FI121926B - Use of human cells - Google Patents
Use of human cells Download PDFInfo
- Publication number
- FI121926B FI121926B FI20095792A FI20095792A FI121926B FI 121926 B FI121926 B FI 121926B FI 20095792 A FI20095792 A FI 20095792A FI 20095792 A FI20095792 A FI 20095792A FI 121926 B FI121926 B FI 121926B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- human cell
- cells
- growth
- probiotic
- bacteria
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
- C12Q1/06—Quantitative determination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Ihmissolujen käyttöUse of human cells
Keksinnön alaField of the Invention
Esillä oleva keksintö liittyy menetelmään probioottisten bakteerikantojen seulomiseksi. Keksintö liittyy myös menetelmään probioottisen viljelmän 5 tai viljelmäerän laadun määrittämiseksi. Lisäksi esillä oleva keksintö liittyy ihmissolujen käyttöön probioottisia kantoja seulottaessa. Esillä oleva keksintö liittyy myös ihmissolujen käyttöön määritettäessä probioottisen viljelmän tai viljelmäerän laatua.The present invention relates to a method for screening probiotic bacterial strains. The invention also relates to a method for determining the quality of a probiotic culture 5 or a lot of culture. Furthermore, the present invention relates to the use of human cells in screening probiotic strains. The present invention also relates to the use of human cells in determining the quality of a probiotic culture or batch of culture.
Keksinnön tausta 10 Määritelmän mukaan probiootit ovat ’’eläviä mikro-organismeja, jot ka sopivasti annettuina saavat aikaan terveysvaikutuksen isännässä” (FAO/WHO 2002). Nykyisin useimmat probioottiset kannat, jotka on tarkoitettu ihmiskäyttöön kuuluvat Lactobacillus tai Bifidobacterium sukuihin. Probioottisten tuotteiden käyttö erilaisissa suolistosairauksissa ja -häiriöissä on jatkuvasti 15 lisääntymässä ja alan kilpailu kannustaa eristämän uusia, tehokkaita probioottisia kantoja. Selvästi on olemassa tarve saada aikaan luotettavampia menetelmiä lupaavimpien kantojen tunnistamiseksi niin varhain kuin mahdollista. Probiootiksi luokitellulla bakteerikannalla on oltava hyödyllisiä vaikutuksia suoliston terveyteen, mutta varsinaisten vaikuttajaominaisuuksien lisäksi on useita 20 muitakin tekijöitä, jotka ovat ratkaisevan tärkeitä kannan hyödyntämiselle. Useiden turvallisuus- ja toimintakriteereiden lisäksi on tärkeää, että kannat pystyvät elämään suolistossa. Nykyisin sappinesteen ja happamien olosuhteiden kesto ovat ominaisuuksia, joita tutkitaan seulottaessa probioottisia kantoja (Bezkorovainy A. (2001) Am J Clin Nutr. 73, 399S-405S; Delgado et ai. (2007) ^ 25 J Food Sei. 72:M310-5). Patogeenisiä bakteereita estävien antimikrobiaalisten ^ aineiden tuotanto on myös probioottiselle kannalle toivottava metabolinen ak- o tiivisuus. Edelleen eräs probioottisten kantojen seulontaan yleisesti käytetty § menetelmä on adheesio suoliston epiteelisoluihin, koska sen uskotaan olevan g mahdollisesti ratkaisevan tärkeä kolonisaatioon vaadittava tekijä. ValitettavastiBACKGROUND OF THE INVENTION By definition, probiotics are '' living microorganisms that, when properly administered, produce a health effect in the host '(FAO / WHO 2002). Today, most probiotic strains are intended for the human Lactobacillus or Bifidobacterium genera. The use of probiotic products in various intestinal diseases and disorders is steadily increasing and competition in the field is encouraging the isolation of new, effective probiotic strains. Clearly, there is a need to provide more reliable methods to identify the most promising strains as early as possible. A bacterial strain classified as a probiotic must have beneficial effects on intestinal health, but in addition to its actual potency, there are several other factors that are crucial to its utilization. In addition to a number of safety and performance criteria, it is important that strains are able to live in the gut. Currently, the duration of bile fluid and acidic conditions are properties that are being studied in screening for probiotic strains (Bezkorovainy A. (2001) Am J Clin Nutr. 73, 399S-405S; Delgado et al. (2007) ^ 25 J Food Sci. ). The production of antimicrobial agents which inhibit pathogenic bacteria is also a desirable metabolic activity for the probiotic strain. Furthermore, one of the commonly used methods for screening probiotic strains is adhesion to intestinal epithelial cells, as it is believed to be a potentially critical factor for colonization. Unfortunately
CLCL
30 nykyiset testit eivät ole tyydyttäviä: esimerkiksi testiolosuhteilla on selvä vaikuni tus in vitro toimintakokeiden tuloksiin ja adheesiokokeet ovat antaneet vaihte in g leviä tuloksia in vitro -mallien välillä ja laboratorioiden välillä (Jacobsen et ai.Current tests are unsatisfactory: for example, test conditions have a clear influence on the results of in vitro activity tests and adhesion tests have provided a shift in g between in vitro models and between laboratories (Jacobsen et al.
° (1999) Appi Environ Microbiol 65:4949-4956; Tuomola et ai. (2001) Am J Clin° (1999) Appl. Environ Microbiol 65: 4949-4956; Tuomola et al. (2001) Am J Clin
Nutr 73:393S-398S). Vaikka adheesiota epiteelisoluihin tai limakalvoon pide-35 tään eräänä peruskriteerinä probioottivalinnalle, nykyisin kaupallisissa valmis- 2 teissä käytettyjen probioottisten kantojen adheesiokyvyt vaihtelevat suuresti (Jacobsen et ai. 1999). Lisäksi interventiokokeet ihmisillä (Jacobsen et ai. 1999) ja hiirillä (Ibznou-Zekri et ai. (2003) Infect Immun. 71: 428-436) ovat osoittaneet, että adheesio-ominaisuus ei ennustanut probioottisen kannan in 5 vivo kolonisaatiokykyä. Vain hyvin harvat probioottisista kannoista, jotka on valittu nykyisten valintakriteereiden perusteella, ovat osoittautuneet kykeneviksi kolonisoimaan suoliston merkittävän pituiseksi ajaksi (Dunne et ai. (2001) Am J Clin Nutr. 73. 386S-392S). Vaikka halutut probioottiset ominaisuudet on määritelty (FAO/WHO, 2002), mitään standardikriteereitä (kuten eri kriteerei-10 den raja-arvoja) tai -testejä ei ole olemassa toiminnan määrityksiä varten. Tyypillisesti potentiaalisten probioottisten kantojen valinta perustuu suhteellisesti parhaiden kantojen valintaan lajinsisäisestä vertailusta. Uusien probioottisten kantojen valinnan lisäksi tarvitaan in vitro toimintakokeita probioottisten viljelmien tai tuote-erien laadunvaihtelun arvioimiseksi. On esimerkiksi raportoi-15 tu suurista eroista saman kannan tuotantoerien kiinnittymis- ja kolonisaatio-ominaisuuksien välillä (Tuomola et ai. 2001). Muita tilanteita, joissa laatunäkö-kohtia testataan, ovat pitkät säilytysjaksot tai muutokset tuotantoprosessissa, joitakin esimerkkejä mainitaksemme. Kasvuominaisuuksia suolen varsinaisten kohdesolujen suhteen ei ole ratkaistu. Lisäksi probioottien annosvaste on huo-20 nosti tunnettu. Tarvitaan uusia, suoraviivaisia in vitro menetelmiä probioottisten kantojen seulomiseksi, koska nykyisin käytössä olevat menetelmät eivät vielä riittävästi ennusta kantojen selviämistä ja tehoa suolistossa.Nutr 73: 393S-398S). Although adhesion to epithelial cells or mucosa is considered one of the basic criteria for probiotic selection, the adhesion abilities of the probiotic strains currently used in commercial preparations vary greatly (Jacobsen et al. 1999). In addition, intervention studies in humans (Jacobsen et al. 1999) and mice (Ibznou-Zekri et al. (2003) Infect Immun. 71: 428-436) have shown that the adhesion property did not predict the in vivo colonization capacity of the probiotic strain. Very few probiotic strains selected on the basis of current selection criteria have been shown to be able to colonize the intestine for a significant length of time (Dunne et al. (2001) Am J Clin Nutr. 73. 386S-392S). Although the desired probiotic properties have been defined (FAO / WHO, 2002), there are no standard criteria (such as thresholds for different criteria) or tests for functional determination. Typically, the selection of potential probiotic strains is based on the selection of relatively best strains from within-species comparisons. In addition to the selection of new probiotic strains, in vitro functional assays are required to assess the quality variation of probiotic cultures or batches of products. For example, large differences have been reported between the attachment and colonization properties of batch production of the same strain (Tuomola et al. 2001). Other situations where quality aspects are tested are long storage periods or changes in the production process, to name a few. Growth Features of the intestine with respect to the actual target cells has not been resolved. In addition, the dose response of probiotics is poorly known. New, straightforward in vitro methods for screening probiotic strains are needed because current methods are not yet sufficiently predictive of strain survival and efficacy.
