FI95286B - Menetelmä kasvainten vastaisen antibiootin BU-3285T tai BU-3285T-desulfaatin valmistamiseksi - Google Patents

Description

53236

Menetelmä kasvainten vastaisen antibiootin BU-3285T tai BU-3285T-desulfaatln valmistamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää uuden kasvaimia 5 vastustavan antibiootin BU-3285T:n valmistamiseksi kasvattamalla Chainia-sukuun kuuluvaa mikro-organismia. Tämä yhdiste osoittaa korkeaa kasvaimia vastustavaa aktiivisuutta, ja sillä on myös sieniä vastustavaa aktiivisuutta. Keksintö koskee myös menetelmää BU-3285T-desulfaatin valio mistamiseksi, joka saadaan BU-3285T:n sulfaattisidoksen entsymaattisella katkaisulla tietyillä sulfataasientsyy-meillä. Desulfatoidulla johdannaisella on kasvaimia vastustavaa aktiivisuutta. Keksintö koskee myös BU-3285T:tä tuottavaa Chainia rosea ATCC 53903 viljelmää.

15 Tekniikan tason viitteiden joukossa, joista viit teistä hakijat ovat tietoisia, seuraava edustaa sitä, jonka uskotaan olevan lähinyä tekniikan tasoa.

US-patentti nro 4 495 286, joka julkaistiin 22. tammikuuta 1985, tuo esiin biologisesti puhtaan Streptomy-20 ces pulveracus -mikro-organismien alalajin fostreus ATCC 31906:n viljelmän, joka pystyy tuottamaan CL 1565 -anti-bioottikompleksia, joka on hyödyllinen antibioottina ja kasvaimia vastustavana aineena/aineina.

US-patentti nro 4 578 383, joka julkaistiin 25.

,,, 25 maaliskuuta 1986, esittää uusia fosforia sisältäviä anti- bioottisia yhdisteitä, CL 1565 ja niiden suolat, kuten myös farmaseuttisia koostumuksia, jotka sisältävät yhdisteiden erilaisia suoloja yksistään tai yhdessä muiden kasvaimia vastustavien aineiden kanssa.

30 US-patentti nro 4 680 416, joka julkaistiin 14.

.· heinäkuuta 1987, esittää uusia pyranoniyhdisteitä ja nii- v " hin liittyviä yhdisteitä, menetelmiä yhdisteiden valmista miseksi ja niiden käyttöä sytotoksisina ja/tai leukemiaa vastustavina aineina.

2 95236

Mikään näistä viitteistä ei esitä tämän keksinnön mukaisia uusia yhdisteitä tai niiden käyttöä kasvaimia ja sieniä vastustavina antibiootteina.

Kuvio 1 esittää BU-3285T:n IR-spektrin.

5 Kuvio 2 esittää BU-3285T:n ^-NMR-spektrin (400 MHz, DMSO-d6:ssa).

Tämä keksintö koskee menetelmää uuden kasvaimia ja sieniä vastustavan antibiootin, jota nimitetään BU-3285T-:ksi, valmistamiseksi fermentaatiomenetelmällä käyttäen 10 uutta aktinomykeettiä, jota tässä nimitetään Chainia rosea -kannaksi L827-7 (ATCC-53903), ja BU-3285T:n desulfatoidun johdannaisen valmistamiseksi BU-3285T:n entsymaattisella käsittelyllä tietyillä sulfataaseilla. BU-3285T-desulfaa-tilla on huomattu olevan kasvaimia vastustavaa aktiivi-15 suutta. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään.

Edullinen tuottava kanta BU-3285T:n tuottamiseksi on aktinomykeetti, kanta nro L827-7, joka eristettiin Gujaratin osavaltiossa, Intiassa kerätystä maanäytteestä.

20 Uuden BU-3285T-antibiootin ja tunnettujen sivutuotteiden, kromomysiinin, pentalenolaktonin ja aburamysiinin seos saatiin fermentoimalla tätä kantaa.

Morfologian, kasvun ja fysiologisten tunnusmerkkien ja solukemian perusteella yllämainittu tuottava kanta tun-25 nistettiin Chainia-suvuksi, toisin sanoen Chainia roseak-si.

Morfologia: llmamyseeliä ei muodostu tai sitä muodostuu vain niukalti agarkasvualustan pinnalle. Substraat-timyseelit ovat hyvin haarautuneita, eivätkä ne ole katko-30 naisia. Substraattimyseelissä syntyy pääasiallisesti pallomaisia, läpikuultavia osasia (3 - 10 pm), joissa on yksittäinen tai useampi varrellinen hyyfi, joista osasista tulee kovettuneita pallon muotoisia kappaleita (halkaisija 10 - 60 pm). Elektronimikroskoopilla tutkiminen osoittaa, 35 että pallon muotoinen pinta on aaltomainen eikä sillä ole li 95286 3 membraania. Ultraohuet preparaatit näyttävät pallojen vaipan epätasaisesti kiertävät ja osittain turvonneet hyyfit, jotka ovat liittyneet yhteen ekstrasellulaarisen metabo-liitin kanssa.

5 Ilmamyseelillä, jota tuskin muodostuu, on kiinteät tai avokierteiset itiöketjut (20 - 50 tai enemmän itiöitä ketjussa). Itiöt ovat soikeita tai pitkulaisia (0,6 x 0,8 - 1,2 pm), ja niillä on pehmeä pinta.

Kasvulliset ja fysiologiset tunnusmerkit: Ilmassa 10 kasvavaa myseeliä ei yleensä muodostu, mutta sitä nähdään niukalti ISP-kasvualustoilla nrot 4 ja 7. Substraattimy-seelin alla oleva väri on syvästä oranssista tummaan punaruskeaan. Nämä pigmentit eivät ole diffundoituvia.

Melaniinia ei muodostu, ja tyrosinaasireaktio on 15 negatiivinen.

Solukemia: Kokosoluhydrolysaatti sisältää LL-diami-nopimeliinihappoa ja mannoosia, ja siten kuuluu tyyppiin I. Fosfolipidit sisältävät fosfatidyylietanoliaminia, ja ne on siten sijoitettu malliin P-ll. Palloset sisältävät 20 2,3-diaminopropionihappoa.

Variantit: Spontaaneja variantteja, jotka muodostavat hyvin ilmassa kasvavaa myseeliä, esiintyy toistuvien siirrostusten yhteydessä.

Taksonominen asema: Palloset identifioidaan rihmas-.. 25 topakkana, joka kuvataan Chainiassa.1-2 Morfologia ja solu- kemia osoittavat, että kanta L827-7 luokitellaan Chainia-sukuun. Taulukossa 1 ja 2 esitetyt kasvun ja fysiologiset tunnusmerkit selvittivät, että kanta muistuttaa Chainia aureaa, C. flavaa, C. minutiscleroticaa, C. roseaa ja 30 C. rubraa, erityisesti suvun 15 lajin joukosta C. roseaa.

1-2,3 Siten kanta L827-7 identifioitiin uudeksi Chainia rosea -kannaksi.

95286 4 ^Lechevalier, M.P.; H.A. Lechevalier ja C.E. Heintz: Morphological and chemical nature of the Sclerotia of Chainia olivacea Thirumalachar and sukapure of the order 5 Actinomycetales. Int. J. Syst. Bacteriol. 23: 157-170, 1973 .

2

Ruan, J.; M.P. Lechevalier, C. Jiang ja H.A. Lechevalier: Chainia kunmingensis, a new actinomycete species found in soil. Int. J. Syst. Bacteriol. 35: 164-168, 1985.

