FI90996C - Menetelmä proteesipinnan endoteelisolupäällystymisen määrittämiseksi - Google Patents
Menetelmä proteesipinnan endoteelisolupäällystymisen määrittämiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI90996C FI90996C FI883209A FI883209A FI90996C FI 90996 C FI90996 C FI 90996C FI 883209 A FI883209 A FI 883209A FI 883209 A FI883209 A FI 883209A FI 90996 C FI90996 C FI 90996C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- cells
- cell
- rhodamine
- endothelial cells
- endothelial
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
- A61F2/00—Filters implantable into blood vessels; Prostheses, i.e. artificial substitutes or replacements for parts of the body; Appliances for connecting them with the body; Devices providing patency to, or preventing collapsing of, tubular structures of the body, e.g. stents
- A61F2/0077—Special surfaces of prostheses, e.g. for improving ingrowth
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
- A61F2/00—Filters implantable into blood vessels; Prostheses, i.e. artificial substitutes or replacements for parts of the body; Appliances for connecting them with the body; Devices providing patency to, or preventing collapsing of, tubular structures of the body, e.g. stents
- A61F2/02—Prostheses implantable into the body
- A61F2/04—Hollow or tubular parts of organs, e.g. bladders, tracheae, bronchi or bile ducts
- A61F2/06—Blood vessels
- A61F2/062—Apparatus for the production of blood vessels made from natural tissue or with layers of living cells
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Prostheses (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Measurement Of The Respiration, Hearing Ability, Form, And Blood Characteristics Of Living Organisms (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Farming Of Fish And Shellfish (AREA)
- Cable Accessories (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
90996
Menetelmå proteesipinnan endoteelisolupåållystymisen maå-rittåmiseksi
Keksinto koskee menetelmåa endoteelisolupeiton måå-5 rittåmiseksi proteesipinnalla, jossa menetelmåsså levite-taan endoteelisoluja mainitulle pinnalle, vårjåtåan endo-teelisolut våriaineella, joka kykenee osoittamaan fluore-soivaa emissiota valitulla aallonpituusalueella ja joka on myrkyton eikå hairitse endoteelisten solujen kasvua, va- 10 laistaan soluja valolla emission aktivoimiseksi proteesipinnan solupeiton havaitsemisen mahdollistamiseksi, ja menetelmå suoritetaan vahingoittamatta pintaa ennen sen istuttamista potilaaseen.
Keksinnon tausta 15 Patentti julkaisussa kåytetyt ylåviitteet viittaavat seuraaviin låhteisiin, jotka sisållytetåån tåten viitteina tåhån patenttijulkaisuun.
1. Edwards, W.H. ja Mulherin, J.L. The role of graft material in femorotibial bypass grafts Ann. Sura.
20 191:721, 1980.
2. Herring, M., Gardner, A., Glover, J., Seeding human arterial prosthesis with mechanically derived endothelium. The detrimental effect of smoking, J.Vasc. Sura.. 1984, 1 (2), 279-289.
25 3. Williams, S., Jarrell, B., Friend, L·., Radomski, J., Carabasi, R., Koolpe, E., Mueller, S., Thornton, S., Marinucci, T., ja Levine, E. Adult human endothelial cell compatibility with prosthetic graft material. J. Sura. Res. 38:618, 1985.
30 4. Jarrell, B., Williams, S., Solomon, L., Speicher, L., Koolpe, E., Radomski, J., Carabasi, R., Greener, D., ja Rosato, F. Use of an endothelial mono-layer upon a vascular graft prior to implantation: temperal dynamics and compatibility with the opera- 35 ting room. Ann. Sure. Vol. 203 No. 6, 671-678, 1986.
2 5. Jarrell, B., Williams, S., Stokes, G., Hubbard, F., Carabasi, R., Koolpe, E., Greener, D., Pratt, K., Radomski, J., Speicher, L., ja Moritz, M. Use of freshly isolated capillary endothelial cells for 5 the immediate establishment of a monolayer on a vascular graft at surgery. Surgery Vo. 100, No. 2, 392-399, 1986.
6. Radomski, J., Jarrell, B., Williams, S., Koolpe, E., Greener, D., ja Carabasi, R. Initial adherence 10 of human capillary endothelial cells to Dacron, painossa, J. Sure. Res.
7. Baker, K.S., Williams, S., Jarrell, B., Koolpe, E., ja Levine, E. EndothelialiZation of human collagen surfaces with human adult endothelial cells. Amer.
15 J. Sure. 150:197, 1985.
8. Durand, R., j a Olive, P. Cytocoxicity, mutagenicity and DNA damage by Hoechst 33342 J. Histochem. Cvto-chem. 30:111, 1982.
9. Williams, S., Sasaki, A., Matthews, M., ja Wagner, 20 R. Quantitative determination of deoxyribonucleic acid from cells collected on filters. Anal. Bio-chem. 107:17, 1980.
10. Greenspan, P., Mayer, E., ja Fowler, S., Nile Red: a selective fluorescent stain for intracellular 25 lipid deposits. J. Cell. Biol. 100:965, 1985.
11. Johnson, L., Walsh. M., ja Chen, L. Localization of mitochondria in living cells with rhodamine 123. P.N.A.S.. U.S.A. 77:990, 1980.
12. Jarrell, B., Shapiro, S., Williams, S., Carabasi, 30 R., Levine, E., Mueller, S., ja Thornton, S. Human adult endothelial cell growth in culture. J. Vase. Surg. 6:757, 1984.
13. Thronton, S., Mueller, S., ja Levine, E. Human endothelial cells: cloning and longterm serial cul- 35 tivation employing heparin. Science 222:623, 1983.
ii 90996 3 14. Jaffe, E.A., Nachman, R., Becker, C., ja Minick, C. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. J. Clin. Invest 52:2745, 1973.
15. Arndt-Jovin, D., and Jovin, T. Analysis ja sorting 5 of living cells according to deoxyribonucleic acid content. J. Histochem. Cvtochem 25:585, 1977.
16. Johnson, L., Summerhayes, I., ja Chen, L. Decreased uptake and retention of rhodamine 123 by mitochondria in feline sarcoma virustransformed Mink cells.
10 Cell, 28:7, 1982.
17. Chen, L., Summerhayes, I., Johnson, L., Walsh, M., Bernal, S., Lampidis, T, Probing mitochondria in living cells with rhodamine 123. Cold Spring Harbor Symposium Quant. Biol. 46:141, 1982.