Keksinnön lyhyt selostusBrief Description of the Invention
Esillä olevan keksinnön tavoitteena on saada aikaan menetelmä 25 probioottisten bakteerikantojen seulomiseksi ja/tai eristämiseksi. Esillä olevan 5 keksinnön eräänä toisena tavoitteena on saada aikaan menetelmä haluttuun ^ vaikutukseen tarvittavan probioottiannoksen arvioimiseksi. Esillä olevan kek- 9 sinnön vielä eräänä tavoitteena on saada aikaan menetelmä probioottisen vil- o jelmän tai viljelmäerän laadun määrittämiseksi. Esillä olevan keksinnön eräänä £ 30 lisätavoitteena on saada aikaan menetelmä bakteerikannan kasvun seulomi-It is an object of the present invention to provide a method for screening and / or isolating probiotic bacterial strains. It is another object of the present invention to provide a method for estimating the dose of probiotic required for a desired effect. Another object of the present invention is to provide a method for determining the quality of a probiotic culture or a lot of culture. It is a further object of the present invention to provide a method for screening for bacterial strain growth.
CLCL
^ seksi sairastuneesta yksilöstä peräisin olevilla ihmissoluilla ja/tai niiden läsnä ^ ollessa ja saman kannan kasvattaminen sairastumattomasta yksilöstä peräisin o olevilla ihmissoluilla ja/tai niiden läsnä ollessa. Lisäksi esillä olevan keksinnön o ^ eräänä tavoitteena on ihmissolun käyttö probioottisen kannan seulomiseksi 35 ja/tai eristämiseksi. Esillä olevan keksinnön vielä eräänä tavoitteena on ihmis-solujen käyttö haluttuun vaikutukseen tarvittavan probioottiannoksen arvioimi- 3 seksi. Edelleen esillä olevan keksinnön eräänä tavoitteena on ihmissolujen käyttö probioottisen viljelmän tai viljelmäerän laadun määrittämiseksi. Esillä olevan keksinnön eräänä lisätavoitteena on saada aikaan ihmissolun käyttö vaihtelun löytämiseksi sairastuneesta yksilöstä peräisin olevalla ihmissolulla 5 ja/tai sen läsnä ollessa tapahtuvan bakteerikannan kasvun ja kyseistä tautia sairastamattomasta yksilöstä peräisin olevalla ihmissolulla ja/tai sen läsnä ollessa tapahtuvan saman bakteerikannan kasvun välillä.sex in and / or in the presence of human cells from a diseased individual and culturing the same strain in and in the presence of human cells from an unhealthy individual. It is a further object of the present invention to use a human cell for screening and / or isolating a probiotic strain. It is another object of the present invention to use human cells to estimate the dose of probiotic required for the desired effect. It is a further object of the present invention to use human cells to determine the quality of a probiotic culture or batch of culture. It is a further object of the present invention to provide the use of a human cell to detect variation in bacterial strain growth in and / or in the presence of a human cell from a diseased individual and in the same bacterial strain in a non-diseased individual.
Keksintö perustuu sille havainnolle, että tiettyjen probioottisten ja/tai suolistoperäisten bakteerikantojen kasvu lisääntyy ihmisen suolen epiteelisolu-10 jen tai fibroplastien läsnä ollessa, kun taas muut kannat säilyvät vain elossa ilman merkittävää kasvua ja jotkut jopa kuolevat. Näin ollen tällä keksinnöllä saadaan aikaan uusi ja tehokas keino potentiaalisesti probioottisten kantojen seulomiseksi ja probioottisten viljelmien tai viljelmäerien laadun määrittämiseksi.The invention is based on the realization that the growth of certain probiotic and / or intestinal bacterial population increased in human intestinal epithelial cell-10 in the presence of fibroblasts or the catalyst, while the other strains are maintained only alive, without significant growth, and some even die. Thus, the present invention provides a novel and effective means of screening for probiotic strains and determining the quality of probiotic cultures or batches of cultures.
15 Keksinnön tavoitteet saavutetaan itsenäisissä patenttivaatimuksissa esitetyillä menetelmi/ällä ja käytöllä. Keksinnön edulliset suoritusmuodot ovat epäitsenäisten patenttivaatimusten kohteina.The objects of the invention are achieved by the method and use disclosed in the independent claims. Preferred embodiments of the invention are claimed in the dependent claims.
Esillä olevan keksinnön muut tavoitteet, yksityiskohdat ja edut käyvät ilmi seuraavista piirustuksista, yksityiskohtaisesta selostuksesta ja esimer-20 keistä.Other objects, details and advantages of the present invention will be apparent from the following drawings, the detailed description and examples.
Piirustusten lyhyt selostusBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
Kuvio 1 esittää L. rhamnosus GG (E-96666) bakteerin kasvua HT-29 epiteelisoluilla ja pelkässä soluviljelymediumissa. Bakteerit siirrostettiin näyte-kuoppiin ja elävien solujen lukumäärä määriteltiin 18 tunnin inkubaation jäl-25 keen. Esitetyt tulokset ovat kahdesta erillisestä kokeesta peräisin olevan neljän ^ näytteen keskiarvoja.Figure 1 shows growth of L. rhamnosus GG (E-96666) on HT-29 epithelial cells and in cell culture medium alone. Bacteria were inoculated into sample wells and the number of live cells was determined after 18 hours of incubation. The results shown are the average of four samples from two separate experiments.
^ Kuvio 2 esittää Lactobacillus spp. kantojen kasvua HT-29 epitee- 9 lisolujen läsnä ollessa. Tulokset on esitetty bakteerien määränä HT-29 soluja o sisältävistä näytekuopista verrattuna bakteerien määrään pelkkää elatusainetta | 30 sisältävistä näytekuopista (kaksoisnäytteiden keskiarvoja).Figure 2 shows Lactobacillus spp. strains in the presence of HT-29 epithelial cells. Results are expressed as bacterial count from sample wells containing HT-29 cells o compared to bacterial count alone medium | 30 wells (duplicate means).
^ Kuvio 3 esittää L. rhamnosus GG (E-96666), L. acidophilus VTT E- g 96276T (=DSM 20079) ja L. casei VTT E-96710NT (=LMG 17314) bakteerien o kasvua Caco-2 paksusuolen epiteelisoluilla ja pelkässä soluviljelymediumissa.^ Figure 3 shows the L. rhamnosus GG (E-96 666), L. acidophilus VTT E-96276T g (= DSM 20079) and L. casei strain VTT E-96710NT (= LMG 17314) No growth of bacteria to Caco-2 colon epithelial cells and in the pure cell culture medium.
o w Bakteerit siirrostettiin näytekuoppiin ja elinkykyiset määrät määriteltiin 18 tun- 35 nin inkubaation jälkeen. Tulokset esittävät kolminkertaisten näytteiden keskiarvoja.The bacteria were inoculated into sample wells and viable counts were determined after 18 hours of incubation. The results represent the means of triplicate samples.
44
Kuvio 4 esittää L. rhamnosus GG (E-96666), L. acidophilus VTT E-96276T (=DSM 20079) ja L casei VTT E-96710NT (=LMG 17314) bakteerien kasvua HuTu80 pienillä epiteelisoluilla ja pelkässä soluviljelymediumissa. Bakteerit siirrostettiin näytekuoppiin ja elävien solujen lukumäärä määriteltiin 18 5 tunnin inkubaation jälkeen. Tulokset esittävät kolminkertaisten näytteiden keskiarvoja.Figure 4 shows bacterial growth of L. rhamnosus GG (E-96666), L. acidophilus VTT E-96276T (= DSM 20079) and L casei VTT E-96710NT (= LMG 17314) in HuTu80 small epithelial cells and in cell culture medium alone. Bacteria were inoculated into sample wells and the number of viable cells determined after 18 incubation for 5 hours. The results represent the means of triplicate samples.
Kuvio 5 esittää L rhamnosus GG (E-96666) bakteerin kasvua HGF-1 ikenen fibroblastisoluilla ja pelkässä soluviljelymediumissa. Bakteerit siirrostettiin näytekuoppiin ja elävien solujen lukumäärä määriteltiin 18 tunnin inku-10 baation jälkeen. Tulokset esittävät kolminkertaisten näytteiden keskiarvoja.Figure 5 shows growth of L rhamnosus GG (E-96666) on HGF-1 gingival fibroblast cells and in cell culture medium alone. Bacteria were inoculated into sample wells and the number of viable cells was determined after 18 hours of incubation. The results represent the means of triplicate samples.
