FR2485739A1 - Detection and determn. of cytostatic activity - based on inhibition of cell growth under impregnated disc - Google Patents
Detection and determn. of cytostatic activity - based on inhibition of cell growth under impregnated disc Download PDFInfo
- Publication number
- FR2485739A1 FR2485739A1 FR8014598A FR8014598A FR2485739A1 FR 2485739 A1 FR2485739 A1 FR 2485739A1 FR 8014598 A FR8014598 A FR 8014598A FR 8014598 A FR8014598 A FR 8014598A FR 2485739 A1 FR2485739 A1 FR 2485739A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- disc
- interferon
- cytostatic
- cells
- agarose
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
Abstract
Description
L'invention concerne un procédé pour détecter et évaluer l'activité de substances à action cytostatique,telles que l'interféron. L'invention concerne aussi les applications d'un tel procédé, notamment à la mesure de l'activité cytostatique de substances à activité antitumorale,ainsi que pour mesurer d'une manière précise l'activité cytostatique de l'interféron humain, ou d'un interféron bactérien produit par manipulation génétique. The invention relates to a method for detecting and evaluating the activity of substances having a cytostatic action, such as interferon. The invention also relates to the applications of such a method, in particular to the measurement of the cytostatic activity of substances with antitumor activity, as well as to measure in a precise manner the cytostatic activity of human interferon, or of a bacterial interferon produced by genetic manipulation.
On sait que dans certaines conditions,des lignées établies à partir de cancers humains,tels que des lymphomes,peuvent former des colonies dans un milieu gélifié par de l'agarose. Il faut alors que la concentration cellulaire dans ce milieu gélifié soit égale ou supérieure à une concentration critique caractéristique de chaque lignée. A titre de documents illustrant la technique antérieure dans ce domaine, on peut citer les articles suivants:
L. MONTAGNIER & I. Mac PHERSON
Croissance sélective en gélose de cellules de hamster
transformées par le virus polyome C.R. Acad. Sci. 258,
4171-4173 (1964)
L. MONTAGNIER
La croissance en gélose de cellules transformées par un
virus sarcomatogène
Path. Biol. 14 , 244-251 (1966)
L. MONTAGNIER, P. VIGIER, J. BOUE et A.BOUE
Transformation en milieu gélifié d'une souche diplolde
de cellules embryonnaires humaines par le virus de Rous
(souche de Schmidt-Ruppin).C.R. Acad. Sci. 265 D
2161-2164 (1967).It is known that under certain conditions, lines established from human cancers, such as lymphomas, can form colonies in an agarose-agarose medium. It is then necessary that the cell concentration in this gelled medium is equal to or greater than a critical concentration characteristic of each line. As documents illustrating the prior art in this field, mention may be made of the following articles:
L. MONTAGNIER & I. Mac PHERSON
Selective growth in hamster cell agar
transformed by the CR Acad polyoma virus. Sci. 258
4171-4173 (1964)
L. MONTAGNIER
The agar growth of cells transformed by a
sarcomatogenic virus
Path. Biol. 14, 244-251 (1966)
L. MONTAGNIER, P. VIGIER, J. BOUE and A.BOUE
Transformation in a gelled medium of a diploid strain
of human embryonic cells by Rous virus
(Schmidt-Ruppin strain) .CR Acad. Sci. 265 D
2161-2164 (1967).
MONTAGNIER, L. & GRUEST, J. Cell Density dependence for growth in
agarose of two human lymphoma lines and its decrease after
Epstein-Barr virus conversion. Int. J. Cancer,1979, 23,
71-75. MONTAGNIER, L. & GRUEST, J. Cell Density dependence for growth
agarose of two human lymphoma lines
Epstein-Barr virus conversion. Int. J. Cancer, 1979, 23,
71-75.
L'invention tire profit de la propriété mentionnée précédemment,en vue de permettre la détection et l'évaluation de l'activité de substances de toutes origines exerçant des effets cellulai- res. The invention takes advantage of the property mentioned above, in order to allow the detection and evaluation of the activity of substances of all origins exerting cellular effects.
Le procédé de l'invention trouve une application particulièrement intéressante pour la mesure de l'activité de l'interféron,protéine à action antivirale,dont l'effet cytostatique parait actuellement prometteur pour le traitement de certains cancers. The method of the invention finds a particularly interesting application for the measurement of the activity of interferon, an antiviral protein whose cytostatic effect currently appears promising for the treatment of certain cancers.
Dans l'art antérieur1 on a déjà proposé de doser l'interféron humain. Ainsi,l'article de GRESSER et al "Interferon and Cell
Division V. Titration of the Anticellular Action of Interferon
Preparations "Proc. Soc. Exp. Biol. and Med. Vol. 137 n"4,p.1258-1261 (1971)*a proposé de doser l'action anticellulaire de l'interféron par des cultures en agarose,l'interféron étant directement incorporé dans le milieu agarose. Un tel procédé, bien que basé sur l'inhibition de la formation des colonies de cellules L 1210 ,n'est cependant pas facile à mettre en oeuvre car il est nécessaire de compter les colonies macroscopiques après un certain nombre de jours d'incubation.In the prior art, it has already been proposed to assay human interferon. Thus, the article by GRESSER et al "Interferon and Cell
Division V. Titration of the Anticellular Action of Interferon
Preparations "Proc., Soc., Exp., Biol., And Vol., 137, No. 4, p.1258-1261 (1971) *, proposed to assay the anti-cellular action of interferon by agarose cultures, interferon. being directly incorporated into the agarose medium. Such a method, although based on the inhibition of L 1210 cell colony formation, is however not easy to implement because it is necessary to count the macroscopic colonies after a certain number of days of incubation.
