FR2498760A1 - METHOD FOR DETERMINING THE ANTI-BODY IGM DIRECTED AGAINST THE HEPATITIS A VIRUS AND REAGENT FOR ITS IMPLEMENTATION - Google Patents
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Abstract
Description
La présente invention concerne les déterminations immunologiques en général et en particulier la détermination inimuno- logique de l'IgM dirigée contre le virus de l'hépatite A. L'invention comporte un procédé pour améliorer la spécificité de détection de l'lgM dirigée contre le virus de l'hépatite A dans le sérum ou le plasma humain. The present invention relates to immunological determinations in general and in particular to the immunological determination of IgM directed against hepatitis A virus. The invention includes a method for improving the specificity of detection of IgM directed against hepatitis A virus. hepatitis A virus in human serum or plasma.
Pendant la phase aiguë de l'infection par l'hépatite A, un anticorps du type IgM dirigé contre le virus de l'hépatite A (lgM anti-VHA) apparaît dans le sérum du patient et persiste pendant le début de la convalescence et n'est pas décelé chez les sujets normaux. Donc, la détection de l'IgM anti-\'HA constitue un diagnostic pour l'infection aiguë par l'hépatite A. During the acute phase of hepatitis A infection, an IgM-like antibody to the hepatitis A virus (IgM anti-HAV) appears in the patient's serum and persists during the onset of convalescence and n is not detected in normal subjects. Therefore, detection of anti-HA IgM constitutes a diagnosis for acute hepatitis A infection.
La technique antérieure décrit diverses tentatives pour classer la détection d'anticorps spécifiques, par exemple les brevets des Etats-Unis d'Amérique n" 4 020 151, 4 048 298 et 3 904 367; Bradley et coll, Journal of Clinical Microbiology, mai 1977, pages 521-530; Lancent, 23 septembre 1978, page 684; Hepatitis Scientific Hemorandum, novembre 1978, page 3; et Hepatitis Scientific Memo randum, février 1979, page 2; tous ces documents indiquent des tentatives pour classer la détection d'anticorps spécifiques. La demande de brevet des Etats-Unis d'Amériqúe Serial nO 928 651 déposée le 28 juillet 1978 au nom de la demanderesse décrit en particulier une détermination immunologique de l'IgM sur phase solide en trois étapes.Dans cette dernière, on fait incuber une perle de matière plastique revetue d'anti-IgM humaine (spécifique des chaines principales ou anti- > i) successivement avec l'échantillon de sérum, le virus d'hépatite A et l'anticorps marqué dirigé contre le virus d'hépatite A. La présente invention représente un perfectionnement a cette détermination, dans lequel le support solide revetu avec l'anti-IgM humaine anti-? où l'échantillon d'essai est traite avec une solution aqueuse diluée de sérum ou plasma humain hépatite négatif ou d'une de leurs fractions contenant ï'lgG. The prior art describes various attempts to classify the detection of specific antibodies, e.g., U.S. Patents 4,020,151, 4,048,298 and 3,904,367; Bradley et al, Journal of Clinical Microbiology, May 1977, pages 521-530; Lancent, September 23, 1978, page 684; Hepatitis Scientific Hemorandum, November 1978, page 3; and Hepatitis Scientific Memo randum, February 1979, page 2; all of these documents indicate attempts to classify the detection of Specific Antibodies United States Patent Application Serial No. 928,651 filed July 28, 1978 in the name of the Applicant describes in particular a three-step solid phase immunoassay of IgM. incubates a plastic bead coated with anti-human IgM (specific for the main chains or anti-> i) successively with the serum sample, the hepatitis A virus and the labeled antibody directed against the virus of hepatitis A. The present invention represents an improvement to this determination, wherein the solid support coated with anti-human anti-IgM? wherein the test sample is treated with a dilute aqueous solution of hepatitis negative human serum or plasma or a fraction thereof containing IgG.
