FR2481314A1

FR2481314A1 - Culturing Streptococcus pyogenes - to yield antitumour agent streptolysin S, using sugar as carbon source and controlled pH

Info

Publication number: FR2481314A1
Application number: FR8009334A
Authority: FR
Inventors: Shintaro Inoue; Mikio Sotomura; Hiroshi Tanaka; Seiichi Iwamoto; Norimasa Takamatsu; Akira Suzuki; Isamu Utsumi
Original assignee: Kanebo Ltd
Current assignee: Kanebo Ltd
Priority date: 1980-04-25
Filing date: 1980-04-25
Publication date: 1981-10-30
Also published as: FR2481314B1

Abstract

Streptococcuspyogenes is cultured in a medium containing fermentable sources of carbon, and at a pH of 5.6 or above throughout the whole culture period. The medium pref contains 0.1-5% fermentable C, such as mono- or di-saccharides esp glucose or sucrose. The pH is pref kept at 5.6-7.5 (6-7), by addn of an alkali. The culture medium is pref prepared by the addn of the fermentable carbon source to a yeast extract medium or a soya-peptone medium. Known cultures of S.pyogenes in the presence of fermentable carbon sources give an extremely poor yield of (I). Cultures in which the C source is not fermentable give (I) in moderate yeild, but the cells do not multiply very well. This new process gives a very healthy growth of S,pyogenes coupled with a good yield of (I).

Description

La présente invention concerne un procédé de culture de Streptococcus Eyogenes hémolytique (appelé plus brièvement dans ce qui suit St. pyogenes), plus particulièrement un procédé donnant avec de hauts rendements des cellules bactériennes qui ont un grand pouvoir de production de Streptolysine-S (désignée ci-après par l'abréviation SLS) et une activité antitumorale.Les St. pyogenes sont des bactéries pathogènes de l'érysipèle, de la septicémie, de la fièvre puerpérale ainsi que de diverses autres maladies, mais certains sont connus depuis longtemps pour avoir une activité antitumorale et sont utilisés en clinique depuis quelques années comme agents anticancéreux.Cette activité antitumorale est étroitement liée à leur pouvoir de production de SLS, et même parmi les sou ches de St. pyogenes qui se trouvent dans la nature, seules les souches qui sont aptes à la production de SLS ont une activité antitumorale. On sait aussi que même pour St. The present invention relates to a method of cultivating hemolytic Streptococcus Eyogenes (hereinafter more briefly referred to as St. pyogenes), more particularly to a method which yields in high yields bacterial cells which have a high potency of producing Streptolysin-S (designated hereinafter abbreviation SLS) and antitumor activity. St. pyogenes are pathogenic bacteria of erysipelas, sepsis, puerperal fever and various other diseases, but some are known for a long time to have antitumor activity and have been used clinically for some years as anticancer agents.This antitumor activity is closely related to their ability to produce SLS, and even among the strains of St. pyogenes found in nature, only strains that are capable of producing SLS have antitumor activity. We also know that even for St.

pyogenes apte à la production de SLS, l'activité antitumorale est perdue si la culture est effectuée dans des conditions qui suppriment le pouvoir de production de SLS.pyogenes suitable for the production of SLS, antitumor activity is lost if the culture is carried out under conditions that suppress the production power of SLS.

Cet exemple a été bien étudié dans le cas de culture de
St. pyogenes en présence de glucose, et l'on sait que Si l'on ajoute du glucose au milieu de culture, même en petites proportions, la production de SLS s'abaisse rapidement, que si la proportion de glucose atteint 0,3 % ou plus il n'y a quasiment plus production de SLS, ce qui entraîne la perte d'activité antitumorale, et enfin que si l'on ajoute au milieu de culture non seulement du glucose, mais aussi du lactose, dufructose, du mannose ou du glycéraldéhyde, le pouvoir de production de SLS des cellules bactériennes s'en trouve inhibé (voir H. Okamoto et al. Japon. J.This example has been well studied in the case of
St. pyogenes in the presence of glucose, and it is known that if glucose is added to the culture medium, even in small proportions, the production of SLS lowers rapidly, only if the proportion of glucose reaches 0.3 % or more there is almost no production of SLS, which results in the loss of antitumor activity, and finally that if one adds to the culture medium not only glucose, but also lactose, fructose, mannose or glyceraldehyde, the production capacity of SLS of bacterial cells is inhibited (see H. Okamoto et al., Japan J.

Exp. Med., Vol. 34, NO 3, pages 109-118, 1964 ; et H.Exp. Med., Vol. 34, No. 3, pp. 109-118, 1964; and H.

Ohtsuki Annual Reports of the Research Institute for Cancer,
Kanazawa University, Vol. 1, pages 141-153, 1967).Ohtsuki Annual Reports of the Research Institute for Cancer,
Kanazawa University, Vol. 1, pp. 141-153, 1967).

Des recherches entreprises par la présente
Demanderesse ont confirme le fait que si l'on ajoute à des milieux de culture de St. pyogenes des sources de carbone fermentables, comme le glucose, la production de
SLS par les cellules bactériennes en est notablement abaissée ou même supprimee, de même que l'activité antitumorale des cellules.Research undertaken by this
We have confirmed the fact that if we add to fermentation media of St. pyogenes fermentable carbon sources, such as glucose, the production of
SLS by the bacterial cells is significantly lowered or even suppressed, as is the antitumor activity of the cells.

Pour les raisons que l'on vient d'indiquer, on était obligé d'employer des milieux de culture sans de telles sources de carbone pour obtenir des cellules bactériennes douées d'une forte action antitumorale (voir le brevet des Etats-Unis d'Amérique N" 3 477 914). For the reasons just mentioned, it was necessary to use culture media without such carbon sources to obtain bacterial cells with a strong antitumor action (see US Pat. America No. 3,477,914).

Il en est resulté que pour obtenir par culture des cellules bactériennes ayant une activité antitumorale élevée, des propositions ont été faites en vue d'employer des-milieux d'extraits de levure sans sources de carbone fermentables, et il a été signalé qu'avec un extrait de levure comme milieu de culture on pouvait obtenir des cellules dont le pouvoir de production de SLS est relativement grand (voir le brevet britannique NO 1 157 947), mais ce procédé n'est cependant pas satis-- faisant car la multiplication des cellules est beaucoup plus basse. As a result, in order to obtain bacterial cells with high antitumor activity by culture, proposals have been made for the use of yeast extract media without fermentable carbon sources, and it has been reported that with yeast extract as a culture medium could be obtained cells whose SLS production power is relatively large (see British Patent No. 1,157,947), but this method is however not satisfactory because the multiplication of cells is much lower.

La présente invention concerne un procédé d'incubation de St. pyogenes donnant avec de hauts rendements des cellules bactériennes de cet organisme qui ont un grand pouvoir de production de SLS et une forte action antitumorale. The present invention relates to a method of incubating St. pyogenes with high yielding bacterial cells of this organism that have a high production capacity of SLS and a strong antitumor action.

Plus précisément,cette invention concerne un procédé de culture pour obtenir avec de hauts rendements des cellules bactériennes ayant un grand pouvoir de production de SLS, malgré que le milieu de culture contienne des sources de carbone fermentables, sources que l'on considère normalement comme étant le facteur de l'abaissement marqué ou même de la suppression du pouvoir de production de SLS. More specifically, this invention relates to a culture method for obtaining high yields of bacterial cells with a high SLS production power, despite the fact that the culture medium contains fermentable carbon sources, sources which are normally considered to be the factor of the marked lowering or even the suppression of the production power of SLS.

L'invention a ainsi pour objet un procédé de culture de streptococcus pyogenes dans un milieu pour la multiplication de cellules bactériennes douées d'activité antitumorale, procéde caractérisé en ce que
(A) on utilise un milieu de culture contenant des sources de carbone fermentables , et
(B) on maintient le pH du milieu à 5,6 ou plus au cours de la culture.The subject of the invention is thus a method for culturing streptococcus pyogenes in a medium for multiplying bacterial cells endowed with antitumor activity, a process characterized in that
(A) using a culture medium containing fermentable carbon sources, and
(B) the pH of the medium is maintained at 5.6 or higher during the culture.

D'après les publications de H. Okamoto et al. According to the publications of H. Okamoto et al.

ci-dessus et les brevets des Etats-Unis d'Amérique et britannique également précités, on a dejà des informations très détaillées sur des procédés de culture de St. pyogenes dans des milieux donnant une multiplication de cellules douées d'activité antitumorale , par exemple sur les milieux de culture , les conditions de la culture etc.. above and the US and UK patents also supra, there is already very detailed information on methods of culturing St. pyogenes in media giving rise to a multiplication of cells with antitumor activity, for example on the culture media, the conditions of culture etc.

H. Okamoto et al , recommandent d'employer des milieux sans sources de carbone fermentables, comme par exemple le glucose, et en particulier des milieux d'ex- traits de levure dont on sait qu'ils ne contiennent pas de sources de carbone fermentables. Okamoto et al., Recommend using media without fermentable carbon sources, such as glucose, and particularly yeast extract media known to contain no fermentable carbon sources. .

Au contraire, selon la présente invention, non seulement on utilise des milieux de culture contenant des sources de carbone fermentables, mais on ajoute de telles sources à des milieux qui n'en contiennent pas, et ceci est une caractéristique de cette invention. In contrast, according to the present invention, not only are culture media containing fermentable carbon sources used, but such sources are added to media which do not contain them, and this is a feature of this invention.

Dans l'exécution de la présente invention on peut employer une très grande variété de milieux de culture de base, par exemple des milieux naturels tels qu'un bouillon nutritif, un bouillon de Todd-Hewitt, un bouillon de caséine et de peptone de soja, un bouillon d'extrait de citrouille ou d'extrait de levure, un bouillon de peptone de soja etc..., ou bien des milieux semi-synthétiques. Par milieux de culture de base on entend ici des milieux per mettant la multiplication de St pyogenes, que cet organisme soit apte Ûu non à la production de SLS.Dans le cas, comme cela sera dit ci-après, d'un milieu de culture de base sans source de carbone fermentable originelle, ce milieu peut être utilisé tel quel ou apres addition de quantités appropriées de sources de carbone fermentables. In the practice of the present invention a very wide variety of basic culture media may be employed, for example natural media such as nutrient broth, Todd-Hewitt broth, casein broth and soy peptone broth. , a pumpkin extract or yeast extract broth, a soy peptone broth, etc., or semi-synthetic media. The term "basic culture medium" is understood here to mean media permitting the multiplication of S. pyogenes, that this organism is suitable for non-production of SLS. In the case, as will be described hereinafter, of a culture medium. This medium can be used as it is or after the addition of appropriate amounts of fermentable carbon sources.

Toute source de carbone dont St. pyogenes peut produire la fermentation peut être ajoutee au milieu de culture de base, mais sont préférables les glucides ou leurs dérivés tels que le glucose, le mannose, le fructose, le lactose, le saccharose, le maltose, le glycéraldéhyde, le tréhalose, la dextrine, l'amidon soluble, les mélasses etc..., et parmi eux sont encore particulièrement préférables des monoholosides et des diholosides, le glucose pouvant être avantageusement employé comme monoholoside et le saccharose comme diholoside. Any source of carbon from which St. pyogenes can produce fermentation may be added to the basic culture medium, but are preferable carbohydrates or their derivatives such as glucose, mannose, fructose, lactose, sucrose, maltose, glyceraldehyde, trehalose, dextrin, soluble starch, molasses, etc., and among them are still particularly preferable monoholosides and diholosides, glucose can be advantageously used as monoholoside and sucrose as diholoside.

