ES3073237T3 - Bifunctional peptide with mucoadhesive and virus binding properties - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un péptido bifuncional que comprende una porción de unión a virus (2) y una porción de unión a mucina (1) unidas covalentemente a la porción de unión a virus (2). La porción de unión a virus se selecciona entre péptidos que se unen al SARS-CoV-2, al virus de la influenza A, al virus de la influenza B, a rinovirus y otros enterovirus, al virus de la parainfluenza humana y/o al metapneuvirus. La porción de unión a mucina se selecciona entre lectinas como el factor trefoil 3. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Péptido bifuncional con propiedades mucoadhesivas y de unión a virus

[0003] La presente invención se refiere a un péptido bifuncional de acuerdo con el preámbulo de la reivindicación 1, al uso médico de tal péptido de acuerdo con el preámbulo de la reivindicación 8, a un medicamento que comprende tal péptido de acuerdo con el preámbulo de la reivindicación 11, y a un método para fabricar tal péptido de acuerdo con el preámbulo de la reivindicación 13.

[0004] La actual pandemia de SARS-CoV-2 ilustró que los patógenos víricos emergentes y recurrentes representan una amenaza constante para la población humana, lo que exige una respuesta rápida y específica para contener la propagación vírica. A pesar de la rápida implementación de medidas de higiene para frenar la transmisión vírica, las vacunas y la terapia antivírica son las principales medidas contra las enfermedades infecciosas. Sin embargo, el desarrollo y las pruebas de las vacunas suelen requerir varios años. La terapia antivírica proporciona una solución rápida para tratar a las personas ya infectadas. Los compuestos orgánicos pequeños predominan en el grupo de los antivíricos, a diferencia de las moléculas más grandes, tales como proteínas o péptidos. Sin embargo, el desarrollo de nuevos fármacos de molécula pequeña es complejo debido a su química a menudo intrincada, lo que dificulta la realización de cribados con una amplia diversidad de análogos de compuestos diferentes. Además, el desarrollo de resistencia es un problema creciente, como resulta evidente con los fármacos antivíricos contra la gripe, tales como oseltamivir o amantadina.

[0005] El tratamiento profiláctico como medida adicional contra la pandemia de SARS-CoV-2 no se usa actualmente, lo que representa una oportunidad perdida que podría aportar diversas ventajas.

[0006] Werner Hoffmann (Hoffmann, Werner. "Trefoil factor family (TFF) peptides and their different roles in the mucosal innate immune defense and more: An update". Current Medicinal Chemistry 28.36 (2021): 7387-7399) describe un heterodímero formado por el factor trefoil (TFF3) y la proteína de unión a IgG-Fc (FCGBP).

[0007] Lauster et al. (Lauster, Daniel, et al. "Multivalent peptide-nanoparticle conjugates for influenza-virus inhibition". Angewandte Chemie International Edition 56.21 (2017): 5931-5936.) describen nanopartículas multivalentes de péptidos y polímeros que se unen con afinidad nanomolar al virus de la gripe a través de su proteína de la espícula, la hemaglutinina. Los autores pudieron demostrar in vitro que, al aumentar el tamaño del armazón polimérico y ajustar la densidad peptídica, la infección vírica se redujo drásticamente.

[0008] Un objeto de la presente invención es proporcionar sustancias novedosas útiles en el tratamiento profiláctico de enfermedades víricas, idealmente evitando la infección vírica.

[0009] Este objeto se logra con un péptido que posee los elementos de la reivindicación 1. Tal péptido es un péptido bifuncional que comprende un resto de unión a virus y un resto de unión a mucina que está unido covalentemente al resto de unión a virus. La unión entre el resto de unión a virus y el resto de unión a mucina puede ser una unión covalente directa o una unión mediante un enlazador.

[0010] El resto de unión a virus comprende o es un péptido que es al menos un 95 %, en particular al menos un 96 %, en particular al menos un 97 %, en particular al menos un 98 %, en particular al menos un 99 %, en particular un 100 %, idéntico a la SEQ ID NO.48.

[0011] La SEQ ID NO. 48 describe un péptido particularmente adecuado para la unión al virus de la gripe A (en particular las cepas H1, H3, H7). Este péptido se dirige a la hemaglutinina (proteína HA) del virus de la gripe A y se describe por Memczak et al. y Miriam Hoffmann et al.

[0012] Las SEQ ID NO. 2 a 13 y 23 a 43, como se divulgan en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, se refieren a restos de unión a virus que son particularmente adecuados para la unión al coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV-2). Si bien las SEQ ID NO.2, 3 y 23 a 41 se refieren a péptidos de unión a virus lineales, Las SEQ ID NO. 4 a 13, 42 y 43 se refieren a péptidos parcialmente ciclados, denominados péptidos grapados. Comprenden al menos un puente entre dos aminoácidos no directamente consecutivos (pero sí cercanos). Este puente actúa como una grapa y contribuye a la estabilización del péptido correspondiente. El puente se puede establecer mediante las dos cadenas laterales de los residuos de aminoácidos correspondientes o mediante un resto químico que está unido covalentemente a los residuos de aminoácidos respectivos, además de a sus cadenas laterales habituales. En el caso de las SEQ ID NO. 42 y 43, el puente es un puente disulfuro formado entre dos residuos de cisteína.

[0013] Las SEQ ID NO. 49 y 50, como se divulgan en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, describen péptidos particularmente adecuados para la unión al virus de la gripe A (en particular, la cepa H5N1, clado 2.3.4, cepa aviar). Estos péptidos se dirigen a la hemaglutinina (proteína HA) del virus de la gripe A y proceden de secuencias del anticuerpo 65C6 descritas por Zuo et al.

[0014] Las SEQ ID NO. 51 y 52, como se divulgan en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, describen péptidos particularmente adecuados para la unión al virus de la gripe A (en particular, la cepa H5N1, clado 2.3.2.1, cepa aviar). Estos péptidos se dirigen a secuencias específicas de la hemaglutinina (proteína HA) que se encuentran en general en la proteína HA de variantes de esta cepa, por ejemplo, en las secuencias de la proteína HA descritas por Bui et al.

[0015] Las SEQ ID NO. 53 y 54, como se divulgan en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, describen péptidos particularmente adecuados para la unión al virus de la gripe B. Estos péptidos se dirigen a la neuraminidasa del virus de la gripe B y se describen por Madsen et al.

[0016] Las SEQ ID NO. 55 y 56, como se divulgan en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, describen péptidos particularmente adecuados para la unión a rinovirus (RV) y otros enterovirus (EV). Estos péptidos proceden de anticuerpos anti-RV que se describen por Hrebik et al., Khan et al. y Smith et al.

[0017] La SEQ ID NO. 57, como se divulga en el presente documento, pero que no forma parte de la invención reivindicada, describe un péptido particularmente adecuado para la unión al virus de la parainfluenza humana (VPIH) (en particular, las cepas HIPV1 y HIPV3). Este péptido se dirige a la proteína de fusión (proteína F) del VPIH y procede de los anticuerpos anti-VPIH descritos por Cabán et al.

[0018] Las SEQ ID NO. 58, 59 y 60, como se divulgan en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, describen péptidos particularmente adecuados para la unión al metapneuvirus (MPV) y al virus sincitial respiratorio (VSR) (en particular, subtipo A y/o subtipo B). Estos péptidos se dirigen a la proteína de fusión (proteína F) del MPV y del VSR. Proceden de anticuerpos anti-VPIH y se describen por Cabán et al.

[0019] Las SEQ ID NO. 61, 62 y 63, como se divulgan en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, describen péptidos particularmente adecuados para la unión al VSR (en particular, subtipo A y/o subtipo B). Estos péptidos también se dirigen a la proteína de fusión (proteína F) del VSR y se describen por Issmail et al., Zhu et al. y McLellan et al.

[0020] El resto de unión a mucina comprende o es un péptido que es al menos un 95 %, en particular al menos un 96 %, en particular al menos un 97 %, en particular al menos un 98 %, en particular al menos un 99 %, en particular un 100 %, idéntico a la SEQ ID NO. 1 (factor trefoil 3 modificado, TFF3 (C57K)), SEQ ID NO. 14 (TFF3 natural), SEQ ID NO. 20 (TFF1 natural), SEQ ID NO. 21 (TFF2 natural) o SEQ ID NO. 22 (jacalina). Estas lectinas son particularmente adecuadas para dirigirse a la mucosa intestinal del paciente. TFF3 es una proteína producida de forma natural en las vías respiratorias (Thim et al., 2002).

