FI64575B

FI64575B - PROCEDURE FOR THE FRAMEWORK OF ANIMAL THERAPEUTIC ANALYSIS SOMATOSTATINANALOG

Info

Publication number: FI64575B
Application number: FI781183A
Authority: FI
Inventors: James Edwin Shields; Tsung-Min Lin
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1977-04-21
Filing date: 1978-04-18
Publication date: 1983-08-31
Also published as: FI781183A; DK174178A; GR69789B; FR2387942B1; CA1120030A; EG14800A; IE780766L; JPS53132589A; NL7804219A; IL54532A; IL54532A0; PT67912B; PT67912A; BG28705A4; AU518731B2; IT1094471B; AT360675B; ES469004A1; BG28704A3; GB1596329A

Description

ΓΒΐ (11)KUULUTUSjULKAISU /»COCΓΒΐ (11) ANNOUNCEMENT / »COC

LJ ' ' UTLÄGGN1NGSSKR1FT '3 c (4¾ P'tait1" ^ y ^ (51) Kv.lk.^Int.CI.3 G 07 C IO3/52 SUOMI — FINLAND (21) P«*nttlhik«mui — Pu*nt«ntöknlnj Τ8ΐΐ83 (22) H«k*ml*p»lvl — An*ekninf$d*j l8.OU.78 (23) AlkupSIvl — Giltifh*t*d»j 18.Ol.78 (41) Tullut julkiseksi — Bllvlt offtntllg 22 10.78LJ '' UTLÄGGN1NGSSKR1FT '3 c (4¾ P'tait1 "^ y ^ (51) Kv.lk. ^ Int.CI.3 G 07 C IO3 / 52 FINLAND - FINLAND (21) P« * nttlhik «mui - Pu * nt «ntöknlnj Τ8ΐΐ83 (22) H« k * ml * p »lvl - An * ekninf $ d * j l8.OU.78 (23) AlkupSIvl - Giltifh * t * d» j 18.Ol.78 (41) Tullut to the public - Bllvlt offtntllg 22 10.78

Patentti- ja rekisterihallitus Nthaviksipanon kuuLJulk^n pvm.- ,, *National Board of Patents and Registration of the Republic of Finland

Patent· och registerstyrelsen ' Antttkan utiagd oeh utljkrKt«n publktnd jx.u0.u3 (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus—Begird prlorltet 21. OU. 77 01.02.78 USA(US) 789^73, 87U173 (71) Eli Lilly and Company, 3Ο7 East McCarty Street, Indianapolis,Patent · och registerstyrelsen 'Antttkan utiagd oeh utljkrKt «n publktnd jx.u0.u3 (32) (33) (31) Requested Privilege — Begird prlorltet 21. OU. 77 01.02.78 USA 789 ^ 73, 87U173 (71) Eli Lilly and Company, 3Ο7 East McCarty Street, Indianapolis,

Indiana 46206, USA(US) (72) James Edwin Shields, Indianapolis, Indiana,Indiana 46206, USA (72) James Edwin Shields, Indianapolis, Indiana,

Tsung-Min Lin, Indianapolis, Indiana, USA(US) (7U) Qy Kolster Ab (54) Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen somatostatiinianalogin valmistamiseksi - Förfarande för framställning av en terapeutiskt anvandbar somatostatinanalog Tämä keksintö koskee menetelmää, jonka avulla voidaan valmistaa te trad e ka pe p t icliä H-D- Vai-G ly- L-Cys- L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L- Lys-L.-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Sep-L-Cys-OH (kaava I), sekä sen farmaseutt sesli vaarat Lomia happoadditiosuoloja.The present invention relates to a process for the preparation of a therapeutically useful somatostatin analogue. The present invention relates to a process for the preparation of a therapeutically useful somatostatin analogue. pt icliä HD- Vai-G ly- L-Cys- L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L.-Thr-L-Phe-L-Thr- L-Sep-L-Cys-OH (Formula I), as well as its pharmaceutical hazards Lomia acid addition salts.

Somatostatiini, joka tunnetaan myös somatotropiinin vapautumista ehkäisevänä tekijänä on tetradekapeptidi, jonka kaava on L-A1a-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-L-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Tnr-L-Ser-L-Cys-OH. Tämä tetradekapeptidi on eristetty lampaan hypotalamuksen uutteista ja sen on todettu ehkäisevän kasvu-hormoonin eritystä, joka tunnetaan myös somatotropiinina. Ks. lähemmin ?. Brazeau, W. Vale, R. Burgus, N-Ling, M. Butcher, J. Rivier ja R. Guiilemin. Science, 17 9 , 77 (1973 ).Somatostatin, also known as a somatotropin release inhibitor, is a tetradecapeptide of the formula L-A1a-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-L-Trp-L-Lys-L -Thr-L-Phe-L-Tnr-L-Ser-L-Cys-OH. This tetradecapeptide has been isolated from sheep hypothalamic extracts and has been found to inhibit the secretion of growth hormone, also known as somatotropin. See. closer? Brazeau, W. Vale, R. Burgus, N-Ling, M. Butcher, J. Rivier, and R. Guiilemin. Science, 179, 77 (1973).

Tämän lisäksi on tätä yhdistettä, jota mukavuussyistä nimite- g tään D-Trp -somatostatiiniksi, selostanut aikaisemmin Brown et ai, Endocrinology, 9_8, n:o 2 , 336-343 ( 1976 ).In addition, this compound, conveniently called D-Trp somatostatin, has been previously described by Brown et al., Endocrinology, 9-8, No. 2, 336-343 (1976).

2 645752 64575

Kaavan I mukaisen biologisesti tehokkaan tetradekapeptidin kaava on esitetty edellä ja siihen kuuluu myös sen ei-toksiset happoadditiosuolat. Uuden yhdisteen rakenne eroaa somatostätiinin rakenteesta siinä suhteessa, että D-tryptofaani-jäännös on asemassa 8 L-tryptofaani-jäännöksen tilalla ja D-valiini-jäännös kohdassa 1 L-alaniini-jäännöksen tilalla. Mukavuussyistä voidaan merkitäThe formula of the biologically active tetradecapeptide of formula I is set forth above and also includes its non-toxic acid addition salts. The structure of the new compound differs from the structure of somatostatin in that the D-tryptophan residue is in position 8 instead of the L-tryptophan residue and the D-valine residue at position 1 in place of the L-alanine residue. For convenience, can be marked

Ί BΊ B

kaavan I mukaisia tetradekapeptidejä seuraavasti: D-Val , D-Trp - somatostatiini.tetradecapeptides of formula I as follows: D-Val, D-Trp - somatostatin.

Valmistettaessa kaavan I mukaista yhdistettä muodostuu välituotteena R-Y-Gly-L-Cys (R-^-L-Lys (R2 )-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp(R5)-L-Lys(R2)-L-Thr(R2)-L-Phe-L-Thr(R^)-L-Ser(R^)-L-Cys(R)-X, kaava II, jossa Y on D-Vai, R on vety tai it-amino-funktion suojaryhmä, R-^ on vety tai tio-funktion suojaryhmä, R2 on vety tai £-amino-funktion suojaryhmä,In the preparation of the compound of formula I, the intermediate RY-Gly-L-Cys (R 1 -L-Lys (R 2) -L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp (R 5) -L-Lys (R 2 ) -L-Thr (R 2) -L-Phe-L-Thr (R 2) - L-Ser (R 2) - L-Cys (R) -X, formula II wherein Y is D-Val, R is hydrogen or an itino-amino protecting group, R 1 is hydrogen or a thio function protecting group, R 2 is hydrogen or an E-amino function protecting group,

Rg ja R^ merkitsevät kumpikin vetyä tai hydroksi-funktion suojaryhmää,R 9 and R 6 each represent hydrogen or a hydroxy protecting group,

Rt- on vety tai formyyli, ja X on hydroksi tai / _____ . / <' \^.hartsi jossa kaavassa hartsi on polystyreeni, sillä ehdolla, että X:n ollessa hydroksi R, R^, R2, R3> R^ ja R& merkitsevät kukin vetyä, ja kun X on <~ " "~\,hartsi niin R, R-^, R2, ja R^ merkitsevät kukin muuta kuin vetyä.Rt- is hydrogen or formyl, and X is hydroxy or / _____. resin in which the resin is polystyrene, provided that when X is hydroxy R, R 1, R 2, R 3> R 2 and R 6 each represent hydrogen, and when X is <~ "" ~ \, resin so R, R 1, R 2, and R 2 are each other than hydrogen.

Uutta kaavan I mukaista tetradekapeptidiä valmistetaan antamalla vastaavan suoraket juisen, kaavan III mukaisen to t;radeka-peptidin Y-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-l.-Phe-L-Phe-D-Trp-l.-Lys- h-Thr- 1,-A novel tetradecapeptide of formula I is prepared by administering the corresponding rectilinear tetradecapeptide of formula III, Y-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-1-Phe-L-Phe-D-Trp-1. .-Lys- h-Thr- 1, -

J—IJ-I

Phe-L-Thr-L-Ser·- L-Cys-OH, jossa Y on D-VuL, reagoida hapot I imen 3 64575 kanssa. Tämä reaktio muuttaa kaksi sulfhydryyliryhmää disulfidi-sillaksi.Phe-L-Thr-L-Ser · -L-Cys-OH, where Y is D-VuL, reacts with acids I 64575. This reaction converts the two sulfhydryl groups into a disulfide bridge.

Farmaseuttisesti sopivia ei-toksisia happoadditiosuoloja ovat orgaaniset ja epäorgaaniset happoadditiosuolat, esimerkiksi seuraavien happojen kanssa valmistetut: suolahappo, rikkihappo, sulfonihappo, viinihappo, fumaarihappo, bromivetyhappo, glykoli-happo, sitruunahappo, maleiinihappo, fosforihappo, meripihkahappo, etikkahappo, typpihappo, bentsoehappo, askorbiinihappo, p-tolueeni-sulfonihappo, bentseenisulfonihappo, naftaleenisulfonihappo ja propionihappo. Happoadditiosuolat ovat edullisimmin etikkahapon kanssa valmistettuja. Kaikki edellä olevat suolat voidaan valmistaa tavanmukaisin menetelmin.Pharmaceutically acceptable non-toxic acid addition salts include organic and inorganic acid addition salts, for example, prepared with the following acids: hydrochloric acid, sulfuric acid, sulfonic acid, tartaric acid, fumaric acid, hydrobromic acid, acetic acid, glycolic acid, citric acid, citric acid, maleic acid, maleic acid, p-toluenesulfonic acid, benzenesulfonic acid, naphthalenesulfonic acid and propionic acid. The acid addition salts are most preferably prepared with acetic acid. All of the above salts can be prepared by conventional methods.

Edellä oleva kaava, joka esittää välituotteita, sisältää amino-, hydroksi- ja tio-(sulfhydryyli)funktioiden suojaryhmät.The above formula, which represents intermediates, contains protecting groups for amino, hydroxy and thio (sulfhydryl) functions.

