FI94645B - Menetelmä ja laite mikrobien kasvua estävien aineiden aktiivisuuden tutkimiseksi - Google Patents

Description

94645

Menetelmä ja laite mikrobien kasvua estävien aineiden aktiivisuuden tutkimiseksi

Keksintö kohdistuu oheisen patenttivaatimuksen 1 5 johdanto-osassa esitettyyn menetelmään mikrobien kasvua estävien aineiden aktiivisuuden tutkimiseksi sekä oheisen patenttivaatimuksen 5 johdanto-osan mukaiseen laitteeseen menetelmän toteuttamiseksi.

10 Mikrobien kasvua estävillä aineilla, kuten antibiooteilla on tärkeä asema infektiotautien hoidossa. Antibiootit määritellään mikrobien tuottamiksi yhdisteiksi, joilla on inhiboiva vaikutus tiettyihin (haitallisiin) mikrobeihin ilman haittavaikutuksia 15 isäntäorganismissa. Toisin sanoen antibiootit ovat valikoivasti myrkyllisiä.

Bakteerien herkkyys eri antibiooteille vaihtelee lajeittain. Antibioottien vaikutusta bakteereihin ja 20 kääntäen bakteerien herkkyyttä antibiootteihin kuvataan termillä antibakteerinen kirjo (mihin bakteeriin ko. antibiootti tehoaa) ja antibioottinen kirjo (mille antibiooteille ko. bakteeri on herkkä).

25 Oikealla antibiootin valinnalla on suuri vaikutus : hoitotulokseen infektiotaudeissa. Tehokkaimpien antibioottien valintaa tiettyä bakteeria kohtaan ei kuitenkaan voi tehdä in vivo tai pelkkiin edellä mainittuihin tunuslukuihin perustuen, vaan testaus on 30 suoritettava laboratorio-olosuhteissa herkkyysanalyy sillä. Luonnollisesti lopullinen "oikea" antibiootti-* hoito määräytyy kliinisin perustein, kun parhaimmat vaihtoehdot on selulottu esiin in vitro -määrityksessä.

35 Herkkyysanalyysi ei ole kertaluonteinen eli samallekin bakteerille tehdään herkkyysanalyysit kerta toisensa jälkeen. Tämä johtuu mm. bakteerikantojen erilaisuudesta ja uusista antibiooteista.

2 94645

Herkkyysanalyysissä pyritään kasvattamaan bakteeria '•standardiolosuhteissa" (lämpötila, kasvuaika, pitoisuudet jne.) antibiootin läsnäollessa. Herkkyysmääri-5 tyksen tulos on kuitenkin vain suuntaa antava, koska olosuhteet laboratoriossa poikkeavat infektiokeskuksen olosuhteista.

Herkkyysmäärityksissä käytetään pääasiassa kahdentyyp-10 pisiä menetelmiä: laimennus- ja diffuusiomenetelmät. Laimennusmenetelmässä annetaan bakteerien kasvaa vaihtelevissa antibioottipitoisuuksissa, jolloin saadaan selville matalin bakteerin kasvun estävä antibioottipitoisuus (MIC, Minumum Inhibitory Con-15 centration).

Laimennusmenetelmää käytetympi on diffuusiomenetelmä. Tässä yhteydessä käsitellään kiekkodif fuusiomenetelmää, jota myös kutsutaan lyhenteellä PDM (Paper Disk 20 Method). PDMrssä bakteeria kasvatetaan elatusainetta sisältävässä agar-maljassa. Ennen varsinaista kasvatusta eli inkubointia maljalle lisätään eri antibiootteja sisältäviä paperikiekkoja. Tämän jälkeen bakteerikasvuston annetaan kehittyä standardiolosuhteissa lämpö-25 kaapissa (lämpötila 35°C - 37°C).

• ·

Paperikiekosta diffundoituu antibioottia bakteerikasvustoon, johon muodostuu antibiootin vaikutuksella verrannollinen bakteeriton ympyränmuotoinen vyöhyke, 30 estorengas. Tämän estorenkaan halkaisija ilmaisee bakteerin herkkyyden ko. antibiootille. Halkaisijan suuruus ei kuitenkaan ilmaise absoluuttisesti antibiootin tehokkuutta, vaan lopullinen valinta riippuu lisäksi käyttökohteesta, bakteerista (mm. kasvunopeus) 35 ja antibiootista (mm. diffuusionopeus, molekyylipaino, varaus, sivuvaikutukset). Estorenkaille on talulukoitu

II

94645 raja-arvot bakteerikohtaisesti. Sekä eri antibioottien raja-arvot samalle bakteerille että saman antibiootin raja-arvot eri bakteereille luonnollisesti vaihtelevat.

5 Kasvualustana käytetty agar-malja on halkaisijaltaan n. 14 cm. Maljan pohja on päällystetty elatusaineella, johon viljeltävä bakteerikanta levitetään. Bakteeri-kerroksen päälle lasketaan antibioottia sisältävät paperikiekot (halkaisija 5 mm) . Kiekot asetellaan 10 koneellisesti tiettyyn paikkaan. Kiekkojen lukumäärä vaihtelee tutkittavasta bakteerista ja käytetystä antibioottiryhmästä riippuen (tällä hetkellä maksimi 14 kpl).

