FR2502787A1 - Immunological detection of human chorionic gonadotrophin - using antibodies raised against beta sub-units, esp. for pregnancy testing - Google Patents

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Francoise Dufour
Robert Maes
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Human Pharm SA Laboratoires
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G01N33/76—Human chorionic gonadotropin including luteinising hormone, follicle stimulating hormone, thyroid stimulating hormone or their receptors

Abstract

Method for detecting human chorionic gonadotrophin (HCG) comprises reacting (a) antibodies specific for beta-subunits of HCG, made by inoculating a mammal with beta-HCG antigen; (b) HCG or beta-HCG antigen immobilised on erythrocytes from a mammal different from that used to raise the antibodies, and (c) the test sample. Sedimentation of the labelled erythrocytes indicates presence of HCG; their agglutination (by bridge formation between antigenic sites and antibody) indicates absence. Pref. sheep erythrocytes are used and antibodies are raised in rabbits. The amts. of antibody and antigen are such that HCG can be detected down to 0.05 IU per ml. The method is partic. used for early and reliable pregnancy testing (97% correct when used 2 days after the expected date of a menstrual period). It can also be used e.g. to monitor subjects at risk from miscarriage and to detect some neoplastic or para-neoplastic conditions which produce HCG. The test is net subject to interference by FSH, TH or LH (these hormones and HCG all have similar alpha-subunits but quite distinct beta-units).

Description

Nouveau procédé de détection de l1HCG et son application notamment dans un nouveau test de grossesse.New method for detecting HCG and its application in particular in a new pregnancy test.

La pressente invention concerne un nouveau procédé de detection de l'HCG (hormone gonadotrophine chorionique) par voie immunologique selon une réaction du type antigèneanticorps. Elle concerne également l'application de ce procédé notamment dans un nouveau test de grossesse. The present invention relates to a novel method for the detection of HCG (chorionic gonadotropin hormone) immunologically by an antigenic antibody reaction. It also relates to the application of this method in particular in a new pregnancy test.

On sait que pour détecter la présence d'HCG dans l'urine de la femme, des tests de grossesse mettant en oeuvre des mécanismes réactionnels du type antigene-anticorps ont éte proposés et commercialisés. Selon ces tests de grossesse connus, le principe du dosage repose sur l'utilisation d'un anticorps anti-HCG. Or il se trouve que les meilleurs de ces tests connus ne sont fiables qu'a partir des 9è a 15è jours de retard de règles, c'est-à-dire I partir du moment où la teneur en HCG dans l'urine de la femme enceinte est de l'ordre de 1 I 1,5 UI/ml. It is known that in order to detect the presence of HCG in the woman's urine, pregnancy tests using antigen-antibody type reaction mechanisms have been proposed and marketed. According to these known pregnancy tests, the principle of the assay is based on the use of an anti-HCG antibody. However, it turns out that the best of these known tests are reliable only from the 9th to 15th days of late menstruation, that is to say from the moment when the HCG content in the urine of the pregnant woman is of the order of 1 I 1.5 IU / ml.

Selon l'invention on préconise un nouveau procédé de détection de l'HCG qui a l'avantage de permettre notamment la réalisation d'un test de grossesse fiable à 97 % dès le 2è jour de retard de regles quand la teneur en HCG dans l'urine de la femme enceinte est de l'ordre de 0.250 UI/ml; et qui, d'une manière générale, permet la détection d'une quantité de HCG supérieure ou égale I 0,05 UI/ml. According to the invention, a new method for detecting HCG is recommended, which has the advantage of enabling, in particular, the realization of a reliable pregnancy test at 97% as early as the second day of rule-breaking when the HCG content in the lamb urine of the pregnant woman is of the order of 0.250 IU / ml; and which, in general, allows the detection of an amount of HCG greater than or equal to 0.05 IU / ml.

Les difficdîtés de détection rencontrées dans les techniques antérieures mettant en oeuvre un mécanisme du type antigène-anticorps sont dues au fait que ledit mécanisme fait appel I l'utilisation d'un moyen anticorps anti-HCG obtenu I partir de la structure complète de l'HCG.  The detection difficulties encountered in the prior art employing an antigen-antibody mechanism are due to the fact that said mechanism involves the use of anti-HCG antibody means obtained from the complete structure of the HCG.