Tässä esitettyjen suojaryhmien ominaisuudet ovat kahdenlaatuisia. Ensiksi,suojaryhmä estää kulloinkin kyseessä olevan molekyylin reaktiokykyisen osan reagoimisen molekyylin joutuessa olosuhtei- ^ siin, jotka voisivat aiheuttaa muutoin aktiivisen osan irtoamisen. Toiseksi, suojaryhmä on sellainen, että se voidaan helposti poistaa palauttamalla entiselleen alkuperäinen aktiivinen osä^ sellaisissa olosuhteissa, jotka eivät epäedullisesti vaikuttaisi molekyylin muihin osiin. Alan asiantuntijat tuntevat hyvin tällaisiin tarkoituksiin käytettävät ryhmät, siis amino-, hydroksi- ja työryhmien suojelemiseen käytettävät ryhmät. Tällaisten ryhmien käyttämisen selostamista ja tarkastelua varten on tehty jopa kokonaisia teoksia. Eräs tällainen teos on oppikirja Protective Groups in Organic Chemistry, J. F. W. McOmie, julkaissut Plenum Press, f' New York, 1973. /The properties of the protecting groups presented here are twofold. First, the protecting group prevents the reactive portion of the molecule in question from reacting when the molecule is exposed to conditions that could cause the otherwise active moiety to cleave. Second, the protecting group is such that it can be readily removed by restoring the original active moiety under conditions that would not adversely affect other portions of the molecule. The groups used for such purposes, i.e. the groups used to protect amino, hydroxy and working groups, are well known to those skilled in the art. Even entire works have been made to explain and review the use of such groups. One such work is the textbook Protective Groups in Organic Chemistry, J. F. W. McOmie, published by Plenum Press, f 'New York, 1973. /

Edellä olevassa, välituotteita definoivassa kaavassa, esittää R joko ^—amino—vetyä tai — amino— funktiota suo jaavaa ryhmää. Peptidikemiaan perehtyneet tuntevat hyvin R:n esittämät t-amino-funktion suojaryhmät. Useita niistä on esitetty yksityiskohtaisesti teoksessa McOmie, supra, luku 2, julkaissut J. W. Barton. Esimerkkeinä tällaisista suojaryhmistä mainittakoon: “ 64575 bentsyylioksikarbonyyli, £-klooribentsyylioksikarbonyyli, £-bromibentsyylioksikarbonyyli, o-klooribentsyylioksikarbonyyli, 2,6-diklooribentsyylioksikarbonyyli , 2 ,4-diklooribervtsyylioksi-karbonyyli, o-bromibentsyylioksikarbonyyli, £-metoksibentsyylioksi-karbonyyli, £-nitrobentsyylioksikarbonyyli, t-butyylioksikarbonyy-li (BOC), t-amyylioksikarbonyyli, 2-(£-bifenylyyli)isopropyyliok-sikarbonyyli (BpOC), adamantyylioksikarbonyyli, isopropyylioksi-karbonyyli, syklopentyylioksikarbonyyli, sykloheksyylioksikarbonyyli, sykloheptyylioksikarbonyyli, trifenyylimetyyli (trityyli), ja £-tolueenisulfonyyli. R:n esittämä -aminofunktiota suojeleva ryhmä on edullisimmin t-butyylioksikarbonyyli.In the above formula defining intermediates, R represents either a ^ -amino-hydrogen or a -amino-protecting group. Those skilled in the art of peptide chemistry are well acquainted with the protecting groups for the t-amino function represented by R. Several of them are detailed in McOmie, supra, Chapter 2, published by J. W. Barton. Examples of such protecting groups include: “64575 benzyloxycarbonyl, E-chlorobenzyloxycarbonyl, E-bromobenzyloxycarbonyl, o-chlorobenzyloxycarbonyl, 2,6-dichlorobenzyloxycarbonyloxy-benzyloxycarboxy-bryloxy] -carbonyloxycarbonyl, o-chlorobenzyloxycarbonyl, o-chlorobenzyloxycarbonyl -butyloxycarbonyl (BOC), t-amyloxycarbonyl, 2- (E-biphenylyl) isopropyloxycarbonyl (BpOC), adamantyloxycarbonyl, isopropyloxycarbonyl, cyclopentyloxycarbonyl, cyclohexyloxycarbonyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cycloheptyl The amino protecting group represented by R is most preferably t-butyloxycarbonyl.

esittää joko vetyä kysteiinin sulfhydryyliryhmässä tai sulfhydryylisubstituentin suojaryhmää. Useita tällaisia suojaryh-miä on esitetty teoksessa McOmie, supra, luku 7, R.G. Hickey, V.R. Rao ja W.G. Rhodes. Sopivia esimerkkejä sellaisista suojaryh-mistä ovat £-metoksibentsyyli, bentsyyli, £-tolyyli, bentshydryy-li, asetamidometyyli, trityyli, £-nitrobentsyyli, t-butyyli, iso-butyylioksimetyyli, samaten kuin mikä tahansa useista trityylijoh-dannaisista. Lisää tällaisia ryhmiä on esimerkiksi teoksessa Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, "Synthese von Pep-tiden" , osat 15/1 ja 15/2, (1974). Stuttgart, Saksan Liittotasavalta. R^:n esittämä sulfhydryylifunktiota suojeleva ryhmä on edullisimmin £-metoksibentsyyli.represents either hydrogen in the sulfhydryl group of cysteine or a protecting group of a sulfhydryl substituent. Several such protecting groups are disclosed in McOmie, supra, Chapter 7, R.G. Hickey, V.R. Rao and W.G. Rhodes. Suitable examples of such protecting groups include E-methoxybenzyl, benzyl, E-tolyl, benzhydryl, acetamidomethyl, trityl, E-nitrobenzyl, t-butyl, iso-butyloxymethyl, as well as any of several trityl derivatives. More such groups can be found, for example, in Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, "Synthese von Peptide", parts 15/1 and 15/2, (1974). Stuttgart, Federal Republic of Germany. The sulfhydryl-protecting group represented by R 1 is most preferably E-methoxybenzyl.

R^ esittää joko vetyä lys.iinijäännöksen E-aminofunktiossa tai sopivaa E-aminofunktion suojaryhmää. Esimerkkeinä sellaisista ryhmistä on suurin osa edellä mainituista, jotka soveltuvat käytettäviksi o<-aminofunktion suojaryhminä. Tyypillisiä tällaisia ryhmiä ovat bentsyylioksikarbonyyli, t-butyylioksikarbonyyli, t-amyy-lioksikarbonyyli, syklopentyylioksikarbonyyli, adamantyylioksikarbonyyli , £-metoksibentsyylioksikarbonyyli, £-klooribentsyylioksi-karbonyyl.i , £-brom.ibent syyl i oks ikarbonyyl i , o-kloori bentsyyl i oksikarbonyyli , 2,6-diklooribentsyyli oksikarbonyyli , 2, 4-di klooribents-yylioksikarbonyyli, o-bromibentsyylioksikarbonyyli, £-nitrobents-yylioks ikarbonyyli, isopropyylioksikarbonyyli, sykloheksyy1i oks i-karbonyyli, sykloheptyylioksikarbonyyli ja p-tolueenisulfonyyli.R 1 represents either hydrogen in the E-amino function of the lysine residue or a suitable protecting group for the E-amino function. Examples of such groups are most of those mentioned above which are suitable for use as protecting groups for the o <amino function. Typical such groups are benzyloxycarbonyl, t-butyloxycarbonyl, t-amyloxycarbonyl, cyclopentyloxycarbonyl, adamantyloxycarbonyl, E-methoxybenzyloxycarbonyl, E-chlorobenzyloxycarbonyl.i, e-bromobenzyl, 2,6-dichlorobenzyl oxycarbonyl, 2,4-dichlorobenzyloxycarbonyl, o-bromobenzyloxycarbonyl, E-nitrobenzyloxycarbonyl, isopropyloxycarbonyl, cyclohexyloxycarbonyl, cycloheptyloxycarbonyl and p-cycloheptyloxycarbonyl.

Kuten seuraavassa tulee esiin, kaavan I mukaisten tetrade-kapeptidien valmistusmenetelmä sisältää jaksoittain toistuvia pep- 5 64575 tidiketjun terminaalisen aminohapon ;x,-aminofunkt ion suojaryhmän lohkaisuja. Ainoa rajoitus, mikä siis tehdään £-aminofunktion suojaryhmän identtisyyteen nähden lysiinijäännöksessä, on se, että se ei lohkea niissä olosuhteissa, joissa lohkaistaan selektiivisesti <X-aminofunktiota suojeleva ryhmä. o(-aminofunkt ion ja £-aminofunk-tion suojaryhmien sopiva valinta on seikka, jonka alaan perehtyneet peptidikemistit tuntevat hyvin, ja valinta riippuu siitä suhteellisesta helppoudesta, millä jokin suojaryhmä voidaan lohkaista. Täten esimerkiksi sellaiset ryhmät kuin 2-(p-bifenylyyli)iso-propyylioksikarbonyyli (BpOC) ja trityyli ovat hyvin labiileja ja ne voidaan lohkaista jo hyvin heikkoa happoa käyttäen. Melko voimakasta happoa, kuten kloorivetyhappoa, trifluorietikkahappoa tai booritrifluoridia etikkahapossa tarvitaan lohkaistaessa muista ryhmiä, kuten t-butyylioksikarbonyyli, t-amyylioksikarbonyyli, ada-mantyylioksikarbonyyli ja p-metoksibentsyylioksikarbonyyli. Vielä voimakkaampia happo-olosuhteita tarvitaan aikaansaamaan eräiden muiden suojaryhmien lohkaisu, kuten esimerkiksi bentsyylioksikar-bonyylin, halogeenibentsyylioksikarbonyylin, p-nitrobentsyyl.ioksi-karbonyylin, sykloalkyylioksikarbonyylin ja isopropyylioksikarbo-nyylin lohkaisu. Näiden jälkimmäisten ryhmien lohkaisu vaatii erittäin voimakkaita happo-olosuhteita, kuten bromivedyn, fluorivedyn tai booritrifluoriasetaatin käyttöä trifluorietikkahapossa. Luonnollisesti myös kaikki labiilimmat ryhmät lohkeavat voimakkaammissa happo-olosuhteissa. Aminofunktion suojaryhmän sopiva valinta merkitsee siis sitä, että c<-aminofunktion suojeturyhmänä käytteitään labiilimpaa ryhmää kuin £-aminofunktion suojelemiseen ja tähän liittyvät myös lohkaisuolosuhteet, jotka on suunniteltu sellaisiksi, että selektiivisesti poistetaan vain <X-aminofunktio.As will be seen below, the process for the preparation of tetrade capeptides of formula I involves periodic repetitive cleavage of the terminal amino acid; x, -aminofunction ion protecting group of the peptide chain. The only limitation, thus, with respect to the identity of the protecting group of the ε-amino function in the lysine residue, is that it does not cleave under conditions in which the <X-amino protecting group is selectively cleaved. The appropriate choice of protecting groups for the β-amino function and the β-amino function is well known to those skilled in the art and depends on the relative ease with which a protecting group can be cleaved. Thus, for example, groups such as 2- (p-biphenylyl) large -propyloxycarbonyl (BpOC) and trityl are very labile and can be cleaved using a very weak acid, and a fairly strong acid such as hydrochloric acid, trifluoroacetic acid or boron trifluoride in acetic acid is required for cleavage of other groups such as t-butyloxycarbonyl, t-butyloxycarbonyl, Even stronger acidic conditions are needed to effect cleavage of certain other protecting groups, such as benzyloxycarbonyl, halobenzyloxycarbonyl, p-nitrobenzyloxyocarbonyl, cycloalkyloxycarbonyl, and isopropyloxycarbonyl, and isopropyloxycarbonyl. very strong acidic conditions, such as the use of hydrogen bromide, hydrogen fluoride or boron trifluoroacetate in trifluoroacetic acid. Naturally, all the most labile groups also cleave under stronger acidic conditions. Thus, the appropriate choice of amino-protecting group means that a more labile group is used as the protecting group for the α-amino function than for the protection of the ε-amino function, and also associated with cleavage conditions designed to selectively remove only the <X-amino function.

Tässä suhteessa on 1*2 edullisimmin o-klooribentsyylioksikarbonyy-li tai syklopentyylioksikarbonyyli ja niiden kanssa valitaan edullisimmin käytettäväksi o<-aminofunktion suojaryhmänä kussakin aminohapossa, joka lisätään peptidiket juun, t-butyyl.ioksikarbonyyli .In this regard, 1 * 2 is most preferably o-chlorobenzyloxycarbonyl or cyclopentyloxycarbonyl, and with them is most preferably selected for use as a protecting group for the o <-amino function at each amino acid to be added to the peptide chains, t-butyl.oxycarbonyl.

Ryhmät ja. esittävät hydroksyyliryhmän vetyä tai treo-niinin ja vastaavasti seriinin alkoholisen hydroksyyl.in suojaryh-mää. Useita sellaisia suojaryhmiä on esitetty teoksessa McOmie, supra, luku 3, C.B. Reese. Tyypillisiä tällaisia suojaryhmiä ovat esimerkiksi C^-C^ -alkyyli, kuten metyyli, etyyli ja t-butyyli; 6 64575 bentsyyli, substituoitu bentsyyli, kuten £-metoksibentsyyli, £-nit-robentsyyli, £-klooribentsyyli ja o-klooribentsyyli; C^-Cg -alkanyy-li, kuten formyyli, asetyyli ja propionyyli; trifenyylimetyyli (tri-tyyli). Kun Rg ja ovat suojaryhmiä, niin suojaryhmäksi valitaan kummassakin tapauksessa edullisimmin bentsyyli.Groups and. represent a hydrogen group of hydrogen or a protecting group of the alcoholic hydroxyl of threonine and serine, respectively. Several such protecting groups are disclosed in McOmie, supra, Chapter 3, C.B. Reese. Typical such protecting groups include, for example, C 1 -C 4 alkyl such as methyl, ethyl and t-butyl; 6,64575 benzyl, substituted benzyl such as E-methoxybenzyl, E-nitrobenzyl, E-chlorobenzyl and o-chlorobenzyl; C 1 -C 6 alkanyl such as formyl, acetyl and propionyl; triphenylmethyl (tri-style). When Rg and are protecting groups, benzyl is most preferably selected as the protecting group in each case.

Ryhmä esittää joko vetyä tai formyyliä ja definoi osan ^NR<. tryptofaani-jäännöksessä. Formyyli toimii suojaryhmänä. Tällaisen suojaryhmän käyttäminen on valinnanvaraista ja sen vuoksi R^ voi sopivasti olla vety (suojaamaton N) tai formyyli (suojattu N) .The group represents either hydrogen or formyl and defines the moiety ^ NR <. tryptophan residue. Formyl acts as a protecting group. The use of such a protecting group is optional and therefore R 1 may suitably be hydrogen (unprotected N) or formyl (protected N).

