FI79328C - Foerfarande foer framstaellning av oligogalaktosderivat och mellanprodukter anvaendbara vid deras framstaellning - Google Patents

Description

1 79328

Menetelmä oligogalaktoosijohdannaisten valmistamiseksi ja niiden valmistuksessa käyttökelpoiset välituotteet

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää ja välituotteita oligogalaktoosi johdannaisten valmistamiseksi, joita voidaan käyttää terapeuttisiin tai diagnostisiin tarkoituksiin.

Muutamien viime vuosien aikana on kohdistettu erikoista huomiota ilmiöön, että bakteerit kiinnittyvät isäntä-epiteeli-soluihin (viite 1). Kaksi ruotsalaista tutkijaryhmää on esittänyt kantanaan (viitteet 2 ja 3), että kaavan 1 mukainen di-galaktoosi-yhdiste toimisi reseptorina ripsireunaisten uro-patogeenisten Coli-bakteerien kiinnittymisessä urinaarialueen epiteelisolujen pintaan ihmisellä. Di-galaktoosi-puoliskon katsotaan sitäpaitsi olevan läsnä epiteelisolujen pinnalla triheksosyyliseramidin (seuraava kaava 2) ja globosidin muodossa .

Lisäksi di-galaktoosia sisältävä glykolipidi "galabiosyyliser-amidi” (seuraava kaava 3) on läsnä munuaiskudoksessa (viite 4), mutta yhdisteen funktio ei ole tiedossa.

Uft f-OH HO r0H ^V\A^V\/VV\A

·£> ro" ^ Γ0Η ^ OH ^ (D (2) H0 ll°o .-OH HN^vV\/VWV\/|

0H V^WW^AV : V OH

(3) 2 79328

Yhdisteen 1 ja yhdisteen 2 trisakkaridipuoliskon yksinkertaisten (esimerkiksi metyyli- ja p-nitrofenyyli-)glykosi-dien on osoitettu inhiboivan uropatogeenisen Coli-bakteerin agglutinoitumista joihinkin punaisiin verisoluihin (viite 1). Tämä indikoi yhdisteen 1 käyttöä uudentyyppisten diagnostisten reagenssien samoin kuin terapeuttisten yhdisteiden valmistukseen, joilla on uudentyyppinen teho verrattuna traditionaalisiin antibiootteihin, so. ne inhiboivat bakteerien kiinnittymistä epiteliumiin sen sijaan että ne hävittäisivät bakteerit.

Kirjallisuudessa on tehty selkoa 4-O-a-D-galaktopyranosyy-li-D-galaktoosin (1) ja sen johdannaisten valmistamisesta.

Yhdistettä 1 on valmistettu di-galakturonihaposta (4) kaavan 1 mukaan (viite 5).

cooh Γ ~

HO I_ COOH

<m\ (MeO)3CH,H+ HJ-<\ CH2N2 ^—\0 9ooh -> x?H /1 <pOOH -> 0H K?H°> 0H °hW> 0H T/^OMe

(4) H

i_ COOMe

H?;-0 -OH

Vm \ DLiAlH. OHj_ -¾¾ 2>H30* α)

N—"rt OH <QH>- OH

°ijSDMe OH

Kaavio 1 3 79328

Epämiellyttävien reagenssien (esimerkiksi diatsometaani, litiumaluminiumhydridi) käyttö kuitenkin estää yhdisteen 1 valmistamisen suuressa mitassa tätä tietä. Myös tämän reak-tiosekvenssin variaatio on ilmoitettu (viite 6).

yhdisteen 1 täydelleen asetyloitua johdannaista on valmistettu (viitteet 7, 8f 9) monivaihereäktiosekvenssien avulla lähtemällä galaktoosista, kuten on esitetty seuraavassa kaaviossa 2 (viite 7). Myös tässä tapauksessa jotkut käytetyt reagenssit (esimerkiksi merkuurisyanidi) yhdessä alhaisen kokonaistuotoksen kanssa tekevät suuremman mittakaavan valmistuksen epäkäytännölliseksi.

D-galaktoosi 2 vannetta 5 vaihetta / l/He(CN)_

AcO i~0Ac H0J_0 9 ;--;-^ ^ · €7 rs:;:-* OAc OAc -kromatografia .—OAc )—q OAc k0Ac \ __L l/Ac-0/H0Ac/HoS0.

N—Λ ._o _ ^Ac<^T>, _l-2—^ OA^^n| + 2/Si02-kromatografia

Ac0 i—OAc °AC OAc ^ _JoCAc OAc 5a Kaavio 2

Nykyisestä tekniikan tasosta, johon edellä on viitattu, voidaan havaita, että on olemassa erityyppisten oligosakkaridien synteettisten valmistusmenetelmien sekä helposti saatavien lähtömateriaalien tarve. Keksinnön pääkohteena on sen vuoksi saada aikaan menetelmä oligosakkaridi- 4 79328 yhdisteiden valmistamiseksi, joita yhdisteitä voidaan käyttää lääketieteellisiin ja diagnostisiin tarkoituksiin.

Keksinnön toisena kohteena on saada aikaan uusia välituotteita, joita voidaan käyttää tällaisten yhdisteiden valmistamiseen .