3

Shirling, E.B. Ja D. Gottlieb: Cooperative description of type strain of Streptomyces. V. Additional descriptions. Int. J. Syst. Bacteriol. 22: 265-394, 1972.

il > ♦ 95286 5

/-“N

CNJ

r·*- ~ o

-i c S

u< <u '"'S

4-> C - CN vJ, c -h g ^ 2 « S ~ n 00 ή rt •H rt ™ rt ~ G. .* £ Jd 2 rt 5 « 2 2 rt τ-t rt > tO ^ Ui

rt -H -rt to — -rt rt UI

UI rt rt 3 2 rt n -rt Ui

•H rt2 3 rt rt *H ·Η "H

O Ui ™ CU rt rt rt •a o 2 g e ·5 to ή 3 rt 2 ω ^ u-t E g r-l to U-! E m rt rt •h 3 JS rt ss Ό Ui ^ > r>» ® — S u"l Mf Ϊ n-' -rt- mi· sr r; 'χ' oo oo \ — “H ' Ί v—' ' ' —i ™ to rt σ> uittoa) to c c rt in l-' ΓΓ1 3 3«! m-' rt 0) c mi- S rt to cc

•H'-' *h ^ h rt rt*H -H

rt to . o t-ι rt rt rt

UI rt tO H td 3«! UI UI

•H Ui rt euoe tO *—1 i—I

uituj»; rtrtiirt 3 <u rtrt trt^itnc h ss ss a. c m ss g ss h h > C 3 :o o C rt :o C :o -h

•H rt Ή Ui Ui -HO) rt ui rt rtulrtC

SS UI rt -H :rt .ui E *h E > -h > ,*:

Ui CO tO C Ui > tO tfl E Ui E .3 Ui _C O

rt rt rt 3 :rt ?s rt 3 3 :n 3 rt :rt rt ή E > Λ a > tn Λ u ui > u> >>> 3 to rt 3 C C uj

C rt rt I

c .«e — c i—l 3 O Ή rt *H Ή

uirtrt-H xi o ^ o E

o to > .h ^ ^ ss ss to -H

^Crtrtrt «H fH 3 rl toc

rtli 3 rt > rt -H ·Η ·Η ·Η rt rt *H ·Η *Hrt*H‘H*HtOI

3> EtOtflrt rt rt rt .3 > rt rt C > rt rt rt ·· ·Η i-ι to Uh rt s>l trt Ui 3 re -h ^ el O :rt rt λ: co > H C c C c c cm r-~ rt rtrt rt C ai to

i c ccc rt cecQ

Γ-l -H *H *H *H C ·Η rt Z

CM i—I rt i—t τ—I iH *h Ή rt I

00 .-Irt t—I ι—I rH i—I ι-l SS OJ

hJ rt E 33 3 O 3 003·—'O

• rt rtrt rtrt rt ss 3 rti rti 3 :rt en ·' C > :rt uitotrt uiu» ui SS ui 3d ui ·ι-> w rtto > SO > SO SO SO -H Jrt -H-Hjrt c rt >mO-h>loo o rt o rtrtoCrt c tx so ss ω so ss ss ss so ss so so ss -h rt rt _ C Ui ^ c? e 3

/-s ^ *H QJ

ro i o μ o en U μ t-H μ CO I ^ μ S* cd -h cd o en e äo cd r— cd 3 cd 00 E &0 μ w CO AJ - 00 ^ en cc a> cd c cd μ »h 3 r cc e tn

*H »H <U *r“) Cd C CO — ·Η *H *H

4-· rH H pH O ÖO -H μ c c 3

4-J 0) 3 00 r-H Cd *H | CL. -H 3«—I

Cd /—s 4-J 3MOW00 0) CO *H 03 » cc μ 3 co ^3>%cd 4-> >h oo ^ tn

,· U CO O CO en «H μ 3 ^ cd *H

4J &o cd iH μ (U cd 3 μ μ o Ή cd > »H Cd Cd ^ CL cd μ cd cd ?> μ c ~-i co oo *h ^ w >^co cl oo ai

co ix-h^-n e ^ cd en μ cd ^ -h o oo en μ cd ro E

«u *hojs—<ΐΓΜθι-ικΰ|ιη·Η co co co 3 en en q i <d jto*h i oo c -u c

3 OI *H O 4J O 3 cd ιΗΟίμα -H Cd*HO

^ o►i*icμ3μcdcd:cdoμ‘HC·H en o 4_»ccd cd μ<ϋθ33ε:«Γ-)θθ>μ33'^·Η o 4_» 4-i e ·ι-> 3 cdCL4J cd cdp:cd<u o en ocqj*h > ^(θο.θΗ>ρμ^ο^ζθΡ-«·μμο ^ -h ccd*n en en h en 3:cd^n >^e^CLcd μ 3 > 3>μ cd co u μ i—i »hm cd cljco^hmo) öO>^ ι-i co a>cd:cd ^ en ^ ^ ,c ^ λ: o) en oo^clco 4_i oo μ cq s > 95286 6

Taulukko 2

Kannan L827-7 fysiologiset tunnusmerkit

Hydrolyysi: laktoosi + sellobioosi + 5 gelatiini + melibioosi tärkkelys + trehaloosi + ksantiini - raffinoosi D-melezitoosi

Maito: koagulaatio + liukeneva tärk- + 10 kelys peptonisaatio + selluloosa dulsitoli

Toleranssi: inositoli +W

D-mannitoli + 15 lysotsyymi - D-sorbitoli 0,01 % 0,001 % + salisiini +

NaCl 1 - 7 % + bentsoaatti 8 % - oksalaatti + 20 pH 5,0 - 10,5 + tartraatti Lämpötila: hapon tuotto: kasvualue 18°C - 45°C adonitoli optimikasvu 35°C - 40°C dulsitoli 25 ei kasvua 14°C & 48°C erytritoli i-inositoli +

Tuotto: laktoosi + * nitraatti- -/ + D-melibioosi + 30 reduktaasi w tyrosinaasi - oC-metyyligluko- + sidi ureaasi + raffinoosi L-ramnoosi +

Hyväksikäyttö: D-sorbitoli

O O

sakkaroosi glyseroli + D-ksyloosi + il 7 55286

Taulukko 2 (j atk.) D-arabinoosi L-arabinoosi + 5 D-ksyloosi + D-riboosi + L-ramnoosi + D-glukoosi + D-galaktoosi + 10 D-fruktoosi + D-mannoosi + L-sorboosi w* * sakkaroosi_+_

Czapekin sakkaroosi-nitraatti -liemi/peptoni-nit-15 raatti -liemi * *+ω , ....

heikosti positiivinen

Chainia rosea -kannan nro L827-7 biologisesti puhdas viljelmä on talletettu American Type Culture Collec-20 tion -talletuslaitokseen, Rockvilleen, Marylandiin talle-tusnumerolla ATCC-53903.

Kuten muidenkin mikro-organismien, myös uuden, tämän keksinnön mukaisen, BU-3285T:tä tuottavan viljelmän, Chainia rosea ATCC-53903:n, tunnusmerkit ovat muuntelun ... 25 kohteena. ATCC-53903-kannan rekombinantteja, variantteja « · ja mutantteja voidaan saada aikaan käsittelemällä erilaisilla tunnetuilla mutageeneillä, kuten UV-säteily, röntgensäteily, korkeataajuiset radioaallot, radioaktiivinen säteily ja kemikaalit. Chainia rosea ATCC-53903:n luon-30 nolliset ja aikaansaadut variantit, mutantit ja rekom- ♦ binantit, jotka säilyttävät ominaispiirteen tuottaa * 4 · BU-3285T:tä, aiotaan sisällyttää tähän keksintöön.

BU-3285T:tä voidaan tuottaa viljelemällä Chainia rosean BU-3285T:tä tuottavaa kantaa, edullisesti Chainia 35 rosea ATCC-53903:a tai sen mutanttia tai varianttia, ve- ' v 55286 8 denalaisissa aerobisissa olosuhteissa vesipitoisessa ravintoalustassa. Organismi kasvaa ravintoalustassa, joka sisältää assimiloituvan hiililähteen, esim. assimiloituvan hiilihydraatin. Esimerkkejä sopivista hiililähteistä ovat 5 laktoosi, glyseroli, sakkaroosi, maissitärkkelys, glukoosi, mannoosi, fruktoosi, sellobioosi, trehaloosi, mannito-li ja ksyloosi. Ravintoalustan pitäisi sisältää myös assimiloituva typpilähde, kuten kalajauhoa, peptonia, soijajauhoa, maapähkinäjauhoa, puuvillansiemenjauhoa ja mais-10 sinliotusvettä. Epäorgaaniset ravintosuolat voidaan myös sisällyttää kasvualustaan, ja sellaiset suolat saattavat käsittää mitkä tahansa tavallisista suoloista, jotka pystyvät antamaan natriumia, kaliumia, ammoniumia, kalsiumia, fosfaattia, sulfaattia, kloridia, bromidia, nitraattia, 15 karbonaattia tai vastaavanlaisia ioneja.

