FI115165B

FI115165B - Menetelmä infektion laadun määrittämiseksi

Info

Publication number: FI115165B
Application number: FI20011168A
Authority: FI
Inventors: Esa-Matti Lilius; Jari Nuutila
Original assignee: Aboatech Ab Oy
Priority date: 2001-06-04
Filing date: 2001-06-04
Publication date: 2005-03-15
Also published as: FI20011168A; EP1405078A1; WO2002099433A1; EP1405078B1; US7645591B2; DE60227955D1; ES2309169T3; FI20011168A0; US20040171013A1; ATE403156T1

Description

i

Menetelmä infektion laadun määrittämiseksi 11516 5

Keksinnön ala 5 Esillä oleva keksintö koskee erotusdiagnostiikkaa, ja sillä saadaan yksinkertainen ja nopea menetelmä sen määrittämiseksi, onko potilaassa havaittu infektio bakteeri- vai virusperäinen. Lisäksi keksinnöllä saadaan diagnostiset testivälinesaijat keksinnön mukaisen menetelmän toteuttamiseksi.

10 Keksinnön tausta

Mikrobi-infektio organismissa laukaisee organismin omat, monimutkaiset puolustusmekanismit tulehdusta vastaan. Laboratoriokokeet ja potilaan kliininen tutkiminen paljastavat tyypilliset muutokset. Infektiot, mutta myös vammat, tulehdustapahtumat ja syövät 15 aiheuttavat organismissa muutoksia, joita kutsutaan akuutin vaiheen reaktioiksi. Näitä muutoksia kutsutaan akuuteiksi, sillä ne ilmaantuvat muutaman tunnin tai päivän kuluessa infektiosta tai vammasta. Muutosten taustalla on maksassa tapahtuvan proteiinisynteesin lisääntyminen, jonka aiheuttavat interleukiini 1 ja interleukiini 6, joita muodostuu infektion tai tulehduksen seurauksena.

20 • 1 < * ·' · Sellaisiin akuutin vaiheen proteiineihin kuuluvat haptoglobiini, seruloplasmiini, fibrino- • · » ‘ · ·’ · 1 geeni, amyloidi-A ja C-reaktiivinen proteiini (CRP). CRP:n määrittäminen verestä on ’ hyödyllisintä, koska sen pitoisuus kasvaa infektion, tulehduksen ja kudosvaurion yhtey dessä. Seerumin CRP-pitoisuuden muutokset voivat kasvaa jopa satakertaiseksi. CRP:n ,, 25 määrittäminen seerumista on myös melko halpaa, mistä syystä CRP on osoittautunut sopivaksi diagnostiseksi välineeksi. CRP:n pääsovellukset ovat infektiosairauksien havaitseminen ja bakteeri- ja virusinfektioiden välinen erotusdiagnostiikka. Vakavien bak-’ - ! _ teeri-infektioiden lisäksi CRP:n arvo voi kuitenkin olla hyvin suuri myös invasiivisissa • t virusinfektioissa, kuten esimerkiksi myyräkuumeessa ja suun ja kurkun herpesvirus-• « » ';;; 30 infektioissa. CRP:n pitoisuus valaisee pääasiassa infektion invasiivista luonnetta sekä • · ”1 siihen liittyvää kudosvauriota ja tulehdussolujen toimintaa. Niinpä CRP ei sellaisenaan ‘ ole spesifinen infektion lähteen suhteen.

• · i i i • · · • t 2 115165 Tällä hetkellä CRP on kliinisessä työssä tärkein akuutin faasin proteiini, koska se muuttuu nopeasti ja sopii erilaisten sairauksien tulehdustason tarkkailemiseen, ja siten myös hoidon tehokkuuden tarkkailemiseen. CRP:n pitoisuus voi muuttua oleellisesti kumpaankin suuntaan jopa alle 24 tunnissa. Sen sijaan toinen yleisesti käytetty tulehduksen 5 mittayksikkö, lasko (engl. Erythrocyte Sedimentation Rate, ESR), muuttuu paljon hitaammin. Se ei suurene oleellisesti ennen kuin yhden viikon jälkeen tulehduksen alkamisesta, ja vastaavasti sen puoliintumisaika on viikkoja. Infektiotautien erotusdiagnostiikassa pelkällä ESRrllä ei ole erityistä arvoa.

10 Käytännön kliinisessä työssä olisi erittäin tärkeää, että olisi myös muita kuin mikrobiologisia välineitä arvioitaessa virus- tai bakteeri-infektion mahdollisuutta potilaan kliinisen tilan huononemisen aiheuttajana. Niinpä luotettava ja nopea infektion, tai infektoi-van aineen luonteen, havaitseminen on tärkeää, jotta pystytään tekemään oikea diagnoosi. Sitten voidaan aloittaa infektion oikea hoito niin pian kuin mahdollista, tai voidaan 15 kunnolla arvioida, onko tulehduksenvastainen hoito lainkaan tarpeellista. Siten voidaan välttää pitkittynyt sairaalahoitoja laskimonsisäinen antibioottihoito.

