FR2461719A2

FR2461719A2 - Anticoagulant heparin muco:polysaccharide fraction - with improved specificity produced by alcohol fractionation of heparin

Info

Publication number: FR2461719A2
Application number: FR7918873A
Authority: FR
Inventors: Jean-Claude Lormeau; Jean Goulay; Jean Choay
Original assignee: Choay SA
Current assignee: Choay SA
Priority date: 1979-07-20
Filing date: 1979-07-20
Publication date: 1981-02-06
Also published as: FR2461719B2

Abstract

New mucopolysaccharide fraction obtainable from fractions contg. heparin or heparin components with molecular weights of 2000-50000 is soluble in an az.-ethanolic medium with a titre of 55-61 degrees GL; tends to insolubility in an aq-ethanolic medium with higher alcohol content; is insol. in pure alcohol; and has a ratio of Yin-Wessler titre to USP titre of is not 2 (pref. is not 3, esp. >=6). The new fraction has an anticoagulant effect, but it is more selective than heparin in that it acts on a smaller number of coagulation factors (esp. activated factor X), so the risk of hypercoagulability is reduced and the need for patient monitoring is minimised.

Description

L'invention est relative à une fraction mucopolysaccharidique douée de propriétés biologiques, lui permettant notamment de jouer un rôle régulateur vis-à-vis de la coagulation sanguine. Une telle fraction peut notamment être obtenue à partir de préparations d'héparine, telles qu'extraites de tissus de mammifères. The invention relates to a mucopolysaccharide fraction endowed with biological properties, enabling it in particular to play a regulatory role with respect to blood coagulation. Such a fraction can in particular be obtained from heparin preparations, as extracted from mammalian tissues.

L'invention représente un développement de celle qui fait l'objet de la demande de brevet nO 78 31357 déposée le 6 novembre 1978. The invention represents a development of that which is the subject of the patent application No. 78 31357 filed November 6, 1978.

On rappellera que l'invention de la demande de brevet principal concerne, dans l'un de ses aspects, une fraction mucopolysaccharidique susceptible d'être obtenue à partir de l'héparine ou de fractions comportant des constituants hépariniques de poids moléculaires s'étageant notamment d'environ 2.000 à 50.000, tels qu'obtenus par extraction à partir de tissus de mammifères.La fraction de la demande de brevet principal est caractérisée en ce qu'elle est soluble dans un milieu hydro-alcoolique (eau-éthanol) ayant un titre de 55-61 GL, en ce qu'elle tend à l'insolubilité dans un milieu eau-éthanol ayant une teneur en alcool plus élevée, en ce qu'elle est insoluble dans l'alcool pur, et en ce qu'elle présente un titre Yin-Wessler et un titre USP qui sont respectivement dans un rapport au moins égal à 2, notamment d'au moins 3, de préférence supérieur à 6. It will be recalled that the invention of the main patent application concerns, in one of its aspects, a mucopolysaccharide fraction that can be obtained from heparin or fractions comprising heparinic constituents of molecular weight ranging in particular from from about 2,000 to 50,000, as obtained by extraction from mammalian tissue.The fraction of the main patent application is characterized in that it is soluble in an aqueous-alcoholic medium (water-ethanol) having a 55-61 GL, in that it tends to insolubility in a water-ethanol medium having a higher alcohol content, insoluble in pure alcohol, and in that has a Yin-Wessler title and a USP title which are respectively in a ratio of at least 2, in particular of at least 3, preferably greater than 6.

Ces fractions mucopolysaccharidiques donnent lieu à des fractionnements supplémentaires, permettant l'obtention de fractions mucopolysaccharidiques de haute activité spécifique, au niveau du titre Yin-Wessler et présentant des rapports du titre Yin-Wessler au titre USP dépassant 10, voire 16. These mucopolysaccharide fractions give rise to additional fractionations, making it possible to obtain mucopolysaccharide fractions of high specific activity at the level of the Yin-Wessler titre and having Yin-Wessler titration ratios with a USP titre exceeding 10 or even 16.

Le titre de Yin-Wessler est mesuré selon la techni- que de ces auteurs qui est décrite dans 1J. Lab. Clin. Med.", 1976, 81, 298-300. The title of Yin-Wessler is measured according to the technique of these authors which is described in 1J. Lab. Clin. Med., 1976, 81, 298-300.

De meme, le titre USP, qui mesure, de façon en soi connue, une intensite de coagulation globale dans des conditions bien déterminées, est bien connu. Pour mémoire, il a été mis en oeuvre de la façon décrite dans la Pharmacopée des Etats-Unis XIX, pp. 229-230 (voir aussi le Second Supplément USP-NF, p. 62, et le Quatrième Supplément USP-NF, page 90, respectivement intitulés "Drug Substances and
Dosage Forms" (substances médicamenteuses et modes de dosage)).Similarly, the USP title, which measures, in a known manner, an overall coagulation intensity under specific conditions, is well known. For the record, it has been carried out as described in the United States Pharmacopoeia XIX, pp. 229-230 (see also USP-NF Second Supplement, page 62, and USP-NF Fourth Supplement, page 90, respectively, entitled "Drug Substances and
Dosage Forms "(drug substances and dosing modes)).

L'invention de la demande de brevet principal four-nit donc un principe actif particulièrement intéressant par la capacité qu'il a d'inhiber le facteur Xa de façon qui peut être très sélective, capacité qui contraste avec son activité sur la coagulation globale, laquelle peut être maintenue à un niveau très faible. The invention of the main patent application thus furnishes an active ingredient that is particularly interesting because of its ability to inhibit factor Xa in a manner that can be very selective, a capacity that contrasts with its activity on global coagulation. which can be kept at a very low level.

Cette fraction mucopolysaccharidique constitue un principe actif de médicament anticoagulant particulièrement avantageux, dans la mesure où l'on peut à ce JOur admettre que l'inhibition préférentielle d'un facteur activé, intervenant à un stade plus proche de la thrombinoformation, pratiquement en aval et à l'intersection des voies intrinsèque et extrinsèque, est susceptible d'assurer une protection contre les risques d'hypercoagulabilité, équivalente à celle procurée par l'héparine couramment utilisée en thérapeutique, sans cependant, en raison de cette sélectivité d'action, entraîner les mêmes risques hémorragiques que ceux de l'héparine classique.Celle-ci est en effet apte à inhiber non seulement le facteur Xa, mais également d'autres facteurs intervenant tant en amont qu'en aval de celui-ci, à d'autres stades des voies de coagulation, par exemple le facteur IIa. This mucopolysaccharide fraction constitutes a particularly advantageous anticoagulant drug active principle, insofar as it can be assumed that preferential inhibition of an activated factor, occurring at a stage closer to thrombinoformation, substantially downstream and at the intersection of the intrinsic and extrinsic pathways, is likely to provide protection against the risks of hypercoagulability, equivalent to that provided by the heparin commonly used in therapy, without, however, because of this selectivity of action, cause the same haemorrhagic risks as those of classical heparin.This is indeed able to inhibit not only the factor Xa, but also other factors intervening both upstream and downstream thereof, to other stages of the coagulation pathways, eg factor IIa.

On conçoit que le rééquilibrage in vivo du système de coagulation et de fibrinolyse, lorsque celui-ci tend à se déséquilibrer sous l'effet d'une cause pathologique ou d'une intervention extérieure, par exemple chirurgicale, soit plus facile à réaliser avec un médicament agissant sélectivement sur un facteur spécifique, le facteur X, plus particulièrement au niveau de l'inhibition du facteur Xa, qu'avec un médicament susceptible d'agir de façon non différenciée sur plusieurs facteurs de coagulation à la fois.It is conceivable that the in vivo rebalancing of the coagulation and fibrinolysis system, when it tends to become unbalanced under the effect of a pathological cause or an external intervention, for example surgical, is easier to achieve with a A drug that selectively acts on a specific factor, factor X, more particularly at the level of factor Xa inhibition, than with a drug that can act undifferentially on several coagulation factors at a time.

La demande de brevet principal définit également un procédé pour obtenir une telle fraction mucopolysaccharidique, ce procédé étant caractérisé par - la mise en suspension dans un milieu hydro-alcoolique du
type eau-éthanol, ayant un titre compris entre environ 55
et environ 610 GL, de préférence de l'ordre de 580 GL,
d'une matière à base d'héparine ou de constituants hépari
niques dont les poids moléculaires s'étagent notamment de
2.000 à 50.000, cette matière ayant une teneur réduite en
sels minéraux, de préférence inférieure à 1 % en poids, - la séparation de la fraction insoluble et la récupération
de la solution contenant la fraction mucopolysaccharidique
dissoute, dont elle peut à son tour etre séparée, notam
ment par précipitation alcoolique, à partir du susdit mi
lieu hydro-alcoolique.The main patent application also defines a process for obtaining such a mucopolysaccharide fraction, this process being characterized by the suspension in a hydro-alcoholic medium of
type water-ethanol, having a title between about 55
and about 610 GL, preferably of the order of 580 GL,
of a heparin-based material or heparin constituents
whose molecular weights range from
2,000 to 50,000, this material having a reduced content of
mineral salts, preferably less than 1% by weight, - the separation of the insoluble fraction and the recovery
of the solution containing the mucopolysaccharide fraction
dissolved, of which it can in turn be separated,
by alcoholic precipitation, from the above mentioned
hydro-alcoholic place.

La matière première, à partir de laquelle le mucopolysaccharide selon l'invention peut être extrait, peut être constituée par une héparine de qualité pharmaceutique classique, injectable, ou par une héparine brute telle qu'elle est obtenue à l'issue des opérations d'extraction de ce principe actif à partir de tissus ou d'organes de mammifères, notamment de mucus d'intestins ou de poumons, par exemple de porc ou de boeuf. Elle peut encore être constituée par les fractions qui sont normalement écartées (produits de rejet) lors de la purification d'une telle héparine brute, en vue de l'obtention d'une héparine de qualité injectable et d'activité spécifique plus élevée, à condition bien entendu que les produits de rejet de moindre activité spécifique contiennent encore des constituants hépariniques. The raw material, from which the mucopolysaccharide according to the invention can be extracted, may be constituted by a conventional pharmaceutical grade heparin, injectable, or by a raw heparin such as is obtained at the end of the operations of extraction of this active ingredient from tissues or organs of mammals, including mucus of the intestines or lungs, for example pork or beef. It can also be constituted by the fractions which are normally discarded (rejects) during the purification of such a crude heparin, with a view to obtaining a heparin of injectable quality and higher specific activity, to however, it is understood that the rejection products with less specific activity still contain heparinic constituents.