BU-3285T-antibiootin tuotanto voidaan saada aikaan missä tahansa lämpötilassa, joka osaltaan vaikuttaa organismin tyydyttävään kasvuun, toisin sanoen suunnilleen 18 - 45 eC:ssa, ja sopivasti se toteutetaan noin 28 °C:n läm-20 pötilassa. Tavallisesti optimituotanto saadaan 3-4 päivän inkuboinnin jälkeen. Fermentaatio voidaan toteuttaa pulloissa ja erilaiset kapasiteetit omaavissa laboratorio-ja teollisuusfermentoreissa. Kun toteutetaan säiliöfermen-tointi, on toivottavaa tuottaa vegetatiivinen ymppi ravin-25 toliemessä siirrostamalla liemiviljelmä vinopinta- tai maaperäviljelmällä tai organismin lyofilisoidulla viljelmällä. Kun saadaan tällä tavalla aktiivinen ymppi, se siirretään aseptisesti fermentaatiosäiliön kasvualustaan antibiootin suuren mittakaavan tuotantoa varten. Kasvu-30 alusta, jossa vegetatiivinen ymppi tuotetaan, voi olla samanlainen tai erilainen kuin se, jota käytetään säiliössä uuden antibiootin tuottamiseen, kunhan se on sellainen, että saadaan hyvä mikro-organismin kasvu.

BU-3285T-antibiootin tuottamista voidaan seurata 35 fermentoinnin aikana testaamalla lieminäytteitä tai mysee-

II

95236 9

Iin kiintoaineiden uutteista antibioottista aktiivisuutta organismeihin, joiden tiedetään olevan herkkiä antibiootille. Tämän antibiootin testaamisessa hyödylliset testi-organismit ovat Candida albicans Ά9540 ja Cryptococcus 5 neoformans IAM4514. Määritys tehdään edullisesti paperi- kiekkokokeena agarmaljoilla.

Kun fermentaatio on täydellinen, BU-3285T otetaan talteen fermentaatioliemestä ja erotetaan kolmesta tunnetusta sivutuotteesta, pentalenolaktonista, aburamysiinistä 10 ja kromomysiinistä, uuttamalla sopivalla orgaanisella liuottimena, jota seuraa sarja pylväskromatografioita. Esimerkit 1 ja 2 valaisevat yksityiskohtaisia menetelmiä BU-3285T:n saamiseksi melkoisen puhdistettuun muotoon.

Esimerkki 1 15 BU-3285T:n fermentaatio

Hyvin kasvanutta Chainia rosea -kannan nro L827-7 vinopintaa käytettiin 500 ml:n erlenmeyerpullon siirrosta-miseen, jossa pullossa oli 100 ml vegetatiivista kasvualustaa sisältäen 2 % mallasuutetta (Oriental), 2 % mais-20 sinliotusvettä (Oji Corn Starch Co.), 0,5 % NaCl, 0,02 % K2HP04 ja 0,2 % CaC03 (pH 7,0, ennen sterilointia).

Vegetatiivista kasvualustaa inkuboitiin 28 °C:ssa 3 päivää pyörivässä ravistelijassa (200 rpm), ja sen jälkeen 5 ml viljelmästä siirrettiin 500 ml:n erlenmeyerpul- ,., 25 loon, joka sisälsi 100 ml tuotantoalustaa, jolla oli sa- » · · manlainen koostumus kuin vegetatiivisella kasvualustalla. Fermentaatio toteutettiin 28 °C:ssa 4 päivässä pyörivässä ravistelijassa. Antibiootin tuotanto fermentaatioliemessä määritettiin paperikiekko-agar-diffuusiomenetelmällä käyt-30 täen testiorganismina Candida albicans A9540:a.

Fermentaatio toteutettiin myös säiliöfermentorissa.

' Pullofermentaatiossa valmistetusta ymppiviljelmästä 2 1 siirrostettiin 200 l:n säiliöfermentorissa olevaan 120 litraan tuotantoalustaa. Fermentaatio toteutettiin 35 28 °C:ssa ravistelunopeudella 250 rpm ja ilmastusnopeudel- • · 95236 10 la 120 litraa minuutissa. Antibiootin tuotanto saavutti maksimin 30 pg/ml 70 tunnin fermentaation jälkeen.

Esimerkki 2

Uuttaminen ja puhdistaminen 5 Saatuun liemeen (58 1, pH 7,5), joka valmistettiin esimerkissä 1 annetun menetelmän mukaan, lisättiin n-buta-nolia (40 1) ja sekoitettiin yksi tunti. Seos jaettiin orgaaniseen ja vesipitoiseen kerrokseen Sharpies-sentri-fuugin avulla (Kokusan nro 4A). Orgaaninen uute (30 1) 10 konsentroitiin tyhjiössä atseotrooppisesti lisäämällä vettä silloin tällöin, yhteensä yksi litra. Konsentraatti lisättiin tipoittain n-heksaaniin (10 1) antibioottikomp-leksin (32,2 g) saostamiseksi tumman ruskeaksi kiinteäksi aineeksi. Raakakiintoaine liuotettiin 50 %:een vesipitoi-15 seen metanoliin (300 ml) ja se laitettiin Diaion HP-20 -kolonniin (Mitsubishi Kasei, 8 x 20 cm). Kun kolonni oli pesty 50 %:lla vesipitoisella metanolilla (2,8 1), kolonni kehitettiin 80 %:lla vesipitoisella metanolilla ja sitten 80 %:lla vesipitoisella asetonilla. Eluaatti kerättiin 120 20 ml: n fraktioissa, jotka tutkittiin paperikiekkokokeella käyttäen testikantana Cryptococcus neoformans IAM4514:ä. Aktiiviset fraktiot yhdistettiin ja konsentroitiin tyhjiössä, jotta saatiin ruskea sakka (11,0 g). Sakka kro-matografioitiin silikageelikolonnissa (Wako gel C-200, 25 4 x 70 cm) ensin käyttäen eluenttina n-heksaani-asetonia (1:1 v/v) ja sitten asetonia. Eluaatteja tarkasteltiin myrkyllisyyskokeen (C. neoformans IAM4514) ja TLC:n (Si02, n-butanoli-etikkahappo-vesi = 4:1:1 v/v) perusteella. Si-vutuoteantibioottien eluoinnin jälkeen n-heksaani-aseto-30 nilla (1:1 v/v), BU-3285T eluoitiin asetonilla. Sopivat fraktiot yhdistettiin ja konsentroitiin tyhjiössä. Sakka kromatografioitiin käänteisfaasisilikageelikolonnissa (ODS-60, 350/250 mesh, Yamamura Chemical Lab, kolonni 4 x 32 cm), joka oli esikäsitelty M/15-fosfaattipuskuri 35 (pH 7,0)-asetonitriilillä (8:2 v/v). Kun kolonni oli pesty

II

u 95236 samalla liuottimena (51), se kehitettiin M/15-fosfaatti-puskuri (pH 7,0)-asetonitriilillä (7:3 v/v) BU-3285T:n eluoimiseksi. Vastaavien fraktioiden konsentroiminen ja sitä seuraava suolan poisto Diaion HP-20 :llä tuotti puo-5 lipuhtaan kiinteän aineen (2,2 g). Kiinteää ainetta käsiteltiin EDTA:11a (2 g) 10 %:ssa vesipitoisessa metanolissa (pH 9,0, 100 ml) ja liuos laitettiin Diaion HP-20 -kolonnin (40 ml) läpi ylimääräisen EDTA:n poistamiseksi. Saatu aktiivinen kiinteä aine kromatografioitiin Sephadex LH-20 10 -kolonnissa (4 x 40 cm) käyttäen metanolia kehittävänä liuottimena. Kun eluaattia oli tarkasteltu yllä kuvatulla tavalla myrkyllisyyskokeella (C. neoformans 1AM4514) ja TLC:llä, sopivat fraktiot konsentroitiin tyhjiössä, jotta saatiin 753 mg puhdasta BU-3285T:tä valkoisena amorfisena 15 j auheena.