15 Tähän asti estorenkaita on mitattu täysin manuaalisesti esimerkiksi työntömitalla tai viivottimella. Mittaustulokset tallennetaan samanaikaisesti laboratorion tietojärjestelmään. Näin suoritettuna rutiininomaiseen työhön kuluu paljon aikaa ja mittausvaihe sitoo kaksi 20 työntekijää. Lisäksi mittaustuloksissa esiintyy vaihtelua eri mittaajien kesken. Myös sama mittaaja . saattaa tulkita vyöhykkeitä eri tavalla eri mittaus- kertoina. Estorenkaat eivät ole aina reunoiltaan teräviä, vaan usein ilmenee liukuvia rajoja. Varsinkin 25 tällaisissa tapauksissa esiintyy hajontaa eri mit taajien kesken.

Keksinnön tarkoituksena on poistaa em. epäkohdat ja esittää menetelmä, jolla em. alueiden mittaamista 30 kasvualustoilta voidaan nopeuttaa ja tulokset saadaan yhtenäisiksi. Keksinnön tarkoituksena on esittää myös laite, jolla em. tavoitteet saavutetaan. Tämän tarkoituksen toteuttamiseksi keksinnön mukaiselle menetelmälle on pääasiassa tunnusomaista se, mikä on esitetty 35 oheisen patenttivaatimuksen 1 tunnusmerkkiosassa, ja keksinnön mukaiselle laitteelle on tunnusomaista se, mikä on esitetty oheisen patenttivaatimuksen 5 tunnusmerkkiosassa .

4 94645

Keksinnössä käytetään automaattista mittausjärjestelmää, joka perustuu hahmontunnistukseen. Valopöydällä oleva agar-malja kuvataan videokameralla, minkä jälkeen 5 videosignaali digitoidaan mikrotietokoneessa olevassa kuvamuistikortissa. Tämän jälkeen analysoidaan digitoitua kuvaa siten, että kuvapisteiden (pikselien 1. kuva-alkioiden) harmaasävyarvojen jakauman perusteella päätellään ne harmaasävyarvot, joita vastaavat pisteet 10 sijaitsevat sen alueen sisällä, jolla antibiootti on vaikuttanut mikrobikasvustoon. Järjestelmällä voidaan myös ·'etsiä" antibioottikiekot, minkä jälkeen voidaan em. periaatteella tunnistaa niiden ympärille mahdollisesti muodostuneet ympyrät. Tiedot voidaan tallentaa 15 ja lopuksi voidaan tulostaa löydettyjen antibiootti-kiekkojen numerot, estorenkaan selkeysprosentit sekä estorenkaiden halkaisijat. Yhden agar-maljan analysointiin (enintään 14 estorengasta) keksinnön toteuttamiseen suunniteltu ohjelma käyttää maksimissaan 20 25 sekuntia. Ohjelma antaa myös monipuoliset mahdolli suudet tulostaa, hakea tiedostosta ja tallentaa kuvia sekä muokata saatuja tuloksia.

Keksintöä selostetaan seuraavassa lähemmin viittaamalla 25 oheisiin kuviin, joissa kuva 1 esittää tyypillistä keksinnön avulla tutkittavaa kohdetta, 30 kuva 2 esittää kaavamaisesti keksinnössä käytetyn menetelmän spektrin kiinnostavan välin määrityksen periaatetta, kuva 3 esittää kaavamaisesti keksinnössä käytetyn 3 5 menetelmän säde-ehdokkaan määrityksen peri aatetta ,

II

5 94645 kuva 4 esittää laitetta menetelmän toteuttamisek si, ja 5 kuva 5 esittää esimerkkiä laitteessa menetelmän toteutuksen aikana näkyvästä tiedosta.

Estorenkaan tunnistus on kolmivaiheinen. Ensin tunnistetaan kaikki antibioottikiekot ja tämän jälkeen niiden 10 ympärille muodostuneet estorenkaat. Lopuksi tulostetaan estorenkaiden numero, selkeysprosentti ja estorenkaan halkaisija. Antibioottikiekkojen tunnistus on melko yksinkertaista, mutta koska estorenkaan tummuus vaihtelee kasvuston ja elatusaineen mukaan, on esto-15 renkaan tunnistus sitävastoin huomattavasti monimut kaisempaa. Parhaimman dynamiikan saavuttamiseksi on päädytty spektrianalyysiin pohjautuvaan hahmontunnistukseen .

20 Seuraavassa kuvataan menetelmän periaatetta, joka toteutetaan laitteella, jota kuvataan tarkemmin myöhempänä.

Kasvualustasta otetaan aluksi kuva CCD-kameralla. Digi-25 toinnissa CCD-kameralla otettu kuva jaetaan ns.

; pikseleihin. Pikseli on kuva-alkio, jonka sisällä harmaasävy on vakio. Harmaasävyarvo ilmaistaan kokonaislukuna. Mitä pienemmistä pikseleistä kuva on rakennettu (resoluutio) ja mitä suurempi on harmaasävy-30 skaala, sitä parempi kuvan laatu on. Pikselien lukumäärä ja kuvan mittasuhteet ilmaistaan kuvamatriisilla, ’ joka tässä sovelluksessa on 768 x 512. Kuvamatriisin kunkin yksittäisen pikselin harmaasävy ilmaistaan luvulla 0...255 (0 = musta, 255 = valkoinen).

