FI63243B

FI63243B - SAETT ATT SEPARERA BLODETS HEMOGLOBIN TILL HEM OCH GLOBIN

Info

Publication number: FI63243B
Application number: FI820862A
Authority: FI
Inventors: Karin Autio; Martti Kiesvaara; Yrjoe Maelkki
Original assignee: Valtion Teknillinen
Priority date: 1982-03-12
Filing date: 1982-03-12
Publication date: 1983-01-31
Also published as: FI63243C

Description

6324363243

Tapa erottaa veren hemoglobiini heiniksi ja globiiniksi Sätt att separera blodets hemoglobin till hem ooh globin Tämä keksintö kohdistuu tapaan erottaa veren hemoglobiini hemiksi ja globiiniksi suspendoimalla verestä erotetut verisolut happamaan vesiliuokseen, jossa hemoglobiini hydrolysoituu hemiksi ja globiiniksi, saostamalla hemi ja erottamalla sakka globiinin vesiliuoksesta.This invention relates to a method of separating blood hemoglobin into heme and globin by suspending the blood cells separated from the blood in an acidic aqueous solution in which hemoglobin is hydrolyzed to heme and globin by precipitating the heme and globin by precipitating the heme and separating the heme.

Veri sisältää tunnetusti rautaa ja pääosa tästä raudasta esiintyy rautaprotoporfyriininä hemoglobiinissa. Kun plasma erotetaan verestä, jää verisolufraktioon noin 80 % koko veren sisältämistä proteiineista. Verisolufraktio sisältää noin 38 % raakaproteiinia, jonka kuiva-aineesta hemoglobiini muodostaa noin 80 % naudalla ja sialla noin 87 %. Hemoglobiini sisältää 6 % hemiä, joka edelleen sisältää noin 9 % rautaa ja loput 94 % on globiinia. Kiinnostus orgaaniseen hemi-rautaan on suuresti lisääntynyt, koska sen eräissä tutkimuksissa on todettu absorboituvan suolistossa paremmin kuin epäorgaanisten rautayhdisteiden. Lisäksi monilla epäorgaanisilla rautayhdisteillä on havaittu olevan haittavaikutuksia. Verisolufraktion voimakkaan värin, hajun ja maun sekä huonon säilyvyyden johdosta sen käyttö sellaisenaan rautalääk-keenä ei tule kysymykseen.Blood is known to contain iron and most of this iron is present as iron protoporphyrin in hemoglobin. When plasma is separated from the blood, about 80% of the proteins in the whole blood remain in the blood cell fraction. The blood cell fraction contains about 38% crude protein, of which about 80% is dry matter hemoglobin in cattle and about 87% in pigs. Hemoglobin contains 6% heme, which still contains about 9% iron and the remaining 94% is globin. Interest in organic hemi-iron has greatly increased as some studies have found it to be better absorbed in the gut than inorganic iron compounds. In addition, many inorganic iron compounds have been found to have side effects. Due to the strong color, odor and taste of the blood cell fraction and its poor shelf life, its use as an iron medicine is out of the question.

Laboratoriomittakaavassa on aikaisemmin hemi erotettu globii-nista kromatograafisesti tai uuttamalla, jolloin liuottimina on käytetty metyyli-etyyliketonia, asetonia ja dimetyyliform-amidia.On a laboratory scale, heme has previously been separated from globin by chromatography or extraction using methyl ethyl ketone, acetone and dimethylformamide as solvents.

Liuotinmenetelmien soveltaminen teknillisessä mittakaavassa aiheuttaa huomattavan korkeat liuotin- ja sen regeneroin-tikustannukset.The application of solvent methods on a technical scale results in remarkably high solvent and regeneration costs.

Lisäksi käytettävät liuottimet ovat hyvin tulenarkoja ja liuotinjäämien poistaminen lopputuotteista on osoittautunut hankalaksi, mikäli lopputuotteita käytetään rehuna, ravintoaineina tai lääkeaineina.In addition, the solvents used are highly flammable and the removal of solvent residues from the final products has proved difficult if the final products are used as feed, nutrients or drugs.

6324363243

Ruotsalaisesta kuulutusjulkaisusta 7 407 882-5 tunnetaan menetelmä hemin erottamiseksi globiinista, jossa hapanta hemo-globiiniliuosta jäähdytetään ja siihen lisätään suuri määrä etanolia kahdessa vaiheessa globiinin saostamiseksi ja erottamiseksi sentrifugoimalla. Tämänkin menetelmän epäkohtana on se, että joudutaan käyttämään suuria määriä liuotinta, joka lopuksi on poistettava lopputuotteista. Lisäksi työskentely on suoritettava matalissa lämpötiloissa, joka aiheuttaa huomattavat lisäkustannukset.Swedish Offenlegungsschrift 7 407 882-5 discloses a method for separating heme from globin, in which an acidic hemoglobin solution is cooled and a large amount of ethanol is added in two steps to precipitate and separate the globin by centrifugation. The disadvantage of this method is that large amounts of solvent have to be used, which must eventually be removed from the final products. In addition, work must be performed at low temperatures, which incurs significant additional costs.

