FR2489363A1 - Hybrid plasmid(s) contg. genes for nitrogen fixation - to introduce nitrogen fixing ability into yeast cells for prodn. of foodstuffs - Google Patents

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Abstract

Hybrid plasmids contg. (a) a DNA fragment of a yeast 2 micrometre plasmid, (b) a DNA segment contg. a yeast gene, (c) a bacterial plasmid DNA fragment, and (d) a DNA fragment contg. the genes responsible for fixing nitrogen, are new. Pref. the DNA fragment (a) is a fragment of the restriction between the Eco R1(1) and the Hind III (3) sites, as defined by Guerineau in Viruses and Plasmids in Fungi, Marcel Dekker, N.Y. 1979, ed. by P.A. Lemke. The yeast gene (b) is pref. URA3+ gene, the DNA fragments being adjacent to form a 'DNA yeast block.' The DNA fragment (c) pref. carries a lambda or lambdoid phage cos site to facilitate cloning, such as pHc 79 described by Collins, Methods in Enzymology, 68, 309, 1979. The DNA fragment carrying nitrogen-fixing genes is pref. derived from Klebsiella pneumoniae. Also claimed are cells and microorganisms contg. the hybrid plasmids. The plasmids may be used to introduce nitrogen-fixing genes into eucaryotic cells, esp. yeasts, their culture enabling foodstuffs to be produced without using nitrogenous fertilisers.

Description

La présente invention concerne desplasmides hybrides"utiles pour l'introduction des gènes nif dans des cellules procaryotes ou eucaryotes qui en sont dépourvues, notamment des bactéries et des levures. The present invention relates to "hybrid plasmids useful for the introduction of nif genes into prokaryotic or eukaryotic cells which lack them, in particular bacteria and yeasts.

Les gènes nif ("nitrogen fixation") sont les gènes portant l'information génétique pour la fixation de l'azote atmosphérique. The nif genes ("nitrogen fixation") are the genes carrying the genetic information for the fixation of atmospheric nitrogen.

L'information génétique pour la fixation de l'azote atmosphérique ne se trouve que chez des organismes procaryotes (bactéries et cyanophycées). The genetic information for the fixation of atmospheric nitrogen is only found in prokaryotic organisms (bacteria and cyanophyceae).

Cependant, cette information conditionne tout le reste de la vie sur la terre puisque les autres organismes vivants (plantes, animaux) ont un besoin absolu d'azote combiné.However, this information conditions the rest of life on earth since other living organisms (plants, animals) have an absolute need for combined nitrogen.

Le développement de l'agriculture intensive n'a pu se faire que par l'apport massif d'engrais azotEs de synthèse et il apparaît clairement aujourd'hui que l'introduction dans les plantes de la capacité d'utiliser l'azote atmosphérique aurait des conséquences économiques considérables. The development of intensive agriculture could only be achieved by the massive supply of synthetic nitrogen fertilizers and it is clear today that the introduction into plants of the capacity to use atmospheric nitrogen would have considerable economic consequences.

La présente invention constitue une première approche de la solution de ce problème en fournissant des plasmides permettant l'introduction des gènes nif dans une cellule eucaryote. The present invention constitutes a first approach to the solution of this problem by providing plasmids allowing the introduction of the nif genes into a eukaryotic cell.

I1 s'agit d'un plasmide hybride caractérisé en ce qu'il comporte au moins - un fragment d'ADN d'un plasmide zende levure, - un segment d'ADN renfermant un gène de levure, - un fragment d'ADN d'un plasmide bactérien, et - un fragment d'ADN renfermant les gènes nif. I1 is a hybrid plasmid characterized in that it comprises at least - a DNA fragment of a yeast plasmid zende, - a DNA segment containing a yeast gene, - a DNA fragment d 'a bacterial plasmid, and - a DNA fragment containing the nif genes.

Dans un mode de réalisation préféré de ces plasmides, le fragment d'ADN de plasmide 2;mess le fragment de restriction R1 H3 de 2,12 Kb de la forme B du plasmide 2um.  In a preferred embodiment of these plasmids, the DNA fragment of plasmid 2; mess the restriction fragment R1 H3 of 2.12 Kb of the B form of the plasmid 2um.

Ce fragment permet une meilleure amplification du plasmide hybride dans la levure. This fragment allows better amplification of the hybrid plasmid in yeast.

Dans le cadre de la présente description, on utilisera parfois, lorsqu'aucune ambiguité n'est permise, les abréviations 1,Hind III" et "Eco R1" pour désigner les endonucléases de restriction Hind III et Eco R1, et les termes "site Hind III" ou site Eco R1" pour désigner les sites de restriction Hind III ou
Eco R1.
In the context of the present description, the abbreviations 1, Hind III "and" Eco R1 "will sometimes be used, when no ambiguity is permitted, to denote the restriction endonucleases Hind III and Eco R1, and the terms" site Hind III "or Eco R1 site" to designate the Hind III restriction sites or
Eco R1.

La nomenclature des sites de restriction du plasmide 2se référera, sauf indication contraire, aux cartes de restriction figurant dans : Guerineau M. The nomenclature of restriction sites for plasmid 2 will, unless otherwise indicated, refer to the restriction maps appearing in: Guerineau M.

Plasmid DNA in Yeast, in Lemke, P.A. (Ed), Viruses and Plasmids in Fungi, Marcel Dekker, New York, 1979.Plasmid DNA in Yeast, in Lemke, P.A. (Ed), Viruses and Plasmids in Fungi, Marcel Dekker, New York, 1979.

Ainsi, le fragment de restriction R1 H3 est un fragment de restriction entre le site Eco R1(1) et le site Hind III(3) tels que définis dans le document précédent. Thus, the R1 H3 restriction fragment is a restriction fragment between the Eco R1 site (1) and the Hind III site (3) as defined in the previous document.

Le fragment d'ADN d'un plasmide bactérien portera, de préférence, un site cos de phage lambda ou lambdoïde qui facilite le clonage comme cela sera décrit ci-après, mais, pour la mise en oeuvre du plasmide, la présence d'un site cos n'est pas indispensable. The DNA fragment of a bacterial plasmid will preferably carry a cos site of phage lambda or lambdoid which facilitates cloning as will be described below, but, for the implementation of the plasmid, the presence of a cos site is not essential.