L'HCG est une glycoprotéine qui est constituée, comme les hormones glycoprotéiques telles que les FSH (hormone folliculostimulante qui assure la croissance et la maturation des follicules de De Graaf), et LH (hormone lutéinisante qui provoque la ponte ovulaire, la formation du corps jaune et stimule la sécrétion de progestérone) qui sont présentes dans un cycle hormonal normal,et comme la TSH (hormone thyroido-stimulante),de deux chaînes (désignées ci-après par le terme "sous-unités") &alpha; et ss qui sont liées entre elles par des ponts disulfure et qui sont structurellement différentes l'une de l'autre.Les sous-unitésC < des quatre hormones sont structurellement similaires (ce qui explique les interférences possibles entraînant les difficultés de détection précitées) ; en revanche, les sous-unités/3 des quatre hormones sont différentes du point de vue structural. Le schéma de l'immuno-réactivité des quatre hormones glycoprotéiques est le suivant :

Figure img00020001
HCG is a glycoprotein that is constituted, such as glycoprotein hormones such as FSH (follicle stimulating hormone that ensures the growth and maturation of De Graaf's follicles), and LH (luteinizing hormone that causes egg ovulation, body formation yellow and stimulates the secretion of progesterone) which are present in a normal hormonal cycle, and like the TSH (thyroid-stimulating hormone), of two chains (hereinafter referred to as "subunits") &alpha; and ss which are linked together by disulfide bridges and which are structurally different from one another.The C <subunits of the four hormones are structurally similar (which explains the possible interferences leading to the aforementioned detection difficulties); on the other hand, the subunits / 3 of the four hormones are structurally different. The pattern of immunoreactivity of the four glycoprotein hormones is as follows:
Figure img00020001

FSH : TSH : LH : HCG
Le procédé de détection selon l'invention s' appuie sur la constatation surprenante que l'anticorps anti-/ss-HCG obtenu à partir de la sous-unité/3 de l'HCG et qui est spécifique de celle-ci, permet de reconnaître la présence de l'HCG avec une plus grande fiabilité.FSH: TSH: LH: HCG
The detection method according to the invention is based on the surprising finding that the anti-ss-HCG antibody obtained from the subunit / 3 of the HCG and which is specific to it, makes it possible to recognize the presence of HCG with greater reliability.

Le procédé de détection de l'HCG que l'on préconise selon l'invention, et qui repose sur un mécanisme immunologique du type antigène-anticorps mettant en oeuvre un anticorps spécifique de la sous-unité4 de l'HCG, est caractérisé en ce que l'on met en contact dans un solvant convenable
a) un moyen anticorps anti-ss -HCG obtenu par
inoculation à un mammifère A d'un moyen
antigène ss -HCG puis récupération à partir du
sérum dudit mammifère,
b) un moyen antigène HCG fixé sur des hématies
d'un mammifère B appartenant une espèce
différente de celle du mammifère A, et
c) une solution aqueuse échantillon à étudier
susceptible de contenir de l'HCG, la sédimentation (inhibition de l'agglutination) des hématies sur lesquelles est fixé le moyen antigène HCG indiquant la présence d'HCG dans ledit échantillon, et l'agglutination des dites hématies par formation de ponts par le moyen anticorps anti-,j-HÇG entre les sites antigèniques desdites hématies indiquant l'absence d'HCG dans ledit échantillon.The method for detecting HCG which is recommended according to the invention, and which is based on an immunological mechanism of the antigen-antibody type using an antibody specific for the HCG subunit 4, is characterized in that that is put in contact in a suitable solvent
a) anti-ss-HCG antibody means obtained by
inoculation to a mammal A means
antigen ss -HCG then recovery from
serum of said mammal,
b) an HCG antigen medium fixed on red blood cells
of a mammal B belonging to a species
different from that of mammal A, and
c) an aqueous sample solution to be studied
likely to contain HCG, the sedimentation (inhibition of agglutination) of the red blood cells on which the HCG antigen means indicating the presence of HCG in said sample, and the agglutination of said red blood cells by the formation of bridges by the anti-HGG antibody between the antigenic sites of said RBCs indicating the absence of HCG in said sample.

Selon un mode préféré de mise en oeuvre du procédé de dosage, objet de l'invention, le moyen anticorps est un anti-A-HCG de lapin obtenu par inoculation de /3-HCG au lapin, et le moyen antigène est fixé sur des hématies de mouton. According to a preferred embodiment of the assay method, which is the subject of the invention, the antibody means is a rabbit anti-A-HCG obtained by inoculating β-HCG in the rabbit, and the antigen means is fixed on sheep red blood cells.

