à une filtration sur gel avec isolement d'une fraction polymère à masse moléculaire d'au moins 100000 daltons, on traite la fraction obtenue par l'acétone, on lave le précipité formé et on sèche à l'acétone; on mélange les résidus secs des fractions de chacun des séro-groupes A, B, C dans des rapports pondéraux de 14:13:13, respectivement. En qualité de cultures de méningocoques on utilise de préférence les souches des séro-groupes A, B, C Neisseria meningitidis, la souche A-208; la souche B-13090, ou la souche B-23247, ou la souche B-C5; la souche C-0638. Toutes les souches indiquées sont déposées dans la collection de cultures de l'institut d'Etat de standardisation et de contre
L.A. Tarasevich. The solution consists in that in the process for the preparation of a multi-component chemical meningococcal vaccine, by culture of meningococcus on a nutritive medium free of proteins, with subsequent isolation of a polymeric macromolecular fraction, according to the invention, cultures are carried out separately. of meningococci of sero-groups A, B and C on a solid nutritive medium free of proteins, the microbial mass obtained from each sero-group is eluted separately with an isotonic solution of sodium chloride at pH 7.0 to 7.6 , the culture liquor obtained is neutralized with acetone, the dry precipitate indicated is dissolved in a buffer solution at pH = 7.6, not greater than 0.2 M, and subjected to gel filtration with isolation of a polymer fraction with a molecular mass of at least 100,000 daltons, the fraction obtained is treated with acetone, the precipitate formed is washed and dried with acetone; the dry residues of the fractions of each of the sero-groups A, B, C are mixed in weight ratios of 14:13:13, respectively. As meningococcal cultures, the strains of the sero groups A, B, C, Neisseria meningitidis, the strain A-208 are preferably used; strain B-13090, or strain B-23247, or strain B-C5; strain C-0638. All the indicated strains are deposited in the culture collection of the State Institute for Standardization and Counter
THE Tarasevich.
En qualité de milieu nutritif solide, exempt de protéines, il est rationnel d'utiliser un milieu nutritif de composition suivante
milieu sec 199 17,5 g
eau de viande 400 ml
pâte d'amidon (1,5%) 100 ml
eau distillée 500 ml
agar-agar 20 g
chlorure de soude 10 g solution à 20% de soude jusqu'à un pH de 7,4 à 7,6.As a solid nutrient medium, free of proteins, it is rational to use a nutrient medium of the following composition
dry medium 199 17.5 g
meat water 400 ml
starch paste (1.5%) 100 ml
distilled water 500 ml
agar-agar 20 g
sodium chloride 10 g 20% sodium hydroxide solution up to a pH of 7.4 to 7.6.
Pour une dissolution plus complète des substances de la paroi cellulaire on ajoute à la suspension de culture obtenue, après neutralisation, une solution à 20% de soude Jusqu'à un pH de 8,2 à 8,4. Le procédé proposé permet d'obtenir un vaccin chimique méningococcique polycomposant à action dirigée contre les méningocoques de tous les séro-groupes connus - A, B, C, D, X, Y, Z, 29 E, W-I 35. For a more complete dissolution of the substances of the cell wall, a 20% sodium hydroxide solution is added to the culture suspension obtained, after neutralization, until a pH of 8.2 to 8.4. The proposed method makes it possible to obtain a multi-component meningococcal chemical vaccine with action directed against meningococci of all known sero-groups - A, B, C, D, X, Y, Z, 29 E, W-I 35.
Le vaccin est inoffensif et peu réactogène, grace à quoi il peut être utilisé pour l'immunisation tant des adultes que des enfants. L'utilisation, dans le procédé, de milieux nutritifs solides exempts de protéines, permet d'obtenir un microbe de méningocoque à l'étant faiblement toxique, étant donné que sa culture se déroule dans des conditions défavorables. Cela permet de conserver dans la substance active du vaccin le lipopolysaccharide de la paroi cellulaire, vu sa faible toxicité. Les conditions défavorables de culture sur le milieu nutritif solide sont la cause de la formation d'une paroi cellulaire friable de méningocoques, facilement soluble par lavage avec une solution physiologique,et n'exige pas l'utilisation de détergents.The vaccine is harmless and not very reactogenic, thanks to which it can be used for immunization of both adults and children. The use, in the process, of solid nutritive media free of proteins, makes it possible to obtain a meningococcus microbe with being slightly toxic, since its culture takes place under unfavorable conditions. This allows the lipopolysaccharide of the cell wall to be preserved in the active substance of the vaccine, given its low toxicity. The unfavorable conditions of culture on the solid nutritive medium are the cause of the formation of a friable cell wall of meningococci, easily soluble by washing with a physiological solution, and does not require the use of detergents.
Tout cela simplifie la technologie du processus, étant donné que certaines opérations pour la purification du principe actif, qui doivent être exécutées dans les procédés connus de préparation du vaccin, sont éliminées. De plus, l'isolement du principe actif du vaccin suivant l'invention n'exige pas des opérations de purification supplémentaires, comme dans les procédés connus, vu que le principe actif est un complexe naturel de toutes les substances de la paroi cellulaire des méningocoques.All this simplifies the technology of the process, since certain operations for the purification of the active ingredient, which have to be carried out in the known methods of preparing the vaccine, are eliminated. In addition, the isolation of the active principle of the vaccine according to the invention does not require additional purification operations, as in the known methods, since the active principle is a natural complex of all the substances of the cell wall of the meningococci .
L'invention sera mieux comprise et d'autres buts, détails et avantages de celle-ci apparattront mieux à la lumière de la description qui va suivre de différents modes non limitatifs de réalisation de l'invention. The invention will be better understood and other objects, details and advantages thereof will appear more clearly in the light of the following description of various nonlimiting embodiments of the invention.
En qualité de souches de vaccin A, B, et C, il est rationnel d'utiliser les souches Neisseria meningitidis, la souche A-208; la souche B-13090 ou la souche B-23247, ou la souche B-C5; la souche C-0638. As vaccine strains A, B, and C, it is rational to use the Neisseria meningitidis strains, strain A-208; strain B-13090 or strain B-23247, or strain B-C5; strain C-0638.
Pour obtenir la culture d'ensemencement des souches de vaccin de méningocoques, on ouvre l'ampoule contenant la culture sèche dans des conditions stériles et on dissémine dans deux bottes de Pétri avec un milieu nutritif solide contenant 20 de sérum sanguin. On réalisé la culture à la température de 370C dans une chambre humide étanche pendant 18-20 heures. Pour obtenir des cultures de production, les cultures d'ensemencement sont enlevées de dessus les bottes de Pétri avec une solution de Hanks réchauffée préalablement jusqu'à la température de 370C. To obtain the seed culture of the meningococcal vaccine strains, the ampoule containing the dry culture is opened under sterile conditions and disseminated in two petri dishes with a solid nutrient medium containing blood serum. The culture is carried out at a temperature of 370C in a sealed humid chamber for 18-20 hours. To obtain production cultures, the seed cultures are removed from above the Petri dishes with a Hanks solution previously warmed to the temperature of 370C.