[0021] El péptido reivindicado actualmente es capaz de fortalecer la función de barrera natural del moco respiratorio. El moco respiratorio es la primera barrera física que encuentran los patógenos respiratorios al acercarse a sus células diana en el epitelio respiratorio. Gracias a su alta viscosidad y sus propiedades de unión microbiana, el moco es una parte importante del sistema de defensa antimicrobiana de nuestro organismo y elimina eficazmente los patógenos adsorbidos mediante el movimiento ciliar. El péptido reivindicado actualmente se puede usar para fortalecer el moco aumentando sus propiedades antimicrobianas mediante la incorporación de sitios de unión para patógenos víricos (aumento del moco). A continuación, los patógenos retenidos se pueden eliminar antes de alcanzar la capa de células epiteliales, previniendo así la infección. Por lo tanto, el presente enfoque consiste en usar péptidos biomiméticos modulares para aumentar y respaldar la eficacia antivírica del moco.

[0022] El aumento del moco es un concepto nuevo para proteger a las personas contra las infecciones respiratorias. El presente enfoque se puede combinar con otras medidas (no) farmacológicas para reducir el riesgo de infección en personas no infectadas y el riesgo de transmisión y enfermedad grave en personas ya infectadas.

[0023] El péptido reivindicado actualmente constituye el núcleo de un sistema ajustable basado en péptidos, con una molécula capaz de adherirse a las mucinas de las vías respiratorias y específicamente de absorber virus. Ambas partes del péptido se pueden adaptar para responder a situaciones que cambian rápidamente. Este enfoque biomimético refuerza las propiedades antivíricas naturales del moco y, dado que los componentes del péptido proceden de proteínas humanas, se considera que los efectos secundarios son mínimos. El péptido bifuncional también se puede usar terapéuticamente en pacientes infectados, ya que atrapa los virus liberados por las células infectadas, reduciendo así la carga vírica y su diseminación al ambiente. Por último, el presente enfoque se puede combinar con medidas antivíricas ya establecidas, lo que ayuda a reducir el riesgo de infección y minimizar el riesgo de enfermedad.

[0024] Debido a la composición modular del péptido reivindicado, ambos restos funcionales del péptido se pueden adaptar para la aplicación deseada.

[0025] Un enlazador adecuado para establecer una unión covalente entre el resto de unión a mucina y el resto de unión a virus es un enlazador de polietilenglicol (PEG) o un enlazador de aminoácidos que comprende de 1 a 20 aminoácidos, en particular de 2 a 19 aminoácidos, en particular de 3 a 18 aminoácidos, en particular de 4 a 17 aminoácidos, en particular de 5 a 16 aminoácidos, en particular de 6 a 15 aminoácidos, en particular de 7 a 14 aminoácidos, en particular de 8 a 13 aminoácidos, en particular de 9 a 12 aminoácidos, en particular de 10 a 11 aminoácidos. Un dipéptido, tal como un dipéptido GT, es un enlazador particularmente adecuado. Un enlazador que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, en particular al menos un 96 %, en particular al menos un 97 %, en particular al menos un 98 %, en particular al menos un 99 %, en particular un 100 % idéntica a la SEQ ID NO. 44, SEQ ID NO. 45, SEQ ID NO. 46 o SEQ ID NO. 47, es también un enlazador particularmente adecuado. La SEQ ID NO. 44 es un ejemplo de enlazador flexible. La SEQ ID NO. 45 es un ejemplo de enlazador rígido. La SEQ ID NO. 46 representa un péptido de unión resultante de una reacción de acoplamiento quimioenzimático mediante Sortasa A. La SEQ ID NO. 47 representa un péptido de unión resultante de una reacción de acoplamiento quimioenzimático mediante transglutaminasa. El resto de unión a virus o el péptido del resto de unión a mucina se acopla al residuo de glutamilo (Q7) mediante un enlace isopeptídico γ-glutamil-ε-lisilo.

[0026] En una realización, el resto de unión a mucina comprende un dominio de unión a glicotopo y se une a un disacárido de N-acetilglucosamina-alfa-1,4-galactosa (GlcNAc-α-1,4-Gal) con una afinidad de al menos 150 µM, en particular de al menos 100 µM, en particular de al menos 75 µM, en particular de al menos 50 µM, en particular de al menos 25 µM, en particular con una afinidad comprendida en un intervalo de 25 µM a 150 µM, en particular de 50 µM a 125 µM, en particular de 75 µM a 100 µM. El disacárido GlcNAc-α-1,4-Gal es un glicotopo que está presente específicamente en las mucinas, tales como la mucina 2 (Muc2), la mucina 5AC (Muc5AC) y la mucina 6 (Muc6). Para dar un ejemplo, el factor trefoil 3 (TFF3) natural tiene una afinidad de unión al disacárido GlcNAc-α-1,4-Gal de 56 µM (Järvå et al 2020). En una realización, el resto de unión a virus está unido covalentemente al resto de unión a mucina en el aminoácido 57 del resto de unión a mucina. En una realización, el aminoácido 57 es un residuo de cisteína. En una realización, el aminoácido 57 es un residuo de lisina. En una realización, el resto de unión a virus está unido covalentemente al resto de unión a mucina en el extremo C del resto de unión a mucina. En particular, en esta última realización, no tiene especial importancia para la capacidad de unión al resto de unión a virus qué aminoácido está presente en la posición 57 (o en cualquier otra posición) del resto de unión a mucina.

[0027] En una realización, el péptido comprende al menos dos restos de unión a virus. En este contexto, el resto de unión a mucina está unido covalentemente, directamente o a través de un enlazador, al menos a uno de al menos dos restos de unión a virus. El resto de unión a mucina también puede estar unido a más de un resto de unión a virus. Para este fin, un enlazador bifurcado es, en una realización, particularmente útil. Tal enlazador bifurcado puede usarse para acoplar un único resto de unión a mucina a una pluralidad de restos de unión a virus que, después del acoplamiento, están dispuestos más o menos equidistantes del resto de unión a mucina.

[0028] Se divulga con el presente documento, aunque no forma parte de la invención reivindicada, la posibilidad de que el resto de unión a virus sea un resto que esté adaptado para unirse a una proteína de la espícula vírica.

[0029] En una realización, el resto de unión a virus es un péptido. En una realización, el resto de unión a virus es un péptido antimicrobiano, tal como una defensina. La retrociclina es una defensina particularmente adecuada. Se divulga con el presente documento, aunque no forma parte de la invención reivindicada, la posibilidad de que el resto de unión a virus sea un residuo antivírico no peptídico, tal como un polisulfato o policarbohidrato dendrítico o lineal.

[0030] En una realización, el resto de unión a virus es un péptido, en donde al menos uno de los residuos de este péptido presenta una sustitución. En una realización, el extremo C del péptido está sustituido con un grupo amino. En una realización, el extremo N del péptido está sustituido con un grupo acetilo. En una realización, el extremo C del péptido está sustituido con un grupo amino, y el extremo N del péptido está sustituido con un grupo acetilo.

[0031] Se divulga con el presente documento, aunque no forma parte de la invención reivindicada, la posibilidad de que el resto de unión a virus sea un péptido que sea al menos un 95 %, en particular al menos un 96 %, en particular al menos un 97 %, en particular al menos un 98 %, en particular al menos un 99 %, en particular un 100 %, idéntico a la SEQ ID NO. 2 y que el resto de unión a mucina (1) sea un péptido del factor trefoil 3 que sea al menos un 95 %, en particular al menos un 96 %, en particular al menos un 97 %, en particular al menos un 98 %, en particular al menos un 99 %, en particular un 100 %, idéntico a la SEQ ID NO. 1. La SEQ ID NO. 2 describe un péptido denominado p4 que ya se ha demostrado que se une al coronavirus 1 del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV-1) con alta afinidad (Han et al., 2006). A pesar de las diferencias estructurales entre el SARS-CoV-1 y el SARS-CoV-2, se encontró sorprendentemente que el péptido p4 también es muy adecuado para unirse al SARS-CoV-2.

[0032] Se divulga con el presente documento, aunque no forma parte de la invención reivindicada, la posibilidad de que el resto de unión a virus sea un péptido que sea al menos un 95 %, en particular al menos un 96 %, en particular al menos un 97 %, en particular al menos un 98 %, en particular al menos un 99 %, en particular un 100 %, idéntico a la SEQ ID NO. 3 y que el resto de unión a mucina (1) sea un péptido del factor trefoil 3 que sea al menos un 95 %, en particular al menos un 96 %, en particular al menos un 97 %, en particular al menos un 98 %, en particular al menos un 99 %, en particular un 100 %, idéntico a la SEQ ID NO. 1. La SEQ ID NO. 3 describe un péptido denominado p6 que ya se ha demostrado que se une al coronavirus 1 del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV-1) con alta afinidad (Han et al., 2006). A pesar de las diferencias estructurales entre el SARS-CoV-1 y el SARS-CoV-2, se encontró sorprendentemente que el péptido p6 también es muy adecuado para unirse al SARS-CoV-2. De este modo, la afinidad de unión del péptido p6 con respecto al SARS-CoV-2 es aproximadamente el doble que la afinidad del péptido p4.