Ennestään on myös tunnettua erottaa veren globiini heinistä kromatograafisesti karboksimetyyliselluloosan avulla. Tässä menetelmässä hemolysoitu ja happohydrolysoitu verisolufrak-tio johdetaan karboksimetyyliselluloosalla täytetyn ionin-vaihtokolonnin lävitse, jolloin hemi adsorboituu karboksime-tyyliselluloosaan. Tällä menetelmällä saadaan kuitenkin niin pieniä määriä hemiä erotetuksi globiinista käytettyyn karb-oksimetyyliselluloosamäärään nähden, että tämä menetelmä ei sovellu tekniseen tuotantomittakaavaan.It is also known to separate blood globin from hay by chromatography with carboxymethylcellulose. In this method, the hemolyzed and acid hydrolyzed blood cell fraction is passed through an ion exchange column packed with carboxymethylcellulose, whereby the heme is adsorbed on the carboxymethylcellulose. However, this method separates such small amounts of heme from globin relative to the amount of carboxymethylcellulose used that this method is not suitable for a technical production scale.

Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on aikaansaada tapa erottaa veren hemoglobiini hemiksi ja globiiniksi, jossa edellä mainitut epäkohdat on eliminoitu ja jossa lopputuotteena saadaan hemiä sisältävä tuote, joka sellaisenaan soveltuu käytettäväksi raaka-aineena rautalääkkeen valmistuksessa, sekä globiiniproteiinia, jota voidaan käyttää ravintoaineen tai rehun aineosana ilman liuottimista aiheutuvia haittoja.The object of the present invention is to provide a method for separating blood hemoglobin into heme and globin, in which the above-mentioned disadvantages are eliminated and in which the end product is a heme-containing product suitable for use as a raw material in the manufacture of iron and a globin protein which can be used as a nutrient or feed ingredient without solvents. disadvantages.

Keksinnön pääasialliset tunnusmerkit ilmenevät oheisesta patenttivaatimuksesta 1.The main features of the invention appear from the appended claim 1.

Keksinnön mukaan plasmasta erotettu verisolufraktio hemoly-soidaan laimentamalla se vedellä ja happohydrolysoidaan säätämällä sen pH-arvo alle 3:n globiinin ja hemin välisten sidosten katkaisemiseksi. Sen jälkeen hemi saostetaan happamasta vesiliuoksesta lisäämällä siihen karboksimetyyliselluloosan (CMC) vesiliuosta ja edullisesti niin, että painosuhde 63243 CMC/globiini on vähintään 1:10, edullisesti kuitenkin korkeintaan 2:10. Hemin sisältämä rauta muodostaa tällöin todennäköisesti koordinaatiosidoksen CMC:n karboksyyliryhmien kanssa, jotka keksinnössä käytetyllä pH-alueella ovat täysin protonoituneet. Saostunut hemi-CMC-kompleksi erotetaan lopuksi globiiniproteiiniliuoksesta esimerkiksi sentrifugoi-malla.According to the invention, the blood cell fraction separated from the plasma is hemolyzed by diluting it with water and acid hydrolyzed by adjusting its pH to less than 3 to break the bonds between globin and heme. The heme is then precipitated from the acidic aqueous solution by adding an aqueous solution of carboxymethylcellulose (CMC) and preferably so that the weight ratio 63243 CMC / globin is at least 1:10, but preferably not more than 2:10. The iron contained in the heme is then likely to form a coordination bond with the carboxyl groups of the CMC, which are fully protonated in the pH range used in the invention. The precipitated hemi-CMC complex is finally separated from the globin protein solution, for example by centrifugation.

Keksintöä selostetaan alla lähemmin esimerkkien avulla. Esimerkki 1The invention is described in more detail below by means of examples. Example 1

Plasmasta erotettu hemoglobiinia sisältävä verisolufraktio laimennetaan vesimäärällä, jonka paino on vähintään kaksinkertainen verisolufraktion painoon nähden ja saadun liuoksen pH säädetään niin alhaiseksi lisäämällä 0,1 M HClrää, että kun tähän liuokseen lisätään CMC-vesiliuosta, vesiliuoksen pH jää alle 3:n. Karboksimetyyliselluloosan vesiliuosta lisätään niin paljon, että karboksimetyyliselluloosan ja glo-biiniproteiinin painosuhde vesiliuoksessa on noin 1:10. Muodostunut sakka erotetaan liuoksesta sentrifugoimalla (8000 g, 15 min). Sakka sisältää 1,8 % rautaa ja vaalea liuos enintään 0,07 % rautaa kuiva-aineen painosta laskettuna.The hemoglobin-containing blood cell fraction separated from the plasma is diluted with an amount of water at least twice the weight of the blood cell fraction and the pH of the resulting solution is adjusted so low by adding 0.1 M HCl that the pH of the aqueous solution remains below 3. The aqueous carboxymethylcellulose solution is added so much that the weight ratio of carboxymethylcellulose to globin protein in the aqueous solution is about 1:10. The precipitate formed is separated from the solution by centrifugation (8000 g, 15 min). The precipitate contains 1.8% iron and the light solution contains not more than 0.07% iron by weight of dry matter.