On obtient une suspension contenait 1 milliard de corps microbiens dans 1 ml. On ensemence 5 ml de cette suspension de méningocoques dans chaque matras contenant le milieu nutritif solide de composition précitée. On conduit la culture de production (de chaque souche séparément) sur un milieu nutritif solide de composition suivante
milieu sec 199 (préparation
Casamino acids "Difco") 17,5 g
eau de viande 400 ml
pâte d'amidon (1,5 ) 100 ml
eau distillée 500 ml
agar-agar 20 g
chlorure de soude 10 g
solution à 20% de soude jusqu'à un pH de 7,4 à 7,6.We obtain a suspension containing 1 billion microbial bodies in 1 ml. 5 ml of this meningococcal suspension are inoculated into each flask containing the solid nutritive medium of the above-mentioned composition. The production culture is carried out (of each strain separately) on a solid nutritive medium of the following composition
dry environment 199 (preparation
Casamino acids "Difco") 17.5 g
meat water 400 ml
starch paste (1.5) 100 ml
distilled water 500 ml
agar-agar 20 g
sodium chloride 10 g
20% sodium hydroxide solution up to a pH of 7.4 to 7.6.
On stérilise le milieu dans un autoclave à la température de 1150C à raison de 30 minutes par jour pendant trois jours. On réalise la culture à la température de 37 C pendant 18-20 heures. Une fois la culture achevée, on examine les matras. La culture de production doit croitre sous forme de colonies rondes, lisses, aplaties, légèrement opalescentes, jusqu'à 3 mm de diamètre, ayant à la lumière une couleur bleuâtre. Le matras est mis au rebut s'il contient des colonies atypiques. On prélève une prise à partir de chaque matiras, qu'on colore par la méthode de Gram. La microscopie doit détecter dans la prise seulement les cocus gram-négatifs. On lave la culture de production de méningocoques avec une solution à 0,9% de
NaCl, à pH de 7,0 à 7,6, on ajoute à la culture lavée du merthiolate jusqu'à une concentration de 0,01%.Pour une neutralisation complète de la suspension, on la maintient à la température ambiante pendant deux heures, sous agitation. Pour une dissolution plus complète des substances de la paroi cellulaire, on ajouteàlasuspension de culture obtenue après la neutralisation une solution à 20% de soude jusqu'à un pH de 8,2 à 8,4. On centrifuge la suspension de la culture de production afin d'éliminer le résidu microbien. On recueille le centrifugat limpide. On refroidit le centrifugat jusqu'à une temperature de +4 à +60C et on ajoute de l'acétone. On maintient le mélange obtenu à ladite température de +4 à +60C pendant 18 à 20 heures.The medium is sterilized in an autoclave at a temperature of 1150C at the rate of 30 minutes per day for three days. The culture is carried out at a temperature of 37 ° C. for 18-20 hours. Once the culture is complete, the matras are examined. The production culture should grow in the form of round, smooth, flattened, slightly opalescent colonies, up to 3 mm in diameter, having a bluish color in the light. The flask is discarded if it contains atypical colonies. We take a sample from each matiras, which we color using the Gram method. Microscopy should detect only gram-negative cuckolds in the socket. The meningococcal production culture is washed with a 0.9% solution of
NaCl, at pH 7.0 to 7.6, is added to the washed culture of merthiolate to a concentration of 0.01%. For complete neutralization of the suspension, it is kept at room temperature for two hours. , with stirring. For a more complete dissolution of the cell wall substances, a 20% sodium hydroxide solution is added to the culture suspension obtained after neutralization up to a pH of 8.2 to 8.4. The suspension of the production culture is centrifuged in order to remove the microbial residue. The clear centrifuge is collected. The centrifugate is cooled to a temperature of +4 to + 60C and acetone is added. The mixture obtained is maintained at said temperature from +4 to + 60C for 18 to 20 hours.
On sépare par centrifugation le précipité formé, on lave et on sèche à l'acétone. On obtient un précipité sec se présentant sous forme d'une poudre jaune ou brun clair.The precipitate formed is separated by centrifugation, washed and dried with acetone. A dry precipitate is obtained in the form of a yellow or light brown powder.
On obtient le précipité sec de la culture de production séparément à partir de chaque souche. On dissout séparément le précipité sec de chaque souche dans une solution tampon, par exemple dans des solutions tampons 01 Mtris, 0,01 M HCl, 0,15 M NaCl avec 0,01% de NaN3, à pH de 7,6. On centrifuge la solution obtenue pour clarification et on la soumet à une filtration sur gel avec isolement d'une fraction polymère à masse moléculaire d'au moins 100000 daltons.The dry precipitate of the production culture is obtained separately from each strain. The dry precipitate of each strain is dissolved separately in a buffer solution, for example in 01 Mtris buffer solutions, 0.01 M HCl, 0.15 M NaCl with 0.01% NaN3, at pH 7.6. The solution obtained is centrifuged for clarification and subjected to gel filtration with isolation of a polymer fraction with a molecular mass of at least 100,000 daltons.
On refroidit la fraction recueillie, contenant la matière vaccinale, jusqu a une température de +4 à +60C et on y ajoute de l'acétone. On maintient le mélange pendant 18 à 20 heures pour précipitation. On sépare le précipité par centrifugation, on lave et on sèche à l'acétone. On obtient une poudre sèche pulvérulente de couleur blanche ou jaunâtre. Les précipités secs de chaque fraction des séro-groupes A, B et C sont soumis à un contrôle de poids moléculaire.On soumet au contrôle le poids moléculaire des précipités secs des fractions par filtration dans une colonne remplie de gel Séphadex G-I 00. On conduit ltélution avec une solution 0,14 M de chlorure de soude contenant une solution 0,05 M de tris-hydroxyméthylaminométhane, et une solution 0,001 M de sel disodique d'acide éthylènediamine-tétra-acétique, et ayantn pH de 7,5.On recueille pendant ltélution des portions de 3 à 3,5 ml. La vitesse d'élution est de 15 à 20 ml/heure. On détermine d'abord le volume libre et le volume final (interne) du gel dans la colonne.Pour cela, on introduit dans la colonne 3 ml d'éluant contenant 5 mg de dextrane bleu (masse moléculaire de 2 millions de daltons) et 5 mg de merthiolate, on réalise une filtration sur gel et on soumet à la spectrophotométrie à 280 nm les portions de 3 à 3,5 ml recueillies.The collected fraction, containing the vaccine material, is cooled to a temperature of +4 to + 60 ° C. and acetone is added thereto. The mixture is kept for 18 to 20 hours for precipitation. The precipitate is separated by centrifugation, washed and dried with acetone. A powdery dry powder of white or yellowish color is obtained. The dry precipitates of each fraction of the sero-groups A, B and C are subjected to a molecular weight control. The molecular weight of the dry precipitates of the fractions is subjected to control by filtration in a column filled with Sephadex GI 00 gel. lelution with a 0.14 M solution of sodium chloride containing a 0.05 M solution of tris-hydroxymethylaminomethane, and a 0.001 M solution of disodium salt of ethylenediamine tetraacetic acid, and having a pH of 7.5. collects during the elution portions of 3 to 3.5 ml. The elution speed is 15 to 20 ml / hour. The free volume and the final (internal) volume of the gel are first determined in the column. To do this, 3 ml of eluent containing 5 mg of blue dextran (molecular mass of 2 million daltons) are introduced into the column and 5 mg of merthiolate, gel filtration is carried out and the 3 to 3.5 ml portions collected are subjected to spectrophotometry at 280 nm.