Fysiko-kemialliset ominaisuudet BU-3285T saatiin valkoisena amorfisena kiinteänä aineena. Tämä kiinteä aine oli liukoinen veteen, metano-liin, etanoliin ja dimetyylisulfoksidiin, jossain määrin 20 liukoinen asetoniin ja etyyliasetaattiin mutta liukenema ton kloroformiin ja n-heksaaniin. Se antoi positiivisen reaktion jodihöyryn ja rikkihapon kanssa, mutta negatiivisen reaktion ninhydriini- ja antronitesteille. BU-3285T:n FAB-massaspektri osoitti pseudomolekulaarisia ioneja m/z . , , 25 493 (M+H)*, 515 (M+Na)+ ja 531 (M+K)*, jotka vastaavat mo- • · < lekyylipainoa 492. BU-3285T:n molekyylikaavaksi osoitettiin C23H33OeSNa suuren resoluution FAB-massaspektrillä [M+NA*, m/z 515,1692; laskettuna C23H33OeSNa2, m/z 515,1714].

BU-3285T:n fysiko-kemiallisista ominaisuuksista on 30 yhteenveto taulukossa 3. IR-spektri (Kuva 1.) osoitti ab-sorptiovöitä 3400, 2930, 1720, 1635, 1460 ja 1260 cm_1:ssä. Vahva karbonyyliabsorptio 1720 cm_1:ssä viittasi a, β-tyy-dyttämättömään δ-laktoniin, ja absorptio 1260 cm_1:ssä viittasi sulfaattiryhmään antibiootissa. BU-3285T:n 35 UV-spektrillä oli tunnusomaiset maksimit 260, 269 ja 279 · « » k 12 93286 nm:ssä, jotka maksimit eivät muuttuneet happamassa tai alkalisessa liuoksessa, osoittaen konjugoitunutta trieeni- [ ryhmää molekyylissä. BU-3285T:n 1H-NMR-spektri (Taulukko 4 ja kuvio 2) osoitti kaksi metyyli- (6: 0,64 ja 0,87), vii-5 si metyleeni- (6: 1,23 - 1,29, 1,36, 2,10 ja 2,17 & 2,38), viisi metiini- (6: 1,23 - 1,29, 4,09, 4,29, 4,46 ja 4,79) ja kymmenen olefiinistä protonia (6: 5,35, 5,67, 5,74, 5,79, 5,95, 6,00, 6,14, 6,47, 6,54 ja 6,99). BU-3285T:n ; 13C-NMR (Taulukko 5) näytti 23 hiilimerkkiä sisältäen kaksi 10 metyyli- (6: 8,7 ja 13,9), viisi metyleeni- (6: 21 - 37), viisi metiini- (6: 40 - 82), kymmenen sp2- (6: 120 - 147) ja yhden karbonyylihiilen (6: 163,4).

Rakenteellinen määrittely

Kuten aikaisemmin mainittiin, BU-3285T:llä on mää-15 ritetty olevan molekyyli kaava C23H3308SNa korkean resoluution FAB-massaspektrometrillä. UV-absorptiomaksimit 260, 269 ja 279 nm:ssä viittaavat trieeniryhmän läsnäoloon antibiootissa. Sen IR-spektri sisälsi vahvoja absorptioita 1720 ja 1260 cm-1: ssä viitaten vastaavasti a, B-tyydyttä-20 mättömään 6-laktoniin ja O-sulforyhmään. Fragmentti-ioni (M-S03Na-, m/z 389) havaittiin yhdessä pseudomoleku-laarisen ionin (M-H‘, m/z 491) kanssa negatiivisessa SIMS-spektrissä, tukien mononatriumsulfaattiesterin läsnäoloa BU-3285T:ssä. Kymmenen olefiinisen protonin joukossa 25 BU-3285T:n 1H-NMR:ssä merkit 6: 5,95:ssä ja 6,99:ssä osoi tettiin vastaavasti a, 8-tyydyttämättömän δ-laktonin a- ja β-protoniksi. 1H-1H COSY -kokeessa tämä δ-protoni liitettiin pariksi hydroksyyliryhmän (6: 4,09) omaavan metiini-protonin kanssa, joka vuorostaan liitettiin pariksi toisen 30 happea sisältävän metiiniprotonin (6: 4,79) kanssa 6-lak-tonirenkaan muodostamiseksi. COSY-tutkimus selvitti lisäksi, että protoni 6: 4,79:ssä liittyi trans-kaksoissidok-seen (6: 5,69 ja 5,79) ja sitten CH2*CH(0S03Na)*CH(CH3)- CH(OH)-ryhmään aikaansaaden osarakenteen (A). Sulfaatin 35 paikka määritettiin 13C-NMR:llä, jossa C-9 resonoi huomat- 13 95286 tavan matalalla alueella (6: 71,0). Hydroksyyliryhmien paikat vahvistettiin noin yhden miljoonasosan siirtymillä alakenttään asetyloitaessa vastaavat protonit. Jäljelle jäävät kuusi olefiilista protonia (6: 5,35, 5,74, 6,00, 5 6,14, 6,47 ja 6,54) määritettiin konjugoituneena trieeni- osuutena, joka oli päätelty UV-spektristä. Havaitut kytkennät osoittivat cis, cis, trans -trienoiinista rakennetta (osarakenne B). ja 13C-NMR-spektrit osoittivat selvästi, että jäljelle jäävä osa on n-pentyyliryhmä (osara-10 kenne C, 6: 21,9, 28,4, 30,8, 32,4 ja 13,9).

fl B C

i^rSV^0H OH H H

15 \ _/=\_/M -CHjCH.CH.CH.CH,

XX /λ H

OSOjN»

Pitkät 1H-13C COSY -tutkimukset osoittivat kolmen osarakenteen liittymisen luoden BU-3285T:n kokonaisraken-20 teen kuten alla.

OH

J 1 'cHpCHpCHpCHpCHo 25 ^^SlSOgN.

Edellisestä on määritetty, että uusi kasvaimia vastustava antibiootti BU-3285T, jota tuotetaan fermentoimal-la Chainia rosea -kantaa nro L827-7, on hapan hydrofiili-30 nen yhdiste, joka näyttää tunnusomaisen trieeniabsorption UV-spektrissä. Rakenteen tutkimukset käyttäen kaksiulot- ♦ teisia NMR-kokeita ja massaspektrometriaa ovat osoittaneet, että BU-3285T on uusi molekyyli, jolla on pyroniren-gas, konjugoitunut trieeni ja mononatriumsulfaattiosa.

35 Rakenne liittyy osittain fostriesiinin rakenteeseen ja sen • » 14 95286 analogioihin. Kuitenkin se on erilainen kuin tunnetut antibiootit siinä, että sillä on mononatriumsulfaattiesteri-toiminnallisuus.

BU-3285T osoittaa in vitro sieniä vastustavaa ak-5 tiivisuutta ja sytotoksisuutta ja voimakasta in vivo ehkäisevää aktiivisuutta hiireen siirrettyä P388- ja L-1210-leukemiaa ja B16-melanoomaa vastaan. Rakenteellisesti läheisesti yhteen liittyvästä fostriesiini-antibiootista ja sen analogioista on raportoitu, että niillä ei ole sieniä 10 vastustavaa aktiivisuutta eikä kasvaimia vastustavaa vaikutusta B16-melanoomaa vastaan. BU-3285T:n huomattiin myös olevan proteiinisynteesin spesifinen inhibiittori L-1210-leukemiasoluissa.