On tunnettua, että erilaiset sairaudet aiheuttavat muutoksia valkosolun pinnan reseptorien määriin. Sellaisia reseptoreita on tutkittu esimerkiksi atoopikoilla ja syöpäpotilailla. 20 Leino ja muut (1997) ja Isolauri ja muut (1997) ovat tutkineet reseptorimuutoksia kuu-•. v meisissa ja vastaavasti atooppisissa potilaissa. Tietoa sellaisten tilojen reseptorimuutok- •.:. sista ei kuitenkaan ole sovellettu erotusdiagnostiikassa, eikä sellaista tietoa ole yhdistet- ' ’ ty ESR-tuloksiin tai kokoveren kerniluminesenssivasteen tuloksiin, so. solun aktivaation • · · * » * ‘ tasoon, kuten on tehty esillä olevassa keksinnössä.

T: 25 * · Keksinnön yhteenveto ’;; Olemme nyt kehittäneet menetelmän, jonka avulla pystytään nopeasti havaitsemaan ’!' infektion lähde potilaassa, so. nopean menetelmän sen havaitsemiseksi, onko havaittu

* * I

'·'>' 30 infektio bakteeri-vai virusperäinen.

Esillä olevan keksinnön mukainen menetelmä perustuu fagosyyttisten solujen pintare-•, ’ · septorien analyysiin, sekä soluaktivaation tasoon. Menetelmä toteutetaan määrittämällä ääreisveren fagosyyttisten solujen komplementtitekijän 1 (CR1) ilmentyminen. Lisäksi 3 115165 määritetään kokoveren kemiluminesenssivaste ei-opsonisoitua tsymosaania (NWBCL) vastaan. Keksinnön edullisessa suoritusmuodossa määritetään myös verinäytteen lasko (ESR).

5 Niinpä edellä osoitettujen mittausten perusteella olemme kehittäneet kaksi yhtälöä, joita voidaan käyttää asiaankuuluvien arvojen laskemiseksi diagnoosia varten. Saatuja arvoja verrataan sitten bakteeri-ja virusinfektioiden menetelmäspesifisiin keskiarvoihin.

Esillä olevan keksinnön pääasiallisena kohteena on siten menetelmä bakteeri-infektion 10 erottamiseksi virusinfektiosta potilaassa. Keksinnön lisäkohteena on diagnostinen testi- välinesarja menetelmän toteuttamiseksi.

Seuraavassa kuvataan keksinnön edullisia suoritusmuotoja mukana oleviin piirustuksiin viitaten.

15

Lyhyt piirustusten kuvaus

Kuvio 1 Erilaisten reseptorien ilmentymisten (CD35 = CR1; CD1 lb = CR3; CD64 = FcyRI; CD32 = FcyRII; CD16 = FcyRIII) virtaussytometristen (keskimääräinen fluo-20 resenssi-intensiteetti, MFI) ja luminometristen (mV) määritysten vertailu.

M · ’ Kuvio 2 Neutrotiilien reseptorien ilmentyminen mitattuna virtaussytometrillä. (ko keiden I ja II arvot on yhdistetty. Kokeessa I aikaviive näytteenoton ja määritysten välillä oli 1 - 2 tuntia ennen määrityksiä, kokeessa II2 - 3 tuntia. Lisäksi kokeessa I käytet-25 tiin ultraäänellä käsiteltyä tsymosaania, kokeessa II ultraäänellä käsittelemätöntä tsymo- • · saania.) Potilasryhmät (diagnoosi): CB = kliininen bakteeri-infektio: diagnoosi tehty kliinisten oireiden perusteella; B = vahvistettu bakteeri-infektio: diagnoosi varmistettu ‘ i i; veri-, virtsa- tai kudosnäytteestä bakteerien mikrobiologisella viljelyllä tai serologisesti seerumi- ja/tai nenänielunäytteestä; COh = nollatunnin kontrollinäyte (välitön määritys); ‘ · i · ‘ 30 C3h = kolmen tunnin kontrollinäyte (näyte huoneenlämmössä 3 tuntia ennen määritys- * ·; *' tä); V = vahvistettu virusinfektio: diagnoosi vahvistettu virusvasta-ainemäärityksillä; '·“'· CV = kliininen virusinfektio: diagnoosi tehty kliinisten oireiden perusteella. A: CR1 '. ’ *: (MFI); B: FcyRII (MFI). Hepariini veren hyytymistä ehkäisevänä aineena.

4 11 5165

Kuvio 3 Monosyyttien ilmentyminen mitattuna virtaussytometrisesti. (Kokeet I ja II yhdessä) A: CR1 (MFI); B: FcyRI (MFI). Potilasryhmät kuten kuviossa 2. Hepariini veren hyytymistä ehkäisevänä aineena.

5 Kuvio 4 Kokoveren luminolilla vahvistettu kemiluminesenssi; NWBCL/μΙ verta. A: koe I; B: koe II. Potilasryhmät kuten kuviossa 2.

Kuvio 5 esittää yhtälöllä #1, CR1 x NWBCL/μΙ verta saadut tulokset, A: Koe I, B: Koe II. Potilasryhmät kuten kuviossa 2.

10

Kuvio 6 esittää yhtälöllä #2, CR1 x NWBCL/μΙ verta x ESR, saadut tulokset, A: koe I, B: koe II. Potilasryhmät kuten kuviossa 2.