Le comptage des colonies est un travail fastidieux qui peut en outre donner lieu à des inexactitudes de lecture.Colony counting is a tedious job that can also lead to inaccurate reading.
L'invention a pour objet un procédé qui est aisé à mettre en oeuvre, et qui permet de détecter et d'évaluer avec précision l'activité de substances exerçant une action cellulaire. The subject of the invention is a method which is easy to implement and which makes it possible to accurately detect and evaluate the activity of substances exerting a cellular action.
Sous sa forme la plus générale,l'invention a pour objet un procédé pour la détection et l'évaluation de l'activité de substances à action cytostatique,en particulier d'interféron,caractérisé en ce qu'il consiste à introduire en milieu agarose des cellules indicatrices, à disposer au moins un disque de papier filtre à la partie supérieure de la couche d'agarose,à imbiber le disque avec une solution de la substance dont on désire tester l'effet cytostatique et à observer la diffusion de ladite substance dans le disque au cours de la croissance cellulaire dans l'agarose,en déterminant la zone annulaire du disque exempte de colonies, ladite zone correspondant à la concentration de la substance qui est suffisante pour inhiber la multiplication cellulaire. In its most general form, the subject of the invention is a method for the detection and evaluation of the activity of substances with cytostatic action, in particular of interferon, characterized in that it consists in introducing into an agarose medium indicator cells, disposing at least one filter paper disc at the top of the agarose layer, imbibing the disc with a solution of the substance whose cytostatic effect is desired to be tested and observing the diffusion of said substance in the disc during cell growth in agarose, by determining the annular zone of the colony-free disc, said area corresponding to the concentration of the substance that is sufficient to inhibit cell multiplication.
Le procédé de l'invention permet d'évaluer rapidement l'action cytostatique de nouveaux composés anticancéreux. On peut alors utiliser pour la culture cellulaire des cellules humaines de même type histologique que les cancers à traiter. Ainsi on peut utiliser des lignées de cellules leucémiques myéloides et lymphodes, de lymphomes de Burkitt, d'ostéosarcomes,de carcinomes mammaires,de carcinomes du col de l'utérus et autres. Lorsque la culture in vitro est possible,on peut même utiliser les cellules I tumorales du malade à traiter. The method of the invention makes it possible to rapidly evaluate the cytostatic action of new anticancer compounds. It is then possible to use human cells of the same histological type for cell culture as the cancers to be treated. Thus, myeloid and lymphoid leukemic cell lines, Burkitt's lymphoma, osteosarcomas, mammary carcinomas, cervical carcinomas and the like can be used. When the in vitro culture is possible, it is even possible to use the tumor cells of the patient to be treated.
Des cellules résistantes peuvent également être aisément détectées par leur capacité à former des colonies dans la zone du halo. Resistant cells can also be easily detected by their ability to form colonies in the halo zone.
En outre,en plaçant sur deux disques dans une même boîte des inhibiteurs différents,on peut détecter l'effet synergique de ces derniers (augmentation du halo dans la zone de diffusion commune) ou leur effet antagoniste. In addition, by placing on two disks in the same box of different inhibitors, one can detect the synergistic effect of the latter (increase of the halo in the common diffusion zone) or their antagonistic effect.
Ainsi,le procédé de l'invention peut être aisément appliqué à la mesure de l'activité cytostatique de n'importe quelle-substance antitumorale ou de n'importe quel type de cellule capable de croître en milieu semi-solide. Thus, the method of the invention can be readily applied to the measurement of the cytostatic activity of any antitumor substance or any type of cell capable of growing in a semi-solid medium.
Dans une application particulièrement intéressante, le procédé de l'invention permet de détecter et de mesurer l'effet cytostatique de l'interféron. On préfère alors utiliser,selon l'invention,des cultures cellulaires particulièrement sensibles à l'action de l'interféron,notamment des lignées dérivées du lymphome de Burkitt. A cet égard,la lignée de lymphome de Burkitt
DAUDI s'est avérée très sensible à l'interféron,comme l'ont montré les travaux de:
STEWART II, .E. GRESSER, I., TOVEY, M.G. BANDU, M. T. & LEGOFF,S.,
Identification of the cell-multiplication-inhibitory factors
in interferon preparations as interferons. Nature,1976,262
300-303.In a particularly interesting application, the method of the invention makes it possible to detect and measure the cytostatic effect of interferon. It is therefore preferred to use, according to the invention, cell cultures that are particularly sensitive to the action of interferon, in particular lines derived from Burkitt's lymphoma. In this regard, the Burkitt lymphoma line
DAUDI has been shown to be very sensitive to interferon, as shown by the work of:
STEWART II, .E. GRESSER, I., TOVEY, MG BANDU, MT & LEGOFF, S.,
Identification of the cell-multiplication-inhibitory factors
in interferon preparations as interferons. Nature, 1976.262
300-303.
et J. HILFENHAUS, H. Dams & 8 R. JOHANNSEN
Sensitivity of Various Human Lymphoblastoid Cells to the
Antiviral and Anticellular Activityof Human Leukocyte
Interferon.and J. HILFENHAUS, H. Dams & 8 R. JOHANNSEN
Sensitivity of Various Human Lymphoblastoid Cells to the
Antiviral and Anticellular Activityof Human Leukocyte
Interferon.