Le milieu de culture peut être tout milieu permettant la multiplication de St. pyogenes et contenant de telles sources de carbone fermentables. The culture medium may be any medium allowing the multiplication of St. pyogenes and containing such fermentable carbon sources.

Ainsi, un milieu de culture contenant originellement certaines sources de carbone fermentables, comme le bouillon de Todd-Hewitt < à environ 0,2 % de glucose), un bouillon de caséine et de peptone de soja (à environ 0,25 % de glucose), un bouillon d'extrait de citrouille < à environ 0,1 % de glucose), un bouillon de peptone de soja < à environ 0,4 % d'un sucre réducteur) etc..., peut être employé tel quel ou bien après une nouvelle addition de ces sources de carbone fermentables. Néanmoins, même dans le cas de milieux contenant originellement des sources de carbone fermentables, il est préférable de leur ajouter au moins 0,1 %- de telles sources car on peut ainsi multiplier avec un plus haut rendement des cellules bactériennes de St. pyogenes donnant une bonne production de SLS. Dans le cas de milieux sans sources de carbone fermentables, comme un bouillon nutritif ou un bouillon d'extrait de levure, il est nécessaire, pour l'exécution de la présente invention, de leur ajouter des sources de carbone fermentables. Thus, a culture medium originally containing certain fermentable carbon sources, such as Todd-Hewitt broth (at about 0.2% glucose), a casein broth and soy peptone (at about 0.25% glucose). ), a pumpkin extract broth <about 0.1% glucose), a soy peptone broth <about 0.4% of a reducing sugar) etc ..., can be used as is or well after a new addition of these fermentable carbon sources. Nevertheless, even in the case of media originally containing fermentable carbon sources, it is preferable to add them at least 0.1% - such sources because it is possible to multiply with a higher yielding bacterial cells of St. pyogenes giving a good production of SLS. In the case of media without fermentable carbon sources, such as a nutrient broth or yeast extract broth, it is necessary for the practice of the present invention to add fermentable carbon sources thereto.

Que l'on ajoute ou non au milieu des sources carbone fermentables, il devra de préférence contenir de telles sources dans une proportion de 0,1 à 5 % en poids par volume, de préférence de 0,1 à 2 % et mieux encore de 0,3 à 2 %, et dans le cas du glucose, par exemple, sa proportion pourra être de 0,1 à 3 % en poids par volume, notamment de 0,3 à 2 %. Whether or not added to the medium of the fermentable carbon sources, it should preferably contain such sources in a proportion of 0.1 to 5% by weight per volume, preferably from 0.1 to 2% and more preferably from 0.3 to 2%, and in the case of glucose, for example, its proportion may be from 0.1 to 3% by weight per volume, especially from 0.3 to 2%.

L'expression "poids par volume" désigne ici le poids des sources de carbone fermentables rapporté au volume du milieu de culture, et dans ce qui suit toutes les teneurs des milieux en sources de carbone,en pourcentages, correspondent à cette définition. The expression "weight by volume" refers here to the weight of the fermentable carbon sources relative to the volume of the culture medium, and in the following all carbon contents in carbon sources, in percentages, correspond to this definition.

Ainsi, que les milieux de base contiennent ou non originellement des sources de carbone fermentables par St. Pyogenes, on opèrera avantageusement avec des milieux dont les concentrations en telles source s seront comprises entre les limites qui ont été indiquées. Thus, whether or not background media originally contain fermentable carbon sources by St. Pyogenes, it will be advantageous to operate with media whose concentrations at such sources will be within the limits that have been indicated.

Pour l'exécution de la présente invention, des milieux de culture particulièrement préférables sont les suivants
1) un bouillon d'extrait de levure auquel
on a ajouté 0,1 à 5 %, de préférence
0,3 à 2 %, de sources de carbone fermen
tables, en particulier de glucose ou de
saccharose, ou encore
2) un bouillon de peptone de soja auquel on
aura ajouté 0,1 à 5 %,de préférence de
0,1 à 5 8, de sources de carbone fermen
tables, notamment de glucose ou de
saccharose.For carrying out the present invention, particularly preferable culture media are as follows
1) a yeast extract broth to which
0.1 to 5%, preferably
0.3 to 2% of carbon sources fermen
tables, especially glucose or
sucrose, or
2) a soy peptone broth
will have added 0.1 to 5%, preferably
0.1 to 5 8, of carbon sources fermen
tables, especially glucose or
sucrose.

Si cela est nécessaire, on peut ajouter aux présents milieux de culture de 1'ARN ou de la ribonucléase. If necessary, RNA or ribonuclease can be added to the present culture media.

Le pH initial du milieu permettant la multiplication de St. pyogenes, et contenant des sources de carbone fermentables aux concentrations indiquées, est ordinairement de l'ordre de 7,1 à 7,4, mais il s'abaisse progressivement au cours de la culture, et quand on arrive au stade où les cellules bactériennes du micron-organisme se sont considérablement multipliées, il est d'environ 5,3 ou moins et le plus souvent de 5,2 ou moins, et même il n'est pas rare qu'il soit inférieur à 5,0, suivant le milieu choisi. The initial pH of the medium allowing the multiplication of St. pyogenes, and containing fermentable carbon sources at the indicated concentrations, is usually of the order of 7.1 to 7.4, but it gradually decreases during the culture. and when we reach the stage where the bacterial cells of the micron-organism have considerably multiplied, it is about 5.3 or less and most often 5.2 or less, and even it is not uncommon for it is less than 5.0, depending on the medium chosen.

La présente Demanderesse pense que cela est dû au fait que la fermentation des sources de carbone par St. pyogenes conduit à la formation de certains acides organiques dans le milieu de culture. The Applicant believes that this is due to the fact that the fermentation of carbon sources by St. pyogenes leads to the formation of certain organic acids in the culture medium.

La présente Demanderesse a cherché une relation entre le changement de pH du milieu qui se produit au cours de la culture et la production de SLS par les cellules bac atériennes de St. pyogenes qui se multiplient dans un milieu contenant de telles sources de carbone fermentables, et elle a trouvé qui si le pH s'abaisse au-dessous de 5,6, en genéral la production de SLS par les cellules diminue rapidement, alors que si l'on poursuit la culture en maintenant le pH à 5,6 ou plus, d'une manière assez surprenante, des cellules qui sont très aptes à la production de SLS se multiplient très rapidement. The present Applicant has sought a relation between the change in pH of the medium which occurs during the culture and the production of SLS by the A pter cells of St. pyogenes which multiply in a medium containing such fermentable carbon sources. and she found that if the pH drops below 5.6, in general the production of SLS by the cells decreases rapidly, whereas if the culture is continued by maintaining the pH at 5.6 or higher , rather surprisingly, cells that are very capable of producing SLS are multiplying very rapidly.

On sait couramment que si l'on prend le maltose comme source de carbone fermentable, la production de SLS par les cellules bactériennes se maintient à un certain degré en dépit du fait que le pH du milieu de culture s'abaisse à 5 ou au voisinage de 5 < H. Ohtsuki, Annual Reports de Research Institute for Cancer , Kanazawa University,
Vol. 1, p. 141-153, 1967), et par suite personne n'a essayé d'améliorer la formation de SLS en réglant le pH au cours de la poursuite de la culture.It is commonly known that if maltose is taken as a source of fermentable carbon, the production of SLS by bacterial cells is maintained to a certain degree despite the fact that the pH of the culture medium is lowered to 5 or in the vicinity Dr. H. Ohtsuki, Annual Reports of the Research Institute for Cancer, Kanazawa University,
Flight. 1, p. 141-153, 1967), and consequently no one has tried to improve the formation of SLS by regulating the pH during the continuation of the culture.

Conformément à la présente invention, dans le cas de sources de carbone autres que le maltose , il est indispensable de maintenir le pH du milieu à 5,6 ou plus, en particulier à 6 ou plus, lors de la poursuite de l'incubation, pour la multiplication de cellules St. pyogenes ayant un haut pouvoir de production de SLS, et même si l'on emploie le maltose comme source de carbone, on peut obtenir avec un plus haut rendement, en réglant le pH aux valeurs ci-dessus, des cellules plus aptes à la production de SLS. According to the present invention, in the case of carbon sources other than maltose, it is essential to maintain the pH of the medium at 5.6 or more, in particular 6 or more, during the further incubation, for the multiplication of St. pyogenes cells with high SLS production power, and even if maltose is used as a carbon source, it is possible to obtain a higher yield by adjusting the pH to the above values, cells more suitable for the production of SLS.

Dans l'exécution de cette invention, la culture se fait par inoculation de St. pyogenes au milieu contenant la source de carbone fermentable ou auquel on a ajouté cette source, et tout en maintenant le pH du milieu à 5,6 ou plus, de préférence entre 5,6 et 7,5 et mieux encore entre 6 et 7. Une température de 30 à 400C, mieux de 35 à 370C, est suffisante, tandis que le temps de culture est variable et dépend de la nature du milieu, de la propor tion des sources-de carbone, de la dimension de l'inoculum etc..., mais il peut être de 8 à 72 heures, et l'on peut normalement obtenir en 12 à 4a heures des cellules bactériennes qui satisfont aux exigences de multiplication,, d'aptitude à la formation de SLS et d'activité antitumorale. In the practice of this invention, the culture is by inoculation of St. pyogenes with the medium containing the fermentable carbon source or with which this source has been added, and while maintaining the pH of the medium at 5.6 or higher, preferably between 5.6 and 7.5 and more preferably between 6 and 7. A temperature of 30 to 400C, more preferably 35 to 370C, is sufficient, while the culture time is variable and depends on the nature of the medium, the proportion of the carbon sources, the size of the inoculum, etc., but it can be from 8 to 72 hours, and bacterial cells which satisfy the requirements can normally be obtained within 12 to 4 hours. multiplication, SLS formation and antitumor activity.

Mais dans ces limites de temps de culture le temps est de préférence prolongé à mesure qu'on élève la teneur du milieu en source de carbone. But within these culture time limits the time is preferably extended as the carbon content of the medium is raised.

On règle le pH du milieu de culture de manière connue, par exemple avec une solution de tamponnage, par neutralisation ou par un autre moyen. On peut par exemple ajouter une solution tampon de phosphate < à pH 7,0 - 7,5) à une concentration dans le milieu de 50 à 300 mbt, de préférence de 100 à 200 mM, ou bien ajouter goutte à goutte une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium ou de potassium ou d'ammoniac ou encore d'un amino-acide basique ou autres (ou, selon le cas, une solution aqueuse d'acide chlorhydrique, sulfurique ou phosphorique ou d'un amino-acide acide ou autres), tout en agitant assez lentement, par exemple entre 100 et 500 tours par minute, en ajustant le pH du milieu. The pH of the culture medium is adjusted in a known manner, for example with a buffer solution, by neutralization or by other means. For example, a phosphate buffer solution (pH 7.0 - 7.5) can be added at a concentration in the medium of 50 to 300 mbt, preferably 100 to 200 mM, or an aqueous solution can be added dropwise. of sodium or potassium hydroxide or of ammonia or of a basic amino acid or the like (or, as the case may be, an aqueous solution of hydrochloric, sulfuric or phosphoric acid or an acidic amino acid or others), while stirring rather slowly, for example between 100 and 500 revolutions per minute, by adjusting the pH of the medium.

On recueille les cellules bactériennes de
St. pyogenes en centrifugeant la solution de culture tout en refroidissant. La multiplicatiôn des cellules est très bonne, de même que leur activité antitumorale. The bacterial cells of
St. pyogenes by centrifuging the culture solution while cooling. The multiplication of cells is very good, as is their antitumor activity.