Kuvio 6 esittää L. rhamnosus LGG (VTT E-96666) ja L casei VTT E-96710nt bakteerien kasvua HT-29 soluilla, HT-29 soluilla käsitellyssä ela-tusaineessa ja pelkässä soluviljelymediumissa. Bakteerit siirrostettiin näyte-kuoppiin ja elinkykyiset määrät määriteltiin 18 tunnin inkubaation jälkeen. Tu-15 lokset esittävät kaksinkertaisten näytteiden keskiarvoja.Figure 6 shows the growth of L. rhamnosus LGG (VTT E-96666) and L casei VTT E-96710nt in HT-29 cells, HT-29 treated medium and cell culture medium alone. Bacteria were inoculated into sample wells and viable levels were determined after 18 hours of incubation. The results for the T-15 represent the mean of duplicate samples.
Kuvio 7 esittää Bifidobacterium-tyyppikantojen kasvua HT-29 epiteelisolujen läsnä ollessa. Tulokset esitetään bakteereiden määränä HT-29 soluja sisältävistä näytekuopista verrattuna bakteereiden määrään pelkkää soluviljelymediumia sisältävistä näytekuopista. L. rhamnosus GG (E-96666) on 20 mukana kontrollina. Tulokset esittävät kaksinkertaisten näytteiden keskiarvoja.Figure 7 shows the growth of Bifidobacterium type strains in the presence of HT-29 epithelial cells. Results are presented as bacterial counts from HT-29 cell-containing sample wells compared to bacterial counts from cell culture medium alone. L. rhamnosus GG (E-96666) is included as a control. The results represent the mean of duplicate samples.
Kuvio 8 esittää absorbanssimittausta (OD A595nm) L. rhamnosus GG (E-96666), L. acidophilus VTT E-96276T ja L. casei VTT E-96710NT bakteerien 18 tunnin yhteiskasvatuksen jälkeen HT-29 solujen kanssa ja pelkässä soluviljelymediumissa.Figure 8 shows an absorbance measurement (OD A595nm) of L. rhamnosus GG (E-96666), L. acidophilus VTT E-96276T, and L. casei VTT E-96710NT after co-culture with HT-29 cells for 18 hours and in cell culture medium alone.
25 Keksinnön yksityiskohtainen selostus ^ Vaikka probioottisilla kannoilla on myönteisiä terveysvaikutuksia ^ isännälle, ne voivat poiketa toisistaan monessa suhteessa, kuten niiden ad- 9 heesio suolen epiteelisoluihin ja antimikrobiaaliset ominaisuudet. Esimerkiksi o kannat L. rhamnosus GG ja L. plantarum 299v kiinnittyvät molemmat suolen | 30 epiteelisoluihin, mutta niiden antimikrobiaalinen aktiivisuus suolen normaalia w flooraa vastaan on erilaista.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION 25 ^ While the probiotic strains have beneficial health effects of ^ the host, they may differ from one another in many respects such as their adhesion to intestinal epithelial cells adhesion is 9 and antimicrobial properties. O For example, strains L. rhamnosus GG and L. plantarum 299v are attached to both bowel | 30 epithelial cells, but their antimicrobial activity of the normal intestinal flora w v is different.
Keksintö perustuu sille tutkimustulokselle, että tiettyjen, tunnettujen o probioottisten kantojen, kuten L. rhamnosus GG, samoin kuin tiettyjen suolis- o ^ tosta peräisin olevien bakteerikantojen kasvu lisääntyy suolen epiteelisolujen 35 tai fibroblastien läsnä ollessa, kun taas muut tunnetut probioottiset kannat, kuten L. plantarum 299v samoin kuin tietyt suolistosta peräisin olevat bakteeri- 5 kannat osoittavat vain jäävänsä eloon ilman merkittävää kasvua ja jotkut kannat jopa kuolevat suoliston epiteelisolujen ja/tai fibroblastien läsnä ollessa.The invention is based on the research result that, in particular, o-known probiotic strains, such as L. rhamnosus GG, as well as certain intestinal o ^ derived from the use of bacterial strains to increase the growth of intestinal epithelial cells 35 or in the presence of fibroblasts, while the other probiotic strains, such as L. known plantarum 299v, as well as certain intestinal bacterial strains, only show survival without significant growth, and some strains even die in the presence of intestinal epithelial cells and / or fibroblasts.
Tämän tutkimustuloksen perusteella on kehitetty menetelmä probi-oottisten kantojen seulomiseksi. Näin löydetyllä kannalla on edullisia vaikutuk-5 siä ihmisen terveyteen ja/tai hyvinvointiin ja se voidaan formuloida terveysvaikutteisiksi ruokatuotteiksi tai ravintolisiksi.Based on this research, a method for screening probiotic strains has been developed. The strain thus found has beneficial effects on human health and / or well-being and can be formulated as health food products or nutritional supplements.
Bakteerikannoilla, jotka kasvavat hyvin ihmissoluilla, kuten limakal-voperäisillä soluilla tai fibroblasteilla, ja/tai niiden läsnä ollessa, on kasvuetu suolistossa olevien lukuisten ja erilaisten mikro-organismien joukossa. Tämä 10 puolestaan parantaa kannan probioottista tehoa.Bacterial strains that grow well in and / or in the presence of human cells, such as mucosal cells or fibroblasts, have a growth advantage among the numerous and diverse microorganisms in the gut. This in turn improves the probiotic potency of the strain.
Tutkittujen Lactobacillus- ja Bifidobacterium-kantojen havaittu kas-vuvaihtelu suoliston epiteelisolujen tai fibroblastisolulinjan läsnä ollessa selittää merkittävät kantakohtaiset erot edullisissa vaikutuksissa, joita maitohappobakteereilla on osoitettu olevan. Bakteerien adheesion HT-29 ja Caco-2 soluihin 15 on aiemmin ajateltu olevan osoitus bakteerin probioottisesta potentiaalista. Nämä tulokset osoittavat, että kantakohtaiset erot myös mikrobi-isäntäsolu-vuorovaikutuksen muissa suhteissa ovat ratkaisevan tärkeitä probioottisten kantojen valinnassa.The observed growth variation of the Lactobacillus and Bifidobacterium strains examined in the presence of intestinal epithelial cells or a fibroblast cell line explains the significant differences between strains in the beneficial effects shown by lactic acid bacteria. Bacterial adhesion to HT-29 and Caco-2 cells was previously thought to be indicative of the probiotic potential of the bacterium. These results demonstrate that strain-specific differences also in other aspects of microbial-host cell interaction are crucial in the selection of probiotic strains.
Tulokset osoittavat, että Lactobacillus- ja Bifidobacterium-tyyppikan-20 tojen joukossa, samoin kuin ihmisen suolistosta eristettyjen bakteerien joukossa, on kantoja, joiden kasvu stimuloituu voimakkaasti ihmissolujen, kuten lima-kalvoperäisten solujen ja/tai fibroblastien, läsnä ollessa.The results show that among Lactobacillus and Bifidobacterium type chickens, as well as in bacteria isolated from the human intestine, there are strains whose growth is strongly stimulated in the presence of human cells, such as mucosal cells and / or fibroblasts.
Esillä olevassa keksinnössä limakalvoperäinen solu tarkoittaa solua, joka on löydetty iholta ja/tai on peräisin ihosta, ruuansulatuskanavasta, erityi-25 sesti suolesta, nenänielukanavasta (nenä, suu ja korvat) ja/tai alveolaarisesta kanavasta (keuhkot). Keksinnön eräässä suoritusmuodossa solu on limakalvon 5 epiteelisolu, kuten suolen epiteelisolu.In the present invention, a mucosal cell is a cell found on and / or derived from the skin, the digestive tract, especially the intestine, the nasopharynx (nose, mouth and ears) and / or the alveolar canal (lungs). In one embodiment of the invention, the cell is a mucosal epithelial cell 5, such as the intestinal epithelial cell.
(M(M
^ Tämän löydön hyödyntäminen probioottisten kantojen valinnassa ^ auttaa tunnistamaan tehokkaat probioottiset kannat. Näin ollen keksintö liittyy ° 30 menetelmään probioottisten kantojen seulomiseksi, joka menetelmä käsittää | bakteerien kasvattamisen ihmisoluilla ja/tai niiden läsnä ollessa ja bakteerien (m kasvun määrän määrittämisen. Erään suoritusmuodon mukaan keksintö liittyy σ> menetelmään probioottisten kantojen seulomiseksi, joka menetelmä käsittää o bakteerien kasvattamisen limakalvoperäisellä ihmissolulla ja/tai sen läsnä ol- ^ 35 lessa ja bakteerien kasvun määrän määrittämisen. Erään toisen suoritusmuo don mukaan keksintö liittyy menetelmään probioottisten bakteerien seulomi- 6 seksi, joka menetelmä käsittää bakteerien kasvattamisen fibroblastilla ja/tai sen läsnä ollessa ja bakteerien kasvun märän määrittämisen. Menetelmä voi sisältää myös lisävaiheita ja/tai valinnaisia vaiheita, jotka ovat bakteerisolujen kasvattamiselle ja/tai viljelylle tavanomaisia, kuten pesu, inkubointi ja solupo-5 pulaatioiden jakaminen.^ Utilizing this finding to select probiotic strains ^ will help identify effective probiotic strains. Accordingly, the invention relates to a method for screening probiotic strains of in one embodiment, the invention relates to a method for screening probiotic strains, which comprises growing bacteria in and / or in the presence of human mucosal cells, and bacterial growth. According to another embodiment, the invention relates to a method for screening probiotic bacteria, which comprises growing the bacteria with and / or in the presence of fibroblast and determining the amount of bacterial growth, which may also include additional steps and / or optional steps which are bacterial cells. cultures and / or cultures such as washing, incubation and dispersion of cellular pools.