Keksinnön yksityiskohtainen selitys 15

Lyhenteet CL kemiluminesenssi CR1 komplementtireseptori 1 CRP C-reaktiivinen proteiini 20 ESR lasko ·.·.·' gHBSS-puskuri Hankin tasapainotettu suolaliuos, jota on täydennetty 0,1% \j.: gelatiinilla *: * HBSS-puskuri Hankin tasapainotettu suolaliuos * * MFI keskimääräinen fluoresenssi-intensiteetti ’ * 25 mV millivolttia ’ · ·' NOZ ei-opsonoitu tsymosaani NWBCL kokoveren kemiluminesenssivaste ei-opsonoitua tsymosaa- •;;; nia vastaan [ilmaistu veren tilavuutta (μΐ) kohti] *” RT huoneenlämpötila 30 WB kokoveri • · •: * *: Tässä keksinnössä käytetty menetelmä perustuu siihen, että erilaiset sairaudet aiheutta- •.' · j vat muutoksia valkosolun pinnan reseptorien määrässä, ja että ne suurentavat solujen aktivaatiotasoa. Riippuu infektion aiheuttajasta, mikä erilaisista valkosolun suojausme- s 115165 kanismeista aktivoituu, ja kuinka laajalti aktivointi tapahtuu. Fagosyyttien aktivoinnissa lisääntyy tiettyjen reseptorien ilmentyminen solujen pinnalla, ja tämä ilmiö voidaan mitata käyttämällä spesifisiä leimattuja vasta-aineita. Tutkittavat reseptorit tunnetaan yleisesti neutrofiilien tai monosyyttien reseptoreina, jotka ovat mukana fagosytoosissa 5 ja komplementtitoiminnassa.

Tämän keksinnön mukaisen menetelmän mukaisesti reseptorimääritys toteutetaan esimerkiksi käyttämällä immuunireaktiota vasta-aineiden kanssa, jotka ovat spesifisiä kullekin reseptorille, käyttämällä virtaussytometristä analyysiä.

10

Keksinnön mukainen menetelmä toteutetaan yleisesti erottamalla fagosyytit infektiopo-tilaasta otetusta verinäytteestä, ja mittaamalla mainittujen solujen valkosolun pinnan reseptorin ilmentyminen. Verinäyte otetaan veren hyytymistä ehkäisevää ainetta sisältävään koeputkeen. Fagosyytit voidaan sitten erottaa verinäytteen punasolujen osmootti-15 sella lyysillä lisäämällä esimerkiksi NHjChää, ja pesemällä hajotettujen punasolujen jäännökset ja plasma verinäytteestä, jolloin jäljelle jäävät vain valkosolut.

Reseptorin ilmentymisen mittaamiseksi valkosolut leimataan kylmässä ympäristössä (noin +4 °C:ssa) fluoresenssileimatulla kyseiselle reseptorille spesifisellä monoklonaali-20 sella vasta-aineella. Kunkin solun (neutrofiilit ja monosyytit) keskimääräinen fluore-’.:,: senssi-intesiteetti (MFI) saadaan virtaussytometrisesti. Tuloksista saadaan kunkin solu- :: tyypin määrä, yhden pulssin vastatessa yhtä solua, ja mitattavan reseptorin määrää, sekä " *· ” * niiden solujen prosenttisosuus, joissa reseptoria on läsnä.

25 Reseptorin määritys voidaan kuitenkin suorittaa myös luminometrisesti. Virtaussyto- · · ‘ metriset reseptorin ilmentymiskokeet ovat suhteellisen kalliita, kun taas luminometriset määritykset ovat suhteellisen halpoja ja nopeita. Parhaimmillaan luminometrinen määri- f I t •;;; tys voidaan suorittaa sormenpään verestä käyttämällä luminometriä, jonka käyttö ei ** vaadi merkittävää laboratoriokokemusta.

30 ' · · · ‘ Kun reseptorin ilmentyminen mitataan luminometrisesti, leukosyytit leimataan samoilla ‘: ‘ ” monoklonaalisilla vasta-aineilla kuin virtaussytometriassa, mutta nyt luminesenssilei- « · :, ‘ · · mattuina, jolloin reseptorien määrä saadaan luminometrisesti luminesenssisignaalin (mV) suuruusluokkana.

6 115165

Luminometrinen reseptorin ilmentymismääritys toteutetaan edullisesti seuraavasti: Valkosolut leimataan ensin mitattavalle reseptorille spesifisellä primäärisellä monoklonaa-lisella vasta-aineella. Saatu seos pestään sopivalla puskurilla, ja sitten sitä inkuboidaan 5 entsyymikonjugaattiin kiinnittyneen sekundäärisen vasta-aineen kanssa. Entsyymikon-jugaatin substraattia lisätään seokseen, ja mitataan luminometrinen intensiteetti. Kaikki ne solut, joihin vasta-aine on kiinnittynyt, antavat valosignaalin.

Edullinen entsyymikonjugaatti esillä olevaan luminometriseen analyysiin on alkalinen 10 fosfataasi, jota on helppo käyttää ja jolle on saatavilla vakaa substraattiliuos. Lisäksi solun taustan mV-vasteen alentamiseksi valkosolujen alkalinen fosfataasi voidaan eliminoida estoaineella.

Keksinnön edullisessa suoritusmuodossa menetelmä toteutetaan seuraavasti: 15 Verinäyte otetaan potilaasta veren hyytymistä ehkäisevää ainetta sisältävään koeputkeen. Veren hyytymistä ehkäisevänä aineena voidaan käyttää esimerkiksi hepariinia tai EDTA:ta. Hepariini on edullinen esillä olevan keksinnön tarkoituksiin, koska kokeissamme erottumisen havaittiin olevan selvempi, kun käytettiin hepariinia, kuin jos käytetään veren hyytymistä ehkäisevänä aineena EDTA:ta.