La présente invention sera expliquée plus en détail dans les exemples d'exécution qui suivent, dans lesquels, à moins d'indications contraires, le signe "" signifie "% en poids/volume'l et la multiplication cellulaire, le pouvoir de production de SLS et activité antitumorale in vivo sont déterminés par les méthodes qui sont décrites ciaprès. The present invention will be explained in more detail in the following embodiments, in which, unless otherwise indicated, the sign "" means "% by weight / volume" and the cell multiplication, the production capacity of SLS and in vivo antitumor activity are determined by the methods which are described below.

Multiplication cellulaire (DO660) (DO = densi
té optique.Cellular multiplication (DO660) (OD = densi
optical tee.

On lave deux fois avec du soluté physiologique les cellules bactériennes obtenues par centrifugation d'une quantité déterminée de solution de culture, puis on dilue avec le même soluté pour atteindre une absorbance de 0,1 à 0,2 à 660 nm (DO660). On mesure la DO660 de la solution diluée et on obtient la Duo660 de la solution de culture en multipliant la valeur trouvée par le facteur de dilution. The bacterial cells obtained by centrifugation of a determined amount of culture solution are washed twice with physiological saline and then diluted with the same solute to obtain an absorbance of 0.1 to 0.2 at 660 nm (OD 660). The OD660 of the diluted solution is measured and the Duo660 of the culture solution is obtained by multiplying the value found by the dilution factor.

Pouvoir de production de SLS. Production power of SLS.

On prélève dans des tubes à essais 5 ml de chacune des solutions de culture des exemples qui sont donnés ci-après, après des temps de culture appropriés, on refroidit dans de la glace puis on centrifuge à froid à 3500 tours/minute pendant 10 minutes, on lave ensuite avec un milieu de base de Bernheimer (milieu comprenant 675 mg de maltose, 6 ml d'une solution aqueuse à 20% de dihydrogénophosphate de potassium, ajustée à pH 7,0 au moyen d'hydroxyde de sodium, 12 ml de solution aqueuse à 2 % de sulfate de magnésium heptahydraté et 66 ml d'eau distillée, milieu désigné ci-après par l'abréviation MBB), et on met en suspension dans 2 ml de MBB frais.On ajoute ensuite 0,06 % de noyau de ribonucléase (préparé à partir d'une digestion de ribonucléase pancréatique de Yeast-Sodium
Ribonucleate (levure-sodium) "Merck"), on fait incuber à 370C pendant 60 minutes puis on centrifuge à 3500 tours/minute pendant 10 minutes à basse température, et on prélève 1 ml du surnageant que l'on dilue par la méthode de dilution au double avec une solution tampon froide à pH 6,5, dont 1 litre contient 7,^ g de chlorure de sodium', 3,17 g de dihydrogénophosphate de potassium et 3,59 g d'hydrogénophosphate disodique dodécahydraté. A 1 ml de chaque solution diluée on ajoute 1 ml d'érythrocytes de lapin préalablement lavé plusieurs fois avec la solution tampon et ajusté avec cette solution à 3 % en volume par volume, et on maintient à 370C pendant 60 minutes. On détermine te rapport ou facteur de dilution de la solution initiale de MBB auquel il se produit une hémolyse de 50 %, et on le multiplie par 0,4. L'unité hémolytique (UH) de la solution de culture est la valeur maximale des échantillons observée au cours de la culture. 5 ml of each of the culture solutions of the examples which are given below are taken from test tubes after appropriate culture times, cooled in ice and then centrifuged at 3500 rpm for 10 minutes. then washed with Bernheimer's base medium (medium comprising 675 mg of maltose, 6 ml of 20% aqueous solution of potassium dihydrogenphosphate, adjusted to pH 7.0 with sodium hydroxide, 12 ml. of a 2% aqueous solution of magnesium sulfate heptahydrate and 66 ml of distilled water, hereinafter referred to as abbreviation MBB), and is suspended in 2 ml of fresh MBB. 0.06% is then added of ribonuclease nucleus (prepared from Yeast-Sodium pancreatic ribonuclease digestion
Ribonucleate (yeast-sodium) "Merck"), incubated at 370 ° C. for 60 minutes and then centrifuged at 3500 rpm for 10 minutes at low temperature, and 1 ml of the supernatant which is diluted by the method of double dilution with a cold buffer solution at pH 6.5, of which 1 liter contains 7 .mu.l of sodium chloride, 3.17 g of potassium dihydrogenphosphate and 3.59 g of disodium hydrogenphosphate dodecahydrate. To 1 ml of each diluted solution is added 1 ml of rabbit erythrocytes previously washed several times with the buffer solution and adjusted with this 3% v / v solution and maintained at 370 ° C. for 60 minutes. The ratio or dilution factor of the initial MBB solution at which 50% hemolysis is produced is determined and multiplied by 0.4. The hemolytic unit (HU) of the culture solution is the maximum value of the samples observed during the culture.

Activité antitumorale in vivo. Antitumor activity in vivo.

On prélève 250 mi de la solution de culture de chacun des exemples suivants, on centrifuge à froid, on lave deux fois avec du soluté physiologique froid, puis on met en suspens ion dans une solution de MBB froide et on ajuste à l'absorbance 10,0 à 660 nm (D0660). On ajoute ensuite à la solution de MBB le cinquième de sa quantité d'une solution de 200 000 unités du sel potassique de penicilline G dans 1,25 mi de solution physiologique, on maintient 370C pendant 20 minutes puis à 450C pendant encore 30 minutes, on verse des quantités de 1 ml dans des flacons stérilisés et on lyophilise. On a ainsi 5 mg de cellules sèches par flacon. 250 ml of the culture solution are taken from each of the following examples, cold centrifuged, washed twice with cold physiological saline, then suspended in cold MBB solution and adjusted to absorbance. 0 to 660 nm (D0660). One-fifth of its amount of a solution of 200,000 units of potassium salt of penicillin G in 1.25 ml of physiological solution is then added to the MBB solution, 370C is maintained for 20 minutes and then at 450 ° C. for a further 30 minutes. 1 ml amounts are poured into sterilized vials and lyophilized. There is thus 5 mg of dry cells per flask.

La préparation lyophilisée ainsi obtenue est mise en suspension dans 5 ml de solution saline et elle est administrée par la voie intrapéritonéale,chaque fois à raison de 0,2 mi pendant 4 jours successifs, à des souris auxquelles on a inoculé lejour précédent par la voie intrapéritonéale 106 cellules du carcinome ascitique d'Ehrlich (un groupe de cinq souris femelles ddY d'environ 5 semaines), tandis que l'on garde comme témoins des souris n'ayant reçu par la voie intrapéritonéale que 0,2 ml de la solution saline physiologique. L'activité antitumorale est définie par le nombre de souris qui survivent pendant 20 jours ou 30 jours après l'inoculation du carcinome ascitique d'Ehrlich. The freeze-dried preparation thus obtained is suspended in 5 ml of saline solution and is administered intraperitoneally, each time at a rate of 0.2 ml for 4 successive days, to mice which have been inoculated the day before by the intraperitoneal cells of Ehrlich ascitic carcinoma cells (a group of five female ddY mice of approximately 5 weeks), while we kept as control mice received intraperitoneally only 0.2 ml of the solution physiological saline. Antitumor activity is defined as the number of mice that survive for 20 days or 30 days after inoculation of Ehrlich ascites carcinoma.

Dans les présents essais, le nombre de souris qui survivent pendant 20 ou 30 jours après l'inoculation est nul pour tous les groupes témoins
EXEMPLE 1
Milieu de culture de base (bouillon d'extrait
de levure à 5 %).In the present tests, the number of mice that survive for 20 or 30 days after inoculation is nil for all control groups
EXAMPLE 1
Basic culture medium (extract broth
yeast at 5%).

On dissout 50 g d'extrait-de levure (Oriental
Kogyo Co., Ltd.) dans 500 ml d'eau distillée, après avoir ajusté à pH 7,2 - 7,4 on fait bouillir à 1000C pendant 1 heure puis on refroidit à l'eau, on sépare par filtration le précipité formé, on réajuste le filtrat à pH 7,2 - 7,4 et on fait bouillir de nouveau à 1000C pendant 30 minutes. 50 g of yeast extract (Oriental) are dissolved
Kogyo Co., Ltd.) in 500 ml of distilled water, after adjusting to pH 7.2-7.4, is boiled at 1000 ° C. for 1 hour and then cooled with water, the precipitate formed is separated by filtration. the filtrate was readjusted to pH 7.2-7.4 and boiled again at 1000C for 30 minutes.

On refroidit ensuite dans de l'eau et on filtre, on ajoute de l'eau distillée au filtrat pour le compléter à 1 litre et on stérilise à 120dC pendant 20 minutes, ce qui donne le milieu de base.It is then cooled in water and filtered, distilled water is added to the filtrate to make it to 1 liter and sterilized at 120 ° C. for 20 minutes to give the base medium.

Procédé selon la présente invention. Process according to the present invention.

A 500 ml de ce milieu de culture de base placé dans un fermenteur de 1500 ml on ajoute une solution de glucose stérilisée pour avoir une teneur en glucose de 0,4 % de la quantité totale de la solution de culture, et on inocule 25 ml (5 % V/V) d'une solution de St. pyogenes (COLLECTION AMERICAINE DE CULTURES DE TISSUS ATCC NO 21060) préalablement cultivée dans le bouillon nutritif de Kyokuto
Seikaku, Ltd.. Au cours de la culture on ajoute goutte à goutte une solution aqueuse 5N d'hydroxyde de sodium stérilisée pour maintenir le pH à 6,5, et on poursuit la culture à 370C pendant 20 heures tout en agitant à 170 tours/minute.To 500 ml of this basic culture medium placed in a 1500 ml fermenter is added a glucose solution sterilized to have a glucose content of 0.4% of the total amount of the culture solution, and 25 ml is inoculated. (5% V / V) solution of St. pyogenes (AMERICAN COLLECTION OF ATCC TISSUE CULTURES # 21060) previously grown in Kyokuto Nutrient Broth
Seikaku, Ltd .. During the culture is added dropwise a 5N aqueous sodium hydroxide solution sterilized to maintain the pH at 6.5, and the culture is continued at 370C for 20 hours while stirring 170 laps /minute.

Témoin A. Witness A.

Au même-milieu de culture de base que dans l'exemple 1 on ajoute également la solution de glucose et on inocule de la même manière la solution de culture de
St. pyogenes, et on cultive dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1, mais sans ajuster le pH du milieu.In the same basic culture medium as in Example 1, the glucose solution is also added and the solution of culture of the same is inoculated.
St. pyogenes, and cultivated under the same conditions as in Example 1, but without adjusting the pH of the medium.

Témoin B. Witness B.

On inocule de la même manière le même milieu de culture de base que dans l'exemple 1, mais sans ajouter la solution de glucose et sans ajuster le pH, et on opère une culture au repos à 370C pendant 20 heures. The same basic culture medium is inoculated in the same manner as in Example 1, but without adding the glucose solution and without adjusting the pH, and a culture is carried out at 370 ° C. for 20 hours.

Sur les diverses solutions de culture on détermine la multiplication cellulaire, le pouvoir de production de SLS et l'activité antitumorale in vivo. Le tableau I ci-après donne les résultats obtenus. On the various culture solutions, cell multiplication, the production capacity of SLS and antitumor activity in vivo are determined. Table I below gives the results obtained.