Esillä oleva keksintö liittyy edelleen menetelmään probioottisen kannan eristämiseksi, joka menetelmä käsittää bakteerien kasvattamisen ih-missoluilla ja/tai niiden läsnä ollessa, bakteerien kasvun määrän määrittämisen ja halutun bakteerikannan eristämisen. Erään suoritusmuodon mukaan keksin-10 tö liittyy menetelmään probioottisen kannan eristämiseksi, joka menetelmä käsittää bakteerien kasvattamisen limakalvoperäisellä ihmissolulla ja/tai sen läsnä ollessa ja bakteerien kasvun määrän määrittämisen. Erään toisen suoritusmuodon mukaan keksintö liittyy menetelmään probioottisen kannan eristämiseksi, joka menetelmä käsittää bakteerien kasvattamisen fibroblastilla ja/tai 15 sen läsnä ollessa ja bakteerien kasvun määrän määrittämisen. Menetelmä voi sisältää myös lisävaiheita ja/tai valinnaisia vaiheita, jotka ovat bakteerisolujen kasvattamiselle ja/tai viljelylle tavanomaisia, kuten pesu, inkubointi ja solupopulaatioiden jakaminen.The present invention further relates to a method for isolating a probiotic strain comprising growing bacteria in and / or in the presence of human cells, determining the amount of bacterial growth and isolating the desired bacterial strain. In one embodiment, the invention relates to a method for isolating a probiotic strain comprising growing bacteria in and / or in the presence of a mucosal human cell and determining the amount of bacterial growth. According to another embodiment, the invention relates to a method for isolating a probiotic strain comprising growing bacteria in and / or in the presence of fibroblast and determining the amount of bacterial growth. The method may also include additional steps and / or optional steps conventional for bacterial cell growth and / or culture, such as washing, incubation, and dividing cell populations.
On myös huomattava, että ihmissolut voivat olla peräisin muualtakin 20 kuin limakalvokudoksesta tai fibroblastista, jos niillä kuitenkin on samanlainen kyky sekä tukea probioottien kasvua että ennustaa probioottien toimintaa. Jotkut vakiintuneet solulinjat voivat olla helpompia viljellä tai turvallisempia käytössä.It should also be noted that human cells may be derived from non-mucosal tissue or fibroblasts, provided they nevertheless have the same ability to both support probiotic growth and to predict probiotic activity. Some established cell lines may be easier to cultivate or safer to use.
Keksintöä voidaan soveltaa nykyisten probioottien jatkokehitykseen, 25 kun uusia alakantoja, joilla on paremmat kolonisaatiokyvyt, seulotaan esimerkiksi käyttäen in vitro -mutageneesiä tai muita menetelmiä. Tämä voi olla eri-o tyisen hyödyllistä, kun probiootti, jolla on monia toivottuja ominaisuuksia muttaThe invention can be applied to the further development of existing probiotics by screening new sub-strains with better colonization capabilities, for example, using in vitro mutagenesis or other methods. This can be especially useful for a probiotic with many desirable properties but
CVJCVJ
^ ei riittävää kolonisaatiokykyä, on tunnistettu ja uusia alakantoja seulotaan al- ° kuperäisestä.^ insufficient colonization ability has been identified and new sub-strains are screened for aliquots.
° 30 Spesifiset probioottiset kannat, jotka on löydetty seulonta- ja/tai eris- | tysmenetelmällä, ovat myös esillä olevan keksinnön kohteina. Keksinnön cvj eräässä suoritusmuodossa probioottiset kannat kuuluvat Lactobacillus tai Bifi- CT> £ dobacterium sukuihin.° 30 Specific probiotic strains found in screening and / or isolates are also subject to the present invention. In one embodiment of the invention cvj, the probiotic strains belong to the genera Lactobacillus or Bifi-CT> Dobacterium.
o Sen tutkimustuloksen perusteella, että tietyn suolistoperäisen bak- ^ 35 teerikannan kasvu lisääntyy ihmissolujen läsnä ollessa, auttaa myös ennusta maan kannan efektiivistä annosta halutun ja/tai tarvittavan vaikutuksen aikaan- 7 saamiseksi isännässä. Siten esillä oleva keksintö liittyy myös menetelmään haluttuun vaikutukseen tarvittavan annoksen arvioimiseksi. Eräässä suoritusmuodossa keksintöä käytetään arvioitaessa probioottiseokseen lisättävien eri probioottien suhteellisia määriä. Voidaan olettaa, että hyvin kasvavia probioot-5 teja, kuten esillä olevassa keksinnössä on selostettu, voidaan tarvita suhteellisesti pienempiä määriä kuin niitä, jotka kasvavat huonosti.The finding that increased growth of a particular intestinal bacterial strain in the presence of human cells also assists in predicting an effective dose of a country strain to achieve the desired and / or necessary effect in a host. Thus, the present invention also relates to a method for assessing the dose required for a desired effect. In one embodiment, the invention is used to evaluate the relative amounts of various probiotics added to a probiotic mixture. It can be assumed that well growing probiotics, as described in the present invention, may require relatively smaller amounts than those which grow poorly.
Edelleen keksinnönmukaista tutkimustulosta voidaan hyödyntää probioottisen viljelmän tai viljelmäerän laadun ja/tai toiminnan määrittämisessä. Näin ollen esillä oleva keksintö liittyy menetelmään probioottisen viljelmän laa-10 dun määrittämiseksi, joka menetelmä käsittää bakteerien kasvattamisen ihmis-soluilla ja/tai niiden läsnä ollessa ja bakteerien kasvun määrän määrittämisen. Erään suoritusmuodon mukaan keksintö liittyy menetelmään probioottisen viljelmän laadun määrittämiseksi, joka menetelmä käsittää bakteerien kasvattamisen limakalvoperäisellä ihmissolulla ja/tai sen läsnä ollessa ja bakteerien 15 kasvun määrän määrittämisen. Erään toisen suoritusmuodon mukaan keksintö liittyy menetelmään probioottisen viljelmän laadun määrittämiseksi, joka menetelmä käsittää bakteerien kasvattamisen fibroblastilla ja/tai sen läsnä ollessa ja bakteerien kasvun määrän määrittämisen. Menetelmä voi sisältää myös lisä-vaiheita ja/tai valinnaisia vaiheita, jotka ovat viljelmien laadunarviointimenetel-20 mille tavanomaisia, kuten esimerkiksi pesu, inkubointi, solupopulaatioiden jakaminen ja tuotantoerien kasvun vertailu. Tilanteita, joissa laatunäkökohtia kuten erien välistä toiminnan vaihtelua testataan, ovat esimerkiksi pitkä säilytysaika ja/tai muutokset tuotantoprosessissa.Further, the research result of the invention can be used to determine the quality and / or function of the probiotic culture or batch of culture. Accordingly, the present invention relates to a method for determining the quality of a probiotic culture, which comprises growing bacteria in and / or in the presence of human cells and determining the amount of bacterial growth. According to one embodiment, the invention relates to a method for determining the quality of a probiotic culture, which comprises growing bacteria in and / or in the presence of a mucosal human cell and determining the amount of bacterial growth. According to another embodiment, the invention relates to a method for determining the quality of a probiotic culture, which comprises growing bacteria in and / or in the presence of fibroblast and determining the amount of bacterial growth. The method may also include additional steps and / or optional steps conventional to culture quality evaluation methods, such as washing, incubation, cell population division and batch growth comparison. Situations where quality aspects such as inter-batch operations are tested include, for example, long shelf life and / or changes in the production process.
Esillä oleva keksintö liittyy edelleen menetelmään mikrobikantojen 25 seulomiseksi, joiden kyky kasvaa ihmissoluilla on erilainen sairaiden ja terveiden kudosten tai solujen välillä. Termillä ’’sairas” tarkoitetaan tässä mitä tahan-o sa sairaustilaa, joista esimerkkeinä voidaan mainita l-tyypin diabetes, keliakiaThe present invention further relates to a method for screening microbial strains having different capacity for growth in human cells between diseased and healthy tissues or cells. The term "" ill "as used herein refers to any condition, such as type 1 diabetes, celiac disease.