20 : ’:': Seuraavaksi fagosyyttien aktivaatiotaso määritetään mittaamalla tsymosaanin fagosy- : : ’: toosi kokoveressä. Osa saadusta kokoverinäytteestä altistetaan sitten NWBCL- määritykseen, kuten edellä on määritelty, lisäämällä mainittuun verinäytteeseen ei-opso-’ ί ‘' '· noitua tsymosaania ja luminolia sopivassa puskurissa. Tsymosaani saa aikaan näytteessä ‘: : 25 läsnä olevien fagosyyttien kemiluminesenssin, ja mainittu kemiluminesenssi mitataan ;.,. · luminometrillä. On edullista käyttää valmistuksen aikana ultraäänellä käsiteltyä tsymo saania.

I t · i k * · · ·' Punasolut hajotetaan ja pestään pois ja määritetään komplementtireseptorin 1 (CR1) f L: 30 ilmentyminen jäljellä olevissa valkosoluissa. Jos ilmentyminen mitataan virtaussytomet- » t * :,,,: risesti, saadaan keskimääräinen fluoresenssi-intensiteettiarvo (MFI), joka osoittaa resepti ·< | torin keskimääräisen määrän solussa, erikseen kullekin solutyypille (neutrofiileille ja monosyyteille). Jos ilmentyminen mitataan luminometrisesti, luminesenssisignaali saa- • · daan millivoltteina (mV). Kuitenkin pitäisi huomata, että keskimääräinen fluoresenssi-

7 11516E

intensiteetti ei ole reseptorien määrän absoluuttinen mitta, vaan se antaa suhteellisen arvon, joka riippuu käytetystä vasta-aine-erästä sekä myös käytetystä laitteistosta. Sama pätee luminometrillä saatuihin mV-arvoihin.

5 Mukana oleva kuviot 2 ja 3 osoittavat virtaussytometrillä mitattujen neutrofiilien ja vastaavasti monosyyttien reseptorien ilmentymisarvot. Toisaalta kuviossa 1 esitetään, että virtaussytometrisesti ja luminometrisesti saadut tulokset ovat vertailukelpoisia keskenään. Lisäksi kuviossa 4 esitetään NWBCL-mittausten tulokset.

10 Edellä osoitettujen arvojen saamisen jälkeen laskutoimitukset diagnoosia varten tehdään yhtälöllä #1: CR1 x NWBCL (kuvio 5). Saatuja arvoja verrataan sitten menetelmäs-pesifisiin bakteeri-ja virusinfektioiden keskimääräisiin arvoihin.

Vielä edullisemmassa keksinnön suoritusmuodossa mitataan myös verinäytteen lasko 15 (ESR), ja edellä olevasta yhtälöstä #1 saatu arvo kerrotaan mainitulla ESR:llä, niin että saadaan yhtälö #2: CR1 x NWBCL x ESR (kuvio 6). Kun tätä yhtälöä käytetään, saadaan arvo, joka osoittaa hyvin selvän differentaation diagnoosissa.

On huomattava, että luminometrisellä menetelmällä saadaan koko valkosolupopulaation 20 reseptoreiden ilmentymistaso, kun taas virtaussytometria antaa tietoa yksittäisistä neut- : V: ro tiilien ja monosyyttien yksittäisistä reseptorien ilmentymisistä.

• · • · · • · · • · · **.*: Pitäisi myös panna merkille, että edellä olevista yhtälöistä saadut numeeriset arvot vaih- ’: *' · televat leimausmenettelystä riippuen, so. miten vasta-aineet on leimattu, tai kuinka on- ':‘: 25 nistunutta leimaaminen oli. Niinpä ei ole mahdollista antaa spesifisiä raja-arvoja, joiden • · · ·...' yläpuolella potilaalla voi olla esimerkiksi bakteeri-infektio, vaan saadut arvot ovat aina menetelmäspesifisiä. Esimerkiksi kun pystytetään menetelmiä, käytettävät vasta-aineet * . ·.' täytyy valita, ja samoja vasta-aineita pitää käyttää johdonmukaisesti sen jälkeen. Kun » · t ♦ · * · · · * vaihdetaan vasta-aine-erä, uusi erä (sen intensiteetti) pitää saattaa oikeaan suhteeseen •, · /· 30 edelliseen nähden. Lisäksi, kuten alan ammattilainen ymmärtää, on suositeltavaa ajaa > · * :: ensin kontrollinäytteet yhtälöistä saatavien numeeristen arvojen perustason määrittämi- •:»· · seksi. On myös suositeltavaa määrittää säännöllisesti menetelmäspesifiset kontrolliar- vot.

8 11516£

Edelleen on edullista toteuttaa määritykset niin pian kuin mahdollista verinäytteen ottamisen jälkeen, ja edullisesti kahden tunnin kuluessa, edullisemmin yhden tunnin kuluessa näytteen ottamisesta. Havaitsimme kokeissamme, että ero oli epäselvempi yli kaksi tuntia vanhoissa näytteissä. Mukana olevissa kuvioissa 5 ja 6 esitetään kahden erilaisen 5 kokeen tulokset. Kokeessa I (laatikko A kussakin mainitussa kuviossa) aikaviive näytteenoton ja määritysten välillä oli 1 - 2 tuntia, mutta kokeessa II (laatikot B) 2 - 3 tuntia. Niinpä vertailtaessa kontrolliarvoihin koetta I pitäisi vertailla 0 tunnin kontrolliin (COh), ja koeta II3 tunnin kontrolliin (C3h).