TABLEAU I

TABLE I

Conditions <SEP> Source <SEP> de <SEP> Ajuste- <SEP> Multipli- <SEP> Production <SEP> production <SEP> Activité <SEP> antitumorale
<tb> et <SEP> carbone <SEP> ment <SEP> du <SEP> cation <SEP> SLS <SEP> par <SEP> SLS <SEP> par <SEP> uni- <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> souris <SEP> survi
Résultats <SEP> (Concen- <SEP> pH <SEP> cellulai- <SEP> unité <SEP> du <SEP> té <SEP> de <SEP> con- <SEP> vantes
<tb> <SEP> tration <SEP> (pH) <SEP> re <SEP> milieu <SEP> de <SEP> centration <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> souris <SEP> testées
<tb> Essais <SEP> %) <SEP> (DO660) <SEP> culture <SEP> cellulaire
<tb> <SEP> rapport) <SEP> (UH/ml) <SEP> (UH/DO660) <SEP> Après <SEP> 20 <SEP> Après <SEP> 30
<tb> <SEP> (rpport) <SEP> (rapport) <SEP> jours <SEP> jours
<tb> Exemple <SEP> 1 <SEP> glucose <SEP> oui <SEP> 2,3 <SEP> 570 <SEP> 248 <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb> <SEP> (0,4) <SEP> (6,5) <SEP> (2,6) <SEP> (2,7) <SEP> (1,03
<tb> Témoin <SEP> A <SEP> glucose <SEP> non <SEP> 1,2 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> 0/5 <SEP> 0/5
<tb> <SEP> (0,4) <SEP> (-) <SEP> * <SEP> (1,3) <SEP> (0,02) <SEP> (0,02)
<tb> Témoin <SEP> B <SEP> - <SEP> non <SEP> 0,89 <SEP> 214 <SEP> 240 <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb> <SEP> (-) <SEP> (-) <SEP> * <SEP> (1,0) <SEP> (1,0) <SEP> (1,0)
<tb> (Notes) (1) Dans tous les essais la souche employée est la souche N 21060 de l'ATCC, et le
milieu de culture de base est le bouillon d'extrait de levure.Conditions <SEP> Source <SEP> of <SEP> Adjustment- <SEP> Multipli- <SEP> Production <SEP> Production <SEP> Activity <SEP> Antitumor
<tb> and <SEP> carbon <SEP><SEP> of the <SEP> cation <SEP> SLS <SEP> by <SEP> SLS <SEP> by <SEP> uni- <SEP> Number <SEP> of <SEP> mouse <SEP> survived
<SEP>SEP><SEP>SEP><SEP>SEP><SEP> SEP <SEP> SEP results
<tb><SEP> tration <SEP> (pH) <SEP> re <SEP> environment <SEP> of <SEP> centration <SEP> Number <SEP> of <SEP>SEP> mice tested
<tb> Assays <SEP>%) <SEP> (DO660) <SEP> cell culture <SEP>
<tb><SEP> ratio <SEP> (UH / ml) <SEP> (UH / DO660) <SEP> After <SEP> 20 <SEP> After <SEP> 30
<tb><SEP> (report) <SEP> (report) <SEP> days <SEP> days
<tb> Example <SEP> 1 <SEP> glucose <SEP> yes <SEP> 2,3 <SEP> 570 <SEP> 248 <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb><SEP> (0.4) <SEP> (6.5) <SEP> (2.6) <SEP> (2.7) <SEP> (1.03)
<tb> Control <SEP> A <SEP> glucose <SEP> no <SEP> 1,2 <SEP><<SEP> 4 <SEP><<SEP> 4 <SEP> 0/5 <SEP> 0/5
<tb><SEP> (0.4) <SEP> (-) <SEP> * <SEP> (1.3) <SEP> (0.02) <SEP> (0.02)
<tb> Control <SEP> B <SEP> - <SEP> no <SEP> 0.89 <SEP> 214 <SEP> 240 <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb><SEP> (-) <SEP> (-) <SEP> * <SEP> (1,0) <SEP> (1,0) <SEP> (1,0)
<tb> (Notes) (1) In all tests the strain used is ATCC strain N 21060, and the
Basic culture medium is the yeast extract broth.

(2)* Le pH final du milieu de culture pour les témoins A et B est respectivement 5,2 et 6,6. (2) * The final pH of the culture medium for controls A and B is 5.2 and 6.6, respectively.

Comme le montrent les résultats du tableau I, les cellules qui sont obtenues par le procédé selon cette invention (exemple 1) sont à peu près identiques, aussi bien en ce qui concerne la production de SLS par unité de concentration cellulaire qu'en ce qui concerne leur activité antitumorale, à celles obtenues par la culture habituelle au repos (témoin B), mais dans le premier cas la multiplication cellulaire est environ 2,6 fois plus elevée, ce qui représente une amélioration considérable. As shown by the results in Table I, the cells that are obtained by the method according to this invention (Example 1) are about the same, both as regards the production of SLS per cell concentration unit and in that As regards their antitumor activity, to those obtained by the usual culture at rest (control B), but in the first case the cell multiplication is about 2.6 times higher, which represents a considerable improvement.

Par ailleurs, en présence de glucose mais sans réglage du pH (témoin 1), on observe sans doute une certaine élévation de la multiplication cellulaire, mais la production de SLS est notablement abaissée et l'activité antitumorale à peu près totalement perdue. Moreover, in the presence of glucose but without pH adjustment (control 1), there is no doubt a certain increase in cell multiplication, but the production of SLS is significantly lowered and the antitumor activity is almost completely lost.

EXEMPLES 2, 3 et 4
En effectuant la culture de la même manière que dans l'exemple 1, mais en remplaçant la souche ATCC NO 21060 de St. pyogenes de cet exemple respectivement par les souches ATCC NO 21059 (exemple 2), IID S-43 (exemple 3) et IID T-3 (exemple 4), on a obtenu les résultats-qui sont groupés dans le tableau II ci-après.EXAMPLES 2, 3 and 4
Performing the culture in the same manner as in Example 1, but replacing the St. pyogenes ATCC NO 21060 strain of this example respectively by ATCC strains NO 21059 (Example 2), IID S-43 (Example 3) and IID T-3 (Example 4), the results were obtained which are grouped in Table II below.

Pour les essais témoins C, D et E, la culture a été effectuée de la même manière que pour le témoin B de d'exemple 1, sauf pour ce qui concerne les diverses bactéries choisies. For the C, D and E control assays, the culture was carried out in the same manner as for control B of Example 1, except for the various selected bacteria.

(Voir tableau II page suivante) TABLEAU II

(See Table II on the next page) TABLE II

Conditions <SEP> Souche <SEP> Source <SEP> Ajuste- <SEP> Multipli- <SEP> Production <SEP> Production <SEP> Activité <SEP> antiet <SEP> de <SEP> car- <SEP> ment <SEP> du <SEP> cation <SEP> SLS <SEP> par <SEP> uni- <SEP> SLS <SEP> par <SEP> uni- <SEP> tumorale
<tb> Résultats <SEP> bone <SEP> pH <SEP> celluaire <SEP> té <SEP> du <SEP> milieu <SEP> té <SEP> de <SEP> concen- <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> souris
<tb> <SEP> (concen- <SEP> (pH) <SEP> (DO660) <SEP> de <SEP> culture <SEP> tration <SEP> cellu- <SEP> survivantes
<tb> Essais <SEP> tration <SEP> (rapport) <SEP> (UH/ml <SEP> laire <SEP> (UH/DO660) <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> souris
<tb> <SEP> %) <SEP> (rapport) <SEP> (rapport) <SEP> testées
<tb> <SEP> Après <SEP> 20 <SEP> Après <SEP> 30
<tb> <SEP> jours <SEP> jours
<tb> Exemple <SEP> 2 <SEP> ATCC <SEP> glucose <SEP> OUT <SEP> 2.4 <SEP> 672 <SEP> 280 <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb> <SEP> Vo. <SEP> 21059 <SEP> (0,4) <SEP> (6,5) <SEP> (2,6) <SEP> (3,7) <SEP> (1,4)
<tb> Témoin <SEP> C <SEP> ATCC <SEP> - <SEP> NON <SEP> 0,91 <SEP> 184 <SEP> 202 <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb> <SEP> Vo.<SEP> 21059 <SEP> (-) <SEP> (1,0) <SEP> (1,0) <SEP> (1,0)
<tb> Exemple <SEP> 3 <SEP> IID <SEP> glucose <SEP> OUI <SEP> 2.3 <SEP> 437 <SEP> 190 <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb> <SEP> S-43 <SEP> (0,4) <SEP> (6,5) <SEP> (2,6) <SEP> (2,2) <SEP> (0,86)
<tb> Témoin <SEP> D <SEP> IID <SEP> - <SEP> NON <SEP> 0,88 <SEP> 195 <SEP> 222 <SEP> 5/5 <SEP> 4/5
<tb> <SEP> S-43 <SEP> (-) <SEP> (1,0) <SEP> (1,0) <SEP> (1,0)
<tb> Exemple <SEP> 4 <SEP> IID <SEP> glucose <SEP> OUI <SEP> 2,3 <SEP> 575 <SEP> 230
<tb> <SEP> T-3 <SEP> (0,4) <SEP> (6.5) <SEP> (2,5) <SEP> (3,3) <SEP> (1,2) <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb> Témoin <SEP> E <SEP> IID <SEP> - <SEP> NON <SEP> 0,92 <SEP> 178 <SEP> 194 <SEP> 5/5 <SEP> 4/5
<tb> <SEP> T-3 <SEP> (-) <SEP> (1,0) <SEP> (1,0) <SEP> (1,0)
<tb> (Note) Dans tous les essais le bouillon d'extrait de levure le milieu de culture de base. Conditions <SEP> Strain <SEP> Source <SEP> Adjustment- <SEP> Multipli- <SEP> Production <SEP> Production <SEP> Activity <SEP> antiet <SEP> of <SEP> car- <SEP> ment <SEP ><SEP> cation <SEP> SLS <SEP> with <SEP> uni- <SEP> SLS <SEP> with <SEP> uni- <SEP> tumoral
<tb> Results <SEP> bone <SEP> pH <SEP> cell type <SEP> t <SEP> of <SEP> medium <SEP> t <SEP> of <SEP> concentration <SEP> Number <SEP> of <SEP> mice
<tb><SEP>(SEP>SEP><SEP> Concentration <SEP><SEP><SEP> Cell Culture <SEP>
<tb> Trials <SEP> tration <SEP> (report) <SEP> (UH / ml <SEP> lair <SEP> (UH / DO660) <SEP> Number <SEP> of <SEP> mice
<tb><SEP>%)<SEP> (report) <SEP> (report) <SEP> tested
<tb><SEP> After <SEP> 20 <SEP> After <SEP> 30
<tb><SEP> days <SEP> days
<tb> Example <SEP> 2 <SEP> ATCC <SEP> glucose <SEP> OUT <SEP> 2.4 <SEP> 672 <SEP> 280 <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb><SEP> Vo. <SEP> 21059 <SEP> (0.4) <SEP> (6.5) <SEP> (2.6) <SEP> (3.7) <SEP> (1.4)
<tb> Control <SEP> C <SEP> ATCC <SEP> - <SEP> NO <SEP> 0.91 <SEP> 184 <SEP> 202 <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb><SEP><SEQID> 21059 <SEP> (-) <SEP> (1.0) <SEP> (1.0) <SEP> (1.0)
<tb> Example <SEP> 3 <SEP> IID <SEP> glucose <SEP> YES <SEP> 2.3 <SEP> 437 <SEP> 190 <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb><SEP> S-43 <SEP> (0.4) <SEP> (6.5) <SEP> (2.6) <SEP> (2.2) <SEP> (0.86)
<tb> Control <SEP> D <SEP> IID <SEP> - <SEP> NO <SEP> 0.88 <SEP> 195 <SEP> 222 <SEP> 5/5 <SEP> 4/5
<tb><SEP> S-43 <SEP> (-) <SEP> (1.0) <SEP> (1.0) <SEP> (1.0)
<tb> Example <SEP> 4 <SEP> IID <SEP> glucose <SEP> YES <SEP> 2,3 <SEP> 575 <SEP> 230
<tb><SEP> T-3 <SEP> (0.4) <SEP> (6.5) <SEP> (2.5) <SEP> (3.3) <SEP> (1.2) <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb> Witness <SEP> E <SEP> IID <SEP> - <SEP> NO <SEP> 0.92 <SEP> 178 <SEP> 194 <SEP> 5/5 <SEP> 4/5
<tb><SEP> T-3 <SEP> (-) <SEP> (1.0) <SEP> (1.0) <SEP> (1.0)
<tb> (Note) In all tests the yeast extract broth the basic culture medium.