15 18. Ziegler, M. and Davidson, R. Elimination of mitro- chondrial elements and improved viability in hybrid cells. Somatic Cell Genetics. 7:73, 1981.
Vaurioituneiden verisuonten korvauksesta proteesi-20 verisuonisiirrannåisillå on tullut viime vuosina toteutet-tavissa oleva kirurginen vaihtoehto. Kun suuri aukkosiir-rånnåisten kaytto on ollut huomattavan menestyksekåstå, tukkeutuvat pienet aukkosiirrånnåiset usein materiaalien trombogeenisen luonteen johdosta. On tehty yrityksiå siir-25 rånnåisten trombogeenisyyden våhentåmiseksi påålly ståmål lå ne istutusta edeltåvåsti endoteelisoluilla. Vaikka tåmå menetelmå on elåinmalleissa osoittautunut toteutettavissa olevaksi, samankaltaiset yritykset ihmisen endoteelisoluja kåyttåen eivåt ole osoittaneet parantunutta avoinnapysy-30 mistå2.
Vastikåån on kehitetty menettely ihmisen endotee-lisolujen kiinnittåmiseksi verisuonisiirrånnåismateriaa-liin in vitro3. Nyttemmin on mahdollista luoda siirrånnåi-sen pinnalle endoteeli-yksisolukerros 1-2 tunnin inku-35 boinnissa4-7. Ennen kuin tåmå menettely voidaan suorittaa 4 leikkaussalissa, tarvitaan kuitenkin yksinkertainen mene-telmå påållystymisprosessin tåydellisyyden måårittåmisek-si. Tåmånhetkiset menetelmåt endoteelisolujen visualisoi-miseksi siirrånnåismateriaalin pinnalla kåsittåvåt soluja 5 irreversiibelisti vahingoittavia kiinnitysmenettelyjå.
Tåten on edelleen olemassa tarve saada suhteellisen nopea, ei-tuhoava menetelmå påållyste-endoteelisolujen yhteenkas-vamisasteen måårittåmiseksi proteesipinnalla.
Keksinnon yhteenveto 10 Kyseinen keksinto tarjoaa menetelmån endoteelisolu- peiton måårittåmiseksi proteesipinnalla, jolloin (a) tuotetaan proteesipinta, joka våhintåån låpåi-see valon valitulla aallonpituusalueella; (b) levitetåån endoteelisoluja pinnalle; 15 (c) vårjåtåån endoteelisolut våriaineella, joka ky- kenee osoittamaan fluoresoivaa emissiota sanotulla valitulla aallonpituusalueella; ja (d) valaistaan soluja valolla emission herattåmi-seksi solupeiton havaitsemisen mahdollistamiseksi pro-20 teesipinnalla.
Keksinnon mukaiselle menetelmålle on tunnusomaista, etta våriaine on rodamiini 123, aallonpituusalue on 500 -600 run ja pinta on venytetty polytetrafluorietyleeni, polyester! tai polyvinyylialkoholi.
25 Kyseinen keksinto tarjoaa arvokkaan diagnostisen menetelmån, jolla voidaan måårittåå kyseinen tåydellisyys-aste, jolla proteesisiirrånnåinen on peitetty endoteeliso-luilla. Sitten kun tarvittavat vaiheet endoteeli-yksisolu-kerroksen muodostumisen mahdollistamiseksi on pååtetty, on 30 erittåin toivottavaa ja jopa vålttåmåtontå, tietåå ennen siirrånnåisen varsinaista istuttamista, onko todella ky-seesså yksisolukerros. Tåmå laatukontrollivaihe on våltta-måton, jotta våltettåisiin istuttamasta siirrånnåistå, joka ei endotelioidu ja jonka tie sen vuoksi olisi viitoi-35 tettu tromboosiin ja epåonnistumiseen. Esimerkiksi on vai- 90996 5 keaa saada elåviå endoteelisoluja nåkymåån polyesteri-(kuten dakronpolyesteri-) pinnalla tai venytetylla poly-tetraf luorietyleeni-( "ePTFE"-) pinnalla niiden låpikuulta-mattomuuden nakyvån valon aallonpituuksilla ja autofluore-5 senssin aallonpituusalueella 400 - 500 nm vuoksi. On to-dettu, ettå solujen lukumåårå voidaan saada vårjååmållå perinteisilla tumavåreillå, mutta mainittu menetelmå on tuhoava ja antaa vain våhån tietoa, mitå tulee soluleviå-miseen tai solusolukosketukseen. Solujen visualisointi 10 voidaan suorittaa tåmån vuoksi edullisesti kåyttåen joko sytoplasmavårejå tai vårejå, jotka osoittavat fluoresoivaa emissiota 500 - 600 nm:n aallonpituusalueella. Edullisesti kåytetåån molemmat ominaisuudet omaavia våriaineita. Edel-leen on edullista, ettå keksinnon mukaisen menetelmån suo-15 ritus kohdistuu itse varsinaiseen siirrånnåiseen eikå so-lupåållysteisen siirrånnåismateriaalin johonkin "kontrol-lisegmenttiin". Tåten vårin tulisi olla myrkytontå ja hy-våksyttåvåå valtimonsisåiseen kåyttoon.
Kyseiseen keksintoon johtaneessa tutkimuksessa kåy-20 tettiin vaihtoehtoisia fluoresoivia våriaineita ihmisen endoteelisolujen vårjååmiseksi in vitro. Nåitå olivat bis-bentsamidivåri Hoechst 33342, joka asettuu DNArssa adenii-ni- ja tymidiiniemåsparien våliin ja jonka on osoitettu olevan myrkytontå alhaisina pitoisuuksina8; mitramysiini, 25 kasvainvastainen antibiootti, joka asettuu guaniini- ja sytosiiniemåsparien våliin9; niilipunainen, joka on syto-plasman lipidirakkuloille spesifinen lipofiilinen våri-aine10; sulfofluoreseiinidiasetaatti (SFDA), joka on syto-plasmaspesifinen våriaine; ja rodamiini 123, joka on mito-30 kondriaspesifinen våriaine11. Olemme todenneet, ettå nåistå yhdisteistå rodamiini 123 omaa toivottavimmat ominaisuudet. Rodamiini 123 emittoi kirkkaan oranssia våriå 510 nm:n (aallonpituuden omaavalla) valolla aktivoituna. Ly-hyttå altistusta tålle våriaineelle seuraten endoteeliso-35 lut fluoresoivat oranssinvårisinå, kun taas alla oleva 6 dakron-, ePTFE- tai polyvinyylialkoholipinta osoittaa vain våhåistå vårinottoa tai autofluoresenssiå. Rodamiini 123 vårjåå selektiivisesti sytoplasmarakenteita mahdolliståen solun reuna-alueiden nakyviin saamisen. Silla ei ole pysy-5 våå vaikutusta endoteelisolujen kasvuun tai kiinnittymis-ominaisuuksiin in vitro ja se on myrkytontå. Menettelyta-van yksinkertaisuus tekee siitå leikkaussalikåyttoon sopi-van. Endoteelisoluilla påållystetystå siirrånnåisestå voi-taisiin nopeasti arvioida låsnå olevien solujen lukumåårå, 10 soluleviåmisen aste sekå solu-soluvuorovaikutuksen laatu siirrånnåisen istutusta edeltåvåsti.