10 Esillä oleva keksintö koskee lisäksi diagnostista testivälinesaijaa keksinnön mukaisen menetelmän toteuttamiseksi, testivälinesaijan käsittäessä (1) välineet reseptorien ilmentymisen määrittämiseksi joko virtaussytometrisesti tai luminometrisesti, ja (2) välineet solujen fagosyyttisen aktiivisuuden luminometriseksi määrittämiseksi.

15 Virtaussytometrillä reseptorien ilmentymisen määrittämistä varten testivälinesaija käsit tää (1) määritettäville reseptoreille spesifisiä vasta-aineita, fluoresenssileiman, ja määrityksessä tarvittavat puskurit, sekä (2) luminolia ja ei-opsonoitua tsymosaania.

Luminometrialla reseptorien ilmentymisen määrittämistä varten testivälinesaija käsittää 20 (1) määritettäville reseptoreille spesifisiä primäärejä vasta-aineita, sekundäärisiä vasta- : V: aineita entsyymikonjugaattien kanssa, substraatin entsyymikonjugaatille, j a määrityk- • · : : sessä tarvittavia puskureita, sekä (2) luminolia ja ei-opsonoitua tsymosaania.

• * " ": Kokeet 25 : Tutkimuskohteet ja määritykset

I « I

...: Tulehdusnäytteet (n = 71,10 ml hepariinilla hyytymättömäksi tehtyä verta) otettiin sai-

IM I I

‘* raalahoidossa olevilta aikuisilta, heidän hyväksynnällään, Turun ylipistollisessa sairaa- 30 lassa. Kohteet jaettiin ryhmiin diagnoosien perusteella. Lyhenteet erilaisille kohderyh- « · · ! : mille ovat seuraavat: B: vahvistettu bakteeri-infektio; CB: kliininen bakteeri-infektio; i · 7 7 : · V: vahvistettu virusinfektio; CV: kliininen virusinfektio (katso kuvio 2, termien selityk- ;*·,· set). Määritettiin neutrofiilien ja monosyyttien reseptorien ilmentymiset, lasko, ja koko- i » veren kemiluminesenssivaste ei-opsonoitua tsymosaania vastaan (NWBCL).

9 11 51 6 £

Potilasalaryhmät ja kontrollit Näytteet analysoitiin kahdessa vaiheessa: koe I (n=38) (näytteet kerättiin joulukuun 5 1998 ja huhtikuun 1999 välisenä aikana) Ja koe II (n = 33) (näytteet kerättiin syyskuun 1999 ja toukokuun 2000 välisenä aikana). Aikaviive näytteenoton ja analyysin välillä oli 1 - 2 tuntia kokeessa I ja 2-3 tuntia kokeessa II sairaalan päivärutiinien takia. Tutkittiin pidentyneen aikaviiveen vaikutus reseptorien ilmentymiseen ja fagosyyttien CL-vasteeseen. Kokeen I tuloksia verrattiin perusviivaryhmään (n = 13) ja kokeen II tulok-10 siä 180 minuutin ryhmään (n = 13). Lisäksi kokeessa II ja 180 minuutin kontrolleissa CL-määritykset tehtiin ultraäänellä käsittelemättömällä tsymosaanilla, jotta voitiin tutkia hiukkaskoon vaikutusta kemiluminesenssivasteisiin. Lyhenteet kahdelle kontrolliryhmälle ovat COh: perusviivakontrollinäytteet 0 tunnin säilytyksen jälkeen; C3h: 180 minuutin kontrollinäytteet 3 tunnin säilytyksen jälkeen.

15 Käytetyt aineet ja menetelmät Verinäytteiden kerääminen ja valmistaminen 20 Laskimoverinäytteet kerättiin tutkimuskohteilta hepariinia sisältäviin koeputkiin. 1 ml : V: hyytymätöntä verta sekoitettiin 10 ml:n kanssa 0,83 % NH4Cl:ää, joka sisälsi 370 mg/1 • · : : dinatrium-EDTA:ta. Suspensiota pidettiin huoneenlämmössä (RT) 15 minuuttia, minkä ·:*·: jälkeen valkosoluja sentrifugoitiin 10 minuuttia nopeudella 400 x g. Valkosolut uudel- *: ‘ ’ ί leensuspendoitiin 1 ml:aan gHBSS-puskuria.

25 • · · •,,, · Lasko (ESR) mitattiin tavanomaisella tavalla.

...: Ei-opsonoidun tsymosaanin (NOZ) valmistaminen I I > • » • · • · · : 30 Tsymosaania A, (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), joka on Saccharomyces L,,: cerevisiaen soluseinämävalmistetta, käytettiin fagosytoituvana hiukkasena luminometri- .... I sissä "respiratory burst" -tutkimuksissa. Tsymosaania A (20 mg/ml HBSS-puskuri) ·,*· ,· kuumennettiin kiehuvassa vesihauteessa 20 min ja hajotettiin voimakkaalla ultraäänikä- • · sittelyllä, 20 sekuntia 11 mikronin huipusta-huippuun-amplitudilla, pestiin kahdesti

10 11516E

HBSS-puskurilla. Varastoliuosta (20 mg NOZ/ml HBSS-puskuria) käytettiin lu-minometrisiin kokeisiin.