Il est alors possible, à partir de matières premières de ce type, sensiblement exemptes de protéines, d'acides nucléiques et de sels minéraux, de préférence lorsque des teneurs pondérales de ces derniers sont inférieures à 1 %, d'obtenir par extraction à l'alcool 55-610 GL une fraction mucopolysaccharidique contenant des constituants de faibles poids moléculaires, dont les titres Yin-Wessler et USP sont dans un rapport d'environ 2 à environ 5, notamment de 3 à 5. It is then possible, from raw materials of this type, substantially free of proteins, nucleic acids and inorganic salts, preferably when their weight contents are less than 1%, to obtain by extraction with Alcohol 55-610 GL a mucopolysaccharide fraction containing low molecular weight constituents, Yin-Wessler and USP titers are in a ratio of about 2 to about 5, especially 3 to 5.

La demande de brevet principal a également déjà défini des variantes de procédé supplémentaires permettant un enrichissement supplémentaire des fractions traitées en un "produit de fractionnement", dont les titres Yin-Wessler et
USP sont dans un rapport encore plus élevé.The main patent application has also already defined additional process variants allowing further enrichment of the treated fractions into a "fractionation product", including Yin-Wessler and
USP are in an even higher ratio.

Selon l'une de ces variantes, on procède à des fractionnements supplémentaires de la fraction mucopolysaccharidique obtenue à l'issue du procédé sus-décrit, par diverses techniques, telles que gel-filtration ou encore précipitation sélective dans un milieu hydro-alcoolique de titre déterminé, en présence de proportions également déterminées d'un sel minéral, tel que le chlorure de sodium. According to one of these variants, the mucopolysaccharide fraction obtained at the end of the above-described process is further fractionated by various techniques, such as gel-filtration or selective precipitation in a hydro-alcoholic title medium. determined, in the presence of also determined proportions of a mineral salt, such as sodium chloride.

Un fractionnement supplémentaire peut être obtenu par une étape supplémentaire appliquée à ladite fraction mucopolysaccharidique, préalablement remise en solution dans l'eau, étape qui consiste à ajouter à cette solution aqueuse de 1 à 2 volumes d'éthanol et de 10 à 100 g/l de chlorure de sodium et à recueillir, d'une part, le précipité formé également actif et, d'autre part, le contenu restant dissous dans le surnageant, notamment par une nouvelle précipitation alcoolique, et qui constitue un produit de fractionnement dont les titres Yin-Wessler et UMP respectivement sont dans un rapport encore plus élevé que celui relatif à la fraction. Additional fractionation can be obtained by an additional step applied to said mucopolysaccharide fraction, previously redissolved in water, which step consists in adding to this aqueous solution of 1 to 2 volumes of ethanol and 10 to 100 g / l of sodium chloride and to collect, on the one hand, the precipitate formed equally active and, on the other hand, the content remaining dissolved in the supernatant, in particular by a new alcoholic precipitation, and which constitutes a fractionation product whose titers Yin-Wessler and UMP respectively are in a ratio even higher than that relative to the fraction.

initiale, notamment passent d'une valeur de l'ordre de 3 à une valeur de l'ordre de 6 à 8.initially, in particular pass from a value of the order of 3 to a value of the order of 6 to 8.

Selon une autre de ces variantes du procédé selon l'invention, on a obtenu des fractions mucopolysaccharidiques ayant un rapport de titres Yin-Wessler/USP plus élevé par gel-filtration à partir des fractions de première extraction par le milieu hydro-alcoolique 55-61 GL, après remise en solution préalable dans un solvant aqueux, telle qu'une solution NaCl 0,5 M ; tris-HCl 0,1 M ; pH 7,5. Une telle solution peut être passée sur un gel de polyacrylamide et d'agarose, sous forme de perles, sous la désignation commerciale ULTROGEL AcA 44, dont la zone de fractionnement effectif se situe entre des'poids moléculaires effectifs de 4.000 à 60.000 (pour les molécules linéaires). According to another of these variants of the process according to the invention, mucopolysaccharide fractions having a higher ratio of Yin-Wessler / USP titers by gel-filtration were obtained from the first extraction fractions by the hydroalcoholic medium. 61 GL, after resuspension in an aqueous solvent, such as a 0.5M NaCl solution; 0.1 M tris-HCl; pH 7.5. Such a solution can be passed on a polyacrylamide and agarose gel, in the form of beads, under the trade name ULTROGEL AcA 44, whose effective fractionation zone is between effective molecular weights of 4,000 to 60,000 (for linear molecules).

Des fractions mucopolysaccharidiques selon l'invention de la demande de brevet principal , qui ont un rapport de titres Yin-Wessler/USP plus élevé, sont donc encore celles qui passent après élution d'un volume de 2,5 litres, volume mort non compris (le volume mort étant le volume de liquide que peut contenir la colonne de gel, notamment dans les espaces interstitiels entre grains de gel), lorsque la gelfiltration est conduite, sous un débit de 200 ml/heure, dans une colonne ayant un diamètre de 100 mm et une hauteur de 1 m et lorsque la concentration en mucopolysaccharide et le volume de la solution placée sur la colonne ont été respectivement de 50 mg/ml et 37,5 ml. Les fractions les plus actives sont alors contenues dans les 1,5 litres qui passent ensuite. Mucopolysaccharide fractions according to the invention of the main patent application, which have a higher ratio of Yin-Wessler / USP securities, are therefore still those which pass after elution of a volume of 2.5 liters, excluding dead volume (the dead volume being the volume of liquid that can contain the gel column, especially in the interstitial spaces between grains of gel), when the gelfiltration is conducted, at a flow rate of 200 ml / hour, in a column having a diameter of 100 mm and a height of 1 m and when the concentration of mucopolysaccharide and the volume of the solution placed on the column were respectively 50 mg / ml and 37.5 ml. The most active fractions are then contained in the 1.5 liters that pass thereafter.

Le contenu des premiers 2,5 litres est en grande partie formé d'héparane-sulfates ou héparitine-sulfates, produits de poids moléculaires élevés et de forte viscosité, qui n'ont pas d'activité anticoagulante. The contents of the first 2.5 liters are largely heparan sulphates or heparitine sulphates, high molecular weight and high viscosity products, which have no anticoagulant activity.

Le passage d'une colonne à une autre colonne de meme longueurmais de section différente suppose la modification du volume de solution (de même concentration) à placer sur l'autre colonne, vis-à-vis du volume placé sur la précédente colonne, dans un rapport égal au carré de celui des sections (ou diamètres) de ces cplonnes, pour que les mêmes fractions soient obtenues dans un volume d'élution de l'autre colonne se trouvant lui aussi dans un rapport avec le volume d'élution correspondant de la précédente colonne sensiblement égal au carré du rapport desdites sections. The passage from one column to another column of the same length but of different section assumes the modification of the volume of solution (of the same concentration) to be placed on the other column, vis-à-vis the volume placed on the previous column, in a ratio equal to the square of that of the sections (or diameters) of these centes, so that the same fractions are obtained in an elution volume of the other column also in a ratio with the corresponding elution volume of the previous column substantially equal to the square of the ratio of said sections.

Enfin, comme on l'a également encore décrit dans la demande de brevet principal, il est possible d'obtenir à partir des fractions ayant des rapports de titres Yin/Wessler/
USP de l'ordre de 6 à 8, par des fractionnements supplementaires, notamment par gel-filtration ou analogue, des fractions mucopolysaccharidiques caractérisées par des rapports de titres Yin-Wessler/USP excédant 10, notamment de l'ordre de 13-16, et ayant des titres Yin-Wessler supérieurs à 130, notamment de 135-160 unités/mg.Finally, as also described in the main patent application, it is possible to obtain from fractions having Yin / Wessler /
USP of the order of 6 to 8, by additional fractionations, in particular by gel filtration or the like, mucopolysaccharide fractions characterized by Yin-Wessler / USP titration ratios exceeding 10, in particular of the order of 13-16, and having Yin-Wessler titers greater than 130, especially 135-160 units / mg.

Il est entendu que les indications de poids moléculaires qui. précèdent (et qui suivent, notamment dans les exemples) découlent des mesures de temps de rétention de solutions ayant une teneur déterminée de matière étudiée, dans des expériences de gel-perméation à travers une colonne de gel, dans des conditions d'élution également déterminées, les logarithmes de ces indications de poids moléculaire étant dans la même relation de proportionnalité vis-à-vis des temps de rétention mesurés susdits, que le sont ceux des poids moléculaires de 4.000, 6.500, 16.000 et 31.000 respectivement, de polystyrène-sulfonates de sodium étalons, notamment ceux commercialisés par la société dite CHROMPACK (Orsay-les-Ulis,
France), vis-à-vis de leurs temps de rétention respectifs, mesurés dans un système et sous des conditions de gelperméation identiques.It is understood that the molecular weight indications that. preceding (and which follow, in particular in the examples) result from measurements of retention time of solutions having a determined content of material studied, in gel-permeation experiments through a column of gel, under conditions of elution also determined , the logarithms of these molecular weight indications being in the same relationship of proportionality with respect to the above measured retention times, as are the molecular weights of 4,000, 6,500, 16,000 and 31,000 respectively, polystyrene sulphonates of sodium standards, especially those marketed by the company called CHROMPACK (Orsay-les-Ulis,
France), vis-à-vis their respective retention times, measured in a system and under identical gelperméation conditions.

L'invention se propose donc de fournir des fractions répondant davantage encore aux buts que la demanderesse s'était assignée dans la demande de brevet principal, à savoir fournir des principes actifs de médicaments (et les médicaments eux-mêmes) qui permettent de remédier au moins en partie à ces difficultés, notamment qui soient capables de permettre un rééquilibrage éventuel et/ou un contrôle plus aisé, au prix d'une moindre surveillance clinique du système coagulation-fibrinolyse chez des patients affectés d'une pathologie de la coagulation ou ayant subi un traitement, tel qu'une intervention chirurgicale, qui les expose à des risques dthypercoagulabilité. The invention therefore proposes to provide fractions which are even more suitable for the purposes which the applicant had set out in the main patent application, namely to provide active ingredients of medicaments (and the drugs themselves) which make it possible to remedy the problem. least in part to these difficulties, in particular which are capable of allowing a possible rebalancing and / or an easier control, at the price of a less clinical surveillance of the coagulation-fibrinolysis system in patients affected by a pathology of coagulation or having undergone treatment, such as surgery, which puts them at risk of hypercoagulability.