Le volume d'élution du premier pic sortant, coloré en bleu, correspond au libre volume de la colonne. Le volume d'élution du deuxième pic incolore correspond au volume final (interne) de la colonne. On dissout la préparation sèche à étudier dans la solution éluante à raison de 15 mg dans 3 ml, on centrifuge pour clarification, on introduit dans la colonne et on effectue une filtration sur gel.The elution volume of the first outgoing peak, colored blue, corresponds to the free volume of the column. The elution volume of the second colorless peak corresponds to the final (internal) volume of the column. The dry preparation to be studied is dissolved in the eluting solution at a rate of 15 mg in 3 ml, centrifuged for clarification, introduced into the column and filtration on gel is carried out.
On recueille les portions d'éluat de 3 à 3,5 ml, qu'on soumet à la spectrophotométrie à 280 nm. Le volume d'éluat total analysé doit correspondre au volume final de la colonne. La préparation analysée de la fraction de vaccin doit sortir de la colonne d'un seul pic dont le volume d'élution doit correspondre au libre volume de la colonne.The eluate portions of 3 to 3.5 ml are collected, which is subjected to spectrophotometry at 280 nm. The volume of total eluate analyzed must correspond to the final volume of the column. The preparation analyzed for the vaccine fraction must leave the column with a single peak, the elution volume of which must correspond to the free volume of the column.
Si la préparation contient des fractions formant des pics avec un volume d'élution dépassant le volume libre de la colonne, cette préparation ne peut pas titre utilisée pour l'obtention du vaccin, elle doit subir une purification supplémentaire.If the preparation contains fractions forming peaks with an elution volume exceeding the free volume of the column, this preparation cannot be used for obtaining the vaccine, it must undergo additional purification.
Les précipités secs de fractions de chaque séro-groupe l, B et C sont mélangés dans des conditions stériles dans des rapports pondéraux de 14:13:13, respectivement. Le mélange constitué par les précipités de trois souches et uniformément brassé est mis en flacons dans des conditions stériles. On bouche les flacons et on conserve à une température de à 0 à +40C à l'abri de la lumière. The dry precipitates of fractions from each sero group 1, B and C are mixed under sterile conditions in weight ratios of 14:13:13, respectively. The mixture constituted by the precipitates of three strains and uniformly stirred is put in bottles under sterile conditions. The bottles are capped and stored at a temperature of 0 to + 40 ° C protected from light.
Le vaccin est dissous avant utilisation dans une solution isotonique injectable de chlorure de soude. La quantité totale de substance sèche de la paroi cellulaire des méningocoques des groupes A, B et C dans le vaccin doit être de 400 g/ml. le vacoin peut etre préparé tent à l'état sec qu'à l'état liquide. The vaccine is dissolved before use in an isotonic solution for injection of sodium chloride. The total amount of dry cell wall substance of group A, B and C meningococci in the vaccine should be 400 g / ml. the vacoin can be prepared tent in the dry state than in the liquid state.
Le vaccin obtenu est une solution de substances de la paroi cellulaire des méningocoques des séro-groupes A,
B, C consistant en un ensemble de mucopolysaccharides de séro-groupe, de protéine typique, de lipopolysaccharides, de protéines de toutes espèces des méningocoques, qui se trouvent sous forme de composés macromoléculaires polymères (à masse moléculaire d'au moins 100.000 daltons), provoquant chez l'homme, après la vaccination, la formation d'anticorps bactéricides vis-à-vis des méningocoques des séro-groupes A, B ,C. Le vaccin fini est soumis à diverses méthodes de contrôle. On réalise le contrôle des propriétés physiques du vaccin par inspection des ampoules contenant le vaccin. Le vaccin doit se présenter sous forme d'une solution incolore limpide ou légèrement opalescente, ne contenant pas d'inclusions, de précipité ou de traces de trouble. Les ampoules dans lesquelles le vaccin ne correspond pas aux conditions requises sont mises au rebut.The vaccine obtained is a solution of substances from the cell wall of sero-group A meningococci,
B, C consisting of a set of mucopolysaccharides of sero-group, of typical protein, of lipopolysaccharides, of proteins of all meningococcal species, which are in the form of macromolecular polymeric compounds (with a molecular mass of at least 100,000 daltons), causing in humans, after vaccination, the formation of bactericidal antibodies against meningococci of sero groups A, B, C. The finished vaccine is subjected to various control methods. The physical properties of the vaccine are checked by inspection of the ampoules containing the vaccine. The vaccine should be in the form of a clear or slightly opalescent colorless solution, not containing inclusions, precipitate or traces of disorder. Ampoules in which the vaccine does not meet the required conditions are discarded.
On effectue un contrôle de la qualité du soudage des ampoules, un contrôle d'étiquetage correct, un contrôle de la stérilité du vaccin. On réalise le contrôle de l'innocuité du vaccin pour les souris blanches. On réalise l'expérience sur 5 souris blanches mises en quarantaine (avant l'expérience) pendant 5 jours. Le poids de chaque animal doit être de 12-14 g au début de l'essai. On injecte à chaque souris 1 ml de vaccin, c'est-à-dire deux doses humaines, par voie intrapéritonéale. Pour cela , on prend avec la seringue le contenu de deux ampoules. On observe ces souris pendant 7 jours. Aucune perte de souris ne doit se produire dans le groupe étudié pendant cette période. We carry out a quality control of the welding of the vials, a correct labeling control, a control of the sterility of the vaccine. The vaccine safety is monitored for white mice. The experiment is carried out on 5 white mice quarantined (before the experiment) for 5 days. The weight of each animal must be 12-14 g at the start of the test. Each mouse is injected with 1 ml of vaccine, that is to say two human doses, intraperitoneally. To do this, take the contents of two ampoules with the syringe. These mice are observed for 7 days. No loss of mice should occur in the study group during this period.