Ryhmä X tarkoittaa tetradekapeptidiketjun karboksyylipää-tettä; se voi olla hydroksyyli, mikä definoi vapaan karboksyyli-ryhmän. Tämän lisäksi X tarkoittaa kiinteää hartsitukiosaa, johon peptidin terminaalinen karboksyyli on liittynyt sen synteesin aikana. Tämä kiinteä hartsi voidaan esittää kaavalla .·=· hartsi -0-CH_— · 2 S ✓ •-·Group X represents the carboxyl terminus of the tetradecapeptide chain; it may be hydroxyl, which defines a free carboxyl group. In addition, X represents a solid resin support moiety to which the terminal carboxyl of the peptide is attached during its synthesis. This solid resin can be represented by the formula · = · resin -0-CH_— · 2 S ✓ • - ·

Kaikissa edellä olevissa yhdisteissä merkitsee R, R^ , Rg,In all of the above compounds, R, R 1, R 9,

Rg , R^ ja R,- kukin vetyä silloin, kun X on hydroksyyli. Kun X merkitsee kiinteää hartsitukiosaa, niin R, R^, Rg, Rg ja R^ ovat kukin suojaryhmiä.R 9, R 10 and R 11 are each hydrogen when X is hydroxyl. When X represents a solid resin support moiety, R, R 1, R 8, R 8 and R 2 are each protecting groups.

Seuraavia lyhennyksiä, joista useimmat ovat hyvin tunnettu--'’ ja ja alalla yleisesti käytettyjä, käytetään tästä lähtien:The following abbreviations, most of which are well known-- '' and and commonly used in the art, are hereinafter used:

Ala - AlaniiniLower Alanine

Asn - AsparagiiniAsn - Asparagine

Cys - KysteiiniCys - Cysteine

Gly - GlysiiniGly - Glycine

Lys - LysiiniLys - Lysine

Phe - FenyylialaniiniPhe - Phenylalanine

Ser - SeriiniSer - Serine

Thr - TreoniiniThr - Threonine

Trp - TryptofaaniTrp - Tryptophan

Vai - Väliini 7 64575 DCC - N,Ν’-disykloheksyylikarbodi-imidi DMF - N,N-dimetyyliformamidi BOC - t-butyylioksikarbonyyli PMB - £-metoksibentsyyli CBzOC - o-klooribentsyylioksikarbonyyli CPOC - SyklopentyylioksikarbonyyliVai - Intermediate 7 64575 DCC - N, Ν'-Dicyclohexylcarbodiimide DMF - N, N-dimethylformamide BOC - t-butyloxycarbonyl PMB - E-methoxybenzyl CBzOC - o-chlorobenzyloxycarbonyl CPOC - Cyclopentyloxycarbonyl

Bzl - BentsyyliBzl - Benzyl

For - Formyyli jFor - Formyl j

BpOC - 2-(p-bifenyyli)isopropyylioksikarbonyyliBpOC - 2- (p-biphenyl) isopropyloxycarbonyl

Vaikka siis ammattitaitoinen, synteettisten peptidien tutkimuksen parissa työskentelevä kemisti pystyy valitsemaan kaavan I j mukaisten yhdisteiden valmistuksessa kulloinkin käytettävät suoja-ryhmät, on kuitenkin hyvä tietää, että suoritettavien reaktioiden ! sekvenssi vaatii valitsemaan juuri nimenomaiset suojaryhmät. Toisin sanoen, valitun suojaryhmän on oltava stabiili sekä reagent-tien suhteen että niiden olosuhteiden suhteen, jotka vallitsevat reaktiosekvenssin peräkkäisissä vaiheissa. Kuten edellä on jo jonkin verran tuotu esiin, on jonkin määrätyn suojaryhmän oltava sellainen, joka pysyy koskemattomana niissä olosuhteissa, joita käytetään lohkaisemaan <X-aminofunktion suojaryhmä peptidifragmentin terminaalisesta aminohappojäännöksestä, kun valmistetaan seuraa-vaksi tulevan aminohappofragmentin liittämistä peptidiketjuun. On myös tärkeää valita suojaryhmäksi sellainen, joka pysyy koskemattomana peptidiketjua rakennettaessa, ja joka on helposti poistet- . ' tavissa, kun täydennetään halutun tetradekapeptidi-yhdisteen syli-teesiä. Kaikki nämä seikat ovat ammattitaitoisen peptidikemistiry'y tiedossa. /Thus, although a skilled chemist working in the field of synthetic peptides will be able to select the protecting groups to be used in the preparation of the compounds of formula Ij, it is good to know that the reactions to be performed! the sequence requires the selection of specific protecting groups. That is, the protecting group selected must be stable to both the reagents and the conditions prevailing in the successive steps of the reaction sequence. As already stated somewhat above, a particular protecting group must be one that remains intact under the conditions used to cleave the <X amino function protecting group from the terminal amino acid residue of the peptide fragment when preparing the subsequent incorporation of the next amino acid fragment into the peptide chain. It is also important to select as the protecting group one that remains intact during the construction of the peptide chain and that is easily removed. when supplementing the synthesis of the desired tetradecapeptide compound. All these facts are known to a skilled peptide chemist. /

Kaavan III mukaista lähtöaineena käytettyä tetradeka·^ peptidiä voidaan valmistaa kiinteän faasin synteesin avulfa.The starting tetradeca · peptide of formula III can be prepared by solid phase synthesis.

Tämä synteesi käsittää peptidiketjun rakentamisen jaksöttaisesti alkaen peptidin C-terminaali -päästä. Tarkemmin sanottuna, ensin liitetään kysteiini karboksyylifunktiostaan hartsiin antamalla ' amino-suojatun, S-suojatun kysteiinin reagoida kloorimetyloidun hartsin tai hydroksimetyylihartsin kanssa. Hydroksimetyylihartsin valmistamisen ovat selostaneet Bodanszky et ai. Chem. Ind. (Lontoo), 3_8, 1 597-98 (1966). Kloorimetyloitua hartsia on saatavissa kaupallisesti Lnb. Systems, Inc. San Matero, Kalifornia.This synthesis involves the construction of a peptide chain periodically starting from the C-terminus of the peptide. More specifically, the cysteine of its carboxyl function is first attached to the resin by reacting the 'amino-protected, S-protected cysteine with a chloromethylated resin or hydroxymethyl resin. The preparation of hydroxymethyl resin has been described by Bodanszky et al. Chem. Ind. (London), 3_8, 1 597-98 (1966). Chloromethylated resin is commercially available from Lnb. Systems, Inc. San Matero, California.

ö 64575ö 64575

Kun C-terminaalinen kysteiini on liitetty hartsiin, muutetaan suojattu kysteiini ensin cesiumsuolakseen. Tämän suolan annetaan sitten reagoida hartsin kanssa menetelmän mukaan, jonka on selostanut B.F. Gisin, Helv. Chim. Acta, J36, 1476 (1 973 ). Vaihtoehtoisesti voidaan kysteiini liittää hartsiin aktivoimalla kyste-iinimolekyylin karboksyylifunktio soveltamalla helposti tunnettavaa tekniikkaa. Kysteiinin voidaan esimerkiksi antaa reagoida hartsin kanssa käyttämällä apuna karboksyyliryhmää aktivoivaa yhdistettä, kuten N,N’-disykloheksyylikarbodi-imidiä (DCC).Once the C-terminal cysteine is attached to the resin, the protected cysteine is first converted to its cesium salt. This salt is then reacted with the resin according to the method described by B.F. Gisin, Helv. Chim. Acta, J36, 1476 (1,973). Alternatively, cysteine can be attached to the resin by activating the carboxyl function of the cysteine molecule using readily known techniques. For example, the cysteine can be reacted with a resin with the aid of a carboxyl group activating compound such as N, N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC).

Sen jälkeen, kun vapaan karboksyylin sisältävä kysteiini on liitetty sopivasti hartsi-tukiosaan, käsittää loppuosa peptidin ra-kentamissekvenssistä kunkin aminohapon jaksottain tapahtuvan lisäämisen peptidiketjun N-päätteiseen osaan. Tämän vuoksi jokaiseen yksityiseen sekvenssiin kuuluu *-aminofunktion suojaryhmän lohkai-su siitä aminohaposta, joka edustaa peptidifragmentin N-päätteis-tä osaa, minkä jälkeen seuraa järjestyksessä seuraavan aminohappo-jäännöksen liittäminen aminohapon N-päätteeseen, joka on tällöin vapaa ja reaktiokykyinen. o*-aminofunktion suojaryhmän lohkaisu voidaan suorittaa käyttämällä happoa, kuten bromivetyhappoa, kloo-rivetyhappoa, trifluorietikkahappoa, jp-tolueenisulfonihappoa, bentseenisulfonihappoa, naftaleenisulfonihappoa ja etikkahappoa, jolloin muodostuu vastaava happoadditiosuola-yhdiste. Eräs toinen menetelmä, jota voidaan käyttää lohkaisemaan aminosuojaryhmä, on booritrifluoridin käyttö. Esimerkiksi booritrifluoridi-di etyyli -eetteraatti jääetikassa muuttaa amino-suojatun peptidifragmentin BFg-kompleksiksi, joka sitten voidaan muuttaa ei-suojatuksi pepti-difragmentiksi käsittelemällä emäksellä, kuten kaliumbikarbonaatin vesiliuoksella. Kaikkia näitä menetelmiä voidaan käyttää, jos vain ollaan selvillä siitä, että valitun menetelmän avulla on voitava lohkaista N-terminaalinen °t-aminofunktion suojaryhmän ilman muiden peptidiketjussa olevien suojaryhmien irrottamista. Tämän vuoksi on edullisinta, että N-terminaalisen suojaryhmän lohkaisu suoritetaan käyttäen trif luor.iet ikkahappoa. Lohkaiseminen suoritetaan tavallisesti läinpiöt i lasso, joka on 0°C:n ja huoneen lämpötilan välillä.After the free carboxyl-containing cysteine is suitably attached to the resin support moiety, the remainder of the peptide construction sequence comprises the periodic addition of each amino acid to the N-terminal portion of the peptide chain. Therefore, each private sequence involves cleavage of the * amino function protecting group from the amino acid representing the N-terminal portion of the peptide fragment, followed by sequential addition of the next amino acid residue to the N-terminal amino acid, which is then free and reactive. Cleavage of the o * amino function can be performed using an acid such as hydrobromic acid, hydrochloric acid, trifluoroacetic acid, n-toluenesulfonic acid, benzenesulfonic acid, naphthalenesulfonic acid and acetic acid to form the corresponding acid addition salt. Another method that can be used to cleave the amino protecting group is the use of boron trifluoride. For example, boron trifluoride diethyl etherate in glacial acetic acid converts an amino-protected peptide fragment to a BFg complex, which can then be converted to an unprotected peptide fragment by treatment with a base such as aqueous potassium bicarbonate. All of these methods can be used as long as it is known that the chosen method must be able to cleave the protecting group of the N-terminal ° t-amino function without removing other protecting groups in the peptide chain. Therefore, it is most preferred that the cleavage of the N-terminal protecting group be performed using trifluoroacetic acid. Cleavage is usually performed at a temperature between 0 ° C and room temperature.

Kun N-päätteen lohkaisu on suoritettu, niin tuloksena oleva yhdiste on tällöin normaalisti suojaryhmän lohkoisussa käytetyn hapon happoadditiosuolan muodossa. Sen jälkeen se voidaan muuttaa ! 9 64575 / yhdisteeksi, jonka päässä on vapaa amino, käsittelemällä sitä laimean emäksen avulla, tyypillisimmin tertiääri sen amiinin, kuten pyridiinin tai trietyyliamiinin avulla.When the N-terminal cleavage is performed, the resulting compound is then normally in the form of an acid addition salt of the acid used in the cleavage of the protecting group. After that it can be changed! 9,64575 / to a compound having a free amino terminus by treatment with a dilute base, most typically a tertiary amine such as pyridine or triethylamine.