Tietokonepohjainen hahmontunnistus perustuu kynnysarvon eli ns. threshold -arvon asetukseen. Tunnistettavan kohteen muoto tunnistetaan vain siinä tapauksessa, että 35 6 94645 sitä ympäröivä taustan harmaasävyarvo on pienempi ja kohteen (taustasta erotettava hahmo) harmaasävy suurempi kuin threshold -arvo tai päinvastoin. Jos esimerkiksi taustan harmaasävy vaihtelee välillä 5 50...100 ja kohteen harmaasävy välillä 150...250, tulee threshold -arvon sijoittua välille 101...149, jotta kohteen ääriviivat tunnistettaisiin oikein. Mikäli threshold on välillä 51...100 lasketaan osa taustaa kuuluvaksi kohteeseen ja mikäli threshold 10 asetetaan välille 150...249, osa kohteesta lasketaan kuuluvaksi taustaan. Jos puolestaan threshold on suurempi kuin 250 tai pienempi kuin 50, ei kohdetta havaita ollenkaan.

15 Oikean threshold -arvon määrittäminen on siis avainasemassa hahmotunnistuksessa. Vasta kappaleen ääriviivojen tunnistuksen jälkeen voidaan analysoida kappaleen ominaisuuksia (ympyriäisyysaste, pinta-ala, minimi-ja maksimisäteet jne.). Normaalissa hahmotunnistuksessa 20 on siis ensin tunnettava kohteiden harmaasävy ja tämän jälkeen ••poimitaan" näistä kohteista tietyn kriteerin omaavat kohteet.

Koska agar-maljojen bakteerikasvuston ja bakteeri vapaan 25 alueen harmaasävyarvot vaihtelevat suuresti, ei mitään ··' vakiona pysyvää threshold -arvoa voida määrittää.

Toisaalta agar-maljojen reunat ja bakteerikasvuston epähomogeenisuus sekä estorenkaiden leikkaus aiheuttaa sen, että estorenkaat ovat usein pyöreästä muodosta 30 poikkeavia. Näille on tämän johdosta kehitetty oma hahmontunnistusmekanismi.

«

Vaikkakin antibioottikiekot "dipataan" agar-maljalle erityisellä koneella, eivät kiekot aina sijaitse 35 täsmällisesti oikealla paikalla. Antibioottikiekon siirtymisiä tapahtuu erityisesti asetusvaiheessa sekä agar-maljojen siirtelyssä ja käsittelyn yhteydessä.

94645 7

Kuvassa 1 on esitetty tyypillinen agar-maljan muodostama ympyränmuotoinen kasvualusta A. Kuvaan on merkitty antibioottikiekot 1-13. 14. Kiekko 14 asetetaan kiekkojen 3, 4 ja 10 väliin jäävälle alueelle.

5

Analysaattori etsii kiekon n. 16 cm2 alueelta sallitun paikan (kiinnostavan alueen keskipiste) ympäriltä. Kiinnostava alue on neliönmuotoinen alue, jota käsitellään ja jonka kuvapisteitä analysoidaan aluksi. Mitat-10 tava malja on siis aina asetettava samaan kohtaan ja suunnilleen samaan asentoon kameraan nähden. Maljan ja kameran asetteleminen oikein on helpointa laitteen monitorissa näkyvän elävän kuvan ja sen päälle asetettavan ristikon avulla, ja tämä voidaan tehdä kerran 15 alussa, minkä jälkeen kuvaukset voidaan suorittaa standardikokoisille maljoille ilman erillisiä tarkennuksia. Kameraa kohti olevassa tukialustassa ja maljassa voi tällöin olla sopivat merkit maljojen asettamiseksi oikeisiin asentoihin siten, että kiekot 20 tulevat suurinpiirtein samoihin kohtiin. Yleensä maljassa olevat kiekot erottuvat selvästi ympäristöstään. Johtuen taustan harmaasävyn suuresta vaihtelusta mitään vakioarvoa ei tässä kuitenkaan käytetä, vaan antibioottikiekkoa etsitään viidellä eri threshold-25 arvolla (140, 120, 100, 80 ja 60). Koska antibioot- • tikiekon muoto ja koko ei vaihtele (halkaisija on 0,5 cm) sekä sen harmaasävyarvo vaihtelee vain hieman (pieni vaihtelu johtuu valotusautomatiikasta), voidaan antibioottikiekko tunnistaa seuraavilla talletettujen 30 kuvapisteiden avulla saatujen tietojen perusteilla: - Harmaasävyarvo on pienempi kuin 140 - Maksimipituuden ja maksimileveyden suhde on välillä 1.1...0.9 - Pinta-ala on välillä 0.8...0.4 cm2 Tämä tarkastelu suoritetaan 14 kertaa, eli jokaisen mahdollisen sallitun antibioottikiekon paikan ympäristöstä etsitään yllämainituilla kiriteereillä. Nämä 35 8 94645 kriteerit karsivat mahdolliset roskat ja tekstit, jotka muuten olisi esim. pelkän harmaasävyarvonsa perusteella tulkittu antibioottikiekoksi.