[0033] Curiosamente, p6 también es capaz de unirse a las variantes alfa y delta del SARS-CoV-2 con una afinidad aún mayor que la del tipo natural de Wuhan del SARS-CoV-2 (véase la Tabla 1).

[0034] Se observó una afinidad aún mayor hacia el SARS-CoV-2 que la del péptido p6 lineal para las variantes grapadas del péptido p6. Se divulga con el presente documento, aunque no forma parte de la invención reivindicada, la posibilidad de que el resto de unión a virus sea un péptido que sea al menos un 95 %, en particular al menos un 96 %, en particular al menos un 97 %, en particular al menos un 98 %, en particular al menos un 99 %, en particular un 100 %, idéntico a la SEQ ID NO. 10. Este péptido es una variante grapada del péptido p6. En adelante, también se le denominará p6-cyc o p6 (R8)<15>(S5)<22>.

[0035] La afinidad de unión de diferentes restos de unión a virus hacia el SARS-CoV-2 (expresada como la constante de disociación Kd) se resume en la siguiente Tabla 1. Se determinó mediante termoforesis a microescala (MST, por sus siglas en inglés). Se observa claramente que los péptidos p4 y p6 (este último tanto en su forma lineal como en su forma ciclada) se unen a varios dominios de unión del receptor de las variantes de SARS-CoV-2 actualmente en circulación con constantes de unión nanomolares.

[0036] Tabla 1: Pro iedades de diferentes restos de unión a virus.

[0038]

[0040] Se divulga con el presente documento, aunque no forma parte de la invención reivindicada, la posibilidad de que el péptido sea al menos un 95 %, en particular al menos un 96 %, en particular al menos un 97 %, en particular al menos un 98 %, en particular al menos un 99 %, en particular un 100 %, idéntico a la SEQ ID NO. 18 o la SEQ ID NO. 19. Estas SEQ ID NO. se refieren a péptidos TFF-3-p6 sintéticos y recombinantes que demostraron tener propiedades muy adecuadas para la resolución del presente objeto.

[0041] En un aspecto, la presente invención se refiere al uso del péptido de acuerdo con las explicaciones anteriores como medicamento.

[0042] En un aspecto, la presente invención se refiere al uso médico del péptido de acuerdo con las explicaciones anteriores para la prevención o el tratamiento de una infección vírica.

[0043] En una realización, la infección vírica a tratar o prevenir es una infección por el virus de la gripe A.

[0044] Se divulga con el presente documento, aunque no forma parte de la invención reivindicada, un método médico para tratar o prevenir una infección vírica en un paciente que necesite dicho tratamiento. El término "paciente", como se usa en el presente documento, se refiere a un paciente humano o animal. Los mamíferos son pacientes animales particularmente adecuados. El método comprende la etapa de administrar el péptido de acuerdo con las explicaciones anteriores al paciente (por ejemplo, en forma de un medicamento que comprende este péptido). Esta administración se realiza, en una realización, proporcionando el péptido por vía nasal o bucal al paciente. Esto se logra con especial facilidad al proporcionar el péptido en una forma farmacéutica de pulverización. A continuación, el péptido se puede administrar, por ejemplo, en forma de un aerosol como una pulverización nasal o una pulverización para inhalación. Tras la administración, entrará en contacto con la mucosa del paciente y permitirá una unión del péptido a la mucosa mediante el resto de unión a mucina. Posteriormente, el péptido permanecerá en su forma unida a la mucosa del paciente y será capaz de "filtrar" virus del aire inhalado por el paciente debido a su resto de unión a virus.

[0045] Se divulga con el presente documento, aunque no forma parte de la invención reivindicada, un método médi aumentar la producción de moco en un paciente que lo necesite. Este método comprende la etapa de administrar el péptido de acuerdo con las explicaciones anteriores al paciente (por ejemplo, en forma de un medicamento que comprende este péptido).

[0046] En un aspecto, la presente invención se refiere a un medicamento que comprende un péptido de acuerdo con las explicaciones anteriores como principio farmacéuticamente activo. Este medicamento puede comprender otros principios farmacéuticamente activos. En una realización, el péptido es el único principio farmacéuticamente activo. En una realización, el medicamento está formulado para que se pueda administrar como aerosol, tal como una pulverización nasal o como una pulverización para inhalación. A continuación, el medicamento (y, por consiguiente, el péptido como principio farmacéuticamente activo) entra en contacto directo con la mucosa en la zona nasofaríngea tras su administración. Esto, a su vez, conduce a un aumento de la producción de moco, como se ha explicado anteriormente. Como resultado, el moco del paciente está mejor preparado para unirse y posteriormente eliminar los virus a los que se enfrenta el paciente (ya sea inhalándolos del ambiente o expulsándolos de las células infectadas por virus del cuerpo del paciente).

[0047] En un aspecto, la presente invención se refiere a un método para fabricar un péptido de acuerdo con las explicaciones anteriores. Este método comprende las etapas que se explican a continuación. En primer lugar, un precursor del resto de unión a virus se hace reaccionar con un primer precursor del resto de unión a mucina. En este contexto, el primer precursor del resto de unión a mucina comprende una primera parte del resto de unión a mucina final. Esta reacción conduce a la formación de un precursor peptídico.

[0048] Posteriormente, el precursor peptídico se hace reaccionar con un segundo precursor del resto de unión a mucina. El segundo precursor del resto de unión a mucina comprende una segunda parte del resto de unión a mucina. Como resultado de esta segunda etapa de reacción, se forma el péptido final. Por supuesto, también pueden llevarse a cabo otras etapas de reacción intermedias. Para dar un ejemplo, es posible dividir el resto de unión a mucina en más de dos precursores del resto de unión a mucina. A continuación, los precursores del resto de unión a mucina individuales de hacen reaccionar uno después del otro con el precursor peptídico ya formado para dar como resultado finalmente un péptido.

[0049] En una realización, el precursor del resto de unión a virus comprende un resto 4-pentinoico que establece un enlace covalente al resto de unión a mucina del péptido final. Este resto 4-pentinoico todavía puede estar presente (completamente o en parte) en el péptido final. Puede actuar como enlazador entre el resto de unión a virus y el resto de unión a mucina en una realización.

[0050] En una realización, el péptido comprende un residuo de triazol que actúa como enlazador entre el resto de unión a virus y el resto de unión a mucina. En una realización, el péptido comprende un residuo de polietilenglicol que actúa como enlazador entre el resto de unión a virus y el resto de unión a mucina. Tal residuo de polietilenglicol se combina con un residuo de triazol para formar un enlazador en una realización.

[0051] En una realización, el primer precursor del resto de unión a mucina comprende menos de la mitad de todos los aminoácidos del resto de unión a mucina. Si solo se usan dos precursores del resto de unión a mucina, entonces el segundo precursor del resto de unión a mucina comprende más de la mitad de todos los aminoácidos del resto de unión a mucina. Para proporcionar un ejemplo específico, el primer precursor del resto de unión a mucina comprende los aminoácidos 36 a 59 del resto de unión a mucina, que es un péptido del factor trefoil 3 en la presente realización. Además, el segundo precursor del resto de unión a mucina comprende los aminoácidos 1 a 35 del resto de unión a mucina. Después de haber hecho reaccionar el primer precursor del resto de unión a mucina (correspondiente a la parte del extremo C del resto de unión a mucina) con el resto de unión a virus, se realiza una reacción con el segundo precursor del resto de unión a mucina (correspondiente a la parte del extremo N del resto de unión a mucina) con la construcción ya formada del primer precursor del resto de unión a mucina y el resto de unión a virus (es decir, el precursor peptídico). Como resultado, se forma el péptido final.