Peptidiketju on sitten valmis reagoimaan järjestyksessä seu-raavan aminohapon kanssa. Se voi tapahtua minkä tahansa tunnetun tekniikan vulla, joita on useita. Kun järjestyksessä seuraava aminohappo liitetään N-päätteiseen peptidiketjuun, käytetään aminohappoa, jossa on vapaa karboksyyli, mutta jonka -aminofunktio on sopivasti suojattu samoin kuin mikä tahansa sen muista reaktioky-kyisistä osista. Aminohappo joutuu sellaisiin olosuhteisiin, joissa sen karboksyylifunktio aktivoidaan liittämisreaktiota varten. Eräs tällainen aktivoimistekniikka, jota voidaan käyttää synteesissä, on aminohapon muuttaminen seka-anhydridiksi. Aminohapon vapaa karboksyylifunktio aktivoituu tällöin reagoidessaan toisen hapon, tyypillisimmin happokloridinsa muodossa olevan karboksyyliha-pon kanssa. Esimerkkejä tällaisista happoklorideista, joita voidaan käyttää sopivien seka-anhydridien muodostamiseen, ovat etyy-liklooriformiaatti, fenyyliklooriformiaatti, sek-butyylikloori-formiaatti, isobutyyliklooriformiaatti ja pivalyylikloridi.The peptide chain is then ready to react with the next amino acid in sequence. It can be done with any of the known techniques, of which there are several. When the next amino acid in sequence is attached to an N-terminal peptide chain, an amino acid having a free carboxyl but whose amino function is suitably protected as well as any of its other reactive moieties is used. The amino acid is subjected to conditions in which its carboxyl function is activated for the coupling reaction. One such activation technique that can be used in the synthesis is the conversion of an amino acid to a mixed anhydride. The free carboxyl function of the amino acid is then activated by reacting with another acid, most typically a carboxylic acid in the form of its acid chloride. Examples of such acid chlorides which can be used to form suitable mixed anhydrides include ethyl chloroformate, phenyl chloroformate, sec-butyl chloroformate, isobutyl chloroformate and pivalyl chloride.

Toinen menetelmä, jolla aminohapon karboksyylifunktio voidaan aktivoida liittymisreaktion aikaansaamiseksi, on muuttaa aminohappo reaktiokykyiseksi esterijohdannaisekseen. Esimerkkeinä tällaisista reaktiokykyisistä estereistä mainittakoon 2,'4,5-tri-kloorifenyyliesteri, pentakloorifenyyliesteri, £-nitrofenyylies-teri, 1-hydroksibentsotriatsolista muodostettu esteri ja N-hydrok-sisykkinimidistä muodostettu esteri. Vielä eräs menetelmä, jonka avulla saadaan aikaan C-terminaalisen aminohapon liittyminen pep-tidifragmenttiin, on sellainen, että liittymisreaktio suoritetaan siten, että mukana on vähintäin ekvimolaarinen määrä Ν,Ν'-disyk-loheksyylikarbodi-imidiä (DCC). Tämä jälkimmäinen menetelmä on parhaana pidetty valmistettaessa kaavan II mukaista tetradekapep-tidiä, jossa X on • —· hartsiAnother method by which the carboxyl function of an amino acid can be activated to effect a coupling reaction is to convert the amino acid to a reactive ester derivative. Examples of such reactive esters are 2,4,5-trichlorophenyl ester, pentachlorophenyl ester, ε-nitrophenyl ester, an ester formed from 1-hydroxybenzotriazole and an ester formed from N-hydroxycyclic imide. Another method of effecting the incorporation of a C-terminal amino acid into a peptide fragment is to perform the coupling reaction in the presence of at least an equimolar amount of β, β'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC). This latter method is preferred for the preparation of a tetradecapeptide of formula II wherein X is • - · resin

-0-QW-/' /S-0-QW- / '/ S

\ / χ·=· 10 64575\ / χ · = · 10 64575

Kun haluttu aminohapposekvenssi on valmis, voidaan tuloksena saatu peptidi poistaa hartsitukiosastaan. Tämä tapahtuu käsittelemällä suojattua, hartsitukiosan omaavaa tetradekapeptidiä fluo-rivedyllä. Fluorivedyllä käsittely lohkaisee peptidin hartsista; sen lisäksi se kuitenkin lohkaisee myös kaikki jäljellä olevat reak-tiokykyisten osien suojaryhmät peptidi ketjussa, samoin kuin N-ter-minaalisen aminohapon (Xr^minofunktion suojaryhmän. Kun käytetään fluorivetyä lohkaisemaan suojaryhmät, on edullisinta suorittaa reaktio siten, että mukana on anisolia. Anisolin mukanaolon on havaittu estävän peptidiketjussa olevien joidenkin aminohappojäännösten potentiaalinen alkyloituminen. Lisäksi on edullista suorittaa loh-kaisu siten, että mukana on etyylimerkaptaania. Etyylimerkaptaani auttaa suojaamaan tryptofaanijäännöksen indolirengasta ja lisäksi se helpottaa suojattujen kysteiinien konversiota tiolimuodoikseen. Kun R(. on formyyli, niin etyylimerkaptaanin mukanaolo helpottaa formyyliryhmän lohkaisua fluorivedyllä.When the desired amino acid sequence is complete, the resulting peptide can be removed from its resin support moiety. This is done by treating the protected tetradecapeptide with a resin support moiety with hydrogen fluoride. Hydrogen fluoride treatment cleaves the peptide from the resin; however, in addition, it also cleaves all remaining protecting groups of the reactive moieties in the peptide chain, as well as the N-terminal amino acid (Xrmino-functional protecting group. When hydrogen fluoride is used to cleave the protecting groups, it is most preferred to carry out the reaction in the presence of anisole. It has also been found to inhibit the potential alkylation of some amino acid residues in the peptide chain. cleavage with hydrogen fluoride.

Kun lohkaisureaktio on suoritettu, niin saatu tuote on suo-raketjuinen peptidi, joka sisältää 14 aminohappojäännöstä. Jotta saataisiin lopullinen, kaavan I mukainen tuote, on välttämätöntä käsitellä suoraketjuista tetradekapeptidiä hapettavissa olosuhteissa, jolloin molekyylissä olevat kaksi sulfhydryyliryhmää, yksi kummassakin kysteiini-osassa, muuttuvat disulfidi-siliaksi. Tämä saadaan aikaan käsittelemällä lineaarisen tetradekapeptidin laimennettu liuos millä tahansa hapettavalla aineella, esimerkiksi jodilla tai kaliumferrisyanidilla. Myös ilmaa voidaan käyttää hapettavana aineena, jolloin seoksen pH-arvo on tavallisesti 2,5 - 9,0 ja edullisimmin noin 6,2 - 7,2. Kun hapettavana aineena käytetään ilmaa, ei peptidiliuoksen konsentraatio ole tavallisesti suurempi kuin noin 0,4 mg peptidiä/ml kohti liuosta ja tavallisesti noin 50 pg/ml.When the cleavage reaction is completed, the product obtained is a straight-chain peptide containing 14 amino acid residues. In order to obtain the final product of formula I, it is necessary to treat the straight-chain tetradecapeptide under oxidative conditions in which the two sulfhydryl groups in the molecule, one in each cysteine moiety, are converted to disulfide-silia. This is accomplished by treating a dilute solution of the linear tetradecapeptide with any oxidizing agent, for example, iodine or potassium ferricyanide. Air can also be used as the oxidizing agent, with the pH of the mixture usually being 2.5 to 9.0 and most preferably about 6.2 to 7.2. When air is used as the oxidizing agent, the concentration of the peptide solution usually does not exceed about 0.4 mg peptide / ml per solution, and usually about 50 pg / ml.

Kaavan I mukaista yhdistettä voidaan antaa lääkkeeksi lämminverisille imettäväisille, myös ihmisille, ja nimenomaan sitä voidaan käyttää sileän lihaksiston ve)aksoimiseen.The compound of formula I can be administered as a medicament to warm-blooded mammals, including humans, and in particular can be used to smooth smooth muscle.

Varsinkin gas Lroin Les Linaali nen alue voidaan relaksoi.da anta- 1 fi maila parenteraalises Li pienaa määriä U-Val , D-Trp -somaLos-tutiinia. Tämä vaikutus, jonka tuloksena on suoli.ston liikkeiden väheneminen, on ei· i koi sen edu.l linen hypo ton j sessa gas Iroin- 11 64575 testinaalisessa röntgenkuvauksessa. Lisäksi tätä yhdistettä voidaan käyttää spastisen paksusuolen, pylorusspasmin ja muiden gast-rointestinaalialueen spastisten tilojen hoitoon, samoin kuin ure-terin ja sappirakon kollikin hoitoon.In particular, the gas Lroin Les Linear region can be relaxed.da given 1 fi racket parenterally Li small amounts of U-Val, D-Trp -somaLos-tutin. This effect, which results in a reduction in intestinal motility, is not due to its advantageous hypogonetic gas irradiation in 11 64575 testicular X-rays. In addition, this compound can be used to treat spastic colon, pylorus spasm, and other spastic conditions of the gastrointestinal tract, as well as to treat ureter and gallbladder colic.

Kun halutaan relaksoida sileitä lihaksia, yhdistettä annetaan lääkkeeksi tavallisesti annos, joka on noin 0,1 μg - 3 μg saajan ruumiin kiloa kohti ja edullisesti noin 3 pg - 1,5 pg ruumiinpainon kiloa kohti. Lääkkeenanto tapahtuu parenteraalisesti ja se voi olla intramuskuläärisesti, subkutaanisesti tai intravenöö-sisti; edullisimmin annetaan yhdisteet intravenöösisti tai intramuskuläär i s e s t i .When smooth muscle relaxation is desired, the compound is usually administered in a dose of about 0.1 μg to 3 μg per kilogram of the recipient's body, and preferably about 3 pg to 1.5 pg per kilogram of body weight. The drug is administered parenterally and may be intramuscularly, subcutaneously or intravenously; most preferably, the compounds are administered intravenously or intramuscularly.

Parenteraalisesti annettavat yksikköannosmuodot valmistetaan tavallisesti käyttäen yhdistettä farmaseuttisen kantaja-aineen, kuten esimerkiksi isotonisen suolaliuoksen, isotonisen gly-siinin, laktoosin, mannitolin, laimennetun etikkahapon, bakterio-staattisen veden kanssa tai esimerkiksi veden kanssa, joka sisältää noin 1 %:n bentsyylialkoholia ja fosfaattipuskuriliuosten kanssa, samoin kuin sopivien mitä tahansa standardi-kantaja -ainetta sisältävien yhdistelmien kanssa. Kantaja-ainetta on tavallisesti mukana suhteessa vaikuttavaan aineeseen paino-osissa noin 25:1 - 1000:1.Parenteral unit dosage forms are usually prepared using a compound with a pharmaceutical carrier such as isotonic saline, isotonic glycine, lactose, mannitol, dilute acetic acid, bacteriostatic water, or, for example, water containing about 1% benzyl alcohol and phosphate. , as well as with suitable combinations containing any standard carrier. The carrier is usually present in an amount of about 25: 1 to 1000: 1 by weight relative to the active ingredient.

Yhdiste, riippuen kantaja-aineesta ja käytetystä konsentraa-t.iosta, voidaan joko suspendoida tai liuottaa sopivaan steriiliin liuottimeen, joista parhaana pidetään vettä. Kun liuoksia valmistetaan, niin yhdiste ja kantaja-aine voidaan liuottaa valittuun liuottimeen, liuos suodatetaan ja pannaan sopivaan pieneen lääke* pulloon tai ampulliin ja lääkepullo tai ampulli suljetaan tiiviisti. Liuottimeen voidaan liuottaa edullisesti apuaineita, kuten paikallisesti käytettävää anestesia-suojalääkeainetta tai puskuroivaa ainetta. Stabilisuuden parantamiseksi yhdiste voidaan liuottaa kantaja-aineen kanssa veteen ja vesiliuos pannaan pieneen lääkepulloon ja sen jälkeen lyofilisoidaan. Kuiva lyofilisoitu kiinteä aine suljetaan sitten lääkepulloon ja varustetaan mukana olevalla lääke-pullolla, jossa on liuotin, jonka avulla seos muodostetaan uudelleen ennen käyttöä. Parenteraaliset suspensiot voidaan valmistaa olennaisesti samalla tavalla, paitsi että yhdiste suspendoidaan kantaja-aineeseen liuotuksen asemesta.The compound, depending on the carrier and the concentration used, can either be suspended or dissolved in a suitable sterile solvent, of which water is preferred. When solutions are prepared, the compound and carrier can be dissolved in the chosen solvent, the solution is filtered and placed in a suitable small vial or ampoule, and the vial or ampoule is sealed. Advantageously, excipients such as a topical anesthetic or a buffering agent can be dissolved in the solvent. To improve stability, the compound can be dissolved in water with a carrier and the aqueous solution placed in a small vial and then lyophilized. The dry lyophilized solid is then sealed in a vial and provided with an accompanying vial containing a solvent to reconstitute the mixture before use. Parenteral suspensions may be prepared in substantially the same manner except that the compound is suspended in the carrier instead of being dissolved.