5 Kun kaikki antibioottikiekot on löydetty, analysoidaan koko kuvan harmaasävyarvojakaumaa 1. spektriä kuvassa 2 esitetyllä periaatteella. Spektristä saadaan suuntaa antavaa tietoa bakteerikasvuston tummuudesta. Etsitään spektrin huippu, sekä tummin ja vaalein kohta, joissa 10 spektri leikkaa 0.2*maksimiarvo-rajan. Näiden väliin jäänyt alue on spektrin kiinnostava väli, eli tältä alueelta aletaan etsiä kunkin estorenkaan threshold-arvoa.

15 Kuvan 2 spektrin kiinnostavan välin määrityksen jälkeen etsitään jokaisen löydetyn antibioottikiekon ympäristön analysoimiseksi sellainen threshold-arvo, että se asettuu bakteerikasvuston ja bakteerivapaan alueen harmaasävyarvojen väliin. Tällöin estorengas tulkitaan 20 oikein. Erona kiinnostavan välin määritykselle on kuitenkin se, että johtuen bakteerikasvuston ja valaistuksen epähomogeenisuudesta sekä agar-maljan reunan synnyttämästä varjosta ei yhtä ainoaa oikeaa threshold -arvoa voida asettaa, vaan jokaiselle 25 estorenkaalle on määriteltävä oma threshold -arvo.

Kuvasta 2 voidaan huomata kaksi suurempaa (normaali-jakautunutta) piikkiä, joista toinen vastaa bakteeri-vapaan alueen ja toinen bakteerikasvuston harmaasävy-30 arvojakaumaa. Threshold-arvo tulisi siis asettaa näiden kahden väliin. Suurin ongelma tässä menetelmässä on se, että spektristä ei voida suoraan nähdä, mikä piikki vastaa bakteerivapaata- ja mikä bakteerialuetta, koska bakteerivapaa alue voi olla tummempi tai vaaleam-35 pi kuin tausta (muuttumaton bakteerikasvusto). Toisinaan taas näiden kahden piikin välille syntyy useita eri minimejä riippuen käytetystä spektrin resoluutiosta ja siitä, kuinka lähellä e.m. kaksi piikkiä

II

9 94645 toisiaan ovat. Nämä kaksi ongelmaa voidaan poistaa seuraavassa kuvaan 3 viitaten esitettävällä proseduurilla, jota voidaan nimittää STAM-menetelmäksi (spek-tripohjäinen threshold-arvon määritys). Proseduurin 5 tarkoituksena on siis määritellä kullekin estorenkaalle threshold-arvo. Yksittäisen estorenkaan threshold-arvon määritys etenee seuraavasti: 1) Määritetään estorenkaan harmaasävyarvo 10 Asetetaan kiinnostava alue siten, että sen kes kipiste on sama kuin antibioottikiekon keskipiste ja sen ala on 1 cm2. Tällöin spektrissä näkyy antibioottikiekon ja bakteerivapaan alueen piikki, joista vain jälkimmäinen osuu spektrin kiinnos-15 tavalle välille (vrt. kuva 3, kohta 1).

2) Seurataan estorenkaan piikin kehitystä Kasvatetaan kiinnostavaa aluetta, kunnes sen ala on 25 cm2, seuraten spektrissä jatkuvasti bakteeriva- 20 paan alueen harmaasävypiikkiä (vrt. kuva 3 kohta 2) .

Näin menetellään siitä syystä, että voitaisiin mahdollisimman varmasti tietää, mikä spektrin piikki vastaa estorenkaan piikkiä. Kiinnostavan alueen kokoon ei vaikuta estorenkaan koko. Jatkossa 25 kiinnostavaa aluetta ei muuteta.

3) Määritetään estorenkaalle kolme threshold -ehdokasta Kuten estorenkaan harmaasävy, myös bakteerikasvuston harmaasävy näkyy spektrissä korkeahkona piikkinä 30 (kuva 3 kohta 2). Tällöin treshold-arvoa vastaa spektrissä näiden kahden piikin välissä oleva minimi. Spektrissä on kuitenkin useita minimejä ja bakteerialueen muodostamasta piikistä ei ole varmuutta. Jotta saataisiin varmempia tuloksia on 35 päädytty menetelmään, jossa määritetään yhden threshold-arvon sijasta kolme threshold-ehdokasta.

10 94645

Proseduuri on seuraava: - Mikäli bakteerikasvusto on tummempi kuin estoren-gas, tarkastellaan spektrin kiinnostavasta välistä väliä estorenkaan spektripiikistä spektrin 5 kiinnostavan välin minimiharmaasävyarvoon. Mikäli bakteerikasvusto on vaaleampi kuin estorengas, tarkastellaan spektrin kiinnostavasta välistä väliä estorenkaan spektripiikistä spektrin kiinnostavan välin maksimiharmaasävyarvoon. 10 Analysoinnin alussa kysytään käyttäjältä onko estorengas tummempi vai vaaleampi kuin bakteerikasvusto .

- Ryhmitellään spektrin tarkasteltavan alueen pik-selien arvot viiteen yhtä suureen jakoväliin 15 (kuva 3 kohta 3) . Esimerkiksi jos bakteerikasvusto on tummempi kuin estorengas, estorenkaan piikki on määritelty kohtaan 150 ja spektrin kiinnnos-tavan välin minimi on 100, niin spektrin arvot jaetaan luokkiin 101-110, 111-120, 121-130, 131-20 140 ja 141-150 (resoluutio on kymmenen).