CVJCVJ
^ ja tulehduksellinen suolistosairaus (IBD), ja vastaavasti termeillä ’’sairaat solut” ° tai ’’sairaat kudokset” tarkoitetaan sairastuneista yksilöistä eristettyjä soluja tai ° 30 kudoksia. Siten esillä oleva keksintö liittyy menetelmään bakteerikannan kas- | vun vaihtelun määrittämiseksi tautia sairastavasta yksilöstä peräisin olevilla cvj ihmissoluilla ja/tai niiden läsnä ollessa ja saman kannan kasvun määrittelemi-and inflammatory bowel disease (IBD), and the terms '' or '' diseased tissues, respectively, refer to cells or tissues isolated from diseased individuals. Thus, the present invention relates to a method for bacterial strain growth to determine the variability of Vu in the presence and / or presence of cvj from human disease cells and to determine the growth of the same strain,
CDCD
seksi tautia sairastamattomasta yksilöstä peräisin olevilla ihmissoluilla ja/tai o niiden läsnä ollessa. Toisin sanoen esillä oleva keksintö liittyy menetelmään ™ 35 seuloa bakteerikannan kasvua tautia sairastavasta yksilöstä peräisin olevilla 8 ihmissoluilla ja/tai niiden läsnä ollessa ja sannan kannan kasvua tautia sairas-tamattomasta yksilöstä peräisin olevilla ihmissoluilla ja/tai niiden läsnä ollessa.sex in human cells from an uninfected individual and / or in their presence. In other words, the present invention relates to a method of screening? 35 for bacterial strain growth in and / or in the presence of 8 human cells from a diseased individual and for human strain growth in a strain of strain in human cells from and / or in a non-diseased individual.
Keksinnön eräässä suoritusmuodossa ihmissolu on limakalvoperäi-nen solu, kuten suoliston epiteelisolu. Eräässä toisessa suoritusmuodossa ih-5 missolu on fibroblasti.In one embodiment of the invention, the human cell is a mucosal cell such as an intestinal epithelial cell. In another embodiment, the ih-5 is a fibroblast.
Lisäksi esillä oleva keksintö liittyy ihmissolun käyttöön probioottisten kantojen seulomiseksi. Esillä oleva keksintö liittyy myös ihmissolun käyttöön probioottisen kannan eristämiseksi. Esillä oleva keksintö liittyy edelleen ihmissolun käyttöön haluttuun vaikutukseen tarvittavan probioottiannoksen määrit-10 tämiseksi. Edelleen esillä oleva keksintö liittyy ihmissolun käyttöön probioottisen viljelmän ja/tai viljelyerän laadun määrittämiseksi.In addition, the present invention relates to the use of a human cell for screening probiotic strains. The present invention also relates to the use of a human cell to isolate a probiotic strain. The present invention further relates to the use of a human cell to determine the dose of probiotic required for the desired effect. The present invention further relates to the use of a human cell for determining the quality of a probiotic culture and / or culture batch.
Lisäksi esillä oleva keksintö liittyy ihmissolun käyttöön variaation löytämiseksi bakteerikannan kasvun tautiin sairastuneesta yksilöstä peräisin olevalla ihmissolulla tai sen läsnä ollessa ja saman bakteerikannan kasvun 15 kyseistä tautia sairastamattomasta yksilöstä peräisin olevalla ihmissolulla tai sen läsnä ollessa, välillä. Siten esillä oleva keksintö liittyy ihmissolun käyttöön sellaisten mikrobikantojen seulomiseksi, joiden kasvukyky ihmisen limakalvo-kudoksilla tai -soluilla on erilainen sairastuneiden ja sairastumattomien yksilöiden välillä.Furthermore, the present invention relates to the use of a human cell for detecting a variation in the growth of a bacterial strain in or in the presence of a human cell from a disease-afflicted individual, and a human cell derived from the same bacterial strain in a human. Thus, the present invention relates to the use of a human cell for screening microbial strains having different growth capacities in human mucosal tissues or cells between diseased and non-diseased individuals.
20 Keksinnön eräässä suoritusmuodossa ihmissolu on limakalvoperäi- nen solu. Eräässä toisessa suoritusmuodossa ihmissolu on fibroblasti. Keksinnön vielä eräässä suoritusmuodossa solu on limakalvoperäinen epiteelisolu, kuten suolen epiteelisolu. Vielä eräässä suoritusmuodossa solu on valittu HT-29 soluista, Caco-2 soluista, HGF-1 soluista ja/tai HuTu80 soluista.In one embodiment of the invention, the human cell is a mucosal cell. In another embodiment, the human cell is a fibroblast. According to yet another embodiment, the cell is limakalvoperäinen epithelial cell, such as the intestinal epithelial cell. In another embodiment, the cell is selected from HT-29 cells, Caco-2 cells, HGF-1 cells, and / or HuTu80 cells.
25 Keksinnön eräässä suoritusmuodossa probioottiset bakteerit kuulu vat Lactobacillus tai Bifodobacterium sukuihin.In one embodiment of the invention, the probiotic bacteria belong to the genera Lactobacillus or Bifodobacterium.
5 Keksintöä selostetaan yksityiskohtaisemmin seuraavien esimerkkienThe invention will be explained in more detail by the following examples
(M(M
^ avulla. Esimerkkejä ei tule tulkita niin, että ne millään tavalla rajoittaisivat pa- ° tenttivaatimuksia.^. The examples are not to be construed as limiting the claims in any way.
sj- o g 30 Esimerkitsj-g 30 Examples
CLCL
^ Materiaalit ja menetelmät σ> Tässä kuvatut materiaalit ja menetelmät ovat esimerkeille 1 - 8 yh- o teisiä.^ Materials and Methods σ> The materials and methods described herein are common to Examples 1-8.
Oo
C\JC \ J
99
Eukaryoottisolujen viljelyCultivation of eukaryotic cells
Eukaryoottisoluja kasvatettiin semikonfluenssiin ja jaettiin 48-kuop-paisille näytelevyille konsentraation ollessa 1x106 solua/ml (HT-29, Caco-2, HuTu80) tai 1x105 solua/ml (HGF-1) täydellisessä soluviljelymediumissa, johon 5 oli lisätty naudan sikiön seerumia (FBS, Gibco). Samaan määrään näytekuop-pia laitettiin sama määrä soluviljelymediumia ilman soluja. Levyjä inkuboitiin +37 celsiusasteen lämpötilassa, 5 % C02 atmosfäärissä yli yön, jonka jälkeen elatusaine poistettiin, kuopat pestiin kahdesti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella, pH 7,2 (PBS) ja tuore, seerumivapaa elatusaine lisättiin kuoppiin.Eukaryotic cells were grown in semiconfluence and plated in 48-well sample plates at a concentration of 1x106 cells / ml (HT-29, Caco-2, HuTu80) or 1x105 cells / ml (HGF-1) in complete cell culture medium supplemented with 5 , Gibco). The same number of sample wells were loaded with the same amount of cell culture medium without cells. The plates were incubated at + 37 ° C, 5% CO 2 overnight, after which the medium was removed, the wells were washed twice with phosphate buffered saline, pH 7.2 (PBS), and fresh, serum-free medium was added to the wells.
10 Bakteereiden viljely ja laskenta10 Bacterial culture and enumeration
Bakteereita viljeltiin anaerobisesti MRS-liemessä (deManin, Ro-gosan ja Sharpen elatusaineformulaatio; Lactobacillus-kannat) tai RCM-lie-messä (Robertsonin keitetty lihaliemi), jota täydennettiin 0,5 g:lla/l L-kysteiini-monohydraattia (Bifidobacterium-kan\.o\a) +37 celsiusasteen lämpötilassa yli 15 yön, kerättiin sentrifugoimalla ja pestiin kahdesti PBS:llä. Bakteerit siirrostettiin näytekuoppiin, joissa oli elatusainetta ja epiteelisoluja, tai näytekuoppiin, joissa oli pelkkää elatusainetta, konsentraation ollessa noin 1x105 bakteeria/ml. Näy-televyjä inkuboitiin +37 celsiusasteen lämpötilassa, 5 % C02 atmosfäärissä 18 tunnin ajan. Inkuboinnin jälkeen määriteltiin elävien bakteerien lukumäärät 20 kuopissa. Sen varmistamiseksi, että myös epiteelisolujen pintaan mahdollisesti tarttuneet bakteerit vapautuisivat elatusaineeseen, levyjä käsiteltiin 45 minuutin ajan 0,2-prosenttisella Triton-X-100:lla (H20:ssa), mikä liuottaa eukaryoottisoluja. Tämän jälkeen näytekuoppien elatusaineen sarjalaimennokset maljat-tiin MRS- tai RCM-agar-maljoille elävien solujen määrien määrittelemiseksi. 25 Epiteelisoluja sisältävien näytekuoppien bakteerilukua verrattiin bakteerien lu- o kumäärään pelkässä soluviljelymediumissa ja siirroksessa.The bacteria were cultured anaerobically in MRS broth (deMan's, Roososa's and Sharpe's medium formulation; Lactobacillus strains) or in RCM's broth (Robertson's cooked broth) supplemented with 0.5 g / L L-cysteine monohydrate (Bifid kan \ .o \ a) at + 37 ° C for over 15 nights, collected by centrifugation and washed twice with PBS. Bacteria were inoculated into media wells containing epithelial cells or media wells alone at a concentration of about 1x105 bacteria / ml. Visual TVs were incubated at + 37 ° C, 5% CO 2 for 18 hours. After incubation, the numbers of live bacteria in 20 wells were determined. To ensure that any bacteria that might adhere to the surface of the epithelial cells were also released into the medium, the plates were treated with 0.2% Triton-X-100 (H 2 O) for 45 minutes to lyse the eukaryotic cells. Serial dilutions of sample wells were then plated on MRS or RCM agar plates to determine the amount of living cells. The bacterial count of the wells containing the epithelial cells was compared with the bacterial count in the cell culture medium alone and inoculum.