[0052] Todas las realizaciones del péptido se pueden combinar de cualquier forma deseada y se pueden transferir, individualmente o de cualquier manera arbitraria, a los usos, al medicamento y a los diferentes métodos. Del mismo modo, todas las realizaciones de los diferentes usos se pueden combinar de cualquier forma deseada y se pueden transferir, individualmente o de cualquier manera arbitraria, al péptido, a los otros usos respectivos, al medicamento y a los diferentes métodos. Del mismo modo, todas las realizaciones del medicamento se pueden combinar de cualquier forma deseada y se pueden transferir, individualmente o de cualquier manera arbitraria, al péptido, a los diferentes usos y a los diferentes métodos. Además, todas las realizaciones de los diferentes métodos se pueden combinar de cualquier forma deseada y se pueden transferir, individualmente o de cualquier manera arbitraria, al péptido, a los diferentes usos y a los otros métodos respectivos.

[0053] A continuación se explicarán más detalles sobre aspectos de la presente invención, haciendo referencia a realizaciones de ejemplo y a las figuras adjuntas. En las figuras:

[0054] La figura 1A muestra esquemáticamente la estructura de un primer péptido bifuncional;

[0055] la figura 1B muestra esquemáticamente la estructura de un segundo péptido bifuncional;

[0056] la figura 2A muestra la estructura primaria de una realización de un primer precursor del resto de unión a mucina correspondiente a la SEQ ID NO. 15;

[0057] la figura 2B muestra la estructura primaria de una realización de un segundo precursor del resto de unión a mucina correspondiente a la SEQ ID NO. 16;

[0058] la figura 2C muestra la estructura primaria de un precursor del resto de unión a virus correspondiente a la SEQ ID NO. 17 (que no forma parte de la invención reivindicada);

[0059] la figura 3 muestra la estructura primaria de un péptido correspondiente a la SEQ ID NO. 18 (que no forma parte de la invención reivindicada) que comprende resto de unión a mucina realizado a partir del primer y segundo precursores del resto de unión a mucina de las figuras 2A y 2B y un resto de unión a virus realizado a partir del precursor del resto de unión a virus de la figura 2C;

[0060] la figura 4 muestra la estructura primaria de un resto de unión a virus correspondiente a la SEQ ID NO. 4 (que no forma parte de la invención reivindicada);

[0061] la figura 5 muestra la estructura primaria de un resto de unión a virus correspondiente a la SEQ ID NO. 5 (que no forma parte de la invención reivindicada);

[0062] la figura 6 muestra la estructura primaria de un resto de unión a virus correspondiente a la SEQ ID NO. 6 (que no forma parte de la invención reivindicada);

[0063] la figura 7 muestra la estructura primaria de un resto de unión a virus correspondiente a la SEQ ID NO. 7 (que no forma parte de la invención reivindicada);

[0064] la figura 8 muestra la estructura primaria de un resto de unión a virus correspondiente a la SEQ ID NO. 8 (que no forma parte de la invención reivindicada);

[0065] la figura 9 muestra la estructura primaria de un resto de unión a virus correspondiente a la SEQ ID NO. 9 (que no forma parte de la invención reivindicada);

[0066] la figura 10 muestra la estructura primaria de un resto de unión a virus correspondiente a la SEQ ID NO. 10 (que no forma parte de la invención reivindicada);

[0067] la figura 11 muestra la estructura primaria de un resto de unión a virus correspondiente a la SEQ ID NO. 11 (que no forma parte de la invención reivindicada);

[0068] la figura 12 muestra la estructura primaria de un resto de unión a virus correspondiente a la SEQ ID NO. 12 (que no forma parte de la invención reivindicada);

[0069] la figura 13 muestra la estructura primaria de un resto de unión a virus correspondiente a la SEQ ID NO. 13 (que no forma parte de la invención reivindicada);

[0070] la figura 14 muestra un gráfico que ilustra la afinidad de unión entre el péptido p6 y diferentes variantes del SARS-CoV-2;

[0071] la figura 15 muestra un gráfico que ilustra la afinidad de unión entre el péptido TFF3-p6 sintético bifuncional correspondiente a la SEQ ID NO. 18 y diferentes variantes del SARS-CoV-2;

[0072] la figura 16 muestra un gráfico que ilustra la afinidad de unión entre la variante del péptido p4 correspondiente a la SEQ ID NO. 23 y el dominio de unión al receptor del SARS-CoV-2 (2019-nCoV);

[0073] la figura 17 muestra un gráfico que ilustra la afinidad de unión entre la variante del péptido p4 correspondiente a la SEQ ID NO. 24 y el dominio de unión al receptor del SARS-CoV-2 (2019-nCoV);

[0074] la figura 18 muestra un gráfico que ilustra la afinidad de unión entre la variante del péptido p4 correspondiente a la SEQ ID NO. 25 y el dominio de unión al receptor del SARS-CoV-2 (2019-nCoV);

[0075] la figura 19 muestra un gráfico que ilustra la afinidad de unión entre la variante del péptido p4 correspondiente a la SEQ ID NO. 26 y el dominio de unión al receptor del SARS-CoV-2 (2019-nCoV);

[0076] la figura 20 muestra un gráfico que ilustra la afinidad de unión entre la variante del péptido p4 correspondiente a la SEQ ID NO. 28 y el dominio de unión al receptor del SARS-CoV-2 (2019-nCoV);

[0077] la figura 21 muestra un gráfico que ilustra la afinidad de unión entre la variante del péptido p4 correspondiente a la SEQ ID NO. 29 y el dominio de unión al receptor del SARS-CoV-2 (2019-nCoV);

[0078] la figura 22 muestra un gráfico que ilustra la afinidad de unión entre la variante del péptido p4 correspondiente a la SEQ ID NO. 30 y el dominio de unión al receptor del SARS-CoV-2 (2019-nCoV);

[0079] la figura 23 muestra un gráfico que ilustra la afinidad de unión entre la variante del péptido p4 correspondiente a la SEQ ID NO. 31 y el dominio de unión al receptor del SARS-CoV-2 (2019-nCoV);

[0080] la figura 24 muestra un gráfico que ilustra la afinidad de unión entre la variante del péptido p4 correspondiente a la SEQ ID NO. 32 y el dominio de unión al receptor del SARS-CoV-2 (2019-nCoV);

[0081] la figura 25 muestra un gráfico que ilustra la afinidad de unión entre la variante del péptido p4 correspondiente a la SEQ ID NO. 33 y el dominio de unión al receptor del SARS-CoV-2 (2019-nCoV);

[0082] la figura 26 muestra un gráfico que ilustra la afinidad de unión entre la variante del péptido p4 correspondiente a la SEQ ID NO. 34 y el dominio de unión al receptor del SARS-CoV-2 (2019-nCoV);

[0083] la figura 27 muestra un gráfico que ilustra la afinidad de unión entre la variante del péptido p4 correspondiente a la SEQ ID NO. 35 y el dominio de unión al receptor del SARS-CoV-2 (2019-nCoV);

[0084] la figura 28 muestra un gráfico que ilustra la afinidad de unión entre la variante del péptido p4 correspondiente a la SEQ ID NO. 36 y el dominio de unión al receptor del SARS-CoV-2 (2019-nCoV);

[0085] la figura 29 muestra un gráfico que ilustra la afinidad de unión entre la variante del péptido p4 correspondiente a la SEQ ID NO. 37 y el dominio de unión al receptor del SARS-CoV-2 (2019-nCoV);

[0086] la figura 30 muestra un gráfico que ilustra la afinidad de unión entre la variante del péptido p4 correspondiente a la SEQ ID NO. 38 y el dominio de unión al receptor del SARS-CoV-2 (2019-nCoV);

[0087] la figura 31 muestra un gráfico que ilustra la afinidad de unión entre la variante del péptido p4 correspondiente a la SEQ ID NO. 39 y el dominio de unión al receptor del SARS-CoV-2 (2019-nCoV);

[0088] la figura 32 muestra un gráfico que ilustra la afinidad de unión entre la variante del péptido p4 correspondiente a la SEQ ID NO. 40 y el dominio de unión al receptor del SARS-CoV-2 (2019-nCoV);

[0089] la figura 33 muestra un gráfico que ilustra la afinidad de unión entre la variante del péptido p6 correspondiente a la SEQ ID NO. 41 y el dominio de unión al receptor del SARS-CoV-2 (2019-nCoV);

[0090] la figura 34 muestra un gráfico que ilustra la afinidad de unión entre la variante del péptido p6 correspondiente a la SEQ ID NO. 42 y el dominio de unión al receptor del SARS-CoV-2 (2019-nCoV);

[0091] la figura 35 muestra un gráfico que ilustra la afinidad de unión entre la variante del péptido p6 correspondiente a la SEQ ID NO. 43 y el dominio de unión al receptor del SARS-CoV-2 (2019-nCoV); y

[0092] la figura 36 muestra un gráfico que ilustra la afinidad de unión entre el péptido TFF3-p6 recombinante bifuncional correspondiente a la SEQ ID NO. 19 y diferentes variantes del SARS-CoV-2.