L'invention concerne des fractions mucopolysaccharidiques (cj-après désignées par la référence MPS) exerçant un effet régulateur à l'égard de la coagulation, notamment dans le sens d'un retard à la coagulation, par-la mise en jeu d'actions inhibitrices plus sélectives encore que celles des
MPS définies dans la demande de brevet principal, s'exerçant tout particulièrement à l'égard du facteur X activé.The invention relates to mucopolysaccharide fractions (hereinafter referred to as MPS) exerting a regulatory effect with respect to coagulation, in particular in the sense of a delay in coagulation, by the setting in motion of actions more selective inhibitors than those
MPS defined in the main patent application, exercising particularly with respect to the activated factor X.

L'invention est relative à une fraction mucopolysaccharidique purifiée susceptible d'être obtenue à partir de la fraction mucopolysaccharidique du brevet principal, celleci étant elle-même susceptible d'être obtenue à partir de l'héparine ou de fractions comportant des constituants hépariniques de poids moléculaires de 2.000 à 50.000, tels qu'ils sont susceptibles d'être obtenus par extraction à partir de tissus de mamifères, cette fraction étant caractérisée en ce qu'elle est soluble dans un milieu hydroalcoolique (eau-éthanol) ayant un titre de 55-610GL, en ce qu'elle tend à l'insolubilité dans un milieu eau-éthanol ayant une teneur en alcool plus élevée, en ce qu'elle est insoluble dans l'alcool pur, et en ce qu'elle présente un titre Yin-Wessler et un titre USP qui sont respectivement dans un rapport au moins égal à 2, notamment d'au moins 3, de préférence supérieur à 6. The invention relates to a purified mucopolysaccharide fraction which can be obtained from the mucopolysaccharide fraction of the main patent, which is itself capable of being obtained from heparin or from fractions comprising heparinic constituents of weight. molecular weight of 2,000 to 50,000, as they are obtainable by extraction from mammalian tissues, this fraction being characterized in that it is soluble in a hydroalcoholic medium (water-ethanol) having a titre of 55. -610GL, in that it tends to insolubility in a water-ethanol medium having a higher alcohol content, in that it is insoluble in pure alcohol, and in that it has a Yin titre Wessler and a USP title which are respectively in a ratio of at least 2, in particular of at least 3, preferably greater than 6.

La fraction de MPS de la présente invention peut plus particulièrement encore être obtenue à partir de l'une ou l'autre des fractions également décrites dans la demande de brevet principal et respectivement caractérisées - en eg aue~;dans une opération de gel-filtration sur colonne
de gel de polyacrylamide et d'agarose, sous forme de
perles, du type commercialisé sous la désignation
ULTROGEL AcA 44, cette fraction passe après élution d'un
volume de 2,5 litres, volume mort non compris, lorsque la
gel-filtration est conduite, sous un débit de 200 ml/
heure, dans une colonne ayant un diamètre de 100 mm et
une hauteur de 1 m et lorsque la concentration en muco
polysaccharides et le volume de la solution placée sur la
colonne ont été respectivement de 50 mg/ml et 37,5 ml,
l'essentiel de cette fraction étant notamment contenu dans
les 1,5 litres d'éluat qui passent ensuite ; - par un temps de rétention de l'ordre de 5,7 à 7,5, notam
ment de 6,6 à 7,0 minutes dans une colonne, dans un sys
tème de gel-perméation sur colonne garnie de silice à gra
nulométrie de 10-100 microns, de 250 mm de hauteur et de
9 mm de diamètre, lorsque 50 ul d'une solution de 1,3 mg/
ml de cette fraction dans un tampon Na2S04 0,02 M, ayant
été placés sur cette colonne, l'on procède ensuite à
l'élution de ladite fraction sous un débit de 3 ml/minute.The fraction of MPS of the present invention may more particularly be obtained from one or the other of the fractions also described in the main patent application and respectively characterized - eg aue ~ in a gel-filtration operation on column
of polyacrylamide gel and agarose, in the form of
beads, of the type marketed under the designation
ULTROGEL AcA 44, this fraction passes after elution of a
volume of 2.5 liters, excluding dead volume, when the
gel-filtration is conducted at a flow rate of 200 ml /
hour, in a column with a diameter of 100 mm and
a height of 1 m and when the concentration of muco
polysaccharides and the volume of the solution placed on the
column were respectively 50 mg / ml and 37.5 ml,
most of this fraction being contained in particular
the 1.5 liters of eluate that pass thereafter; - by a retention time of the order of 5.7 to 7.5, in particular
from 6.6 to 7.0 minutes in a column, in a sys
gel-permeation column on column filled with silica to gra
10-100 micron, 250 mm high and
9 mm in diameter, when 50 μl of a solution of 1.3 mg /
ml of this fraction in 0.02 M Na 2 SO 4 buffer,
placed on this column, then proceed to
eluting said fraction at a flow rate of 3 ml / minute.

Il résulte de ce qui précède que la fraction et les produits selon la présente invention se trouvent être contenus dans les différentes fractions qui ont été définies dans la demande de brevet principal et que, à ce titre, ils en possèdent (conjointement avec les autres constituants contenus dans ces fractions) toutes les propriétés. It follows from the foregoing that the fraction and the products according to the present invention are found to be contained in the various fractions which have been defined in the main patent application and that, as such, they possess them (together with the other constituents). contained in these fractions) all properties.

Les fractions selon la présente invention sont caractérisées plus particulièrement encore, d'une part, par une affinité particulière à l'égard de l'antithrombine III se manifestant par leur capacité de se fixer sur cette dernière, notamment dans un système comprenant la mise en contact de ces fractions avec une antithrombine III fixée sur un support, tel que l'agarose, au sein d'un tampon NaCl 0,2 M, tris-HCl 0,05 M pH 7,5 et, d'autre part, par des titres Yin
Wessler et USP qui sont dans un rapport (rapport YW/USP) au moins égal à 6, le titre Yin-Wessler lui-même étant au moins égal à 300 UI/mg.The fractions according to the present invention are characterized even more particularly, on the one hand, by a particular affinity for antithrombin III manifested by their ability to bind to the latter, especially in a system comprising the implementation of contact of these fractions with a carrier-bound antithrombin III, such as agarose, in a 0.2 M NaCl buffer, 0.05 M tris-HCl pH 7.5, and on the other hand, Yin securities
Wessler and USP which are in a ratio (YW / USP ratio) of at least 6, the Yin-Wessler titre itself being at least 300 IU / mg.

Des fractions et composés préférés selon l'invention sont caractérisés par des rapports YW/USP supérieurs à 18, avec une activité Yin-Wessler supérieure à 900. Preferred fractions and compounds according to the invention are characterized by YW / USP ratios greater than 18, with Yin-Wessler activity greater than 900.

De préférence encore les fractions et composés selon l'invention sont caractérisés par des rapports YW/USP supérieurs à 50. More preferably the fractions and compounds according to the invention are characterized by YW / USP ratios greater than 50.

Les composés préférés de l'invention sont caractérisés par des rapports YW/USP supérieurs à 65 avec une activité Yin-Wessler supérieure à 1.300 UI/mg. Preferred compounds of the invention are characterized by YW / USP ratios greater than 65 with Yin-Wessler activity greater than 1,300 IU / mg.

L'affinité particulière des fractions selon l'invention est à la base du procédé selon la présente invention pour l'obtention de telles fractions, notamment à partir de celles qui ont été définies dans le brevet principal, procédé qui consiste à réaliser une fixation sélective des fractions ou produits de la présente invention sur l'antithrombine III, notamment par la mise en contact des fractions initiales avec l'antithrombine III fixée sur un support, notamment de l'agarose, au sein d'un tampon tel que NaCl 0,2 M, tris-HCl 0,05 M pH 7,5,. puis à éluer la fraction fixée avec un tampon de force ionique plus forte, suffisante pour produire la désorption, notamment un tampon NaCl 2 M, tris
HCl 0,05 M.The particular affinity of the fractions according to the invention is at the basis of the process according to the present invention for obtaining such fractions, in particular from those which have been defined in the main patent, a process which consists in carrying out selective fixation. fractions or products of the present invention on antithrombin III, in particular by contacting the initial fractions with antithrombin III fixed on a support, in particular agarose, in a buffer such as NaCl 0, 2 M, 0.05 M tris-HCl pH 7.5 ,. then eluting the fixed fraction with a stronger ionic strength buffer, sufficient to produce the desorption, in particular a 2M NaCl buffer, tris
0.05 M HCl

Bien entendu,les matièrespremièresà partir-desquelles les fractions ou les composés de l'invention sont susceptibles d'être obtenus ne sont pas limitées aux fractions qui ont -été définies dans la demande de brevet principal. Ils peuvent être obtenus de toutes autres manières appropriées, notamment à partir des matières premières brutes dont on -a plus haut rappelé la nature et à partir desquelles peuvent être obtenues les fractions définies dans la demande de brevet principal.:
L'invention concerne plus particulièrement encore des composés sensiblement homogènes qui paraissent constituer le principe actif essentiel des fractions ayant fait l'objet de la demande de brevet principal et que le procédé selon l'invention qui vient d'être défini permet d'obtenir à un état pratiquement pur.Of course, the raw materials from which the fractions or compounds of the invention are likely to be obtained are not limited to the fractions which have been defined in the main patent application. They may be obtained in any other suitable manner, in particular from the raw materials whose nature has been described above and from which the fractions defined in the main patent application can be obtained:
The invention more particularly relates to substantially homogeneous compounds which appear to constitute the essential active principle of the fractions which were the subject of the main patent application and that the method according to the invention which has just been defined makes it possible to obtain a virtually pure state.

Ces composés sont caractérisés par les spectres de résonance magnétique nucléaire (RMN) réalisés dans les conditions indiquées ci-après et qui font l'objet des figures 4, 5, 7 et 8. These compounds are characterized by the nuclear magnetic resonance (NMR) spectra produced under the conditions indicated below and which are the subject of FIGS. 4, 5, 7 and 8.