Archives of Virology 54,271-277(1977). Archives of Virology 54, 271-277 (1977).
Le procédé de l'invention est alors très sensible:il permet de détecter des halos d'inhibition à partir de 1 à 2 unités internationales d'interféron leucocytaire humain. Mais on peut également appliquer le procédé à la détection de clones bactériens producteurs d'interféron au cours d'expériences de manipulation génétique. The method of the invention is then very sensitive: it makes it possible to detect inhibition halos from 1 to 2 international units of human leukocyte interferon. However, the method can also be applied to the detection of interferon-producing bacterial clones in genetic manipulation experiments.
On a constaté que le halo de l'inhibition de la colonie autour du disque était directement proportionnel au logarithme de la concentration d'interféron, ce qui permet une détermination précise de l'effet cytostatique de l'interféra n . Lorsqu'on a comparé l'effet cytostatique de l'interféron extrait de bactéries et purifié, et l'interféron leucocytaire humain authentique, on a trouvé que les courbes de réponse ne pouvaient pas être distinguées,ce qui permet de conclure que l'interféron fabriqué à partir de bactéries a la même aptitude à inhiber la croissance des cellules DAUDI que l'interféron authentique, pour un rapport unités antivirales /unités anticellulaires qui ne diffère pas de manière significative dans les deux cas.It was found that the halo of colony inhibition around the disc was directly proportional to the logarithm of the interferon concentration, allowing a precise determination of the cytostatic effect of the interferon. When comparing the cytostatic effect of bacteria-extracted interferon and purified, and authentic human leukocyte interferon, it was found that the response curves could not be distinguished, suggesting that interferon made from bacteria has the same ability to inhibit the growth of DAUDI cells as authentic interferon, for a ratio antiviral units / anti-cell units that does not differ significantly in both cases.
Selon une caractéristique du procédé de l'invention,on utilise des disques de papier filtre imbibés de solution de substances dont on veut tester l'effet cytostatique. Bien entendu,on utilise avec le plus d'avantages des solutions aqueuses. Cependant, le procédé est applicable également à des substances non hydrosolubles en utilisant des dilutions aqueuses de solutions-mères dans le diméthylsulfoxyde (DMSO)à condition que la concentration finale de DMSO sur les disques ne dépasse pas 1% en volume environ. According to one characteristic of the process of the invention, filter paper disks impregnated with a solution of substances whose cytostatic effect is to be tested are used. Of course, aqueous solutions are most advantageously used. However, the method is equally applicable to non-water soluble substances using aqueous dilutions of dimethylsulfoxide (DMSO) stock solutions provided that the final concentration of DMSO on the disks does not exceed about 1% by volume.
Pour la mise en oeuvre pratique de l'i*vention,on utilise la technique connue de coulage de l'agarose en couches contenant la suspension cellulaire appropriée On dispose ensuite sur la couche d'agarose le ou les papiers filtres. Ceux-ci ont un diamètre généralement compris entre 6 et 9 mm. Chaque papier filtre est imbibé d'une faible quantité (10 ou 20 microlitres) de la solution de l'inhibiteur cytostatique à tester. Il importe que le papier filtre présente des caractéristiques physiques telles qu'il soit exempt de cendres et de graisse. Avant utilisation, les disques sont autoclavés et séchés en étuve. Il faut que le papier filtre n'écrase pas le gel de culture, lequel a une consistance relativement molle.Il faut donc mettre en place délicatement les disques de papier après imbibition, sur la couche d'agarose solidifiée au préalable. For the practical application of the invention, the known technique for casting the layered agarose containing the appropriate cell suspension is used. The filter paper (s) is then placed on the agarose layer. These have a diameter generally between 6 and 9 mm. Each filter paper is impregnated with a small amount (10 or 20 microliters) of the solution of the cytostatic inhibitor to be tested. It is important that the filter paper has physical characteristics such that it is free of ash and grease. Before use, the discs are autoclaved and dried in an oven. It is necessary that the filter paper does not crush the culture gel, which has a relatively soft consistency. It is therefore necessary to gently position the paper disks after imbibition, on the previously solidified agarose layer.
Dans ces conditions, on atteint rapidement un gradient de concentration gracie à la diffusion de la substance à tester autour du disque. Lorsque la concentration en inhibiteur atteint une valeur suffisante pour inhiber la multiplication cellulaire,les cellules ne sont plus capables de former des colonies et demeurent isolées. Under these conditions, a concentration gradient is reached rapidly thanks to diffusion of the test substance around the disc. When the inhibitor concentration reaches a value sufficient to inhibit cell multiplication, the cells are no longer able to form colonies and remain isolated.