Luminolilla vahvistetun kemiluminesenssin mittaaminen 5

Tsymosaanilla indusoidussa kokoveren kemiluminesenssimäärityksessä (NWBCL) re-aktioseos sisälsi 0,5 ml:n kokonaistilavuuden gHBSS:ää, joka sisälsi 0,4 mM luminolia, 1 mg NOZ:ia ja 100 nl hepariinilla hyytymättömäksi muutettua kokoverta (WB). Kont-rollikyveteissä tsymosaani korvattiin gHBSSrllä. Ensin puskuria, luminolia ja tsymo-10 saania inkuboitiin +37 °C:ssa 30 minuuttia reaktiolämpötilan stabiloimiseksi, ja erotettuja valkosoluja tai kokoveren laimennosta (molemmat pidetty huoneenlämpötilassa siihen saakka, kunnes niitä käytettiin) lisättiin reaktion aloittamiseksi. Reaktio mitattiin kahtena rinnakkaisena BioOrbit 1251 -luminometrillä MultiUse 2.01 -ohjelmistolla (Bi-oOrbit Ltd., Turku, Suomi) +37 °C:ssa. Fagosyyttien CL-emissiokyky ilmaistiin huip-15 puaika-arvona (mV) 60 minuutin jakson aikana ja huippuarvon saavuttamiseen tarvittava aika huippuarvona (min). Tulokset ilmaistaan huippuarvona mV/μΙ kokoverta.

Reseptorien ilmentymisen mittaaminen virtaussytometrillä 20 Valkosolureseptorien ilmentymisen mittaaminen suoritettiin käyttämällä fluoresenssi-: #^! leimattuja (FITC tai PE) reseptonspesmsiä monoklonaalisia vasta-ameita. Käytetyt • i ·, · mAbsrit ostettiin Immunotech'ilta.

• * *·" ‘ Ennen reseptorin ilmentymisen mittauksia valkosoluja (3 x 105) inkuboitiin 50 pl:ssa ' *' · 25 gHBSS:ää monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa (0,4 pg) polystyreenivirtaussytomet-

i · I

*...' ripulloissa 30 minuuttia +4 °C:ssa. Inkuboinnin jälkeen solut pestiin kerran kylmällä gHBSSdlä (400 x g, 5 min) ja uudelleensuspendoitiin kylmään gHBSSrään. Valkosolut f < * • · ·: värjättiin irrelevanteilla hiiren immunoglobuliineilla, jotka toimivat kontrollina leuko- • t ’ ; syytin autofluoresenssin korjaamiseksi. Reseptorin ilmentymisen suhteellinen määrä ·’,·,· 30 saatiin määrittämällä 5000 valkosolun keskimääräinen fluoresenssi-intensiteetti virtaus- <«i :sytometrillä (EPICS XL -virtaussytometri argonionilaserin kanssa 488 nm viritysaal-*:··: lonpituudella (Coulter, Miami, Florida, USA)). Erilliset tulokset neutrofiileille ja mono- i t t * * j syyteille saatrm MFI:nä.

11 115165

Valkosolujen reseptorien ilmentymisen mittaaminen luminometrillä

Luminometrisessä reseptorien ilmentymismäärityksessä koko verta (3 x 105 valkosolua/-50 μΐ), joka oli hajotettu N^Clilla, inkuboitiin 30 min +4 °C:ssa hiiressä tuotettujen 5 leimaamattomien primääristen reseptorispesifisten monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa (0,4 pg) (Immunotech). Inkuboinnin jälkeen ylimääräinen vasta-aine pestiin pois 500 piillä HBSS-puskuria (0,1 % Na-atsidi) (400 x g, 5 min), minkä jälkeen reseptoreihin sitoutuneet vasta-aineet havaittiin vuohen anti-hiiren vasta-aineella AF-F(ab’)2 (Zymed) leimattuna sekundäärisellä alkalisella fosfataasilla (AF). Sekundäärinen lei-10 maaminen suoritettiin 50 μ1:η tilavuudessa (HBSS) 30 min +4 °C:ssa. Inkuboinnin jälkeen ylimääräinen AF-leimattu sekundäärinen vasta-aine poistettiin pesemällä solut kolme kertaa 500 piillä HBSS-puskuria (0,1 % Na-atsidi) (400 x g, 5 min). Pesujen jälkeen solupelletit suspendoitiin nopeasti 270 pilaan emäksistä fosfataasisubstraattiliuosta (jossa oli 42 mg/ml substraattia (AMPPD, Zymed) ja 1/25 endogeenisen AF:n (Leva-15 misole, Zymed) estäjän laimennosta. 250 μΐ solususpensiota substraattiliuoksessa siirrettiin luminometrikyvettiin (polystyreeniä) jakemiluminesenssi mitattiin luminometril-lä. Valkosolujen reseptorien ilmentyminen annettiin millivoltteina (mV). Kemilumine-senssi mitattiin myös kolmessa erilaisessa taustakyvetissä: . , 20 1. Vain substraattiliuos • * » ’ 2. Vain solut • * » • ♦ · 3. Solut + AF-leimattu sekundäärinen vasta-aine * · · * ♦ * ♦ • · * « · _ . Taustakyvettejä käsiteltiin samalla tavalla kuin reseptorimittauskyvettejä.