Se référant plus particulièrement au spectre de RMN des composés selon l'invention pour le proton CH2 H) réalisé sur des solutions de ces composés dissous dans l'veau deutériée à 35 C avec un rayonnement de 270 mégaherz (MHz), on observe à titre d'élément caractéristique du spectre, des signaux de résonance qui, pour des déplacements chimiques de l'ordre de 4,8 et 5,2 ppm, sont sensiblement plus faibles que le signal de résonance qui est également observé pour un déplacement chimique de l'ordre de 5,4 ppm (référence pour la mesure des déplacements : TSP (sodium 3-triméthylsilyl propionate 2,2, 3,3-d4)). Referring more particularly to the NMR spectrum of the compounds according to the invention for the proton CH 2 H) produced on solutions of these compounds dissolved in the deuterated calf at 35 ° C. with a radiation of 270 megaherz (MHz), it is observed that characteristic element of the spectrum, resonance signals which, for chemical shifts of the order of 4.8 and 5.2 ppm, are substantially lower than the resonance signal which is also observed for a chemical shift of the 5.4 ppm (reference for displacement measurement: TSP (sodium 3-trimethylsilylpropionate 2,2,3,3-d4)).

Les signaux observés au niveau des déplacements chimiques de 5,4; 5,2 et 4,8 ppm correspondent aux signaux qui, dans le cas d'une héparine classique étudiée en RMN dans les mêmes conditions, sont respectivement caractéristiques - du proton anomère, en position 1, des motifs glucosamine
N-sulfatée de l'héparine (signal G1) ; - du proton anomère en position 1, des motifs acide iduro
nique 2-0-sulfaté (signal I1) et - du proton en position 5 des motifs acide iduronique
2-0-sulfaté (signal 15).Signals observed at chemical shifts of 5.4; 5.2 and 4.8 ppm correspond to the signals which, in the case of a conventional heparin studied in NMR under the same conditions, are respectively characteristic of the proton anomeric, in position 1, of glucosamine units.
N-sulfated heparin (G1 signal); anomeric proton at position 1, iduro acid units
2-0-sulfated ring (signal I1) and - the proton at position 5 of the iduronic acid units
2-0-sulfated (signal 15).

Dans les héparines classiques, les signaux (G1), (11) et (15) présentent tous trois des intensités du même ordre de grandeur. In conventional heparins, the signals (G1), (11) and (15) all have intensities of the same order of magnitude.

Pour la commodité du langage, il sera également fait référence ci-après, même en ce qui concerne les fractions ou composés selon l'invention, aux signaux (G1), (I1) et pour désigner les signaux observés en rapport avec les déplacements c mimiques correspondants (que ce soit pour le proton ou pour 1 C)
Cette èquivalence au niveau du langage s'éteindra éga- lement aux spectres RMN réalisés dans des conditions et avec des références différentes.For the convenience of the language, reference will also be made hereinafter, even with regard to the fractions or compounds according to the invention, to the signals (G1), (I1) and to designate the signals observed in relation to the displacements c corresponding mimics (whether for the proton or for 1 C)
This equivalence at the language level will also be extinguished with NMR spectra made under different conditions and with different references.

Se référant plus particulièrement au spectre de RMN des composés selon l'invention pour le carbone 13 (13C), réalisé sur des solutions de ces composés dissousdans liteau deutériée avec un rayonnement de 20 MHz, on observe à titre d'éléments caractéristiques du spectre (référence pour la mesure des déplacements TM5 (tétraméthylsilane)) - pratiquement l'absence de signal de résonance caractéris
tique de la présence de groupes OH sur le carbone primaire
(en position 6)des motifs glucosamine contenus dans les
fractions mucopolysaccharidiques de l'invention, - des signaux supplémentaires, dans la région des signaux
(I1) et (G1), dans des régions correspondant à des déplace
ments chimiques de l'ordre de 100 ppm, - un signal (G2) supplémentaire près du signal G2N-sulfaté dans la
région 60 ppm - la présence d'un signal de résonance dans la région 75 ppm
(auquel normalement ne correspond sensiblement aucun si
gnal de résonance dans des spectres de RMN réalisés dans
des conditions semblables avec une héparine classique), (les indications de déplacements chimiques sus-indiqués sont appréciéesvis-à-vis du CH3 des groupes N-acétyl glucosamine contenus dans les MPS selon l'invention (région de 25 ppm dans les spectres joints)).Referring more particularly to the NMR spectrum of the compounds according to the invention for carbon 13 (13C), carried out on solutions of these compounds dissolved in deuterated baton with a radiation of 20 MHz, are observed as characteristic elements of the spectrum ( reference for displacement measurement TM5 (tetramethylsilane)) - practically no characteristic resonance signal
the presence of OH groups on primary carbon
(in position 6) glucosamine units contained in the
mucopolysaccharide fractions of the invention, - additional signals, in the region of the signals
(I1) and (G1), in regions corresponding to displacements
100 ppm, - an additional signal (G2) near the G2N-sulphated signal in the
region 60 ppm - the presence of a resonance signal in the region 75 ppm
(to which normally does not correspond substantially if
resonance in NMR spectra made in
similar conditions with a conventional heparin), (the indications of chemical shifts given above are evaluated vis-à-vis the CH3 N-acetyl glucosamine groups contained in the MPS according to the invention (region of 25 ppm in the joined spectra) ).

Les composés homogènes selon l'invention, à l'état pratiquement purifié, qui présentent toutes les caractéristiques qui ont déjà été définies plus haut, pour ce qui est de leurs activités USP et Yin-Wessler et leurs affinités spécifiques vis-à-vis de l'antithrombine III, sont encore caractérisés en ce qu'ils sont formés par un oligosaccharide homogène présentant encore les caractéristiques supplémentaires suivantes - il comprend de 8 à 12, notamment dix motifs mono-saccharidiques; - toutes les positions primaires des motifs glucosamine
de cet oligosaccharide sont sulfatées ; - cet oligosaccharide comporte une unité N-acétyl-glucosamine
pour deux unités acide iduronique 2-0-sulfate et pour deux
unités N-sulfate-glucosamine, les autres saccharides étant de
nature différente et comportant des substituants distincts.The homogeneous compounds according to the invention, in the substantially purified state, which have all the characteristics which have already been defined above, with regard to their USP and Yin-Wessler activities and their specific affinities with respect to antithrombin III, are further characterized in that they are formed by a homogeneous oligosaccharide still having the following additional characteristics - it comprises from 8 to 12, in particular ten monosaccharide units; - all primary positions of glucosamine units
of this oligosaccharide are sulfated; this oligosaccharide comprises an N-acetylglucosamine unit
for two units iduronic acid 2-0-sulfate and for two
N-sulfate-glucosamine units, the other saccharides being
different nature and having distinct substituents.

Les poids moléculaires de certains au moins des oligosaccharides selon l'invention se situent dans un intervalle d'environ 2.000 à environ 3.000, notamment d'environ 2.500 dans la mesure où il s'agit de décasaccharides. The molecular weights of at least some of the oligosaccharides according to the invention are in a range of about 2,000 to about 3,000, especially about 2,500 as they are decasaccharides.

L'invention concerne également des polysaccharides ayant les propriétés générales indiquées ci-dessus, en ce qui concerne plus particulièrement les activités USP et Yin
Wessler, d'une part, et l'affinité pour l'antithrombine III, d'autre part, ces fractions ayant un poids moléculaire plus élevé, mais contenant également dans leur structure une partie oligosaccharide répondant aux conditions évoquées cidessus.The invention also relates to polysaccharides having the general properties indicated above, with particular regard to the USP and Yin activities.
Wessler, on the one hand, and the affinity for antithrombin III, on the other hand, these fractions having a higher molecular weight, but also containing in their structure an oligosaccharide portion corresponding to the conditions mentioned above.

D'autres caractéristiques de l'invention apparaîtront encore au cours de la description d'exemples de mise en oeuvre de l'invention, notamment avec référence aux dessins dans lesquels - la fig. 1 est un diagramme d'élution schématique d'une
fraction conforme à l'invention, à l'occasion de la mise
en oeuvre du procédé, également selon l'invention, de sé
paration sélective de ladite fraction à partir d'une frac
tion contenant également d'autres constituants ; - la fig. 2 est représentative d'un diagramme d'élution
caractéristique d'une autre fraction mucopolysaccharide
préférée, conforme à l'invention ; - la fig. 3 est le spectre RMN d'une héparine classique pour
le proton H ; - les fig. 4 et 5 sont des spectres de RMN pour le proton 1H
de différentes fractions conformes à l'invention ;; - la fig. 6 est un spectre de RMN pour le carbone 13 d'une
héparine classique utilisée à titre de comparaison ; - la fig. 7 est un spectre RMN pour le carbone 13 d'une
fraction conforme à l'invention et - la fig. 8 est un agrandissement d'une partie du spectre de
RMN de la fig. 7. Other features of the invention will become apparent in the course of the description of exemplary embodiments of the invention, particularly with reference to the drawings in which - FIG. 1 is a schematic elution diagram of a
fraction according to the invention, on the occasion of the
of the method, also according to the invention, of
selective paration of said fraction from a frac
also containing other constituents; - fig. 2 is representative of an elution diagram
characteristic of another mucopolysaccharide fraction
preferred, according to the invention; - fig. 3 is the NMR spectrum of a conventional heparin for
the proton H; - figs. 4 and 5 are NMR spectra for the 1H proton
different fractions according to the invention; - fig. 6 is an NMR spectrum for the carbon 13 of a
classical heparin used for comparison; - fig. 7 is an NMR spectrum for carbon 13 of a
fraction according to the invention and - fig. 8 is an enlargement of part of the spectrum of
NMR of FIG. 7.

EXEMPLE I
Matière première
Elle est constituée par des sous-produits issus de la fabrication dthéparinate de calcium injectable à partir dthéparinesbrutes, telles qu'elles sont extraites de tissus d'animaux (notamment mucus d'intestins ou poumons de boeuf ou deporc) ou d 'hépa- rines purifiées ou semi-purifiées commerciales.EXAMPLE I
Raw material
It consists of by-products derived from the manufacture of injectable calcium heparin from heparinbrutes, as extracted from animal tissues (in particular intestinal mucus or lungs from beef or poultry) or from heparins. purified or semi-purified commercial.

Ces sous-produits contiennent des protéines, des mucopolysaccharides (MPS), notamment héparines, héparanes,héparitines, etc. et, le cas échéant, des acides nucléiques. These by-products contain proteins, mucopolysaccharides (MPS), including heparins, heparans, heparitins, etc. and, where appropriate, nucleic acids.