[0093] La figura 1A ilustra esquemáticamente la estructura de un péptido bifuncional, concretamente TFF3-p6 (que no forma parte de la invención reivindicada). Este es un péptido en el que el péptido del factor trefoil 3 (TFF3) 1 es el resto de unión a mucina, en donde el péptido p62 es el resto de unión a virus. El péptido TFF31 tiene una secuencia primaria correspondiente a la SEQ ID NO. 1. El péptido p62 tiene una secuencia primaria correspondiente a la SEQ ID NO.3. El péptido p62 está unido covalentemente a la lisina 57 del péptido TFF3.

[0094] La figura 1B muestra un péptido bifuncional alternativo (que no forma parte de la invención reivindicada). En esta figura y en todas las siguientes, los elementos similares se representarán con la misma referencia numérica. En este caso, el péptido p62 está unido covalentemente al extremo C del péptido TFF31.

[0095] La síntesis de TFF3-p6 se explicará con más detalle a continuación.

[0096] Para la producción de TFF3, se siguió el protocolo de Braga Emidio et al. 2021. A diferencia de las rutas de síntesis publicadas por Braga Emidio et al., se introdujo azido lisina en TFF3 reemplazando la cisteína en la posición 57. TFF3(36-59)(C57AzK), que representa una realización de un primer precursor del resto de unión a mucina, se realizó completamente mediante SPPS en resina de amida Rink, usando el componente básico correspondiente para la azido lisina (AzK) en la posición 57. TFF3<(36-59)>C57AzK [M+H]<+>= 2825,31 g/mol, [M+2H]<3+>/3 = 943,7 g/mol. La estructura primaria se ilustra en la figura 2A.

[0097] TFF3(1-35)-Nbz, que representa una realización de un segundo precursor del resto de unión a mucina, se sintetizó en resina de amida Rink, que se funcionalizó inicialmente con ácido 3-fluorenilmetoxicarbonil-4-diaminobenzoico (Fmoc-Dbz) mediante metodologías de acoplamiento normal (5 equivalentes (equiv.) de Fmoc-Dbz, 4,9 equiv. de hexafluorofosfato de azabenzotriazol tetrametil uronio (HATU), 10 equiv. de N,N-diisopropiletilamina (Dipea), en dimetilformamida (DMF) lo suficiente como para hacer la solución 0,2 M con respecto al ácido 3-Fmoc-4-diaminobenzoico (Fmoc-Dbz). A continuación, se siguió la síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS) normal. El último residuo se añadió como un aminoácido protegido con Boc. Tras el ensamblaje del péptido en la resina, el extremo C se activó a través de la acilación con Se añadió p-nitrofenilcloroformiato (5 equiv., CH<2>Cl<2>, 45 min) seguido de la adición de base (Dipea, 0,5 M en DMF, 20 min) para promover el ataque intramolecular de la anilida y formar la bencimidazolinona unida a la resina. La escisión de la resina se realizó usando 94:2,5:2,5:1,0 de ácido trifluoroacético (TFA):1,2-etanoditiol (EDT):H<2>O:triisopropilsilano (TIPS), el producto en bruto se disolvió en 3 ml de acetonitrilo (MeCN) al 30 %/H<2>O con TFA al 0,1 %, se filtró y se inyectó en un sistema de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) preparativa para su purificación. TFF3(1-35)-Nbz. 3980,4: M<+>, 996,1: (M+4H)<4+>/4. La estructura primaria se ilustra en la figura 2B.

[0098] El pentinoico-(PEG)<2>-p6, que representa un resto de unión a virus (que no forma parte de la invención reivindicada), se realizó mediante SPPS hasta obtener las dos unidades de PEG, sobre una resina de amida Rink. A continuación, el ácido 4-pentinoico se acopló manualmente (5 equiv. de ácido 4-pentinoico, 4,9 equiv. de HATU, 10 equiv. de Dipea, en DMF lo suficiente como para hacer la solución 0,2 M con respecto al ácido 4-pentinoico). El acoplamiento se realizó dos veces durante 1,5 h. A continuación, el péptido se escindió con 95:2,5:2,5 de TFA:H<2>O:TIPS y se purificó por HPLC preparativa. Penti-p6 [M+H]<+>= 3975,90 g/mol, [M+2H]<3+>/3 = 994,9 g/mol. La estructura primaria se ilustra en la figura 2C.

[0099] En un vial pequeño, se añadió CuSO<4>(10 equiv.) de una solución 1 mM y se mezcló con THPTA (50 equiv.). Se dejó que el complejo organometálico se formara mientras se mezclaban los demás reactivos.

[0100] Para formar un precursor peptídico mediante química de clic entre la azido lisina 57 y el grupo alquino del pentinoico-(PEG)<2>-p6, el pentinoico-(PEG)<2>-p6 (1,5 equiv.) y el TFF3(36-59)(C57AzK) (1,0 equiv.) se disolvieron en un tampón de reacción (NH<4>HCO<3>10 mM) en un tubo Eppendorf de 1,5 ml. Posteriormente, se añadió aminoguanidina (100 equiv.) de una solución madre 200 mM. A continuación, a la mezcla de reacción se le añadió la mezcla de CuSO<4>y THPTA. Por último, a la reacción se le añadió ascorbato de sodio (100 equiv.) y el pH se ajustó a 8,0 mediante HCl/KOH. Se dejó fluir nitrógeno en el tubo de reacción. A continuación, el tubo de reacción se selló inmediatamente. La incubación se realizó durante 12 h, con agitación a 37 °C. Los controles se realizaron disolviendo 1 µl del producto de reacción en bruto en 20 µl de MeCN al 30 %/H<2>O y a continuación añadiendo tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) hasta alcanzar una concentración de 30 mM. Después de la incubación a 37 °C durante 5 minutos, las muestras se analizaron mediante HPLC-espectrometría de masas (HPLC-MS).

[0101] Para la ligación química natural entre TFF3(1-35)-Nbz y TFF3(36-59)(C57K-Pentip6), TFF3(1-35)-Nbz (1,0 equiv.) y TFF3(36-59)(C57K-Pentip6) (0,8 equiv.) se disolvieron en tampón de reacción (clorhidrato de guanidinio 6 M, Na<2>HPO<4>100 mM y TCEP 30 mM, el pH se ajustó a 7,0 con HCl/NaOH). A continuación, se añadió 2-mercaptoetanosulfonato (MeSNa) (100 equiv.), y la reacción se mantuvo en agitación durante 4 h a temperatura ambiente. Los controles se realizaron disolviendo 1 µl del producto de reacción en bruto en 20 µl de MeCN al 30 %/H<2>O y a continuación añadiendo TCEP hasta alcanzar una concentración de 30 mM. Después de la incubación a 37 °C durante 5 minutos, las muestras se analizaron por HPLC-MS. Cuando no se detectó ningún rastro del tioéster, el volumen de la reacción se aumentó a 3 ml añadiendo MeCN al 30 %/H<2>O con TFA al 0,1 %, se filtró y se inyectó en un sistema de HPLC preparativa para su purificación. Se obtuvo TFF3-C57K(Penti-p6), que tenía una [M+H]<+>= 10600,96 g/mol, [M+8H]<8+>/8 = 1326,1 g/mol, [M+9H]<9+>/9 = 1178,8 g/mol [M+10H]<10+>/10 = 1061,1 g/mol. La estructura primaria se ilustra en la figura 3.

[0102] También se produjo TFF3 natural mediante recombinación. Para lograr esto, el protocolo de Järvå et al., 2020 se siguió y se ajustó.

[0103] A continuación, la secuencia de TFF3 se extendió en el extremo 5' para introducir etiquetas de purificación. Posteriormente, el producto se integró en el plásmido pET28b para determinar la expresión bacteriana mediante clonación independiente de secuencia y ligación (SLIC, por sus siglas en inglés). El plásmido final se validó mediante secuenciación y se transformó en células BL21CodonPlus(DE3) RIPL (R = Arginina, I = Isoleucina Ile, P = Prolina, L = Leucina) para determinar la expresión bacteriana. Esto se explicará con más detalle a continuación.