Kaavan I mukainen yhdiste on myös tehokas, vaikkei 12 64575 välttämättä yhtä suuressa määrin, inhiboimaan kasvuhormoonin eristystä. Tämä inhiboiva vaikutus on hyödyllinen niissä tapauksissa, joissa hoidettava henkilö tarvitsee terapeuttista käsittelyä liiallisen somatotropiinin erityksen takia, mikä liittyy haitallisiin tiloihin, kuten nuoruusiän diabetekseen ja akromegaliaan. Tällä yhdisteellä on myös muita fysiologisia vaikutuksia, kuten vatsahapon erityksen inhiboiminen, mikä on hyödyllistä vatsahaavan hoidossa; samoin pankreaksen eksokriinisen erityksen inhiboiminen, joka on mahdollisesti hyödyllinen pankreatitiksen hoidossa, ja insuliinin ja glukagonin erityksen inhiboiminen. Tätä yhdistettä voidaan antaa lääkkeeksi useilla eri tavoilla, kuten oraalisesti, sublinguaalisesti, subkutaanisesti, intramuskuläärisesti ja intra-venöösisti. Sublinguaalisen ja oraalisen antotavan ollessa kyseessä, on annos edullisimmin noin 1 mg - 100 mg/kg ruumiinpainoa kohti. Intravenöösi, subkutaaninen tai intramuskuläärinen annostus on tavallisesti näissä jälkimmäisissä indikaatioissa noin 1 pg -1 mg/kg ruumiin painoa kohti ja edullisimmin noin 50 pg - 100 pg/ kg ruumiin painoa kohti. On selvää, että annostus voi vaihdella laajasti riippuen kulloinkin kyseessä olevasta tilasta samoin kuin taudin tilan vakavuudesta.The compound of formula I is also effective, although not necessarily to the same extent, in inhibiting growth hormone isolation. This inhibitory effect is useful in cases where the subject is in need of therapeutic treatment due to excessive somatotropin secretion associated with adverse conditions such as juvenile onset diabetes and acromegaly. This compound also has other physiological effects, such as inhibition of gastric acid secretion, which is useful in the treatment of gastric ulcer; as well as inhibition of pancreatic exocrine secretion, which is potentially useful in the treatment of pancreatitis, and inhibition of insulin and glucagon secretion. This compound can be administered in a variety of ways, such as orally, sublingually, subcutaneously, intramuscularly, and intravenously. For sublingual and oral administration, the dose is most preferably about 1 mg to 100 mg / kg body weight. Intravenous, subcutaneous or intramuscular dosage in these latter indications is usually about 1 pg to 1 mg / kg body weight, and most preferably about 50 pg to 100 pg / kg body weight. It will be appreciated that the dosage may vary widely depending on the particular condition as well as the severity of the condition.

Kaavan I mukaista yhdistettä voidaan antaa lääkkeeksi oraalisesti tai sublinguaalisesti yhdessä farmaseuttisen kantaja-aineen kanssa, esimerkiksi tablettien tai kapselien muodossa. Inert-tejä laimennusaineita tai kantaja-aineita, esimerkiksi magnesium-karbonaattia tai laktoosia voidaan käyttää yhdessä tavanmukaisten hajoamista edistävien aineiden, esimerkiksi maissitärkkelyksen ja algiinihapon kanssa ja voitelevien aineiden, kuten magnesiumstear· raatin kanssa. Kantaja-aineen tai laimennusaineen määrä on tyylillisesti noin 5-95 % lopullisesta seoksesta ja edullisimmin lioin 50-85 % lopullisesta seoksesta. Voidaan käyttää myös sopivia maustavia aineita lopullisessa valmistuksessa tekemään seoksesta paremman makuinen.The compound of formula I may be administered orally or sublingually as a medicament together with a pharmaceutical carrier, for example in the form of tablets or capsules. Inert diluents or carriers, for example magnesium carbonate or lactose, may be used in combination with conventional disintegrants, for example maize starch and alginic acid, and lubricating agents, for example magnesium stearate. The amount of carrier or diluent is stylistically about 5-95% of the final mixture and most preferably 50-85% of the final mixture. Suitable flavoring agents may also be used in the final preparation to make the mixture taste better.

Kun kaavan I mukaista yhdistettä annetaan lääkkeeksi paren-teraalisesti, voidaan käyttää sopivia kantaja-aineita, kuten esimerkiksi mitä tahansa edellä näiden yhdisteiden sileän lihaksiston relaksoimiseen käyttämisen yhteydessä selostettuja.When a compound of formula I is administered parenterally, suitable carriers may be used, such as any of those described above in connection with the use of these compounds for the relaxation of smooth muscle.

i3 64575i3 64575

Seuraavat esimerkit valaisevat kaavan I mukaisen yhdisteen ja sen välituotteiden valmistusta.The following examples illustrate the preparation of a compound of formula I and its intermediates.

Esimerkki 1 N-t-butyylioksikarbonyyli-L-kysteinyyli(S-p-metoksibentsyy- li)-metyloitu polystyreeni-hartsi 1 000 mlraan N,N-dimetyyliformamidia (DMF), joka sisälsi N-t-butyylioksikarbonyyli-(S-p-metoksibentsyyli)-kysteiinin kesium-suolaa (valmistettu 17,5 g:sta vapaata happoa), lisättiin 100 g kloorimetyloitua polystyreeniharts ia (Lab. Systems, Inc., 0,75 mmoo-lia Cl/g). Seosta hämmennettiin huoneen lämmössä viiden päivän j ajan. Sen jälkeen suodatettiin hartsi ja pestiin vuorotellen kolme kertaa seoksella, jossa oli 85 % DMF ja 15 % vettä ja pelkästään DMF:11a, ja sitten kaksi kertaa DMF:11a. Hartsi suspendoitiin 1 000 ml:aan DMF:a ja siihen lisättiin liuos, jossa oli 16 g (83,4 mmoolia) kesiumasetaattia. Seosta hämmennettiin 9 päivän ajan huoneen lämmössä. Sen jälkeen hartsi suodatettiin ja pestiin vuorotellen kolme kertaa seoksella, jossa oli 85 % DMF:a ja 15 % vettä ja pelkästään DMF:11a. Hartsi pestiin CHCl^:11a ja suspendoitiin sitten neljä kertaa CHCl3:een erotussuppilossa ja vedettiin neste joka kerta pois hienojen hiukkasten poistamiseksi. Hartsi suodatettiin, pestiin 95-%:isella etanolilla ja sitten vuorotellen kolme kertaa bentseenillä ja 95-%:isella etanolilla. Sen jälkeen Ijtrt-si kuivattiin vakuumissa 30°C:ssa, jolloin saatiin 115,3 g otsakkeessa mainittua ainetta. Aminohappoanalyysi osoitti 0,254 mmoolia Cys/g kohti hartsia. Kysteiini määrättiin kysteiinihappona happohydrolyysistä, joka suoritettiin käyttäen 1:1 seosta diok-saania ja konsentroitua kloorivetyhappoa, johon oli lisätty pieni määrä dimetyylisulfoksidia.Example 1 Nt-butyloxycarbonyl-L-cysteinyl (Sp-methoxybenzyl) -methylated polystyrene resin in 1000 ml of N, N-dimethylformamide (DMF) containing the cesium salt of Nt-butyloxycarbonyl- (Sp-methoxybenzyl) -cysteine ( prepared from 17.5 g of free acid), 100 g of chloromethylated polystyrene resin (Lab. Systems, Inc., 0.75 mmol Cl / g) was added. The mixture was stirred at room temperature for five days. The resin was then filtered and washed alternately three times with a mixture of 85% DMF and 15% water and DMF alone, and then twice with DMF. The resin was suspended in 1000 ml of DMF and a solution of 16 g (83.4 mmol) of cesium acetate was added. The mixture was stirred for 9 days at room temperature. The resin was then filtered and washed alternately three times with a mixture of 85% DMF and 15% water and DMF alone. The resin was washed with CHCl 3 and then suspended four times in CHCl 3 in a separatory funnel and the liquid was withdrawn each time to remove fine particles. The resin was filtered, washed with 95% ethanol and then alternately three times with benzene and 95% ethanol. The Ijtrt was then dried in vacuo at 30 ° C to give 115.3 g of the title compound. Amino acid analysis showed 0.254 mmol Cys / g per resin. Cysteine was determined as cysteic acid by acid hydrolysis performed using a 1: 1 mixture of dioxane and concentrated hydrochloric acid to which a small amount of dimethyl sulfoxide had been added.

i4 6 4 5 7 5i4 6 4 5 7 5

Esimerkki 2 N-t-butyyli oks ikarbonyyli-D-valyyli-glysyyli-L-(S-£-metoksi bent syy 1 i )kysteinyy1Ί-L-(N*-o-klooribentsyylioksikarbonyyli)-lysyyli-L-asparagi nyyl i -L-fenyylialanyyli -L-fenyyl i a] anyyli -D-trypt°fyyli-L-CN^-o-klooribentsyyl i oksikarbonyyli )lysyyli -L-(0-bentsyyli)treonyyli-L-fenyylialanyyli-L-(0-bentsyy1i)treonyyli-L-(0-bentsyyli)seryyli-L-(S-£-metoksibentsyyli)kysteinyyli metyloitu polystyreeni-hartsiExample 2 Nt-butyloxycarbonyl-D-valyl-glycyl-L- (S-? -Methoxy Benzyl) cysteinyl---L- (N * -o-chlorobenzyloxycarbonyl) -lysyl-L-asparaginyl-L- phenylalanyl-L-phenyl and methyl-D-tryptophyl-L-CN (-o-chlorobenzyloxycarbonyl) lysyl-L- (O-benzyl) threonyl-L-phenylalanyl-L- (O-benzyl) threonyl- L- (O-Benzyl) seryl-L- (S-? -Methoxybenzyl) cysteinyl methylated polystyrene resin