Taulukko 3 15 BU-3285T:n fysiko-kemialliset ominaisuudet luonne : valkoinen amorfinen kiinteä aine

sulamispiste (haj.) : 123 - 125°C

20 la](c 1.0, MeOH) : + 23° UV x nm (ε) : 260(25,600), 269(31,600), 279(24,400) ; 25 molekyylikaava : C23H330gSNa FAB-massa (m/z) : 493(M+H)+, 515(M+Na)+, 531(M+K)+ 30 HR-FAB-massa : 515,1692 (M+Na)+ (laskettu C23K33°8^a2' m/z 515,1714) 35 TLC, Si02 ·· Rf 0,42 (n-butanoli-etikkahappo-vesi= 4:1:1 v/v) li 15 55286

Taulukko 4 BU-3285T:n ^-NMR-spektri (400 MHz, DMSO-ds; ssa) protoni_ BU-32B5T_ 5 23-CH3 0j 64 (3H, d, J=6.8 Hz) 22-CH3 0.87 (3H, t, J=6;8 Hz) 10 10-CH, 20-CH2, 21-CH2 lf23 - 1;29 (5H, m) 19-CH2 1j 36 (2H, m) 18-CH2 2;10 (2H, m) 15 8- CH2 2 j17 & 2 j 38 (2H, m) 4- H 4.09 (1H, dd, J=5,4 & 2f9 Hz) 20 11-H 4,29 (1H, t, J=10;2 Hz) 9- H 4,46 (1H, m) 5- H 4, 79 (1H, dd, J=7;3 & 2,9 Hz) 25 4 ti 12-H 5^35 (1H, dd, J=10,2 & 11 3 Hz) 6- H 5,67 (1H, dd, J=15;7 & 7,3 Hz) 30 17-H 5.74 (1H, m, J=15.1 & 7,3 Hz) 4 7- H 5,79 (1H, m) « « 95286 16

Taulukko 4 (jatk.) _protoni_____BU-3285T_ 5 2- H 5.95 (1 H, d, J=9.7 Hz) 15- H 6^ 00 (1H, t, J=ll.3 Hz) 10 13-H 6,14 (1H, t, J=11.3 Hz) 14-H . 6,47 (1H, t, J=11.3 Hz) 16- H 6,54 (1H, dd, J=15.1 & 11.3 Hz) 15 3- H 6;99 (1H, dd, J=9;7 & 5,4 Hz)

A 4 .OH

li 0H

20 „ „ „ U JL ch2ch2ch2ch2ch3 7 TriNOS03Na 17 95286

Taulukko 5 BU-3285T:n 13C-NMR-spektri (100 MHz DMSO-dK:ssa) C-l 163,4 (s)* 013 123.0 (d) 2 120,9 (d) 14 123,5 (d) 3 146.9 (d) 15 129,7 (d) 4 61,6 (d) 16 ' 125,6 (d) 5 ' 81,4 (d) 17 136,5 (d) 10 6 126,8 (d) 18 32,4 (t) 7 131,9 (d) 19 28,4 (t) 8 36,8 (t) 20 30,8 (t) 9 71,0 (d) 21 21,9 (t) 10 40,1 (d) 22 13,9 (q) 15 11 66,8 (d) 23 8,7 (q) 12 135,2 (d) *Multiplicity in off-resonanssispektri 20 °H » „ 0 ° I « 3 10 1213 u\ 18 n jo 21 22 U JL CH2CH2CH2CH2CH3 g 9 0S03Na , 25 BU-3285T:n kasvaimia vastustava aktiivisuus BU-3285T:tä testattiin in vitro -sytotoksisuuden suhteen useita hiiren ja ihmisen kasvainsolulinjoja vastaan ja in vivo kasvaimia vastustavan aktiivisuuden suhteen hiirissä. Mitomysiini C:tä käytettiin vertailuyhdis-30 teenä sekä in vitro - että in vivo -kokeissa. B16-F10 (hiiren melanooma) - ja Moser (ihmisen paksusuoli-peräsuolialueen syöpä) -soluja kasvatettiin logaritmiseen vaiheeseen parannellulla Eagle-minimikasvualustalla, johon oli lisätty sikiövasikan seerumia (FCS, 10 %) ja kanamysiiniä 35 (60 pg/ml); HCT-116 (ihmisen paksusuolisyöpä) -solut oli- • 95286 18 vat McCoyn 5A -kasvualustalla, johon oli lisätty FCS:a (10 %), penisilliiniä (100 U/ml) ja streptomysiiniä (100 pg/ml); ja P388 (hiiren lymfosyyttinen leukemia) -solut ja sen vinkristiinille resistentti alalinja (P388/VCR) olivat 5 RPMI 1640 -kasvualustalla, johon oli lisätty FCS:a (10 %), penisilliiniä (100 U/ml) ja streptomysiiniä (100 pg/ml).

B16-F10-, Moser-, HCT-116- ja P388-solut kerättiin ja siirrettiin 96-koloisen (B16-F10-, Moser- ja HCT-116-soluille) tai 24-koloisen (P388-soluille) kudosviljelyle-10 vyn koloihin testimateriaalien kanssa siirrostusmääriltään vastaavasti 3 x 104, 6 x 104, 6 x 104 ja 2 x 104 solua/ml. Niitä inkuboitiin 37 eC:ssa kostutetussa ilmassa, jossa oli 5 % C02 ja 95 % ilmaa, 72 tunnin ajan. Sytotoksisuus määritettiin kolorimetrisesti aallonpituudella 540 nm sen 15 jälkeen, kun solut oli värjätty 0,006 % neutraalilla punaisella liuoksella. P388-soluille elävien solujen lukumäärä määritettiin Coulter-laskurilla. Kuten taulukosta 6 näkyy, kolmessa ei-leukemia-solulinjassa, B16-F10-, HCT-166- ja Moser-soluissa, BU-3285T osoitti voimakkainta 20 sytotoksista aktiivisuutta Moser-soluja (luonnostaan esiintyviä lääkeresistenttejä soluja) vastaan. Mielenkiintoisesti tämä yhdiste osoitti melkein samaa sytotoksisuutta P388/VCR:ää vastaan kuin sen kantasoluja vastaan.

BU-3285T:n ehkäisevät vaikutukset makromolekyyli-25 biosynteesissä (DNA, RNA ja proteiini) määritettiin kasvatetuissa L1210-hiirileukemiasoluissa. Soluja (5 x 10s solua/ml) inkuboitiin yhdisteen kanssa 37 °C:ssa 15 minuuttia ja inkubointia jatkettiin 60 minuuttia merkityn pre-kursorin, 3H-tymiinin, 14C-uridiinin tai 3H-leusiinin li-30 säyksen jälkeen kasvatusseokseen. Jäähdytetyllä 5 % tri-kloroetikkahappoliuoksella pesun jälkeen solujen happoon liukenemattomaan fraktioon liittynyt radioaktiivisuus määritettiin nestetuikelaskurilla. Kuten taulukosta 7 näkyy, BU-3285T ehkäisi proteiinisynteesiä 18 kertaa voimakkaam-35 min kuin RNA-synteesiä. Tämä yhdiste ei osoittanut merkit- 95286 19 tävää ehkäisevää vaikutusta DNA-synteesiin korkeimmalla testatulla konsentraatiolla 100 pg/ml.