Ils ont auparavant été dessalés par deux précipitations alcooliques.They were previously desalinated by two alcoholic precipitations.

La matière première type utilisée dans l'exemple qui suit avait les caractéristiques suivantes
Poids : 252 kg Titre USP : 82 UI/mg
Titre Yin-Wessler :100 UI/mg.The typical raw material used in the following example had the following characteristics
Weight: 252 kg USP Title: 82 IU / mg
Yin-Wessler titre: 100 IU / mg.

On a alors eu recours aux étapes de traitement décrites ci-après. The processing steps described below were then used.

Extraction à l'alcool 580 GL
Les 252 kg de matière première sont dispersés dans 6.000 litres d'alcool 580GL, sous agitation violente.Extraction with alcohol 580 GL
The 252 kg of raw material is dispersed in 6,000 liters of alcohol 580GL, with violent stirring.

On sépare la phase insoluble par décantation et centrifugation. The insoluble phase is separated by decantation and centrifugation.

On récupère la fraction soluble par addition de
NaCl et d'alcool îO00GL. The soluble fraction is recovered by addition of
NaCl and alcohol.

On obtient
Fraction insoluble : 230 kg recyclés en fabrication,
Fraction soluble : 20,6 kg (titre USP = 21 UI/mg
titre Yin-Wessler = 90 UI/mg).We obtain
Insoluble fraction: 230 kg recycled in production,
Soluble fraction: 20.6 kg (USP titre = 21 IU / mg
Yin-Wessler titre = 90 IU / mg).

Extraction des bas poids moléculaires de la fraction soluble
La fraction soluble dans l'alcool 580GL est dissoute dans 512 litres d'eau (20 volumes).Extraction of the low molecular weights of the soluble fraction
The alcohol soluble fraction 580GL is dissolved in 512 liters of water (20 volumes).

On ajoute 20g/l de NaCl, soit 10,24 kg, puis 1,5 volumes d'alcool 1000GL, soit 768 litres. La fraction précipitée est recueillie, déshydratée à l'alcool et séchée. 20 g / l NaCl or 10.24 kg, then 1.5 volumes of alcohol 1000GL or 768 liters. The precipitated fraction is collected, dehydrated with alcohol and dried.

Poids : 19 kg Titre USP = 22 UI/mg
Titre Yin-Wessler = 89 UI/mg.Weight: 19 kg Title USP = 22 IU / mg
Yin-Wessler titre = 89 IU / mg.

Cette fraction est conservée et sera ultérieurment purifiée et transformée en sel de calcium injectable. This fraction is stored and will be further purified and converted to injectable calcium salt.

Le surnageant de la précipitation à 1,5 volumes est additionné de 1,5 volumes d'alcool, soit 768 litres. La fraction précipitée est recueillie, déshydratée à l'alcool et séchée. The supernatant of the 1.5 volume precipitation is supplemented with 1.5 volumes of alcohol, ie 768 liters. The precipitated fraction is collected, dehydrated with alcohol and dried.

Poids : 700 grammes Titre USP = 6 UI/mg,
Titre Yin-Wessler = 40 UI/mg.Weight: 700 grams Title USP = 6 IU / mg,
Yin-Wessler titre = 40 IU / mg.

Cette fraction de 700 grammes est un mélange de
MPS de bas poids moléculaire, de MPS de haut poids moléculaire peu sulfatés et d'acides nucléiques plus ou moins dégradés.This fraction of 700 grams is a mixture of
MPS of low molecular weight, high molecular weight MPS low sulfated and more or less degraded nucleic acids.

Elimination des acides nucléiques de la fraction de bas poids moléculaire
La majeure partie des acides nucléiques est éliminée par précipitation au chlorure de manganèse, de la manière suivante
La fraction de 700 grammes est dissoute dans 7 litres d'eau. 1 litre de MnCl2 à 10 % est ajouté sous agitation. Le précipité important formé (constitué des sels de manganèse insolubles des ARN et ADN) est éliminé par centrifugation.Elimination of nucleic acids from the low molecular weight fraction
Most of the nucleic acids are removed by precipitation with manganese chloride, as follows
The fraction of 700 grams is dissolved in 7 liters of water. 1 liter of 10% MnCl 2 is added with stirring. The large precipitate formed (consisting of insoluble manganese salts of RNA and DNA) is removed by centrifugation.

Les MPS sont récupérés du surnageant limpide par précipitation à l'alcool.MPS are recovered from the clear supernatant by precipitation with alcohol.

Poids : 480 grammes Titre USP = 8 UI/mg,
Titre Yin-Wessler = 54 UI/mg.Weight: 480 grams Title USP = 8 IU / mg,
Yin-Wessler titre = 54 IU / mg.

Isolement des très bas poids moléculaires par gelfiltration
Les très bas poids moléculaires sont séparés par gelfiltration sur ultrogel ACA 44.Isolation of very low molecular weights by gelfiltration
The very low molecular weights are separated by gelfiltration on ultrogel ACA 44.

Une colonne de 200 mm de diamètre et 1 m de hauteur permet de traiter 25 grammes. A column 200 mm in diameter and 1 m high can treat 25 grams.

Le diagramme d'élution est du type de celui représenté à la fig. 1. The elution diagram is of the type shown in FIG. 1.

Trois fractions (numérotées de (1) à (3)) sont recueillies. Elles ont les caractéristiques suivantes (pour 25 grammes mis en oeuvre au départ) (1) poids : 16 grammes Titre USP : 12 UI/mg Titre Y.W : 30 UI/mg, (2) poids : 7 grammes Titre USP : 6,5 UI/mg Titre Y.W : 70 UI/m* (3) poids : 2 grammes Titre USP : 2,1 UI/mg Titre Y.W : 60 UI/mg. Three fractions (numbered from (1) to (3)) are collected. They have the following characteristics (for 25 grams initially used) (1) Weight: 16 grams Title USP: 12 IU / mg Title YW: 30 IU / mg, (2) Weight: 7 grams Title USP: 6.5 UI / mg Title YW: 70 IU / m * (3) Weight: 2 grams Title USP: 2.1 IU / mg Title YW: 60 IU / mg.

Chromatographie sur antithrombine III insolubilisée
La fraction (3) précédente est soumise à une chromatographie sur antithrombine III fixée sur agarose.Chromatography on antithrombin III insolubilized
The preceding fraction (3) is subjected to an antithrombin III chromatography fixed on agarose.

Une colonne de 100 ml utilisée actuellement permet de traiter 700 mg de la fraction -(3). A 100 ml column currently used makes it possible to treat 700 mg of fraction - (3).

L'adsorption se fait en tampon NaCl 0,2 M, tris
HCl 0,05 M pH 7,5.The adsorption is in 0.2 M NaCl buffer, tris
0.05 M HCl pH 7.5.

L'élution est effectuée par du tampon NaCl 2 M, tris-HCl 0,05 M. Elution is carried out with 2M NaCl buffer, 0.05 M tris-HCl.

La partie non fixée (600 à 650 mg) a un titre USP voisin de 1 à 2 UI/mg et un titre Yin/Wessler de 10 à 20 UI/mg. The unbound portion (600 to 650 mg) has a USP titre of about 1 to 2 IU / mg and a Yin / Wessler titre of 10 to 20 IU / mg.

La partie fixée (10 à 30 mg) a un titre USP de 10 à 20 UI/mg et un titre Yin-Wessler de 1.000 à 1.400 UI/mg. The fixed part (10 to 30 mg) has a USP titre of 10 to 20 IU / mg and a Yin-Wessler titre of 1,000 to 1,400 IU / mg.

EXEMPLE Il
La matière première utilisée provient de sousfractions telles qu'elles sont obtenues à 1occasion de la purification d'une héparine du commerce, en vue de la production d'une héparine injectable. Elle provient notamment en partie du surnageant obtenu par addition de 0,6 à 0,7 volume d'alcool 1000 GL à une-solution aqueuse de l'héparine contenant 10 à 20 g par litre de chlorure de sodium, l'héparine purifiée précipitée étant alors récupérée en vue de purifications. La matière première ici retenue contient également divers résidus de purification de l'héparine, notamment ceux obtenus à l'occasion des précipitations alcooliques, en vue de débarrasser l'héparine injectable des traces de sels minéraux.EXAMPLE II
The raw material used comes from subfractions as obtained during the purification of a commercial heparin, for the production of an injectable heparin. It comes in part from the supernatant obtained by addition of 0.6 to 0.7 volume of alcohol GL 1000 to an aqueous solution of heparin containing 10 to 20 g per liter of sodium chloride, the purified heparin precipitated being then recovered for purifications. The raw material used here also contains various heparin purification residues, especially those obtained during alcoholic precipitations, in order to rid the injectable heparin of traces of mineral salts.

On ajoute à 10 kg de cette matière première 30 volumes d'alcool 580GL (300 litres). On soumet la suspension à une dispersion et agitation violentes pendant 15 minutes, l'agitation étant encore maintenue de façon énergique pendant 12 heures. On laisse ensuite reposer pendant 48 heures, afin d'obtenir une décantation de la matière première non solubilisée. Le surnageant légèrement trouble est alors repris et clarifié par centrifugation. 10 volumes of alcohol 580GL (300 liters) are added to 10 kg of this raw material. The suspension is subjected to violent dispersion and stirring for 15 minutes, the stirring being maintained vigorously for 12 hours. It is then allowed to stand for 48 hours, in order to obtain a decantation of the unsolubilized raw material. The slightly turbid supernatant is then taken up and clarified by centrifugation.

On ajoute au surnageant (volume de 280 litres) 10 litres d'une solution saturée de chlorure de sodium, puis 1 volume (280 litres d'alcool) 1000 GL. Le précipité obtenu, qui contient la fraction mucopolysaccharidique, est lavé à l'alcool 100 GL, puis séché. To the supernatant (volume of 280 liters) is added 10 liters of a saturated solution of sodium chloride and then 1 volume (280 liters of alcohol) 1000 g. The precipitate obtained, which contains the mucopolysaccharide fraction, is washed with 100 GL alcohol and then dried.

On obtient 660 g d'une fraction dont les titres Yin
Wessler et USP, respectivement, sont déjà dans un rapport supérieur à 2 (fraction P194HH(A)). We obtain 660 g of a fraction whose titles Yin
Wessler and USP, respectively, are already in a ratio greater than 2 (fraction P194HH (A)).