Esimerkissä 1 saatu tuote (5,0 g) pantiin Beckmanin reak-tioastiaan 990, automaattiseen peptidien synteesilaitteeseen, ja kaksitoista jäljellä olevista kolmestatoista aminohaposta lisättiin käyttäen automaattista synteesilaitetta. Tuloksena oleva suojattu tridekapeptidihartsi jaettiin kahteen samanlaiseen osaan ja lopullinen jäännös pantiin toiseen näistä osista. Käytettiin aminohappoja seuraavan käyttösekvenssin mukaisesti: (1) N-t-butyyli-oksikarbonyyli-(0-bentsyyli)-L-seriini; (2) N-t-butyylioksikarbo-nyyli-(0-bentsyyli)-L-treoniini; (3) N-t-butyylioksikarbonyyli-L-fenyylialaniini; (4) N-t-butyylioksikarbonyyli-(0-bentsyyli)-L-treoniini; (5) N^-t-butyylioksikarbonyyli-N^-o-klooribentsyyli-oksikarbonyyli-L-lysiini; (6) NÄ-t-butyylioksikarbonyyli-D-trypto-faani; (7) N-t-butyylioksikarbonyyli-L-fenyylialaniini; (8) N-t-butyylioksikarbonyyli-L-f enyylialaniini ; (9) N-t-butyylioksikarbo-nyyli-L-asparagiini, £-nitrofenyyli-esteri; (10) NA-t-butyylioksi-karbonyyli-N£-o-klooribentsyylioksikarbonyyli-L-lysiimi; (11) N-t-butyylioksikarbonyyli-(S-£-metoksibentsyyli)-L-kysteiini; (12) N-t-butyylioksikarbonyyli-glysiini; ja (13) N-t-butyylioksikarbo-nyyli-D-valiini. Suojaryhmän poistamisen, neutraloinnin, liittämisen ja uudelleenliittämisen sekvenssi, jonka mukaan kukin aminohappo liitetään peptidiin, on seuraava: 1) kolme pesua (10 ml/g hartsia) kolmen minuutin ajan, jokainen suoritetaan kloroformilla; 2) BOC-ryhmän poistaminen käsittelemällä kahdesti 20 minuutin ajan, kummallakin kerralla käyttäen (10 ml/g hartsia) seosta, jossa on 29 % trifluorietikkahappoa, 48 % kloroformia, 6 % trietyy-lisilaania ja 17 % metyleenikloridia; 3) kaksi pesua (10 ml/g hartsia) kolmen minuutin ajan, kumpikin kloroformilla; 4) yksi pesu (10 ml/g hartsia) kolmcm minuutin ajan metyleenikloridi I1 a; 15 64575 5) kolme pesua (10 ml/g hartsia) kolmen minuutin ajan, käyttäen kussakin seosta, jossa on 90 % t-butyylialkoholia ja 10 % t-amyylialkoholia; 6) kolme pesua (10 ml/g hartsia) kolmen minuutin ajan, kukin metyleenikloridilla; 7) neutralointi kolmen käsittelyn avulla, kolmen minuutin ajan kukin ja käyttäen (10 ml/g hartsia) seosta, jossa 3 % trietyyliamiinia metyleenikloridissa; 8) kolme pesua (10 ml/g hartsia), kukin kolmen minuutin ajan, metyleenikloridilla; 9) Kolme pesua (10 ml/g hartsia), kukin kolmen minuutin ajan seoksella, jossa on 90 % t-butyylialkoholia ja 10 % t-amyylialkoholia; 10) kolme pesua (10 ml/g hartsia) kolmen minuutin ajan kukin metyleenikloridilla; 11) lisätään 1,0 mmoolia/g hartsia suojattua aminohappoa ja 1,0 mmoolia/g hartsia N ,N'-disykloheksyylikarbodi-imi-diä (DCC) 10 ml:ssa/g hartsia metyleeniklor.idia, jota seuraa sekoitus 120 minuutin ajan; 12) kolme pesua (10 ml/g hartsia), kukin kolmen minuutin ajan metyleenikloridilla; 13) kolme pesua (10 ml/g hartsia) kolmen minuutin ajan kukin seoksella, jossa on 90 % t-butyylialkoholia ja 10 % t-amyylialkoholia; 14) kolme pesua (10 ml/g hartsia) kolmen minuutin ajan kukin, metyleenikloridilla; 15) neutralointi kolmen käsittelyn avulla, kukin kolmen minuutin ajan käyttäen 10 ml/g hartsia 3-%:ista trietyyliamiinia metyleenikloridissa; 16) kolme pesua (10 ml/g hartsia) kolmen minuutin ajan, kukin metyleenikloridilla; 17) kolme pesua (10 ml/g hartsia) kolmen minuutin ajan, kukin seoksella, jossa on 90 % t-butyylialkoholia ja 10 % t-amyylialkoholia; 18) kolme pesua (10 ml/g hartsia) kolmen minuutin ajan, kukin metyleenikloridilla; 19) kolme pesua (10 ml/g hartsia) kolmen minuutin ajan, kukin DMF:lla; 20) lisätään 1,0 mmoolia/g hartsia suojattua aminohappoa ja 1,0 mmoolia/g hartsia n"n'-disykloheksyylikarbodi-imidiä (DCC) 10 ml:ssa/g hartsia seosta, jossa on 1:1 suhteessa DMF:a ja metyleenikloridia, mitä seuraa hämmentäminen 120 minuutin ajan; 21) kolme pesua (10 ml/g hartsia), kukin kolmen minuutin ajan DMF:11a; 22) kolme pesua (10 ml/g hartsia), kukin kolmen minuutin ajan metyleenikloridilla; 23) kolme pesua (10 ml/g hartsia), kukin kolmen minuutin ajan seoksella, jossa on 90 % t-butyylialkoholia ja 10 % t-amyylialkoholia; 24) kolme pesua (10 ml/g hartsia) kukin kolmen minuutin ajan metyleenikloridilla; 25) neutralointi kolmen käsittelyn avulla, kukin kolmen minuutin ajan käyttäen 10 ml/g hartsia seosta, jossa on 3 % ie 64575 trietyyliamiinia metyleenikloridissa; 26) kolme pesua (10 ml/g hartsia), kukin kolmen minuutin ajan metyleenikloridilla; 27) kolme pesua (10 ml/g hartsia), kukin kolmen minuutin ajan seoksella, jossa 90 % t-butyylialkoholia ja 10 % t-amyylialkoholia; ja 28) kolme pesua (10 ml/g hartsia), kukin kolmen minuutin ajan metyleenikloridilla .The product obtained in Example 1 (5.0 g) was placed in a Beckman reaction vessel 990, an automatic peptide synthesizer, and twelve of the remaining thirteen amino acids were added using an automatic synthesizer. The resulting protected tridecapeptide resin was divided into two similar portions and the final residue was placed in one of these portions. Amino acids were used according to the following sequence of use: (1) N-t-butyloxycarbonyl- (O-benzyl) -L-serine; (2) N-t-butyloxycarbonyl- (O-benzyl) -L-threonine; (3) N-t-butyloxycarbonyl-L-phenylalanine; (4) N-t-butyloxycarbonyl- (O-benzyl) -L-threonine; (5) N, N-t-butyloxycarbonyl-N, N-chlorobenzyloxycarbonyl-L-lysine; (6) N-t-butyloxycarbonyl-D-tryptophan; (7) N-t-butyloxycarbonyl-L-phenylalanine; (8) N-t-butyloxycarbonyl-L-phenylalanine; (9) N-t-butyloxycarbonyl-L-asparagine, E-nitrophenyl ester; (10) NA-t-butyloxycarbonyl-N, -o-chlorobenzyloxycarbonyl-L-lysime; (11) N-t-butyloxycarbonyl- (S-E-methoxybenzyl) -L-cysteine; (12) N-t-butyloxycarbonylglycine; and (13) N-t-butyloxycarbonyl-D-valine. The sequence of deprotection, neutralization, attachment, and reattachment, according to which each amino acid is attached to the peptide, is as follows: 1) three washes (10 ml / g of resin) for three minutes, each performed with chloroform; 2) Removal of the BOC group by treatment twice for 20 minutes, each time using (10 ml / g resin) a mixture of 29% trifluoroacetic acid, 48% chloroform, 6% triethylsilane and 17% methylene chloride; 3) two washes (10 ml / g resin) for three minutes, each with chloroform; 4) one wash (10 ml / g resin) for three cm minutes of methylene chloride I1a; 5) washings (10 ml / g resin) for three minutes, each using a mixture of 90% t-butyl alcohol and 10% t-amyl alcohol; 6) three washes (10 ml / g resin) for three minutes, each with methylene chloride; 7) neutralization by three treatments, for three minutes each and using (10 ml / g resin) a mixture of 3% triethylamine in methylene chloride; 8) three washes (10 ml / g resin), each for three minutes, with methylene chloride; 9) Three washes (10 ml / g resin), each for three minutes with a mixture of 90% t-butyl alcohol and 10% t-amyl alcohol; 10) three washes (10 ml / g resin) for three minutes each with methylene chloride; 11) 1.0 mmol / g of resin protected amino acid and 1.0 mmol / g of resin N, N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) in 10 ml / g of resin methylene chloride are added, followed by stirring for 120 minutes ; 12) three washes (10 ml / g resin), each for three minutes with methylene chloride; 13) three washes (10 ml / g resin) for three minutes each with a mixture of 90% t-butyl alcohol and 10% t-amyl alcohol; 14) three washes (10 ml / g resin) for three minutes each, with methylene chloride; 15) neutralization by three treatments, each for three minutes, using 10 ml / g of resin in 3% triethylamine in methylene chloride; 16) three washes (10 ml / g resin) for three minutes, each with methylene chloride; 17) three washes (10 ml / g resin) for three minutes, each with a mixture of 90% t-butyl alcohol and 10% t-amyl alcohol; 18) three washes (10 ml / g resin) for three minutes, each with methylene chloride; 19) three washes (10 ml / g resin) for three minutes, each with DMF; 20) 1.0 mmol / g of resin protected amino acid and 1.0 mmol / g of resin n "n'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) in 10 ml / g of resin are added in a 1: 1 mixture of DMF, and methylene chloride followed by stirring for 120 minutes, 21) three washes (10 ml / g resin), each for three minutes with DMF, 22) three washes (10 ml / g resin), each for three minutes with methylene chloride, 23) three washing (10 ml / g resin), each for three minutes with a mixture of 90% t-butyl alcohol and 10% t-amyl alcohol, 24) three washes (10 ml / g resin) for three minutes each with methylene chloride, 25) neutralization with three treatment, each for three minutes using 10 ml / g of resin in a mixture of 3% ie 64575 triethylamine in methylene chloride; 26) three washes (10 ml / g of resin), each for three minutes with methylene chloride; 27) three washes (10 ml / g of resin); g of resin), each for three minutes with a mixture of 90% t-butyl alcohol and 10% t-amyl alcohol, and 28) k we are washing (10 ml / g resin), each for three minutes with methylene chloride.

Yllä olevaa sekvenssikäsittelyä käytettiin lisättäessä jokainen aminohappo, paitsi glysiini- ja asparagiinijäännökset. Gly-siinin lisäys suoritettiin käyttäen vain vaiheita 1-18. Asparagii-nijäännös lisättiin sen aktiivisen £-nitrofenyyli-esterin kautta. Näin menetellen yllä oleva vaihe 11) muutettiin seuraavaksi 3-vai-hesekvenssiksi: a) kolme pesua (10 ml/g hartsia), kukin kolmen minuutin ajan DMF:lla; b) lisättiin 1,0 mmoolia/g hartsia N-t-butyy-lioksikarbonyyli-L-asparagiinin p-nitrofenyyliesteriä 10 ml:ssa/g hartsia seosta, jossa on 1:3 suhteessa DMF:a ja metyleenikloridia, mitä seurasi hämmentämistä 720 minuutin ajan; ja c) kolme pesua (10 ml/g hartsia), kukin kolmen minuutin ajan käyttäen DMF:a. Samoin edellä oleva vaihe 20) muutettiin siten, että käytettiin N-t-butyylioksikarbonyyli-L-asparagiinin £-nitrofenyyliesteriä seoksessa, jossa oli 3:1 suhteessa DMF:a ja metyleenikloridia, mitä seurasi hämmentämistä 720 minuutin ajan.The above sequence treatment was used to add every amino acid except glycine and asparagine residues. Glycine addition was performed using steps 1-18 only. The asparagine residue was added via its active ε-nitrophenyl ester. Thus, step 11) above was converted to the following 3-step sequence: a) three washes (10 ml / g resin), each for three minutes with DMF; b) 1.0 mmol / g of resin N-t-butyloxycarbonyl-L-asparagine p-nitrophenyl ester in 10 ml / g of resin was added in a 1: 3 mixture of DMF and methylene chloride, followed by stirring for 720 minutes; and c) three washes (10 ml / g resin), each for three minutes using DMF. Similarly, step 20) above was modified to use N-t-butyloxycarbonyl-L-asparagine E-nitrophenyl ester in a 3: 1 mixture of DMF and methylene chloride, followed by stirring for 720 minutes.

' . Valmis peptidi-hartsi kuivattiin vakuumissa. Tuote hydrolysoit iinxpystyjäähdyttäjän olosuhteissa 72 tunnin ajan seoksessa, jossa oli 1:1 suhteessa konsentroitua kloorivetyhappoa ja dioksaa-nia. Tuloksena olevan yhdisteen aminohappoanalyysi antoi seuraavat tulokset: Asn 1,00; 2 Thr 2,18; Ser 0,95; Gly 1,00; Vai 0,99; 3 Phe 3,45; 2 Lys 2,00.'. The finished peptide-resin was dried in vacuo. The product was hydrolyzed under vertical condenser conditions for 72 hours in a 1: 1 mixture of concentrated hydrochloric acid and dioxane. Amino acid analysis of the resulting compound gave the following results: Asn 1.00; 2 Thr 2.18; Ser 0.95; Gly 1.00; Or 0.99; 3 Phe 3.45; 2 Lys 2.00.

Esimerkki 3 D-valyyli-glysyyli-L-kysteinyyli-L-lysyyli-L-asparaginyyli-L-fenyylialanyyli-L-fenyylialanyyli-D-tryptofyyli-L-lysyyli-L-treonyyli-L-fenyylialanyyli-L-treonyyli-L-seryyli-L-kystei iniExample 3 D-Valyl-glycyl-L-cysteinyl-L-lysyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-L- seryl L-cysteine

Seokseen, jossa oli 7,2 ml anisolia ja 7,2 ml etyy.1 imerkap-taania, lisättiin 3,914 g (substituutiotaso 0,155 mmoolia/g) esimerkki 2:n suojattua tetradekapeptidihartsia. Seos jäähdytettiin nestemäisessä typessä ja 80 ml nestemäistä fluorivetyä lisättiin tislauksessa. Saadun seoksen annettiin lämmetä 0°C:seen ja sitä 17 64575 sekoitettiin kaksi tuntia. Fluorivety poistettiin sitten tislaamalla. Jäännökseen lisättiin eetteriä ja seos jäähdytettiin 0°C:seen.To a mixture of 7.2 ml of anisole and 7.2 ml of ethyl 1 imercaptan was added 3.914 g (substitution level 0.155 mmol / g) of the protected tetradecapeptide resin of Example 2. The mixture was cooled in liquid nitrogen, and 80 ml of liquid hydrogen fluoride was added by distillation. The resulting mixture was allowed to warm to 0 ° C and stirred for 17 hours. Hydrogen fluoride was then removed by distillation. Ether was added to the residue and the mixture was cooled to 0 ° C.

Saatu sakka otettiin talteen suodattamalla ja pestiin eetterillä.The resulting precipitate was collected by filtration and washed with ether.

Tuote kuivattiin ja suojaamaton tetradekapeptidi uutettiin hartsi-seoksesta käyttäen 1 M etikkahappoa ja 50 % etikkahappoa. Etikka-happoliuos luofilisoitiin sitten välittömästi kuiviin pimeässä.The product was dried and the unprotected tetradecapeptide was extracted from the resin mixture using 1 M acetic acid and 50% acetic acid. The acetic acid solution was then immediately lyophilized to dryness in the dark.