BU-3285T:n in vivo kasvaimia vastustava aktiivisuus määritettiin kokeellisissa hiirikasvaimissa. Naaraspuolis-5 iin CDFj-hiiriin siirrostettiin vatsaontelon sisäisesti 0,4 ml laimennettua ascites -nestettä, joka sisälsi 106 lymfo-syyttisiä leukemia-P388-solua tai 105 imuleukemia-L1210-solua, ja urospuolisiin BDF1-hiiriin siirrostettiin vatsaontelon sisäisesti 0,5 ml 10 % melanoottista melanooma-10 B16-sosetta. Testiyhdisteet annettiin vatsaontelon sisäisesti hiirille seuraavan käsittelysuunnitelman mukaan; päivinä 1, 2 ja 3(Q1D x 3)tai päivinä 1, 4 ja 7 (Q3D x 3). Kuten taulukoista 8, 9 ja 10 näkyy, BU-3285T osoitti hyvää kasvaimia vastustavaa aktiivisuutta kaikissa testatuissa 15 kasvaimissa. Verrattuna mitomysiini C:hen tämän yhdisteen aktiivisuus oli verrannollinen aktiivisuuteen P388-leuke-miaa vastaan, mutta jonkin verran heikompi B16-melanoomaa ja L1210-leukemiaa vastaan pienimmän tehokkaan annoksen muodossa.

20 Taulukko 6

In vitro -sytotoksisuus hiiren ja ihmisen kasvainsoluja vastaan___________-- - _I£s 0_IkSZmU_ 25

yhdiste B16-F10 HCT-116 Moser P386 P388/VCR

BU-3285T 13.3 3,4 0.85 3,8 '4,4 i li 1 >

mitomysiini C 0,5 0 j 8 1^.2 NO* ND

30 *ND: ei tehty 55286 20

Taulukko 7

Makromolekyyli-biosynteesin ehkäisy L1210 -leukemiasoluissa _IC50 (pg/ml)_ 5 ...

yhdiste . dna RNA proteiini BU-3285T >100 14,4 0,78 mitomysiini C 1|7 >100 >100

Taulukko 8 BU-3285T:n kasvaimia vastustava aktiivisuus P388 -leukemiaa vastaan (ip) ruumiinpai- 15 annos käsittely- MST*1 T/c non mUutos yhdiste (mg/kq/- suunnitel- (päivä) (y\ päivänä 4(g) päivä) ma (ip) - - BU-3285T 10 Q1D x 3 16,0 160*2 0,0 3 " 15,0 150*2 ' 'l]i* 1 " 14^0 140 2 +1/° 20 °/3 " 13 i 0 130*2 +1,0 0 1 " 12,0 120 +1.5 1 l i mitomysiini C 3 Q1D'x 3 20,0 200*2 -1 0

1 I

1 " 13.5 135*2 +0,5 i f 25 °r3 " 14,0 140*2 +1,0 01 " 11.5 115 +1.8 / / apuaine - QlD x3 10.0 - +1.3 • f 30 *1 keskimääräinen hengissäpysymisaika *2 osoittaa merkittävää kasvaimia vastustavaa vaikutusta (T/C > 125%) il 2i 95286

Taulukko 9 BU-3285T:n kasvaimia vastustava aktiivisuus L1210 -leukemiaa vastaan (ip)____ 5 annos käsittelv- mct*1 r/r ruumiinpai- . ,. . . . Käsittely MST T/C non muutos yhdiste,_ (mg/kg/- suunnitel- (päivä) 1%1 päivänä 6.(g) päivä) ma (ip) BU-3285T 10 Q1D x 3 10.5 . 150*2 0,0 3 " 9,0 129*2 + 1,5 10 1 " 9.0 129*2 +1,5 °,·3 " 8,0 114 +2,5 O;1 " 8,0 114 +2,3 mitomysiini C 3 Q1D x 3 13,0 186*2 -2,5 15 1 " 9,5 136*2 +0,3 ®r3 " 10,0 143*2 +2,3 °J1 " 8,5 121 +2.5 / apuaine - Q1D x 3 7^Q _ +3 i 20 } *1 keskimääräinen hengissäpysymisaika +2 osoittaa merkittävää kasvaimia vastustavaa vaikutusta (T/C > 125%) 22 S5286

Taulukko 10 BU-3285T:n kasvaimia vastustava vaikutus B16 -melanoomaa vastaan (ip)__.

*1 ruumiinpai- annos käsittely- M ST T/C non rauutos 5 yhdiste (mg/kg/- suunnitel- (päivä) 1%2 päivänä 5 ία) päivä) ma (ip) BU-3285T ΪΓ Q3D x 3 21;5 126*2 +0,5 3 " 26.5 156*2 0.0 I i 1 " 22,5 132*2 +0.5 0.3 " 20,0 118 +0.3 10 „ ' 0.1 ”. 18,5 109 + 0,8 mitomysiini C 2 Q3D x 3 34.5 203*2 0,0 1 ’’ 23,0 135*2 +1.0 I i 0.5 " 22.0 129*2 +0,3 15 ,, 0 , 25 " 20,0 118 +0 j 3 apuaine - Q3D x 3 17,0 - +0,8 20 *1 keskimääräinen hengissäpysymisaika *2 osoittaa merkittävää kasvaimia vastustavaa vaikutusta (T/C > 125%) 25 BU-3285T:n in vitro sieniä vastustava aktiivisuus • In vitro sieniä vastustava aktiivisuus määritettiin erilaisia sieniä vastaan sarja-agarlaimennusmenetelmällä. Sabouraud-dekstroosiagaria (pH 7,0) käytettiin kokeeseen. Siirrostusmäärä säädettiin arvoon 106 CFU/ml. Neljänkymme-30 nen tunnin inkuboinnin jälkeen 28 °C:ssa, pienin ehkäisevä konsentraatio (MIC) tutkittiin. Kuten allaolevasta yhteenvedosta selviää, BU-3285T osoitti suhteellisen hyvää ja laajaa sieniä vastustavaa profiilia.

9 23 95286 _MIC (iig/ml)_ amofote- ketoko-risiini natsoli

_ testiorgamsmi BU-3285T B

O

Candida albicans IAM4B88 25 16 50 C. albicans A9540 25 1/6 50

Crvptococcus neoformans D49 1^.6 0;8 0/4

Cj_ neoformans IAM4514 1/6 · 0/. 8 0/4

Aspergillus fumiqatus IAM2530 25 3^1 3^.1 A. fumiqatus IAM2034 >100 3^.1 6/3 A. f1avus FA21436 50 1/6 0/4

Fusarium moniliforme A2284 25 3^1 6/3 m Piricularia orvzae D91 50 12 5 31 J-D f j

Trichophyton mentaqrophvtes D155 25 63 1,6 f ί T. mentaqrophvtes #4329 12.5 63 16 ' r 1

Blastomyces dermatidis D40 12,5 12 5 04 / ' t

Sporribhrix schenckii IF08158 100 >100 6.3 / 2q Petriellidium bovdii IF08078 0/. 8 >100 1^6

Mucor spinosus IF05317 25 6.3 100 t Tämän patenttihakemuksen ensimmäinen prioriteetti-hakemuksen jättämisen jälkeen tiettyjen sulfataasientsyy-25 mien huomattiin katkaisevan BU-3285T:n sulfaattisidoksen · tuottaen desulfatoidun BU-3285T:n, jolla on kaava t

^ .OH

: 0H

30 U JL ch2ch2ch2ch2ch3 Ί)Η ; Desulfatoitu johdannainen osoitti samanlaista in « i vitro sytotoksisuutta kuin kanta-antibiootti. Desulfatoitu yhdiste ei ollut aktiivinen yhdessä in vivo -testissä, 35 joka toteutettiin hiiren lymfosyyttisessä leukemia • . · · 24 95286 P388:ssa. Desulfatoitu yhdiste ei osoittanut aktiivisuutta sieniä vastaan in vitro.

BU-3285T:tä käsiteltiin sulfataasientsyymeillä, Joita saatiin erilaisista lähteistä (Taulukko 11.; Sigma 5 Chemical Co. ) pH:ssa 7,5 tai pH;ssa 5,0. Tuotteet analysoitiin silikageeli-TLC:llä (Kiesel-geeli 60F254 ) detektoi-malla 0D 254 nm:ssä (Shimadzu Co.). Kuten on kuvattu taulukossa 11., H-5-sulfataasi (S-3009 tyyppi H-5) tuotti BU-3285T:n desulfatoitua johdannaista hyvällä saannolla sekä 10 pH:ssa 7,5 että 5,0. Kolme muuta sulfataasia, jotka on luetteloitu taulukkoon, tuottivat myös desulfaattia, mutta paljon pienemmällä saannolla. Esimerkki 3 valaisee desul-fatoidun BU-3285T:n valmistusta.