L'invention concerne un perfectionnement dans la détection de la phase aiguë de l'infection par l'hépatite A par mesure des anti-IgM anti-virus de l'hépatite A. Ce perfectionnement consiste à diluer l'échantillon d'essai avec une solution aqueuse contenant du sérum ou du plasma hépatite-négatif ou une de leurs fractions contenant l'IgG. La demanderesse a donc découvert qu'une dilution de 100 à 200 fois de l'échantillon d'essai avec un diluant contenant environ 0,1% de sérum ou de plasma humain hépatite-nAga- tif améliore fortement la spécificité d'une détermination en phase solide comportant une détermination au moyen d'un réactif constitué d'un support solide revêtu d'anti-IgM humaine, dans laquelle on fait réagir le réactif sur support solide avec l'échantillon d'essai dilue, on le lave, on le fait réagir avec l'antigène de l'hépatite A, on lave et on fait réagir avec l'anticorps marqué anti-hépatite A, on lave et on mesure le marquage sur le support solide. Le support solide peut également être prétraité avec une solution aqueuse diluée de sérum ou de plasma humain hépatite-négatifs ou d'une de leurs fractions contenant de l'igC. Dans ce dernier mode de mise en oeuvre, on préfère le traitement par la fraction contenant l'IgG. The invention relates to an improvement in the detection of the acute phase of hepatitis A infection by measuring anti-IgM anti-hepatitis A virus. This improvement consists in diluting the test sample with a aqueous solution containing hepatitis-negative serum or plasma or a fraction thereof containing IgG. Applicants have therefore found that a 100 to 200-fold dilution of the test sample with a diluent containing about 0.1% human hepatitis-nAgative serum or plasma greatly improves the specificity of an assay. solid phase comprising determination by means of a reagent consisting of a solid support coated with anti-human IgM, in which the solid supported reagent is reacted with the diluted test sample, washed, reacted with hepatitis A antigen, washed and reacted with labeled anti-hepatitis A antibody, washed and the labeling measured on the solid support. The solid support can also be pretreated with a dilute aqueous solution of hepatitis-negative human serum or plasma or one of their fractions containing igC. In this latter embodiment, treatment with the fraction containing IgG is preferred.
Pour la mise en oeuvre d'un mode de mise en oeuvre préféré de l'invention, on prépare les réactifs suivants
Perles revêtues d'anti-y
On se procure de l'antisérum de chèvre anti-IgM humaine anti-u chez la société Litton Bionetics. On revet des perles de polystyrène (6 mm) pendant 2 heures avec l'antisérum dilué 1 000 fois par le tampon tris O,OlM à pH 9,0, et on les lave et on sèche à l'air.For the implementation of a preferred embodiment of the invention, the following reagents are prepared
Anti-y coated beads
Goat anti-human anti-u IgM antiserum was purchased from Litton Bionetics. Polystyrene beads (6 mm) were coated for 2 hours with the antiserum diluted 1000 times with tris 0.1M buffer, pH 9.0, and washed and air dried.
On conserve les perles à 4"C jusqu'à l'utilisation.The beads are stored at 4 ° C until use.
Solution d'antigène du virus de l'hépatite A (VHA)
On obtient le VHA à partir des foies de tamarins aux stades aigus de l'hépatite A. On prépare les extraits de foies et on inactive l'infectiosité virale par le formaldéhyde en solution aqueuse à environ 372 (formaline). On dilue des extraits dans le tampon au phosphate 0,014 a pH 7,0 dans le sérum normal (sTPI contenant de 1'EDTA 5mM et 0,1% d'azide de sodium pour donner le comptage convenable (coups/min) dans l'essai.Hepatitis A virus (HAV) antigen solution
HAV is obtained from the livers of tamarinds in the acute stages of hepatitis A. The liver extracts are prepared and the viral infectivity is inactivated by formaldehyde in aqueous solution at about 372 (formalin). Extracts were diluted in 0.014 phosphate buffer pH 7.0 in normal serum (sTPI containing 5mM EDTA and 0.1% sodium azide to give the proper count (counts / min) in test.
12.5I-anti-VHA
On isole l'IgG par chromatographie sur DEAE-cellulose (diéthylaminoéthylcellulose) à partir de sérums convalescents ayant des titres élevés en anti-VHA. On la marque par l'iode radioactif 1251 par la méthode de Greenwood. On dilue l'anticorps iodé jusqu'à environ 5 . 106 coups/min par ml dans le STP contenant du sérum de veau, du sérum humain normal, de l'EDTA et de l'azide de sodium.12.5I-anti-HAV
IgG is isolated by chromatography on DEAE-cellulose (diethylaminoethylcellulose) from convalescent sera having high titers of anti-HAV. It is labeled with radioactive iodine 1251 by the Greenwood method. The iodine antibody is diluted to about 5. 106 strokes / min per ml in PBS containing calf serum, normal human serum, EDTA and sodium azide.
Première solution diluée
On dilue d'abord 200 fois chaque échantillon à essayer dans le sérum normal (chlorure de sodium à 0,9%) ou dans le sérum tamponné au phosphate (STP au phosphate de sodium 0,01M, pH 7,2 dans le sérum à 0,920). First diluted solution
Each sample to be tested is first diluted 200 times in normal serum (0.9% sodium chloride) or in phosphate buffered serum (0.01M sodium phosphate PBS, pH 7.2 in normal serum. 0.920).