On entend par "site cos" dans le cas du phage lambda, le domaine comprenant les extrémités cohésives agglutinantes. Ainsi, parmi les plasmides bactériens qui peuvent étre fragmentés pour être introduits dans un plasmide selon l'invention, il faut mentionner le cosmide (plasmide comportant un site cos) pHC 79 décrit dans COLLINS J., Methods in
Enzymol., 68, 309, 1979 et particulièrement le fragment de restriction Hind III Eco R1 de 6,5 Kb comportant le site cos.
The term “cos site” is understood to mean, in the case of phage lambda, the domain comprising the cohesive agglutinating ends. Thus, among the bacterial plasmids which can be fragmented to be introduced into a plasmid according to the invention, mention should be made of the cosmid (plasmid comprising a cos site) pHC 79 described in COLLINS J., Methods in
Enzymol., 68, 309, 1979 and particularly the Hind III Eco R1 restriction fragment of 6.5 Kb comprising the cos site.

Le fragment d'ADN portant les gènes nif provient de préférence de Klebsiella pneumoniae. The DNA fragment carrying the nif genes preferably comes from Klebsiella pneumoniae.

Chez cette bacterie, ces gènes sont portés par deux fragments de 1'ADN dont les extrémités sont pourvues de séquences de nucléotides reconnus par l'enzyme de restriction Hind III. Ces fragments sont de l'ordre de 16 et 25 Kb, il s'agit des 14 gènes nif organisés en 7 unités de transcription qui ont été identifiés.In this bacteria, these genes are carried by two fragments of DNA, the ends of which are provided with nucleotide sequences recognized by the restriction enzyme Hind III. These fragments are of the order of 16 and 25 Kb, these are the 14 nif genes organized into 7 transcription units which have been identified.

Enfin, dans le mode de réalisation préféré des plasmides selon l'invention, le gène de levure est le gène URA3 et les fragments d'ADN de levure sont contigus afin de former un bloc d'ADN de levure". Finally, in the preferred embodiment of the plasmids according to the invention, the yeast gene is the URA3 gene and the yeast DNA fragments are contiguous in order to form a yeast DNA block ".

La présente invention concerne également les microorganismes et les cellules eucaryotes, notamment les levures, comportant un plasmide tel que défini précédemment. Parmi ces microorganismes, il faut citer plus particulièrement les bactéries et surtout les levures. The present invention also relates to microorganisms and eukaryotic cells, in particular yeasts, comprising a plasmid as defined above. Among these microorganisms, mention should be made more particularly of bacteria and especially yeasts.

Les exemples ci-après sont destinés à illustrer certaines caractéristiques des plasmides selon la présente invention mais ne sauraient en aucune façon la limiter. The examples below are intended to illustrate certain characteristics of the plasmids according to the present invention but cannot in any way limit it.

L'utilisation des enzymes de restriction et des ligases est connue de l'homme de métier et afin d'alléger la description, sauf indication contraire, les enzymes en cause seront mises en oeuvre conformément aux prescriptions du fabricant. Ces enzymes sont commercialisées notamment par la société BIOLABS, la société MILES LABORATORIES INC. The use of restriction enzymes and ligases is known to those skilled in the art and in order to simplify the description, unless otherwise indicated, the enzymes in question will be used in accordance with the manufacturer's instructions. These enzymes are sold in particular by the company BIOLABS, the company MILES LABORATORIES INC.

et la société BOEHRINGER.and the company BOEHRINGER.

Exemple 1
Préparation du plasmide pG 63
A - On utilise comme plasmide de départ le plasmide pBR 322 (commercialisé par BETHESDA
RESEARCH LABORATORY, INC., Rockville, Maryland.)
Ce plasmide est digéré simultanément par deux enzymes de restriction : endo Eco R1 et Hind III, selon les conditions décrites par le fabricant (BIOLABS). Le plasmide est coupé en deux fragments, l'un de 31 paires de bases et l'autre de 4331 paires de bases (SUTCLIFFE J.C. Nucleic Acids Research 1978, 5, 2721-2728). Les deux fragments sont séparés par électrophorèse en gel d'agarose 1 % et le grand fragment est récupéré par la technique de congélation-décongélation (COLBERE-GARRAPIN F.,
CHOUSTERMAN S., HORODNICEANU F., KOURILSKY P., CARMIN A. Proc. Nat. Acad. Sci.USA 1979, 76, 3755-3759.)
B - Le plasmide de 2pm est extrait de la souche T8 de levure (GUERINEAU M., SLONIMSKI P.P.,
AVNER P.R. Biochemical Biophys. Res. Com. 1974', 61, 462-469).
Example 1
Preparation of plasmid pG 63
A - The plasmid pBR 322 (used by BETHESDA) is used as the starting plasmid
RESEARCH LABORATORY, INC., Rockville, Maryland.)
This plasmid is digested simultaneously with two restriction enzymes: endo Eco R1 and Hind III, according to the conditions described by the manufacturer (BIOLABS). The plasmid is cut into two fragments, one of 31 base pairs and the other of 4331 base pairs (SUTCLIFFE JC Nucleic Acids Research 1978, 5, 2721-2728). The two fragments are separated by electrophoresis in 1% agarose gel and the large fragment is recovered by the freeze-thaw technique (COLBERE-GARRAPIN F.,
CHOUSTERMAN S., HORODNICEANU F., KOURILSKY P., CARMIN A. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1979, 76, 3755-3759.)
B - The 2 μm plasmid is extracted from the yeast strain T8 (GUERINEAU M., SLONIMSKI PP,
AVNER PR Biochemical Biophys. Res. Com. 1974 ', 61, 462-469).

I1 est digéré lui aussi simultanément par les deux enzymes de restriction endo Eco R1 et endo
Hind III (BIOLABS).
I1 is also digested simultaneously by the two restriction enzymes endo Eco R1 and endo
Hind III (BIOLABS).

La carte de restriction du plasmide 2pmmontre qu'il existe deux formes A et B du plasmide de 2pm. The restriction map of plasmid 2mm shows that there are two forms A and B of the 2pm plasmid.

Le fragment Eco R1(1) Hind III (3) (RI H3) de la forme B d'un poids moléculaire de 2,12 Xb est purifié par électrophorèse en gel d'agarose t 1 % et il est recueilli du gel par la technique de congélationdécongélation déjà décrite.The Eco R1 (1) Hind III (3) (RI H3) fragment of form B with a molecular weight of 2.12 Xb is purified by electrophoresis in agarose gel t 1% and it is collected from the gel by freezing-thawing technique already described.

C - Le fragment pBR 322 et le fragment de levure de 2,12 Kb cités précédemment sont mélangés et ligaturés avec de la DNA ligase extraite du bactériophage T4 dans les conditions indiquées par le fabricant (BIOLABS). C - The fragment pBR 322 and the 2.12 Kb yeast fragment mentioned above are mixed and ligated with DNA ligase extracted from bacteriophage T4 under the conditions indicated by the manufacturer (BIOLABS).