Taulukko 11 15 BU-3285T:n sulfataasireaktio desulfatoitu j51^ 1)0 'TyyPP1 lähde dH* BU-32BST <·/.) S-3009 H-5 Helix pomatia 7^5 90 5;0 90 20 S-8629 V Limpets (Petella vulgata) 7;5 2 5j0 2 S-1629 VI Aerobactor aerogenes Ίχ 5 3 S-9629 VII Abalone Entrails 7^5 5 5/° 5 25 : *puskuri 0,1M Tris-HCl, pH 7,5 0^ 2M asetaatti pH 5;0 reaktio-olosuhteet * « —^-^.1 I—Il 30 substraatti(BU-3285T, 0?4 mg/50 yl-H?0) jokainen entsyymi 5 yksikköä/100 yl -puskuri : : jokainen puskuri 200 yl « · j : H20 150 yl 35 yhteensä 500 yl

’ · * Q

\ inkuboi 37 C:ssa, 18 tuntia • ·· ♦ ·· « • · • · « «

II

25 55286

Detektio: Reaktioseos 20 μΐ laitettiin silikageeli-levylle (Merck Co.) ja levy kehitettiin CHCl3-MeOH (5:1, v/v) -liuotinsysteemissä. TLC-levy tutkittiin lukemalla OD 254 nm:ssä.

5 Esimerkki 3 BU-3285T-desulfaatin valmistus

Bli-3285T:n (45 mg) ja sulfataasin (28 mg, S-3009 tyyppi H-5) liuosta 0,1 M tris-HCl-puskurissa (pH 7,5, 10 ml) inkuboitiin 37 °C:ssa 18 tuntia. Reaktioseos kaadet-10 tiin veteen (40 ml) ja uutettiin sitten kahdella 50 ml:n annoksella etyyliasetaattia. Uutteet yhdistettiin ja haihdutettiin kuivaksi tyhjiössä, jotta saatiin vaalean keltainen sakka (27 mg). Sakka puhdistettiin preparatiivisel-la TLC:llä käyttäen metyleenikloridi:metanoli (5:1 v/v) 15 -liuotinsysteemiä ja sen jälkeen pylväskromatografiällä Sephadex LH-20:llä (2 x 40 cm) käyttäen metanolia kehittävänä liuottimena. Kun eluaattia oli tarkkailtu TLC:llä (Si02, metyleenikloridi:metanoii, 5:1 v/v) sopivat fraktiot yhdistettiin ja konsentroitiin tyhjiössä, jotta saatiin 8 20 mg BU-3285T-desulfaattia valkoisena amorfisena jauheena.

BU-3285T-desulfaatin fysiko-kemialliset ominaisuudet BU-3285T-desulfaatti saatiin valkoisena amorfisena kiinteänä aineena. Tämä kiinteä aine liukenee metanoliin, 25 etanoliin, asetoniin ja dimetyylisulfoksidiin, se liukenee jonkin verran veteen, mutta on liukenematon hiilitetraklo-ridiin ja n-heksaaniin. Se antoi positiivisen reaktion jodihöyrylle ja rikkihapolle, mutta negatiivisen reaktion ninhydriini- ja antronitesteille. BU-3285T-desulfaatin 30 positiivinen FAB-massaspektri osoitti pseudomolekulaari-siaioneja kohdissa m/z 413 (M+Na)* ja 429 (M+K)+, mikä vastaa molekyylipainoa 390. Sen molekyylikaava arvioitiin C23H3405: ksi spektrometrianalyyseillä, ehdottaen, että se oli BU-3285T:n desulfatoitu johdannainen. BU-3285T-desul-35 faatin fysiko-kemiallisista ominaisuuksista on yhteenveto 95286 26 taulukossa 12. IR-spektri osoitti absorptiovöitä 3410, 2930, 2850, 1715, 1670, 1635, 1450, 1380, 1085 ja 1035 cm^rssä. Sulfaattiryhmään viittaava vahva absorptio 1260 cm_1:ssä havaitaan kanta-antibiootissa, mutta se puuttuu 5 tuotteesta. BU-3285T-desulfaatin UV-spektrillä on absorp-tiomaksimit 260, 270 ja 280 nmrssä, jotka eivät muuttuneet happamassa ja alkalisessa liuoksessa kuten ei BU-3285T:n tapauksessakaan, osoittaen molekyylin konjugoituneen tri-eeniryhmän retention. Sen XH-NMR-spektri (Taulukko 13) 10 muistuttaa läheisesti BU-3285T:n spektriä paitsi, että sulfaattiryhmän omaavaan hiiliatomiin liittynyt metiini-protoni jälkimmäisessä siirtyi yläkenttään (6 4,46:sta δ 3,94:ään) edellä mainitussa. Nämä spektritiedot osoittavat, että tuote säilytti kaikki muut rakenteelliset piir-15 teet, mutta sisälsi hydroksyyliryhmän BU-3285T:n sulfaattiryhmän tilalla.

Taulukko 12 BU-3285T-desulfaatin fysiko-kemialliset ominaisuudet 20 luonne : valkoinen amorfinen kiinteä aine

sulamispiste (haj.) : 223 - 226°C

UV *Me0Hnm (e) : 260(25,300), 270(31,500), max ' 280(24,600) 25 molekyylikaava : C23^3405 FAB-massa : 413(M+Na) , 429(M+K) 30 TLC, SiO^ n-butanoli-etikkahappo-vesi = 4:1:1 v/v : Rf 0^70 CH2Cl2-MeOH =5:1 v/v : Rf 0,62 27 95286

Taulukko 13 BU-3285T:n ja sen desulfaattijohdannaisen 1H-NMR -spektri (400 MHz DMS0-d6:ssa) 5 protoni _BD-3285T___ BU-3285T-desulfaatti 23-CHj 0,64 <3H. d. >6,8 Hz) 0,67 <3H. d. >6,8 Hz) 22-CHg 0,87 (3H. t. >6,8 Hz) 0;86 (3H, t. >6,5 Hz) 1Q ]0-CH,20-CH2.21-CH2 1,23 - 1.29 (5H. ) 1,23 - 1.26 (58.1) 19-CH2 1,36 (2H. ) 1,36 <2H. ) 18-CH2 2.10 (28. ) 2,11 (2H. ) 8- CH2 2,17 £ 2.38 (2H. ) 2fll £ 2,20 (2H. ) 4- H 4,09 (1H. dd. J-5;4 £ 2,9 Hz) 4,05 0H.«) 5 ll-H 4,29 UH. t. >10,2 Hz) 4,33 UH. ) 9- H 4,46 UH. ) 3,94 UH. ) 5- H 4,79 UH. dd. J«7;3 £ 2,9 Hz) 4,8t UH. dd. >7.7 £ 2,5 Hz) 12- H 5,35 UH. dd. >10,2 fi 11,3 Hz) 5,38 UH. ) 6- H 5,67 UH. dd. >15.7 £ 7,3 Hz) 5,67 UH. ) 2Q 17-H 5,74 UH. . >15,1 £ 7,3 Hz) 5.71 UH. ) 7- H 5,79 UH. ) 5,84 UH. ) 2- B 5,95 UH. d. >9,7 Πζ) 5,98 UH. d. >9.8 Rz) 15- H 6,00 UH. t. >11,3 Hz) 6,00 UH. ) 13- H 6,14 UH. t. >11,3 Hz) 6.15 UH. t. >11,1 Hz.) 25 14-H 6,47 UH. t. >11,3 Hz) 6,48 UH. t. >11.1 Hz) 16- H 6,54 UI, dd. >15,1 £ 11,3 Hz.) 6,52 (1H. dd. >15,2 fi 11,1 Hz) 3- H 6,99 UH. dd. >9,7 fi 5,4 Hz) 7,01 UH. dd. >9,8 £ 5,5 Rz) BU-3285T-desulfaatin kasvaimia vastustava aktiivisuus 30 BU-3285T:tä ja sen desulfatoitua johdannaista, BU- 3285T-desulfaattia, tutkittiin vertaillen in vitro -syto-toksisuuden suhteen hiiren ja ihmisen kasvainsolulinjoja vastaan.