Keksintö kohdistuu näin ollen menetelmään yhdisteen valmistamiseksi, jolla on kaava (II) CX„OR2 okJ—o

W V

'-f'C' ex,or2 ; or2 o 1 2 a (1I) 'tX, OR2 0R “n 2 3 jossa R on vety tai alempi alkanoyyli, R merkitsee sa- 2 maa kuin ryhmä R tai se on alkyyliryhmä, ^oka edullisesti sisältää 1-6 hiiliatomia, jolloin ryhmä OR C-atomissa 1 molekyylin pelkistyvässä päässä on jokoa - tai g-konfiguraa-tiossa, X on vety, deuterium tai tritium ja n on kokonaisluku 1-10, lähtien polygalakturonihaposta, joka hydrolysoidaan oligogalakturonihapon muodostamiseksi.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle kaavan (II) mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi on tunnusomaista, että a) saatu oligogalakturonihappo esteröidään sinänsä tunnetulla tavalla esterin muodostamiseksi, jolla on kaava (III) 5 79328 COQR4 ν^°\- τ \ f8 /\ COOR4 Ν-( O J— ο (ΙΙ1> V X »0, ί ο _η °Η ν / \ \χ ΟΗ \/Ν/ ΟΗ L η \_/ ΟΗ 4 jossa on R on esteriryhmän alkoholiosa ja n merkitsee samaa kuin edellä, ja saatu kaavan (III) mukainen esteri pelkistetään edullisesti vesiliuoksessa, yhdisteen muodostamiseksi, jolla on kaava (IV): cx2oh OH i—--n y'V 7 \0H Λ N ex oh N—r ° X-o,

p^0H

0HJ VoH /'OH

a V!-/

OH

jossa n ja X merkitsevät samaa kuin edellä, ja sen jälkeen kaavan (IV) mukainen yhdiste hydrolysoidaan kaavan (II) mu- 2 3 kaisen yhdisteen muodostamiseksi, jossa R ja R ovat vetyjä, tai kaavan (IV) mukainen yhdiste asylysoidaan kaavan 2 3

(II) mukaisen yhdisteen muodostamiseksi, jossa R ja R

6 79328 ovat alempia alkanoyylejä, ja sitten mikäli halutaan, hydrolysoidaan saatu yhdiste kaavan (II) mukaisen yhdisteen muo- 2 3 dostamiseksi, jossa R ja R ovat vetyjä, tai b) saatu oligogalakturonihappo esteröidään ja glykosidoidaan sinänsä tunnetulla tavalla yhdisteen muodostamiseksi, jolla on kaava (V):

COOR

Ö, COOR (V) ‘Ka

1-1 OR

L OH j n jossa n merkitsee samaa kuin edellä ja R on alkyyliryhmä, joka edullisesti sisältää 1-6 hiiliatomia, ja saatu kaavan (V) mukainen yhdiste pelkistetään kaavan (II) mukaisen yhdisteen muodostamiseksi, ja sen jälkeen haluttaessa hydrolysoidaan , 2 3

saatu kaavan (II) mukainen yhdiste, jossa R on vety ja R

on alkyyliryhmä, joka edullisesti sisältää 1-6 hiiliatomia , 2 kaavan (II) mukaisen yhdisteen muodostamiseksi, jossa R ja R ovat vetyjä ja n ja X merkitsevät samaa kuin edellä.

2

Kun ryhmä R kaavassa (II) on alkanoyyli, se on edullisesti formyyli, asetyyli tai propionyyli ja erityisesti asetyyli, ja n on edullisesti 2.

3

Kun ryhmä R kaavassa (II) on alkyyliryhmä, se on edullisesti metyyli, etyyli tai butyyli ja erityisesti metyyli.

Keksinnön mukaisilla uusilla yhdisteillä, joita voidaan käyttää välituotteina valmistettaessa kaavan (II) mukaisia yhdisteitä, on kaava (IV) 7 79328

CX2OH

OH U--o V_x CX20H ' N—< ° ο Ρ£ϋ0Η OH \/ /\

_ J \θΗ / OH

n -(

OH

jossa X on vety, deuterium tai tritium ja n on kokonaisluku 1-10.

Menetelmän a) ensimmäinen osa suoritetaan etupäässä jossakin hydroksyyliryhmiä sisältävässä liuottimessa ja täysin este-röityneen yhdisteen III pelkistäminen suoritetaan sopivasti käyttämällä natriumboorihydridiä tai natriumsyanoboorihydri-diä pelkistävänä aineena.

Yhdisteen IV asylyysi suoritetaan etupäässä käyttäen etikka-happoanhydridiä yhdessä jonkin voimakkaan hapon kanssa. Tällaisista voimakkaista hapoista voidaan mainita rikkihappo.

Termi "asylyysi" tässä käytettynä viittaa yhden (tai useiden) glykosidi-sidoksen tai -sidosten katkaisemiseen, jolloin lohkaistut osat korvataan alkanoyyliryhmillä. Hydroksyyliryhmien esteröiminen asyloimalla, so. korvaamalla vetyatomit alkanoyyliryhmillä, voi tapahtua samanaikaisesti asylyysin olosuhteissa.

Eräs edellä esitetyn keksinnön mukaisen menetelmän eduista on se seikka, että pektiiniä voidaan käyttää alkuperäisenä lähtöaineena. Kuten hyvin tiedetään, pektiini on eräs harvoista 8 79328 luonnossa esiintyvistä yhdisteistä, jotka sisältävä halutun oe-1,4-sidoksen ja lisäksi se on halpa ja helposti saatava lähtöaine. Pektiini soveltuu yhdisteiden II suurimittaiseen valmistukseen ja jäljempänä esitetyissä kaavioissa 4 ja 5 on yhteenveto ot- ja β -glykosidien valmistusmenetelmästä kokonaisuudessaan, joita yhdisteitä voidaan käyttää mielenkiintoisiin lääketieteellisiin ja muihin tarkoituksiin. Kaaviossa 4 on pektiinin hydrolyysituotteen (vaihe a) esimerkkinä tri-galakturonihappo, mutta on selvää, että pektiinin hydrolyysi voi johtaa muihin oligomeereihin dimeereistä esimerkiksi aina dekameereihin saakka. Di-galakturonihapon käyttöä esitetään kaaviossa 5.

Lähtöaineena käytetty pektiini hydrolysoidaan entsymaattisen tai happohydrolyysin avulla, jolloin muodostuu polygalakturo-nihappoa (eri,4), joka sen jälkeen joko entsymaattisen tai happohydrolyysin avulla hydrolysoidaan esimerkiksi tri-galak-turonihapoksi, so. yhdisteeksi 9 kaaviossa 4 ja di-galakturo-nihapoksi, so. yhdisteeksi 13 kaaviossa 5.