Le moyen antigène fixé sur des hematies pourra être constitué par la structure entière de l'HCG soit encore par la sous-unite de l'HCG
Pour la préparation des cellules antigènes, on traite des hématies de mammifère B (en particulier des hématies de mouton) avec du formaldéhyde selon la technique de
CSIMAS, Soc. Exp. Biol 103, 157 (1960) puis on les sensibilise par HCG ou /3-HCG selon une méthode connue en soi.The antigenic medium fixed on red blood cells may consist of the entire structure of HCG or the subunit of HCG.
For the preparation of the antigenic cells, mammalian red blood cells B (in particular sheep red blood cells) are treated with formaldehyde according to the technique of
CSIMAS, Soc. Exp. Biol 103, 157 (1960) then sensitized by HCG or / 3-HCG according to a method known per se.

La sous-unité 3-HCG est obtenue à partir d'HCG purifiée selon la technique de MORGAN et al., Endo. 94, 1601-1606 (1974). Le moyen anticorps est obtenu par incorporation de A-HCG dans une émulsion d'eau dans de l'huile minérale en présence d'Arlacel et de protamine, et le mélange résultant est inoculé à des mammifères A (en particulier des lapins) puis les animaux sont saignés à intervalles réguliers. The 3-HCG subunit is obtained from purified HCG according to the technique of MORGAN et al., Endo. 94, 1601-1606 (1974). The antibody medium is obtained by incorporation of A-HCG into a water emulsion in mineral oil in the presence of Arlacel and protamine, and the resulting mixture is inoculated into mammals A (in particular rabbits) and the Animals are bled at regular intervals.

Le moyen antigène fixé sur les hématies et le moyen anticorps sont avantageusement lyophilisés soit séparément, soit, de préférence, ensemble selon la technique dite à deux couches, avant d'être utilises dans le procédé de dosage de l'HCG. The antigen means fixed on the red cells and the antibody means are advantageously freeze-dried either separately or, preferably, together according to the so-called two-layer technique, before being used in the HCG assay method.

Parmi les solvants qui conviennent pour la mise en contact du moyen anticorps, du moyen antigène et de l'échantillon à étudier, le préféré est l'eau déminéralisée. Among the suitable solvents for contacting the antibody means, the antigen means and the sample to be studied, the preferred one is demineralized water.

Le procédé de détection de l'HCG selon l'invention est directement applicable I la détermination de cette hormone dans des liquides corporels, chaque fois que l'on peut supposer qu'elle a éte secrétée, comme cela est le cas surtout chez la femme enceinte, mais également dans les cas de môles hydati formes avant curetage (pour lesquels les taux sériques de HCG et de ss-HCG présentent une augmentation de 7 à 13 fois supérieurs au taux sérique des grossesses témoins), dans les cas de menaces d'avortement spontané (où les taux d'HCG native diminuent considérablement), et dans les cas de certains syndromes néoplasiques ou para-néoplasiques (où on peut mettre en évidence une secrétion d'HCG aussi bien chez la femme que chez l'homme). The method for detecting HCG according to the invention is directly applicable to the determination of this hormone in body fluids, whenever it can be supposed that it has been secreted, as is the case especially in women. pregnant, but also in cases of hydatious moles formed before curettage (for which the serum HCG and ss-HCG levels show an increase of 7 to 13 times higher than the serum level of the control pregnancies), in cases of threats of spontaneous abortion (where the native HCG levels decrease considerably), and in the case of certain neoplastic or para-neoplastic syndromes (where a secretion of HCG can be demonstrated in both women and men).