Comme le fragment d'ADN du plasmide pBR 322 porte le gène Ampr, le mélange de ligation sert a transformer une souche d'E. coli ampicilline sensible et les bactéries devenues ampicilline résistantes sont sélectionnées. Le plasmide extrait, appelé pG 6 et décrit dans la demande de brevet français nO 80 18755 déposée le meme jour que la présente demande au nom du
Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) et intitulée "Nouveaux plasmides hybrides et microorganismes les comportant", contient le morceau RI H3 du 2 pm de levure inséré dans les sites RI H3 de pBR 322.
Since the DNA fragment of the plasmid pBR 322 carries the Ampr gene, the ligation mixture is used to transform a strain of E. coli ampicillin sensitive and bacteria that have become ampicillin resistant are selected. The extracted plasmid, called pG 6 and described in French patent application no. 80 18755 filed on the same day as the present application in the name of
National Center for Scientific Research (CNRS) and entitled "New hybrid plasmids and microorganisms containing them", contains the RI H3 piece of 2 pm of yeast inserted in the RI H3 sites of pBR 322.

D - Le gène URA 3 est obtenu par digestion par
Hind III du plasmide pBR 322 - URA 3 clone 6 (BACH M.L.,
LACROUTE F., BOTSTEIN D., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1979, 76, 386-390) et le fragment de 1,1 Kb est purifié et récolté par les techniques précédemment décrites. I1 est mélangé à pG 6 préalablement digéré par Hind III puis ligaturé comme précédemment décrit. Le melange sert à transformer une bactérie E. coli pyr F. Les transformants capables de se multiplier en l'absence d'uracile sont sélectionnés.
D - The URA 3 gene is obtained by digestion with
Hind III of plasmid pBR 322 - URA 3 clone 6 (BACH ML,
LACROUTE F., BOTSTEIN D., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1979, 76, 386-390) and the 1.1 Kb fragment is purified and harvested by the techniques described above. I1 is mixed with pG 6 previously digested with Hind III and then ligated as previously described. The mixture is used to transform an E. coli pyr F bacterium. The transformants capable of multiplying in the absence of uracil are selected.

De ces transformants on extrait un nouveau plasmide chimère pG 63 qui est décrit dans la figure 1.
Sur cette figure 1 J - la partie

Figure img00060001

représente 1'ADN du gène URA 3 - la partie
Figure img00060002

représente 1'ADN du plasmide pBR 322 - la partie
Figure img00060003

représente le fragment d'ADN du
plasmide 2Wm - la partie vs4s représente une séquence répétée
inverse du plasmide 2um. From these transformants, a new chimeric plasmid pG 63 is extracted, which is described in FIG. 1.
In this figure 1 J - the part
Figure img00060001

represents the DNA of the URA 3 gene - the part
Figure img00060002

represents the DNA of the plasmid pBR 322 - the part
Figure img00060003

represents the DNA fragment of the
2Wm plasmid - the vs4s part represents a repeated sequence
reverse of plasmid 2um.

Les sites de restriction sont notés de la façon suivante - R site de restriction Eco R1 - H site de restriction Hind III - P site de restriction Pst - Hpa site de restriction Hpa - B site de restriction Bam H1. The restriction sites are noted as follows - R restriction site Eco R1 - H restriction site Hind III - P restriction site Pst - Hpa restriction site Hpa - B restriction site Bam H1.

Ce plasmide comporte donc un bloc d'ADN de levure de 3,3 Kb situé entre un site de restriction
Eco R1 et Hind III et constitué du fragment d'ADN de 2,12 Xb du plasmide 2imide levure et d'un fragment d'ADN de 1,1 b portant le gène URA 3. Le fragment bactérien qui complète le plasmide est constitué par le fragment d'ADN de pBR 322 comportant 4331 paires de bases.
This plasmid therefore contains a yeast DNA block of 3.3 Kb located between a restriction site
Eco R1 and Hind III and consisting of the 2.12 Xb DNA fragment of the yeast 2imide plasmid and a 1.1b DNA fragment carrying the URA 3 gene. The bacterial fragment which completes the plasmid consists of the DNA fragment of pBR 322 comprising 4331 base pairs.

I1 faut remarquer que ce plasmide possède dans le bloc d'ADN de levure un site Hind III qui a servi à insérer le gène URA 3. It should be noted that this plasmid has a Hind III site in the yeast DNA block which was used to insert the URA 3 gene.

Afin d'obtenir un plasmide vecteur intéressant, il convient que celui-ci possède un maximum de site de restriction unique, en particulier un site de restriction unique Hind III qui correspond a l'une des enzymes de restriction le plus couramment utilisée. In order to obtain a vector plasmid of interest, it should have a maximum of unique restriction site, in particular a unique Hind III restriction site which corresponds to one of the most commonly used restriction enzymes.

C'est pourquoi on doit deleter ce site Hind III.This is why we must delete this Hind III site.

Exemple 2
Préparation du plasmide pG 63 11
Le site Hind III situé entre la partie levure 2 pm et le gène URA 3 de pG 63 a été délété de la manière suivante : le plasmide pG 63, déposé a la CNCM (Collection Nationale de Cultures Microbiennes a l'institut Pasteur I Paris) sous le nO I-130, a été digéré partiellement par Hind III. Les molécules linéaires de longueur complète sont séparées et purifiées par électrophorèse en gel d'agarose. Ces molécules sont ensuite traitées par l'endonucléase SI spécifique du DNA monobrin (BIOLABS) dans les conditions décrites par le fabricant, excepté la température qui est 200C.
Example 2
Preparation of the plasmid pG 63 11
The Hind III site located between the 2 μm yeast part and the URA 3 gene of pG 63 was deleted as follows: the plasmid pG 63, deposited at the CNCM (National Collection of Microbial Cultures at the Pasteur I Institute in Paris) under nO I-130, was partially digested with Hind III. The full length linear molecules are separated and purified by agarose gel electrophoresis. These molecules are then treated with the endonuclease SI specific for single-strand DNA (BIOLABS) under the conditions described by the manufacturer, except the temperature which is 200C.

Après traitement, le DNA est précipité et ligaturé avec de la DNA ligase du phage T4 (BIOLABS) I forte concentration, ce qui permet de ligaturer des bouts francs sans extrémités cohésives. After treatment, the DNA is precipitated and ligated with DNA ligase from phage T4 (BIOLABS) I at high concentration, which makes it possible to ligate blunt ends without cohesive ends.