Après quelques jours d'incubation à 37"C en atmosphère contrôlée par exemple 10 jours, on peut observer un halo d'inhibition autour du disque, qui est exempt de colonies et qui est entouré de colonies ayant une taille normale. La frontière entre les deux zones est bien délimitée,ce qui indique que la diffusion de l'inhibiteur est rapide et atteint les cellules avant qu'elles réalisent leur première division.After a few days of incubation at 37 ° C. in a controlled atmosphere, for example 10 days, a halo of inhibition around the disc, which is free of colonies and surrounded by colonies having a normal size, can be observed. two zones are well defined, which indicates that the diffusion of the inhibitor is fast and reaches the cells before they realize their first division.
Il va sans dire que la coloration des colonies à l'aide d'un colorant vital,tel que le chlorure de 2(p-iodophényl-3-(p-nitrophényl) -5-phényQ 2H-tétrazoliumBpermet d'augmenter le contraste entre les deux zones et facilite la lecture. It goes without saying that colony staining with a vital stain, such as 2-p-iodophenyl-3- (p-nitrophenyl) -5-phenyl-2H-tetrazolium chloride, can increase the contrast between both areas and makes reading easier.
En étudiant les courbes de réponse en fonction de la concentration,on a constaté que le diamètre du halo était directement proportionnel au logarithme de la concentration initiale de substance dans le disque. Il est alors possible de choisir une unité arbitraire,par exemple telle que la concentration fournissant un halo de 10 mm de diamètre,compte non tenu du diamètre du disque en papier. By studying the response curves as a function of concentration, it was found that the diameter of the halo was directly proportional to the logarithm of the initial substance concentration in the disc. It is then possible to choose an arbitrary unit, for example such that the concentration providing a halo of 10 mm in diameter, regardless of the diameter of the paper disc.
Selon une application intéressante de l'invention, on évalue l'activité de substances neutralisant l'action anticellulaire d'inhibiteurs cytostatiques,tels que l'interféron et on met en évidence les clones cellulaires producteurs de ces substances (en particulier hybridomes producteurs d'anticorps monoclonaux), en incubant préalablement l'inhibiteur cytostatique avec le surnageant de culture des cellules productrices de la substance neutralisante, en inhibant le disque du mélange ainsi obtenu et en déterminant la dilution maximale supprimant le halo d'inhibition dû à l'inhibiteur cytostatique. According to an advantageous application of the invention, the activity of substances that neutralize the anticellular action of cytostatic inhibitors, such as interferon, is evaluated and the cellular clones producing these substances (in particular hybridomas producing monoclonal antibodies), by previously incubating the cytostatic inhibitor with the culture supernatant of the neutralizing substance producing cells, by inhibiting the disc of the mixture thus obtained and determining the maximum dilution suppressing the inhibition halo due to the cytostatic inhibitor .
L'invention sera maintenant davantage illustrée sans être aucunement limitée par les exemples ci-après. The invention will now be further illustrated without being limited by the following examples.
EXEMPLE 1
Cet exemple illustre la technique générale d'utilisation du procédé de l'invention pour la détermination de l'activité cytostatique de composés anti-cancéreux
Cellules: on utilise des lignées provenant de lymphomes humains de Burkitt contenant ou non le virus d'Epstein-Barr.EXAMPLE 1
This example illustrates the general technique for using the method of the invention for determining the cytostatic activity of anti-cancer compounds.
Cells: Lines from human Burkitt lymphoma with or without Epstein-Barr virus are used.
On met avantageusement en oeuvre la lignée provenant d'un lymphome de Burkitt BJAB. MENEZES, J. LEIBOLD, W. KLEIN, G., and
CLEMENTS, G.B., Establishment and characterization of an Epstein
Barr virus (EBV)-negative lymphoblastoid B cell line (BJAB) from an exceptional EBV-genome-negative African Burkitt's lymphoma,
Biomedicine,22,276-284(l975b).The line originating from Burkitt BJAB lymphoma is advantageously used. MENEZES, J. LEIBOLD, W. KLEIN, G., and
CLEMENTS, GB, Establishment and characterization of an Epstein
Barr virus (EBV) -negative lymphoblastoid B cell line (BJAB) from an exceptional EBV-genome-negative African Burkitt's lymphoma,
Biomedicine, 22.276 to 284 (l975b).
Les cellules sont multipliées en suspension non agitée dans des flacons plastiques de 75 cm3 dans du milieu RPMI 16-40. The cells are multiplied in a non-stirred suspension in 75 cm3 plastic bottles in RPMI 16-40 medium.
Ce milieu est obtenu commercialement à l'état de poudre et est dilué dans de l'eau distillée de haute qualité, dépourvue de matière organique. On utilise de préférence de liteau obtenue par le procédé objet du brevet FR 76 18 150 déposé le 15 Juin 1976. Cette eau est commercialement disponible sous la dénomination "eau hyperhydor Pasteur". This medium is commercially obtained in the form of powder and is diluted in high quality distilled water, free of organic matter. It is preferably used liteau obtained by the method of the patent FR 76 18 150 filed June 15, 1976. This water is commercially available under the name "water hyperhydor Pasteur".