- Etsitään minimiä (viereisten piikkien korkeus suurempi kuin ko. piikki) estorenkaan piikistä lähtien. Mikäli kolmea minimiä ei ole löytynyt ensimmäisellä kierroksella, parannetaan spektrin 25 resoluutiota (jakoväliä pienennetään) kunnes kolme minimiä on löytynyt tai jakoväli on yksi (alkuperäinen spektri).

Jokaisen löydetyn minimin harmaasävyarvo on thres-30 hold-ehdokas. Mikäli kolmea threshold-ehdokasta ei ole löytynyt, käytetään puuttuvien threshold- ehdokkaiden kohdalla vakio-oletusarvoja.

Em. menetelmään on päädytty mm. seuraavista syistä: 35 - Estorenkaan ja bakteerin muodostamien spektripiik-kien sijainti vaihtelee (harmaasävyarvo ei ole vakio).

Il 11 94645 - Piikkien koko on verrannollinen bakteerikasvuston ja estorenkaan kokoon, eikä siis piikkien korkeudesta eikä koosta voi päätellä, mistä ko. piikki on peräisin.

5 - Spektrissä on runsaasti häiriöpiikkejä.

- Spektrin piikit eivät ole teräviä. Mikäli bak-teerivapaan- ja estorenkaan harmaasävyt ovat lähellä toisiaan, ne sekoittuvat keskenään.

10 4) Määritetään estorenkaalle kolme säde-ehdokasta

Mitataan etäisyys antibioottikiekon keskipisteestä lähimpään sellaiseen kohtaan, jossa kuvan profiili (eli pikselien harmaasävyarvo etäisyyden funktiona) leikkaa threshold-ehdokkaan arvon (kuva 3 kohta 15 4). Tätä etäisyyttä nimitetään säde-ehdokkaaksi ja niitä on siis jokaisella estorenkaalla kolme kappaletta (jokaisella threshold-ehdokkaalla yksi) . Tämä mittaus suoritetaan sinänsä tunnetulla kuvapis-teiden tietojen käsittelytekniikalla.

20 5) Valitaan oikea säde Säde-ehdokkaista valitaan se, jonka selkeysprosentti on suurin.

25 Poikkeuksen muodostavat estorenkaat, jotka koskettavat ‘ agar-maljan reunaa. Tällöin joudutaan karsimaan kaikki ne pikselit, joiden etäisyys on yli 6 cm maljan keskipisteestä.

30 Analysoinnin lopussa määritetään vielä estorenkaan . rajan selkeys, joka ilmoitetaan prosentteina. Esto- renkaan selkeysprosentti määritetään kaavalla: 35 harmaasävy fulkopix.^ _ harmaasävy (sisäpix.t * 100 „ ulkopix. lukumäärä ” sisäpix. lukumäärä 255 * 40 12 94645

Ulkopikselit otetaan 5 pikselin etäisyydeltä sädekan-didaatista sädekandidaatin ulkopuolelta ja vastaavasti sisäpikselit otetaan 5 pikselin etäisyydeltä sädekandidaatin sisäpuolelta. Mikäli selkeys on liian pieni 5 (alle 10 %) ohjelma määrittää, onko k.o. estorengas nolla vai ylisuuri. Mikäli estorenkaan spektripiikin harmaasävyarvo on pienempi kuin muiden estorenkaiden threshold-ehdokkaiden maksimiharmaasävyarvo, määritetään estorengas nollaksi. Muuten se määritetään 48 10 mm:ksi (= ylisuuri). Mikäli estorengas on tummempi kuin bakteerikasvusto, verrataan harmaasävyarvoa vastaavalla tavalla muiden estorenkaiden threshold-ehdokkaiden minimiharmaasävyarvoon. Sadan prosentin selkeyden saa ympyrä, jonka bakteerivapaa alue (esto-15 rengas) on puhdas valkoinen (harmaasävyarvo 255) ja ympäröivä bakteerikasvusto on puhdas musta (harmaasävyarvo 0) tai päinvastoin.

Analysoinnin päätteeksi laitteeseen kuuluvan PC:n 20 monitoriin ilmestyy ikkuna, josta voidaan lukea jokaisen antibioottikiekon halkaisija millimetreissä sekä selkeysprosentti. Ohjelma piirtää määrittelemänsä estorenkaat ja antibioottikiekon numeron myös agarmal-jan kuvaan ns. overlay-grafiikkana. Tulosikkunan 25 kautta voidaan helposti muokata tuloksia ja lopulta hyväksyä ne, jolloin tulokset tallentuvat tiedostoon esto.xls tai hylätä tulos. Esimerkki tulostuksesta on esitetty kuvassa 5.

30 Seuraavassa on esitetty yksi esimerkki kysymykseen tulevasta mittauslaitteesta ja oheisohjelmista. Luetellut osat eivät ole ainoita kysymykseen tulevia ja ne voidaan korvata vastaavasti toimivilla muiden valmistajien osilla, jotka ovat yhteensopivia.