[0104] Preparación de un cultivo madre en crecimiento exponencial de BL21CodonPlus(DE3) RIPL de E. coli transformadas Se transformaron células BL21CodonPlus(DE3) RIPL de E. coli con el plásmido correspondiente. Las células se sembraron en placas de agar con caldo de lisogenia (LB) que contenían 50 µg/ml de estreptomicina, 25 µg/µl de cloranfenicol y 50 µg/ml de kanamicina y se incubaron en una incubadora a 37 °C durante una noche. Se seleccionó una colonia, se inoculó en un medio LB que contenía 50 µg/ml de estreptomicina, 25 µg/µl de cloranfenicol y 50 µg/ml de kanamicina y se incubó en una incubadora con agitación rotatoria a 250 rpm, a 37 °C durante una noche. Se inoculó medio con caldo Terrific (TB) con un cultivo LB con una densidad óptica inicial medida a 600 nm (DO<600>) de 0,02 y se incubó en una incubadora con agitación rotatoria a 250 rpm y a 37 °C. El cultivo se dejó crecer hasta una DO<600>de >2,867. Se añadió DMSO al 7,527 % a este cultivo, y la mezcla (precultivo) se congeló rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 °C para su uso posterior.

[0105] Expresión y lavado de proteínas

[0106] El medio TB se inoculó con una DO<600>de 0,04 con el precultivo. El cultivo se incubó en una incubadora con agitación rotatoria a 250 rpm, a 26 °C durante 24 horas. Después de 24 horas, el cultivo bacteriano se enfrió en hielo durante 15 minutos y se centrifugó a 3000 g durante 15 minutos. El sobrenadante se descartó y las células se suspendieron de nuevo en tampón de lavado (a base de HEPES, pH 7) DNasa I fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF). La suspensión se centrifugó a 3000 g durante 15 minutos y el sobrenadante se descartó. La etapa de lavado se repitió. Las proteínas diana se purificaron mediante cromatografía de afinidad en tándem con purificación con marcador His y Strep (motivo de unión para estreptavidina). Los sitios de escisión de proteasa permiten la elución de las proteínas de las columnas. La proteína eluida se dializó y se verificó mediante SDS-PAGE.

[0107] Fabricación de péptidos grapados con lactama

[0108] Todos los péptidos grapados con lactama se sintetizaron sobre resina de amida Rink. Los componentes básicos para la formación del enlace isopeptídico fueron N-α-Fmoc-N-ε-4-metiltritil-L-lisina (en lo sucesivo en el presente documento representada MttK) y β-2-fenilisopropil éster del ácido N-α-Fmoc-L-aspártico (en lo sucesivo en el presente documento representado PhiPr). Después de la SPPS, el péptido unido a la resina se trató con TFA al 2 % en diclorometano (DCM) para inducir la desprotección de 4-metiltritilo y 2-fenilisopropilo. A continuación, se permitió la formación del enlace isopeptídico, seguida de la adición de 0,9 equivalentes de HATU y 2 equivalentes de DIPEA, en DMF. Tras un aclarado exhaustivo en DMF y DCM, se realizó una segunda adición del cóctel de acoplamiento. Los péptidos se escindieron de la resina usando 95:2,5:2,5 de TFA:H<2>O:TIPS y se precipitaron con éter frío. A continuación, los péptidos se filtraron, se secaron y se disolvieron de nuevo en MeCN al 30 %/H2O con TFA al 0,1 % hasta un volumen final de 3 ml. Después de la filtración, las muestras se inyectaron en un sistema de HPLC preparativa para su purificación.

[0109] Las estructuras resultantes de los péptidos grapados con lactama se ilustran en las figuras 4 a 9.

[0110] La afinidad de unión de diferentes restos de unión a virus cíclicos hacia el SARS-CoV-2 (expresada como la constante de disociación Kd) se resume en la siguiente Tabla 2. Se determinó mediante termoforesis a microescala (MST). Se observa claramente que los péptidos p6 cíclicos se unen al SARS-CoV-2 con constantes de unión micromolares.

[0111] Tabla 2: Pro iedades de diferentes restos de unión a virus cíclicos.

[0113]

[0114] n in i n

[0116]

[0118] Fabricación de restos de unión a virus grapados mediante metátesis de cierre de anillo (RCM, por sus siglas en inglés) Para las reacciones RCM, se usaron los siguientes aminoácidos no canónicos:

[0119] S5Fmoc = Fmoc-(S)-2-(4-pentenil)Ala-OH

[0120] R8Fmoc = Fmoc-(R)-2-(7-octenil)Ala-OH

[0121] Para estos aminoácidos (AA), las condiciones de acoplamiento fueron: 3,0 equivalentes de AA, 2,9 equiv. de HATU, 6 equiv. de DIPEA. Se añadió DMF hasta alcanzar una concentración de 0,2 M con respecto al AA.

[0122] Para todos los aminoácidos naturales, las condiciones de acoplamiento fueron: 5,0 equivalentes de AA, 4,9 equiv. de HATU, 10 equiv. de DIPEA. Se añadió DMF hasta alcanzar una concentración de 0,2 M con respecto al AA.

[0123] Tras confirmar la masa del péptido no grapado mediante una prueba de escisión, se realizó la RCM. La resina se lavó con 1 ml de DCM (3 x 1 min) y a continuación con 1 ml de 1,2-dicloroetano (DCE) (3 x 1 min). La resina (50 µmol) se trató con 1 ml de una solución 6 mM del catalizador de Grubbs de primera generación en DCE (20 % en moles con respecto a la sustitución de la resina). La suspensión resultante se agitó con burbujeo continuo en una atmósfera de nitrógeno a 20-25 °C durante 2 h. Posteriormente, se drenó el disolvente. A continuación, se realizó una doble adición del catalizador de Grubbs. Posteriormente, la resina se lavó con 1 ml de DCE (3 x 1 min), a continuación con 1 ml de DCM (3 x 1 min) y a continuación se secó en una corriente de nitrógeno. La escisión peptídica péptido de la resina se realizó usando 95:2,5:2,5 de TFA:H<2>O:TIPS. El producto en bruto se precipitó con éter frío, se filtró y se secó. El producto se disolvió de nuevo en MeCN al 30 %/H2O con TFA al 0,1 % hasta un volumen final de 3 ml. Después de la filtración, las muestras se inyectaron en un sistema de HPLC preparativa para su purificación.

[0124] Se realizó la acetilación de los productos de RCM hinchando la resina desprotegida con Fmoc en 1 ml de N-metil-2-pirrolidona (NMP) durante 10 min y drenando el disolvente. A continuación, se prepararon 2 ml de una solución de anhídrido acético y DIPEA en NMP (85:315:1.600 en volumen) y se añadieron a la resina. Se realizó la agitación suave de la mezcla con burbujeo en una atmósfera de nitrógeno durante 45 min y a continuación se drenó el disolvente. Se realizaron lavados exhaustivos con DCM y DMF. Por último, se realizó la escisión y la purificación según lo descrito anteriormente.

[0125] Después de la desprotección, los péptidos contenían i) un residuo S5 (una S-alanina alquenilada) y un residuo R8 (una R-alanina alquenilada) o ii) dos residuos S5. Se formó un puente alquenilo entre i) un residuo S5 y un residuo R8 o ii) entre dos residuos S5. Este puente alquenilo es un residuo 7-undecenilo en el caso de un residuo S5 y un residuo R8. Además, el puente alquenilo es un residuo 4-octenilo en el caso de dos residuos S5.

[0126] Las estructuras resultantes de los péptidos grapados producidos por RCM se ilustran en las figuras 10 a 13.

[0127] Las propiedades de diferentes restos de unión a virus cíclicos, incluyendo la afinidad de unión al SARS-CoV-2 (expresada como la constante de disociación Kd), se resumen en la Tabla 3. La afinidad de unión se determinó mediante termoforesis a microescala (MST). Se observa claramente que el péptido p6 cíclico p6(R8)<15>(S5)<22>se une al SARS-CoV-2 con una constante de unión nanomolar.

[0128] Tabla 3: Pro iedades de diferentes restos de unión a virus cíclicos.

[0130]

[0132] Mediciones de afinidad de unión peptídica

[0133] Las mediciones de afinidad se realizaron mediante termoforesis a microescala (MST). En este caso, la relación entre la difusión química y térmica (efecto Soret) influye en la movilidad de un compuesto marcado (en este caso: RBD) en función del número de ligandos unidos (en este caso: péptidos). En la MST, un láser infrarrojo induce un punto de calor localizado y, posteriormente, un gradiente de temperatura. Las moléculas se desplazan a lo largo de este gradiente según sus características en la interfaz agua-proteína. La unión de un ligando provoca cambios en la capa de agua ordenada en la proteína observada, y puede modificar o aumentar el potencial superficial eficaz. Esto conlleva cambios en el comportamiento termoforético, indicados por un aumento o una disminución de la amplitud de la termoforesis. Tras la adición de diferentes concentraciones de ligando, el cambio en la fluorescencia se puede representar gráficamente (eje y) en función de la concentración de ligando. A partir del cambio a la mitad de la fluorescencia máxima (punto de inflexión de la curva de saturación), se puede obtener la Kd de la interacción proteínaligando mediante la aplicación de la ley de acción de masas (Jerabek-Willemsen et al., 2014).