EXEMPLES 5, 6 et 7
On effectue la culture exactement comme dans l'exemple 1, sauf que le pH du milieu est maintenu respectivement à 5,0 (Témoin F), 6,0 (exemple 5), 7,0 (exemple 6) et 7,5 (exemple 7) au cours de la culture.EXAMPLES 5, 6 and 7
The culture is carried out exactly as in Example 1 except that the pH of the medium is maintained at 5.0 (Control F), 6.0 (Example 5), 7.0 (Example 6) and 7.5 ( Example 7) during cultivation.

Le tableau III donne les resultats obtenus et il reproduit aussi ceux de l'essai témoin B de l'exemple 1. Table III gives the results obtained and it also reproduces those of the control test B of Example 1.

I1 ressort du tableau III que le pH du milieu de culture doit de préférence être compris entre 6 et 7. It can be seen from Table III that the pH of the culture medium should preferably be between 6 and 7.

(Voir tableau III page suivante) TABLEAU III

(See Table III on the next page) TABLE III

Conditions <SEP> Source <SEP> de <SEP> Ajuste- <SEP> Multipli- <SEP> Production <SEP> Production <SEP> Activité <SEP> antitumorale
<tb> et <SEP> carbone <SEP> ment <SEP> du <SEP> cation <SEP> SLS <SEP> par <SEP> SLS <SEP> par <SEP> uni- <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> souris <SEP> survi
Résultats <SEP> (Concen- <SEP> pH <SEP> cellulai- <SEP> unité <SEP> du <SEP> té <SEP> de <SEP> con- <SEP> vantes
<tb> <SEP> tration <SEP> (pH) <SEP> re <SEP> milieu <SEP> de <SEP> centration <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> souris <SEP> testées
<tb> Essais <SEP> %) <SEP> (DO660) <SEP> culture <SEP> cellulaire
<tb> <SEP> rapport) <SEP> (UH/ml) <SEP> (UH/DO660) <SEP> Après <SEP> 20 <SEP> Après <SEP> 30
<tb> <SEP> (rpport) <SEP> (rapport) <SEP> jours <SEP> jours
<tb> Exemple <SEP> 5 <SEP> glucose <SEP> OUI <SEP> 2,3 <SEP> 455 <SEP> 198 <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb> <SEP> (0,4) <SEP> (6,0) <SEP> (2,6) <SEP> (2,1) <SEP> (0,8)
<tb> Exemple <SEP> 6 <SEP> glucose <SEP> OUI <SEP> 2,4 <SEP> 490 <SEP> 204 <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb> <SEP> (0,4) <SEP> (7,0) <SEP> (2,7) <SEP> (2,3) <SEP> (0,9)
<tb> Exemple <SEP> 7 <SEP> glucose <SEP> OUI <SEP> 2,3 <SEP> 414 <SEP> 180 <SEP> 4/5 <SEP> 3/5
<tb> <SEP> (0,4) <SEP> (7,5) <SEP> (2,6) <SEP> (1,9) <SEP> (0,8)
<tb> Témoin <SEP> F <SEP> glucose <SEP> OUI <SEP> 1,2 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> 0/5 <SEP> 0/5
<tb> <SEP> (0,4) <SEP> (5,0) <SEP> (1,3) <SEP> < <SEP> 0,02) <SEP> ( < <SEP> 0,02)
<tb> Témoin <SEP> B <SEP> - <SEP> NON <SEP> 0,89 <SEP> 214 <SEP> 240 <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb> <SEP> (-) <SEP> (1,0) <SEP> (1,0) <SEP> (1,0)
<tb> (Note) Dans tous les essais la souche utilisée est la souche ATCC N 21060 et le milieu de
culture de base est le bouillon d'extrait de levure. Conditions <SEP> Source <SEP> of <SEP> Adjustment- <SEP> Multipli- <SEP> Production <SEP> Production <SEP> Activity <SEP> Antitumor
<tb> and <SEP> carbon <SEP><SEP> of the <SEP> cation <SEP> SLS <SEP> by <SEP> SLS <SEP> by <SEP> uni- <SEP> Number <SEP> of <SEP> mouse <SEP> survived
<SEP>SEP><SEP>SEP><SEP>SEP><SEP> SEP <SEP> SEP results
<tb><SEP> tration <SEP> (pH) <SEP> re <SEP> environment <SEP> of <SEP> centration <SEP> Number <SEP> of <SEP>SEP> mice tested
<tb> Assays <SEP>%) <SEP> (DO660) <SEP> cell culture <SEP>
<tb><SEP> ratio <SEP> (UH / ml) <SEP> (UH / DO660) <SEP> After <SEP> 20 <SEP> After <SEP> 30
<tb><SEP> (report) <SEP> (report) <SEP> days <SEP> days
<tb> Example <SEP> 5 <SEP> glucose <SEP> YES <SEP> 2,3 <SEP> 455 <SEP> 198 <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb><SEP> (0.4) <SEP> (6.0) <SEP> (2.6) <SEP> (2.1) <SEP> (0.8)
<tb> Example <SEP> 6 <SEP> glucose <SEP> YES <SEP> 2,4 <SEP> 490 <SEP> 204 <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb><SEP> (0.4) <SEP> (7.0) <SEP> (2.7) <SEP> (2.3) <SEP> (0.9)
<tb> Example <SEP> 7 <SEP> glucose <SEP> YES <SEP> 2,3 <SEP> 414 <SEP> 180 <SEP> 4/5 <SEP> 3/5
<tb><SEP> (0.4) <SEP> (7.5) <SEP> (2.6) <SEP> (1.9) <SEP> (0.8)
<tb> Control <SEP> F <SEP> glucose <SEP> YES <SEP> 1,2 <SEP><<SEP> 4 <SEP><<SEP> 4 <SEP> 0/5 <SEP> 0/5
<tb><SEP> (0.4) <SEP> (5.0) <SEP> (1.3) <SEP><<SEP> 0.02) <SEP>(<SEP> 0.02)
<tb> Control <SEP> B <SEP> - <SEP> NO <SEP> 0.89 <SEP> 214 <SEP> 240 <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb><SEP> (-) <SEP> (1,0) <SEP> (1,0) <SEP> (1,0)
<tb> (Note) In all tests the strain used is ATCC strain N 21060 and
Basic culture is the yeast extract broth.

EXEMPLES 8 à 12
Le tableau IV ci-après donne les résultats de cultures conduites de la même manière que dans l'exemple 1, sauf que la teneur en glucose est de 0,1 % pour l'exemple 8, 0,3 % pour l'exemple 9, de 0,8 % pour pour l'exemple 10, de 2,0 % pour l'exemple 11 et de 5,0 % pour l'exemple 12, et que le temps de culture est de 30 heures dans l'exemple 11 et de 40 heures. dans l'exemple 12. Ce tableau reproduit aussi à titre comparatif les résultats de l'essai témoin B de l'exemple 1.Comme le montre le tableau IV, par rapport au procédé usuel (essai témoin B de l'exemple 1), dans tous les essais effectués conformément à la présente invention, c'est-à-dire dans les exemples 8 à 12, la multiplication cellulaire est de 2 à 4 fois supérieure, tandis que la production de
SLS par unité de concentration cellulaire se maintient à un taux suffisant et que l'on observe une amélioration remarquable de la production totale de SLS.EXAMPLES 8 to 12
Table IV below gives the results of cultures conducted in the same manner as in Example 1, except that the glucose content is 0.1% for Example 8, 0.3% for Example 9. , 0.8% for Example 10, 2.0% for Example 11 and 5.0% for Example 12, and the culture time is 30 hours in Example 11 and 40 hours. in Example 12. This table also compares the results of the control test B of Example 1. As shown in Table IV, compared to the usual method (control test B of Example 1), in all the tests carried out in accordance with the present invention, that is to say in Examples 8 to 12, the cell multiplication is 2 to 4 times higher, whereas the production of
SLS per cell concentration unit remains at a sufficient rate and there is a remarkable improvement in total SLS production.

On peut aussi noter d'après ces résultats, qu'il y a une gamme préférée de proportions de glucose, la multiplication cellulaire augmentant à mesure que prélève la quantité de glucose ajoutée, mais par contre la production de-SLS par unité de concentration cellulaire a tendance à être plus faible. It can also be noted from these results that there is a preferred range of glucose proportions, with increased cell multiplication as the amount of glucose added is increased, but the production of SLS per cell concentration unit is decreased. tends to be weaker.