Tuloksena oleva oligogalakturonihapojen seos voidaan helposti erottaa suuressa mittakaavassa ioninvaihtokromatografian avulla (viite 10).

9 79328

Menetelmä A. Esteröiminen etyleenioksidin avulla.

Saatu tri-galakturonihappo (yhdiste 9 kaaviossa 4) sen jälkeen esteröidään etylöenioksidin avulla ennestään tunnetulla tavalla (vaihe b, viite 11), jolloin saadaan vastaavaa hydroksietyyliesteriä (yhdiste 10 kaaviossa 4).

Sitten hydroksietyyliesteri 10 pelkistetään vettä sisältävän natriumboorihydridin avulla (vaihe c, viite 12), jolloin saadaan galaktitoli-glykosidia (yhdiste 11, kaavio 4), joka on uusi ja ennestään tuntematon yhdiste.

Uusi yhdiste 11 voidaan asetyloida käyttäen asetanhydri-diä, jolloin saadaan per-O-asetaattia (vaihe d; yhdiste 12), joka on uusi yhdiste. Mainittua yhdistettä 12 käsitellään sitten asetanhydridin kanssa, joka sisältää konsentroitua rikkihappoa (vaihe e; viite 11), josta on tuloksena galak-titoli-puoliskon lohkaisu ilman että molekyylin muu osa hajoaisi havaittavasti, ja muodostuu täysin asetyloitu di-galaktoosi (yhdiste 5 kaaviossa 4). Vaihtoehtoisesti voidaan yhdistettä 5 muodostaa yhdessä vaiheessa (d ja e samanaikaisesti) käyttämällä asetanhydridiä ja konsentroitua rikkihappoa.

Täysin asetyloitu di-galaktoosi-yhdiste 5 eristettiin käyttämällä esitettyä menetelmää. Yhdistettä 5 voidaan käyttää vapaan sokerin valmistukseen (yhdiste 1) hydrolysoimalla, glykosidien valmistukseen biologista käyttöä varten ($-glykosidit tai α-glykosidit) ja muiden mahdollisten johdannaisten valmistukseen, jotka sisältävät 4-O-a-D-galaktopy-ranosyyli-D-galaktopyranoosi-yksikön, kuten on esitetty kaaviossa 4. On tietenkin mahdollista valmistaa glykosi-deja yhdisteestä 1, kuten on ilmoitettu kaaviossa 4.

10 79328

COOH

Hr °>

\-COOH

a·. HO iJ—0 h. /°\ H,0

Pektiini ^ > 1 \0H yi ' J=±—? V

f' COOH

9 H0k^-0H

OH

coo A/^n %1 ^0« H\£ IJOL· ^ Mi ΓΟΗ Ac20 “ "·" „

HO k I

\ 0H

11

Ac20/H2S04

AcO r°0Ac Ac0 CqAC >'

Ac20/„2S04 €>1 _0AC + AcOr“C CZ

A^fei ^οΙ£λ '©i rOAg/'0- ^GiE ' ^OAC |@CA<:0--0Ac U Ι4γ\0Αο 5α °AC 5B °A^l>Ac 0A° OAc H0 cT H°i/^”°\ 5 1/glyk-=i-l=^ti_ ^L^j-OJIor ^θΓ« . ^de-asetylointi HO HO (^IH \

\ ~Ah ho°R

de-asetylointi β-glykosidit a-glykosidit muut

johdannaiset Kaavio A

11 79328 HO f 0°H HO f°°Me ... 1/ °\ MeOH/HCl 1/ 0\

Pektimi < OH > -> <QH > \L_/J COOH N-Λ OOOMe »

OH OH

H0 Γ0Η . „ ,-OAc ^-foC.» SädiÄi ,-OAc Mg0H/Me°-^> 13 H0 <=Λ. Ac0 fe .15 0H J 16 Mi«e OAc

AcO r0Ac —1—1-1—' (¾

AcO O r0Ac i£°> 50 N—(OAc OAc

Kaavio 5

Menetelmä B. Samanaikainen esteröiminen ja glykosidointi. Saatu di-galakturonihappo (yhdiste 13 kaaviossa 5) sen jälkeen esteröidään ja glykosidoidaan samanaikaisesti meta-nolilla (tai muilla yksinkertaisilla alkoholeilla) ja hapolla ennestään tunnetulla tavalla kuten muut uronihapot (viite 14), jolloin saadaan vastaavaa uutta ja ennestään tuntematonta metyyliesteriglykosidia (yhdiste 14 kaaviossa 5). Yhdiste 14 on anomeerinen seos (α/β, 3/1).

Metyyliesteriglykosidi 14 sen jälkeen pelkistetään vettä sisältävällä natriumboorihydridillä, jolloin saadaan metyyli-glykosidia (yhdiste 15 kaaviossa 5), joka on uusi ja ennestään tuntematon yhdiste. Tämä uusi yhdiste 15 voidaan 12 79328 asetyloida käyttäen asetanhydridiä, jolloin saadaan per-O-asetyloitu glykosidi (yhdiste 16 kaaviossa 5), joka on jälleen uusi ja ennestään tuntematon yhdiste. Mainittua yhdistettä 16 käsitellään sitten asetanhydridillä, joka sisältää konsentroitua rikkihappoa, minkä tuloksena on metyyli-aglykoniosan lohkaisu ilman havaittavissa olevaa molekyylin muun osan tuhoutumista, ja muodostuu täysin asetyloitu di-galaktoosi (yhdiste 5 kaavioissa 4 ja 5). Vaihtoehtoisesti voidaan yhdistettä 5 muodostaa yhdessä vaiheessa yhdisteestä 15 käyttämällä asetanhydridiä ja konsentroitua rikkihappoa.

Per-O-asetyloitu di-galaktoosi 5 eristetään käyttäen esitettyä menetelmää ja sitä voidaan käyttää inter alia valmistamaan yhdistettä 1 ja sen erilaisia glykosideja (vrt. kaaviota 4) .