35

II

94645

Kuvassa 4 esitetty mittauslaite muodostuu seuraa-vista moduleista: - Tietokone (PC) MikroMikko 5 CX486 (viitemerkintä C) 5 - Kuvandigitointikortti DT3851 - CCD-kamera Panasonic WV-BL600 (viitemerkintä K) - Värimonitori Panasonic BT-H1450Y, ei välttämätön (viitemerkintä M) - Planilux -valopöytä (viitemerkintä L).

10

Valopöydän L valaiseva pinta on peitetty levyllä P, jossa on aukko maljan asettamiseksi oikeaan kohtaan.

MikroMikko 5 on ICL:n 80486-pohjainen mikrotietokone 15 varustettuna 210MB kovalevyllä, 1.44MB levyasemalla (3.5”) ja VGA-näytönohjaimella (ATI). Keskusyksikön lisäksi kokoonpanoon kuuluu näppäimistö, VE17C monitori (17") ja hiiri. Käyttöympäristönä on Windows 3.1.

20 Kuvandigitointikortti DT2867:ssa kuva digitoidaan 768 x 512-matriisilla 8 bitin tarkkuudella (256 eri harmaasävyä). Kortilla on M/V-sisäänmeno (15-pin male right-angle D-shell -liitin) kuvien digitointia varten ja RGB-ulostulo (15-pin female high-density right-25 angle D-shell -liitin) digitoitujen ja reaaliaikaisen kuvan esittämistä varten. Kuvandigitointikortti kytketään PC:n AT-väylään muiden lisäkorttien tapaan.

WV-BL600 on tarkkailukameraksi suunniteltu valoherkkä 30 CCD-kamera. Kamerassa on käytetty kiinteäpolttovälistä autoiiris-linssiä (12mm 1:1.4 WV-LA12B2) sekä AGC:tä paremman dynamiikan saavuttamiseksi. CCD-kamerassa on BNC-liitin videosignaalia varten. Kamera on kiinnitetty valopöydän yläpuolelle erityisellä telineellä.

35 14 94645

Agar-maljoja valaistaan alta päin, jolloin antibiootti-kiekot ja estorenkaat erottuvat bakteerikasvustosta, Valopöydältä vaaditaan tasaista valaistusta, sensijaan normaali ympöristövalaistus ei häiritse mittausta.

5

Mikron digitointikortin RGB-ulostuloon on liitetty BNC-liittimillä Panasonicin BT-H1450Y värimonitori. Monitorissa näkyy joko kameran kuvaama malja reaaliajassa (signaali kiertää kuvamuistikortin kautta) tai 10 kuvamuistiin taltioitu kuva. Ohjelma kuitenkin mahdollistaa digitoidun pysäytyskuvan (frame) esittämisen myös Windows-ikkunassa, jolloin ulkoista monitoria ei tarvita.

15 Järjestelmä vaatii toimiakseen seuraavia ohjelmistoja: - Microsoft Windows 3.1 (käyttöliittymä)

Microsoft DOS 5.0 (käyttöjärjestelmä) esto.exe (ajettava ohjelma) 20 - dt2867.dll (digitointikortin ajuri)

Ohjelmassa on Windows-pohjainen käyttöliittymä se ja tarvitsee siten sekä Microsoftin DOS-käyttöjär jestelmän että Windows-käyttöliittymän.

25

Esto.exe on varsinainen ajo-ohjelma, jonka suuruus on noin 100 ktavua. Exe-ohjelma koostuu viidestä C-kielisestä ohjelmasta (app.c, apputil.c, glinit.c, imagutil.c ja tooldemo.c). Mikäli ohjelmaan tehdään 30 muutoksia, on C-kieliset ohjelmat käännettävä esto.Ink -ohjelmalla, joka sisältää oikeat optiot linkkaukseen • (n.bat on dos -pohjainen ohjelma).

Dt2867.dll -tiedostoa tarvitaan digitointikortin 35 ajuriksi, mutta mikäli käytetään muita digitointikort-teja (menetelmää on kokeiltu myös Data Translationin QuickCapture -kortilla), on käytettävä k.o. kortin 15 94645 dll-tiedostoa. Laite toimii myös ilman digitointikort-tia eräin poikkeuksin. Ohjelma hakee automaattisesti oikean dll-tiedoston työhakemiston dlls-alihakemistos-ta.

5

Automaattisen mittauksen lisäksi ohjelma sisältää useita muita tiedostoon, mittaukseen, ikkunointiin ja analysointiin liittyviä komentoja, jotka eivät sinänsä muodosta keksintöä.

10

Kun kytketään virrat päälle kameraan, valopöytään, PC:n monitoriin ja tietokoneseen sekä mahdolliseen ulkoiseen monitoriin ja printteriin, kone käynnistää automaattisesti ERA-sovellutuksen (ERA = estoren-15 gasanalysaattori). Mikäli sovellutus ei ole määrätty käynnistymään automaattisesti ja kone on Windows-tilassa, estorengasanalysaattori käynnistyy kuten muutkin Windows-sovellutukset. Sovellutuksen käynnistyessä valitaan käytetäänkö ulkoista monitoria. Valinta 20 voidaan suorittaa järjestelmästä riippumatta. Järjestelmää voidaan siis käyttää yksimonitorisena, riippumatta siitä, onko digitointikortti, kamera tai ulkoinen monitori kytketty.