D'autres avantages et caractéristiques de l'invention seront mieux compris 1 la lecture de la description qui va suivre, en regard des dessins annexés, donnée titre d'exemple non limitatif - les figures 1 et respectivement 2 représentent les courbes
relatives au taux hormonal normal sans fécondation et respec
tivement au taux hormonal normal après fecondation, chez la
femme ; - la figure 3 représente schématiquement le procédé de dosage
selon l'invention appliqué au test de grossesse - la figure 4 représente une vue en perspective du conditionnement
du test de grossesse selon l'invention ; - la figure 5 représente une vue en perspective du portoirlogeable
dans le conditionnement sus-nommé ; - la figure 6 est une coupe du portoir selon VI-VI ; et - la figure 7 est une vue en perspective de la pochette renfermant
le solvant. Other advantages and characteristics of the invention will be better understood on reading the description which follows, with reference to the appended drawings, given by way of nonlimiting example - FIGS. 1 and 2 respectively represent the curves
normal hormone levels without fertilization and respec
at normal hormone levels after fertilization, at the
women ; FIG. 3 diagrammatically represents the assay procedure
according to the invention applied to the pregnancy test - Figure 4 shows a perspective view of the packaging
pregnancy test according to the invention; - Figure 5 shows a perspective view of the portoirlogeable
in the above named packaging; - Figure 6 is a section of the rack according to VI-VI; and FIG. 7 is a perspective view of the pouch enclosing
the solvent.

Les courbes des figures 1 et 2 donnent la variation en mUI/ml dans l'urine de la femme des FSH et LH quand il n'y a pas eu fécondation (figure 1), et des FSH, LH et HCG quand il y a eu fécondation et nidation (figure 2). The curves in Figures 1 and 2 give the variation in mUI / ml in the female urine of FSH and LH when there was no fertilization (Figure 1), and FSH, LH and HCG when there is fertilization and implantation (Figure 2).

Plus précisément, la figure 2 montre comment, s > il y a eu fécondation et nidation, la quantité de HCG secrétée croît rapidement à partir du 9è - 10è joursenviron apres la décharge en LH.Specifically, Figure 2 shows how, if fertilization and implantation occurred, the amount of secreted HCG increased rapidly from the 9th to 10th day approximately after the LH release.

Le diagramme de la figure 3 illustre l'obtention d'un anticorps 1 anti-/3 -HCG par inoculation d'antigène p -HCG humain 3 à un lapin, et l'obtention d'hématies 2 sensibilisées par des antigènes fixes sur des globules rouges 4 de mouton. The diagram of FIG. 3 illustrates the production of an anti-β-HCG antibody 1 by inoculation of human p -HCG antigen 3 with a rabbit, and the production of erythrocytes 2 sensitized with fixed antigens on red blood cells 4 of sheep.

Les moyens anticorps 1 et antigène 2 sont mis en présence dans un ttibe I essai en même temps que l'urine contenant de l'HCG complet 5. Les anticorps reconnaissent spécifiquement la sous-unitéi de l'HCG présente dans l'urine, ils sont donc bloqués comme représenté en 6, et les hématies libres ne peuvent s'agglutiner mais sédimentent en formant un anneau au fond du tube à essai. En revanche, si I et 2 sont mis en présence en même temps que l'urine sans HCG, les anticorps forment des ponts entre les sites antigéniques des hématies, ce qui provoque une agglutination représentée en 7 qui se traduit par une coloration uniforme au fond du tube. The means antibody 1 and antigen 2 are brought together in a ttibe I test at the same time as urine containing complete HCG 5. The antibodies specifically recognize the subunit of HCG present in the urine, they are thus blocked as shown in 6, and the free red cells can not agglutinate but sediment by forming a ring at the bottom of the test tube. On the other hand, if I and 2 are combined with the urine without HCG, the antibodies form bridges between the antigenic sites of the red blood cells, which causes an agglutination represented at 7 which results in a uniform coloration at the bottom. of the tube.

Les moyens et dispositifs pour mettre en oeuvre l'application du procédé de détection selon l'invention dans le cadre d'un test de grossesse ont été décrits ci-après par référence aux figures 4 I 7. The means and devices for carrying out the application of the detection method according to the invention in the context of a pregnancy test have been described below with reference to FIGS.

Ladite application est caractérisée en ce qu'elle se présente sous la forme d'une composition de matiere comprenant
- une bote de conditionnement,
- un porte-objet ou portoir 10 qui est (i) muni sa partie
supérieure d'un conduit creux 22 opaque pourvu d'un
rebord circulaire 23 destiné I soutenir un tube transparent
21 logé dans ledit conduit, ce tube renfermant le
mélange lyophilisé des moyens anticorps et antigène devant
réagir avec l'urine de la femme en présence d'un solvant,
et (ii) pourvu à sa partie inférieure d'un miroir 11
permettant de visualiser l'image 25 du fond du tube situé
dans la lumière du rebord 23, ledit miroir étant maintenu
incliné par un dispositif convenable disposé sur la paroi
intérieure du portoir, et
- un solvant.Said application is characterized in that it is in the form of a composition of matter comprising
- a conditioning box,
a holder or rack 10 which is (i) provided with its part
upper part of an opaque hollow conduit 22 provided with a
circular flange 23 intended to support a transparent tube
21 housed in said conduit, this tube enclosing the
freeze-dried mixture of antibody and antigen means
react with the woman's urine in the presence of a solvent,
and (ii) provided at its lower part with a mirror 11
to visualize the image 25 of the bottom of the tube located
in the light of the flange 23, said mirror being maintained
tilted by a suitable device disposed on the wall
inside the rack, and
a solvent.