Le milieu des cultures est renouvelé aux 2/3 trois fois par semaine. The crop environment is renewed 2/3 three times a week.
Mise en agarose: on utilise de l'agarose "Indubiose 37" (Industrie Biologique Française-Gennevilliers). Pour 100 ml de milieu final,on pèse dans un bécher Pyrex 0,40 g d"'Indubiose".Agarose: Agarose "Indubiose 37" (French Biological Industry-Gennevilliers) is used. Per 100 ml of final medium, 0.44 g of "Indubiose" is weighed into a Pyrex beaker.
On ajoute 76,5 ml d'eau "hyperhydor et on laisse dans un bain -marie à l'ébullition jusqu'à complète dissolution de l'agarose (enviren 10 minutes). 76.5 ml of "hyperhydor" water are added and the mixture is left to boil until the agarose is completely dissolved (about 10 minutes).
La solution est ensuite placée dans un bain-marie à 44 C. The solution is then placed in a 44 C waterbath.
Après équilibrage de la température ,on ajoute à la solution d'agarose les constituants du milieu nutritif,à savoir dans l'ordre: -9 ml RPMI 10 fois concentré (Gibco) en milieu acide, -3,5 ml bicarbonate de sodium à 35go (autoclavé). After equilibration with the temperature, the constituents of the nutrient medium are added to the agarose solution, namely in the order: -9 ml RPMI 10 times concentrated (Gibco) in an acidic medium, -3.5 ml sodium bicarbonate 35g (autoclaved).
On ajuste le pH à 7,0 en ajoutant de l'hydroxyde de sodium 5N (soit environ 0,2 ml pour 100 ml de milieu ); -10 ml de sérum de veau foetal "Rehatuin" (Reheis, Armour
Chemical Co) - 1 ml de glutamine à 29,2 mg/ml -0,05 ml d'Auréomycine "Specia "à 10 mg;/ml -0,05 ml de Fungizone "Squibb" à 2,5 mg/ml.The pH is adjusted to 7.0 by adding 5N sodium hydroxide (ie, about 0.2 ml per 100 ml of medium); -10 ml fetal calf serum "Rehatuin" (Reheis, Armor
Chemical Co) - 1 ml of glutamine at 29.2 mg / ml -0.05 ml of Aureomycin "Specia" at 10 mg / ml -0.05 ml of Fungizone "Squibb" at 2.5 mg / ml.
Coulage de l'agarose: on coule 6 ml avec une pipette graduée à large col dans chaque bote de Petri plastique "Falcon" ou similaire de 60 mm de diamètre.Pouring the agarose: pour 6 ml with a graduated pipette wide neck in each plastic Petri dish "Falcon" or similar 60 mm in diameter.
Après prise du gel,on ajoute à 0,4 ml de la suspension cellulaire contenant le nombre de cellules désiré, soit 4.lot dans le cas des cellules BJAB,l ml du milieu à l'agarose maintenu à 450C ,et on coule le mélange immédiatement sur la sous-couche d ' agarose. After taking the gel, 0.4 ml of the cell suspension containing the desired number of cells is added, ie 4.lot in the case of BJAB cells, 1 ml of the agarose medium maintained at 450 ° C., and the mix immediately on the agarose undercoat.
Après solidification de la surcouche à la température ambiante, on ajoute délicatement les disques de papier.Immédiatement auparavant, chaque disque tenu par une pince stérile reçoit 10 à 20P1 du produit à tester,ce qui imbibe tout le disque. After solidification of the overlay at room temperature, the paper disks are gently added. Immediately beforehand, each disk held by a sterile forceps receives 10 to 20 μl of the product to be tested, which soaks the entire disk.
Préparation des disques: les disques sont en papier-filtre sans cendres et sans graisse ( commercialisés par la Société
Durieux ,Paris,n"lll) de 6 ou 9 mm de diamètre Ils sont autoclavés dans des bottes de Petri en verre préalablement rincées avec de l'eau "hyperhydor. Après autoclavege ils sont séchés dans une étuve à 550Co
Incubation: Les botes d'agarose sont incubées à 37"C dans un caisson étanche contenant 2 boîtes de Petri de 100 mm remplies d'eau additionnée de bleu de méthylène ,de façon à maintenir un haut degré d'hygrométrie ,et gazé pendant 5 minutes avec un mélange d'air 90 et C02 10%, passant dans un flacon laveur rempli d'eau additionnée de bleu de méthylène et à travers un filtre Millipore de 0,45 p. Preparation of discs: the discs are made of ash-free and grease-free filter paper (marketed by the Company
Durieux, Paris, No. Ill) 6 or 9 mm in diameter They are autoclaved in glass Petri bunches previously rinsed with "hyperhydor" water. After autoclaving they are dried in an oven at 550Co
Incubation: The agarose dishes are incubated at 37 ° C. in a watertight container containing 2 100 mm Petri dishes filled with methylene blue water, so as to maintain a high degree of hygrometry, and gassed for 5 minutes. minutes with a mixture of 90% air and 10% CO 2, passing through a wash bottle filled with methylene blue water and through a 0.45 μ Millipore filter.