Seconde solution diluée
On utilise une seconde solution pour une nouvelle dilution de l'échantillon. On place une partie aliquotede la première dilution de l'échantillon dans le sérum ou le STP dans le godet de réaction et on dilue 21 fois avec une solution consistant en : 0,1% de sérum ou plasma humain normal; 8% de sérum fétal de veau
EDTA 0,005M (Bthylènediaminetétraacétate); 0,2% de "Tween-20" et 0,1% d'azide de sodium dans le sérum tanponné au pnospllate, 0,019 a pil 7,4.Second diluted solution
A second solution is used for further dilution of the sample. An aliquot of the first dilution of the sample in serum or PBS is placed in the reaction well and diluted 21 times with a solution consisting of: 0.1% normal human serum or plasma; 8% fetal calf serum
0.005M EDTA (Bthylenediaminetetraacetate); 0.2% of "Tween-20" and 0.1% of sodium azide in serum tanponed with pnosplate, 0.019 a pil 7.4.
Préparation de témoins
On prépare un témoin positif à partir de sérum en phase aiguë ou en début de convalescence prélevé sur des sujets atteints d'hépatite A. On prépare un témoin négatif de la meme manière à partir de sérums négatifs à l'anti-Vi. Preparation of witnesses
A positive control is prepared from serum in the acute phase or at the start of convalescence taken from subjects suffering from hepatitis A. A negative control is prepared in the same way from sera negative for anti-Vi.
Mode opératoire
Le mode opératoire peut être résumé de la façon suivante 1. Perle.anti- + IgM t Perle.anti-y-IgM 2. Perle.anti-y-IgM + VHA 4 PerLe.anti-p-IgM-VHA 3. Perle.anti-P-IgM-VHA + 125I-anti-VHA - >
Perle.anti- -IgM-VHA-125I-anti-VHA
Les essais,y compris avec les témoins positif et négatif,sont effectués selon le mode opératoire suivant 1. On ajoute 10 yl de chaque échantillon à 2 ml de sérum normal.Operating mode
The procedure can be summarized as follows 1. Perle.anti- + IgM t Perle.anti-y-IgM 2. Perle.anti-y-IgM + VHA 4 PerLe.anti-p-IgM-VHA 3. Perle .anti-P-IgM-VHA + 125I-anti-VHA ->
Pearl.anti- -IgM-VHA-125I-anti-VHA
The tests, including with the positive and negative controls, are carried out according to the following procedure 1. 10 μl of each sample are added to 2 ml of normal serum.
2. On pipette 10 ,al de chaque temoin ou échantillon dilué dans l'un
des godets d'une plaque de rédaction. 2. Pipette 10, al of each control or sample diluted in one
buckets of a drafting plate.
3. On ajoute 200 200 l d'échantillon diluant dans chaque godet, on
tapote la plaque pour mélanger.3. Add 200-200 l of diluent sample to each well, then
pat the plate to mix.
4. On ajoute dans chaque godet une perle revêtue avec l'anticorps
anti-IgM humaine. 4. A bead coated with the antibody is added to each well.
anti-human IgM.
5. On couvre la plaque et on tapote pour mélanger. On fait incuber
la température ambiante pendant 2 heures.5. Cover the plate and tap to mix. We incubate
room temperature for 2 hours.
6. On aspire le liquide,puis on lave chaque perle deux fois avec
5 ml d'eau.6. Aspirate the liquid, then wash each bead twice with
5 ml of water.
7. On ajoute dans chaque godet 200 pl de solution de VHA. On couvre
et on fait incuber la température ambiante pendant 18 à 22 heures.7. 200 µl of HAV solution is added to each well. We cover
and incubated at room temperature for 18-22 hours.
8. On répète l'étape 6. 8. Repeat step 6.
9. On ajoute dans chaque godet 125I anti-VHA. On couvre et
on fait incuber å 450C pendant 4 heures.9. 125I anti-HAV is added to each well. We cover and
incubate at 450C for 4 hours.
10. On répète l'étape 6.10. Repeat step 6.
11. On transfère les perles dans des tubes de comptage et on les
passe dans un compteur approprié pendant une minute.11. Transfer the beads to counting tubes and
goes through a suitable counter for one minute.
12. On détermine le comptage moyen en coups par minute du témoin
positif et du témoin négatif. On calcule le passage positif
négatif ou "cut off" en ajoutant un d i x i è m e de
la moyenne du témoin positif a la moyenne du témoin négatif,
par exemple x PC + x NC = cut-off.12. The average count in counts per minute of the witness is determined.
positive and negative control. We calculate the positive passage
negative or "cut off" by adding a tenth of
the mean of the positive control has the mean of the negative control,
for example x PC + x NC = cut-off.