On effectue le contrôle de l'innocuité du vaccin pour les cobayes. On réalise l'expérience sur 5 cobayes de 350-400 g chacun, qu'on met en quarantaine avant l'expérience. On injecte à chaque cobaye 5 ml de vaccin, ctest-à-dire 10 doses humaines, par voie intrapéritonéale. On observe les cobayes vaccinés pendant 7 jours. Aucun sacrifice de cobayes ne doit se produire dans le groupe étudié pendant cette période. On effectue le contrôle des propriétés pyrogènes pour les lapins.The safety of the vaccine for guinea pigs is monitored. The experiment is carried out on 5 guinea pigs of 350-400 g each, which are quarantined before the experiment. Each guinea pig is injected with 5 ml of vaccine, that is to say 10 human doses, intraperitoneally. The vaccinated guinea pigs are observed for 7 days. No guinea pig sacrifice should occur in the study group during this period. The pyrogenic properties are checked for rabbits.
Le vaccin ne doit pas être pyrogène pour les lapins après introduction intraveineuse en dilution de 1:40000 dans le volume de 1 ml par kg de poids du lapin. The vaccine should not be pyrogenic for rabbits after intravenous introduction in a dilution of 1: 40000 in the volume of 1 ml per kg of rabbit weight.
On réalise l'étude sur des lapins sains des deux sexes, de 1,5 à 2,5 kg chacun, maintenus a des rations de valeur requise. On choisit les lapins 5 jours avant l'essai. On les pèse au moins 3 fois tous les deux jours, Les lapins ne doivent pas perdre de poids pendant la période qui précède l'essai (5 jours) On mesure la température des lapins expérimentaux pendant les 3 jours qui précèdent l'essai. La température initiale doit titre dans des limites de 38,5 à 39,50C. Vingt-quatre heures avant l'essai, on place les lapins dans un local, dans lequel on réalise l'épreuve de pyrogénéité. Avant et au cours de l'essai, les lapins ne reçoivent pas de nourriture, mais on leur donne de l'eau sans restriction. La pyrogénéité du vaccin a été contrôlée sur 5 lapins.The study is carried out on healthy rabbits of both sexes, 1.5 to 2.5 kg each, maintained at rations of required value. The rabbits are chosen 5 days before the test. They are weighed at least 3 times every two days. The rabbits must not lose weight during the period preceding the test (5 days). The temperature of the experimental rabbits is measured during the 3 days preceding the test. The initial temperature should be within 38.5 to 39.50C. Twenty-four hours before the test, the rabbits are placed in a room, in which the pyrogenicity test is carried out. Before and during the test, the rabbits do not receive food, but they are given water without restriction. The pyrogenicity of the vaccine was checked in 5 rabbits.
La solution a étudier sur chaque lapin est préparée à partir d'une ampoule distincte contenant le vaccin. On utilise pour la dilution du vaccin une solution isotonique à 0,9,' de chlorure de soude pour injections.
On injecte à chacun des 3 lapins la solution préparée de vaccin dilué à 1:40.000, à raison de 1 ml par kg de poids, par voie intraveineuse. On considère l'épreuve de pyrogénéité du vaccin comme satisfaisante si, après son introduction, on n'observe chez aucun des 3 lapins expérimentaux et dans aucune des trois mesures effectuées (à des intervalles d'une heure), une augmentation de plus de 0,60C par rapport à celle de départ, et si l'augmentation totale de la température chez les trois lapins ne dépasse pas 1,40C. The solution to be studied on each rabbit is prepared from a separate vial containing the vaccine. An isotonic 0.9% solution of sodium chloride for injections is used for the dilution of the vaccine.
Each of the 3 rabbits is injected with the prepared solution of vaccine diluted to 1: 40,000, at a rate of 1 ml per kg of weight, intravenously. The pyrogenicity test of the vaccine is considered to be satisfactory if, after its introduction, in none of the 3 experimental rabbits and in none of the three measurements taken (at one hour intervals), an increase of more than 0 , 60C compared to that of departure, and if the total increase in temperature in the three rabbits does not exceed 1.40C.
Si la température chez l'un ou chez deux des lapins augmente de plus de O,C Cet au total de plus de 1,45 on repète l'essai sur 5 lapins. Le vaccin est considéré comme correspondant aux exigences de l'épreuve de pyrogénéité si on observe une augmentation individuelle de la température de 0,60Cau plus chez 3 des 8 lapins, et si la somme des augmentations de température chez les 8 lapins ne dépasse pas 3,70cyon réalise également un contrôle de l'activité sérologique du vaccin et de l'aptitude du vaccin à provoquer la formation d'anticorps bactéricides chez l'homme.If the temperature in one or two of the rabbits increases by more than O, C This in total by more than 1.45 the test is repeated on 5 rabbits. The vaccine is considered to meet the requirements of the pyrogenicity test if there is an individual temperature increase of at most 0.60C in 3 of the 8 rabbits, and if the sum of the temperature increases in the 8 rabbits does not exceed 3 , 70cyon also monitors the serological activity of the vaccine and the ability of the vaccine to cause the formation of bactericidal antibodies in humans.
Le vaccin est considéré comme capable de provoquer la formation d'anticorps bactéricides chez l'homme si chez au moins 4 sur 5 personnes vaccinées on observe dans les sérums obtenus après la vaccination, la formation d'anticorps bactéricides pour chacune des trois souches étudiées dont le titre dépasse de quatre fois le titre des anticorps bactéricides des sérums prélevés avant l'immunisation. Si on observe une augmentation quadruple du titre des anticorps bactéricides, pour chacune des souches utilisées pour l'essai, chez moins de 4 personnes parmi les 5 vaccinées, on répète l'expérience. Pendant cette répétition on effectue l'expérience sur 10 volontaires. Une augmentation quadruple du titre des anticorps bactéricides doit être observée chez au moins 8 personnes pour chacune des 3 souches, comparativement au titre avant la vaccination. The vaccine is considered capable of causing the formation of bactericidal antibodies in humans if, in at least 4 out of 5 vaccinated persons, the formation of bactericidal antibodies is observed in each of the three strains studied, in the sera obtained after vaccination. the titer exceeds four times the titer of bactericidal antibodies in sera collected before immunization. If a quadruple increase in the titre of bactericidal antibodies is observed, for each of the strains used for the test, in less than 4 people out of the 5 vaccinated, the experiment is repeated. During this rehearsal the experiment is carried out on 10 volunteers. A quadruple increase in the titer of bactericidal antibodies should be observed in at least 8 people for each of the 3 strains, compared to the titer before vaccination.
Le vaccin suivant l'invention a été soumis à un essai d'innocuité vis-à-vis de sujets humains. The vaccine according to the invention has been subjected to a safety test with respect to human subjects.