Les colonies sont comptées après 10 ou 12 jours dans le cas de cellules humaines à multiplication relativement lente. Ce temps peut être réduit à 5 jours pour des cellules tumorales à multiplication plus rapide. Colonies are counted after 10 or 12 days in the case of relatively slow-multiplying human cells. This time can be reduced to 5 days for faster multiplying tumor cells.
Le diamètre du halo est linéairement proportionnel à la concentration du produit essayé. The diameter of the halo is linearly proportional to the concentration of the product tested.
EXEMPLE 2
La technique générale décrite à l'exemple 1 a été utilisée pour évaluer l'effet d'une substance connue à activité antitumorale dénommée BD40 sur des cellules leucémiques L 1210 de souris La substance BD40 est décrite dans LIDEREAU, R., CHERMANN, J C. GRUEST,J.EXAMPLE 2
The general technique described in Example 1 was used to evaluate the effect of a known antitumor activity substance called BD40 on mouse L1210 leukemia cells. The substance BD40 is described in LIDEREAU, R., CHERMANN, J. GRUEST, J.
MONTAGNIER, L. DUCROCQ, L., RIVALE C & BISAGNI, E., Antitumoral activity of dipyrido/4y3~b7/x\4-fhndoles on L 1210 leukemia. Bull. MONTAGNIER, L. DUCROCQ, L., RIVALE C & BISAGNI, E., Antitumoral activity of dipyrido / 4y3 ~ b7 / x \ 4-fhndoles on L 1210 leukemia. Bull.
Cancer (Paris), 1980, 67, 1-8. Cancer (Paris), 1980, 67, 1-8.
On a utilisé une quantité de 3.104 cellules par boîte de 60 mm. Les résultats sont reportés à la figure 1 des dessins annexés, qui montre les halos obtenus pour des concentrations de
BD40 ,respectivement de 0,1, 2, 3, 4 et 10 micromoles sur le disque On On constate que le diamètre du halo est proportionnel au logarithme de la concentration du produit.An amount of 3.104 cells per 60 mm dish was used. The results are shown in FIG. 1 of the attached drawings, which shows the halos obtained for concentrations of
BD40, 0.1, 2, 3, 4 and 10 micromoles respectively on the disk. It is found that the diameter of the halo is proportional to the logarithm of the concentration of the product.
EXEMPLE 3
Cet exemple concerne la détermination de l'action cytostatique de l'interféron leucocytaire humain.EXAMPLE 3
This example concerns the determination of the cytostatic action of human leukocyte interferon.
On utilise une lignée de lymphome de Burkitt DAUDI. A Burkitt lymphoma line DAUDI is used.
/ plein et col: Cancer Res.28, 1300(1310 (1068) 7
On coule, selon les conditions précédemment décrites à l'exemple l, 30105 cellules/boîte de Petri de 60 mm ou 1.106 cellules/boite de Petri de 100 mm. On place sur les disques 10 à 20 rl de solution d'interféron leucocytaire humain à des concentrations variables. Les cellules sont incubées 12 jours à 370C. Le diamètre du halo d'inhibition est proportionnel à la dose d'interféron.On peut détecter des halos d'inhibition à partir de 1 à 2 unités internationales d'interféron leucocytaire humain
Les résultats d'un-essai typique sont reportes à la figure 2 qui est un graphique sur lequel on a porté en ordonnée le diamètre du halo d'inhibition et en abcisse la concentration en interféron exprimée en unités internationales. La courbe obtenue est une droite parfaite, ce qui permet de déterminer avec précision une valeur de concentration correspondant à une unité de halo donnée./ full and cervix: Cancer Res.28, 1300 (1310 (1068) 7
Under the conditions previously described in Example 1, 30105 cells / 60 mm Petri dish or 1.106 cells / Petri dish of 100 mm are poured. 10 to 20 μl disks of human leukocyte interferon solution were placed at varying concentrations. The cells are incubated for 12 days at 370C. The diameter of the inhibition halo is proportional to the dose of interferon. Inhibition halos can be detected from 1 to 2 international units of human leukocyte interferon.
The results of a typical test are shown in FIG. 2, which is a graph on which the diameter of the inhibition halo is plotted on the ordinate and the concentration of interferon expressed in international units is shown in abscissa. The curve obtained is a perfect line, which makes it possible to determine precisely a concentration value corresponding to a given unit of halo.
Des expériences préliminaires ont indiqué également que la sensibilité de l'effet pouvait être augmentée en traitant au préalable les cellules indicatrices avec du n-butyrate de sodium (lO 3 Mdans le milieu de culture 48 h avant la mise des cellules en agarose).Preliminary experiments also indicated that the sensitivity of the effect could be increased by previously treating the indicator cells with sodium n-butyrate (10 3 M in the culture medium 48 h before placing the cells in agarose).
EXEMPLE 4
Dâns cet exemple on a utilisé la technique de l'exemple 3 pour comparer l'effet cytostatique d'un interféron extrait de bactéries et purifié, et d'un interféron leucocytaire authentique, les deux produits présentant des titres antiviraux identiques.EXAMPLE 4
In this example, the technique of Example 3 was used to compare the cytostatic effect of an interferon extracted from bacteria and purified, and an authentic leukocyte interferon, both products having identical antiviral titles.