Esimerkit;

Keksintöä valaistaan lisää seuraavien spesifisten esimerkkien avulla, joita ei kuitenkaan pidä käsittää rajoittaviksi .

Esimerkki I

Polygalakturonihapon hydrolyysi

Poly-D-galakturonihappoa (50 g; Sigma) suspendoitiin nat-riumasetaattipuskuriin (1000 ml; 20 mM; pH 4,5) ja pH säädettiin natriumhydroksidilla (5 M). Suspensiota sekoitetaan 40°C:ssa ja lisättiin pektinaasia (1,0 g; PV 8, Miles) . Hydrolyysiä jatkettiin 24 h 40°C:ssa ja sen jälkeen se lopetettiin kuumentamalla 100°C:ssa 5 min ajan. Näytteitä otettiin pienin välein ja analysoitiin ohutlevykro-matografian avulla. Piidioksidigeeli 60; Merck. Eluoin-tiaine: butanoli/muurahaishappo/vesi 4/6/1. Tehtiin silmin nähtäviksi: levyt kuivattiin, niihin suihkutettiin rikkihappoa etanolissa (5 %) ja kuumennettiin (105°). Suurin osa hydrolysaatista muodostui di-, tri-, tetra- ja penta-meereistä.

i3 79328

Esimerkki II

Hydrplyysituotteiden puhdistaminen (vert. viite 10)

Osa hydrolysaatista, joka sisälsi D-galakturonihapon 1,4-a-kytkeytyneitä oligomeerejä pantiin valumaan "Zerolite" 225 (H+) kationinvaihtohartsi-pvlvään läpi (600 ml hartsia 1000 ml kohti hydrolysaattia) ja eluaatti lyofilisoitiin. Tuloksena oleva oligomeerien seos (6 g) liuotettiin tislattuun veteen (20 ml) ja liuos pantiin anioninvaihtohartsi-pylvääseen (Dowex 1x2, 50-100 mesh; formaattimuoto, tasapainotettu tislatulla vedellä). Pylväs eluoitiin muura-haishappoliuoksella (pesu: 350 ml; 0,2 M) jota seurasi kovera gradientti (0,2 M, 2000 ml - 0,65 M, 1200 ml), jolloin saatiin fraktioita, jotka sisälsivät di- ja tri-ga-lakturonihappoa. Tetragalakturonihappoa eluoitiin 1 M muu-rahaishappoliuoksella. Pakastekuivaamalla saatiin yhdisteet lähes puhtaassa muodossa (> 90 %). D-galakturonihappo-oligomeerien tuotokset on esitetty taulukossa 1.

Taulukko 1 D-galakturonihappo-oligomeerien tuotokset raa'an hydroly-saatin ioninvaihtokromatografiän jälkeen 6 g:sta poly-D-galakturonihappoa.

n kaavassa: (Oligo- Tuotos Eluointiaineen (1,4-g-D-gal)n meeri) g (%) tilavuus (ml) 1 (mono) 0,2 (3) 200 2 (di) 1,0 (17) 500-1250 3 (tri) 2,0 (34) 1650-3750 4 (tetra) 1,4 (23) 3950-4850

Esimerkki III

1,2,3,6-tetra-O-(2,3,4,6-tetra-O-asetyyli-a-D-galaktopyra-nosyyli) -a-D-galaktopyranoosin (yhdiste 5a kaavioissa 4 ja 5) valmistaminen_

Menetelmä A:

Tri-D-galakturonihappoa (9; 1,65 g) liuotettiin veteen (16,5 ml) ja lisättiin ylimäärä nestemäistä etyleenioksidia 14 79328 (noin 2 g). Reaktioseosta sekoitettiin huoneenlämmössä 6 vrk., jona aikana toistettiin etyleenioksidilisäyksiä 2-6 g 5 kertaa (1, 2, 3, 4 ja 5 päivän kuluttua). Reaktiota monitoroitiin pH:n nousun avulla ja ohutlevykromatogra-fian avulla (Si02: Et0Ac/H0Ac/H20 2/1/1).

6 vrk.:n kuluttua, kun vallitsi etyleenioksidiylimäärä (pH 7), poistettiin jäljellä oleva etyleenioksidi (vesi-imu) ja reaktioseos lisättiin pisaroittaan 5 min kuluessa natriumboorihydridin (2 g) vesiliuokseen (2 ml) ja pidettiin lämpötila 20-25°C:ssa. 12 h sekoittamisen jälkeen huoneenlämmössä reaktioseos tehtiin heikosti happameksi (pH 5,5) etikkahapolla. Reaktioseos suodatettiin ja suodos haihdutettiin (40°C) useita kertoja lisäämällä metanolia. Jäännös (vaalean keltainen öljy) haihdutettiin useita kertoja lisäämällä tolueenia ja kuivattiin (öljypumppupaine), jolloin saatiin 23 g. Etyleeniglykoli, natriumasetaatti ja pieniä määriä suuren molekyylipainon omaavia epäpuhtauksia poistettiin liuottamalla jäännös (23 g) 45 ml:aan vettä ja suodattamalla Sephadex G-15-pylvään (6 x 55 cm) läpi. Erotusta monitoroitiin ohutlevykromatografiän avulla (Si02: Et0Ac/H0Ac/H20 2/1/1). Fraktiot, jotka sisälsivät yhdistettä 11 (R^ 0,2) yhdistettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin 1,5 g amorfista jäännöstä.