L'essai d'innocuité du vaccin a une importance particulière étant donné que le principe actif du vaccin contient 12 à 18% de lipopolysaccharides, considérés comme des endotoxines provoquant des réactions secondaires nuisibles après l'inoculation. Dans les conditions cliniques (avec hospitalisation pour examens précis) l'innocuité du vaccin a été vérifiée chez 20 volontaires ayant reçu une dose du vaccin de 0,5 ml contenant 200/ccg de principe actif de la paroi cellulaire des méningocoques. The vaccine safety test is of particular importance since the active ingredient in the vaccine contains 12-18% lipopolysaccharides, considered to be endotoxins causing harmful side reactions after inoculation. Under clinical conditions (with hospitalization for specific examinations), the safety of the vaccine was verified in 20 volunteers who received a dose of the 0.5 ml vaccine containing 200 / ccg of active principle of the meningococcal cell wall.
Les volontaires examinés étaient âgés de 18 à 48 ans. Les sujets vaccinés ont subi dans les conditions cliniques un examen de leur état général, une détermination détaillée et régulière de la réaction de température, un contre des réactions locales, un examen systématique par les médecins-cliniciens. On a réalisé une électrocardiographie et une électroencéphalographie, on a déterminé systématiquement l'hémogramme, on a effectué des analyses systématiques de l'urine, on a déterminé les indices de l'équilibre acido-basique du sang. Tous les indices obtenus se trouvaient dans les limites des réactions physiologiques normales et ont témoigné de l'innocuité clinique du vaccin proposé pour les adultes. The volunteers examined were between 18 and 48 years old. The vaccinated subjects underwent under clinical conditions an examination of their general state, a detailed and regular determination of the temperature reaction, a counter of local reactions, a systematic examination by the clinician-physicians. Electrocardiography and electroencephalography were performed, the hemogram was systematically determined, systematic urine analyzes were carried out, the indices of the acid-base balance of the blood were determined. All the clues obtained were within the limits of normal physiological reactions and testified to the clinical safety of the vaccine proposed for adults.
L'innocuité et les propriétés réactogènes du vaccin ont été déterminées dans les conditions ambulatoires chez des volontaires agés de 18 à 22 ans, s'occupant de travaux physiques lourds sous le climat torride de la zone géographique des steppes sèches, sans acclimatation et adaptation suffisantes à ces conditions. Quatre groupes de sujets ont été vaccinés (110 sujets par groupe). A chaque groupe de volontaires on a injecté par voie souscutanée et à l'aide de seringues : 1) 0,25 ml de vaccin (100/tg de principe actif); 2) 0,5 ml de vaccin (200yLg de principe actif); 3) 1,0 ml de vaccin (400/reg de principe actif); 4) dans le groupe de contrôle-0,5 ml de solution physiologique injectable. Chez les personnes inoculées avec le vaccin méningococcique on a observé de faibles réactions de température (jusqu'à 37,50), pas plus fréquents que dans le groupe de contrôle (50,0%).Des réactions de température moyennes (jusqu'à 38,50) ont eu lieu,dans des cas isolés, avec des doses de vaccin de 0,5 ml et 1,0 ml , chez 5 et 2 sujets respectivement, dans chaque groupe de 110 sujets. The safety and reactogenic properties of the vaccine were determined under ambulatory conditions in volunteers aged 18 to 22 years, carrying out heavy physical work in the torrid climate of the geographical area of the dry steppes, without sufficient acclimatization and adaptation. on these conditions. Four groups of subjects were vaccinated (110 subjects per group). Each group of volunteers was injected subcutaneously and using syringes: 1) 0.25 ml of vaccine (100 / tg of active ingredient); 2) 0.5 ml of vaccine (200yLg of active ingredient); 3) 1.0 ml of vaccine (400 / reg active ingredient); 4) in the control group - 0.5 ml of physiological solution for injection. In people inoculated with the meningococcal vaccine, mild temperature reactions (up to 37.50) were observed, no more frequent than in the control group (50.0%). 38.50) occurred in isolated cases with doses of 0.5 ml and 1.0 ml vaccine in 5 and 2 subjects, respectively, in each group of 110 subjects.
Ces réactions n'ont pas eu lieu avec une dose de 0,25 nil. These reactions did not take place with a dose of 0.25 nil.
Chez 3 sujets inoculés avec 0,5 ml de vaccin s'est manifestée une rubéfaction allant jusqu'à 2,5 cm de diamètre, sans infiltration. Les indices de l'examen du sang (avec détermination des hémogrammes), de l'urine, de l'électro- cardiographie et de l'inspection médicale ont témoigné de l'-innocuité du vaccin après son introduction aux adultes à des doses allant jusqu a 1,0 ml par vois sous-cutanée.In 3 subjects inoculated with 0.5 ml of vaccine, redness up to 2.5 cm in diameter was manifested, without infiltration. Evidence from examination of blood (with determination of hemograms), urine, electrocardiography and medical inspection testified to the safety of the vaccine after it was introduced to adults at doses ranging up to 1.0 ml per subcutaneous view.
La détermination de l'innocuité et du caractère réactogène du vaccin dans les conditions de champ a été réalisée chez 5.000 sujets de 18 à 22 ans, à qui on a injecté 0,5 ml de vaccin (2OOg g de principe actif) à l'aide d'un injecteur sans aiguille. Les sujets vaccinés s'occupaient de travaux physiques lourds sous le climat torride de la zone géographique des steppes sèches, sans acclimatation et adaptation suffisantes. Tous les sujets vaccinés se trouvaient
sous observation médicale constante. Chez aucun de ces sujets on n'a observé une altération de la santé ou une diminution de la capacité de travail, ce qui témoigne de l'innocuité du vaccin après son introduction par voie sous-cutanée à l'aide d'un injecteur sans aiguille à une dose de 0,5 ml (200 g de principe actif).The determination of the safety and reactogenicity of the vaccine under field conditions was carried out in 5,000 subjects from 18 to 22 years old, who were injected with 0.5 ml of vaccine (2OOg g of active principle) at using a needle-less injector. The vaccinated subjects were engaged in heavy physical work in the torrid climate of the geographical area of the dry steppes, without sufficient acclimatization and adaptation. All vaccinated subjects were
under constant medical observation. In none of these subjects was there any deterioration in health or a reduction in working capacity, which testifies to the safety of the vaccine after its introduction subcutaneously using an injector without needle at a dose of 0.5 ml (200 g of active ingredient).
L'innocuité et le caractère réactogène du vaccin pour les enfants ontété étudiés par injections sous-cutanées de 0,2 ml (80 g g de principe actif) chez des enfants agés de 6 mois à 2 ans, et de 0,25 ml (100/cg de principe actif du vaccin) chez des enfants agés de 3 à 7 ans. Les données de l'observation clinique des enfants, ainsi que les examens de laboratoire instrumentaux et allergologiques ont permis de conclure que les doses utilisées (0,2 ml et 0,25 ml) sont absolument inoffensives et tolérables. The safety and reactogenicity of the vaccine for children have been studied by subcutaneous injections of 0.2 ml (80 gg of active ingredient) in children aged 6 months to 2 years, and 0.25 ml (100 / cg of active ingredient of the vaccine) in children aged 3 to 7 years. The data from the clinical observation of children, as well as the instrumental and allergological laboratory examinations made it possible to conclude that the doses used (0.2 ml and 0.25 ml) are absolutely harmless and tolerable.