Selon un mode de réalisation, cette composition de matière est présentée sous la forme d'un ensemble ou kit, prêt à l'emploi constitué par
- une boîte de conditionnement qui est utilisable pour
recueillir l'urine de la femme, comprenant un réservoir 8
et un couvercle 9
- un porte-objets ou portoir 10 du type corps creux parallé
lipipedique comprenant deux faces latérales verticales et
deux faces horizontales l'une inférieure et l'autre supe
rieure munie d'orifices 18 pour soutenir une pochette 20
contenant de l'eau déminéralisée et un compte-gouttes 17
destiné au prélèvement du volume desiré d'urine et un
conduit creux 22 opaque pourvu I sa partie inférieure d'un
rebord 23 soutenant un tube transparent 21 logé dans
ledit conduit creux 22, le tube transparent 21 contenant
un mélange lyophilisé 24 de moyen anticorps anti-/3-HCG de la
pilet de moyen antigène constitué parHCGou/J'-HCG sur hématies
de mouton, les moyens anticorps et antigène ne réagissant
pas à l'état sec mais étant susceptibles de réagir en
présence d'eau, ledit tube 21 étant destiné à recevoir
des gouttes d'urine et l'eau contenue dans la pochette 20
et libérée au moyen d'un dispositif d'ouverture 26
prévu sur la pochette 20 (et qui est dans le cas d'espèce
un papillon secable) ;;
- un miroir 11 disposé,de façon inclinée, sous le rebord 23
du tube 21, à la partie inférieure du portoir 10, et lié
audit portoir au moyen d'un dispositif de positionnement
(qui est dans le cas d'espèce constitué par des ergots
12, 13 et 14 et des barrettes horizontales inférieure 15
et supérieure 16, et qui pourrait être constitué par des
rainures équivalentes) prévu sur le côté intérieur de
chaque face latérale du portoir 10, le fond du tube 21
situé dans la lumière du rebord 23 étant visualisé sur
le miroir par une image 25.According to one embodiment, this composition of matter is presented in the form of a set or kit, ready to use constituted by
- a packaging box that is usable for
collect the woman's urine, including a reservoir 8
and a lid 9
a carrier or rack 10 of the parallel hollow body type
lipipedic material comprising two vertical lateral faces and
two horizontal faces one lower and the other supe
upper with holes 18 to support a pocket 20
containing demineralized water and a dropper 17
intended for the collection of the desired volume of urine and a
hollow conduit 22 opaque provided I its lower part of a
ledge 23 supporting a transparent tube 21 housed in
said hollow conduit 22, the transparent tube 21 containing
a freeze-dried mixture 24 of anti-β-HCG antibody medium of the
middle antigen pellet consisting of HCGou / I-HCG on red blood cells
of sheep, the means antibody and antigen reacting
not in the dry state but being able to react in
presence of water, said tube 21 being intended to receive
drops of urine and the water contained in the pouch 20
and released by means of an opening device 26
provided in pocket 20 (and which is in the present case
a shattering butterfly);
a mirror 11 disposed inclinedly under the rim 23
of the tube 21, at the bottom of the rack 10, and bound
to said rack by means of a positioning device
(which in this case consists of lugs
12, 13 and 14 and lower horizontal bars 15
and higher 16, and which could be constituted by
grooves equivalent) provided on the inner side of
each side face of the rack 10, the bottom of the tube 21
located in the rim light 23 being visualized on
the mirror by an image 25.

Le conduit opaque 22 et le rebord 23 ont pour objet (i) d'éviter toute manipulation quand la réaction anticorpsantigène se développe, et (ii) de faciliter la lecture du résultat en évitant les risques d'erreur qui pourraient resulter de reflets. The opaque conduit 22 and the rim 23 are intended (i) to avoid any manipulation when the antibodyantigen reaction develops, and (ii) to facilitate the reading of the result avoiding the risk of error that could result from reflections.