Saatu heikosti keltainen sakka suspendoitiin seokseen, jossa oli 10 ml 0,2 M etikkahappoa, josta oli poistettu kaasu, ja 4 ml jää- j etikkahappoa. Saatu suspensio kuumennettiin hieman 6 ml:n kanssa 50-%:ista etikkahappoa, kunnes syntyi kirkas, keltainen liuos ja tämä liuos pantiin Sephadex G-25 F pylvääseen. Kromatografiset olosuhteet olivat: liuotin, 0,2 M etikkahappoa, josta kaasu oli poistettu; pylvään koko 7,5 -150 cm; lämpötila 26°C; virtausnopeus 1 670 ml/h; fraktion volyymi 25,05 ml.The resulting pale yellow precipitate was suspended in a mixture of 10 ml of 0.2 M degassed acetic acid and 4 ml of glacial acetic acid. The resulting suspension was heated slightly with 6 mL of 50% acetic acid until a clear yellow solution formed and this solution was applied to a Sephadex G-25 F column. The chromatographic conditions were: solvent, 0.2 M degassed acetic acid; column size 7.5 -150 cm; temperature 26 ° C; flow rate 1,670 ml / h; fraction volume 25.05 ml.

Kunkin fraktion absorptio kohdassa 280 nm osoitti fraktio-numeroa kohti yhden leveän piikin, josta seurasi olka. US-spektro-skopia osoitti, että pääosa piikistä oli tuotetta. Fraktiot, jotka yhdistettiin ja niiden virtausvolyymit ovat seuraavat:The absorbance of each fraction at 280 nm showed one broad peak per fraction number, followed by a shoulder. U.S. spectroscopy showed that the majority of the peak was product. The fractions that were pooled and their flow rates are as follows:

Fraktiot 207-233 (5160-5837 ml, piikki = 5515 ml).Fractions 207-233 (5160-5837 ml, peak = 5515 ml).

Nämä yhdistetyt fraktiot eivät sisältäneet taustapuolen olkaa. UV-spektroskopia osoitti, että 470 mg tuotetta oli mukana, (saalis = 46,4 %). Ellman-titraus osoitti, että vapaiden sulfhvJ-ryylien määrä oli 95 % teoreettisesta.These combined fractions did not include the back of the shoulder. UV spectroscopy showed that 470 mg of product was present, (yield = 46.4%). Ellman titration showed that the amount of free sulfhvJ groups was 95% of theory.

Esimerkki 4 1 8Example 4 1 8

Hapetus D-Val , D-Trp -somatostatiiniksi 1 8Oxidation to D-Val, D-Trp-somatostatin 1 8

Pelkistetyn D-Val , D-Trp -somatostatiinin (677 ml) liuos esimerkistä 3 laimennettiin tislatulla vedellä konsentraatioon 50 pg/ml. Lisättiin konsentroitua ammoniumhydroksidia seoksen pH-ar-von säätämiseksi arvoon 6,7. Liuosta sekoitettiin 4°C:ssa pimeässä 64 tunnin ajan, minkä jälkeen Ellman-titraus osoitti, että hapettuminen oli tapahtunut täydelleen.A solution of reduced D-Val, D-Trp somatostatin (677 ml) from Example 3 was diluted with distilled water to a concentration of 50 pg / ml. Concentrated ammonium hydroxide was added to adjust the pH of the mixture to 6.7. The solution was stirred at 4 ° C in the dark for 64 hours, after which time Ellman titration indicated that the oxidation was complete.

Seos konsentroitiin vakuumissa 45 ml:n volyymiin, ja lisättiin 45 ml jääetikkahappoa. Sitten seos absorboitiin Sephadex G-25 F pylvääseen. Kromatografiset olosuhteet olivat seuraavat: liuotin 50-%:ista etikkahappoa, josta oli poistettu kaasu, pylvään koko 5,ϋ x 215 cm, lämpötila ?6°0, virtausnopeus 148 ml/h, fraktion vo iyyrn i 17,3 m] .The mixture was concentrated in vacuo to a volume of 45 mL, and 45 mL of glacial acetic acid was added. The mixture was then absorbed onto a Sephadex G-25 F column. The chromatographic conditions were as follows: solvent of 50% degassed acetic acid, column size 5, ϋ x 215 cm, temperature 66 ° 0, flow rate 148 ml / h, fraction volume 17.3 m].

18 64 57518 64 575

Absorptio kohdassa 280 mm kutakin fraktionumeroa kohti osoitti kaksi leveää piikkiä. Ensimmäinen piikki esitti yhdisteen agre-goituja muotoja ja toinen piikki esitti monomeeristä yhdistettä. Toisen piikin esittämä materiaali otettiin talteen /’fraktiot 116- 1 55 ( 2 000 - 2 685 ml)_7. UV-spektroskopia osoitti, että näytteessä oli 279 mg yhdistettä (saalis = 59,*+ %). Liuos lyofilisoitiin kuiviin pimeässä.Absorption at 280 mm for each fraction number showed two broad peaks. The first peak represented aggregated forms of the compound and the second peak represented a monomeric compound. The material from the second peak was recovered / fractions 116-155 (2,000-2,685 mL) _7. UV spectroscopy showed that the sample contained 279 mg of compound (yield = 59, * +%). The solution was lyophilized to dryness in the dark.

Tuloksena oleva valkea kiinteä aine kromatografioitiin uudelleen kahtena suunnilleen saman kokoisena osana. Ensimmäinen osa liuotettiin 25 ml:aan 50-%:ista etikkahappoa, josta oli poistettu kaasu ja se absorboitiin Sephadex G-25 F pylvääseen. Kromatografiset olosuhteet olivat: liuos 50-%:ista etikkahappoa, josta oli poistettu kaasu, pylvään koko 5,0 x 215 cm, lämpötila 26°C, virtausnopeus 148 ml/h, fraktion volyymi 17,3 ml.The resulting white solid was rechromatographed in two portions of approximately the same size. The first portion was dissolved in 25 mL of 50% degassed acetic acid and absorbed onto a Sephadex G-25 F column. The chromatographic conditions were: a solution of 50% degassed acetic acid, column size 5.0 x 215 cm, temperature 26 ° C, flow rate 148 ml / h, fraction volume 17.3 ml.

Absorptio kohdassa 280 nm kutakin fraktionumeroa kohti osoitti kaksi leveää piikkiä. Tehtiin konservatiivinen jako toisesta piikistä. Fraktiot 119-125 (virtausvolyymit 2 128 - 2 256 ml) yhdistettiin. UV-spektroskopia osoitti, että tässä näytteessä oli 65,3 mg yhdistettä. Liuos lyofilisoitiin kuiviin pimeässä, jotta saatiin haluttu yhdiste.Absorption at 280 nm for each fraction number showed two broad peaks. A conservative division was made from the second peak. Fractions 119-125 (flow volumes 2,128-2,256 ml) were combined. UV spectroscopy showed that this sample contained 65.3 mg of compound. The solution was lyophilized to dryness in the dark to give the desired compound.

Toinen osa kromatografioitiin samalla tavoin kuin ensimmäinen ja samoin tuloksin. Molemmat oikeat tuotteet yhdistettiin ja saatiin yhteensä 125 mg UV-spektroskopian mukaan (45,2 % saalis puhdasta tuotetta). Yhdistetty tuote liuotettiin 15 ml:aan 0,2 M etikkahappoa, josta oli poistettu kaasu, ja se pantiin Sephadex G-25 F pylvääseen. Kromatografiset olosuhteet olivat: liuotin 0,2 M etikkahappoa, josta kaasu poistettu, pylvään koko 5,0 x 150 cm, lämpötila 26°C, virtausnopeus 466 ml/h, fraktion volyymi 16,3 ml.The second portion was chromatographed in the same manner as the first and with the same results. The two correct products were combined to give a total of 125 mg by UV spectroscopy (45.2% yield of pure product). The combined product was dissolved in 15 ml of 0.2 M degassed acetic acid and applied to a Sephadex G-25 F column. The chromatographic conditions were: solvent 0.2 M degassed acetic acid, column size 5.0 x 150 cm, temperature 26 ° C, flow rate 466 ml / h, fraction volume 16.3 ml.

Absorptio kohdassa 280 nm kutakin fraktionumeroa kohti osoitti yhden leveän piikin. UV-spektroskopia osoitti, että suurin osa piikistä oli erinomaista tuotetta. Fraktiot 160-180 (2 592 - 2 934 ml, piikki = 2 685 ml) yhdistettiin ja lyofilisoitiin kuiviin pimeässä. UV-spektroskopia osoitti, että tuotetta oli 90,4 mg (71,7 % saalis).Absorption at 280 nm for each fraction number showed one broad peak. UV spectroscopy showed that most of the peak was an excellent product. Fractions 160-180 (2,592-2,934 ml, peak = 2,685 ml) were combined and lyophilized to dryness in the dark. UV spectroscopy showed that the product was 90.4 mg (71.7% yield).

Optinen kierto /öc7^6 - -56,1° (1-% : inen etikkahappo) .Optical rotation δ 6 6 - -56.1 ° (1% acetic acid).

Aminohappoanalyysi: Vai 1,0; Gly 0,97; 2 Cys 1,62; 2 Lys 2,00; Asn 1,01; 3 Phe 2,87; Trp 1,02; 2 Thr 1,83; Ser 0,81.Amino acid analysis: Val 1.0; Gly 0.97; 2 Cys 1.62; 2 Lys 2.00; Asn 1.01; 3 Phe 2.87; Trp 1.02; 2 Thr 1.83; Ser 0.81.

is 64 57 5is 64 57 5

Yllä olevat tulokset on ilmaistu suhteessa Lys/2 = 1,0.The above results are expressed as Lys / 2 = 1.0.

Kaikki arvot ovat keskiarvoja kahdesta 21 tunnin hydrolyysistä ilman huuhtelulaitteita (scavengers). Tryptofaani määrättiin UV-spektroskopian avulla (suhteessa Lys/2:een), seriinin arvoa ei korjattu hydrolyysin aikana tapahtuneista häviöistä.All values are averages of two 21-hour hydrolyses without scavengers. Tryptophan was determined by UV spectroscopy (relative to Lys / 2), serine value was not corrected for losses during hydrolysis.

Yllä oleva tuote sisältää pienempiä epäpuhtauksia. Mikäli halutaan, voidaan tuote puhdistaa edelleen panemalla se prepara- tiiviseen korkeapaine-nestekromatografia-laitteeseen (HPLC).The above product contains minor impurities. If desired, the product can be further purified by subjecting it to a preparative high pressure liquid chromatography (HPLC) apparatus.

1 81 8

Vaihtoehtoinen menetelmä pelkistetyn D-Val , D-Trp -soma- X 8 ' tostatiinin hapettamiseksi D-Val , D-Trp -somatostatiiniksi on kä- jAn alternative method for oxidizing reduced D-Val, D-Trp soma-X 8 'tostatin to D-Val, D-Trp somatostatin is

sittely kaliumferrisyanidin avulla. Hapetus suoritetaan vesiliuok- Jtreatment with potassium ferricyanide. The oxidation is carried out in aqueous solution

sessa, jonka pH on säädetty arvoon 6,7, kuten on edellä selostettu tässä esimerkissä. Kaliumferrisyanidin vesiliuos lisätään seokseen, jolloin saadaan lopullinen konsentraatio, joka edustaa suun-nilleen 3,3 kertaa pelkistetyn D-Val , D-Trp -somatostatiinin kon-sentraatiota. Liuosta sekoitetaan pimeässä huoneen lämmössä noin kahden tunnin ajan. Hapetuksen täydellisyys voidaan todeta Ellman- titrauksella.with a pH adjusted to 6.7 as described above in this example. An aqueous solution of potassium ferricyanide is added to the mixture to give a final concentration representing approximately 3.3 times the concentration of reduced D-Val, D-Trp somatostatin. The solution is stirred in the dark at room temperature for about two hours. The completeness of the oxidation can be determined by Ellman titration.