• · 25 • ·

Sytometristen ja luminometristen määritysten vertailu • * * > ."'. Kuviossa 1 esitetään vastaavuussuhde virtaussytometrillä ja luminometrillä mitattujen M» reseptorien ilmentymisten välillä. Virtaussytometrisissä mittauksissa käytettiin samoja • · · _ i!! f 30 primäärisiä vasta-aineita kuin luminometrisissä mittauksissa, mutta sekundäärisenä vas- • » * * * > * > ta-aineena käytettiin FITC-leimattua vuohen anti-hiiren IgG-vasta-ainetta (FITC- F(ab’)2, Zymed). Molemmissa menetelmissä näytteitä käsiteltiin rinnakkain samalla • · · * : tavalla, mutta virtaussytometrisissä määrityksissä substraattiliuos korvattiin 500 piillä HBSS-puskuria, minkä jälkeen tehtiin virtaussytometrinen määritys. Kuvio 1 näyttää, i2 11 51 β r että luminometrinen määritys vastaa hyvin virtaussytometristä määritystä. Koska mainittu kuvio pyrkii havainnollistamaan näiden kahden määrityksen vastaavuussuhdetta, määritettiin myös komplementtireseptorin 3 (CR3) ja FcyRIILn ilmentyminen, huolimatta siitä, että näiden reseptorien ilmentymistä ei tarvita keksinnön mukaisissa yhtä-5 löissä (katso kuvion 1 selitteet).

Tulokset

Neutrofiilien reseptorien ilmentyminen 10

Vahvistetuissa ja kliinisissä bakteeri-infektioissa CR1 :n ilmentyminen on nelin- tai viisinkertainen verrattuna vahvistettuihin virusinfektioihin tai kontrolleihin (p < 0,001), virusinfektioiden ollessa hieman alle kontrollien (kuvio 2A). FcyRII:n ilmentyminen on vähäisempää virusinfektiossa vahvistettuun bakteeri-infektioon ja, yllättävästi, myös 15 kontrolleihin (p < 0,05) (kuvio 2B) verrattuna.

Monosyyttien reseptorien ilmentyminen

Neutrofiileissä bakteeri-infektio lisää CR1 :n ilmentymistä monosyyteissä (kuvio 3A).

20 Kasvu on nelinkertainen verrattuna 0 tunnin kontrollinäytteisiin (p < 0,001) ja kaksin- '**;* kertainen (p < 0,001) verrattuna virusinfektioon tai 180 minuutin kontrolleihin. Baktee- • · · • · · * * *. ri-infektiossa CR1 :n ilmentyminen monosyyteissä on noin 65 prosenttia neutrofiilien . vastaavasta. Monosyytti-FcyRLn ilmentyminen oli merkitsevästi vähäisempää molem- * · missä kontrolliryhmissä (p < 0,001) kuin bakteeri- ja virusinfektioissa (kuvio 3B). Toi- • · .··*, 25 sin kuin neutrofiileissä, virus-ja bakteeri-infektioiden välillä ei ollut eroja FcyRLn il- • · • I » mentymisessä monosyyteissä.

; ’ ’ ; Kemiluminesenssi » t · , · - · _ 30 Kokeiden I ja IINWBCL-vasteet on esitetty kuvioissa 4A ja 4B. Kokeessa I, NWBCL- • | • > vaste vahvistetussa bakteeri-infektiossa oni merkitsevästi suurempi (p < 0,001) verrat- » » . , tuna kontrolliin (COh) ja virusinfektioon, kun taas kokeessa II, jossa käytettiin ultraää nellä käsittelemätöntä tsymosaania, NWBCL-vasteessa ei ollut merkitsevää eroa kontrollien (C3h) ja potilaiden välillä. Niinpä on ilmeistä, että mitä suurempi niiden hiuk- 13 11 51 6 £ kasien koko, jotka indusoivat reaktiivisten happilaatujen (ROS) tuotantoa ja mitä pitempi verinäytteen säilytysaika on, sitä vähemmän käyttökelpoinen on NWBCL-vaste erotettaessa bakteeri-infektiota virusinfektiosta.

5 Laskutoimitukset diagnoosia varten

Yhtälö #1

Mitatuista muuttujista NWBCL-vaste, CR1 :n ilmentyminen ja ESR ovat kaikki vahvasti 10 suurentuneet bakteeri-infektiossa. Tässä hakemuksessa on osoitettu, että kaikkia näitä muuttujia voidaan käyttää bakteeri-ja virusinfektioiden erottamisessa. Koska tsymosaa-nihiukkasten kokoja näytteiden erilaiset säilöntäaikaviiveet vaikuttavat suuresti NWBCL-vasteisiin ja reseptorien ilmentymisiin, tulokset on ilmaistu erikseen kokeelle I ja kokeelle II. Yksinkertaisin arvo, jota voidaan käyttää luokitteluun, voidaan laskea 15 CR1 x NWBCL:nä (yhtälö #1).

Yhtälön #1 tulos on merkitsevästi suurempi (p < 0,001) bakteeri-infektioissa verrattuna virusinfektioihin ja perusviivakontrolleihin (kuvio 5 A). 180 minuutin kontrollien NWBCL-vaste, joka on saatu aikaan sonikoimattomalla tsymosaanilla, on yhtä suuri 20 kuin bakteeri-infektioiden vaste. Huolimatta merkitsevistä eroista bakteeri-infektioiden ’ . ‘ ja virusinfektioiden tai 180 minuutin kontrollien (p < 0,01) välillä, NWBCL-vaste, jon- ' · · · * ka on saanut aikaan ultraäänellä käsittelemätön tsymosaani, hämärtää nämä erot (kuvio : ’ : 5B).