Bl6-F10:tä (hiiren melanoomaa), HCT-116:ta (ihmi-35 sen paksusuolisyöpää), A549:ää (ihmisen keuhkosyöpää) ja • · < 28 S5286 A549/VP29:ää (A549:n etoposidiresistenttiä alalinjaa) kasvatettiin Eaglen MEM-alustalla (Nissui), johon oli lisätty FCS:a (vasikkasikiön seerumia, 10 %) ja ei-välttämättömiä aminohappoja (B16-F10), tai McCoyn 5A -alustalla (Gibco), 5 jossa oli FCS:a (10 %), välttämättömiä ja ei-välttämättö-miä aminohappoja, vitamiineja ja antibiootteja (HCT-116 ja molemmat A549) 37 °C:ssa kostutetussa ilmassa 5 % C02 -in-kubaattorissa. Eksponentiaalisesti kasvavat B16-F10-, HCT-116- ja A549-solut kerättiin, laskettiin ja suspentoitiin 10 kasvualustaan vastaavasti 1,5 x 104, 3 x 104 ja 3 x 104 so-lua/ml. Sen jälkeen, kun 180 μΐ solususpensiota oli laitettu 96-koloisen mikrotiitterin koloihin päivänä 0, tes-timateriaalit (20 μΐ) lisättiin päivänä 1 ja levyjä inku-boitiin 72 tuntia. Sytotoksinen aktiivisuus määritettiin 15 kolorimetrisesti aallonpituudella 540 nm sen jälkeen, kun elävät solut oli värjätty neutraalilla punaisella liuoksella. Tuloksista on yhteenveto taulukossa 14. Sekä BU-3285T että BU-3285T-desulfaatti olivat melko aktiivisia hiiren ja ihmisen kasvainsolulinjoja vastaan ja niiden 20 IC50-arvot olivat vastaavasti 1,9 - 38 pg/ml ja 5,5 - 14 pg/ml. Mielenkiintoisesti desulfaatti oli melkein yhtä sytotoksinen resistenttiä kasvainsolulinjaa A549/VP29 vastaan kuin kantasolulinjaa vastaan.

29 95286

Taulukko 14

In vitro -sytotoksisuus hiiren ja ihmisen kasvainsoluja vastaan 5 ' ' _ 1CZQ (uq/ml)_

Yhdiste B16-F10 HCT-116 A549 ' A549/VP29 10 BU-3285T A 38 1;9 4^1 17

Bu-3285T-desulfaatti 14 5,5 13 15

. c Adriamysiini 0,03 0,30 ND* ND

Id i VP16 0.21 5.3 1,2 40 20 *ND: ei tehty

Edellä mainittujen yhdisteiden makromolekyylibio-synteesin (DNA, RNA ja proteiini) ehkäisevät vaikutukset määritettiin kasvatetuissa L1210-hiirileukemiasoluissa.

.. 25 Soluja (5 x 105 solua/ml) inkuboitiin testimateriaalien kanssa 37 °C:ssa 15 minuuttia ja merkityn prekursorin, 3H-tymidiinin, 14C-uridiinin tai 3H-leusiinin, lisäyksen jälkeen kasvatusseokseen vielä 60 minuuttia. Jäähdytetyllä 5 % trikloroetikkahappoliuoksella pesun jälkeen solujen 30 happoon liukenemattomaan fraktioon liittynyt radioaktiivisuus määritettiin nestetuikelaskurilla. Kuten taulukosta 15. näkyy, BU-3285T ja BU-3285T-desulfaatti ehkäisivät voimakkaasti RNA- ja proteiinisynteesin ICS0-arvoilla vastaavasti 5,8 ja 2,4 pg/ml, ja 6,1 ja 8,1 pg/ml. Sekä BU-35 3285T-desulfaatti että kantayhdiste eivät osoittaneet mer- 30 55286 kittävää ehkäisevää vaikutusta DNA-synteesissä korkeimmalla testatulla konsentraatiolla 100 pg/ral.

Taulukko 15

Makromolekyylibiosynteesin ehkäiseminen L1210 -leukemiaso-5 luissa _I-C50 (yq/ml)_

Yhdiste dna RNA proteiini 10 - - - BU-3285T A >100 5^8 2;4 BU-3285T-desulfaatti >100 6;1 8^1 15

Kuten on edellä osoitettu, BU-3285T omaa ehkäisevää vaikutusta sieniorganismeja ja nisäkkäiden pahanlaatuisia kas-20 vaimia vastaan. BU-3285T-desulfaatilla on ehkäisevää aktiivisuutta nisäkkäiden kasvaimia vastaan.

Keksintö tarjoaa mahdollisuuden terapeuttisesti käsitellä eläinisäntää, jolla on sieni-infektio, jolloin tehokas sieniä vastustava BU-3285T-annos annetaan maini-25 tulle isännälle.

*:1 On myös mahdollista terapeuttisesti käsitellä nisä- • 1 käsisäntää, jolla on pahanlaatuinen BU-3285T:lle tai BU-·. 3285T-desulfaatille herkkä kasvain, jolloin tehokas kas vainta ehkäisevä BU-3285T- tai BU-3285T-desulfaattiannos 30 tai farmaseuttinen BU-3285T:tä tai BU-3285T-desulfaattia sisältävä koostumus annetaan mainitulle isännälle.

Valmistettavia yhdisteitä voidaan sisällyttää far-* maseuttiseen koostumukseen, joka käsittää tehokkaan sie- niä vastustavan BU-3285T-määrän yhdessä inertin farmaseut-35 tisesti hyväksyttävän kantajan tai laimennusaineen kanssa.

% • · · * · 95286 31 Nämä koostumukset voidaan tehdä missä tahansa farmaseuttisessa muodossa, joka on sopiva ruuansulatuskanavan ulkopuoliselle antamiselle.

On myös mahdollista valmistaa farmaseuttinen koos-5 tumus, joka käsittää tehokkaan kasvainta ehkäisevän BU-3285T- tai BU-3285T-desulfaattimäärän yhdessä inertin farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan tai laimennusaineen kanssa. Nämä koostumukset voidaan tehdä missä tahansa farmaseuttisessa muodossa, joka on sopiva ruuansulatuskanavan 10 ulkopuoliselle antamiselle. 1 ·

Claims (3)

95286 ___________ Γ _

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen BU-3285T:n (Ia) tai BU-3285T-desulfaatin (Ib) valmistamisek-5 si, joilla on kaava /V -OM OH

10. CMjCMjCMjCHjCM, ja (la)

15. CH,cHjCMjCH,cMj^ vastaavasti, °M (ib) tunnettu siitä, että BU-3285T:tä tuottava Chainia rosea ATCC 53903 kasvatetaan vedenalaisissa aerobisissa 20 olosuhteissa vesipitoisessa kasvualustassa, joka sisältää assimiloituvat hiilen ja typen lähteet kunnes mikro-organismi on tuottanut huomattavan määrän BU-3285T:tä mainitussa kasvualustassa, ja sitten BU-3285T otetaan talteen « I ·' ’ kasvualustasta melko vapaana sivutuotteista, ja, halutta- ! 1 25 essa, kaavan I b mukaisen yhdisteen valmistamiseksi BU- 3285T saatetaan reagoimaan joko ennen talteenottoa tai talteenoton jälkeen sulfataasientsyymin kanssa, joka pys-tyyt muuttamaan BU-3285T:n halutuksi BU-3285T-desulfaatti-johdannaiseksi.

2. Biologisesti puhdas mikro-organismin Chainia rosea ATCC 53903 viljelmä. ♦ ♦ · 4 · · · * ♦ · * · · · · « · 33 55286