X 8 D-Val , D-Trp -somatostatiinia testattiin koiriin sen vatsa-hapon erittymistä in vivo ehkäisevän vaikutuksen suhteen. Kuudella koiralla, joilla oli krooninen fistula ja Heidenhainpussi, indusoi- ' tiin vatsaan HCl-eritystä infusoimalla gastriinin C-päätteistä tet-rapeptidiä 0,5 pg/kg/h. Kukin koira oli itsensä kontrollina. Kun HCl:a oli erittynyt jatkuvana vakiomääräisenä yhden tunnin ajan, infusoitiin D-Val , D-Trp -somatostatiinia yhden tunnin ajan 0,15 pg/kg/h. Vatsahapponäytteiden keräämistä jatkettiin vielä 1,5 tuntia 15 minuutin väliajoin. Näytteet titrattiin pH-arvoon 7 auto- X 8 maattisella titrauslaitteella. D-Val -D-Trp -somatostatiinin maksimaalinen ehkäisyvaikutus ekstrapoloitiin somatostatiinin annos-herkkyyskäyrän suhteen ja analogisen yhdisteen suhteellinen tehokkuus somatostatiinin tehokkuuteen nähden ilmoitetaan prosentuaalisena vaikutuksena.X 8 D-Val, D-Trp somatostatin was tested in dogs for its in vivo inhibitory effect on gastric acid secretion. Six dogs with chronic fistula and Heidenhainpussi induced gastric HCl secretion by infusing gastrin C-terminal tetrapeptide at 0.5 pg / kg / h. Each dog was under its own control. After continuous constant secretion of HCl for one hour, D-Val, D-Trp somatostatin was infused for one hour at 0.15 pg / kg / h. The collection of gastric acid samples was continued for another 1.5 hours at 15 minute intervals. The samples were titrated to pH 7 with an auto-X 8 automatic titrator. The maximal inhibitory effect of D-Val-D-Trp somatostatin was extrapolated from the somatostatin dose-response curve, and the relative efficacy of the analog compound relative to the efficacy of somatostatin is expressed as a percentage effect.

X 8 D-Val , D-Trp -somatostatiini ehkäisi vakiotilan happoeri-tystä, joka oli indusoitu gastriinin C-päätteisen tetrapeptidin avulla, noin 48,22 +_ 6,45 %:lla (standardi keskimääräinen virhe).X 8 D-Val, D-Trp somatostatin inhibited steady state acid secretion induced by gastrin C-terminal tetrapeptide by approximately 48.22 ± 6.45% (standard mean error).

Tämä vaikutus on ekvivalenttinen somatostatinnille 0,175 ^ig/kg/h.This effect is equivalent to 0.175 ug / kg / h of somatostatin.

Sen vaikutus on siis suhteessa somatostatiinin vaikutukseen J16 %.Thus, its effect is proportional to the effect of somatostatin J16%.

20 64575 1 8 Täydellisemmin puhdistettu näyte D-Val , D-Trp -somatostatiinia, jota annettiin 0,200, 0,156 ja 0,138 pg/kg/h annoksina esti jatkuvaa vakiotilan happoeristystä, joka oli indusoitu gastriinin C-päät-teisen tetrapeptidin avulla, 77,63, 71,57 ja 67,8 %. Tämä merkitsee somatostatiinin vaikutukseen nähden 302-325-%:ista vaikutusta.20 64575 1 8 A more fully purified sample of D-Val, D-Trp somatostatin administered at doses of 0.200, 0.156 and 0.138 pg / kg / h prevented continuous steady state acid isolation induced by gastrin C-terminal tetrapeptide, 77.63 , 71.57 and 67.8%. This represents an effect of 302-325% relative to the effect of somatostatin.

18 D-Val , D-Trp -somatostatiini testattiin myös sen suoliston liikeisiin vaikuttavan tehon suhteen tajuisaan olevilla koirilla. Testeissä käytettiin kolmea koiraa, joilla oli intralumenaaliset katetrit asetettuina antrumiin, duodenumiin ja pylorukseen. Paine-vaihtelut suolen lumenissa rekisteröitiin Visicorder-laitteella jännitysmittaimen avulla ja miniatyyrikokoa olevilla valonsäde-galvanometreillä. Kun oli suoritettu pysyvän olotilan tarkistus, infusoitiin testiyhdistettä intravenöösisesti 10 minuutin ajan. Aluksi testiyhdiste lisäsi intralumenaalipainetta pyloruksessa ja sen jälkeen pienensi sitä, kun taas paine duodenumissa ja antru-missa pysyivät alhaisina koko testin ajan. Minimi vaikuttava määrä, joka vaadittiin nostamaan pyloruksen painetta ja laskemaan duodenumin ja antrumin paineita, on noin 0,05 ng/kg - 10 min 18 r D-Val , D-Trp -somatostatiinille. Tämä vastaa itse somatostatiinin määrää 0,125 - 0,25 ug/kg - 10 min.18 D-Val, D-Trp somatostatin was also tested for its effect on intestinal motility in conscious dogs. Three dogs with intraluminal catheters placed in the antrum, duodenum, and pylorus were used in the experiments. Pressure fluctuations in the lumen of the gut were recorded Visicorder device jännitysmittaimen BY, and a miniature light beam galvanometers. After a steady state check, the test compound was infused intravenously for 10 minutes. Initially, the test compound increased intraluminal pressure in the pylorus and then decreased it, while the pressure in the duodenum and antrum remained low throughout the test. The minimum effective amount required to increase pylorus pressure and lower duodenal and antrum pressures is about 0.05 ng / kg to 10 min for 18 r D-Val, D-Trp somatostatin. This corresponds to the amount of somatostatin itself 0.125 to 0.25 ug / kg to 10 min.

1 8 D-Val , D-Trp -somatostatiinia testattiin myös sen vaikutuksen suhteen kasvuhormoonin eritykseen. Käytetty menetelmä toteutettiin tavallisten Spraque-Dawley koirasrottien avulla, jotka painoi-vat 100-120 g ( laboratory Supply Company, Indianapolis, Indiana). Testi on muunnos menetelmästä, jonka ovat selostaneet P.Brazeau, W. Wale ja R. Guillman, Endocrinology, 9_4 184 (1974). Tässä kokeessa käytettiin kaiken kaikkiaan viittä ryhmää, kahdeksan rottaa kussakin, testaamaan kutakin yhdistettä. Natriumpentobarbitalia annettiin intraperitoneaalisesti kaikille rotille stimuloimaan kasvuhormoonin eritystä. Yksi ryhmä toimi kontrollina ja sai vain suolaliuosta. Kaksi ryhmää sai somatostatiinia, toinen niistä 2 pg/rottaa kohti subkutaanisesti, ja toinen ryhmä SU ^g/rottaa kohti subkutaanisesti. Kaksi muuta ryhmää sai testiyhdistettä, toinen 10 ug/rottaa kohti subkutaanisesti ja toinen 0,4 pg/rottaa kohti subkutaanisesti. Kasvuhormoonin seerurnikonsentraat io mitattiin 20 min kuluttua sen jälkeen, kun oli annettu simultaanisesti natriumpentobarbitalia ja testiyhdistettä. Kasvuhormoonin seerumin konsentraation inhibitioaste määrätä iin kontrolliryhmään nähden ia Lestiyhdisteen ja testiyhdistettä. Kasvuhormoonin seerumin kon- 21 64575 sentraation inhibitioaste määrättiin kontrolliryhmään nähden ja testiyhdisteen ja itse somatostatiinin suhteellisia tehokkuuksia verrattiin keskenään.18 D-Val, D-Trp somatostatin was also tested for its effect on growth hormone secretion. The method used was performed with standard Spraque-Dawley male rats weighing 100-120 g (laboratory Supply Company, Indianapolis, Indiana). The test is a modification of the method described by P. Brazil, W. Wale and R. Guillman, Endocrinology, 9_4 184 (1974). A total of five groups, eight rats each, were used in this experiment to test each compound. Sodium pentobarbital was administered intraperitoneally to all rats to stimulate growth hormone secretion. One group served as a control and received saline only. Two groups received somatostatin, one 2 pg / rat subcutaneously, and the other group SU 2 g / rat subcutaneously. The other two groups received the test compound, one 10 ug / rat subcutaneously and the other 0.4 pg / rat subcutaneously. Serum growth hormone concentrations were measured 20 min after simultaneous administration of sodium pentobarbital and test compound. The degree of inhibition of serum growth hormone concentration relative to the control group and the Lesti Compound and test compound are determined. The degree of inhibition of serum growth hormone concentration was determined relative to the control group and the relative efficacy of the test compound and somatostatin itself was compared.

Annostasolla 0,4 hg/rotta ja 10 ug/rotta inhiboi D-Val1, 8 * D-Trp -somatostatiini kasvuhormoonin erityksen kasvua 14 %, ja 42 % yli kontrolliryhmän. Somatostatiini, annostasolla 2 ug/rotta, ei vaikuttanut lainkaan kasvuhormoonin erityksen kasvuun, kun taas annoksen ollessa 50 ug/rotta, se inhiboi kasvuhormoonin erityksen kasvua 56 % yli kontrollin.At a dose level of 0.4 hg / rat and 10 μg / rat, D-Val1,8 * D-Trp somatostatin inhibited the growth of growth hormone secretion by 14%, and 42% over the control group. Somatostatin, at a dose level of 2 μg / rat, had no effect on the increase in growth hormone secretion, whereas at a dose of 50 μg / rat, it inhibited the increase in growth hormone secretion by 56% over the control.

1 o '1 o '

Annostasolla 0,4 ug/rotta ja 10 jig/rotta D-Ala , D-Trp -somatostatiini inhiboi kasvuhormoonierityksen lisäystä 54 % ja 91 % yli kontrolliryhmän. Somatostatiini annostasolla 2 pg/rotta ja 50 pg/rotta inhiboi kasvuhormoonierityksen kasvua 40 % ja 87 % yli kontrolliryhmän.At a dose level of 0.4 μg / rat and 10 μg / rat D-Ala, D-Trp somatostatin inhibited the increase in growth hormone secretion by 54% and 91% over the control group. Somatostatin at the 2 pg / rat and 50 pg / rat dose levels inhibited the increase in growth hormone secretion by 40% and 87% over the control group.

Ί ÖΊ Ö

Testattiin D-Val , D-Trp -somatostatiinin teho inhiboida in vivo glukagonin ja insuliinin eritystä sen jälkeen, kun sitä oli stimuloitu L-alaniinilla. Normaalien, sekarotuisten, molempia sukupuolta olevien koirien, annettiin infusoida suolaliuosta, soma-tostatiinia tai testiyhdistettä. 30 minuutin kuluttua annettiin vielä L-alaniinia intravenöösisesti 15 minuutin ajan. Suolaliuoksen, somatostatiinin tai testiyhdisteen infuusiota jatkettiin 15 minuuttia sen jälkeen, kun oli annettu L-alaniini. L-alaniinin infuusio aiheutti äkillisen glukagonin ja insuliinin konsentraation nousun seerumissa, mikä palautui takaisin kontrollikonsentraatioon, kun L-alaniinin irifusoiminen oli päättynyt. Yllä olevasta määri- 1 8 teltiin minimiannos D-Val , D-Trp -somatostatiinille 0,04 - 0,11 ug/kg/min, joka inhiboi glukagonin eritystä, ja insuliinin eritystä inhiboivaksi annokseksi vähemmän kuin 0,004 ug/kg/min.The efficacy of D-Val, D-Trp somatostatin to inhibit glucagon and insulin secretion in vivo after stimulation with L-alanine was tested. Normal, mixed-breed dogs of both sexes were allowed to infuse saline, somatostatin, or test compound. After 30 minutes, additional L-alanine was administered intravenously for 15 minutes. The infusion of saline, somatostatin or test compound was continued 15 minutes after L-alanine administration. Infusion of L-alanine caused a sudden increase in serum glucagon and insulin concentrations, which returned to control concentrations when L-alanine irradiation was complete. From the above, a minimum dose of 0.04 to 0.11 μg / kg / min for D-Val, D-Trp somatostatin, which inhibits glucagon secretion, and an insulin secretion inhibiting dose of less than 0.004 μg / kg / min were determined.

Farmakologiset vertailukokeetPharmacological comparative tests

Vertailuna käytettiinsomatostatiinia. Esillä olevan keksin-X 8 nön mukaisella D-Val , D-Trp -somatostatiinilla oli somatostatii-niin verrattuna seuraavat aktiviteetit:Somatostatin was used as a control. The D-Val, D-Trp somatostatin of the present invention-X 8 had the following activities compared to somatostatin:

Vatsahapon eritys (koira, in vivo) 116 % ja enemmän puhdistetulla näytteellä 302-325 %. Suolen liikkuvuus (koira,in vivo) pienin tehokas annos 0,05 g/kg - 10 min verrattuna somatostatiinilla saatuun arvoon 0,125 - 0,25 ug/kg - 10 min. Kasvuhormoonien vapau hiin i ιητι (reittä) 0,4 pg/rottn - 14 %:n kasvuhormoonin erittymisen kasvu esto, 1() up/rot la = 47 %: n kanvuhormooni n kasvunGastric acid secretion (dog, in vivo) 116% and more with purified sample 302-325%. Intestinal motility (dogs, in vivo), the minimal effective dose of 0.05 g / kg - compared to the value obtained for 10 minutes with somatostatin 0.125 - 0.25 / kg - 10 min. Inhibition of growth hormone release i ιητι (thigh) 0.4 pg / rat - 14% growth hormone secretion growth inhibition, 1 () up / rot la = 47% growth of hormone hormone