Comme précédemment, après ligation, le mélange de ligation sert I transformer une souche E. coli ampicilline sensible et on sélectionne les bactéries ampicilline résistantes qui contiennent nécessairement le plasmide. As before, after ligation, the ligation mixture is used to transform an E. coli ampicillin-sensitive strain and the resistant ampicillin bacteria which necessarily contain the plasmid are selected.

Après analyse des plasmides que l'on extrait et qui sont analysés par restriction, on obtient le-plasmide pG 63 11 représenté sur la figure 2. After analysis of the plasmids which are extracted and which are analyzed by restriction, the plasmid pG 63 11 shown in FIG. 2 is obtained.

Ce plasmide présente la même structure d'ensemble que le plasmide pG 63 décrit précédemment mais le site de restriction Hind III situé entre la partie levure 2pmet le gène URA 3 a été délété. This plasmid has the same overall structure as the plasmid pG 63 described above, but the Hind III restriction site located between the yeast part 2 and the URA 3 gene has been deleted.

La structure de ce plasmide est particulièrement intéressante. En effet,
1) il possède plusieurs sites de restriction uniques : Eco R1, Hind III, Bam H1 et Hp al
2) le fragment de restriction Eco R1 Hind III n'est constitué que de DNA de levure, c'est- -dire que l'on a ainsi construit un bloc levure transposable aisément dans d'autres vecteurs
3) la résistance I la tétracycline est maintenue et l'incorporation d'un DNA étranger au site Bam H1 entraîne l'inactivation du gène et donne donc un phénotype tétracyline sensible ; la résistance I l'ampicilline est aussi maintenue mais, cependant, il existe trois sites Ps tI dans ce vecteur.
The structure of this plasmid is particularly interesting. Indeed,
1) it has several unique restriction sites: Eco R1, Hind III, Bam H1 and Hp al
2) the Eco R1 Hind III restriction fragment consists only of yeast DNA, that is to say that a yeast block has thus been constructed which can easily be transposed into other vectors
3) resistance I tetracycline is maintained and the incorporation of a foreign DNA at the Bam H1 site leads to the inactivation of the gene and therefore gives a sensitive tetracyline phenotype; resistance I to ampicillin is also maintained but, however, there are three Ps tI sites in this vector.

Exemple 3
Préparation du cosmide pHCG 3
A partir du plasmide pG 63 11 on extrait le bloc levure par digestion du plasmide par Hind III et
Eco R1 comme cela est décrit dans l'exemple 1-B.
Example 3
Preparation of the cosmid pHCG 3
From the plasmid pG 63 11, the yeast block is extracted by digestion of the plasmid with Hind III and
Eco R1 as described in Example 1-B.

De même, on traite comme dans l'exemple 1-A le cosmide pHC 79 décrit par COLLINS J. Methods in
Enzymol., 68, 309, 1979 par Hind III et Eco R1 par électrophorèsesur gel d'agarose, on récupère le fragment de restriction Eco R1 Hind III de 6,5 Kb comportant le sitecos.
Likewise, the cosmid pHC 79 described by COLLINS J. Methods in
Enzymol., 68, 309, 1979 by Hind III and Eco R1 by electrophoresis on agarose gel, the Eco R1 Hind III restriction fragment of 6.5 Kb is recovered, comprising the sitecos.

Par ligation des deux fragments d'ADN obtenus, comme cela est décrit dans l'exemple 1-C, on obtient le cosmide pHCG 3 ayant la structure représentée I la figure 3. By ligation of the two DNA fragments obtained, as described in Example 1-C, the cosmid pHCG 3 is obtained having the structure shown in FIG. 3.

Dans ce schema, la partie svw représente le site cos d'un phage A ; les significations des autres éléments du schema étant identiques à ce qui a été indiqué pour la figure 1, c'est-à-dire que la partie

Figure img00080001

représente 1'ADN du cosmide pHC 79 dans lequel on a fait apparaître le site cos.In this diagram, the svw part represents the cos site of a phage A; the meanings of the other elements of the diagram being identical to what has been indicated for FIG. 1, that is to say that the part
Figure img00080001

represents the DNA of the cosmid pHC 79 in which the cos site has been shown.

Le plasmide pHCG 3 est utilisé pour introduire les gènes nif dans une levure en opérant de la façon suivante.  The plasmid pHCG 3 is used to introduce the nif genes into a yeast by operating as follows.

Exemple 4
Préparation du cosmide pPC 857
A - Source d'ADN nif
La source d'ADN nif est le plasmide pCE 1 (Km Tc Cb Gnd His Nif Tra IncP) décrit dans ELMERICH C.,
HOUMARD J., SIBOLD L., RNHEIMER I. et CUARPIN N.,
Molec. Gen. Genet. 165, 181-189, 1978, qui porte les gènes nif de K. pneumoniae. Ces genes, dont 13 pour l'instant ont été identifiés (MERRICK M., FILSER M.,
DIXON R., ELMERICH C., SIBOLD L. et HOUMARD J.,
J. Gener. Microbiol. 117, 509-520, 1980), sont portés par deux fragments de restriction Hind III contigus (PUHLER A., BURKARDT H.J. et KLIPP W., Molec. Gen.
Example 4
Preparation of the cosmid pPC 857
A - Source of nif DNA
The source of nif DNA is the plasmid pCE 1 (Km Tc Cb Gnd His Nif Tra IncP) described in ELMERICH C.,
HOUMARD J., SIBOLD L., RNHEIMER I. and CUARPIN N.,
Molec. Gen. Broom. 165, 181-189, 1978, which carries the nif genes of K. pneumoniae. These genes, 13 of which have so far been identified (MERRICK M., FILSER M.,
DIXON R., ELMERICH C., SIBOLD L. and HOUMARD J.,
J. Gener. Microbiol. 117, 509-520, 1980), are carried by two contiguous Hind III restriction fragments (PUHLER A., BURKARDT HJ and KLIPP W., Molec. Gen.