On a utilisé les cellules DAUDI qui ont été coulées en milieu agarose comme décrit à l'exemple 3. On a imbibé des disques en papier avec 20 ul de l'échantillon d'interféron à essayer,et on a placé les disques sur le milieu agarose après solidification de la surcouche. Les boîtes d'agarose sont incubées pendant 10 - 12 jours en atmosphère contrôlée (mélange d'air 90% et C02 10%) après quoi on mesure sur des photcgraphies les diamètres des halos d'inhibition. DAUDI cells which were cast in agarose medium were used as described in Example 3. Paper disks were impregnated with 20 μl of the interferon sample to be tested, and the disks were placed on the medium. agarose after solidification of the overcoat. The agarose plates are incubated for 10-12 days in a controlled atmosphere (90% air mixture and 10% CO 2), after which the diameters of the inhibition halos are measured on photograms.
Dans l'essai considéré,les rapports unité antivirale/ unité anticellulaire étaient respectivement de 3,3 pour l'interféron bactérien et de 3,9 pour l'interféron leucocytaire authentique. On rappellera qu'une unité anticellulaire correspond à la concentration fournissant un halo d'inhibition de 10 mm. In the study considered, the antiviral unit / anti-cell unit ratios were respectively 3.3 for bacterial interferon and 3.9 for authentic leukocyte interferon. It will be recalled that an anti-cell unit corresponds to the concentration providing a 10 mm inhibition halo.
On a porté les résultats sur un graphique avec,en or donnéetle diamètre du halo, le diamètre du disque (6 mm) étant soustrait,et en abscisse la concentration de l'interféron dans le disque, exprimée en unités internationales antivirales. The results were plotted on a graph with gold and the diameter of the halo, the diameter of the disc (6 mm) being subtracted, and on the abscissa the concentration of interferon in the disc, expressed in international anti-viral units.
Au dessin de la figure 3,la courbe A correspond au résultat obtenu avec l'interféron bactérien produit au cours de manipulations génétiques, et la courbe B est un témoin comprenant un interféron leucocytaire authentique mélangé avec des extraits bactériens et traité comme l'interféron bactérien précité. In the drawing of FIG. 3, the curve A corresponds to the result obtained with the bacterial interferon produced during genetic manipulations, and the curve B is a control comprising an authentic leucocyte interferon mixed with bacterial extracts and treated as bacterial interferon. supra.
Les résultats illustrés par le graphique de la figure 3 montrent que les deux courbes de réponse ne peuvent pratiquement pas être distinguées,ce qui amène à conclure que l'interféron produit à partir de bactéries a la même capacité d'inhiber la croissance des cellules DAUDI qu'un interféron authentique, puisque les rapports unités antivirales/unités anticellulaires ne diffèrent pas d'une manière significative. The results illustrated by the graph of Figure 3 show that the two response curves can hardly be distinguished, leading to the conclusion that interferon produced from bacteria has the same ability to inhibit the growth of DAUDI cells. that authentic interferon, since the ratios antiviral units / anticellular units do not differ significantly.
Il va sans dire que le procédé de l'invention n'est pas limité aux applications qui ont été décrites dans les exemples ci-dessus,lesquels sont purement illustratifs . Le procédé de l'invention est en effet applicable d'une manière générale à la détection des effets cytostatiques et transformants d'agents biologiques et chimiques sur des cellules humaines et animales. It goes without saying that the method of the invention is not limited to the applications which have been described in the examples above, which are purely illustrative. The method of the invention is indeed applicable in general to the detection of cytostatic and transforming effects of biological and chemical agents on human and animal cells.
Il est applicable asec grand intérêt en cancérologie et à la chimiothérapie anticancéreuse. En particulier, il permet de mesurer avec précision,rapidité et facilité l'action cytostatique de l'interféron,qu'il s'agisse d'interféron leucocytaire humain authentique ou d'interféron bactérien produit par les souches soumises à manipulations génétiques.It is applicable with great interest in oncology and anticancer chemotherapy. In particular, it allows to measure with precision, speed and ease the cytostatic action of interferon, whether authentic human leukocyte interferon or bacterial interferon produced by strains subjected to genetic manipulation.
Dans cette dernière application,il permet de détecter rapidement les clones bactériens qui sont les meilleurs ; > roducteurs d'interféron. On peut également appliquer le procédé au titrage du pouvoir neutralisant d'un anticorps anti-interféron, en particulier d'un anticorps monoclonal. Dans ce cas, on préincube une concentration fixe d'interféron pendant 3 h à 370C,avec diverses dilutions d'un sérum antiinterféron ou d'un anticorps monoclonal, et les mélanges sont ensuite placés sur les disques. On détermine ainsi de manière précise la dilution maximale de l'anticorps supprimant le halo d'inhibition dû à l'interféron. In this latter application, it makes it possible to rapidly detect the bacterial clones that are the best; > interferon roducers. The method can also be applied to the assay of the neutralizing power of an anti-interferon antibody, in particular a monoclonal antibody. In this case, a fixed concentration of interferon is preincubated for 3 h at 370 ° C., with various dilutions of an anti-interferon serum or a monoclonal antibody, and the mixtures are then placed on the disks. The maximum dilution of the antibody suppressing the inhibition halo due to interferon is thus accurately determined.