L'efficacité immunologique du vaccin a été étudiée par détermination des anticorps bactéricides chez des sujets agés de 18 à 22 ans inoculés par voie sous-cutanée à l'aide d'une seringue à des doses de 0,25 ml (100 g) (56 sujets), de 0,5 ml (200 g) (55 sujets), et de 1,0 ml (400+ g) (57 sujets). Une augmentation quadruple et davantage des titres des anticorps bactéricides à l'égard des méningocoques des séro-groupes A, B et C a été observée 22 à 30 jours après l'inoculation chez 152 sujets parmi les 168 inoculés (c'est-à-dire chez 90,4%).On a réalisé des études de l'efficacité épidémiologique du vaccin : 400 sujets âgés de 18 à 22 ans et se trouvant dans des conditions de morbidité élevée due à des formes généralisées d'infection méningococcique ont été inoculés avec le vaccin chimique méningococcique polycomposant par voie sous-cutanée. Centdix sujets ont été inoculés avec des doses de 0,25 ml (100/ > g de principe actif), 110 sujets avec des doses de 1,0 ml (400 g de principe actif), et 180 avec des doses de 0,5 ml (200 g de substance sèche).Pendant les trois mois d'observation (à compter du jour de vaccination), on n'a pas enregistré chez les vaccinés d'affections par des formes généralisées d'infection méningococcique, tandis que chez les sujets non vaccinés se trouvant dans les mêmes conditions et en contact de vie et de travail étroit avec les sujets inoculés, on a observé, comme auparavant, des indices élevés de morbidité due à des formes généralisées d'infection méningococcique.The immunological efficacy of the vaccine was studied by determination of bactericidal antibodies in subjects aged 18 to 22 years inoculated subcutaneously using a syringe at doses of 0.25 ml (100 g) ( 56 subjects), 0.5 ml (200 g) (55 subjects), and 1.0 ml (400+ g) (57 subjects). A quadruple and more increase in the titre of bactericidal antibodies against meningococci of sero-groups A, B and C was observed 22 to 30 days after inoculation in 152 subjects out of 168 inoculated (i.e. say in 90.4%). Studies have been carried out on the epidemiological efficacy of the vaccine: 400 subjects aged 18 to 22 years and in conditions of high morbidity due to generalized forms of meningococcal infection have been inoculated with the multi-component subcutaneous meningococcal chemical vaccine. One hundred and ten subjects were inoculated with doses of 0.25 ml (100 g of active principle), 110 subjects with doses of 1.0 ml (400 g of active principle), and 180 with doses of 0.5 ml (200 g of dry substance). During the three months of observation (from the day of vaccination), there were no recorded in vaccines any conditions with generalized forms of meningococcal infection, while in Unvaccinated subjects being in the same conditions and in close working and living contact with the inoculated subjects, as before, there were high indices of morbidity due to generalized forms of meningococcal infection.
Plusieurs exemples concrets mais non limitatifs de mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention sont décrits ci-après. Several concrete but nonlimiting examples of implementation of the method according to the invention are described below.
Exemple 1
Des souches vaccinales de méningocoques des séro-groupes A, B et C sont conservées à l'état lyophilisé dans des ampoules soudées. La préparation du médicament faisant partie de la composition du vaccin se fait séparément à partir de chaque souche de trois séro-groupes. Le séro-groupe A-Neisseria meningitidis, souche A-208, le séro-groupe B-Neisseria meningitidis, souche B-1309O, le séro-groupe C-souche C-0638. Pour obtenir la culture d'ensemencement, le contenu d'une ampoule est ensemencé dans deux bottes avec un milieu nutritif solide contenant 20% de sérum sanguin. On effectue la culture à la température de 370C dans une chambre humide, dans une atmosphère contenant 1096 de C02, pendant 18-20 heures.Example 1
Vaccine strains of sero-groups A, B and C meningococci are stored in the lyophilized state in sealed ampoules. The preparation of the drug forming part of the vaccine composition is done separately from each strain of three sero-groups. The sero-group A-Neisseria meningitidis, strain A-208, the sero-group B-Neisseria meningitidis, strain B-1309O, the sero-group C-strain C-0638. To obtain the seed culture, the contents of one vial are seeded in two bundles with a solid nutritive medium containing 20% of blood serum. The culture is carried out at a temperature of 370C in a humid chamber, in an atmosphere containing 1096 CO 2, for 18-20 hours.
Pour obtenir les cultures de production, on élue les cultures d'ensemencement de dessus de boites de Pétri pour obtenir une suspension contenant 1 milliard d'anticorps microbiens dans 1 ml. Cette suspension est ensemencée dans des matras contenant un milieu nutritif semi-synthétique exempt de protéines,dense , de composition suivante
milieu sec 199 (Casamino
acides 11Difco") 17,5 g
eau de viande 400 ml
pâte d'amidon (1,5%) 100 ml
eau distillée 500 ml
agar-agar 20 g
chlorure de soude 10 g
solution à 2096 de soude ajoutée
jusqu'à pH = 7,4 à 7,6.To obtain the production cultures, the top seed cultures are eluted from Petri dishes to obtain a suspension containing 1 billion microbial antibodies in 1 ml. This suspension is seeded in matras containing a semi-synthetic nutritive medium free of proteins, dense, of the following composition
dry environment 199 (Casamino
11Difco acids ") 17.5 g
meat water 400 ml
starch paste (1.5%) 100 ml
distilled water 500 ml
agar-agar 20 g
sodium chloride 10 g
2096 soda solution added
up to pH = 7.4 to 7.6.
On stérilise le milieu dans un autoclave à la température de 1150C à raison de 30 minutes quotidiennement, pendant 3 jours. Chaque matras est ensemencé avec 5 ml de suspension. La suspension de méningocoques de chacun des trois séro-groupes est ensemencée dans 100 matras. The medium is sterilized in an autoclave at a temperature of 1150C at a rate of 30 minutes daily, for 3 days. Each flask is seeded with 5 ml of suspension. The meningococcus suspension of each of the three sero-groups is seeded in 100 flasks.
On effectue la culture de production à la température de 370C dans une chambre humide, dans une atmosphère contenant 10% de C02, pendant 18-20 heures. The production culture is carried out at a temperature of 370C in a humid chamber, in an atmosphere containing 10% CO 2, for 18-20 hours.