Genet. 176, 17-24, 1979). Le plasmide pCE 1, introduit dans E. coli SB 1801 (A(his gnd)rpsl) a été purifié par la méthode de HUMPHREYS G.O., WILLSHAW G.A.,
ANDERSON E.S., Biochim. Biophys. Acta, 383, 457-463, 1975. A partir de 15 1 de culture en milieu LB (Luria
Broth) I 370C on a obtenu 500 ug d'ADN purifié. Une partie aliquote de 5 g a été hydrolysée par l'endonucléase Hind III (BIOLABS, 1 unité) pendant 30 minutes I 370C dans le tampon recommandé par BIOLABS.
Broom. 176, 17-24, 1979). The plasmid pCE 1, introduced into E. coli SB 1801 (A (his gnd) rpsl) was purified by the method of HUMPHREYS GO, WILLSHAW GA,
ANDERSON ES, Biochim. Biophys. Acta, 383, 457-463, 1975. From 15 liters of culture in LB medium (Luria
Broth) I 370C was obtained 500 ug of purified DNA. A 5 g aliquot was hydrolyzed by the Hind III endonuclease (BIOLABS, 1 unit) for 30 minutes at 370C in the buffer recommended by BIOLABS.

B - Préparation du vecteur
Le vecteur choisi est le cosmide pHC 79 mentionné précédemment. L'ADN du vecteur a été purifié comme décrit en A à partir de 200 ml d'une culture en milieu LB à 370C de la souche 5 K d'E. coli, décrite dans Proc. Nat. Acad. Sc. USA, 1978, 75, 4242, contenant pHC 79 décrit dans l'article de COLLINS J. (Methods in Enzymol., 1979, 68, 309) après amplification au chloramphenicol (150 pg/ml). On a obtenu 200 pg d'ADN purifié. Une partie aliquote (1 pg) a été hydrolysée par l'endonucléase Hind III comme décrit en A.
B - Preparation of the vector
The vector chosen is the cosmid pHC 79 mentioned above. The vector DNA was purified as described in A from 200 ml of a culture in LB medium at 370C of the strain 5 K of E. coli, described in Proc. Nat. Acad. Sc. USA, 1978, 75, 4242, containing pHC 79 described in the article by COLLINS J. (Methods in Enzymol., 1979, 68, 309) after amplification with chloramphenicol (150 pg / ml). 200 µg of purified DNA were obtained. An aliquot part (1 μg) was hydrolyzed by the Hind III endonuclease as described in A.

C - Clonage
On mélange 2 pg d'ADN'hydrolysé de pCE 1 obtenu en A et 0,5 ug d'ADN hydrolysé de pHC 79 obtenu en B dans 20 ul de tampon de ligature (MILES L BORATORIES) auquel on ajoute 0,1 pl d'une solution de ligase de T4 (MILES LABORATORIES). -La solution est incubée 16 heures I 120C.
C - Cloning
2 μg of hydrolyzed DNA of pCE 1 obtained in A and 0.5 μg of hydrolyzed DNA of pHC 79 obtained in B are mixed in 20 μl of ligation buffer (MILES L BORATORIES) to which 0.1 μl are added. 'a T4 ligase solution (MILES LABORATORIES). -The solution is incubated for 16 hours at 120C.

L'ADN recombinant est encapsidé in vitro dans le bactériophage X selon la méthode de COLLINS J. The recombinant DNA is packaged in vitro in bacteriophage X according to the method of COLLINS J.

et HOHN B. Proc. Natl. Acad. Sci. 75, 4242-4246, 1978.and HOHN B. Proc. Natl. Acad. Sci. 75, 4242-4246, 1978.

Les phages ainsi préparés servent I infecter la souche C 600 d'E. coli. Les clones recombinants sont sélectionnés pour leur caractère de résistance a l'ampicilline sur milieu solide LB contenant 100 pg/ml d'ampicilline.The phages thus prepared serve to infect strain C 600 of E. coli. The recombinant clones are selected for their character of resistance to ampicillin on solid LB medium containing 100 μg / ml of ampicillin.

Sur 500 clones examinés, on a décelé la présence de gènes nif dans 10 I 20 % des clones par hybridation avec 1'ADN de petits plasmides amplifiables portant certains gènes nif tels que pSA 30 et pCM 1 mentionnés dans CANNON F., RIEDEL G.E. On 500 clones examined, the presence of nif genes was detected in 10-20% of the clones by hybridization with the DNA of small amplifiable plasmids carrying certain nif genes such as pSA 30 and pCM 1 mentioned in CANNON F., RIEDEL G.E.

et AUSUBEL F.M., Molec. Gen. Genet. 174, 59-66, 1979.and AUSUBEL F.M., Molec. Gen. Broom. 174, 59-66, 1979.

Une vingtaine de cosmides provenant de clones donnant une réaction d'hybridation positive ont été purifiés et leurs diagrammes de restriction, après hydrolyse par Hind III et Eco R1, ont été établis. Twenty cosmids from clones giving a positive hybridization reaction were purified and their restriction diagrams, after hydrolysis with Hind III and Eco R1, were established.

Le cosmide pPC 857 est représenté sur la figure 4. I1 a été déposé I la CNCM sous le nO I-131 ; il s'est révélé contenir l'ensemble des gènes nif.  The cosmid pPC 857 is represented in FIG. 4. It has been deposited at the CNCM under the number I-131; it was found to contain all of the nif genes.

Sur ce schema, les sites Eco R1 sont représentés par : | et les sites Hind III sont représentés par : t. In this diagram, the Eco R1 sites are represented by: | and the Hind III sites are represented by: t.

Les gènes nif sont indiqués par leurs abréviations communes : BALFGVSUNEKDHJ.  The nif genes are indicated by their common abbreviations: BALFGVSUNEKDHJ.

Ces gènes sont portés par deux fragments de restriction Hind III contigus, le site de restriction
Hind III de séparation étant situé entre les gènes
K et D. Dans ce cosmide pPC 857, les deux fragments de restriction Hind III portant l'ensemble des gènes nif sont présents mais ligaturés dans le mauvais sens.
These genes are carried by two contiguous Hind III restriction fragments, the restriction site
Hind III separation being located between genes
K and D. In this cosmid pPC 857, the two Hind III restriction fragments carrying all of the nif genes are present but ligated in the wrong direction.

L'ADN du cosmide de pHC 79 est représenté schematiquement entre deux sites de restriction Hind III. L'ADN du cosmide de pHC 79 comporte, outre le site cos

Figure img00110001

un site de restriction Eco R1. Les autres sites de restriction portés sur 1'ADN codant pour les gènes nif ne sont pas représentés sur le schéma.The cosmid DNA of pHC 79 is represented diagrammatically between two Hind III restriction sites. The cosmid DNA of pHC 79 contains, in addition to the cos site
Figure img00110001

an Eco R1 restriction site. The other restriction sites carried on the DNA coding for the nif genes are not shown in the diagram.