25 Tiedosto -valikko sisältää komentoja, joita käytetään ·· tiedoston ja tulostuksen hallintaan. Avaa Kuva...

-komennolla voidaan hakea tiedostoihin tallennettuja kuvia ja näyttää niitä aktiivisessa puskurissa. Tallenna Kuva... -komento vastaavasti tallettaa kuvan 30 aktiivisesta puskurista tiedostoon. Kuvat voivat olla TIFF, PCX tai IRIS -formaatissa. Tulosta Kuva -komennolla voidaan ottaa paperitulostus aktiivisesta puskurista.

35 Ikkuna -valikosta löytyy eräitä yleisimpiä Windows-ikkunoiden muokkausta ja järjestelyä koskevia komentoja. Nämä komennot ovat käytössä vain yksimonitorista systeemiä käytettäessä. Ikkunoita voidaan myös muokata - 94645 kuten muissakin Windows -sovellutuksissa (venytys, vieritys, siirto, pienennys jne.). Uusi ikkuna -komento avaa uuden ikkunan ja kopioi kuvan aktiivisesta ikkunasta. Tällöin voidaan toista ikkunaa käyttää 5 ns. overlay-ikkunana, eli toiseen ikkunaan suoritetaan mittaukset toisen pysyessä puhtaana. Limittäin ja Vierekkäin -komentoja käytetään ikkunoiden uudelleen järjestelyyn. Sulje Kaikki -komento sulkee kaikki ikkunat ja Suurenna Kuva -komento maksimoi aktiivisen 10 ikkunan. Avaa Uusi Puskuri -option ollessa päällä avataan jokaiselle uudelle kuvalle uusi ikkuna.

Työkalut -valikko sisältää kaikki oleellisimmat komennot tässä sovellutuksessa. Näillä komennoilla 15 voidaan analysoida ja mitata estorenkaita sekä kalibroida ERA (estorengasanalysaattori) toimintakuntoon.

Ota Kuva -komennolla otetaan pysäytyskuvia kameralla. Analysoi -komento käynnistää analysointiohjelman, joka mittaa automaattisesti pysytyskuvassa olevan 20 agar-maljan edellisessä kappaleessa mainitulla tavalla.

Tulos -komento antaa viimeisimmän mittauksen tuloksen. Mittaustulos ilmestyy automaattisesti Analysoi ja Mittaa komentojen yhteydessä. Pyyhi -komento pyyhkii overlay-grafiikan aktiivisesta puskurista. Mittaus 25 -komennolla voidaan "manuaalisesti" mitata ympyrän halkaisija. Mittaus tapahtuu hiirellä siten, että painetaan hiiren vasenta nappia halutun ympyrän keskipisteen kohdalla ja vedetään hiirellä kuminauha-ympyrää suuremmaksi tai pienemmäksi. Mittaustulos 30 ilmestyy välittömästi Tulos- tai informaatio-ikkunana, toisin kuin Mittaa Kaikki -komennossa, jossa mittaus-*- tulos saadaan painamalla hiiren oikeata nappia.

Yksimonitorisessa systeemissä mittaus tapahtuu suoraan ikkunaan. Tällöin Mittaa Kaikki toimii optiona, joka 35 oletusarvona ei ole päällä. Ristikko-optio asetaa kuvan päälle ristikon, jonka avulla voidaan asettaa kamera oikeaan asentoon. Ristikon saa pois päältä

II

17 94645 antamalla uudelleen Ristikko-komento. Elävä Kuva -option ollessa päällä ulkoisessa monitorissa näkyy ns. livekuva. Tämä helpottaa kameran säädöissä. Elävä kuva muuttuu pysäytyskuvaksi Analysoi- ja Ota Kuva-5 komennoilla.

Sovellus lopetetaan kuten muutkin Windows-sovellutukset joko ohjausvalikkoruudusta tai Lopeta ERA -komennolla (tiedosto -valikko).

10

Esimerkki estorengasanalysaattorin peruskäytöstä 1) Kytketään monitori, kamera ja valopöytä päälle. Tämän jälkeen käynnistetään tietokone, joka käyn- 15 nistää automaattisesti estorengasanalysaattorin (määritelty autoexec.bat:ssa ja Käynnistys -ryhmä-ikkunassa) .

2) Asetetaan ensimmäinen agar-malja valopöydälle ja otetaan kuva. Mikäli kuva on kohdallaan siirrytään 20 kohtaan 4.

3) Mikäli kamera on siirtynyt tai tarkkuus ei ole kohdalla kohdistetaan kamera asettamalla elävä kuva ja ristikko ja tarkennetaan kuva kamerasta.

4) Analysoidaan estorenkaat. Ohjelma kysyy (messagewin- 25 dow), että onko bakteerikasvusto vaaleampi kuin estorengas, johon vastataan kyllä/ei/peruuta (peruuta = keskeytä analysointi).

5) Analysoinnin päätyttyä (n. 20 sekunnin kuluttua) ilmestyvät tulokset taulukoituna, jolloin voidaan 30 muokata tuloksia joko painikenäppäimistä tai hiirellä, minkä jälkeen hyväksytään tulokset.

6) Hyväksytään tulokset ja asetetaan seuraava malja valopöydälle ja analysoidaan se jne.