La lyophilisation des moyens anticorps et antigène est avantageusement effectuée en deux couches. A cet effet, on procède comme suit : les hematies de mouton sensibilisées sont mises en suspension dans un milieu aqueux de lyophilisation comprenant un tampon de sels minéraux, de l'albumine et du sucre à pH 6, 4 ; après congélation, une quantité d'antisérum nécessaire et suffisante pour produire un test sensible à la présence de d'une quantité supérieure ou égale A 50 UI de HCCw par litre d'urine est ajoutée (par exemple pour avoir une sensibilité de 50 Ulil ou de 250 Ulil de HCG) et le tout est lyophilisé. Lyophilization of the antibody and antigen means is advantageously carried out in two layers. For this purpose, the procedure is as follows: the sensitized sheep red blood cells are suspended in an aqueous lyophilization medium comprising a buffer of mineral salts, albumin and sugar at pH 6.4; after freezing, an amount of antisera necessary and sufficient to produce a test sensitive to the presence of an amount greater than or equal to 50 IU HCCw per liter of urine is added (for example to have a sensitivity of 50 Ulil or 250 ulil of HCG) and all is lyophilized.

Les lyophilisats restent stables pour une durée de 2 ans au moins, lorsqu'ils sont conservés à une température inférieure ou égale à 20"C.  The lyophilizates remain stable for a period of at least 2 years, when they are kept at a temperature of less than or equal to 20 ° C.

Le mode d'emploi préconisé est décrit ci-après. The recommended instructions are described below.

On recueille la première urine du matin dans le récipient 8. On prélève de l'urine au moyen du compte-gouttes 17 et verse 3 gouttes (0,15 ml) dans le tube 21 contenant un mélange lyophilisé 24 d'anticorps et d'antigène préparé comme indiqué ci dessus-.0n ajoute dans le tube 21 le contenudela pochette 20(0,25 ml d'eau déminéralisée) par l'intermédiaire du papillon 26.0n rebouche le tube 21 puis le secoue pour bien mélanger les 4 ingrédients le moyen anticorps, le moyen antigène, l'eau déminéralisée et l'urine. On replace le tube dans son logement 22 et on le laisse au repos pendant exactement 2 heures dans un endroit dépourvu de vibrations et loin d'une source de chaleur. La lecture est alors effectuée sur le miroir.Un anneau de sédimentation nettement délimité de couleur brune au fond du tube indique que la femme est enceinte. En revanche, une coloration uniforme (agglutination) de couleur brun-rougeâtre au fond du tube indique que la femme n'est pas enceinte. The first urine of the morning is collected in the container 8. The urine is withdrawn by means of the dropper 17 and 3 drops (0.15 ml) are poured into the tube 21 containing a freeze-dried mixture 24 of antibodies and antigen prepared as above-.0n add in the tube 21 the contents of the pouch 20 (0.25 ml of demineralized water) via the butterfly 26.0n rebouche the tube 21 and then shake to mix the 4 ingredients the medium antibodies, antigen medium, demineralised water and urine. The tube is placed back in its housing 22 and left standing for exactly 2 hours in a place free of vibrations and far from a source of heat. The reading is then performed on the mirror. A clearly defined sedimentation ring of brown color at the bottom of the tube indicates that the woman is pregnant. On the other hand, a uniform coloring (agglutination) of reddish-brown color at the bottom of the tube indicates that the woman is not pregnant.

Si le tube a été secoué par inadvertance avant que les 2 heures ne soient écoulées, le mélange des quatre ingrédients peut etre remis en suspension en le resecouant et la lecture est réalisée 2 heures après. If the tube has been shaken inadvertently before the 2 hours have elapsed, the mixture of the four ingredients can be resuspended by reticulating it and reading is performed 2 hours later.

Dans ce test, on peut bien entendu introduire dans le tube 21 l'eau déminéralisée avant l'urine sans modifier le résultat. In this test, it is of course possible to introduce into the tube 21 the demineralised water before the urine without modifying the result.