Lyhyt kuvaus piirroksista
Kuvio 1: H33342:n, niili-punaisen (NR), SFDA:n, rodamiini 123:n (R123), mitramysiinin (Mith) ja pelkån kas-15 vualustan (CM) vaikutukset endoteelisolujen tarttumiseen polystyreeniin. Ihmisen mikroverisuoniendoteelisoluja in-kuboitiin 90 minuutin ajan kasvualustassa, joka sisålsi 20 μς/ιηΐ H33342:ta, 10 μς/πιΐ niilipunaista, 20 μς/ιηΐ SFDA:ta, .10 μ/ml rodamiini 123:a tai 10 μg/ ml mitramysiiniå. Inku-20 boinnin pååtyttyå påållystettiin 1,96 x 104 solua/cm2 gela-tiinipinnoitetulle polystyreenille. Nåiden leimattujen solujen annettiin olla kosketuksissa pintaan 60 tai 120 minuutin ajan, mitå seurasi perusteellinen pesu. Jåljelle jååneiden tarttuneiden solujen lukumåårå mååritettiin ly-25 hyen trypsinoinnin ja laskennan Coulter Counter - laitteen avulla. Kukin tarttumismååritys suoritettiin kolminkertai-sena (måårityksenå). Tulokset arvioitiin laskemalla kes-kiarvo ± keskiarvon standardivirhe ja niitå verrattiin Studentin T-testiå kåyttåen. Tilastollista merkitsevyyttå 30 esiintyi p:n ollessa alle 0,05 (+). H33342, niilipunainen ja SFDA osoittivat tilastollisesti merkitsevåå våhenemåå solutarttumisessa sekå aika-arvolla 60 ettå 120 minuuttia ei-leimattuihin soluihin (CM) verrattuna.
Kuvio 2: Kasvukåyriå, jotka osoittavat esikåsitte-35 lyn 10 μΜ rodamiini 123:11a vaikutuksen ihmisen mikrove- li 90996 7 risuoniendoteelisoluihin. Soluja inkuboitiin 90 minuuttia yhdessa kolmesta kasvualustasta: 1. kasvualusta (A); 2.
0,1 % DMSO:ta sisåltåvå kasvualusta (9); tai 3. 0,1 % DMSO:ta ja 10 μΜ rodamiini 123:a sisåltåvå kasvualusta 5 ()· Inkubointia seuraten solut pestiin ja påållystettiin gelatiinipinnoitetulle polystyreenille måårånå 5 x 104 so-lua/cm2 ja såilytettiin kasvualustassa. Solujen lukumåårå mååritettiin påivinå 1, 3 ja 5 ja ilmaistiin keskiarvona ± keskiarvon standardivirheenå. Moninkertaisessa regressio-10 analyysisså ei paljastunut tilastollista eroa solujen lu-kumååråsså. Tåmå viittaa siihen, ettå esileimauksella rodamiini 123:11a on minimaalinen vaikutus solukasvuun.
Kuvio 3: Kasvukåyriå, jotka osoittavat rodamiini 123:a sisåltåvån kasvualustan vaikutuksen ihmisen mikro-15 verisuoniendoteelisoluihin. Solut pestiin ja påållystettiin gelatiinipinnoitetulle polystyreenille måårånå 5 x 104 solua/cm2 ja såilytettiin kasvualustassa, joka sisålsi 10 μΜ rodamiini 123:a (9) tai kasvualustassa, joka ei sisål-tånyt rodamiini 123:a (). Solujen lukumåårå mååritettiin 20 påivinå 1, 3 ja 5 ja ilmaistiin keskiarvona ± keskiarvon standardivirheenå. Moninkertaisessa regressioanalyysisså paljastui tilastollinen ero solukasvussa rodamiini 123:a sisåltåvåsså kasvualustassa ja (pelkåsså) kasvualustassa kasvatettujen solujen vålillå. Pitempåån jatkuva kosketus 25 rodamiini 123:een eståå solukasvua viljelmåsså.
Keksinnon yksityiskohtainen kuvaus Kyky eriståå ihmisen tåysikasvuisia endoteelisoluja ja kasvattaa niitå viljelmånå on mahdollistanut endoteelisolu jen ominaisuuksien perusteellisen arvioinnin3. Erås 30 intensiivisen tutkimuksen osa-alue on kohdistunut niiden muuttujien ymmårtåmiseen, jotka vaikuttavat EC-proteesi-pintavuorovaikutuksiin3. Optimiolosuhteita solutarttumisel-le ja -lisååntymiselle ei ole vielå mååritetty. Sitten kun nåmå olosuhteet on mååritelty, saattaa olla mahdollista 35 peittåå verisuonisiirrånnåisen aukko tåysin endoteeliso- δ luilla leikkaussalissa istutusta edeltåvåsti. Tåmå saat-taisi teoreettisesti minimoida veritulppamuodostuksen ja siirrånnåisen varhaisen epåonnistumisen. Eras tårkeå este yksisolukerroksen muodostusprosessin ymmårtåmiselle on 5 ollut kyvyttomyys havainnoida endoteelisoluja suoraan sii-rrånnåismateriaalin pinnalla. Tåsså patenttijulkaisussa kuvatun menettelytavan kehittåmistå edeltåvåsti useimmat visualisointimenettelyt edellyttivåt nåytteiden pysyvåå kiinnittåmistå monina koeajankohtina eri olosuhteiden vai-10 kutuksen arvioimiseksi. Pysyvå kiinnittåminen ei ainoas-taan tapa soluja, vaan tuottaa niinikåån mahdollisia kåy-tetyn tekniikan aiheuttamia keinoloydoksiå.
