ES3071925T3 - Gdnf fusion polypeptides and methods of use thereof - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a composiciones y métodos de polipéptidos de fusión de GDNF, en los que dichos polipéptidos incluyen un dominio Fc, un péptido de unión a albúmina, un dominio de fibronectina o albúmina sérica humana, unidos a una variante de GDNF directamente o mediante un enlazador. Los polipéptidos de fusión de GDNF pueden utilizarse para tratar enfermedades metabólicas, como la obesidad y la diabetes tipo 1 y tipo 2, y enfermedades neurológicas, como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y la enfermedad de Parkinson. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Polipéptidos de fusión GDNF y métodos de uso de los mismos

[0003] FONDO DE LA INVENCIÓN

[0004] La obesidad es un problema creciente en los Estados Unidos, con una prevalencia de aproximadamente el 25% de la población. El aumento de la grasa visceral y subcutánea provoca disfunciones en diversos órganos. Un peso corporal excesivo es un factor de riesgo para toda una serie de complicaciones, como la obesidad, la diabetes (por ejemplo, diabetes de tipo 1 y de tipo 2), las enfermedades cardiovasculares y varias formas de cáncer.

[0005] La resistencia a la insulina se produce cuando los tejidos periféricos requieren una cantidad elevada de insulina y está asociada a la obesidad. Cuando las células β del páncreas ya no pueden producir suficiente insulina para satisfacer la demanda, se produce hiperglucemia y aparece la diabetes de tipo 2. Se cree que los adipocitos, que aumentan en la obesidad, desempeñan un papel en este proceso. Los esfuerzos para tratar la obesidad y las enfermedades y afecciones relacionadas, incluidas las enfermedades metabólicas (especialmente la diabetes de tipo 1 y 2) y la resistencia a la insulina, han adoptado diversos enfoques que van desde la cirugía a los fármacos.

[0006] A pesar de la prevalencia de la obesidad y de enfermedades metabólicas como la diabetes (por ejemplo, diabetes de tipo 1 y de tipo 2), se dispone de pocas opciones terapéuticas. Se necesitan nuevos tratamientos para estas enfermedades metabólicas.

[0007] Boado et al., divulga una proteína de fusión GDNF para la administración dirigida de fármacos a través de la barrera hematoencefálica humana (Biotechnology and Bioengineering, vol 100, n.º 2, 2008, páginas 387-396). Mwangi et al., divulga un factor neurotrófico derivado de la línea celular glial que protege contra la obesidad inducida por una dieta rica en grasas (American Journal of Physiology - Gastrointestinal and liver physiology, vol.306, n.º 6, 2014, páginas G515-G525).

[0008] RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0009] La invención proporciona un polipéptido de fusión del factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF) que comprende la fórmula A-L-B, en la que A comprende un dominio Fc, un péptido de unión a albúmina, un dominio de fibronectina, o una albúmina sérica humana; L es un enlazador; y B es una variante de GDNF que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con una secuencia de GDNF de referencia que consiste en los aminoácidos 118-211, 117-211, 110-211, o 92-211 de SEQ ID N.º: 1, donde A se une al extremo N-terminal de la variante de GDNF mediante el enlazador, y en el que el polipéptido de fusión GDNF se une al receptor alfa-1 humano de la familia GDNF con una KD de 20 a 20.000 pM.

[0010] Los polipéptidos de fusión GDNF de la invención se unen al receptor alfa-1 humano de la familia GDNF (GFRα1) y es deseable que tengan una semivida sérica larga. La invención también presenta composiciones farmacéuticas que comprenden polipéptidos de fusión GDNF como se define en las reivindicaciones para su uso en el tratamiento y/o prevención de enfermedades metabólicas como la obesidad y la diabetes de tipo 1 y 2, y enfermedades neurológicas como la esquizofrenia, la epilepsia, la esclerosis lateral amiotrófica (ALS), la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Huntington, la ansiedad, el ictus, un tumor cerebral, y una metástasis cerebral.

[0011] En un aspecto, la invención presenta un polipéptido de fusión GDNF como se define en las reivindicaciones que tiene la fórmula A-L-B, en la que A incluye un dominio Fc; L es un enlazador; y B incluye una variante de GDNF que tiene al menos 95%, 97%, o 100% de identidad de secuencia con una secuencia de GDNF de referencia que consiste en los aminoácidos 118-211 de SEQ ID N.º: 1.

[0012] En algunas realizaciones, el polipéptido de fusión GDNF como se define en las reivindicaciones incluye además un péptido de unión a albúmina unido al N-terminal del dominio Fc.

[0013] En otras realizaciones, el polipéptido de fusión GDNF como se define en las reivindicaciones incluye además un dominio de fibronectina unido al N-terminal del dominio Fc.