(Yoir tableau IV page suivante) TABLEAU IV

(See Table IV on the next page) TABLE IV

Conditions <SEP> Source <SEP> de <SEP> Ajuste- <SEP> Multipli- <SEP> Production <SEP> Production <SEP> Activité <SEP> antitumorale
<tb> et <SEP> carbone <SEP> ment <SEP> du <SEP> cation <SEP> SLS <SEP> par <SEP> SLS <SEP> par <SEP> uni- <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> souris <SEP> survi
Résultats <SEP> (Concen- <SEP> pH <SEP> cellulai- <SEP> unité <SEP> du <SEP> té <SEP> de <SEP> con- <SEP> vantes
<tb> <SEP> tration <SEP> (pH) <SEP> re <SEP> milieu <SEP> de <SEP> centration <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> souris <SEP> testées
<tb> Essais <SEP> %) <SEP> (DO660) <SEP> culture <SEP> cellulaire
<tb> <SEP> rapport) <SEP> (UH/ml) <SEP> (UH/DO660) <SEP> Après <SEP> 20 <SEP> Après <SEP> 30
<tb> <SEP> (rpport) <SEP> (rapport) <SEP> jours <SEP> jours
<tb> Exemple <SEP> 8 <SEP> glucose <SEP> OUI <SEP> 1,6 <SEP> 406 <SEP> 254 <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb> <SEP> (0,1) <SEP> (6,5) <SEP> (1,8) <SEP> (1,9) <SEP> (1,1)
<tb> Exemple <SEP> 9 <SEP> glucose <SEP> OUI <SEP> 2,2 <SEP> 545 <SEP> 248 <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb> <SEP> (0,3) <SEP> (6,5) <SEP> (2,5) <SEP> (2,5) <SEP> (1,0)
<tb> Exemple <SEP> 10 <SEP> glucose <SEP> OUI <SEP> 2,5 <SEP> 540 <SEP> 216 <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb> <SEP> (0,8) <SEP> (6,5) <SEP> (2,0) <SEP> (2,5) <SEP> (0,9)]
<tb> Exemple <SEP> 11 <SEP> glucose <SEP> OUI <SEP> 2,8 <SEP> 504 <SEP> 180 <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb> <SEP> (2,0) <SEP> (6,5) <SEP> (3,1) <SEP> (2,4) <SEP> (0,8)
<tb> Exemple <SEP> 12 <SEP> glucose <SEP> OUI <SEP> 3,9 <SEP> 581 <SEP> 149 <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb> <SEP> (5,0) <SEP> (6,5) <SEP> (4,4) <SEP> (2,7) <SEP> (0,6)
<tb> Témoin <SEP> B <SEP> - <SEP> NON <SEP> 0,89 <SEP> 214 <SEP> 240 <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb> <SEP> (-) <SEP> (1,0) <SEP> (1,0) <SEP> (1,0)
<tb> (Note) Dans tous les essais on a utilisé la souche ATCC N 21060 et le bouillon d'extrait
de levure comme milieu de culture de base. Conditions <SEP> Source <SEP> of <SEP> Adjustment- <SEP> Multipli- <SEP> Production <SEP> Production <SEP> Activity <SEP> Antitumor
<tb> and <SEP> carbon <SEP><SEP> of the <SEP> cation <SEP> SLS <SEP> by <SEP> SLS <SEP> by <SEP> uni- <SEP> Number <SEP> of <SEP> mouse <SEP> survived
<SEP>SEP><SEP>SEP><SEP>SEP><SEP> SEP <SEP> SEP results
<tb><SEP> tration <SEP> (pH) <SEP> re <SEP> environment <SEP> of <SEP> centration <SEP> Number <SEP> of <SEP>SEP> mice tested
<tb> Assays <SEP>%) <SEP> (DO660) <SEP> cell culture <SEP>
<tb><SEP> ratio <SEP> (UH / ml) <SEP> (UH / DO660) <SEP> After <SEP> 20 <SEP> After <SEP> 30
<tb><SEP> (report) <SEP> (report) <SEP> days <SEP> days
<tb> Example <SEP> 8 <SEP> glucose <SEP> YES <SEP> 1.6 <SEP> 406 <SEP> 254 <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb><SEP> (0.1) <SEP> (6.5) <SEP> (1.8) <SEP> (1.9) <SEP> (1.1)
<tb> Example <SEP> 9 <SEP> glucose <SEP> YES <SEP> 2,2 <SEP> 545 <SEP> 248 <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb><SEP> (0.3) <SEP> (6.5) <SEP> (2.5) <SEP> (2.5) <SEP> (1.0)
<tb> Example <SEP> 10 <SEP> glucose <SEP> YES <SEP> 2.5 <SEP> 540 <SEP> 216 <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb><SEP> (0.8) <SEP> (6.5) <SEP> (2.0) <SEP> (2.5) <SEP> (0.9)]
<tb> Example <SEP> 11 <SEP> glucose <SEP> YES <SEP> 2,8 <SEP> 504 <SEP> 180 <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb><SEP> (2.0) <SEP> (6.5) <SEP> (3.1) <SEP> (2.4) <SEP> (0.8)
<tb> Example <SEP> 12 <SEP> glucose <SEP> YES <SEP> 3.9 <SEP> 581 <SEP> 149 <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb><SEP> (5.0) <SEP> (6.5) <SEP> (4.4) <SEP> (2.7) <SEP> (0.6)
<tb> Control <SEP> B <SEP> - <SEP> NO <SEP> 0.89 <SEP> 214 <SEP> 240 <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb><SEP> (-) <SEP> (1,0) <SEP> (1,0) <SEP> (1,0)
<tb> (Note) In all tests ATCC strain N 21060 and extract broth were used
of yeast as a basic culture medium.

EXEMPLES 13 à 16
Les résultats qui sont groupés dans le tableau V ont été obtenus par culture de la même manière que dans l'exemple 1, sauf qu'à la place du glucose on a employé comme source de carbone fermentable 0,4 % respectivement de maltose dans l'exemple 13, de mannose dans l'exemple 14, de saccharose dans l'exemple 15 et de lactose dans l'exemple 16.EXAMPLES 13 to 16
The results which are grouped in Table V were obtained by culture in the same manner as in Example 1, except that instead of glucose, 0.4% or maltose was used as the fermentable carbon source respectively. Example 13, mannose in Example 14, sucrose in Example 15 and lactose in Example 16.

De plus, pour leurs essais témoins ses- pectifs G, H, I et J, on opère la culture comme dans l'essai témoin A de l'exemple 1 mais en remplaçant le glucose respectivement par les sources de carbone ci-dessus, et le tableau reproduit aussi les résultats de l'essai témoin B de l'exemple 1 effectué sans source de carbone. In addition, for their G, H, I and J selective control trials, culture was performed as in control test A of Example 1 but replacing glucose with the above carbon sources, respectively, and the table also reproduces the results of the control test B of Example 1 carried out without a carbon source.

Dans l'exécution conforme à la présente invention, avec l'une quelconque des sources de carbone ci-dessus, la multiplication cellulaire augmente notablement et de plus on peut obtenir d'excellentes cellules bactériennes en ce qui concerne la production de SLS aussi bien que leur activité antitumorale. Par ailleurs, en présence de la source de carbone mais sans réglage du pH, la multiplication cellulaire augmente sans doute à un certain degré mais la production de SLS et l'activité antitumorale sont notablement réduites, voirmême supprimées. In the embodiment according to the present invention, with any of the above carbon sources, cell multiplication increases noticeably and furthermore excellent bacterial cells can be obtained with regard to the production of SLS as well as their antitumour activity. Moreover, in the presence of the carbon source but without pH adjustment, cell multiplication probably increases to a certain degree but SLS production and antitumor activity are significantly reduced, even suppressed.

(Voir tableau V page suivante) TABLEAU

(See Table V on the next page) TABLE

Conditions <SEP> Source <SEP> de <SEP> Ajuste- <SEP> Multipli- <SEP> Production <SEP> Production <SEP> Activité <SEP> antitumorale
<tb> et <SEP> carbone <SEP> ment <SEP> du <SEP> cation <SEP> SLS <SEP> par <SEP> SLS <SEP> par <SEP> uni- <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> souris <SEP> survi
Résultats <SEP> (Concen- <SEP> pH <SEP> cellulai- <SEP> unité <SEP> du <SEP> té <SEP> de <SEP> con- <SEP> vantes
<tb> <SEP> tration <SEP> (pH) <SEP> re <SEP> milieu <SEP> de <SEP> centration <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> souris <SEP> testées
<tb> Essais <SEP> %) <SEP> (DO660) <SEP> culture <SEP> cellulaire
<tb> <SEP> rapport) <SEP> (UH/ml) <SEP> (UH/DO660) <SEP> Après <SEP> 20 <SEP> Après <SEP> 30
<tb> <SEP> (rpport) <SEP> (rapport) <SEP> jours <SEP> jours
<tb> Exemple <SEP> 13 <SEP> maltose <SEP> OUI <SEP> 2,6 <SEP> 785 <SEP> 302 <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb> <SEP> (0,4) <SEP> (6,5) <SEP> (2,9) <SEP> (3,7) <SEP> (1,6)
<tb> Témoin <SEP> G <SEP> maltose <SEP> NON <SEP> 1,4 <SEP> 210 <SEP> 150 <SEP> 3/5 <SEP> 2/5
<tb> <SEP> (0,4) <SEP> (1,6) <SEP> (1,0) <SEP> (0,6)
<tb> Exemple <SEP> 14 <SEP> mennose <SEP> OUI <SEP> 2,2 <SEP> 475 <SEP> 216 <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb> <SEP> (0,4) <SEP> (6,5) <SEP> (2,5) <SEP> (2,2) <SEP> (0,9)
<tb> Témoin <SEP> H <SEP> mannose <SEP> NON <SEP> 1,2 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> 1/5 <SEP> 0/5
<tb> <SEP> (0,4) <SEP> (1,3) <SEP> ( < <SEP> 0,02) <SEP> ( < <SEP> 0,02)
<tb> Exemple <SEP> 15 <SEP> saccharo- <SEP> OUI <SEP> 2,6 <SEP> 624 <SEP> 240 <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb> <SEP> se
<tb> <SEP> (0,4) <SEP> (6,5) <SEP> (2,9) <SEP> (2,9) <SEP> (1,0)
<tb> Témoin <SEP> I <SEP> Saccharo- <SEP> NON <SEP> 1,3 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> 0/5 <SEP> 0/5
<tb> <SEP> se
<tb> <SEP> (0,4) <SEP> (1,5) <SEP> ( < <SEP> 0,02) <SEP> ( < <SEP> 0,02)
<tb> (suite du tableau V page suivnte) TABLEAU V (suite et fin)

Conditions <SEP> Source <SEP> of <SEP> Adjustment- <SEP> Multipli- <SEP> Production <SEP> Production <SEP> Activity <SEP> Antitumor
<tb> and <SEP> carbon <SEP><SEP> of the <SEP> cation <SEP> SLS <SEP> by <SEP> SLS <SEP> by <SEP> uni- <SEP> Number <SEP> of <SEP> mouse <SEP> survived
<SEP>SEP><SEP>SEP><SEP>SEP><SEP> SEP <SEP> SEP results
<tb><SEP> tration <SEP> (pH) <SEP> re <SEP> environment <SEP> of <SEP> centration <SEP> Number <SEP> of <SEP>SEP> mice tested
<tb> Assays <SEP>%) <SEP> (DO660) <SEP> cell culture <SEP>
<tb><SEP> ratio <SEP> (UH / ml) <SEP> (UH / DO660) <SEP> After <SEP> 20 <SEP> After <SEP> 30
<tb><SEP> (report) <SEP> (report) <SEP> days <SEP> days
<tb> Example <SEP> 13 <SEP> maltose <SEP> YES <SEP> 2,6 <SEP> 785 <SEP> 302 <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb><SEP> (0.4) <SEP> (6.5) <SEP> (2.9) <SEP> (3.7) <SEP> (1.6)
<tb> Control <SEP> G <SEP> Maltose <SEP> NO <SEP> 1.4 <SEP> 210 <SEP> 150 <SEP> 3/5 <SEP> 2/5
<tb><SEP> (0.4) <SEP> (1.6) <SEP> (1.0) <SEP> (0.6)
<tb> Example <SEP> 14 <SEP> mennose <SEP> YES <SEP> 2,2 <SEP> 475 <SEP> 216 <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb><SEP> (0.4) <SEP> (6.5) <SEP> (2.5) <SEP> (2.2) <SEP> (0.9)
<tb> Control <SEP> H <SEP> Mannose <SEP> NO <SEP> 1,2 <SEP><<SEP> 4 <SEP><<SEP> 4 <SEP> 1/5 <SEP> 0/5
<tb><SEP> (0.4) <SEP> (1.3) <SEP>(<<SEP> 0.02) <SEP>(<SEP> 0.02)
<tb> Example <SEP> 15 <SEP> saccharo- <SEP> YES <SEP> 2,6 <SEP> 624 <SEP> 240 <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb><SEP> se
<tb><SEP> (0.4) <SEP> (6.5) <SEP> (2.9) <SEP> (2.9) <SEP> (1.0)
<tb> Control <SEP> I <SEP> Saccharo- <SEP> NO <SEP> 1,3 <SEP><<SEP> 4 <SEP><<SEP> 4 <SEP> 0/5 <SEP> 0 / 5
<tb><SEP> se
<tb><SEP> (0.4) <SEP> (1.5) <SEP>(<<SEP> 0.02) <SEP>(<<SEP> 0.02)
<tb> (continued from Table V following page) TABLE V (continued and end)