Kyseiseen keksintoon johtaneen tutkimuksen tarkoi-tuksena on kehittåå nopea, helposti suoritettava ei-myr-15 kyllinen menetelmå endoteelisolujen visualisoimiseksi dakron-, ePTFE-, polyvinyylialkoholisiirrånnåismateriaalien ja muiden siirrånnåismateriaalien pinnalla. Tutkimme ryh-måå fluoresoivia våriaineita, joilla on lukuisia sovellu-tuksia solubiologian piirisså sytoplasmakomponenttien vi-20 sualisoinnista10'11 virtaussytometriaan asti15. Tuloksemme osoittivat, ettå rodamiini 123 oli hyodyllisin endoteelisolu jen visualisoimiseksi kudotulla dakronilla, ePTFE:-llå ja PVA:lla. Rodamiini 123:a on kåytetty histologian piirisså normaalien ja transformoitujen sidekudosmuodos-25 tussolujen vertaamiseksi16, kemoterapian tehokkuuden måå- rittåmiseksi17 ja mutaatioita sisåltåvien solujen valikoi-miseksi18. Sen spesifisyys mitokondroiden suhteen vaikuttaa johtuvan mitokondriansisåisestå korkeasta negatiivisesta varauksesta ja rodamiini 123 :n voimakkaasti positiivisesta 30 varauksesta fysiologisessa pH:ssa.
Tarkoituksiimme rodamiini 123 omaa useita toivotta-via piirteitå. Se assimiloituu soluihin nopeasti pitoisuu-desta riippuvalla tavalla ja on soluille suhteellisen myr-kytontå. Vaikka våriaine on soluille myrkyllistå yllåpi-35 dettåesså nåitå viljelmånå, lyhyellå altistuksella våriai- li 90996 9 neelle, mitå seuraa viljely varia sisåltåmåttomåsså kasvu-alustassa on tuskin lainkaan todettavaa tuhoisaa vaikutus-ta. Myos kantoaineen, 0,l-%:isen DMS0:n, vaikutus soluihin on merkitykseton tarttuvuuden tai kasvun kannalta. Tåmå 5 ilmeinen myrkyllisyyden puuttuminen tekee toteuttamiskel-poiseksi endoteelisolujen kasittelyn rodamiini 123:11a ja sitå seuraten niiden påållyståmisen dakron-, ePTFE- tai PVA-pinnalle pelkasså kasvualustassa vaikuttamatta solujen tarttuvuuteen tai kasvuun. Lopuksi rodamiini 123 fluoresoi 10 aallonpituudella, jolla dakronin, ePTFEtn ja PVAsn auto-fluoresenssi on mitaton.
Kyvyllå visualisoida ihmisen endoteelisolut veri-suonisiirrånnåismateriaalin pinnalla on kaksi pååasiallis-ta sovellutusta. Laboratoriossa endoteelisolujen fluore-15 senssileimaus rodamiini 123:11a sallii elåvien solujen morfologisen vasteen vaihteleville koeolosuhteille suoran havainnoinnin. Tåstå seuraten endoteelisolujen tarttuvuuteen verisuonisiirrånnåisiin ja kasvuun niiden pinnalla vaikuttavia muuttujia voidaan arvioida reaaliajassa, eikå 20 kemiallista kiinnittåmistå seuraten. Kun nåmå olosuhteet on mååritelty, saattaa olla mahdollista tehdå tåmånhetki-sistå siirrånnåispåållyståmismenettelytavoista hienos-tuneempia.
Kliinisesså ympåristosså tåtå menettelytapaa voi-25 taisiin kåyttåå verisuonisiirrånnåisten påållystymisen endoteelisoluilla laajuuden måårittåmiseksi leikkaussalis-sa. Olemme vastikåån osoittaneet, ettå lukumåårållisesti suuria mååriå endoteelisoluja voidaan ottaa nopeasti tal-teen pienistå mååristå ihmisrasvaa5. Saatujen solujen måårå 30 on lukumåårållisesti riittåvå sallimaan siirrånnåisen påållyståminen yhteenkasvutiheyksisså tarvitsematta solu-viljelmåå. Lisåksi olemme osoittaneet, ettå nåmå endoteelisolut omaavat kyvyn luoda yhteenkasvanut yksisolukerros tiettyjen verisuonisiirrånnåisten pinnalle alle yhdesså 35 tunnissa. Yksi nåkokohta tåsså jårjestelmåsså on kyky måå- 10 rittåå nopeasti siirrånnåisen påållystymisen endoteeliso-luilla tåydellisyysistutusta edeltåvåsti. Eras mahdollinen menetelmån tåmån laatukontrollivaiheen suorittamiseksi on lopullisen yksisolukerroksen suora fluoresenssivisuali-5 sointi rodamiini 123:a kåyttåen. Tåmå myrkyton fluoresoiva våriaine sallii endoteelisolujen nopean nåkyviinsaattamisen ja mahdollistaa sekå lasnå olevlen solujen lukumåårån ettå solu-soluvuorovaikutusten laadun måårittåmisen.
Menetelmåt 10 Ihmisrasvamikroverisuoniendoteelisolujen eristys:
Ihmisen munuaista ympåroivåå ja vatsapaitarasvaa saatiin kuolleilta munuaisluovuttajilta. Noudatettiin sopivaa låå-ketieteellistå arvostelumenettelyå ja eristettiin mikrove-risuoniendoteelisolut mekaanisesti paloittelemalla ja di-15 gestoimalla kollagenaasilla (Worthington Type I; Worthington Diagnostic Systems, Freehold, N.J.) pitoisuutena 4 mg/ml, mitå seurasi tiheysgradienttisentrifugointi 45-%:i-sessa Percoll-valmisteessa (Pharmacia Fine Chemicals, Pis-cataway, N.J.)5· Soluja kasvatettiin 25 cm3:n kasvatuspul-20 loissa, jotka oli esikåsitelty l-%:isella gelatiiniliuok-sella. Kasvualusta koostui kasvualustasta 199, joka sisal-si 10 % lampoinaktivoitua vasikansikioseerumia, 90 μg/ml sian hepariinia ja 20 μg/ml endoteelisolukasvutekijåå (ECGF)12'13. Soluja inkuboitiin 37 °C:ssa 5 %:n C02-ilmake-25 håsså ja yhteenkasvamisvaiheessa niiden tiheys kohosi 105 soluun/cm2.