cv o Esimerkki 1 o HT-29 paksusuolen epiteelisolujen vaikutus Lactobacillus rhamnosusCV No No Example 1 HT-29 colon epithelial cells, the effect of Lactobacillus rhamnosus
Ee GG:n kasvuun Q_ <M 30 HT-29 paksusuolen epiteelisoluja (ATCC HTB-38) kasvatettiin Mc- 05 £ Coyn 5A viljelymediumissa (Gibco), johon oli lisätty 10 % naudan sikiön see- o rumia. Probioottinen kanta Lactobacillus rhamnosus GG (VTT E-96666, kanta ^ GG) siirrostettiin HT-29 soluille seerumittomassa McCoyn 5A viljelymediumis sa samoin kuin pelkkään seerumittomaan McCoyn 5A viljelymediumiin. Elävien 10 bakteerien lukumäärä näytekuopissa määriteltiin 18 tunnin inkuboinnin jälkeen yllä selostetulla tavalla.Ee GG growth Q_ <M 30 HT-29 colonic epithelial cells (ATCC HTB-38) were grown McGill 05 £ Coyn 5A culture medium (GIBCO) supplemented with 10% fetal bovine serum No serum. The probiotic strain Lactobacillus rhamnosus GG (VTT E-96666, strain GG) was inoculated with HT-29 cells in serum-free McCoy 5A culture medium as well as serum-free McCoy 5A culture medium. The number of live bacteria in the sample wells after 18 hours of incubation was determined as described above.
Tulokset on esitetty kuviossa 1. Kuten kuviosta 1 näkyy, LGG kasvoi yli satakertaiseen määrään HT-29 solujen läsnä ollessa. Sitä vastoin pelkässä 5 soluviljelymediumissa inkuboidut bakteerit osoittivat vain vaatimatonta kasvua.The results are shown in Figure 1. As shown in Figure 1, LGG increased to more than 100-fold in the presence of HT-29 cells. In contrast, bacteria incubated in 5 cell culture medium alone showed only modest growth.
Esimerkki 2 HT-29 epiteelisolujen vaikutus erilaisten Lactobacillus spp. kantojen kasvuunExample 2 Effect of HT-29 epithelial cells on various Lactobacillus spp. strain growth
Tutkittiin, onko epiteelisoluvälitteinen kasvun stimulointi yleinen 10 ominaisuus maitohappobakteereilla. Kasvua stimuloivat kokeet suoritettiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla.It was examined whether epithelial cell-mediated growth stimulation was a common feature of lactic acid bacteria. Growth stimulating experiments were performed as described in Example 1.
Tulokset on esitetty kuviossa 2. Tulokset yhdeksällä Lactobacillus-kannalla L rhamnosus VTT E-96666 (=GG), L. rhamnosus VTT E-96031T, L casei VTT E-96710NT, L casei DSM 20011T, L brevis VTT E-82152 (=ATCC 15 367), L. reuteri VTT E-92142T, L. delbrueckii subsp. bulgaricus DSM 20081T, L. acidophilus VTT E-96276T ja L. plantarum Lp299v osoittavat, että on kantoja, joiden kasvua HT-29 solut stimuloivat tehokkaasti (tulokset on esitetty HT-29 soluja sisältävien näytekuoppien bakteerimäärinä verrattuna pelkkää kasvu-liuosta sisältävien näytekuoppien bakteerimääriin). Kuitenkin löydettiin myös 20 kantoja, joiden kasvua HT-29 epiteelisolut eivät stimuloineet ja jotkut kannat jopa kuolivat nopeammin HT-29 epiteelisolujen läsnä ollessa kuin pelkässä soluviljelymediumissa. Havaittiin myös lajinsisäisiä eroja kahdessa erillisessä kannassa, jotka edustivat L rhamnosus ja L casei kantoja. Nämä tulokset osoittavat, että Lactobacillus spp. sisältää lajeja ja kantoja, joilla on hyvin eri-25 lainen kyky säilyä elossa suoliston epiteelissä ja että epiteelisolujen stimulaa- o tiovaikutus on kantakohtainen.The results are shown in Figure 2. Results for nine Lactobacillus strains L rhamnosus VTT E-96666 (= GG), L. rhamnosus VTT E-96031T, L casei VTT E-96710NT, L casei DSM 20011T, L brevis VTT E-82152 (= ATCC 15 367), L. reuteri VTT E-92142T, L. delbrueckii subsp. bulgaricus DSM 20081T, L. acidophilus VTT E-96276T, and L. plantarum Lp299v indicate that there are strains that are effectively stimulated by HT-29 cells (results are expressed as bacterial counts for HT-29 cells as compared to bacterial counts for growth medium alone). . However, strains that were not stimulated by HT-29 epithelial cells were also found, and some strains even died faster in the presence of HT-29 epithelial cells than in cell culture medium alone. Intra-species differences were also observed in two separate strains representing L rhamnosus and L casei strains. These results indicate that Lactobacillus spp. contains species and strains that have a very different ability to survive in the gut epithelium and that the stimulatory effect of epithelial cells is strain specific.
cv o Esimerkki 3 o Caco-2 paksusuolen epiteelisolujen vaikutus maitohappobakteerien kas- c vuuncv o Example 3 of the Caco-2 colon epithelial cells, the effect of lactic acid bacteria growth c vuun
CLCL
cv 30 Caco-2 suolen epiteelisolujen (ATCC HTB-37) vaikutus L. rham- £ nosus GG (VTT E-96666), L. acidophilus VTT E-96276T (=DSM 20079) ja L.CV 30 Caco-2 intestinal epithelial cells (ATCC HTB-37) against L. rham- £ nosus GG (VTT E-96 666), L. acidophilus VTT E-96276T (= DSM 20079) and L.
o casei VTT E-96710NT (=LMG 17314) -bakteerikantojen kasvuun mitattiin. Ca- ^ co-2 soluja kasvatettiin MEM-mediumissa (Gibco), johon oli lisätty L- glutamiinia (Gibco), natriumpyruvaattia (Gibco) ja 20 % naudan sikiön seeru- 11 mia. Bakteerien selviytymistä mitattiin seerumivapaassa elatusaineessa, kuten yllä on selostettu.o casei VTT E-96710NT (= LMG 17314) for bacterial growth was measured. Ca 2 -C 2 cells were grown in MEM medium (Gibco) supplemented with L-glutamine (Gibco), sodium pyruvate (Gibco) and 20% fetal bovine serum. Bacterial survival was measured in serum-free medium as described above.
Tulokset on esitetty kuviossa 3. Kuten kuviosta 3 näkyy, L. rham-nosus GG -solujen, joka on yleinen probioottinen kanta, lukumäärä lisääntyi 5 satakertaisesti Caco-2 solujen läsnä ollessa, kun taas Caco-2 solujen poissa ollessa havaittiin vain minimaalista kasvua. Caco-2 epiteelisolujen aikaansaamaa kasvun stimulaatiota ei havaittu kahdessa muussa Lactobacillus sp.-tyypin kannassa. Nämä tulokset osoittavat, että Caco-2 paksusuolen epiteelisolut stimuloivat LGG:n kasvua ja kasvustimulaatio-ominaisuus vaihtelee lak-10 tobasilleissa.The results are shown in Figure 3. As shown in Figure 3, the number of L. rham-nosus GG cells, a common probiotic strain, increased 5-fold in the presence of Caco-2 cells, whereas only minimal growth was observed in the absence of Caco-2 cells. Growth stimulation by Caco-2 epithelial cells was not observed in the other two Lactobacillus sp. These results show that the Caco-2 colon epithelial cells of the LGG stimulate the growth and growth stimulation function varies lak-10 tobasilleissa.