Conditions <SEP> Source <SEP> de <SEP> Ajuste- <SEP> Multipli- <SEP> Production <SEP> Production <SEP> Activité <SEP> antitumorale
<tb> et <SEP> carbone <SEP> ment <SEP> du <SEP> cation <SEP> SLS <SEP> par <SEP> SLS <SEP> par <SEP> uni- <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> souris <SEP> survi
Résultats <SEP> (Concen- <SEP> pH <SEP> cellulai- <SEP> unité <SEP> du <SEP> té <SEP> de <SEP> con- <SEP> vantes
<tb> <SEP> tration <SEP> (pH) <SEP> re <SEP> milieu <SEP> de <SEP> centration <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> souris <SEP> testées
<tb> Essais <SEP> %) <SEP> (DO660) <SEP> culture <SEP> cellulaire
<tb> <SEP> rapport) <SEP> (UH/ml) <SEP> (UH/DO660) <SEP> Après <SEP> 20 <SEP> Après <SEP> 30
<tb> <SEP> (rpport) <SEP> (rapport) <SEP> jours <SEP> jours
<tb> Exemple <SEP> 16 <SEP> lactose <SEP> OUI <SEP> 2,3 <SEP> 580 <SEP> 252 <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb> <SEP> (0,4) <SEP> (6,5) <SEP> (2,6) <SEP> (2,7) <SEP> (1,1)
<tb> Témoin <SEP> J <SEP> lactose <SEP> NON <SEP> 1,2 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> < <SEP> 4 <SEP> 0/3 <SEP> 0/5
<tb> <SEP> (0,4) <SEP> (1,3) <SEP> ( < <SEP> 0,02) <SEP> ( < <SEP> 0,02)
<tb> Témoin <SEP> B <SEP> - <SEP> NON <SEP> 0,89 <SEP> 214 <SEP> 240 <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb> <SEP> (-) <SEP> (1,0) <SEP> (1,0) <SEP> (1,0)
<tb> (Note) Dans tous les essais on a utilisé la souche ATCC N 21060 et le bouillon d'extrait
de levure comme milieu de culture de base. Conditions <SEP> Source <SEP> of <SEP> Adjustment- <SEP> Multipli- <SEP> Production <SEP> Production <SEP> Activity <SEP> Antitumor
<tb> and <SEP> carbon <SEP><SEP> of the <SEP> cation <SEP> SLS <SEP> by <SEP> SLS <SEP> by <SEP> uni- <SEP> Number <SEP> of <SEP> mouse <SEP> survived
<SEP>SEP><SEP>SEP><SEP>SEP><SEP> SEP <SEP> SEP results
<tb><SEP> tration <SEP> (pH) <SEP> re <SEP> environment <SEP> of <SEP> centration <SEP> Number <SEP> of <SEP>SEP> mice tested
<tb> Assays <SEP>%) <SEP> (DO660) <SEP> cell culture <SEP>
<tb><SEP> ratio <SEP> (UH / ml) <SEP> (UH / DO660) <SEP> After <SEP> 20 <SEP> After <SEP> 30
<tb><SEP> (report) <SEP> (report) <SEP> days <SEP> days
<tb> Example <SEP> 16 <SEP> Lactose <SEP> YES <SEP> 2,3 <SEP> 580 <SEP> 252 <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb><SEP> (0.4) <SEP> (6.5) <SEP> (2.6) <SEP> (2.7) <SEP> (1.1)
<tb> Control <SEP> J <SEP> Lactose <SEP> NO <SEP> 1,2 <SEP><<SEP> 4 <SEP><<SEP> 4 <SEP> 0/3 <SEP> 0/5
<tb><SEP> (0.4) <SEP> (1.3) <SEP>(<<SEP> 0.02) <SEP>(<SEP> 0.02)
<tb> Control <SEP> B <SEP> - <SEP> NO <SEP> 0.89 <SEP> 214 <SEP> 240 <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb><SEP> (-) <SEP> (1,0) <SEP> (1,0) <SEP> (1,0)
<tb> (Note) In all tests ATCC strain N 21060 and extract broth were used
of yeast as a basic culture medium.

EXEMPLES 17 et 18
Les résultats du tableau VI ont été obtenus par culture de la même manière que dans l'exemple 1, sauf que l'extrait de levure employé dans cet exemple comme milieu de culture de base a été remplacé dans l'exemple 17 par un bouillon de polypeptone (préparé par ajustement à pH 7,2 - 7,4 de 1000 ml d'une solution aqueuse de 5 g de peptone (BBL), 5 g d'extrait de levure et 5 g de chlorure de sodium et stérilisation à 1200C pendant 20 minutes), et dans l'exemple 18 par un bouillon de peptone de soja préparé par ajustement à pH 7,2-7,4 de 1000 mi d'une solution aqueuse de 30 g de peptone (BBL), puis stérilisation à 1200C pendant 20 minutes.EXAMPLES 17 and 18
The results of Table VI were obtained by culture in the same manner as in Example 1, except that the yeast extract employed in this example as a basic culture medium was replaced in Example 17 by a broth of polypeptone (prepared by adjusting pH 7.2 - 7.4 of 1000 ml of an aqueous solution of 5 g of peptone (BBL), 5 g of yeast extract and 5 g of sodium chloride and sterilization at 1200C for 20 minutes), and in Example 18 by a soy peptone broth prepared by adjusting to pH 7.2-7.4 1000 ml of an aqueous solution of 30 g of peptone (BBL), then sterilization at 1200C for 20 minutes.

Le tableau VI donne aussi les résultats de cultures effectuées comme dans l'essai témoin B de l'exemple 1 mais avec le bouillon de polypeptone (témoin K) et le bouillon de peptone de soja (témoin L) à la place du bouillon d'extrait de levure à 5 %. Table VI also gives the results of cultures carried out as in the control test B of Example 1 but with the polypeptone broth (control K) and the peptone broth of soy (control L) instead of the broth of yeast extract at 5%.

(Voir tableau VI page suivante) TABLEAU VI

(See Table VI on the next page) TABLE VI

Conditions <SEP> Milieu <SEP> Source <SEP> Ajuste- <SEP> Multipli- <SEP> Production <SEP> Production <SEP> Activité <SEP> antiet <SEP> de <SEP> de <SEP> car- <SEP> ment <SEP> du <SEP> cation <SEP> SLS <SEP> par <SEP> uni- <SEP> SLS <SEP> par <SEP> uni- <SEP> tumorale
<tb> Résultats <SEP> culture <SEP> bone <SEP> pH <SEP> celluaire <SEP> té <SEP> du <SEP> milieu <SEP> té <SEP> de <SEP> concen- <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> souris
<tb> <SEP> de <SEP> (concen- <SEP> (pH) <SEP> (DO660) <SEP> de <SEP> culture <SEP> tration <SEP> cellu- <SEP> survivantes
<tb> Essais <SEP> base <SEP> tration <SEP> (rapport) <SEP> (UM/ml) <SEP> laire <SEP> (UH/DO660) <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> souris
<tb> <SEP> %) <SEP> (rapport) <SEP> (rapport) <SEP> testées
<tb> <SEP> Après <SEP> 20 <SEP> Après <SEP> 30
<tb> <SEP> jours <SEP> jours
<tb> Exemple <SEP> 17 <SEP> Bouillon <SEP> glucose <SEP> OUI <SEP> 2,3 <SEP> 685 <SEP> 298 <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb> <SEP> de <SEP> poly- <SEP> (0,4) <SEP> (6,5) <SEP> (4,8) <SEP> (5,4) <SEP> (1,1)
<tb> <SEP> peptona
<tb> Témoin <SEP> K <SEP> Bouillon <SEP> - <SEP> NON <SEP> 0,48 <SEP> 126 <SEP> 262 <SEP> 5/5 <SEP> 4/5
<tb> <SEP> de <SEP> poly- <SEP> (-) <SEP> (1,0) <SEP> (1,0) <SEP> (1,0)
<tb> <SEP> peptone
<tb> Exemple <SEP> 28 <SEP> Bouillon <SEP> glucose <SEP> OUI <SEP> 2,4 <SEP> 643 <SEP> 268 <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb> <SEP> de <SEP> pep
<SEP> tone <SEP> de <SEP> (0,5) <SEP> (6,5) <SEP> (2,5) <SEP> (40,1) <SEP> (16,8)
<tb> <SEP> sojax
<tb> Témoin <SEP> L <SEP> Bouillon <SEP> - <SEP> NON <SEP> 0,96 <SEP> 16 <SEP> 16 <SEP> 1/5 <SEP> 0,5
<tb> <SEP> de <SEP> pep
<SEP> tone <SEP> de <SEP> (-) <SEP> 1,0) <SEP> (1,0) <SEP> (1,0)
<tb> <SEP> soja <SEP> *
<tb> (Notess) (1) * Ce bouillon de peptone de soja contient environ 0,4 % de sucre réducteur.Conditions <SEP> Medium <SEP> Source <SEP> Adjustment- <SEP> Multipli- <SEP> Production <SEP> Production <SEP> Activity <SEP> antiet <SEP> of <SEP> of <SEP> Car- <SEP ><SEP> of the <SEP> cation <SEP> SLS <SEP> by <SEP> uni- <SEP> SLS <SEP> by <SEP> uni- <SEP> tumor
<tb> Results <SEP> culture <SEP> bone <SEP> pH <SEP> cell type <SEP> t <SEP> of <SEP> medium <SEP> t <SEP> of <SEP> concentration <SEP> Number <SEP> of <SEP> mice
<tb><SEP> of <SEP>(<sep>SEP>SEP>SEP><SEP>SEP><SEP> Concentration <SEP><SEP> Cell Cells <SEP>
<tb> Tests <SEP> base <SEP> treatment <SEP> (report) <SEP> (UM / ml) <SEP> laire <SEP> (UH / DO660) <SEP> Number <SEP> of <SEP> mice
<tb><SEP>%)<SEP> (report) <SEP> (report) <SEP> tested
<tb><SEP> After <SEP> 20 <SEP> After <SEP> 30
<tb><SEP> days <SEP> days
<tb> Example <SEP> 17 <SEP> Broth <SEP> glucose <SEP> YES <SEP> 2,3 <SEP> 685 <SEP> 298 <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb><SEP> of <SEP> poly- <SEP> (0.4) <SEP> (6.5) <SEP> (4.8) <SEP> (5.4) <SEP> (1, 1)
<tb><SEP> peptona
<tb> Control <SEP> K <SEP> Broth <SEP> - <SEP> NO <SEP> 0.48 <SEQ> 126 <SEP> 262 <SEP> 5/5 <SEP> 4/5
<tb><SEP> of <SEP> poly- <SEP> (-) <SEP> (1.0) <SEP> (1.0) <SEP> (1.0)
<tb><SEP> peptone
<tb> Example <SEP> 28 <SEP> Broth <SEP> glucose <SEP> YES <SEP> 2,4 <SEP> 643 <SE> 268 <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb><SEP> of <SEP> pep
<SEP> tone <SEP> of <SEP> (0.5) <SEP> (6.5) <SEP> (2.5) <SEP> (40.1) <SEP> (16.8)
<tb><SEP> sojax
<tb> Control <SEP> L <SEP> Broth <SEP> - <SEP> NO <SEP> 0.96 <SEP> 16 <SEP> 16 <SEP> 1/5 <SEP> 0.5
<tb><SEP> of <SEP> pep
<SEP> tone <SEP> of <SEP> (-) <SEP> 1.0) <SEP> (1.0) <SEP> (1.0)
<tb><SEP> soybean <SEP> *
<tb> (Notess) (1) * This soy peptone broth contains about 0.4% reducing sugar.