Une fois la culture achevée, on élue la culture de production avec une solution à 0,996 de chlorure de soude à pH de 7,2-7,4, en l'ajoutant dans les matras à raison de 15-20 ml. On réunit les éluats des matiras, en obtenant 1000-2000 ml de suspension de chacun des différents sérogroupes de méningocoques. Chaque suspension est additionnée de thiomersal (merthiolate) à raison de 10 mg par 100 ml de suspension, c'est-à-dire jusqu la concentration de 0,01%. Once the culture is complete, the production culture is eluted with a 0.996 solution of sodium chloride at pH 7.2-7.4, adding it to the flasks at the rate of 15-20 ml. The elirates of the matiras are combined, obtaining 1000-2000 ml of suspension from each of the different meningococcal serogroups. Each suspension is supplemented with thiomersal (merthiolate) at a rate of 10 mg per 100 ml of suspension, that is to say up to the concentration of 0.01%.
On maintient les suspensions pendant deux heures à la température ambiante, en les agitant toutes les 20-30 minutes. The suspensions are kept for two hours at room temperature, shaking them every 20-30 minutes.
On ajoute une solution à 2096 de soude jusqu'à un pH de 8,2-8,4, immédiatement après ltélution des matras et l'addition de merthiolate dans la suspension. A 2096 solution of sodium hydroxide is added to a pH of 8.2-8.4, immediately after the dilution of the flasks and the addition of merthiolate to the suspension.
On centrifuge la suspension pour une précipitation complète des microbes, on recueille le centrifugat limpide et on rejette le résidu. The suspension is centrifuged for complete precipitation of the microbes, the clear centrifuge is collected and the residue is discarded.
On refroidit le centrifugat de la culture de production jusqu'à une température de +4 à +60C et on ajoute 2 volumes d'acétone préalablement refroidie jusqu'à cettEtempérature , on maintient le mélange à ladite température de +4 à +60C pendant 18-20 heures pour former le précipité. On sépare par centrifugation le précipité formé, on lave trois fois à l'acétone refroidie (+h à +60C), et on sèche dans un bécher centrifuge dans un courant d'air. The centrifugate of the production culture is cooled to a temperature of +4 to + 60C and 2 volumes of acetone previously cooled to this temperature are added, the mixture is maintained at said temperature from +4 to + 60C for 18 -20 hours to form the precipitate. The precipitate formed is separated by centrifugation, washed three times with cooled acetone (+ h at + 60C), and dried in a centrifugal beaker in a stream of air.
On obtient une préparation sèche de centrifugat de culture de production, se présentant sous forme d'une poudre jaunâtre. On conserve cette préparation dans des flacons fermés hermétiquement avec des bouchons de caoutchouc, dans un local sec à la température ambiante.A dry preparation of a production culture centrifugate is obtained, which is in the form of a yellowish powder. This preparation is stored in tightly closed bottles with rubber stoppers in a dry room at room temperature.
Le rendement en préparation sèche obtenue dans 100 matras est de 10 à 20 g. The yield of dry preparation obtained in 100 flask is 10 to 20 g.
L'isolement de la fraction vaccinale de la préparation sèche de chaque séro-groupe de méningocoques est réalisé par filtration sur gel à travers du Séphadex G-100. Le fractionnement est effectué dans des conditions stériles. Par filtration sur gel, on recueille une substance éluable dans le volume libre de la colonne. On effectue l'élution avec une solution stérile à 0,9% de chlorure de soude à pH de 7,4-7,6. The isolation of the vaccine fraction from the dry preparation of each sero-group of meningococci is carried out by gel filtration through Sephadex G-100. The fractionation is carried out under sterile conditions. By gel filtration, an elutable substance is collected in the free volume of the column. The elution is carried out with a sterile 0.9% solution of sodium chloride at pH 7.4-7.6.
La substance recueillie par filtration sur gel, éluable dans le volume libre de la colonne et contenant la matière vaccinale, est refroidie jusqu'à une température de +4 à +60C, et on y ajoute deux volumes d'acétone refroidie. On maintient le mélange à une température de+4 à +60C pendant 18-20 heures pour former le précipité. The substance collected by gel filtration, eluted in the free volume of the column and containing the vaccine material, is cooled to a temperature of +4 to + 60C, and two volumes of cooled acetone are added thereto. The mixture is kept at a temperature of + 4 to + 60C for 18-20 hours to form the precipitate.
On sépare par centrifugation. le préclplte forme, on lave trois fois à l'acétone refroidie et on sèche dans le courant d'air. Separate by centrifugation. the pre-triple forms, washed three times with cooled acetone and dried in the air stream.
On obtient une matière pulvérulente sèche de couleur blanche ou jaune. Le rendement en préparation sèche de la fraction vaccinale est de 150 à 200 mg dans 100 matiras. A dry powdery material of white or yellow color is obtained. The dry preparation yield of the vaccine fraction is 150 to 200 mg in 100 matiras.
On mélange les précipités secs obtenus des fractions de chaque séro-groupe A, B, C dans des conditions stériles et dans des rapports pondéraux de 14:13:13. La quantité totale de substance sèche de la paroi cellulaire des miningocoques des séro-groupes A, B et C dans le vaccin constitue 400 otfg/ml. The dry precipitates obtained from the fractions of each sero-group A, B, C are mixed under sterile conditions and in weight ratios of 14:13:13. The total amount of dry substance in the cell wall of the sero-groups A, B and C miningococci in the vaccine constitutes 400 otfg / ml.
Le mélange sec obtenu est conditionné en atmosphère stérile dans des flacons de 10 doses chaque (à raison d'une dose de 200 Ig de principe actif sec), calculée pour la dilution dans 0,5 ml de solution isotonique de chlorure de soude à injecter. The dry mixture obtained is conditioned in a sterile atmosphere in vials of 10 doses each (at a dose of 200 Ig of dry active principle), calculated for dilution in 0.5 ml of isotonic solution of sodium chloride to be injected .
Le rendement en vaccin fini dans 300 matras (à raison de 100 matras pour chaque séro-groupe) constitue 1200-1500 doses. La durée de validité du vaccin est un an à partir du jour de sa préparation. The yield of finished vaccine in 300 matras (at the rate of 100 matras for each sero-group) constitutes 1200-1500 doses. The period of validity of the vaccine is one year from the day of its preparation.
Exemple 2
On réalise la préparation du vaccin d'une façon analogue à celle décrite dans l'exemple 1. En qualité de souche du séro-groupe B on utilise Neisseria meningitidis, souche B-23247.Example 2
The preparation of the vaccine is carried out in a manner analogous to that described in Example 1. As the strain of sero-group B, Neisseria meningitidis, strain B-23247 is used.