Exemple 5
Préparation des cosmides pPC 874 et pPC 922
A partir de 1'ADN de pPC 857, les opérations d'hydrolyse, ligature, encapsidation et sélection de clones décrites dans l'exemple 4 ont été répétées.
Example 5
Preparation of the cosmids pPC 874 and pPC 922
Starting from pPC 857 DNA, the operations of hydrolysis, ligation, packaging and selection of clones described in Example 4 were repeated.

Sur 200 clones examinés, 9 se sont révélés fixateurs d'azote. La structure des cosmides contenus dans ces clones a été établie sur la base de leur diagramme de restriction après hydrolyse par Hind III, Eco R1,
Bam H1, Bgl II (BIOLABS). Ils se répartissent dans les deux groupes théoriques possibles
- l'un correspond I pPC 874 (représenté sur la figure 5) qui ne confère pas de résistance I la tétracycline,
- l'autre correspond I pPC 922 (représenté sur la figure 6) qui confère une faible résistance la tétracycline.
Out of 200 clones examined, 9 were found to be nitrogen-fixing. The structure of the cosmids contained in these clones was established on the basis of their restriction diagram after hydrolysis with Hind III, Eco R1,
Bam H1, Bgl II (BIOLABS). They fall into two possible theoretical groups
one corresponds to I pPC 874 (shown in FIG. 5) which does not confer resistance to tetracycline,
- the other corresponds to I pPC 922 (shown in FIG. 6) which confers low resistance to tetracycline.

Afin d'étudier l'expression des gènes nif portés par ces plasmides, ceux-ci ont été transférés dans des souches bactériennes de E. coli et de K. pneumoniae dépourvues de gènes nif. On a utilisé, par exemple, la souche K. pneumoniae UNF 107 qui porte une délétion totale des gènes nif (Anif) décrite dans Molec. Gen. In order to study the expression of the nif genes carried by these plasmids, they were transferred into bacterial strains of E. coli and K. pneumoniae lacking nif genes. We used, for example, the strain K. pneumoniae UNF 107 which carries a total deletion of the nif genes (Anif) described in Molec. Gen.

Genet., 1978, 165, 181.Genet., 1978, 165, 181.

Pour transférer les plasmides pPC 874 et pPC 922 chez K. pneumoniae, on procède une infection lytique des souches d'E. coli qui les portent par le phage Sh 434 cts. Le lysat obtenu sert I infecter les souches de K. pneumoniae et les clones portant le cosmide sont sélectionnés par leur résistance I l'ampicilline. To transfer the plasmids pPC 874 and pPC 922 to K. pneumoniae, a lytic infection of the strains of E is carried out. coli which carry them by the phage Sh 434 cts. The lysate obtained is used to infect the strains of K. pneumoniae and the clones carrying the cosmid are selected by their resistance to ampicillin.

L'activiste fixatrice d'azote, selon la méthode décrite dans Molec. Gen. Genet., 1978, 165, 181-189 (test de réduction de l'acétylne) d'E. coli ou de
K. pneumoniae (Anif) portant les plasmides pPC 874 ou pPC 922 est équivalente å celle de la souche sauvage M5 al de K. pneumoniae dont dérivent les gènes nif clonés.
The nitrogen-fixing activist, according to the method described in Molec. Gen. Genet., 1978, 165, 181-189 (acetylene reduction test) by E. coli or from
K. pneumoniae (Anif) carrying the plasmids pPC 874 or pPC 922 is equivalent to that of the wild strain M5 al of K. pneumoniae from which the cloned nif genes are derived.

Pour éviter la perte des plasmides pendant la croissance des bactéries hôtes (ségrégation), il faut ajouter de l'ampicilline a tous les milieux. To avoid loss of plasmids during the growth of host bacteria (segregation), ampicillin must be added to all media.

Exemple 6
Préparation du cosmide pGPC 875
A - Source d'ADN nif A partir de 23 ijg d'ADN pPC 857 hydrolysés par Hind III (6 unités BIOLABS), les deux segments de restriction portant l'ensemble des gènes nif ont été purifiés par gradient de saccharose selon la méthode de MANIATIS T., HARDISON R.C., LACY E.,
LAUER J., O'CONNELL C. et QUON D., Cell. 15, 687-701, 1978.
Example 6
Preparation of the cosmid pGPC 875
A - Source of nif DNA From 23 μg of pPC 857 DNA hydrolyzed by Hind III (6 BIOLABS units), the two restriction segments carrying all of the nif genes were purified by sucrose gradient according to the method of MANIATIS T., HARDISON RC, LACY E.,
LAUER J., O'CONNELL C. and QUON D., Cell. 15, 687-701, 1978.

B - HydrolZse du vecteur
1 pg de 1'ADN du plasmide pHCG 3, préparé comme décrit I l'exemple 3, a été hydrolysé par Hind III (1 unité BIOLABS).
B - HydrolZse of the vector
1 µg of the plasmid pHCG 3 DNA, prepared as described in Example 3, was hydrolyzed with Hind III (1 BIOLABS unit).

C - Clonage
Les mêmes opérations que celles décrites l'exemple 4 (ligature, encapsidation, sélection de clones) ont été effectuées I partir d'un mélange contenant 1 ug d'ADN nif et 0,5 pg d'ADN de pHCG 3.
C - Cloning
The same operations as those described in Example 4 (ligation, packaging, selection of clones) were carried out using a mixture containing 1 μg of nif DNA and 0.5 μg of pHCG 3 DNA.

Sur 180 clones examinés, deux avaient la propriété de fixer l'azote. Tous deux ont la même structure qui est représentée sur la figure 7. Le cosmide correspondant est appelé pGPC 875.Out of 180 clones examined, two had the property of fixing nitrogen. Both have the same structure which is shown in Figure 7. The corresponding cosmid is called pGPC 875.

Sur cette figure 7, la partie en trait continu représente lesfragmentsde restriction Hind III d'ADN de
K. pneumoniae portant les gènes nif indiqués par leurs abréviations conventionnelles.
In this FIG. 7, the solid line represents the Hind III restriction fragments of DNA from
K. pneumoniae carrying the nif genes indicated by their conventional abbreviations.

Le fragment de restriction Hind III Eco R1 de pHC 79 (6,5 Xb) est représenté en pointillé, quant au bloc levure, il est représenté par un trait ondulé (nsxm ). The Hind III Eco R1 restriction fragment of pHC 79 (6.5 Xb) is shown in dotted lines, as for the yeast block, it is represented by a wavy line (nsxm).

Ce bloc levure comporte 1'ADN du gène URA3 et le fragment d'ADN du plasmide 2ter1 H3 de la forme B (décrit I l'exemple 1-B). This yeast block comprises the DNA of the URA3 gene and the DNA fragment of the plasmid 2ter1 H3 of form B (described I in Example 1-B).