(2) Dans tous les essais on a utilisé la souche ATCC N 21060. (2) In all tests ATCC strain N 21060 was used.

Avec le bouillon de polypeptone et le bouillon de peptone de soja, dans l'exécution conforme à la présente invention la modification cellulaire augmente respectivement de 4,8 fois et de 2,5 fois par rapport à la culture au repos sans glucose (témoins et L), et la production de SLS et l'activité antitumorale sont meilleures. With the polypeptone broth and the soy peptone broth, in the embodiment according to the present invention, the cellular change increases by 4.8 and 2.5 times respectively relative to the resting culture without glucose (controls and L), and the production of SLS and antitumor activity are better.

Dans l'essai témoin L, la production de
SLS est abaissée bien que l'on n'ait pas ajouté de glucose, le sucre fermentable originellement contenu en très forte proportion dans la peptone de soja étant considéré comme responsable de ce résultat.In the control test L, the production of
SLS is lowered even though no glucose has been added, the fermentable sugar originally contained in very high proportion in the soy peptone being considered responsible for this result.

EXEMPLE 19
Les résultats du tableau VII ci-après ont été obtenus par culture de la même manière que dans l'exemple 18, avec la meme peptone de soja que dans cet exemple mais sans addition de glucose.EXAMPLE 19
The results of Table VII below were obtained by culture in the same manner as in Example 18, with the same soy peptone as in this example but without the addition of glucose.

Les résultats de L'vessai témoin L du tableau
VI sont également indiqués à titre comparatif.The results of the control bladder L of the table
VI are also indicated for comparison.

(Voir tableau VII page suivante) TABLEAU VII

(See Table VII on the next page) TABLE VII

Conditions <SEP> Milieu <SEP> Source <SEP> Ajuste- <SEP> Multipli- <SEP> Production <SEP> Production <SEP> Activité <SEP> antiet <SEP> de <SEP> de <SEP> car- <SEP> ment <SEP> du <SEP> cation <SEP> SLS <SEP> par <SEP> uni- <SEP> SLS <SEP> par <SEP> uni- <SEP> tumorale
<tb> Résultats <SEP> culture <SEP> bone <SEP> pH <SEP> celluaire <SEP> té <SEP> du <SEP> milieu <SEP> té <SEP> de <SEP> concen- <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> souris
<tb> <SEP> de <SEP> (concen- <SEP> (pH) <SEP> (DO660) <SEP> de <SEP> culture <SEP> tration <SEP> cellu- <SEP> survivantes
<tb> Essais <SEP> base <SEP> tration <SEP> (rapport) <SEP> (UM/ml) <SEP> laire <SEP> (UH/DO660) <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> souris
<tb> <SEP> %) <SEP> (rapport) <SEP> (rapport) <SEP> testées
<tb> <SEP> Après <SEP> 20 <SEP> Après <SEP> 30
<tb> <SEP> jours <SEP> jours
<tb> Exemple <SEP> 19 <SEP> Souillon <SEP> - <SEP> OUI <SEP> 1,2 <SEP> 312 <SEP> 260 <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb> <SEP> de <SEP> pep
<SEP> tone <SEP> de <SEP> (-) <SEP> (6,5) <SEP> (1,3) <SEP> (19,5) <SEP> (16,3)
<tb> <SEP> soha <SEP> #
<tb> Témoin <SEP> L <SEP> Bouillon <SEP> - <SEP> NON <SEP> 0,96 <SEP> 16 <SEP> 16 <SEP> 1/5 <SEP> 0/5
<tb> <SEP> de <SEP> pep
<SEP> tone <SEP> de <SEP> (-) <SEP> (1,0) <SEP> (1,0) <SEP> (1,0)
<tb> <SEP> soja <SEP> *
<tb> (Notes) (1) * Ce couillon de peptone de soja contient environ 0,4 % de sucre réducteur.Conditions <SEP> Medium <SEP> Source <SEP> Adjustment- <SEP> Multipli- <SEP> Production <SEP> Production <SEP> Activity <SEP> antiet <SEP> of <SEP> of <SEP> Car- <SEP ><SEP> of the <SEP> cation <SEP> SLS <SEP> by <SEP> uni- <SEP> SLS <SEP> by <SEP> uni- <SEP> tumor
<tb> Results <SEP> culture <SEP> bone <SEP> pH <SEP> cell type <SEP> t <SEP> of <SEP> medium <SEP> t <SEP> of <SEP> concentration <SEP> Number <SEP> of <SEP> mice
<tb><SEP> of <SEP>(<sep>SEP>SEP>SEP><SEP>SEP><SEP> Concentration <SEP><SEP> Cell Cells <SEP>
<tb> Tests <SEP> base <SEP> treatment <SEP> (report) <SEP> (UM / ml) <SEP> laire <SEP> (UH / DO660) <SEP> Number <SEP> of <SEP> mice
<tb><SEP>%)<SEP> (report) <SEP> (report) <SEP> tested
<tb><SEP> After <SEP> 20 <SEP> After <SEP> 30
<tb><SEP> days <SEP> days
<tb> Example <SEP> 19 <SEP> Slime <SEP> - <SEP> YES <SEP> 1,2 <SEP> 312 <SEP> 260 <SEP> 5/5 <SEP> 5/5
<tb><SEP> of <SEP> pep
<SEP> tone <SEP> of <SEP> (-) <SEP> (6.5) <SEP> (1.3) <SEP> (19.5) <SEP> (16.3)
<tb><SEP> soha <SEP>#
<tb> Control <SEP> L <SEP> Broth <SEP> - <SEP> NO <SEP> 0.96 <SEP> 16 <SEP> 16 <SEP> 1/5 <SEP> 0/5
<tb><SEP> of <SEP> pep
<SEP> tone <SEP> of <SEP> (-) <SEP> (1.0) <SEP> (1.0) <SEP> (1.0)
<tb><SEP> soybean <SEP> *
<tb> (Notes) (1) * This peptone of soy peptone contains about 0.4% reducing sugar.

D'après les résultats du tableau VII, on peut noter que dans le cas d'un milieu de culture de base contenant originellement des sources de carbone fermentables, on peut obtenir avec un bon rendement des cellules ayant un haut pouvoir de production de SLS ainsi qu'une bonne activité antitumorale, mais cela seulement en réglant le pH du milieu de culture
Une comparaison entre l'exemple 19 du tableau 7 et l'exemple 18 du tableau 6 montre que l'on peut obtenir de meilleurs résultats avec une addition supplémentaire de glucose, même dans le cas d'un milieu de culture de base contenant originellement des sources de carbone fermentables.From the results of Table VII, it can be noted that in the case of a basic culture medium initially containing fermentable carbon sources, cells having a high production capacity of SLS can be obtained in good yield. good antitumor activity, but only by regulating the pH of the culture medium
A comparison between Example 19 of Table 7 and Example 18 of Table 6 shows that better results can be obtained with additional glucose addition, even in the case of a basic culture medium originally containing fermentable carbon sources.

EXEMPLE 20
On mélange 500 ml d'un bouillon d'extrait de levure à 10 % (préparé par dissolution de 100 g d'extrait de levure dans 500 ml d'eau distillée, ajustement à pH 7,2 - 7,4 puis ébullition à 1000C pendant une heure, refroidissement dans de l'eau, filtration pour éliminer le précipité, nouvelle ébullition à 1000C pendant 30 minutes après avoir réajusté le p à 7,2 - 7,4, refroidissement à l'eau et filtration puis oomplément à 1000 ml dans une fiole) avec 500 mi d'une solution tampon de phosphate 300 mM à pH 7,3, on stérilise le mélange à 1200C pendant 20 minutes puis on lui ajoute une solution de glucose stérilisée pour avoir une teneur finale en glucose de 0,4 % par rapport à la quantité totale de la solution de culture, on inocule 50 ml (5 % V/V) d'une solution de culture de St. pyogenes ATCC NO 21060 préalablement cultivé dans le bouillon nutritif et on opère la culture au repos à 370C pendant 20 heures. Cette culture donne une multiplication bactérienne coreespondant à une DO660 de 2,2, ce qui environ 2,5 fois supérieur au résultat obtenu par la culture classique au repos qui aboutit à une DO660 de 0,89 (Témoin B). EXAMPLE 20
500 ml of a 10% yeast extract broth (prepared by dissolving 100 g of yeast extract in 500 ml of distilled water are added, adjustment to pH 7.2 - 7.4 then boiling at 1000 ° C. for one hour, cooling in water, filtering to remove the precipitate, boiling again at 1000C for 30 minutes after readjusting the p at 7.2-7.4, cooling with water and filtering then oomplément at 1000 ml in a flask) with 500 ml of a 300 mM phosphate buffer solution at pH 7.3, the mixture is sterilized at 1200C for 20 minutes and then a sterilized glucose solution is added to have a final glucose content of 0, 4% relative to the total amount of the culture solution, 50 ml (5% V / V) of an ATCC NO 21060 pyogenes culture solution previously cultured in the nutrient broth is inoculated and the culture is carried out at room temperature. stand at 370C for 20 hours. This culture gives a bacterial multiplication corre- sponding to an OD660 of 2.2, which is about 2.5 times higher than the result obtained by the conventional culture at rest which results in an OD660 of 0.89 (control B).

On obtient des valeurs élevées pour la production de SLSjaussi bien par unité de solution de culture (UH/ml) que par unité de concentration cellulaire (UH/DO660), valeurs qui sont respectivement de 466 et 212, et dans des essais d'activite antitumorale in vivo sur les préparations lyophilisées, toutes les souris examinées (un groupe de cinq souris) survivent 30 jours après une inoculation du carcinome ascitique d'Ehrlich par la voie intrapéritonéale. High values for the production of SLS are obtained as much per unit culture solution (UH / ml) as per unit cell concentration (UH / OD660), which are 466 and 212, respectively, and in activity tests. antitumor in vivo on lyophilized preparations, all mice examined (a group of five mice) survive 30 days after inoculation of Ehrlich ascites carcinoma by the intraperitoneal route.

Claims

1. A method of culturing Streptococcus pyogenes in a medium for the multiplication of bacterial cells endowed with antitumor activity, characterized in that

(A) we operate in a medium of culture

fermentable carbon sources

and

(B) the pH of the medium is maintained at 5.6 or

more during the culture.

2. The process of claim 1, wherein the proportion of fermentable carbon sources is from 0.1 to 5%.

3. The process of claim 1, wherein the proportion of fermentable carbon sources is 0.1 to 2%.

4. The process of claim 1, wherein the proportion of fermentable carbon sources is 0.3 to 2%.

5. A process according to any one of claims 1 to 4 wherein the medium is maintained at a pH of 5.6 to 7.5 during cultivation.

6. A process according to any one of claims 1 to 4, wherein the medium is maintained at a pH of 6 to 7 during the cultivation.

7. A process according to any one of claims 1 to 6, wherein the fermentable carbon sources are fermentable carbohydrates.

The method of claim 7, wherein the fermentable carbohydrates are mono-holosides or fermentable di-holosides.

The process of claim 8 wherein the fermentable mono-holoside is glucose.

The process of claim 8 wherein the fermentable di-holoside is sucrose.

11. A process according to any one of claims 1, 2, 5 and 7, wherein the culture medium is prepared by adding 0.3 to 2% of fermentable carbon sources to a yeast extract broth.

12. A process according to any one of claims 1, 2, 5 and 7, wherein the culture medium is prepared by adding 0.1 to 1.5% of fermentable carbon sources to a soy peptone broth. .