10
Un échantillon est jugé positif si ses valeurs de comptage
(coups par minute) sont égales ou supérieures à la valeur de
cut-off.
10
A sample is considered positive if its count values
(strokes per minute) are equal to or greater than the value of
cut-off.
13. A titre de vérification des résultats de l'essai, on determine
le rapport positif/négatif (P:N) en utilisant les valeurs nettes
de comptage pour chaque témoin. La valeur P:N doit etre inférieure
d 5,0 pour assurer un essai valable.13. As a check of the results of the test, it is determined
the positive / negative ratio (P: N) using the net values
count for each witness. The P: N value must be less
d 5.0 to ensure a valid test.
L'effet de la dilution de l'échantillon et de la présence de plasma humain normal (PHN) sur la spécificité de 1'IgH pour l'hépatite A est indiqué dans le tableau ci-après. The effect of sample dilution and the presence of normal human plasma (PHN) on the specificity of IgH for hepatitis A is shown in the table below.
TABLEAU
Paa de PHN dans le o,lwZ de PHN dans le
diluant diluant
Dilution de l'échantillon 1:50 1:200 l:SO 1:200
*S:CO +/o S:CO +/o S:CO +/o S:CO +/o
IgM anti-VHA forte 6,32 + 5,88 + 6,61 + 6,44 + IgM anti-VHA faible 5,17 + 2,69 + 4,80 + 2,33 +
IgG anti-VHA du patient I 1,10 + 1,03 + 0,85 o 0,54 o
IgG anti-VHA du patient II 1,10 t 0,84 o 0,96 o 0,63 o S:CO est le rapport échantillon/cut-off. BOARD
Paa of PHN in the o, lwZ of PHN in the
diluent diluent
Sample dilution 1:50 1: 200 l: SO 1: 200
* S: CO + / o S: CO + / o S: CO + / o S: CO + / o
Strong anti-HAV IgM 6.32 + 5.88 + 6.61 + 6.44 + Weak anti-HAV IgM 5.17 + 2.69 + 4.88 + 2.33 +
Patient I anti-HAV IgG 1.10 + 1.03 + 0.85 o 0.54 o
Patient II anti-HAV IgG 1.10 t 0.84 o 0.96 o 0.63 o S: CO is the sample / cut-off ratio.
On peut voir d'après les patients I et II que des teneurs fortes ou élevées en IgG anti-VN peuvent donner un résultat positif faux,mais celui-ci est éliminé par dilution avec un diluant contenant 0,1 de plasma humain normal. Donc, en diluant un échantillon 50 à 500 fois par le sérum physiologique normal en présence d'une dilution d'environ 10-25 fois avec une solution à 0,1 de de sérum ou de plasma humain hépatite-négatif, on augmente le rapport de sensibilité IgM/IgG du support solide revêtu avec le réactif anti-IgM humaine.L'homme de l'art rompu à la technique des déterminations immunologiques reconnattra que l'on peut faire réagir le support solide revêtu avec l'IgM anti-humaine avec une solution aqueuse de sérum ou de plasma hépatite-négatif ou d'une de leurs fractions d'IgG avant de commencer le mode opératoire oubien oamne ci-dessus pendant le déroulement de la détermination. Généralement, de très faibles quantités seulement du sérum ou plasma hépatitenégatif s o n t nécessaires pour augmenter le rapport de sensibilité
IgM/IgG du réactif.It can be seen from patients I and II that high or high levels of anti-VN IgG can give a false positive result, but this is removed by dilution with a diluent containing 0.1 of normal human plasma. Therefore, by diluting a sample 50-500 times with normal physiological saline in the presence of about 10-25 times dilution with 0.1 solution of hepatitis-negative human serum or plasma, the ratio is increased. IgM / IgG sensitivity of the solid support coated with the anti-human IgM reagent. Those skilled in the art of immunoassays will recognize that the coated solid support can be reacted with the anti-human IgM. with an aqueous solution of hepatitis-negative serum or plasma or one of their IgG fractions before starting the procedure or well as above during the course of the determination. Usually only very small amounts of the hepatitis-negative serum or plasma are needed to increase the susceptibility ratio.
IgM / IgG reagent.
Il est entendu que l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation préférés décrits ci-dessus à titre d'illustration et que l'homme de l'art peut y apporter diverses modifications et divers changements sans toutefois s'écarter du cadre et de l'esprit de l'invention. It is understood that the invention is not limited to the preferred embodiments described above by way of illustration and that those skilled in the art can make various modifications and changes thereto without, however, departing from the scope. and the spirit of the invention.
Claims (3)
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