On procède encore à un fractionnement supplémentaire de cette fraction, en dissolvant les 660 g dans 13.200 ml d'eau. This fraction is further fractionated by dissolving the 660 g in 13,200 ml of water.

On ajoute à la solution formée 264 g de chlorure de sodium, puis 1,5 volumes d'alcool 1000GL (19,8 litres). Le produit précipité est recueilli, lavé à l'alcool, puis seché. 264 g of sodium chloride and then 1.5 volumes of 1000GL alcohol (19.8 liters) are added to the solution formed. The precipitated product is collected, washed with alcohol and then dried.

On obtient 640 g de la fraction P194HH(C) ayant les caractéristiques suivantes - titre USP : 31 UI/mg, - titre Yin-Wessler : 100 UI/mg.640 g of the P194HH fraction (C) having the following characteristics are obtained: USP titre: 31 IU / mg, Yin-Wessler titre: 100 IU / mg.

Le surnageant contient également des fractions mucopolysaccharidiques actives. Il est alors lui-même additionné de 19,8 litres d'alcool 1000 GL et la suspension formée laissée au repos pendant 24 heures. The supernatant also contains active mucopolysaccharide moieties. It is then added itself 19.8 liters of alcohol 1000 GL and the suspension formed left to rest for 24 hours.

Le précipité formé est recueilli, lavé à l'alcool 1000 GL et séché. On obtient 6 g d'une fraction dite P194HH(p) ayant les caractéristiques suivantes - titre USP : 7 UI/mg, - titre Yin-Wessler : 46 UI/mg. The precipitate formed is collected, washed with 1000 GL alcohol and dried. 6 g of a so-called P194HH fraction (p) having the following characteristics are obtained: USP titre: 7 IU / mg, Yin-Wessler titre: 46 IU / mg.

La fraction P194HH(p) est à nouveau dissoute dans un tampon de tris-HCl 0,05 M, pH 7,5, NaCl 30 g/l, à raison de 50 mg/ml. The P194HH fraction (p) is again dissolved in a buffer of 0.05 M tris-HCl, pH 7.5, 30 g / l NaCl, at 50 mg / ml.

La solution est soumise à une gel-filtration sur une colonne d'ULTROGEL AcA 44 (Pharmacia K 100/100, volume 7 litres ; hauteur 100 cm ; diamètre 10 cm) sous un débit de 200 ml/heure. The solution is subjected to gel filtration on a column of ULTROGEL AcA 44 (Pharmacia K 100/100, volume 7 liters, height 100 cm, diameter 10 cm) at a flow rate of 200 ml / hour.

Le diagramme d'élution obtenu est schématiquement indiqué à la fig. 1, représentative des variations de la teneur en matière (densité optique DO mesurée à 660 nanomètres) en fonction du volume élué, en litres (1). The elution diagram obtained is schematically indicated in FIG. 1, representative of the variations in the content (optical density OD measured at 660 nanometers) as a function of the volume eluted, in liters (1).

On recueille, après passage d'un volume de liquide correspondant au volume mort de la colonne, les fractions successives K, J, I, G, F, E, D, C, B et A, dont les volumes sont indiqués par les longueurs des segments d'abscisse correspondants de la fig. 1. After the passage of a volume of liquid corresponding to the dead volume of the column, the successive fractions K, J, I, G, F, E, D, C, B and A, whose volumes are indicated by the lengths, are collected. corresponding abscissa segments of FIG. 1.

Chacune de ces fractions possède les caractéristi ques analytiques qui figurent dans le tableau ci-après. Each of these fractions has the analytical characteristics shown in the table below.

TABLEAU I
Caractéristiques des fractions obtenues

TABLE I
Characteristics of the fractions obtained

Rapp@@@
<tb> <SEP> Poids <SEP> Titre <SEP> USP <SEP> Titre <SEP> anti-Xa
<tb> N <SEP> fraction <SEP> anti-Xa
<tb> <SEP> (mg) <SEP> (UI) <SEP> (UI)
<tb> USP
<tb> <SEP> A <SEP> 120 <SEP> 3,7 <SEP> 44,4 <SEP> 12
<tb> <SEP> B <SEP> 120 <SEP> 4,5 <SEP> 72 <SEP> 16
<tb> <SEP> C <SEP> 250 <SEP> 6 <SEP> 54 <SEP> 9
<tb> <SEP> D <SEP> 150 <SEP> 9 <SEP> 135 <SEP> 15
<tb> <SEP> E <SEP> , <SEP> 300 <SEP> 9 <SEP> 144 <SEP> <SEP> 16 <SEP>
<tb> <SEP> F <SEP> 400 <SEP> 11 <SEP> 143 <SEP> 13
<tb> <SEP> G <SEP> ' <SEP> <SEP> 300 <SEP> :<SEP> <SEP> 11,5 <SEP> 161 <SEP> 14
<tb> H <SEP> 200 <SEP> 13 <SEP> 143 <SEP> 11
<tb> <SEP> I <SEP> 50 <SEP> 13 <SEP> 91 <SEP> 7
<tb> <SEP> J <SEP> 200 <SEP> 7 <SEP> 14 <SEP> 2
<tb> <SEP> K <SEP> 3500 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> /
<tb>
On constate que les fractions peuvent être groupées en quatre types
a) Les fractions A, B, C, dont les volumes d'élution correspondent, dans le protocole opératoire sus-décrit, essentiellement au quatrième litre élué, dont les titres
USP sont -inférieurs à 10 et les titres Yin-Wessler infe- rieurs à 80 ; leurs poids moléculaires sont au plus de l'ordre de 4.000 ;
b) Les fractions D, E, F, G, H, dont les titres USP sont inférieurs à 10 et les titres Yin-Wessler très élevés 135 à 161 unités ; ces fractions présentent aussi les rapports de titres Yin-Wessler/USP les plus favorables, de 13 à 16 ; elles sont essentiellement contenues dans le troisième litre d'éluat ; leurs poids moléculaires sont de l'ordre de 4.000 à 10.000, notamment de 4.000 à 8.000
Les fractions A, B et C ci-dessus sont réunies en une fraction unique qui fait alors l'objet d'un fractionnement supplémentaire par fixation sélective sur colonne d'Agarose
Antithrombine III, dans les conditions définies dans l'exemple
I. On élue la fraction fixée. On obtient la fraction dénommée ci-après P 194HHPA. Elle possède un titre Yin-Wessler de 310 UI/mg et un titre USP de 40 UI/mg.Rapp @@@
<tb><SEP> Weight <SEP> Title <SEP> USP <SEP> Title <SEP> anti-Xa
<tb> N <SEP> fraction <SEP> anti-Xa
<tb><SEP> (mg) <SEP> (UI) <SEP> (UI)
<tb> USP
<tb><SEP> A <SEP> 120 <SEP> 3.7 <SEP> 44.4 <SEP> 12
<tb><SEP> B <SEP> 120 <SEP> 4.5 <SEP> 72 <SEP> 16
<tb><SEP> C <SEP> 250 <SEP> 6 <SEP> 54 <SEP> 9
<tb><SEP> D <SEP> 150 <SEP> 9 <SEP> 135 <SEP> 15
<tb><SEP> E <SEP>, <SEP> 300 <SEP> 9 <SEP> 144 <SEP><SEP> 16 <SEP>
<tb><SEP> F <SEP> 400 <SEP> 11 <SEP> 143 <SEP> 13
<tb><SEP> G <SEP>'<SEP><SEP> 300 <SEP>: <SEP><SEP> 11.5 <SEP> 161 <SEP> 14
<tb> H <SEP> 200 <SEP> 13 <SEP> 143 <SEP> 11
<tb><SEP> I <SEP> 50 <SEP> 13 <SEP> 91 <SEP> 7
<tb><SEP> J <SEP> 200 <SEP> 7 <SEP> 14 <SEP> 2
<tb><SEP> K <SEP> 3500 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> /
<Tb>
It can be seen that the fractions can be grouped into four types
a) The fractions A, B, C, whose elution volumes correspond, in the operating protocol described above, essentially to the fourth eluted liter, whose titers
USP are less than 10 and Yin-Wessler securities less than 80; their molecular weights are at most of the order of 4,000;
b) Fractions D, E, F, G, H, whose USP securities are less than 10 and the Yin-Wessler securities very high 135 to 161 units; these fractions also show the most favorable Yin-Wessler / USP securities ratios, from 13 to 16; they are essentially contained in the third liter of eluate; their molecular weights are of the order of 4,000 to 10,000, in particular from 4,000 to 8,000
Fractions A, B and C above are combined into a single fraction which is then further fractionated by selective fixation on Agarose column.
Antithrombin III, under the conditions defined in the example
I. The fixed fraction is eluted. The fraction named hereinafter P 194HHPA is obtained. It has a Yin-Wessler titre of 310 IU / mg and a USP titre of 40 IU / mg.

On réunit de même les fractions E et F susdites. On procède de même à la séparation des fractions les plus actives par la technique de fixation-élution sus-définie, au moyen de la colonne d'Agarose-Antithrombine III. On obtient finalement une fractionPî9L'HH ayant un titre Yin et Wessler de 900 UI/mg et un titre USP de 82 UI/mg. The fractions E and F mentioned above are likewise collected. The most active fractions are also separated by the above-defined binding-elution technique using the Agarose-Antithrombin III column. A HH fraction with a Yin and Wessler titre of 900 IU / mg and a USP titre of 82 IU / mg is finally obtained.

On soumet lesdites fractions P 194HHPA et P 194HHPF à l'analyse RMN, pour le proton 1H. On fait de même avec une héparine classique (7021HH). These P 194HHPA and P 194HHPF fractions are subjected to NMR analysis for the 1H proton. The same is done with a conventional heparin (7021HH).

L'analyse est effectuée sur chacun desdits produits, préalablement dissous dans de l'eau deutériée à raison de 14 à 62 mg/0,35 ml, avec un appareil BRUKER, 270 MHz, équipé d'un système de transformée de FOURIER et permettant l'accumulation de spectres. Les déplacements chimiques ont été mesurés par référence au TSF, comme indiqué plus haut. The analysis is carried out on each of said products, previously dissolved in deuterated water at a rate of 14 to 62 mg / 0.35 ml, with a BRUKER apparatus, 270 MHz, equipped with a FOURIER transform system and allowing the accumulation of spectra. The chemical shifts were measured by reference to the TSF, as indicated above.