[0134] El marcaje y la purificación del RBD se realizaron usando un kit de marcaje NHS-Red de 2.ª generación (NanoTemper). La solución de RBD se diluyó con agua a 10 µM, se tamponó de nuevo en una solución acuosa de carbonato de sodio a pH 8,0 y se incubó en la oscuridad a 300 µM del colorante rojo. La cromatografía de exclusión por tamaño permitió obtener el RBD marcado, sin colorante sin reaccionar. La eficiencia del marcaje se analizó a partir de mediciones de espectroscopia y resultó ser de aproximadamente 1:1 (proteína:colorante). Las mediciones de afinidad se realizaron en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) (sin Ca<2+>ni Mg<2+>) complementada con Tween 20 al 0,05 % (v/v) y capilares de alta calidad (NanoTemper).

[0135] A continuación, la MST se midió mediante 16 diluciones secuenciales 1:1 de cada péptido, usando PBS Tween 20 al 0,05 % como diluyente, con un volumen final de 10 µl en cada una. A continuación, cada muestra diluida se incubó con 10 µl de la solución madre de RBD marcada a 10 nM, manteniendo así siempre una concentración 5 nM de la proteína diana marcada en cada muestra.

[0136] A continuación, la señal de MST se adquirió en un instrumento NanoTemper Technologies Monolith NT.115 Pico, con una potencia de excitación del 20 % y una potencia de MST del 40 %. La señal se analizó 1,5 segundos después del inicio del láser IR, y los datos obtenidos se ajustaron como se ha mostrado previamente (Bhatia et al., 2017). Estas condiciones se mantuvieron constantes para todas las muestras medidas.

[0137] Medición de la afinidad de p6 frente a RBD (SARS-CoV-2, Ómicron B.1.1.529)

[0138] Además, el péptido p6 sintetizado químicamente (de acuerdo con la SEQ ID NO. 3) se valoró frente a una concentración constante (5 nM) de RBD marcado con fluorescencia de la variante ómicron del SARS-CoV-2 (cepa B.1.1.529). Se determinó una constante de disociación (Kd) de 280 nM. Por lo tanto, el péptido p6 también muestra una alta afinidad de unión hacia la variante ómicron del SARS-CoV-2.

[0139] La figura 14 muestra los resultados de la caracterización de afinidad del péptido p6 (de acuerdo con la SEQ ID NO.

[0140] 3), explicada previamente, mediante la técnica de MST frente a dominios de unión al receptor (RBD) marcados con fluorescencia del SARS-CoV-2 de tipo natural (círculos de color negro), la variante alfa (círculos de color blanco), la variante delta (triángulos) y la variante ómicron (cuadrados) del SARS-CoV-2 (cepa natural, variante alfa y variante delta: N = 3, las barras de error muestran el EEM). Se observa claramente que el péptido p6 se une a todas las variantes/cepas del SARS-CoV-2 con alta afinidad (véase también la Tabla 1 para los resultados cuantitativos de estos experimentos).

[0141] Derivados de p4 y p6

[0142] Se sintetizó una pluralidad de derivados de p4 y p6 adicionales, y la afinidad de estos derivados de p4 y p6 frente al dominio de unión al receptor se ensayó mediante experimentos MST, como se ha explicado anteriormente para el péptido p6.

[0143] Todos los derivados de p4 se sintetizaron como se describe en Sarto et al. 2022. Los derivados de p6, p6-rígido, p6-dis y p6-rígido-dis, se adquirieron en PSL (Peptide Specialty Laboratories GmbH, Heidelberg) en forma de sal TFA. Tras su llegada, los péptidos se reconstituyeron en PBS, se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C hasta su uso posterior.

[0144] La Tabla 4 enumera los diferentes derivados de p4 ensayados, así como las constantes de disociación obtenidas a partir de las mediciones de afinidad. Los residuos de cisteína de todos los péptidos se encuentran en su estado normal reducido. Los resultados de las mediciones de afinidad también se ilustran en las figuras 16 a 32.

[0145] Tabla 4: Pro iedades de los derivados de 4 restos de unión a virus .

[0147]

[0149] Todos los derivados de p4 que muestran una constante de disociación frente al RBD del SARS-CoV-2 inferior a 0,3, en particular inferior a 0,2, en particular inferior a 0,1, en particular inferior a 0,05, en particular inferior a 0,04, en particular inferior a 0,03, en particular inferior a 0,02, son restos de unión a virus particularmente adecuados.

[0150] La Tabla 5 enumera los diferentes derivados de p6 ensayados, así como las constantes de disociación obtenidas a partir de las mediciones de afinidad. Los residuos de cisteína de todos los péptidos se encuentran en su estado oxidado, formando así un enlace disulfuro intramolecular. Los resultados de las mediciones de afinidad también se ilustran en las figuras 33 a 35.

[0151] Tabla 5: Pro iedades de los derivados de 6 restos de unión a virus .

[0153]

[0155] Producción recombinante de TFF3-p6

[0156] TFF3-p6 también se produjo de forma recombinante. Para lograr esto, el protocolo de Järvå et al., 2020 se siguió y se ajustó.

[0157] A continuación, la secuencia de TFF3 se extendió para introducir marcadores de purificación y un sitio de escisión de proteasa del TEV (virus del grabado del tabaco) en el extremo 5' y p6 en el extremo 3'. Posteriormente, el producto se integró en el plásmido pET28b para determinar la expresión bacteriana mediante clonación independiente de secuencia y ligación (SLIC, por sus siglas en inglés). El plásmido final se validó mediante secuenciación y se transformó en células BL21CodonPlus(DE3) RIPL para determinar la expresión bacteriana. Esto se realizó como se ha explicado anteriormente en detalle en el párrafo "Preparación de un cultivo madre en crecimiento exponencial de BL21CodonPlus(DE3) RIPL de E. coli transformadas".

[0158] Expresión y lavado de proteínas

[0159] El medio TB se inoculó con una DO<600>de 0,04 con el precultivo. El cultivo se incubó en una incubadora con agitación rotatoria a 250 rpm, a 26 °C durante 24 horas. Después de 24 horas, el cultivo bacteriano se enfrió en hielo durante 15 minutos y se centrifugó a 3000 g durante 15 minutos. El sobrenadante se descartó y las células se suspendieron de nuevo en tampón de lavado (a base de HEPES, pH 8). La suspensión se centrifugó a 3000 g durante 15 minutos y el sobrenadante se descartó. La etapa de lavado se repitió. Las células bacterianas se lisaron en tampón de lisis (a base de HEPES, pH 8) mediante sonicación. El lisado se centrifugó a 12.000 g durante 45 minutos, el sedimento se descartó y el sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,2 µm.

[0160] Purificación de proteínas

[0161] Las proteínas diana se purificaron mediante cromatografía de afinidad en tándem con purificación con marcador His y Strep (motivo de unión para estreptavidina). Se añadió imidazol (ImH) al lisado bacteriano filtrado hasta una concentración final de 40 mM. El lisado se aplicó a una columna HisTrap (Cytiva) usando un dispositivo de cromatografía líquida de proteínas rápido (FPLC) Äkta Pure 25 (Cytiva). La columna se lavó con tampón de lavado (NaCl 300 mM, Tris-base 50 mM, ImH 40 mM, pH 7,5), las proteínas se eluyeron con tampón de elución (NaCl 300 mM, Tris-base 50 mM, ImH 400 mM, pH 7,5) y el eluido se recogió en fracciones. Las fracciones que contenían el producto de interés se identificaron mediante SDS-PAGE y se agruparon.

[0162] Las fracciones combinadas se aplicaron a una columna Strep-Tactin XT 4Flow (IBA Lifesciences) usando un Äkta Pure 25. La columna se lavó con tampón de lavado (Tris-HCl 100 mM, NaCl 150 mM, ETDA 1 mM, pH 8), las proteínas se eluyeron con tampón de elución (Tris-HCl 100 mM, NaCl 150 mM, ETDA 1 mM, biotina 50 mM, pH 8) y el eluido se recogió en fracciones. Las fracciones que contenían el producto de interés se identificaron mediante SDS-PAGE y se agruparon antes de la diálisis contra PBS (pH 7,4). El contenido proteico se determinó mediante el espectro de absorción a 280 nm usando un espectrofotómetro NanoDrop2000 (Thermo Fisher Scientific).