Ce test de grossesse pérmet de déceler une teneur en HCG dans l'urine supérieure ou égale à 0,05 UI/ml. Par exemple la sensibilité en HCG pourra être choisie entre 0,05 et 0,25 UI/ml. Si le test est sensible I une teneur en HCG de 0,25 UI/ml, la fiabilité sera au moins de 97 Z à partir du 2è jour de retard de règles. Si le test est sensible une teneur en
HCG de 0,05 UI/ml, on obtiendra un résultat avec la même fiabilité plus tôt. En revanche, les tests de grossesse antérieurement connus ne présentent la meme fiabilité qu'à compter du 9è au 15è jours environ de retard de règles. Le test selon l'invention permet donc de donner une réponse fiable précoce.This pregnancy test can detect an HCG content in the urine greater than or equal to 0.05 IU / ml. For example, the sensitivity of HCG may be chosen between 0.05 and 0.25 IU / ml. If the test is sensitive to an HCG content of 0.25 IU / ml, the reliability will be at least 97% from the 2nd day of late menstruation. If the test is sensitive a content in
HCG 0.05 IU / ml, we will obtain a result with the same reliability earlier. On the other hand, previously known pregnancy tests have the same reliability as from about the 9th to the 15th day of late menstruation. The test according to the invention thus makes it possible to give an early reliable answer.

Par ailleurs, ce test est spécifique de l'HCG car il n'est pas influencé par les autres hormones glycoprotéiques. En particulier, les essais relatifs I une éventuelle interférence avec la LH ont montré qu'il n'y avait pas d'inhibition de l'agglutination (c'est-à-dire pas de sédimentation) à la concentration de 2,56 UI/ml en LH, alors que l'HCG est détectable à partir de 0,05 UI/ml.  In addition, this test is specific for HCG because it is not influenced by other glycoprotein hormones. In particular, tests relating to possible interference with LH showed that there was no inhibition of agglutination (i.e., no sedimentation) at the concentration of 2.56 IU. / ml in LH, whereas HCG is detectable from 0.05 IU / ml.

Claims (10)