Laaja verisuoni-endoteelisolujen eristys: Ihmisen laajoja verisuonia puhdistettiin ympåroivistå peitinkal-voistaan ja huuhdottiin kasvualustalla14. Verisuonen påihin 30 asetettiin kanyyli ja aukkoa kåsiteltiin kollagenaasilla (Worthington Type I, Worthington Diagnostic Systems, Inc., Freehold, N.J.) endoteelisolujen irrottamiseksi sisåseinå-måstå. Sitten verisuonet huuhdottiin kasvualustalla solujen talteenottamiseksi. Laaja verisuonisoluja viljeltiin 35 identtisisså olosuhteissa niihin nåhden, joita kåytettiin
II
90996 11 mikroverisuoniendoteelisolujen yhteydesså.
Siirrånnåismateriaalin valmistus: Immobilisoitiin kudotusta dakronista (Meadox Medicals, Inc.) ja ePTFEsstå (W.L. Gore, Inc.) valmistettuja siirrånnåismateriaaleja 5 muovirenkaisiin (tuote "Beem-capsule", Polysciences, Fort Washington, PA), joiden pinta-ala oli 0,5 cm2. Liimattiin polyvinyylialkoholia (PVAita), hydrogeeliå, jota ei tålla hetkellå kåytetå verisuonisiirrånnåisiin, samat mitat omaavan lasiputken pååhån. Kåyttoå edeltåvåsti dakronista 10 ja ePTFEtstå poistettiin rasva pesemållå toisiaan seuraten asetonilla, 8,5-%:isella fosforihapolla 1 N natriumhydrok-sidilla ja tislatulla vedellå. Sitten siirrånnåismateriaa-li kuivattiin låpikotaisin ja kaasusteriloitiin. PVAsta hydratoitiin PBSssså ainakin 24 tunnin ajan kåyttoå edel-15 tåvåsti.
Verihiutalepitoisen plasman valmistus: Otettiin tuoretta ihmisverta natriumsitraattia sisåltåvåån putkeen. Verta sentrifugoitiin kuusi minuuttia 300 x g:sså. Super-natantti yhdistettiin kalsiumkloridiin (tåmån) loppupitoi-20 suuteen 20 mM. Kåytettiin vålittomåsti 200 μΐ tåtå liuosta dakronin ja ePTFE:n påållyståmiseen kunkin Beem-kapselin pohjalla ja pakotettiin liuos siirrånnåisen låpi mikropi-petin avulla. Kun hyytyminen oli tåydellistå, jåånnoshyy-tymå poistettiin siirrånnåisestå imemållå. PVArhan ei koh-25 distettu muuta esikåsittelyå kuin hydratointi.
Endoteelisolu jen istuttaminen: Kåsiteltiin endotee- lisoluja yhteenkasvamisvaihepulloissa usean minuutin ajan liuoksella, joka sisålsi 0,25 % trypsiiniå ja 0,04 % ED-TA:ta puskuroidussa Hankin suolaliuoksessa. Solujen nous-30 tua pulion pohjalta lisåttiin kasvualustaa trypsiinin in-aktivoimiseksi. Solut påållystettiin siirrånnåisen pinnal-le aina 105 solua/cm2 tiheyksinå.
Valomikroskopia: Påållystettyjå siirrånnåisiå pes-tiin kasvualustalla ja kiinnitettiin sitten 95-%:isella 35 etanolilla 15 minuutin ajan huoneen låmpotilassa. Siirrån- 12 nåiset pestiin kahdesti tislatulla vedellå ja kåsiteltiin sitten Gillin hemotoksyliinillå (Fisher Scientific Co., Fairlawn, N.J.) 2,5 minuuttia. Siirrånnåiset pestiin kahdesti tislatulla vedellå ja altistettiin sitten Scottin 5 vesijohtovesikorvikkeelle (Fisher Scientific Co., Fair-lawn, N.J.) yhden minuutin ajan. Siirrånnåiset pestiin kahdesti tislatulla vedellå, kahdesti 95-%sisella etano-lilla ja asetettiin sitten objektilasin ja peitinlasin våliin tarkasteltaviksi valomikroskopian avulla.
10 Fluoresoivien våriaineiden lisååminens Valmistet- tiin 20 μ9/πι1:η liuos H33342:sta (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) Dulbeccon fosfaatilla puskuroituun suolaliuok-seen (PBSsåån), pH 7,4, tuoreena kutakin kåyttoå vårten. Valmistettiin 10 μ9/πι1:η liuos mitramysiinistå (Sigma Che-15 mical Co., St. Louis, MO) yhdiståmållå 0,5 ml mitramysii-nivarastoliuosta (0,2 mg/ml PBSssså), 0,5 ml magnesiumklo-ridiliuosta (300 mM PBSssså) ja 9 ml kasvualustaa. Niili-punainen (Eastman Kodak Co., Rochester, New York) liuotet-tiin ensin asetoniin 1 mg/ml pitoisuudeksi ja laimennet-20 tiin sitten ls100 PBSsåån loppupitoisuuden 10 μg/ml saa-miseksi. Sulfofluoreseiinidiasetaattia (Molecular Probes, Junction City, OR) kåytettiin pitoisuutena 20 μg/ml PBSssså. Rodamiini 123sn (Molecular Probes, Junction City, OR) 4 mg/ml varastoliuosta DMSOsssa laimennettiin lsl 000 kas-25 vualustaan loppupitoisuuden 4 μg/ml saamiseksi. Kaikki liuokset suodatettiin Gelman 0,2 mikronin kertakåyttosuo-dattimilla (Gelman Science, Inc., Ann Arbor, MI) niiden steriloimiseksi kåyttoå edeltåvåsti.
Endoteelisoluja kåsiteltiin våriaineella kolmella 30 tavalla. Påållystetyt Beem-kapselit pestiin kerran kasvu-alustalla ja upotettiin sitten våriaineliuokseen 30 - 90 minuutiksi 37 °Csssa. Vaihtoehtoisesti kåsiteltiin yhteen-kasvaneita soluja viljelypulloissa trypsiinillå, pelletoi-tiin sentrifugoimalla kuuden minuutin ajan 300 x gssså, 35 uudelleensuspendoitiin våriaineliuokseen ja inkuboitiin 30 li 90996 13 - 90 minuuttia 37 °C:ssa. Nåmå solut påållystettiin sitten siirrånnåismateriaalin pinnalle ja inkuboitiin vaihtelevan pituinen aika solujen tarttumisen mahdollistamiseksi. Lo-puksl rodamiinl 123:11, H33324:n ja mitramysiinin kyseesså 5 ollessa soluja viljeltiin aina viiteen påivåån asti 37 °C:ssa kasvualustassa, joka sisålsi vaihtelevia pitoisuuk-sia nåitå yhdisteitå ja påållystettiin sitten siirrånnåis-materiaalille. Kaikki endoteelisolut (leimatut ja kontrolli-) tehtiin sitten nåkyviksi fluoresenssi- tai valomik-10 roskopian avulla påållyståmistå siirrånnåismateriaalin pintaan seuraten.