Asetanhydridiä (50 ml), joka sisälsi 1 % konsentroitua rikkihappoa, lisättiin kuivaan jäännökseen ja reaktioseosta sekoitettiin 55°C:ssa 8 vrk. ajan. Reaktiota monitoroitiin ohutlevykromatografiän avulla. Reaktioseos jäähdytettiin, laimennettiin eetterillä ja uutettiin vedellä, kyllästetyllä natriumvetykarbonaattiliuoksella ja vedellä. Eetteri-liuos kuivattiin (Na2S04) ja haihdutettiin joitakin kertoja lisäämällä etanolia. Jäännös, (vaalean ruskea "puolittain kiteinen" öljy) kromatografoitiin piidioksidigeeli-pylväässä (4 x 60 cm) etyyliasetaatti/iso-oktaani (3/1) eluointiaineena. Haluttua ainetta sisältävät, kohtalaisen homogeeniset fraktiot yhdistettiin ja haihdutettiin, jolloin is 79328 saatiin yhdistettä 5α (joka sisälsi pienen määrän yhdistettä 5β). Tuotos: 700 mg (35 %). Uudelleenkiteytettiin etanolista ja saatiin puhdasta yhdistettä (5a, 425 mg, 21 % tri-galakturonihaposta).

Menetelmä B:

Di-D-galakturonihappoa (13; 20,0 g) lisättiin kalsiumklo-ridin (20 g) liuokseen metanolissa (1,0 1). Lisättiin Duolite'ä (H+) (15 g) ja seosta kuumennettiin palautusjääh dyttäen 18 h, suodatettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin raakaa yhdistettä 14 (kaavio 5). Jäännös liuotettiin veteen (200 ml) ja lisättiin natriumboorihydridin (6,0 g) liuosta vedessä (30 ml) 3 min kuluessa sekoittaen silloin tällöin. Reaktioseos pidettiin ympäristön lämpötilassa 20 h ajan ja tehtiin sitten happamaksi /Dowex 50 W-X (2)_/, suodatettiin, haihdutettiin yhdessä metanolin kanssa useita kertoja ja kuivattiin lopuksi (0,1 torr.). Jäännös (raaka yhdiste 15, kaavio 5) suspendoitiin asetanhydridin ja pyri-diinin seokseen (1:1, 600 ml), sekoitettiin ympäristön lämpötilassa 24 h ajan ja haihdutettiin sitten yhdessä to-lueenin kanssa useita kertoja paksuksi, puolikiinteäksi jäännökseksi, jossa ei ollut pyridiinin hajua. Jäännös jaettiin eetterin (0,5 1) ja veden (0,2 1) kesken. Vesi-faasi uutettiin eetterillä (2 x 100 ml) ja yhdistetyt eet-terifaasit pestiin vedellä (50 ml), kuivattiin (Na2S04) ja haihdutettiin kuiviin. Kun haihdutettiin yhdessä tolueenin kanssa ja kuivattiin (0,1 torr.) saatiin vaalean keltaista jäännöstä (31,5 g; etupäässä yhdistettä 16, kaavio 5). Lisättiin asetanhydridiä (320 ml) joka sisälsi 1 % konsentroitua rikkihappoa kuivaan jäännökseen ja reaktioseosta sekoitettiin huoneenlämmössä. Reaktiota monitoroitiin ohut-levykromatografiän avulla (Si02 eetteri/tolueeni, 3/1). Kun oli sekoitettu 50 min, reaktioseos kaadettiin eetterin päälle (1 litra) ja eetteriliuos pestiin tämän jälkeen jää-vesiseoksella (150 ml), kyllästetyllä natriumvety-karbonaattiliuoksella (150 ml) ja jää-vesiseoksella (150 ml), ja kuivattiin (Na2SC>4), haihdutettiin yhdessä tolueenin i6 79328 kanssa ja kuivattiin (0,1 torr.), jolloin saatiin amorfista jäännöstä (32 g). Kun kiteytettiin etanolista, saatiin otsakkeen yhdistettä (12,3 g, 33 % di-galakturonihaposta). Emäliuoksen kromatografia (SiC>2, EtoAc/iso-oktaani, 1/1), jota seurasi kiteyttäminen etanolista, lisäsi tuotosta 55 %:iin.

Taulukko 2 a-D-Galp-l-4-a-D-Galp(Ac)g:n (yhdiste 5a) fysikaaliset datat

Sp. (°C) /“a 7^ Lähde Tämä keksintö 151-154 + 1352^ (c 0,5, CHClg)

Totaalisynteesi 157-159 + 13722 (c 1,6, CHClg)

Viite 7 153-154 + 13824 (c 2, CHC1,,) 20

Viite 9 150-151 + 141 (c 1,0, CHClg).

Yhdisteen 5a spektroskooppiset datat: ^HNMR (CDClg, TMS):δ 6.40 (d, 1H, J=3,5 Hz, H-l) 5,59 (d/d, 1H, Jx=3,0 Hz, J2 1Hz, H-4'), 5,44 (d/d, 1H, J2=11,0 Hz, J2 3,5 Hz, H-2), 5.40 (d/d, 1H, J1=11,0 Hz, J2 3,0 Hz, H-3'), 5,25 (d/d, 1H, J1=11,0 Hz, J2=3,5 Hz, H-2'), 5,23 (d/d, 1H, J1=11,0 Hz, J2=2,5 Hz, H-3), 5,03 (d, 1H, J=3,5 Hz, H-l'), 4,54 (d/t, 1H, J1=J2=7,0 Hz, J3=1Hz, H-5'), 4,36 (d/d, 1H, J 10 Hz, J2=6 Hz, H-6), 4-23 (t, 1H, J=6 Hz, H-5), 4,21 (d, 2H, J=7 Hz, H-6'), 4,08 (d/d, 1H, J-^10 Hz, J2 = 6 Hz, H-6), 2,15, 2,14, 2,11, 2,10, 2,06, 2,03, 2,02, 1,98.

(s , 3H kukin).

13CNMR (CDC13); 6 170,58, 170,50, 170,32, 170,25, 170,11, 169,84, 169,49, 168,87, 99,15 (d, J=173 Hz, C-l'), 89,81 (d, J=178 Hz, C-l), 77,02, 70,37, 69,26, 68,22, 67,79, 67,29, 67,12, 66,21, 61,74, 60,62, 20,95, 20,90, 20,72 (2c), 20,62 (3c) , 20,51.