7) Suljetaan estorengasanalysaattori ja Windows sekä 35 suljetaan PC, monitori, kamera ja valopöytä.

18 94645

Keksintöä voidaan soveltaa kaikkien mikrobien kasvua estävien aineiden mikrobikasvustoissa aiheuttamien muutosten tutkimiseen. Aine voi olla lisätty myös 5 muilla tavoin alustalle kuin antibioottikiekkoina. Edellytyksenä on, että lisätty aine aiheuttaa havaittavan muutoksen alustan harmaasävyissä.

* «

II

Claims (8)

19 94645 Patenttivaatimukset;

1. Menetelmä mikrobien kasvua estävien aineiden aktiivisuuden tutkimiseksi, jossa tutkitaan mikrobien 5 kasvualustalle (A) lisätyn aineen aikaansaamaa muutosta kasvualustassa, tunnettu siitä, että - kasvualusta kuvataan ja saatu kuva jaetaan kuvapis-teiksi (kuva-alkioiksi), joiden harmaasävyarvot talletetaan, 10. talletettujen harmaasävyarvojen jakauma (spektri), joka kertoo kuvapisteiden lukumäärän harmaasävyar-voittain, muodostetaan jakaumasta määritetään kasvua estävän aineen aikaansaaman muutosalueen ja normaalin mikrobikasvuston 15 rajan kertova harmaasävyarvojen kynnysarvo etsimällä sopiva minimi, joka sijaitsee kuvapisteiden lukumäärää harmaasävyarvojen funktiona kuvaavassa spektrissä muutosalueen ja kasvuston kuvapisteiden muodostamien jakaumahuippujen välissä, ja määrit- 20 tämällä tätä minimiä vastaava harmaasävyarvo kynnysarvoksi, - kynnysarvon toteuttavien kuvapisteiden sijaintien avulla määritetään muutosalueen tunnusluku, kuten antibiootin aikaansaaman estorenkaan halkaisija. 25

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kasvualustan (A) kuvapisteistä etsitään lisättyä kasvua estävää ainetta sisältävää alustaa (1-14) vastaavat kuvapisteet etsimällä ne kuvapisteet, 30 jotka toteuttavat ennaltamäärätyn harmaasävyarvojen kynnysarvon. ·

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että analysoitavaa aluetta lisätyn kasvua 35 estävää ainetta sisältävän alustan (1-14) ympärillä suurennetaan vähitellen peräkkäisten harmaasävyjakau-mien aikaansaamiseksi, joiden avulla seurataan jakauman • · huippuja ja -minimejä. 20 94645

4. Jonkin edellisistä patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että jakaumasta etsitään useampi kuin yksi harmaasävyarvojen minimi sopivimmin tarkentamalla resoluutiota asteittain 5 kunnes on havaittavissa haluttu määrä minimikohtia tutkitulla spektrin välillä, minkä jälkeen laskennallisesti määritetään kutakin minimiä vastaavan rajan selkeys, ja selkeintä rajaa vastaava tunnusluku valitaan. 10

5. Laite mikrobien kasvua estävien aineiden aktiivisuuden tutkimiseksi mikrobien kasvualustalla (A) , tunnettu siitä, että se käsittää tukialustan mikrobien kasvualustan sijoittamiseksi, 15. tukialustaa kohti olevan kameran (K) kasvualustan (A) kuvaamiseksi, - välineet kuvan jakamiseksi kuvapisteiksi (kuva- alkioiksi) ja välineet kuvapisteiden harmaasävyarvojen määrittämiseksi ja tallentamiseksi, 20. välineet tallennettujen harmaasävyarvojen käsit telemiseksi ja harmaasävyarvojen jakauman (spektrin) muodostamiseksi tietynsuuruiselta alueelta eri harmaasävyarvoja vastaavien alueen kuvapisteiden • lukumäärien perusteella, 25. välineet kasvua estävän aineen vaikutusalueen ja ’· normaalin mikrobikasvuston rajaa vastaavan har maasävyarvojen kynnysarvon määrittämiseksi, jolloin välineet on järjestetty etsimään kuvapisteiden lukumäärää harmaasävyarvojen funktiona kuvaavasta 30 spektristä minimi, joka sijaitsee vaikutusalueen kuvapisteiden ja normaalin mikrobikasvuston kuvapisteiden muodostamien jakaumahuippujen välissä, ja rekisteröimään tätä minimiä vastaava harmaasävyarvo kynnysarvoksi, 35. välineet kasvua estävän aineen tehoa kuvaavan suureen laskemiseksi kynnysarvoa vastaavien kuvapisteiden avulla, ja • · · välineet mainitun suureen tallentamiseksi. 21 94645

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen laite, tunnettu siitä, että se käsittää näyttölaitteen tulosten näyttämiseksi. 5

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen laite, tunnettu siitä, että näyttölaite on järjestetty esittämään grafiikallaan kameran (K) kuvaaman kuvan sekä kuvapis-teiden analyysin tulokset samassa kuvassa (kuva 5). 10

8. Jonkin patenttivaatimuksien 5-7 mukainen laite, tunnettu siitä, että alusta kasvualustan sijoittamiseksi on valopöytä (L) , johon kuuluu teline, johon on kiinnitetty valopöytään päin suunnattu kamera 15 (K). • ·« • 94645 22