Fluoresenssimikroskopia: Fluoresenssimikroskopia suoritettiin kåyttåen Nikon diafot -mikroskooppia. Akti-vaatio- ja emissioaallonpituuksia kontrolloitiin aktivaa-15 tio- ja emissiosulkusuodattimien spesifisten yhdistelmien dikroismisuodatinyhdistelmån avulla (380 nm:n dikroistinen peili H33342:lle ja sulfofluoreseiinidiasetaatille; 510 nm:n dikroistinen peili mitramysiinille; 550 nm:n dikroistinen peili niilipunaiselle ja rodamiini 123:lle).
20 Tarttumistutkimuksia: Erilaisten våriaineiden vai- kutus endoteelisolujen tarttumiseen polystyreeniin mååri-tettiin seuraavasti. Viljeltyjå mikroverisuoniendoteeli-soluja inkuboitiin 90 minuuttia 37 °C:ssa yhdesså yhdek-såstå liuoksesta. Nåmå olivat 20 μς/πιΐ H33342:ta Dulbeccon 25 PBS:sså; 10 μ9/πι1 mitramysiiniå tåydellisesså kasvualustassa 199; 10 μ9^1 niilipunaista ja 1 % asetonia Dulbeccon PBS:sså; 20 μς/ιηΐ SFDA: ta Dulbeccon PBS:sså; ja 4 μςΜΙ (10 μΜ) rodamiini 123 ja 0,1 % DMSOita tåydellisesså kasvualustassa 199. Kontrolleina soluja inkuboitiin niin-30 ikåån pelkåsså tåydellisesså kasvualustassa 199; pelkåsså Dulbeccon PBS:sså; 1 % asetonia sisåltåvåsså Dulbeccon PBS:sså; ja 0,1 % DMSO:ta sisåltåvåsså tåydellisesså kasvualustassa 199: Solut pestiin kahdesti sentrifugoimalla kuuden minuutin ajan 300 x g:sså, uudelleensuspendoitiin 35 pelkkåån tåydelliseen kasvualustaan 199 ja påållystettiin 14 kolminkertaisena måårityksenå gelatiinipinnoitettujen 24 kuopan kuoppalevyjen kuoppiin tiheytenå 1,96 x 104 solua/ cm2. Kasvualusta imettiin pois 60 ja 120 minuutin kuluttua, lisåttiin kuhunkin kuoppaan 0,5 ml trypsiiniliuosta ja in-5 kuboitiin soluja 10 minuutin ajan 37 °C:ssa. Sitten lisåt-tiin 0,2 ml saatua solususpensiota 9,8 ml:aan Isoton-val-mistetta ja mååritettiin tarttuneiden solujen lukumååra kuoppaa kohden Coulter Counter -laitetta kåyttåen.
Kasvukåyrån mååritys: Inkuboitiin viljeltyjå munu-10 aista ymparoivan rasvan mikroverisuoniendoteelisoluja 90 minuuttia kasvualustassa, joka sisålsi 10 μΜ rodamiini 123:a ja 0,1 %:n DMS0:ta, kasvualustassa, joka sisålsi 0,1 %:n DMSO:ta pelkåståån tai pelkåsså kasvualustassa. Solut pestiin sentrifugoimalla kuuden minuutin ajan 300 x g:sså 15 ja påållystettiin 24 kuopan polystyreeniviljelylevyjen gelatinoituihin kuoppiin alkutiheytenå 0,5 x 105 solua/cm2. Soluja kasvatettiin pelkåsså kasvualustassa tai kasvualustassa, joka sisålsi 0,1 %:n DMSO:ta ja 10 μΜ rodamiini 123:a. Mååråttyinå ajankohtina kasvualusta imettiin pois, 20 solut pestiin kerran kasvualustalla ja niitå kåsiteltiin 0,5 ml:11a trypsiiniå 10 minuutin ajan 37 °C:ssa. Lisåttiin 0,2 ml tåtå suspensiota 9,8 ml:aan Isoton-liuosta ja laskettiin solut Coulter Counter -laitteella.
Tilastotietoja: 25 Kussakin tutkimuksessa EC-solulukumåårå mååritet- tiin laskemalla solut Coulter Counter -laitteella kolmelle toistokokeelle ja ilmaistiin solulukumåårånå ± keskiarvon standardivirheenå. Tarttumistutkimusten kohdalla verrat-tiin koearvoja kontrollinåytteisiin kåyttåen Studentin T-30 testiå. Kasvukåyråanalyysi suoritettiin kåyttåen lineaa-rista regressioanalyysiå. Tilastollisesti merkitseviksi valittiin arvot p < 0,05.
II
90996 15
Tulokset: 1. Vårjåysominaisuudet
Kokeet, joissa oli kyseesså H33324 (20 μς/πιΐ) ja mitramysiini (10 μς/πιΐ), osoittivat, ettå ihmisen aortta-, 5 suoliluusuoni- tai mikrosuoniendoteelisolujen inkubointi 90 minuutin ajan 37 °C:ssa johti onnistuneeseen solutumien leimaukseen. Samoin niilipunainen, rodamiini 123 ja SFDA pitoisuutena 20 μς/πιΐ olivat tehokkaita solusytoplasman fluoresoivassa leimaamisessa.
10 H33342:n, mitramysiinin, niilipunaisen ja SFDA:n vakava haittapuoli oli, ettå nåiden våriaineiden nåkyviin-saattamisen tarvittaviin aallonpituuksiin liittyi dakron-ja ePTFE-siirrånnåismateriaalin merkittåvåå autofluore-senssia. Vaikka nåillå neljållå vårillå kåsitellyt endo-15 teelisolut voitiin saada nåkyviin siirrånnåisten pinnalla, oli usein vaikeaa erottaa soluja taustasta. Toinen nåiden våriaineiden kohdalla tavattu vaikeus oli våriaineiden epåspesifisen siirtymisen siirrånnåismateriaaliin korkea aste. Solujen puuttuessa millå tahansa nåistå neljåstå 20 våriaineesta 90 minuutin ajan 37 °C:ssa kåsitelty siirrån-nåismateriaali osoitti selviå fluoresoivia alueita, joita olisi voitu luulla soluiksi. Nåistå syistå H33342, mitramysiini, sulfofluoreseiinidiasetaatti ja niilipunainen eivåt olleet tarkoituksiimme hyvåksyttåviå.