Esimerkki IV

Di-galaktoosi 5:n per-O-asetyloitu ga -glykosidi (a-D-Galp-l-4-a-D-Galp-l-3-galaktitoli (Ac) 12; yhdiste 12, kaavio 4_ I7 79328

Yhdistettä 11 esimerkistä III käsiteltiin asetanhydridin avulla, joka sisälsi 1 % konsentroitua rikkihappoa 3 h ajan.

Jatkotyöskentelyä kuten edellä on selostettu seurasi kro-matografia (Si02, etyyliasetaatti/iso-oktaani 3/1), jolloin saatiin dodeka-asetaattia (12) värittömänä amorfisena sakkana.

/“a7p2 + 93° (c 1,2, CHC13) . 1HNMR (CDC13TMS) : δ 5,58 (d/d, 1H, J1= 3,0 Hz, J2=1Hz, H-4"), 5,54-5,10 (8H), 5,01 (d, 1H, J=3,3 Hz, H-l"), 4,54 (t, 1H, J=7 Hz, H-5"), 4,48-4,00 (11H), 2,14, 2,12, 2,11, 2,105, 2,09, 2,09, 2,085, 2,08, 2,07, 2,06, 2,03, 1,99 (s, 3H kukin).

13 CNMR: δ 170,54, 170,43 (3c), 170,30 (2c), 170,18, 170,08, 169,97, 169,93, 169,85, 169,73, 99,23 (d, J=172 Hz), 97,79 (d, J=174 Hz), 77,56, 75,92, 70,59, 70,44, 69,06, 69,01, 68,94, 68,26, 67,78, 67,43, 67,37, 67,01, 67,27, 62,10, 61,79, 60,51, 20,99, 20,83, 20,72 (2c), 20,709 (2c), 20,706 (2c), 20,67 (3c), 20,56.

Esimerkki V

Metyyli-2,3,6-tetra-0-asetyyli-4-0-(2,3,4,6-tetra-O-ase-tyyli-a-D-galaktopyranosyyli)-a-D-galaktopyranosidi (yhdiste 16, kaavio 5)_

Osa raa'asta yhdisteestä 16 (esimerkki III, menetelmä B, vaalean keltainen jäännös) kiteytettiin metanolista ja saatiin otsakkeen yhdistettä 16 neulasina.

Sp. 176-178,5°C; /“Y/^2 + 159,7° (c 0,9, CHCl-j) ·, ^NMR (CDC13, TMS): 6 5,57 (leveä d, 1H, J==3 Hz, H-4') , 5,40 (d/d, 1H, J1=ll Hz, J2=3 Hz, H-3'), 5,30-5,19 (3H, H-3, H-2, H-2'), 5,00 (leveä S, 2H, H-l, H-l'), 4,54 (leveä t, 1H, J=7 Hz, H-5'), 4,36 (d/d, 1H, J-,^13 Hz, J2=9 Hz, H-6) , 4,24- 4,04 (5H), 3,42 (S, 3H, CH30-), 2,15 (S, 6H), 2,11, 2,10, 2,09, 2,05, 2,01 (S, 3H kukin).

13C-NMR (CDC13, TMS): 6 170,54, 170,50, 170,42, 170,30, is 79328 170,17, 169,99, 169,40, 99,03, (d, J=172 Hz, C-l'), 97,19 (d, J=175 Hz, C-l), 77,71, 69,44, 68,28, 67,80 (3C), 67,40, 66,97, 62,37, 60,64, 55,39 (CH30) 20,96, 20,80, 20,78, 20,77, 20,73, 20,66 (2C).

Esimerkki VI

Metyyli-4-O-(a-D-galaktopyranosyyli)-a-D-galaktopyranosidi (yhdiste 15, kaavio 5)_

Otsakkeen yhdistettä 15 (kaavio 5 ja esimerkki III, menetelmä B) valmistettiin puhtaassa muodossa deasetyloimalla yhdistettä 16 (kts. esimerkkiä V) seuraavan menetelmän mukaan:

Yhdiste 16 (2,5 g) liuotettiin lämpimään tetrahydrofuraaniin (10 ml). Metanolia (20 ml) lisättiin ja seos jäähdytettiin ympäristön lämpötilaan. Lisättiin metanolia sisältävää natriummetylaattia (0,1 M, 3 ml) ja reaktioseosta sekoitettiin 24 h, jonka jälkeen otsakkeen yhdiste oli saostunut neulasina. Reaktioseos suodatettiin ja sakka pestiin metanolilla ja kuivattiin (0,1 torr.), jolloin saatiin 1,08 g (79 %) otsakkeen yhdistettä 15.

Sp. 210-211°C; /“oT^2 + 228,3° (c 0,5, H20). 1H-NMR (DMSO-Dg, D20 lisätty, 50°C, TMS) m.m.: 6 4,82 (1H, d, J=3,5 Hz, H-l1) 4,59 (1H, d, J=2,5 Hz, H-l), 3,27 (3H, s, CH30).

13C-NMR (D20, TSP): 6 103,33 (d, J=170 Hz, C-l), 102,33 (d, J=170 Hz, C-l'), 81,73, 73,94, 73,85, 72,07, 72,00, 71,85, 71,47, 71,26, 63,47 (t, 2c, J=144 Hz, C-6, C-6'), 58,05 (q, J=144 Hz, CH30).

Esimerkki VII

Di-galakturonihapon metyyliesteri-glykosidi (yhdiste 14, kaavio 5)_

Otsakkeen yhdistettä 14 (kaavio 5 ja esimerkki III, menetelmä B) valmistettiin puhdistamalla kromatograafisesti raakamateriaalia, joka muodostui ensimmäisessä reaktio- i9 79328 vaiheessa kuten on selostettu esimerkissä III/ menetelmä B. a- ja β-isomeerien suhde oli suunnilleen 3:1 (määrätty NMR:n avulla).