Esimerkki 4Example 4
Ohutsuolen epiteelisolujen (HuTu80) vaikutus maitohappobakteerien kasvuunIntestinal epithelial cells (HuTu80) the effect of lactic acid bacteria growth
Tutkittiin L. rhamnosus GG (VTT E-96666), L. acidophilus VTT E-15 96276T (=DSM 20079) ja L casei VTT E-96710NT (=LMG 17314) kantojen kasvua ohutsuolesta peräisin olevien HuTu80 epiteelisolujen (ATCC HTB-40) läsnä ollessa. HuTu80 soluja kasvatettiin MEM-mediumissa (Gibco), johon oli lisätty L-glutamiinia (Gibco), natriumpyruvaattia (Gibco) ja 10 % naudan sikiön seerumia. Bakteerien selviytymistä mitattiin seerumittomassa elatusaineessa, 20 kuten yllä on selostettu.Strains of L. rhamnosus GG (VTT E-96666), L. acidophilus VTT E-15 96276T (= DSM 20079) and L casei VTT E-96710NT (= LMG 17314) were examined for growth of small intestine HuTu80 epithelial cells (ATCC HTB-40). in the presence of. HuTu80 cells were grown in MEM medium (Gibco) supplemented with L-glutamine (Gibco), sodium pyruvate (Gibco) and 10% fetal bovine serum. Bacterial survival was measured in serum-free medium as described above.
Tulokset on esitetty kuviossa 4. Kuten kuviosta 4 näkyy, L rhamnosus GG solujen lukumäärä lisääntyi satakertaisesti HuTu80 solujen läsnä ollessa, kun taas HuTu80 solujen poissa ollessa havaittiin vain minimaalista kasvua. HuTu80 epiteelisolujen aikaansaamaa kasvun stimulaatiota ei havaittu 25 kahdessa muussa Lactobacillus sp. kannassa. Nämä tulokset osoittavat, että 5 myös ohutsuolen epiteelisolut stimuloivat LGG:n kasvua ja kasvustimulaatio-The results are shown in Figure 4. As shown in Figure 4, the number of L rhamnosus GG cells increased 100-fold in the presence of HuTu80 cells, whereas only minimal growth was observed in the absence of HuTu80 cells. Growth stimulation by HuTu80 epithelial cells was not observed in the other two Lactobacillus sp. position. These results show that the five small intestinal epithelial cells, stimulate the LGG growth and kasvustimulaatio-
C\JC \ J
ominaisuus vaihtelee laktobasilleissa.the characteristic varies in lactobacilli.
cp o Esimerkki 5 ϊ Ikenen fibroblastisolujen (HGF-1) vaikutus maitohappobakteerien kas- ^ 30 vuuncp o Example 5 vaikutus Effect of yeast fibroblast cells (HGF-1) on the growth of lactic acid bacteria
CDCD
Tutkittiin L. rhamnosus GG (VTT E-96666) kannan kasvua ihmisen o ikenistä peräisin olevien HGF-1 fibroblastisolujen (ATCC CRL-2014) läsnä ol- ^ lessa. HGF-1 soluja kasvatettiin Dulbeccon Modified Eagle’s Medium - elatusaineessa (ATCC), johon oli lisätty 10 % FBS:ää (tiheyden ollessa 105 12 solua/ml). Bakteerien selviytymistä mitattiin seerumittomassa elatusaineessa, kuten yllä on selostettu. Tulokset näkyvät kuviossa 5. Kuten kuviosta 5 näkyy, L. rhamnosus GG solujen lukumäärä lisääntyi noin kymmenkertaisesti HGF-1 solujen läsnä ollessa.Growth of L. rhamnosus GG (VTT E-96666) in the presence of human oak derived HGF-1 fibroblast cells (ATCC CRL-2014) was examined. HGF-1 cells were grown in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (ATCC) supplemented with 10% FBS (at a density of 105 to 12 cells / ml). Bacterial survival was measured in serum-free medium as described above. The results are shown in Figure 5. As shown in Figure 5, the number of L. rhamnosus GG cells increased approximately ten-fold in the presence of HGF-1 cells.
5 Esimerkki 6 HT-29 epiteelisolut stimuloivat bakteerikasvua tehokkaammin kuin HT-29 soluilla esikäsitelty elatusaineExample 6 HT-29 epithelial cells stimulate bacterial growth more effectively than media pre-treated with HT-29 cells
Sen selvittämiseksi, voitaisiinko seulontamenetelmässä hyödyntää bakteerisiirrostusta epiteelisoluilla käsiteltyyn elatusaineeseen itse epiteelisolu-10 jen sijaan, HT-29 epiteelisoluja inkuboitiin ensin seerumittomassa McCoyn 5A elatusaineessa 18 tunnin ajan. Soluilla käsitelty elatusaine kerättiin ja bakteerit (L. rhamnosus VTT E-96666 ja L. casei VTT E-96710NT) siirrostettiin joko soluilla käsiteltyyn elatusaineeseen, HT-29 soluille tai pelkkään soluviljelyme-diumiin. Elävien bakteerien määrät määriteltiin 18 tunnin inkuboinnin jälkeen.To determine whether the screening method could utilize bacterial inoculation with epithelial cell-treated medium instead of epithelial cell-10 itself, HT-29 epithelial cells were first incubated in serum-free McCoy's 5A medium for 18 hours. Cell-treated medium was harvested and bacteria (L. rhamnosus VTT E-96666 and L. casei VTT E-96710NT) were inoculated with either cell-treated medium, HT-29 cells or cell culture medium alone. The numbers of live bacteria were determined after 18 hours of incubation.
15 Tulokset on esitetty kuviossa 6. Kuten kuviosta 6 näkyy, myös käsi telty elatusaine stimuloi bakteerien kasvua kohtuullisessa määrin (20 kertaa [LGG] ja 5 kertaa [L casei] enemmän bakteereita kuin pelkässä soluviljelyme-diumissa), kuitenkin bakteerien määrät solujen läsnä ollessa olivat huomattavasti suurempia (yli 100 kertaa enemmän bakteereita kuin pelkässä elatusai-20 neessa).The results are shown in Figure 6. As shown in Figure 6, the treated medium also stimulated bacterial growth to a moderate extent (20 times [LGG] and 5 times [L casei] more bacteria than in cell culture medium alone), however, in the presence of cells, much larger (more than 100 times more bacteria than in culture alone).
Esimerkki 7 HT-29 epiteelisolujen vaikutus erilaisten Bifidobacterium spp. kantojen kasvuunExample 7 Effect of HT-29 Epithelial Cells on Bifidobacterium spp. strain growth
Tutkittiin myös, voidaanko HT-29 epiteelisoluvälitteinen stimulaatio 5 25 ulottaa Bifidobacterium spp. kantoihin. Kasvustimulaatiokokeet suoritettiin, ku-It was also examined whether HT-29 epithelial cell-mediated stimulation could be extended to Bifidobacterium spp. strains. Growth stimulation experiments were performed
C\JC \ J
ten on selostettu esimerkissä 1.are described in Example 1.
° Tulokset on esitetty kuviossa 7. Tulokset Bifidobacterium spp. kan- ° noilla B. adolescentis VTT E-981074T, B. bifidum VTT E-97795T, B. longum° The results are shown in Figure 7. Results Bifidobacterium spp. can- noilla B. adolescentis VTT E-981074T, B. bifidum VTT E-97795T, B. longum
| VTT E-96664T, B. angulatum DSM 20098T ja B. catenulatum DSM 16992T| VTT E-96664T, B. angulatum DSM 20098T and B. catenulatum DSM 16992T
cm 30 osoittavat, että on kantoja, joiden kasvua HT-29 solut stimuloivat tehokkaasti.cm 30 indicate that there are strains whose growth is effectively stimulated by HT-29 cells.
CDCD
Kuitenkin, kuten Lactobacillus spp:n tapauksessa, löysimme myös kantoja, o joiden kasvua epiteelisolut eivät stimuloineet.However, as with Lactobacillus spp, we also found strains whose growth was not stimulated by epithelial cells.
(M(M
1313
Esimerkki 8 HT-29 epiteelisolujen vaikutus erilaisten suolistobakteeri-isolaattien kasvuunExample 8 Effect of HT-29 epithelial cells on growth of various intestinal bacterial isolates
Karakterisoimme 44 suolistobakteeri-isolaattia niiden kasvun suh-5 teen HT-29 suoliston epiteelisoluilla. Kasvustimulaatiokokeet suoritettiin, kuten on selostettu esimerkissä 1. Testatun 44 isolaatin joukosta HT-29 solut stimuloivat 12 kannan kasvua satakertaisesti tai enemmän verrattuna pelkkään ela-tusaineeseen, kun taas HT-29 solut estivät kahdeksan kannan kasvua. Nämä tulokset osoittavat, että menetelmä soveltuu suolistobakteerikantojen ominai-10 suuksien vertailuun.We characterized 44 intestinal bacterial isolates for their growth rate on HT-29 intestinal epithelial cells. Growth stimulation experiments were performed as described in Example 1. Of the 44 isolates tested, HT-29 cells stimulated growth of 12 strains 100-fold or more compared to medium alone, while HT-29 cells inhibited the growth of eight strains. These results indicate that the method is suitable for comparing the properties of intestinal bacterial strains.