25 Rodamiini 123:n vaikutusten tutkimiseksi inkuboi- tiin ihmisen mikroverisuoniendoteelisoluja 90 minuutin ajan 37 °C:ssa kasvualustassa, joka sisålsi 1, 5, 10, 20 ja 100 μΜ rodamiini 123:a (0,4, 2,0, 4,0, 8,0, 40,0 μ9/χα1) ja sopivan DMSO-laimennoksen ja tarkasteltiin niitå fluo-30 resenssimikroskopian avulla. Fluoresenssi-intensiteetisså ilmeni pitoisuudesta riippuva kasvu. Yksi mikmolaarisella (1 μΜ) rodamiini 123:11a kåsitellyt solut osoittivat heik-koa fluoresenssia, kun taas inkubointi 100 μΜ liuoksessa tuotti voimakkaan fluoresenssin.
35 Leimattaessa soluja rodamiini 123:11a (4 μς/πιΐ), 16 mitå seurasi inkubointi joko dakron-, ePTFE- tai PVA-pin-nalla, saatiin erinomainen sytoplasman visualisoituminen, johon liittyi minimaalinen pinnan autofluoresenssi. Akti-vaatio- ja emissioaallonpituudet olivat 510 nm ja vastaa-5 vasti 590 nm kaikissa tapauksissa.
2. Tarttumisvaikutuksia
Mikroverisuoniendoteelisolujen tarttumista polysty-reeniin tutkittiin kunkin viidestå fluoresoivasta våriai-neesta osalta. Soluja esi-inkuboitiin kullakin vårilla 10 menetelmisså lueteltuina pitoisuuksina 90 minuutin ajan. Leimausta seuraten solut paallystettiin polystyreenipin-nalle måårånå 1,96 x 104 solua/cm2 ja inkuboitiin yhden ja kahden tunnin ajan. Tuona ajankohtana pinta pestiin perus-teellisesti kahteen kertaan. Pintaan jåaneet solut lasket-15 tiin lyhyttå trypsinointia seuraten. Jåljelle jååneiden solujen lukumåårå on esitetty kuviossa 1. Ei-leimattuihin kontrollisoluihin verrattuna H33342, niilipunainen ja S FDA osoittivat merkittåvåå vaikutusta seuraavaan solutarttumi-seen mitattuna ajankohtana 60 ja 120 minuuttia. Mitramy-20 siinillå ja rodamilnl 123:11a ei ollut vaikutusta solu-tarttumiseen.
3. Vaikutukset kasvuun rodamiini 123 -leimauksen jålkeen
Koska rodamiini 123 salli optimaalisen endoteeli-25 solujen visualisoinnin siirrånnåispinnoilla, tutkittiin viljelyå edeltåvån leimauksen vaikutusta solujen kasvuun. Esi-inkuboitiin endoteelisoluja kasvualustassa, joka sisålsi 0,1 % DMSO:ta tai kasvualustassa, joka sisålsi 0,1 % DMS0:ta ja 10 μΜ rodamiini 123:a. Esi-inkuboinnin ja pesun 30 jålkeen solut istutettiin låhtopitoisuutena 0,5 x 105 solua/cm2 ja aloitettiin kasvatus. Solujen lukumåårå mååri-tettiin påivinå 1, 3 ja 5. Kuvion 2 kasvukåyrisså ilmenee vain våhån eroa esileimattujen ja ei-leimattujen solujen vålillå seuranneessa solujen kasvussa kasvualustassa 199.
I! 90996 17 4. Kasvukåyråt rodamiini 123sa sisåltåvåsså kasvu-alustassa
Koska solujen esileimauksella rodamiini 123:11a oli vain våhan vaikutusta leimausta seuraavaan solukasvuun, 5 tutkittiin jatkuvan rodamiini 123 -låsnåolon vaikutusta kasvualustassa. Solut levitettiin maårånå 0,5 x 105 solua/ cm2 polystyreenipinnalle ja aloitettiin kasvatus. Tåman kasvukåyråtutkimuksen kasvualusta sisålsi rodamiini 123:a kautta koko tutkimusajan. Kasvualustassa yllåpidetty ro-10 damiini 123 esti solukasvun viljelmåsså (katso kuvio 3).
Claims (4)
1. Menetelmå endoteelisolupeiton måårittåmiseksi proteesipinnalla, jossa menetelmåsså levitetåån endotee- 5 lisoluja mainitulle pinnalle, vårjåtåån endoteelisolut våriaineella, joka kykenee osoittamaan fluoresoivaa emis-siota valitulla aallonpituusalueella ja joka on myrkyton eikå håiritse endoteelisten solujen kasvua, valaistaan soluja valolla emission aktivoimiseksi proteesipinnan so-10 lupeiton havaitsemisen mahdollistamiseksi, ja menetelmå suoritetaan vahingoittamatta pintaa ennen sen istuttamista potilaaseen, tunnettu siitå, ettå våriaine on ro-damiini 123, aallonpituusalue on 500 - 600 nm ja pinta on venytetty polytetrafluorietyleeni, polyesteri tai polyvi-15 nyylialkoholi.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå pinta ei autofluoresoi valitulla aallonpituusalueella.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, t u n-20 n e t t u siitå, ettå pinta on verisuonisiirrånnåinen, jonka seinåmå on våhintåån låpinåkyvå emissiolle, ja ettå levitysvaihe suoritetaan seinåmån sisåpintaan kohdistuen.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå siirrånnåinen muodostaa suljetun 25 rakenteen levitettyjen endoteelisolujen kanssa. Il 90996 19
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US92774586A | 1986-11-06 | 1986-11-06 | |
| US92774586 | 1986-11-06 | ||
| US8702973 | 1987-11-04 | ||
| PCT/US1987/002973 WO1988003571A1 (en) | 1986-11-06 | 1987-11-04 | Method of determining endothelial cell coverage of a prosthetic surface |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI883209A FI883209A (fi) | 1988-07-05 |
| FI883209A0 FI883209A0 (fi) | 1988-07-05 |
| FI90996B FI90996B (fi) | 1994-01-14 |
| FI90996C true FI90996C (fi) | 1994-04-25 |
Family
ID=25455183
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI883209A FI90996C (fi) | 1986-11-06 | 1988-07-05 | Menetelmä proteesipinnan endoteelisolupäällystymisen määrittämiseksi |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0267049B1 (fi) |
| JP (1) | JPH01501818A (fi) |
| KR (1) | KR950013951B1 (fi) |
| AT (1) | ATE103390T1 (fi) |
| AU (1) | AU614948B2 (fi) |
| CA (1) | CA1309646C (fi) |
| DE (1) | DE3789419T2 (fi) |
| DK (1) | DK373288A (fi) |
| ES (1) | ES2061514T3 (fi) |
| FI (1) | FI90996C (fi) |
| NO (1) | NO883009L (fi) |