1H-NMR (DMSO-D6, D20 lisätty, 50°C, TMS) m.m.: 6 4,96 (d, J=1,5 Hz, H-5), 4,93* (d, J=l,5 Hz, H-5), 4,72 (d, J=3 Hz, H-l'), 4,69 (d, J=4 Hz, H-l), 4,32 (d, J=lHz, H-5'), 4,29* (d, J=1 Hz, H-5'), 4,18 (d/d, = 3,0 Hz, J2 = 1 Hz, H-4'), 4,10* (d, J=7,5 Hz, H-l) 3,92 (d/d,

Jx = 3,0 Hz, J2 = 1,5 Hz, H-4), 3,69 (S, COOCH3), 3,63 (S, COOCH3), 3,42* (S, CH30), 3,29 (S, CH30).

13C-NMR (D20, TSP): δ 174,28, 173,36, 173*, 106,51*, 106,38, 103,29*, 102,52, 81,83, 81,04*, 74,17, 72,97*, 72,84, 72,75, 71,46, 71,40*, 71,39*, 70,81, 70,57, 70,75, 60,38*, 58,59, 55,85*, 55,78, 55,65.

*

Signaaleja β-isomeeristä Esimerkki VIII

4-0-q-D-galaktopyranosyyli-D-galaktoosi (yhdiste 1, kaavio 4) Yhdiste 5a (5 g) kaaviosta 4 tai 5 edellä liuotettiin lämmittämällä 100 ml:aan metanolia. Jäähdytettiin huoneenlämpöön ja lisättiin 12 ml 0,1 M natriummetoksidin metanoli-liuosta (vrt. viite 14). Pidettiin 4 vrk. huoneenlämmössä ja laimennettiin sitten seosta vedellä ja metanoli haihdutettiin pois. Vesiliuos neutraloitiin happamen ioninvaih-tajahartsin avulla /Dowex 50 W-X2 (H_)_/, käsiteltiin hiilen kanssa, saostettiin ja haihdutettiin. Kun kiteytettiin metanoli-vedestä, saatiin otsakkeen yhdistettä 1 (2 g, 78 %), jota ei voi erottaa kokonaissynteesin avulla valmistetusta yhdisteestä 1.

Sp. 211-213°C; /“α7ρ6 + 171° (C 1, H20), Litt.15: sp. 210-211°C; Γα7*6 + 177°; Litt.7: + 167° (c 1, h2o).

Edellä on tehty selkoa kaavojen III ja V mukaisten yhdisteiden pelkistyksestä vastaavasti kaavojen IV tai II ja VI

2o 79328 mukaisiksi yhdisteiksi. Tällaisissa pelkistyksissä voidaan helposti tuoda deuterium- tai tritiumatomeja substituent-ti-hiiliatomeihin, jotka ovat liittyneinä 5-asentoon käyttämällä NaBD^iä tai NaBT^:ä pelkistävinä aineina. Tällaisten raskaampien isotooppien tuominen 5-asennossa liittyneihin hiiliatomeihin tuo analyyttisiä etuja verrattuna vastaaviin yhdisteisiin. Siten esimerkiksi vetyatomien korvaaminen deuteriumatomeilla aikaansaa sen, että interferenssin jonka laktoosin mukanaolo aiheuttaa massaspektrometrimit-tauksiin, eliminoituu pois. Toisaalta tritiumatomien tuominen mainittuihin hiiliatomeihin tekee tuloksena olevat yhdisteet radioaktiivisilla mittauksilla havaittaviksi. Molemmat nämä seikat helpottavat suuresti yhdisteiden seuraamista, kun niitä käytetään testisysteemeissä tai terapeuttisessa tai diagnostisessa tarkoituksessa. Syntyneet yhdisteet ovat tietenkin uusia ja ennestään tuntemattomia ja muodostavat sellaisina kyseessä olevan keksinnön lisä-aspektin.

Esimerkki IX

6,6-di-deuterio-4-O-(6,6-di-deuterio-a-D-galaktopyranosyy- li)-D-galaktoosi_

Otsakkeen yhdistettä valmistettiin di-D-galaktouronihaposta 13 menetelmän mukaan, joka on selostettu esimerkissä III, menetelmä B; ainoana erona on se, että natriumboorihydridi korvattiin natriumboorideuteridilla. Asetyloiminen happamis-sa olosuhteissa antoi tetra-deuteroitua per-O-asetaattia, joka on analoginen yhdisteen 5 kanssa.

1HNMR (CDC13, TMS): δ 6,38 (d, 1H, J=3,5 Hz, H-l), 5,57 (d/d, 1H, ^=3 Hz, J2=l Hz, H-4'), 5,41 (d/d, 1H, = 11 Hz, J2 = 3,5 Hz, H-2), 5,39 (d/d, 1H, J± = 11 Hz, J2 = 3 Hz, H-3'), 5,22 (d/d, 1H, J = 11 Hz, J2 = 3,5 Hz, H-2'), 5,24 (d/d, 1H, J1 = 11 Hz, J2 = 3 Hz, H-3), 5,02 (d, 1H, J = 3,5 Hz, H-l'), 4,52 (leveä s, 1H, H-5'), 4,22 (s, 1H, H-5), 4,21 (d, 1H, J = 3 Hz, H-4), 2,16, 2,14, 2,11, 21 79328 2,07, 2,04, 2,03, 2,00 (s, 3H kukin, CH3CO).

13CNMR (CDC13, TMS): δ 170,57, 170,49, 170,33, 170,28, 170,08, 169,83, 169,44, 168,86, 99,09 (d, J = 171 Hz, OI'), 89,79 (d, J = 178 H2, C-l), 76,93, 70,17, 69,23, 68,19, 67,70, 67,75, 66,95, 66,14, 20,93, 20,89, 20,71 (2c), 20,61 (3c), 20,49.

Deasetyloimisen, jatkovalmistuksen ja kiteyttämisen jälkeen, kuten on selitettu esimerkissä VIII, saatiin otsakkeen yhdistettä.