• · 4 » 25 Yhtälö #2 t · * « .·

Lisäämällä termi ESR yhtälöön #1 saadaan yhtälö #2, joka voidaan kiqoittaa kaavalla # > ‘ CR1 x NWBCL x ESR. Yhtälön #2 kyky erottaa bakteeri-infektiot virusinfektioista on * » * ' · ‘ melkein yhtä suuri kuin yhtälön #1 kokeessa I (kuvio 5A kuviota 6A vastaan), mutta se

• · I

‘;;; ’ 30 parantaa erityisesti erotuskykyä bakteeri- ja virusinfektioiden välillä kokeessa II (kuvio ·; 5B kuviota 6B vastaan).

• · • · i4 1151 6 Γ

Viitejulkaisut

Isolauri, E., Pelto, L., Nuutila, J., Majamaa, H., Lilius, E.M., Salminen, S. (1997). Altered expression of IgG and complement receptors indicates a significant role of phago-5 cytes in atopic dermatitis. J. Allergy Clin. Immunol. 99, 707-713.

Leino, L., Sorvajärvi, K., Katajisto, J., laine, M., Lilius, E.M., Pelliniemi, T.T., Rajamäki, A., Silvoniemi, P, Nikoskelainen, J. (1997). Febrile infection changes the expression of IgG Fc receptors and complement receptors in human neutrophils in vivo. Clin. Exp. 10 Immunol. 107, 37-43.

• I

• « • 1 · • 1 · • t I » · • · »14 • · a • · t · • · » • · » * · t

a I I I

• » 1 V ·

Claims

115165

1. Menetelmä bakteeri-infektion erottamiseksi virusinfektiosta potilaassa, jossa menetelmässä 5 (a) otetaan potilaasta verinäyte veren hyytymistä ehkäisevää ainetta sisältävään koe putkeen, (b) mitataan mainitussa verinäytteessä ei-opsonoidulla, ultraäänellä käsitellyllä tsymo-saanilla (NWBCL) indusoitu fagosyyttien kemiluminesenssi, ilmaistuna veren tilavuutta kohti, 10 (c) erotetaan verinäytteen punasolut valkosoluista lyysillä, (d) määritetään valkosoluista komplementtireseptorin 1 (CR1) ilmentyminen, (e) kerrotaan vaiheessa (b) saatu arvo vaiheessa (d) saadulla arvolla, ja (f) verrataan näin saatua arvoa bakteeri-ja virusinfektioiden menetelmäspesifisiin keskiarvoihin, 15 jolloin vaiheet (b) - (d) suoritetaan kahden tunnin kuluessa verinäytteen ottamisesta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa veren hyytymistä ehkäisevä aine on hepariini.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa vaiheet (b) - (d) suoritetaan yhden ' · ‘' tunnin kuluessa verinäytteen ottamisesta.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa vaiheessa (e) käytetään yhtälöä * * » » · ] ’CR1 x NWBCL/μΙ verta’, jossa CR1 on komplementtireseptorin 1 ilmentyminen. 25 • * ...

’ “ 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, joka käsittää lisävaiheen, jossa todetaan verinäytteen laskon (ESR) arvo ja kerrotaan vaiheessa (e) saatu arvo mainitulla ESR-’ ’_ arvolla. ;; ;* 30

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, jossa käytetään yhtälöä ’CR1 x ’;' NWBCL/μΙ verta x ESR’, jossa CR1 on komplementtireseptorin 1 ilmentyminen. 1

’: 7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukainen menetelmä, jossa CR1 :n ilmentyminen määritetään virtaussytometrisesti. 1« 11 51 65

8. Diagnostinen testivälinesaqa patenttivaatimuksen 7 mukaisen menetelmän toteuttamiseksi, joka testivälinesaqa sisältää - monoklonaalisen vasta-aineen, joka on spesifinen komplementtireseptorille 1, 5. fluoresenssileiman mainitulle vasta-aineelle, - virtaussytometriseen analyysiin tarvittavat puskurit, luminolia ja ei-opsonoitua tsymosaania ja - kujalliset ohjeet, joissa esitetään yhtälöt #1 ja #2 diagnoosia varten tarvittavan arvon laskemiseksi. 10

9. Jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukainen menetelmä, jossa CR1 :n ilmentyminen määritetään luminometrisesti.

10. Diagnostinen testivälinesaqa patenttivaatimuksen 9 mukaisen menetelmän toteutta-15 miseksi, joka testivälinesaqa sisältää - komplementtireseptorille 1 spesifisen primäärisen monoklonaalisen vasta-aineen, sekundäärisen vasta-aineen, joka tunnistaa mainitun primäärisen vasta-aineen, mainitun sekundäärisen vasta-aineen ollessa konjugoituneena entsyymileimaan, 20 - substraatin entsyymille, • · ’.'. 1 - luminometriseen analyysiin tarvittavat puskurit, • « · '··>' - luminolia ja ei-opsonoitua tsymosaania ja - kirjalliset ohjeet, joissa esitetään yhtälöt #1 ja #2 diagnoosia varten tarvittavan • · t I « arvon laskemiseksi. » • · • · • « * · · * 1 · » • 1 I • t • « · • · · • · · • » » t • · · · • · > * 1 » 17 1151657