Claims (11)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8014598A FR2485739A1 (en) | 1980-06-30 | 1980-06-30 | Detection and determn. of cytostatic activity - based on inhibition of cell growth under impregnated disc |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8014598A FR2485739A1 (en) | 1980-06-30 | 1980-06-30 | Detection and determn. of cytostatic activity - based on inhibition of cell growth under impregnated disc |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2485739A1 true FR2485739A1 (en) | 1981-12-31 |
| FR2485739B1 FR2485739B1 (en) | 1984-12-07 |
Family
ID=9243700
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR8014598A Granted FR2485739A1 (en) | 1980-06-30 | 1980-06-30 | Detection and determn. of cytostatic activity - based on inhibition of cell growth under impregnated disc |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2485739A1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992002551A1 (en) * | 1990-08-02 | 1992-02-20 | B.R. Centre Limited | Methods for the production of proteins with a desired function |
| US8030095B2 (en) | 2008-03-04 | 2011-10-04 | Crystal Bioscience Inc. | Gel microdrop composition and method of using the same |
-
1980
- 1980-06-30 FR FR8014598A patent/FR2485739A1/en active Granted
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992002551A1 (en) * | 1990-08-02 | 1992-02-20 | B.R. Centre Limited | Methods for the production of proteins with a desired function |
| US5627052A (en) * | 1990-08-02 | 1997-05-06 | B.R. Centre, Ltd. | Methods for the production of proteins with a desired function |
| US8030095B2 (en) | 2008-03-04 | 2011-10-04 | Crystal Bioscience Inc. | Gel microdrop composition and method of using the same |
| US8415173B2 (en) | 2008-03-04 | 2013-04-09 | Crystal Bioscience Inc. | Gel microdrop composition and method of using the same |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2485739B1 (en) | 1984-12-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Afonso et al. | LTB4 is a signal-relay molecule during neutrophil chemotaxis | |
| Wikstrand et al. | Demonstration of complex antigenic heterogeneity in a human glioma cell line and eight derived clones by specific monoclonal antibodies | |
| Soll et al. | High-frequency switching in Candida strains isolated from vaginitis patients | |
| Oh et al. | Intracellular fate of Mycobacterium avium: use of dual-label spectrofluorometry to investigate the influence of bacterial viability and opsonization on phagosomal pH and phagosome-lysosome interaction | |
| Mulugeta et al. | Long-term occurrence of Trypanosoma congolense resistant to diminazene, isometamidium and homidium in cattle at Ghibe, Ethiopia | |
| JP3725164B2 (en) | Bacteria detection method | |
| Deepa et al. | In vitro evaluation of virulence factors of Candida species isolated from oral cavity | |
| Zhang et al. | Quantitative RT-PCR assay for high-throughput screening (HTS) of drugs against the growth of Cryptosporidium parvum in vitro | |
| Vassen et al. | Localized incorporation of outer membrane components in the pathogen Brucella abortus | |
| Tully et al. | Characterization of some caprine mycoplasmas, with proposals for new species, Mycoplasma capricolum and Mycoplasma putrefaciens | |
| Lan et al. | Controversies and considerations in the diagnosis of primary cutaneous CD4+ small/medium T-cell lymphoma | |
| Camirand et al. | CD45 ligation expands Tregs by promoting interactions with DCs | |
| Honoré et al. | Influence of the host and parasite strain in a mouse model of visceral Leishmania infantum infection | |
| Santer et al. | The glycoprotein surface coat on different classes of murine lymphocytes | |
| FR2485739A1 (en) | Detection and determn. of cytostatic activity - based on inhibition of cell growth under impregnated disc | |
| Evans et al. | Fluorescence-activated cell sorter analysis of binding by lipopolysaccharide-specific monoclonal antibodies to gram-negative bacteria | |
| Mayfield | A fluorescence-staining method for microscopically counting viable microorganisms in soil | |
| FR2519650A1 (en) | MURINE ANTI-HERPIC HYBRID CELL LINES, METHOD OF OBTAINING, ANTI-HERPIC MONOCLONAL ANTIBODIES, BIOLOGICAL APPLICATIONS | |
| Taupier et al. | Nonrandom Escape of Tumor Cells from Immune Lysis Due to Intracional Fluctuations in Antigen Expression | |
| Soloneski et al. | Effect of dithiocarbamate pesticide zineb and its commercial formulation, azzurro. II. micronucleus induction in immunophenotyped human lymphocytes | |
| Favrot et al. | Bone marrow purging procedure in Burkitt lymphoma with monoclonal antibodies and complement: quantification by a liquid cell culture monitoring system | |
| Ma et al. | Flow cytometry with crystal violet to detect intracytoplasmic fluorescence in viable human lymphocytes demonstration of antibody entering living cells | |
| Lankoff et al. | Nucleotide excision repair impairment by nodularin in CHO cell lines due to ERCC1/XPF inactivation | |
| Znachor et al. | Bacterial colonization of the freshwater planktonic diatom Fragilaria crotonensis | |
| O'Brien et al. | Evaluation of an agarose overlay assay to determine the eye irritation potential of detergent-based products |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| ST | Notification of lapse |