Exemple 7
Transformation de la levure
1 pg d'ADN du pGPC 875 a servi a transformer
S. cerevisiae, souche FL 100, selon la méthode de
GERBAUD C., FOURNIER Ph. BLANC H., AIGLE M. HESLOT H.
Example 7
Yeast transformation
1 pg of pGPC 875 DNA was used to transform
S. cerevisiae, strain FL 100, according to the method of
GERBAUD C., FOURNIER Ph. BLANC H., AIGLE M. HESLOT H.

et GUERINEAU M., Gene, 5, 233-253, 1979. Environ 250 transformants sélectionnés pour le caractère Ura+ ont été obtenus. L'ADN circulaire contenu dans un de ces clones (clone 3) a été extrait selon la méthode décrite dans 11 article de GERBAUD mentionné précédemment et a servi a transformer la souche 1106 (met, hsdR, hsdM) d'E. coli selon la méthode de
COHEN S.N., CHANG A.C.Y. et HSU L., Proc. Natl. Acad
Sci. 69, 2110-2114, 1972. Les transformants ont été sélectionnés pour la résistance I l'ampicilline.
and GUERINEAU M., Gene, 5, 233-253, 1979. About 250 transformants selected for the character Ura + were obtained. The circular DNA contained in one of these clones (clone 3) was extracted according to the method described in the article by GERBAUD mentioned previously and was used to transform the strain 1106 (met, hsdR, hsdM) of E. coli according to the method of
COHEN SN, CHANG ACY and HSU L., Proc. Natl. Acad
Sci. 69, 2110-2114, 1972. The transformants were selected for resistance to ampicillin.

Sur 10 clones examinés, tous se sont révélés fixateurs d'azote. La structure des plasmides portés par ces 10 clones est identique t celle du plasmide pGPC 875 de départ. Gracie à l'utilisation du phageXrh434 cts comme dans l'exemple 5, ces plasmides ont été retransférs dans différentes souches de K. pneumoniae mutées ou délétées dans les gènes nif et dans la souche
DB 6656 (pyrF Mu LacZam, trPam, hsdR) d'E. coli.
Out of 10 clones examined, all were found to be nitrogen-fixing. The structure of the plasmids carried by these 10 clones is identical to that of the starting plasmid pGPC 875. Thanks to the use of phageXrh434 cts as in Example 5, these plasmids were transferred back to different strains of K. pneumoniae mutated or deleted in the nif genes and in the strain
DB 6656 (pyrF Mu LacZam, trPam, hsdR) from E. coli.

On a pu ainsi vérifier que les phénotypes du cosmide pGPC 875 Ura+ et nif avaient été conservés.It was thus possible to verify that the phenotypes of the cosmid pGPC 875 Ura + and nif had been preserved.

Fixation de l'azote
L'activité fixatrice d'azote d'E. coli ou
K. pneumoniae (d nif) portant le plasmide pGPC 875 est équivalente celle de la souche sauvage M5al de
K. pneumoniae.
Nitrogen fixation
The nitrogen-fixing activity of E. coli or
K. pneumoniae (d nif) carrying the plasmid pGPC 875 is equivalent to that of the wild strain M5al of
K. pneumoniae.

Le plasmide pGPC 875 selon la présente invention peut donc être utilisé pour transformer un microorganisme,- bactérie ou levure, ne comportant pas les gènes responsables de la fixation de l'azote. The plasmid pGPC 875 according to the present invention can therefore be used to transform a microorganism, - bacteria or yeast, not containing the genes responsible for nitrogen fixation.

Le plasmide pG 63 a été déposé sous le nO I-130 dans la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) le 25 août 1980. The plasmid pG 63 was deposited under the nO I-130 in the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM) on August 25, 1980.

Le cosmide pPC 857 a été déposé sous le nO I-131 dans la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes le 25 août 1980.  The cosmid pPC 857 was deposited under No. I-131 in the National Collection of Cultures of Microorganisms on August 25, 1980.

Claims (11)