Esimerkki 9Example 9
Absorbanssimittaus menetelmänä bakteerikasvun nopeaksi määrittämiseksi epiteelisoluillaAbsorbance measurement as a method for rapidly determining bacterial growth in epithelial cells
Elävien solujen lukumäärän lisäksi mittasimme myös soluviljelmien 15 optista tiheyttä (A595nm) inkuboinnin jälkeen L rhamnosus GG (VTT E-96666), L acidophilus VTT E-96276T (=DSM 200679) ja L. casei VTT E-96710NT (=LMG 17314) kannoilla. Tällöin epiteelisoluja kasvatettiin 96-kuop-paisilla levyillä. Solujen pesun jälkeen seerumitonta elatusainetta ja bakteeri-siirrosta lisättiin, kuten materiaalissa ja menetelmissä on selostettu. Bakteerit 20 siirrostettiin samalla tavalla pelkkään elatusaineeseen ja A595nm mitattiin 18 tunnin inkuboinnin jälkeen.In addition to the number of living cells, we also measured the optical density (A595nm) of cell cultures after incubation with strains of L rhamnosus GG (VTT E-96666), L acidophilus VTT E-96276T (= DSM 200679) and L. casei VTT E-96710NT (= LMG 17314). . The epithelial cells were then grown in 96-well plates. After washing the cells, serum-free medium and bacterial inoculum were added as described in the material and methods. Bacteria 20 were similarly inoculated into medium alone and A595nm was measured after 18 hours of incubation.
Tulokset on esitetty kuviossa 8. Kuten kuviosta 8 näkyy, L. rham-nosus GG kannan optinen tiheys (OD) kasvoi merkittävästi kasvatettaessa HT-29 soluilla, kun taas mitään merkittävää optisen tiheyden (OD) kasvua ei ha-i- 25 vaittu kahdessa muussa Lactobacillus spp. kannassa kasvatettaessa HT-29 ^ soluilla tai kasvatettaessa pelkissä elatusaineissa. Optisen tiheyden mittausta g voidaan siten käyttää nopeana menetelmänä niiden kantojen seulomiseksi, joilla on paras kasvukyky epiteelisoluilla.The results are shown in Figure 8. As shown in Figure 8, the optical density (OD) of L. rham-nosus GG strain increased significantly when grown on HT-29 cells, whereas no significant increase in optical density (OD) was observed in the other two. Lactobacillus spp. strain when grown on HT-29 cells or grown in culture medium alone. Optical density measurement g can thus be used as a rapid method for screening strains having the best growth capacity on epithelial cells.
oo
XX
cccc
CLCL
(M(M
CDCD
I'-I '
LOLO
CDCD
Oo
Oo
(M(M
Claims (17)
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI20095792A FI121926B (en) | 2009-07-15 | 2009-07-15 | Use of human cells |
| US13/384,521 US20120115180A1 (en) | 2009-07-15 | 2010-07-14 | Use of animal cells for screening probiotic bacteria strains |
| PCT/FI2010/050593 WO2011007049A1 (en) | 2009-07-15 | 2010-07-14 | Use of animal cells for screening probiotic bacteria strains |
| EP10744708A EP2454594A1 (en) | 2009-07-15 | 2010-07-14 | Use of animal cells for screening probiotic bacteria strains |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI20095792 | 2009-07-15 | ||
| FI20095792A FI121926B (en) | 2009-07-15 | 2009-07-15 | Use of human cells |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI20095792A0 FI20095792A0 (en) | 2009-07-15 |
| FI20095792A FI20095792A (en) | 2011-01-16 |
| FI121926B true FI121926B (en) | 2011-06-15 |
Family
ID=40935872
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI20095792A FI121926B (en) | 2009-07-15 | 2009-07-15 | Use of human cells |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20120115180A1 (en) |
| EP (1) | EP2454594A1 (en) |
| FI (1) | FI121926B (en) |
| WO (1) | WO2011007049A1 (en) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106459876A (en) * | 2014-03-28 | 2017-02-22 | 促接合因子股份有限公司 | Preparation of small colony variants of therapeutic bacteria |
| CN105274035B (en) * | 2015-11-20 | 2018-10-19 | 四川东坡中国泡菜产业技术研究院 | A method of probiotic lactobacillus is screened based on pickle fermentation system oriented |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FI20002445A0 (en) * | 2000-11-08 | 2000-11-08 | Raisio Yhtymae Oyj | Method for bacterial screening |
| ITRM20040166A1 (en) * | 2004-03-31 | 2004-06-30 | Alberto Cresci | BACTERIAL STRAINS LAB WITH PROBIOTIC PROPERTIES AND COMPOSITIONS THAT CONTAIN THE SAME. |
-
2009
- 2009-07-15 FI FI20095792A patent/FI121926B/en not_active IP Right Cessation
-
2010
- 2010-07-14 EP EP10744708A patent/EP2454594A1/en not_active Withdrawn
- 2010-07-14 WO PCT/FI2010/050593 patent/WO2011007049A1/en active Application Filing
- 2010-07-14 US US13/384,521 patent/US20120115180A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2011007049A1 (en) | 2011-01-20 |
| FI20095792A (en) | 2011-01-16 |
| FI20095792A0 (en) | 2009-07-15 |
| US20120115180A1 (en) | 2012-05-10 |
| EP2454594A1 (en) | 2012-05-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| de Melo Pereira et al. | How to select a probiotic? A review and update of methods and criteria | |
| Minelli et al. | Assessment of novel probiotic Lactobacillus casei strains for the production of functional dairy foods | |
| Guo et al. | Screening lactic acid bacteria from swine origins for multistrain probiotics based on in vitro functional properties | |
| RU2501850C2 (en) | Lactobacillus paracasei subspecies paracasei strain having antimicrobial and immunomodulating properties, and food product on its basis | |
| Kongnum et al. | Effect of Lactobacillus plantarum isolated from digestive tract of wild shrimp on growth and survival of white shrimp (Litopenaeus vannamei) challenged with Vibrio harveyi | |
| Rehaiem et al. | Assessment of potential probiotic properties and multiple bacteriocin encoding-genes of the technological performing strain Enterococcus faecium MMRA | |
| Ramirez-Chavarin et al. | Probiotic potential of thermotolerant lactic acid bacteria strains isolated from cooked meat products. | |
| Yun et al. | Isolation and characterization of potential probiotic lactobacilli from pig feces | |
| Hammes et al. | Research approaches for pre-and probiotics: challenges and outlook | |
| Golowczyc et al. | Characterization of homofermentative lactobacilli isolated from kefir grains: potential use as probiotic | |
| Mahmoudi et al. | Functional in vitro screening of Lactobacillus strains isolated from Tunisian camel raw milk toward their selection as probiotic | |
| Čitar et al. | Human intestinal mucosa-associated Lactobacillus and Bifidobacterium strains with probiotic properties modulate IL-10, IL-6 and IL-12 gene expression in THP-1 cells | |
| US20110117629A1 (en) | Lactobacillus plantarum bb9 capable of adhering to gastrointestinal tract and cholesterol removal | |
| Saran et al. | Comparing adhesion attributes of two isolates of Lactobacillus acidophilus for assessment of prebiotics, honey and inulin | |
| Sakai et al. | M-RTLV agar, a novel selective medium to distinguish Lactobacillus casei and Lactobacillus paracasei from Lactobacillus rhamnosus | |
| Liu et al. | Screening of lactobacilli with antagonistic activity against enteroinvasive Escherichia coli | |
| Palaniswamy et al. | In-vitro probiotic characteristics assessment of feruloyl esterase and glutamate decarboxylase producing Lactobacillus spp. isolated from traditional fermented millet porridge (kambu koozh) | |
| Deng et al. | In vitro and in vivo examination of anticolonization of pathogens by Lactobacillus paracasei FJ861111. 1 | |
| WO2005095656A1 (en) | Lactic acid bacteria strains exhibiting probiotic properties and compositions comprising the same | |
| CN113817622B (en) | Bifidobacterium longum with effect of reducing genotoxicity of carcinogen to human cells and application thereof | |
| Miranda et al. | Development of a selective culture medium for bifidobacteria, Raffinose-Propionate Lithium Mupirocin (RP-MUP) and assessment of its usage with Petrifilm™ Aerobic Count plates | |
| Horáčková et al. | Stability of selected lactobacilli in the conditions simulating those in the gastrointestinal tract | |
| Starke et al. | Effects of the probiotic Enterococcus faecium NCIMB 10415 on selected lactic acid bacteria and enterobacteria in co-culture | |
| Olszewska et al. | Utilization of physiological and taxonomic fluorescent probes to study Lactobacilli cells and response to pH challenge | |
| Zhang et al. | In vitro growth performance, antioxidant activity and cell surface physiological characteristics of Pediococcus pentosaceus R1 and Lactobacillus fermentum R6 stressed at different NaCl concentrations |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Ref document number: 121926 Country of ref document: FI |
|
| MM | Patent lapsed |