La fig. 3 est représentative du spectre de RMN obtenu avec l'héparine classique. Les fig. 4 et 5 sont de même représentatives des spectres de RMN des fractions P 194HHPF et
P 194HHPA. Fig. 3 is representative of the NMR spectrum obtained with conventional heparin. Figs. 4 and 5 are likewise representative of the NMR spectra of the P 194HHPF fractions and
P 194HHPA.

On remarque,par la comparaison des spectres de RMN, que les signaux (I1)et(I5) des fractions selon l'invention sont nettement moins intenses que le signal (G1), alors que ces signaux sont sensiblement de même inensité dans le spectre de l'héparine de référence. It is noted, by comparing the NMR spectra, that the signals (I1) and (I5) of the fractions according to the invention are much less intense than the signal (G1), whereas these signals are substantially of the same intensity in the spectrum. heparin reference.

EXEMPLE III
En appliquant les techniques décrites dans les exemples
I et II à autres matières premières, on a obtenu de façon semblable des fractions
P.219 HH : titre USP................= 14 UI/mg
Titre Yin-Wessler...,....=1350 UI/mg
P.225 HH : Titre USP................= 17 UI/mg Titre Yin-Wessler........= = 1320 UIlmg
P.231 HH : Titre USP................= 16,2 UI/mg
Titre Yin-Wessler........=1400 UI/mg
P 194 HH A : Titre USP................ = 82 ui/mg
Titre Yin-Wessler = 900 u/mg
P 242 HH A : Titre USP................ = 16 ui/mg
Titre Yin-Wessler =1800 u/mg
P 255 HH A : Titre USP = = 36 ui/mg
Titre Yin-Wessler =2145 u/mg
On a soumis la fraction P 242HHA à l'analyse RMN, pour le carbone 13 (13C) (fig. 7 et 8). On a fait de même avec l'hé- parine classique de référence 7071HH (fig. 6). L'analyse est effectuée sur chacune des fractions (en solution dans l'eau dentériée à raison de 100 mg dans 1 ml de D20 avec un appareil
VARIAN CFT-20, 20 MHz, équipé d'un système de transformée de
FOURIER (référence pour la mesure des déplacements chimiques
TMS).EXAMPLE III
By applying the techniques described in the examples
I and II to other raw materials, fractions were similarly obtained
P.219 HH: USP titre ................ = 14 IU / mg
Title Yin-Wessler ..., .... = 1350 IU / mg
P.225 HH: Title USP ................ = 17 IU / mg Title Yin-Wessler ........ = = 1320 UIlmg
P.231 HH: Title USP ................ = 16.2 IU / mg
Title Yin-Wessler ........ = 1400 IU / mg
P 194 HH A: Title USP ................ = 82 u / mg
Yin-Wessler titre = 900 u / mg
P 242 HH A: USP titre ................ = 16 ui / mg
Yin-Wessler titre = 1800 u / mg
P 255 HH A: Title USP = = 36 ui / mg
Title Yin-Wessler = 2145 u / mg
The P 242HHA fraction was subjected to NMR analysis for carbon 13 (13C) (Figures 7 and 8). The same was done with the standard 7071HH standard heparin (Fig. 6). The analysis is carried out on each of the fractions (in solution in the dentined water at the rate of 100 mg in 1 ml of D20 with a device
VARIAN CFT-20, 20 MHz, equipped with a transformer system
FOURIER (reference for measuring chemical shifts
TMS).

On remarque - pratiquement l'absence de signal de résonance caractéristi
que de la présence de groupes OH sur le carbone primaire
(en position 6 des motifs glucosamine contenus dans les
fractions mucopolysaccharides de l'invention), - des signaux supplémentaires (non contenus dans le spectre RMN
de l'héparine de référence dans la région des signaux (I1) et
(G1), dans des régions correspondant à des déplacements chi
miques de l'ordre de 100 ppm, - un signal supplémentaire dans la région 60 ppm près du
signal (G2), - la présence d'un signal de résonance dans la région 75 ppm
(auquel normalement ne correspond sensiblement aucun signal
de résonance dans des spectres de RMN réalisés dans des con
ditions semblables avec une héparine classique), (les indications de déplacements chimiques sus-indiqués sont appréciées vis-à-vis du CH3 des groupes N-acétyl glucosamine contenus dans les MPS selon l'invention (région de 25 ppm dans les spectres joints N-Ac dans les figures 7 et 8).Note - practically the absence of characteristic resonance signal
than the presence of OH groups on the primary carbon
(in position 6 of the glucosamine units contained in the
mucopolysaccharide fractions of the invention), - additional signals (not contained in the NMR spectrum
reference heparin in the signal region (I1) and
(G1), in regions corresponding to shifts
100 ppm, - an additional signal in the 60 ppm region near the
signal (G2), the presence of a resonance signal in the region 75 ppm
(to which normally does not correspond substantially any signal
of resonance in NMR spectra made in cones
similar conditions with conventional heparin), (the above-mentioned chemical shift indications are preferred for the CH 3 of the N-acetyl glucosamine groups contained in the MPS according to the invention (region of 25 ppm in the joined spectra N -Ac in Figures 7 and 8).

Les signaux particuliers aux fractions ou composés selon l'invention sont marqués d'un astérique dans les fig. 7 et 8. The signals peculiar to the fractions or compounds according to the invention are marked with an asterisk in FIGS. 7 and 8.

La fig. 8 comporte également la courbe d'intégration CI,laquelle permet de constater que - le composé étudié est homogène, donc pratiquement pur, - il présente les caractéristiques d'un décasaccharide, - il comporte une unité N-acétyl-glucosamine, pour deux unités
acide iduronique 2-O-sulfate et pour deux unites N-sulfate
glucosamine.Fig. 8 also includes the integration curve CI, which makes it possible to observe that the studied compound is homogeneous and therefore essentially pure, has the characteristics of a decasaccharide, and comprises an N-acetylglucosamine unit for two units.
iduronic acid 2-O-sulfate and for two N-sulphate units
glucosamine.

Les fractions selon l'invention sont particulièrement actives in vivo. The fractions according to the invention are particularly active in vivo.

Des lapins ont reçu 500 UI/kg par voie sous-cutanée. Rabbits received 500 IU / kg subcutaneously.

Il s'agit d'une dose importante donnée intentionnellement,les lapins ayant beaucoup plus d'antithrombine que les humainsDn constate que 500 UI Yin et Wessler provoquent dans la deuxième heure chez le lapin une héparinémie de 0,85 UI/ml exprimée en unités anti-Xa, alors qu'il n'y a que 0,15 ml exprimée en TCK (temps de céphaline-kaolin).This is a large dose given intentionally, rabbits having much more antithrombin than humans. It is found that 500 IU Yin and Wessler cause in the second hour in the rabbit a heparinemia of 0.85 IU / ml expressed in units anti-Xa, whereas there is only 0.15 ml expressed in TCK (thromboplastin-kaolin time).

Comparativement : 500 UI/USP de l'héparinate de calcium normal donnent 0 > 55 Ut/ml exprimée enanti-Xa contre 0,30 UI/ml en TCK. Comparatively, 500 IU / USP of normal calcium heparinate gives 0> 55 μg / ml expressed as anti-Xa against 0.30 IU / ml in TCK.

On constate donc que l'action de 500 UI anti-Xa est plus forte que celle de 500 UI USP d'une héparine normale par le dosage de Yin-Wessler. Le résultat est inversé quand on s'exprime en TCK. It is therefore found that the action of 500 IU anti-Xa is greater than that of 500 IU USP of a normal heparin by the Yin-Wessler assay. The result is reversed when one speaks TCK.

Les fractions ou composés selon l'invention peuvent être utilisés sous toutes les formes de sels thérapeutiquement utiles, notamment de métaux physiologiquement acceptables (sels de sodium, calcium, magnésium ou sels mixtes).Onpasse éventuellement de l'un à l'autre par le procédé décrit dans la demande de brevet nO 73 13580 déposée le 13 avril 1973, au nom de la demanderesse. The fractions or compounds according to the invention can be used in all the forms of therapeutically useful salts, in particular of physiologically acceptable metals (sodium salts, calcium, magnesium or mixed salts). Possibly from one to the other by the process described in patent application No. 73 13580 filed April 13, 1973, in the name of the applicant.

Les essais in vitro et in Vivo sont donc tous deux dans le sens- d'une action de la fraction mucopolysaccharidique de l'invention -nettement plus sélective, notamment au niveau de l'inhibition du facteur Xa, que celle de l'héparine de référence. The in vitro and in Vivo tests are therefore both in the sense of an action of the mucopolysaccharide fraction of the invention, which is more selective, particularly in terms of the inhibition of factor Xa, than that of the heparin of reference.

Les fractions mucopolysaccharidiques selon l'invention sont atoxiques. L'administration de 100 mg/kg ntentraîne chez le'lapin aucune réaction toxique et aucun effet pyrogène dans le test de pyrogénicité sur le lapin conforme à la Pharmacopée française. The mucopolysaccharide fractions according to the invention are non-toxic. Administration of 100 mg / kg did not induce any toxic reaction and no pyrogenic effect in rabbit pyrogenicity test according to the French Pharmacopoeia.

L'invention concerne donc plus particulièrement des fractions mucopolysaccharidiques du type qui vient d'être décrit, ayant notamment une activité d'au moins 700, de préférence au moins 900, et même de façon plus avantageuse encore d'au moins I.WO UI/mg (titre Yin-Wessler). Elle concerne également les préparations pharmaceutiques, ayant des activités semblables, -exemptes de substances pyrogènes, et en association avec des excipients pharmaceutiques.Elle concerne en particulier des solutions concentrées de ces fractions, injectables, stériles, utilisables en thérapeutique pour le contrôle de la coagulation sanguine, de façon particulièrement avantageuse pour la prévention des thromboses ou embolies post-opératoires, ces solutions contenant de 1.000 à 100.000 UI (Yin-Wessler)/ml de la fraction muco polysaccharidique, de préférence de 5.000 à 50.000, par exemple de 25.000 UI/ml, lorsque ces solutions sont destinées à l'injection sous-cutanée ou contenant encore par exemple de 500 à 10.000, par exemple 5.000 unités UI/ml de la fraction mucopolysaccharidique, lorsqu'elles sont destinées à l'injection intraveineuse ou à la perfusion. The invention therefore relates more particularly to mucopolysaccharide fractions of the type just described, in particular having an activity of at least 700, preferably at least 900, and even more advantageously of at least I.WO IU. / mg (Yin-Wessler title). It also relates to pharmaceutical preparations having similar activities, free of pyrogenic substances, and in combination with pharmaceutical excipients. It relates in particular to concentrated solutions of these fractions, injectable, sterile, used therapeutically for the control of coagulation. particularly advantageous for the prevention of thromboses or postoperative emboli, these solutions containing from 1,000 to 100,000 IU (Yin-Wessler) / ml of the mucopolysaccharide fraction, preferably from 5,000 to 50,000, for example 25,000 IU. / ml, when these solutions are intended for subcutaneous injection or still containing, for example, from 500 to 10,000, for example 5,000 IU / ml units of the mucopolysaccharide fraction, when they are intended for intravenous injection or for infusion.