Esimerkki 2Example 2

Veriplasmasta erotetut hemoglobiinia sisältävät verisolut lietetään veteen (painosuhde 1:2). Liuoksen pH säädetään 1 M HCl:llä arvoon 1,5 ja happamaan vesiliuokseen lisätään viisinkertainen tilavuus 0,3 %;sta karboksimetyyliselluloosan vesiliuosta, jolloin CMC:n ja globiiniproteiinin painosuhde vesiliuoksessa on 2:10. Seoksen annetaan seistä 15 min ja erotetaan saostunut hemi-CMC-kompleksi globiiniproteiiniliuoksesta sentrifugoimalla 1/2 h (8000 g). Proteiinifraktio sisältää noin 70 % alkuperäisistä globiiniproteiineista ja sen kuiva-aineista alle 0,05 paino-% on rautaa.Hemoglobin-containing blood cells isolated from plasma are slurried in water (1: 2 weight ratio). The pH of the solution is adjusted to 1.5 with 1 M HCl and five times the volume of 0.3% aqueous carboxymethylcellulose is added to the acidic aqueous solution, the weight ratio of CMC to globin protein in the aqueous solution being 2:10. The mixture is allowed to stand for 15 min and the precipitated hemi-CMC complex is separated from the globin protein solution by centrifugation for 1/2 h (8000 g). The protein fraction contains about 70% of the original globin proteins and less than 0.05% by weight of its dry matter is iron.

Esimerkki 3Example 3

Plasmasta erotetut verisolut laimennetaan vedellä (painosuhde 4 63243 1:3). Liuoksen pH säädetään 1 M HCl:llä. l,5:ksi ja lisä" tään 4 x liuoksen tilavuus 0,3 %:sta karboksimetyylisel-luloosan vesiliuosta, jolloin CMC;n ja globiiniproteiinin painosuhde on 1,9:10. Seoksen annetaan seistä 15 min ja erotetaan saostunut hemi-CMC-kompleksi globiiniproteiiniliuok-sesta sentrifugoimalla 1/2 h (8000 g). Proteiinifraktio sisältää noin 70 paino-% alkuperäisistä globiiniproteiineista ja sen kuiva-aineista alle 0,06 paino-% on rautaa.Blood cells separated from plasma are diluted with water (weight ratio 4 63243 1: 3). The pH of the solution is adjusted with 1 M HCl. to 1.5 and add 4 x volume of a 0.3% aqueous solution of carboxymethylcellulose to give a weight ratio of CMC to globin protein of 1.9:10. The mixture is allowed to stand for 15 minutes and the precipitated hemi-CMC is separated. complex from the globin protein solution by centrifugation for 1/2 h (8000 g) The protein fraction contains about 70% by weight of the original globin proteins and less than 0.06% by weight of its dry matter is iron.

Esimerkki 4Example 4

Plasmasta erotetut verisolut laimennetaan vedellä (painosuhde 1:4), Liuoksen pH säädetään 1 M suolahapon vesiliuoksella arvoon 1,5 ja lisätään kolminkertainen tilavuus 0,35 %:sta CMC-vesiliuosta, jolloin CMC;n ja globiinin painosuhde on vesiliuoksessa 1,7; 10. Seoksen annetaan seistä 15 min ja erotetaan saostunut hemi-CMC-kompleksi proteiiniliuokses-ta sentrifugoimalla 1/2 h (8000 g). Globiiniproteiinifrak-tio sisältää noin 80 % alkuperäisistä proteiineista ja sen kuiva-aineista ainoastaan noin Q,07 paino-% on rautaa.Plasma-separated blood cells are diluted with water (1: 4 weight ratio), the pH of the solution is adjusted to 1.5 with 1 M aqueous hydrochloric acid, and three volumes of 0.35% aqueous CMC are added to give a weight ratio of CMC to globin of 1.7; 10. Allow the mixture to stand for 15 min and separate the precipitated hemi-CMC complex from the protein solution by centrifugation for 1/2 h (8000 g). The globin protein fraction contains about 80% of the original proteins and only about 0.07% by weight of its dry matter is iron.

Claims

5 63243

A method of separating blood hemoglobin into heme and globin by suspending the blood cells separated from the blood in an acidic aqueous solution, precipitating the heme and separating the precipitate from the aqueous solution of globin, characterized in that carboxymethylcellulose is added to the acidic aqueous solution to precipitate the hemi-CMC complex.

Process according to Claim 1, characterized in that such an aqueous solution of carboxymethylcellulose is added to the acidic aqueous solution that the weight ratio CMC / globin is at least 1:10, but preferably not more than 2:10.

Process according to Claim 1 or 2, characterized in that the pH of the acidic aqueous solution is maintained at a value of at most about 3 during the precipitation of the heme.