[0163] Para eliminar los marcadores de purificación de afinidad en tándem, los productos purificados se incubaron durante una noche a 30 °C con ProTEV Plus (Promega) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante con 1 U de ProTEV Plus por cada 15 µg de producto purificado.

[0164] Se añadió ImH a la mezcla de reacción hasta una concentración final de 40 mM antes de aplicarla a una columna HisTrap usando un Äkta Pure 25 y lavar la columna con tampón de lavado (NaCl 300 mM, Tris-base 50 mM, ImH 40 mM, pH 7,5). El fluido pasante con el producto final (TFF3-p6) se recogió en fracciones, mientras que los marcadores de purificación escindidos y el ProTEV Plus (que también contenía un marcador His) permanecieron en la columna. Las fracciones que contenían el producto final se identificaron mediante SDS-PAGE, se agruparon y se dializaron contra PBS (pH 7,4). El volumen se redujo usando un concentrador centrífugo Vivaspin PES (Sartorius) hasta una concentración final de proteína entre 1 mg/ml y 3 mg/ml, según lo determinado mediante NanoDrop2000. La solución se congeló rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenó a -20 °C hasta su uso posterior. El producto final correcto y la pureza se controlaron mediante SDS-PAGE y cromatografía líquida de ultra alto rendimiento acoplada a espectrometría de masas (UPLC/MS).

[0165] Medición de la afinidad de TFF-p6 frente al RBD del SARS-CoV-2

[0166] En estos experimentos, el TFF3-p6 (TFF3-C57K(Penti-p6) sintetizado químicamente o TFF3-p6 syn; cuya estructura primaria se ilustra en la figura 3 y se reproduce en la SEQ ID NO. 18) y el TFF3-p6 recombinante (TFF3-p6 rec) de acuerdo con la SEQ ID NO.19 se valoraron con respecto a una concentración constante (5 nM) de RBD marcado con fluorescencia del SARS-CoV2 de tipo natural (también denominado nCov2019) y/o la variante delta del SARS-CoV2 (también denominado Delta (B.1.617.2)). Las constantes de disociación (Kd) resultantes se enumeran en la Tabla 6. Los resultados de esta medición de afinidad se muestran en la figura 15 para TFF3-p6 syn y en la figura 36 para TFF3-p6 rec.

[0167] Tabla 6: Constantes de disociación de las mediciones de afinidad de TFF- 6 frente al RBD del SARS-CoV-2.

[0170]

[0172] Ensayo de citotoxicidad

[0173] La viabilidad celular se determinó usando un kit de recuento celular (Hycultec, HY-K0301) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

[0174] Las células A549, HBE y Calu-3 se cultivaron en medio DMEM complementado con FBS al 10 % (v/v), 100 U/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina. Las células se sembraron en una placa de 96 pocillos a una densidad de 5 x 10<4>células/ml en 90 µl de medio DMEM por pocillo durante una noche a 37 °C y con CO<2>al 5 %.

[0175] Se añadieron 10 µl de TFF3-p6 recombinante o tags-TFF3-p6 (que aún contenía los marcadores de afinidad) disueltos en agua desionizada en diluciones en serie (6,6 x 10<-6>M - 6,6 x 10<-10>M), incluyendo controles positivos (SDS al 1 %) y negativos (vehículo; medio, H<2>O) y se incubaron durante 48 h más a 37 °C y con CO<2>al 5 %. Para restar el fondo, también se usaron pocillos sin células, solo con la muestra. Después de 48 h de incubación, se añadió la solución CCK8 (10 µl/pocillo) y se midió la absorbancia (450 nm/650 nm) después de aproximadamente 3 h de incubación del colorante, usando un lector de placas Tecan (SPARK, lector TECAN, Tecan Group Ltd.). La viabilidad celular se calculó estableciendo el control no tratado al 100 % tras restar la señal de fondo.

[0176] Ni TFF3-p6 recombinante ni tags-TFF3-p6 mostraron diferencias significativas con respecto a los controles negativos. Más bien, la viabilidad celular fue de aproximadamente el 100 % en todos los casos. Por el contrario, los controles positivos mostraron una viabilidad celular de o cercana al 0 %.

[0177] Eficacia antivírica

[0178] Para ensayar la eficacia antivírica de TFF3-p6, se usó un sistema de infección pseudovírica. El sistema se basa en un virus de la estomatitis vesicular (VEV) que carece de la glucoproteína de la envoltura del VEV, pero contiene una eGFP y la proteína de la espícula del SARS-CoV-2 (VSVΔG-CoV-2; Markus Hoffmann et al.).

[0179] Se incubó TFF3-p6 o PBS (control) con VSVΔG-CoV-2 durante 30 min a una concentración final de TFF3-p650 µM y 2,625 x 10<4>uff/ml de virus en 100 µl. La mezcla se añadió a células VeroE6 y se incubó durante 24 h a 37 °C en una incubadora de cultivo celular. Se tomaron imágenes con un microscopio de fluorescencia y se determinó el número de células infectadas.

[0180] TFF3-p6 podría reducir la infección de células VeroE6 con el pseudovirus VSVΔG-CoV2 en aproximadamente un 40 % en comparación con el control de PBS.

[0181] Lista de referencias mencionadas en las secciones anteriores

[0182] 1. Bhatia, Sumati, et al. "Linear polysialoside outperforms dendritic analogs for inhibition of influenza virus infection in vitro and in vivo". Biomaterials 138 (2017): 22-34.

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[0184] 3. Bui, Vuong N., et al. "Pathogenicity of an H5N1 avian influenza virus isolated in Vietnam in 2012 and reliability of conjunctival samples for diagnosis of infection". Virus Research 179 (2014): 125-132.

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Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

1. Péptido que comprende un resto de unión a virus (2) y un resto de unión a mucina (1) unido covalentemente al resto de unión a virus (2),

caracterizado

por que el resto de unión a virus (2) comprende o es un péptido que es al menos un 95 % idéntico a la SEQ ID NO.

48; y

por que el resto de unión a mucina (1) comprende o es un péptido que es al menos un 95 % idéntico a la SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21 o SEQ ID NO. 22.

2. Péptido de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que el resto de unión a mucina (1) comprende o es un péptido de jacalina que es al menos un 95 % idéntico a la SEQ ID NO. 22.

3. Péptido de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que el resto de unión a mucina (1) comprende o es un péptido del factor trefoil 3 que es al menos un 95 % idéntico a la SEQ ID NO. 1.

4. Péptido de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que el resto de unión a mucina (1) comprende o es un péptido del factor trefoil 3 que es al menos un 95 % idéntico a la SEQ ID NO. 14.

5. Péptido de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que el resto de unión a mucina (1) comprende o es un péptido del factor trefoil 1 que es al menos un 95 % idéntico a la SEQ ID NO. 20.

6. Péptido de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que el resto de unión a mucina (1) comprende o es un péptido del factor trefoil 2 que es al menos un 95 % idéntico a la SEQ ID NO. 21.

7. Péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el péptido comprende al menos dos restos de unión a virus (2), en donde el resto de unión a mucina (1) está unido covalentemente al menos a uno de los al menos dos restos de unión a virus (2).

8. Péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en la prevención o el tratamiento de una infección vírica.

9. Péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque la infección vírica es una infección por el virus de la gripe A.

10. Péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado por que el virus de la gripe A es un virus de la cepa H1, H3 o H7.

11. Medicamento que comprende un péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 como principio farmacéuticamente activo.

12. Medicamento de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado por que el medicamento está diseñado y configurado para administrarse como pulverización nasal o pulverización para inhalación.

13. Método para fabricar un péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende las siguientes etapas:

a) hacer reaccionar un resto de unión a virus precursor con un primer precursor del resto de unión a mucina, comprendiendo el primer precursor del resto de unión a mucina una primera parte del resto de unión a mucina (1), obteniendo de este modo un precursor peptídico; y

b) hacer reaccionar el precursor peptídico con un segundo precursor del resto de unión a mucina, comprendiendo el segundo precursor del resto de unión a mucina una segunda parte del resto de unión a mucina (1).

14. Método de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado por que el precursor del resto de unión a virus comprende un resto 4-pentinoico unido covalentemente a un resto de unión a virus (2).

15. Método de acuerdo con las reivindicaciones 13 o 14, caracterizado por que el primer precursor del resto de unión a mucina comprende menos de la mitad de todos los aminoácidos del resto de unión a mucina (1).