La fraction mucopolysaecharidique selon l'invention est avantageusement sous forme de sel d'au moins un métal physiologiquement acceptable, tel que le sodium et/ou le calcium. Avantageusement, ces proportions pharmaceutiques sont présentées sous forme de seringues à n'utiliser qu'une fois, prêtes à l'emploi au moment approprié. The mucopolysafety fraction according to the invention is advantageously in the salt form of at least one physiologically acceptable metal, such as sodium and / or calcium. Advantageously, these pharmaceutical proportions are presented in the form of syringes to be used once, ready for use at the appropriate time.

Les compositions selon l'invention sont particulièrement adaptées au contrôle (préventif ou curatif) de la coagulation sanguine chez l'homme ou l'animal, notamment dans ceux des cas où l'hôte est soumis à des risques d'hypercoagulabilité, plus particulièrement ceux résultant d'une perturbation de la phase extrinsèque susdite, par exemple comme conséquence d'une libération par l'organisme de thromboplastine, par exemple de thromboplastine tissulaire (interventions chirurgicales, processus athéromateux, développement de tumeurs, perturbations des mécanismes de la coagulation par des activateurs bactériens ou enzymatiques, etc.).Dans le seul but d'illustrer l'invention, et sans que l'on puisse y trouver de cause à limiter la protection de l'invention, on indiquera ci-après, à titre d'exemple, une posologie susceptible d'être utilisée chez l'homme : elle comprend par exemple l'administration au patient de 1.000 à 25.000 UI par voie sous-cutanée, deux à trois fois par jour, selon le niveau des risquesdthypercoagulation ou l'état thrombotique du patient, ou de 1.000 à 25.000 UI par 24 heures par voie intraveineuse, en administration discontinue à intervalles réguliers ou de façon continue par perfusion, ou encore de 1.000 à 25.000 UI (trois fois par semaine) par voie intramusculaire (titres exprimés en UI Yin-Wessler). Les doses devront naturellement, chez chaque patient, être ajustées selon les résultats des analyses sanguines préalablement effectuées, de la nature de l'affection dont le patient souffre et, d'une façon générale, de son état de santé, comme cela est bien connu. The compositions according to the invention are particularly suitable for the control (preventive or curative) of blood coagulation in humans or animals, especially in those cases where the host is subject to risks of hypercoagulability, especially those resulting from a disruption of the aforementioned extrinsic phase, for example as a result of the release of thromboplastin by the body, for example tissue thromboplastin (surgical procedures, atheromatous processes, tumor development, disruption of coagulation mechanisms by bacterial or enzymatic activators, etc.) For the sole purpose of illustrating the invention, and without it being possible to find any cause to limit the protection of the invention, it will be indicated hereinafter as for example, a dosage which can be used in humans: it comprises, for example, the administration to the patient of 1,000 to 25,000 IU subcutaneously, two to three times as much as day, depending on the level of risk of hypercoagulation or thrombotic state of the patient, or 1,000 to 25,000 IU per 24 hours intravenously, discontinuous administration at regular intervals or continuously by infusion, or from 1,000 to 25,000 IU ( three times a week) intramuscularly (titres expressed in Yin-Wessler UI). The doses will naturally have, in each patient, to be adjusted according to the results of blood tests previously performed, the nature of the condition which the patient suffers and, in general, his state of health, as is well known .

L'invention concerne également encore l'application des mucopolysaccharides selon l'invention à la constitution de réactifs biologiques utilisables au laboratoire, notamment à titre de référence de comparaison pour l'étude d'autres produits dont est testée l'activité anticoagulante, notamment au niveau de l'inhibition du facteur Xa. The invention also relates to the application of the mucopolysaccharides according to the invention to the constitution of biological reagents for use in the laboratory, in particular as a reference for comparison for the study of other products whose anticoagulant activity is tested, particularly at level of inhibition of factor Xa.

Les mesures qui ont été faites par gel-perméation et auxquelles référence a été faite à la page 7 de la présente description ont été faites, à l'aide d'un chromatographe
SPECTRAPHYSICS 3500, sur des colonnes 250 x 9 mm garnies de silice de granulométrie 10-100 microns, notamment celles commercialisées sous la désignation LICHROPHOSPHER, de solutions de ces fractions dans un tampon Na2S04 0,02 M, à raison de 1,3 mg de matière mucopolysaccharidique/ml (volume initialement déposé sur la colonne : 50 pl) et sous un débit d'élution de 3 ml/minute. La détection des matières a été faite par spectrophotométrie UV (200 mu). The measurements that were made by gel-permeation and to which reference was made on page 7 of this description were made, using a chromatograph
SPECTRAPHYSICS 3500, on columns 250 x 9 mm lined with silica with a particle size of 10-100 microns, in particular those marketed under the designation LICHROPHOSPHER, solutions of these fractions in a 0.02 M Na 2 SO 4 buffer, at the rate of 1.3 mg of Mucopolysaccharide material / ml (volume initially deposited on the column: 50 μl) and at an elution rate of 3 ml / minute. The detection of the materials was done by UV spectrophotometry (200 mu).

Claims

1. Mucopolysacoharidic fraction according to claim 1

of the main patent application, characterized, on the one hand, by

a particular affinity for antithrombin III is

demonstrating by its ability to focus on it,

in particular in a system comprising contacting this

fraction with an antithrombin III attached to a support1 such as

agarose, in a 0.2 M NaCl buffer, 0.05 M tris-HCl pH 7.5 and, on the other hand, Yin-Wessler and USP

a ratio (YW / USP ratio) of at least 6, the Yin-Wess title

Ier itself being at least 300 IU / mg.

2. Fraction according to claim 1, characterized by a

YW / USP ratio greater than 18 and a higher Yin-Wessler activity

less than 900 IU / mg.

3. Fraction according to claim 1 or 2, characterized by

a YW / USP ratio greater than 50.

4. Fraction according to any one of claims 1 to 3,

characterized by a YW / USP ratio greater than 65 with an acti

Yin-Wessler activity greater than 1,300 IU / mg.

5.- Fraction or compound according to any of the following

dications 1 to 4, characterized by an NMR spectrum for the proton

(1H), carried out on a solution of this compound dissolved in water

deuterated at 350C with a radiation of 270 megahertz (MHz), which

includes, as characteristic features of the spectrum,

resonance signals which, for chemical shifts of gold

4.8 and 5.2 ppm, are significantly lower than the signal

of resonance which is also observed for a chi displacement

in the range of 5.4 ppm (reference for the measurement of

cements: TSP (sodium 3-trimethylsilylpropionate 2,2,3,3-d4)).

6. Fraction or compound according to any one of the claims

cations 1 to 5, characterized by an NMR spectrum for carbon

13 (13C), carried out on a solution of this compound dissolved in

deuterated water with a radiation of 20 MHz, which includes,

as characteristic elements of the spectrum (reference for

displacement measurement: TMS (tetramethylsilane)

- practically no characteristic resonance signal

the presence of OH groups on the primary carbon (in posi

6) Glucosamine units contained in the fractions

mucopolysaccharides of the invention,

- additional signals in the signal region

(I1) and (G1), in regions corresponding to displacements

100 ppm, - an additional signal (G2) near the N-sulfated G2 signal in

the region 60 ppm,

the presence of a resonance signal in the 75 ppm region.

7.- Fraction or compound according to any one of

Claims 1 to 6, characterized by an NMR spectrum

shape to that of at least one of Figures 4, 5, 7 and 8.

8. Fraction or compound according to claim 7,

characterized in that it is formed by a homogeneous oligosaccharide

still presenting the additional features sui

vantes:

it comprises from 8 to 12, in particular ten mono-saccharidi motifs

which

- all the primary positions of the glucosamine units of this

oligosaccharide are sulfated

this oligosaccharide comprises an N-acetylglucosamine unit

for two units iduronic acid 2-O-sulfate and for two

N-sulfate-glucosamine units, the other saccharides being

of different nature and having distinct substituents.

9, - fraction or compound according to claim 8,

tered by a molecular weight of about 2,000 to about

3,000, including about 2,500.

10.- Process for obtaining a fraction or a

compound according to any one of claims 1 to 9,

applied to a raw material being formed of a fraction,

it is itself characterized.

in that, in a gel filtration operation on a column

polyacrylamide and agarose gel, in the form of pearls,

of the type marketed under the designation ULTROGEL AcA 44,

this fraction passes after elution of a volume of 2.5 liters,

dead volume not included, when gel-filtration is con

at a flow rate of 200 ml / hour, in a column having

a diameter of 100 mm and a height of 1 m and when the

mucopolysaccharide concentration and the volume of the

solution placed on the column were respectively of

50 mg / ml and 37.5 ml, most of this fraction being

especially contained in the 1.5 liters of eluate that pass

then; - by a retention time of the order of 5.7 to 7.5, in particular

from 6.6 to 7.0 minutes in a column, in a gel system

column permeation with silica granulometry

10-100 microns, 250 mm high and 9 mm in diameter,

when 50 μl of a solution of 1.3 mg / ml of this fraction

in 0.02M Na2SO4 buffer, having been placed on this colon

then, the elution of said fraction under

a flow rate of 3 ml / minute, this process consisting in performing a selective attachment of the fraction or compound of the present invention to antithrombin

III, in particular by contacting the initial fractions with antithrombin III fixed on a support, in particular agarose, in a buffer such as 0.2M NaCl, 0.05 tris-HCl

M pH 7.5, then elute the fraction or fixed compound with a stronger ionic strength buffer, sufficient to produce its desorption, including a 2M NaCl buffer, 0.05 M tris-HCl.

11.- medicament containing the compound or fraction according to any one of claims 1 to 9 or that obtained by carrying out the process according to claim 10 in association with a physiologically acceptable vehicle.