REVENDICATIONS 1. Procédé de détection de l'HCG selon un mécanisme immunologique du type antigène-anticorps mettant en oeuvre un anticorps spécifique de la sous-unitép de l'HCG, ledit procédé étant caractérisé en ce que l'on met en contact dans un solvant convenable1. A method for detecting HCG according to an immunological mechanism of the antigen-antibody type using an antibody specific for the subunit of HCG, said method being characterized in that it is brought into contact in a solvent suitable a) un moyen anticorps anti-P-HCG obtenu par inoculation a) an anti-P-HCG antibody medium obtained by inoculation à un mammifère A d'un moyen antigène/?-HCG puis récu to a mammal A of antigenic means /? - HCG then recu pération à partir du sérum dudit mammifère, from the serum of said mammal, b) un moyen antigène choisi parmi HCG et/3-HCG et b) antigen means selected from HCG and / 3-HCG and fixé sur des hématies d'un mammifère B appartenant à une attached to red blood cells of a mammal B belonging to a espèce différente de celle du mammifère A, et species different from that of mammal A, and c) une solution aqueuse échantillon à étudier susceptible (c) an aqueous sample solution to be tested de contenir de l'HCG, la sédimentation des hematies sur lesquelles est fixé le moyen antigène indiquant la présence d'HCG dans ledit échantillon, et l'agglutination desdites hématies par formation de ponts par le moyen anticorps anti-/3-HCG entre les sites antigéniques desdites hématies indiquant l'absence d'HCG dans ledit échantillon. to contain HCG, the sedimentation of the red blood cells on which is fixed the antigen means indicating the presence of HCG in said sample, and the agglutination of said red blood cells by bridging by means of anti-3 / HCG antibody between antigenic sites of said red blood cells indicating the absence of HCG in said sample. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'antigène fixé sur des hématies est constitué par la sous-unité/9 de l'HCC. 2. Method according to claim 1, characterized in that the antigen fixed on red blood cells is constituted by the subunit / 9 of the HCC. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'antigène fixé sur les hématies est constitué par l'HCG.3. Method according to claim 1, characterized in that the antigen fixed on the red blood cells consists of HCG. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le moyen anticorps est un anti-/ -HCG obtenu par inoculation de p -HCG à un lapin.4. Method according to claim 1, characterized in that the antibody means is an anti-/ -HCG obtained by inoculation of p -HCG to a rabbit. 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'antigène choisi parmi l'ensemble HCG et/I- HCG est fixé sur des hématies de mouton.5. Method according to claim 1, characterized in that the antigen selected from the group HCG and / I-HCG is fixed on sheep red blood cells. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le solvant pour la mise en contact de l'anticorps anti--HCG de lapin, de l'antigène fixé sur des hématies de mouton est l'eau déminéralisée. 6. Method according to claim 1, characterized in that the solvent for bringing into contact the anti-rabbit HCG antibody, the antigen fixed on sheep red cells is demineralised water. 7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les quantités respectives de moyens antigène et anticorps sont choisies de telle façon que le dosage soit sensible à une quantité supérieure ou égale à 0,05 UI/ml en HCG dans l'échantillon.7. Method according to claim 1, characterized in that the respective amounts of antigen and antibody means are chosen such that the assay is sensitive to an amount greater than or equal to 0.05 IU / ml of HCG in the sample. 8. Procédé selon la revendication I, caractérisé en ce que les quantités respectives de moyens antigène et anticorps sont choisies de telle façon que le dosage soit sensible à une quantité supérieure ou égale à 0,25 UI/ml en HCG dans l'échantillon.8. Process according to claim 1, characterized in that the respective amounts of antigen and antibody means are chosen such that the assay is sensitive to an amount greater than or equal to 0.25 IU / ml of HCG in the sample. 9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les moyens antigène et anticorps sont lyophilisés selon la technique dite I deux couches, par congelation du moyen antigène préalablement fixé sur hématies de mouton dans un milieu approprie, addition du moyen anticorps, et lyophilisation de l'ensemble résultant.9. Method according to claim 1, characterized in that the antigen and antibody means are freeze-dried according to the so-called two-layer technique, by freezing the antigen means previously fixed on sheep red cells in an appropriate medium, adding the antibody medium, and freeze-drying. of the resulting set. 10. Application du procédé de dosage de l'HÇG selon la revendication 1, dans le cadre d'un test de grossesse précoce et fiable, ladite application étant caractérisée en ce que l'ensemble des moyens nécessaires comprend - une boîte de conditionnement, - un portoir 10 qui est (i) muni à sa partie supérieure d'un conduit10. Application of the HGG assay method according to claim 1, within the framework of an early and reliable pregnancy test, said application being characterized in that all of the necessary means comprise - a conditioning box, a rack 10 which is (i) provided at its upper part with a conduit creux 22 opaque pourvu d'un rebord circulaire 23 destiné å  hollow 22 opaque provided with a circular rim 23 for å soutenir un tube transparent 21 logé dans ledit conduit, support a transparent tube 21 housed in said conduit, ce tube renfermant le mélange lyophilisé des moyens anticorps this tube containing the freeze-dried mixture of the antibody means et antigène devant réagir avec l'urine de la femme en présence and antigen to react with the urine of the woman in the presence d'un solvant, et (ii) pourvu à sa partie inférieure d'un a solvent, and (ii) provided at its lower end with a miroir Il permettant de visualiser l'image 25 du fond du tube mirror It allows to visualize the image 25 of the bottom of the tube situé dans la lumière du rebord 23, ledit miroir etant maintenu located in the light of the rim 23, said mirror being maintained incliné par un dispositif convenable disposé sur la paroi inté-  inclined by a suitable device disposed on the wall rieure du portoir, et - un solvant, et en ce que le mélange lyophilisé des moyens antigène et anticorps a été obtenu par lyophilisation en deux couches, les quantités respectives des moyens antigène et anticorps ayant éte choisies de telle façon que le dosage soit sensible à une concentration en HCG dans l'urine à tester, supérieure ou égale à 0,05 UI/ml, et notamment de 0,25 UI/ml.  and in that the freeze-dried mixture of the antigen and antibody means was obtained by lyophilization in two layers, the respective amounts of the antigen and antibody means having been chosen so that the assay is sensitive to the reaction medium. a concentration of HCG in the urine to be tested greater than or equal to 0.05 IU / ml, and especially 0.25 IU / ml.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0164780A1 (en) * 1984-05-15 1985-12-18 l'Association internationale à but scientifique, dite: Institut international de pathologie cellulaire et moléculaire Method of immunological determination of a substance in a liquid sample
AP156A (en) * 1989-09-25 1991-11-06 Agen Ltd Agglutination assay.
CN111596076A (en) * 2020-06-04 2020-08-28 昆明天沃生物科技有限公司 Method for detecting sheep fertility

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