On dissout les précipités secs des fractions de chacun des séro-groupes A, B, C dans une solution isotonique de chlorure de soude à injecter, de façon que 1 ml de vaccin contienne la quantité de substance sèche suivante, en
préparation de méningocoques du séro-groupe A;140
préparation de méningocoques du séro-groupe B:130
préparation de méningocoques du séro-groupe C:13O. The dry precipitates of the fractions of each of the sero groups A, B, C are dissolved in an isotonic solution of sodium chloride to be injected, so that 1 ml of vaccine contains the following quantity of dry substance,
preparation of sero-group A meningococci; 140
preparation of sero-group B meningococci: 130
preparation of sero-group C: 13O meningococci.
Immédiatement après la dissolution des précipités secs des fractions de chacun des séro-groupes A, B, C dans la solution isotonique de chlorure de soude à injecter, on soumet la solution obtenue à une filtration stérilisante à travers des filtres à dimensions de pores supérieures à 0,22 micron, on remplit stérilement les ampoules de 0,5 mlet on les soude. Une dose de vaccin de 0,5 ml contient 200 de principe actif sec. Immediately after the dissolution of the dry precipitates of the fractions of each of the sero groups A, B, C in the isotonic solution of sodium chloride to be injected, the solution obtained is subjected to sterilizing filtration through filters with pore dimensions greater than 0.22 micron, the 0.5 ml ampules are sterile filled and welded. A 0.5 ml dose of vaccine contains 200 of dry active ingredient.
Le rendement en vaccin fini obtenu dans 300 matras (à raison de 100 matras pour chacun des sérogroupes) constitue 1200-1500 doses. The yield of finished vaccine obtained in 300 matras (at the rate of 100 matras for each of the serogroups) constitutes 1200-1500 doses.
On conserve les ampoules contenant le vaccin à une température de +4 à +6 C jusqu'au jour de l'injection. The ampoules containing the vaccine are stored at a temperature of +4 to +6 C until the day of the injection.
La durée de validité du vaccin est d'uné année à compter du jour de la préparation de la solution de fractions vaccinales. The period of validity of the vaccine is one year from the day of preparation of the solution of vaccine fractions.
Exemple 3
On réalise la préparation du vaccin comme dans l'exemple 1. Example 3
The vaccine is prepared as in Example 1.
En qualité de souche du séro-groupe B on utilise N.meningitidis, souche B-C5. As strain of sero-group B, N. meningitidis, strain B-C5, is used.
On conditionne le vaccin sec obtenu par 100 doses (à raison d'une dose de 200) g de principe actif sec). The dry vaccine obtained is conditioned by 100 doses (at a dose of 200) g of dry active principle).
Le rendement en vaccin fini obtenu dans 300 matras est de 1200-1500 doses. La dure'e d* validité du vaccin est d'une année à compter du jour de sa préparation. The yield of finished vaccine obtained in 300 matras is 1200-1500 doses. The period of validity of the vaccine is one year from the day of its preparation.
Claims (5)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8207557A FR2525902A1 (en) | 1982-04-30 | 1982-04-30 | Multivalent meningococcal vaccine prodn. - by growing separate serotype(s) on solid protein deficient media |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8207557A FR2525902A1 (en) | 1982-04-30 | 1982-04-30 | Multivalent meningococcal vaccine prodn. - by growing separate serotype(s) on solid protein deficient media |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2525902A1 true FR2525902A1 (en) | 1983-11-04 |
Family
ID=9273612
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR8207557A Withdrawn FR2525902A1 (en) | 1982-04-30 | 1982-04-30 | Multivalent meningococcal vaccine prodn. - by growing separate serotype(s) on solid protein deficient media |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2525902A1 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3577527A (en) * | 1969-01-27 | 1971-05-04 | Us Navy | Neisseria meningitidis antigen |
| US3636192A (en) * | 1970-01-13 | 1972-01-18 | Us Army | Meningococcal polysaccharide vaccines |
-
1982
- 1982-04-30 FR FR8207557A patent/FR2525902A1/en not_active Withdrawn
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3577527A (en) * | 1969-01-27 | 1971-05-04 | Us Navy | Neisseria meningitidis antigen |
| US3636192A (en) * | 1970-01-13 | 1972-01-18 | Us Army | Meningococcal polysaccharide vaccines |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103687612B (en) | Process for detergent-free production of outer membrane vesicles | |
| CA1052307A (en) | Method for the extraction and processing of glycoproteins, mucopolysaccharides and accompanying substances | |
| EP0072513B1 (en) | Process for the preparation of purified bacterial capsular antigenic polysaccharides, the obtained products and their use | |
| DE69925187T2 (en) | Antigen conjugates of conserved lipooligosaccharides from gram-negative bacteria | |
| FR2468372A1 (en) | NEW VACCINE AGAINST INFECTIOUS DISEASES IN BOVINE AND METHOD OF PRODUCING THE SAME | |
| FR2579895A1 (en) | ||
| BRPI0806318A2 (en) | modified saccharides | |
| FR2472386A1 (en) | ||
| EP0035429A1 (en) | Vaccinal complex containing a specific antigen and vaccine containing it | |
| CA1151544A (en) | Process for preparing new glycoproteins extracted from klebsiella pneumoniae | |
| CN102245629B (en) | Modified amyloid beta peptide | |
| CA1093963A (en) | No translation available | |
| EP0071515B1 (en) | Process for producing capsular polyosides, capsular polyosides so obtained and their use in the preparation of vaccines | |
| CN1161376C (en) | Major outer membrane protein CD of Moraxella | |
| CN1312080A (en) | Composition containing fatty acid | |
| US4472378A (en) | Live vaccine for the prevention of salmonellosis in water fowl, a process for making and applying the same | |
| FR2515518A1 (en) | PROCESS FOR THE PRODUCTION OF IMMUNOBIOLOGICAL PREPARATIONS APPLICABLE FOR THE DIAGNOSIS, PREVENTION AND / OR TREATMENT OF CANDIDA GUILLIERMONDII INFECTIONS, AND IMMUNOBIOLOGICAL PREPARATIONS RESULTING THEREFROM | |
| FR2525902A1 (en) | Multivalent meningococcal vaccine prodn. - by growing separate serotype(s) on solid protein deficient media | |
| CN101820891B (en) | BCG polysaccharide nucleic acid extractive and preparation method thereof | |
| BE893009A (en) | Multivalent meningococcal vaccine prodn. - by growing separate serotype(s) on solid protein deficient media | |
| CN110237251B (en) | Composite specificity egg yolk antibody oral spray and preparation method thereof | |
| CA1117882A (en) | Process for the preparation of a novel biological product and product thus prepared | |
| CN101337070B (en) | Freeze-dried attenuated live vaccine for hepatitis A and its preparing process | |
| CN100571774C (en) | Typhoid fever, paratyphoid ectoblast protein vaccine | |
| NL8201859A (en) | Multivalent meningococcal vaccine prodn. - by growing separate serotype(s) on solid protein deficient media |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| ST | Notification of lapse |