REVENDICATIONS 1) Plasmide hybride caractérisé en ce qu'il comporte au moins - un fragment d'ADN d'un plasmide 2 pm de levure, - un segment d'ADN renfermant un gène de levure, - un fragment d'ADN d'un plasmide bactérien, et - un fragment d'ADN renfermant les gènes responsables 1) Hybrid plasmid characterized in that it comprises at least - a DNA fragment of a 2 μm yeast plasmid, - a DNA segment containing a yeast gene, - a DNA fragment of a plasmid bacterial, and - a DNA fragment containing the genes responsible de la fixation de l'azote. of nitrogen fixation. 2) Plasmide hybride selon la revendication 1, caractérisé en ce que le fragment d'ADN du plasmide bactérien porte un ou plusieurs sites cos du phage A. 2) Hybrid plasmid according to claim 1, characterized in that the DNA fragment of the bacterial plasmid carries one or more cos sites of phage A. 3) Plasmide hybride selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le fragment d'ADN renfermant la totalité des genes responsables de la fixation de l'azote est constitué de deux fragments de restriction Hind III. 3) Hybrid plasmid according to one of claims 1 and 2, characterized in that the DNA fragment containing all of the genes responsible for nitrogen fixation consists of two Hind III restriction fragments. 4) Plasmide hybride selon la revendication 3, caractérisé en ce que le fragment d'ADN renfermant la totalité des gènes responsables de la fixation de l'azote provient de K. pneumoniae. 4) Hybrid plasmid according to claim 3, characterized in that the DNA fragment containing all of the genes responsible for nitrogen fixation comes from K. pneumoniae. 5) Plasmide hybride selon l'une des revendications 1 I 4, caractérisé en ce que le fragment d'ADN de plasmide 2 pm est le fragment de restriction R1 H3 de 2,12 Kb de la forme B du plasmide 2 pm. 5) Hybrid plasmid according to one of claims 1 I 4, characterized in that the DNA fragment of plasmid 2 pm is the restriction fragment R1 H3 of 2.12 Kb of form B of the plasmid 2 pm. 6) Plasmide hybride selon l'une des revendications 2 I 5, caractérisé en ce que le fragment d'ADN d'un plasmide bactérien est le fragment de restriction 6) Hybrid plasmid according to one of claims 2 I 5, characterized in that the DNA fragment of a bacterial plasmid is the restriction fragment Eco R1 Hind III du cosmide pHC 79 comportant le site cos.Eco R1 Hind III of cosmid pHC 79 comprising the cos site. 7) Plasmide hybride selon la revendication 1, caractérisé en ce que le gène de levure du segment d'ADN est le gène URA3+.  7) Hybrid plasmid according to claim 1, characterized in that the yeast gene of the DNA segment is the URA3 + gene. 8) Plasmide hybride selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que les fragments d'ADN de levure sont contigus. 8) Hybrid plasmid according to one of claims 1 to 7, characterized in that the yeast DNA fragments are contiguous. 9) Cellules et microorganismes comportant un plasmide hybride selon l'une des revendications 1 8. 9) Cells and microorganisms comprising a hybrid plasmid according to one of claims 1 8. 10) Procédé de construction du plasmide hybride selon la revendication l, caractérisé en ce qu'il consiste 9 utiliser le plasmide pHCG 3, I ajouter de 1'ADN nif purifié I partir de pPC 857, I ligaturer, encapsider in vitro dans un phage X, et I infecter partir du plasmide hybride ainsi obtenu. 10) A method of constructing the hybrid plasmid according to claim l, characterized in that it consists of using the plasmid pHCG 3, I adding purified nif DNA from pPC 857, I ligating, packaging in vitro in a phage X, and I infect from the hybrid plasmid thus obtained. 11) Procedé de préparation de souches de levures initialement A nif transformées en nif + , caractérisé en ce que l'on utilise de 1'ADN extrait de clones bactériens (E. coli) ayant été infectés par le plasmide hybride préparé par le procédé selon la revendication 10.  11) Process for preparing strains of yeast initially A nif transformed into nif +, characterized in that DNA extracted from bacterial clones (E. coli) having been infected with the hybrid plasmid prepared by the method according to claim 10.
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Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2556008A1 (en) * 1983-12-06 1985-06-07 Centre Nat Rech Scient PLASMIDIC CLONING AND PROTEIN EXPRESSION VECTORS IN MICROORGANISM COMPRISING AT LEAST THE PROMOTER OF B-GLUCOSIDASE EXPRESSION IN YEASTS; MICRO-ORGANISMS CONTAINING THEM; FERMENTATION PROCESS AND ENZYMES OBTAINED
WO2002020431A1 (en) * 2000-09-05 2002-03-14 Ultra Biotech Limited A biological fertilizer based on yeasts
US6416982B1 (en) 2000-09-05 2002-07-09 Ultra Biotech Ltd. Biological fertilizer based on yeasts
WO2002070436A2 (en) * 2001-03-01 2002-09-12 Ultra Biotech Limited Biological fertilizer compositions comprising manure, sludge or garbage
US6596273B2 (en) 2001-03-01 2003-07-22 Ultra Biotech Limited Biological fertilizer compositions comprising swine manure
US6596272B2 (en) 2001-03-01 2003-07-22 Ultra Biotech Limited Biological fertilizer compositions comprising poultry manure
US6761886B2 (en) 2001-03-01 2004-07-13 Ultra Biotech Limited Biological fertilizer compositions comprising cattle manure
US6828132B2 (en) 2001-03-01 2004-12-07 Ultra Biotech Limited Biological fertilizer compositions comprising garbage

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2441659A1 (en) * 1978-11-14 1980-06-13 Anvar NOVEL HYBRID PLASMIDS AND MICROORGANISMS CONTAINING THEM

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2441659A1 (en) * 1978-11-14 1980-06-13 Anvar NOVEL HYBRID PLASMIDS AND MICROORGANISMS CONTAINING THEM

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EXBK/79 *

Cited By (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2556008A1 (en) * 1983-12-06 1985-06-07 Centre Nat Rech Scient PLASMIDIC CLONING AND PROTEIN EXPRESSION VECTORS IN MICROORGANISM COMPRISING AT LEAST THE PROMOTER OF B-GLUCOSIDASE EXPRESSION IN YEASTS; MICRO-ORGANISMS CONTAINING THEM; FERMENTATION PROCESS AND ENZYMES OBTAINED
EP0148668A2 (en) * 1983-12-06 1985-07-17 Etablissement Public dit: CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS) Plasmid cloning and expression vectors for a protein in a microorganism, comprising at least the expression promotor of beta-glucosidase in the yeasts; these vectors containing microorganisms; fermentation process and enzymes so obtained
EP0148668A3 (en) * 1983-12-06 1985-08-28 Etablissement Public Dit: Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Plasmid cloning and expression vectors for a protein in a microorganism, comprising at least the expression promotor of beta-glucosidase in the yeasts; these vectors containing microorganisms; fermentation process and enzymes so obtained
US4745062A (en) * 1983-12-06 1988-05-17 Centre National De La Recherche Scientifique Plasmid vectors for cloning and expression of a protein in a microorganism, comprising at least one promoter for expression of β-glucosidase in yeasts; microorganisms containing these plasmids; a fermentation process and the enzymes obtained
WO2002020431A1 (en) * 2000-09-05 2002-03-14 Ultra Biotech Limited A biological fertilizer based on yeasts
US6416982B1 (en) 2000-09-05 2002-07-09 Ultra Biotech Ltd. Biological fertilizer based on yeasts
US6416983B1 (en) 2000-09-05 2002-07-09 Ultra Biotech Limited Biological fertilizer compositions comprising garbage
US6828131B2 (en) 2000-09-05 2004-12-07 Ultra Biotech Limited Biological fertilizer based on yeasts
WO2002070436A3 (en) * 2001-03-01 2003-07-17 Ultra Biotech Ltd Biological fertilizer compositions comprising manure, sludge or garbage
US6596273B2 (en) 2001-03-01 2003-07-22 Ultra Biotech Limited Biological fertilizer compositions comprising swine manure
US6596272B2 (en) 2001-03-01 2003-07-22 Ultra Biotech Limited Biological fertilizer compositions comprising poultry manure
US6761886B2 (en) 2001-03-01 2004-07-13 Ultra Biotech Limited Biological fertilizer compositions comprising cattle manure
US6828132B2 (en) 2001-03-01 2004-12-07 Ultra Biotech Limited Biological fertilizer compositions comprising garbage
WO2002070436A2 (en) * 2001-03-01 2002-09-12 Ultra Biotech Limited Biological fertilizer compositions comprising manure, sludge or garbage
US6979444B2 (en) 2001-03-01 2005-12-27 Ultra Biotech Limited Method for preparing a biological fertilizer composition comprising poultry manure
US6994850B2 (en) 2001-03-01 2006-02-07 Ultra Biotech Limited Method for preparing a biological fertilizer composition comprising swine manure

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