| WO (1) | WO1988003571A1 (fi) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19938520A1 (de) * | 1999-08-13 | 2001-02-22 | Vascular Biotech Gmbh | Verfahren zur Qualitätskontrolle der Endothelauskleidung nativer Blutgefäße oder im Gewebelabor endothelialisierter, künstlicher oder natürlicher Blutgefäße und Blutgefäßklappen, Herzhöhlen und Herzklappen |
| ITTO20080593A1 (it) | 2008-07-30 | 2010-01-31 | Freudenberg Carl Kg | Guarnizione di tenuta per condotti di scarico. |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4304720A (en) * | 1980-04-30 | 1981-12-08 | Merck & Co., Inc. | Fluorescein esters and ethers and the preparation thereof |
| US4559299A (en) * | 1983-02-04 | 1985-12-17 | Brown University Research Foundation Inc. | Cytotoxicity assays in cell culturing devices |
| GB2145112B (en) * | 1983-04-27 | 1987-02-18 | Milk Marketing Board | Sorting living spermatozoa |
-
1987
- 1987-11-04 AU AU83283/87A patent/AU614948B2/en not_active Ceased
- 1987-11-04 KR KR1019880700785A patent/KR950013951B1/ko active IP Right Grant
- 1987-11-04 WO PCT/US1987/002973 patent/WO1988003571A1/en active IP Right Grant
- 1987-11-04 JP JP63500177A patent/JPH01501818A/ja active Pending
- 1987-11-05 CA CA000551142A patent/CA1309646C/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-11-06 DE DE3789419T patent/DE3789419T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1987-11-06 AT AT87309848T patent/ATE103390T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-11-06 ES ES87309848T patent/ES2061514T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-11-06 EP EP87309848A patent/EP0267049B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-07-05 FI FI883209A patent/FI90996C/fi not_active IP Right Cessation
- 1988-07-05 DK DK373288A patent/DK373288A/da not_active Application Discontinuation
- 1988-07-05 NO NO883009A patent/NO883009L/no unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI883209A (fi) | 1988-07-05 |
| DK373288D0 (da) | 1988-07-05 |
| EP0267049A3 (en) | 1989-09-27 |
| DK373288A (da) | 1988-09-06 |
| WO1988003571A1 (en) | 1988-05-19 |
| ES2061514T3 (es) | 1994-12-16 |
| KR890700168A (ko) | 1989-03-10 |
| CA1309646C (en) | 1992-11-03 |
| AU614948B2 (en) | 1991-09-19 |
| KR950013951B1 (ko) | 1995-11-18 |
| EP0267049A2 (en) | 1988-05-11 |
| ATE103390T1 (de) | 1994-04-15 |
| NO883009D0 (no) | 1988-07-05 |
| EP0267049B1 (en) | 1994-03-23 |
| DE3789419T2 (de) | 1994-10-13 |
| FI883209A0 (fi) | 1988-07-05 |
| FI90996B (fi) | 1994-01-14 |
| NO883009L (no) | 1988-08-18 |
| JPH01501818A (ja) | 1989-06-22 |
| AU8328387A (en) | 1988-06-01 |
| DE3789419D1 (de) | 1994-04-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| White et al. | Factors influencing the expression of stress fibers in vascular endothelial cells in situ. | |
| Eddleman et al. | Endocytotic formation of vesicles and other membranous structures induced by Ca2+ and axolemmal injury | |
| Ragnarson et al. | Labeling with fluorescent carbocyanine dyes of cultured endothelial and smooth muscle cells by growth in dye-containing medium | |
| JPH04501516A (ja) | 移植組織 | |
| Gonzalez et al. | Analyzing live cellularity in the human trabecular meshwork | |
| US7749726B2 (en) | Methods for identifying and isolating stem cells | |
| Cutiongco et al. | Functional differences between healthy and diabetic endothelial cells on topographical cues | |
| Goligorsky et al. | Branching points of renal resistance arteries are enriched in L-type calcium channels and initiate vasoconstriction | |
| Schakenraad | 3.3 CELLS: THEIR SURFACES AND INTERACTIONS WITH MATERIALS | |
| Gorman et al. | Analysis of the G1 arrest position of senescent WI38 cells by quinacrine dihydrochloride nuclear fluorescence: evidence for a late G1 arrest | |
| Kovbasnjuk et al. | Regulation of the MDCK cell tight junction | |
| CN105343933B (zh) | 一种光氧化胶原交联的方法及其应用 | |
| Horbett et al. | Some background concepts | |
| FI90996C (fi) | Menetelmä proteesipinnan endoteelisolupäällystymisen määrittämiseksi | |
| US5194373A (en) | Method of determining endothelial cell coverage of a prosthetic surface | |
| EP1226433B1 (de) | Verfahren zur identifizierung von anti-apoptotisch wirksamen verbindungen | |
| Kaplan et al. | Single cell fusion events induced by influenza hemagglutinin: studies with rapid-flow, quantitative fluorescence microscopy | |
| Nie et al. | Imaging the Drosophila retina: zwitterionic buffers PIPES and HEPES induce morphological artifacts in tissue fixation | |
| Mechem et al. | Intravital fluorescence microscopy of endothelial cells on vascular grafts | |
| Jordan Jr et al. | Lipid changes produced by chronic hypercholesterolemia in nylon and orlon replacements of canine thoracic aorta. | |
| Ivarsson et al. | Fibronectin enhances early shear stress resistance of seeded adult human venous endothelial cells | |
| Cooper et al. | Monocyte adhesion to human saphenous vein in vitro | |
| Gentile et al. | Characterization of cellular density and determination of neointimal extracellular matrix constituents in human lower extremity vein graft stenoses | |
| Gray et al. | Investigating biomechanical determinants of endothelial permeability in a modified hollow fibre bioreactor | |
| RU2768152C1 (ru) | Способ обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в суправитально окрашенном препарате крови |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB | Publication of examined application | ||
| MM | Patent lapsed | ||
| MM | Patent lapsed |
Owner name: THOMAS JEFFERSON UNIVERSITY |