22 79328

Kirjallisuuslähteet 1. Advances in chemotherapy, III. Symphosium, jonka aiheena bakteereiden kiinnittyminen, Tukholma, Ruotsi, tammikuu 23, 1981.

2. H. Leffler ja C. Svanborg-EdSn, FEMS Microbiol.

Lett. 8, 127 (1980).

3. G. Källenius, R. Möllby, S.B. Svenson, J. Winberg, A. Lundblad, S. Svensson ja B. Cedergren, FEMS Michrobiol. Lett. Ί_, 297 (1980) .

4. E. Märtensson, Acta Chem. Scand. , 3/7, 2356 (1963).

5. J.K.N. Jones ja W.W. Reid, J. Chem. Soc. 1955, 1890.

6. G.O. Aspinall ja R.S. Fanshawe, J. Chem. Soc. 1961, 4215.

7. M.E. Chacon-Fuertes ja M. Martin-Lomas: Carbohyd.

Res. j43, 51 (1975) .

8. P.A. Gent, R. Gigg ja A.A.E. Penglis, J. Chem. Soc.

Perkin Trans. _1, 1395 (1976) .

9. D.D. Cox, E.K. Metzner ja E.J. Reist, Carbohyd.

Res., 62, 245 (1978).

Cf. G.M. Bebault ja G.G.S. Dutton, Carbohyd.

Res. 3_7, 309 (1974) .

M. Dejter-Juszynski ja H.M. Flowers, Carbohyd.

Res., 41, 308 (1975).

10. I. Ashby, J. Brooks ja W.W. Reid, Chem. ja Ind., 26, 360 (1955).

11. W.W. Reid; Meth. Carbohyd. Chem. I, 309 (1962).

12. C.f. B.A. Lewis, F. Smith ja A.M. Stephens, Meth. Carbohyd. Chem. II, 68 (1963).

13. M.L. Wolfrom, A. Thompson ja E. Pacsu, Meth.

Carbohyd. Chem. II, 215 (1963).

14. J.K.N. Jones ja M. Stacey, J. Chem. Soc., 1947, 1340.

15. R.L. Whistler ja H.E. Conrad, J. Am. Chem. Soc., 76, 1673 (1954).

Claims (5)

23 79 328

1. Menetelmä yhdisteen valmistamiseksi, jolla on kaava (II) CX-OR2 okO—o \OR2 \r -] ^-12 ^ CX OR2 ! . , OR2 O I 2 n (II> <5l_X 3 OR2 0R Jn 2 3 jossa R on vety tai alempi alkanoyyli, R merkitsee samaa kuin ryhmä R tai se on alkyyliryhmä, ^oka edullisesti sisältää 1-6 hiiliatomia, jolloin ryhmä OR C-atomissa 1 molekyylin pelkistyvässä päässä on joko a- tai β-konfiguraa-tiossa, X on vety, deuterium tai tritium ja n on kokonaisluku 1-10, lähtien polygalakturonihaposta, joka hydrolysoidaan oligogalakturonihapon muodostamiseksi, tunnettu siitä, että a) saatu oligogalakturonihappo esteröidään sinänsä tunnetulla tavalla esterin muodostamiseksi, jolla on kaava (III) 4 COOR /\| f°°R4 (III) r:; °" \Öh )\ COOR4 0H \ / °\ NX OH \/v oh O-': L n V.-/ OH 24 79328 4 jossa on R on esteriryhmän alkoholiosa ja n merkitsee samaa kuin edellä, ja saatu kaavan (III) mukainen esteri pelkistetään edullisesti vesiliuoksessa, yhdisteen muodostamiseksi, jolla on kaava (IV): cx2oh )-0 (IV) p^oh L 0HIV/» OH jossa n ja X merkitsevät samaa kuin edellä, ja sen jälkeen kaavan (IV) mukainen yhdiste hydrolysoidaan kaavan (II) mu- 2 3 kaisen yhdisteen muodostamiseksi, jossa R ja R ovat vetyjä, tai kaavan (IV) mukainen yhdiste asylysoidaan kaavan 2 3 (II) mukaisen yhdisteen muodostamiseksi, jossa R ja R ovat alempia alkanoyylejä, ja sitten mikäli halutaan, hydrolysoidaan saatu yhdiste kaavan (II) mukaisen yhdisteen muo- 2 3 dostamiseksi, jossa R ja R ovat vetyjä, tai b) saatu oligogalakturonihappo esteröidään ja glykosidoidaan sinänsä tunnetulla tavalla yhdisteen muodostamiseksi, jolla on kaava (V): COOR η _S \ COOR (V) f OR _ CH n 25 7 9 3 2 8 jossa n merkitsee samaa kuin edellä ja R on alkyyliryhmä, joka edullisesti sisältää 1-6 hiiliatomia, ja saatu kaavan (V) mukainen yhdiste pelkistetään kaavan (II) mukaisen yhdisteen muodostamiseksi, ja sen jälkeen haluttaessa hydrolysoidaan 2 3 saatu kaavan (II) mukainen yhdiste, josa R on vety ja R on alkyyliryhmä, joka edullisesti sisältää 1-6 hiiliatomia 2 kaavan (II) mukaisen yhdisteen muodostamiseksi, jossa R ja 3 ... R ovat vetyjä ja n ja X merkitsevät samaa kuin edellä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että kaavan (III) mukaisen yhdisteen pelkistäminen suoritetaan natriumboorihydridin tai natriumsyanoboori-hydridin avulla vesiliuoksessa.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaavan (IV) mukaisen yhdisteen asylyy-si suoritetaan käyttäen etikkahappoanhydridiä yhdessä voimakkaan hapon kanssa, kuten rikkihapon kanssa.

4. Yhdiste, jolla on kaava (IV) : CX OH - 1 r o >— o “ vlA r.« OH °V^~0H L -i VL_Xoh jossa X on vety, deuterium tai tritium ja n on kokonaisluku i-lO.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen yhdiste, tunnettu siitä, että n on 1 tai 2, edullisesti 1. 26 79328