[0014] En otras realizaciones, el polipéptido de fusión GDNF como se define en las reivindicaciones incluye además una albúmina sérica humana unida al N-terminal del dominio Fc.

[0015] En otro aspecto, la invención presenta un polipéptido de fusión GDNF como se define en las reivindicaciones que tiene la fórmula A-L-B, en la que A incluye un péptido de unión a albúmina; L es un enlazador; y B incluye una variante de GDNF que tiene al menos 95%, 97%, o 100% de identidad de secuencia con una secuencia de GDNF de referencia que consiste en los aminoácidos 118-211 de SEQ ID N.º: 1.

[0016] [0012]En otro aspecto, la invención presenta un polipéptido de fusión GDNF como se define en las reivindicaciones que tiene la fórmula A-L-B, en la que A incluye un dominio de fibronectina; L es un enlazador; y B incluye una variante de GDNF que tiene al menos 95%, 97%, o 100% de identidad de secuencia con una secuencia de GDNF de referencia que consiste en los aminoácidos 118-211 de SEQ ID N.º: 1.

[0017] En otro aspecto más, la invención presenta un polipéptido de fusión GDNF como se define en las reivindicaciones que tiene la fórmula A-L-B, en la que A incluye una albúmina de suero humano; L es un enlazador; y B incluye una variante de GDNF que tiene al menos 95%, 97%, o 100% de identidad de secuencia) con una secuencia de GDNF de referencia que consiste en los aminoácidos 118-211 de SEQ ID N.º: 1.

[0018] En ciertas realizaciones de cualquiera de los aspectos anteriores, la variante de GDNF definida en las reivindicaciones está formada por los aminoácidos 92-211 de SEQ ID N.º: 1 o un fragmento del mismo.

[0019] En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos anteriores, la secuencia de GDNF de referencia consiste en los aminoácidos 117-211, los aminoácidos 110-211 o los aminoácidos 92-211 de SEQ ID N.º: 1.

[0020] En algunas realizaciones, la variante de GDNF definida en las reivindicaciones incluye sustituciones de aminoácidos con respecto al GDNF humano de tipo salvaje que reducen la proteólisis entre los residuos de aminoácidos 85 y 120 de SEQ ID N.º: 1. En ciertas realizaciones, la variante de GDNF como se define en las reivindicaciones incluye sustituciones de aminoácidos de uno o más de los siguientes residuos en relación con el GDNF humano de tipo salvaje: R88, R89, R91, R93, R104, K106, R108, R109, R112, K114 y R116, en relación con la secuencia de SEQ ID N.º: 1, para un aminoácido no básico.

[0021] En algunas realizaciones, el péptido de unión a albúmina incluye la secuencia de SEQ ID N.º: 2.

[0022] En otras realizaciones, el dominio Fc no forma un dímero. En otras realizaciones, el dominio Fc no incluye un dominio bisagra.

[0023] En algunas realizaciones, el dominio Fc incluye una o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos: T366W, T366Y, T394W, F405W, Y349T, Y349E, Y349V, L351T, L351H, L351N, L352K, P353S, S354D, D356K, D356R, D356S, E357K, E357R, E357Q, S364A, T366E, L368T, L368Y, L368E, K370E, K370D, K370Q, K392E, K392D, T394N, P395N, P396T, V397T, V397Q, L398T, D399K, D399R, D399N, F405T, F405H, F405R, Y407T, Y407H, Y407I, K409E, K409D, K409T, y K409I, en relación con la secuencia de la IgG1 humana. La secuencia del dominio Fc de tipo salvaje se muestra en SEQ ID N.º: 3.

[0024] En algunas realizaciones, el enlazador en el polipéptido de fusión GDNF es un enlace. En otras realizaciones, el enlazador en el polipéptido de fusión GDNF es un espaciador. En realizaciones particulares, el espaciador incluye la secuencia de cualquiera de los SEQ ID N.º: 4-29.

[0025] En algunas realizaciones, el dominio de fibronectina en el polipéptido de fusión GDNF es un dominio de fibronectina tipo III (SEQ ID N.º: 30) que tiene los aminoácidos 610-702 de la secuencia de UniProt ID N.º: P02751. En otras realizaciones, un dominio de fibronectina es una proteína adnectina.

[0026] En algunas realizaciones, la albúmina sérica humana en el polipéptido de fusión GDNF tiene la secuencia de UniProt ID N.º: P02768 (SEQ ID N.º: 31).

[0027] En algunas realizaciones, el polipéptido de fusión GDNF de la invención tiene una semivida sérica de 3 a 60 días.

[0028] En otras realizaciones, el polipéptido de fusión GDNF se une al receptor alfa-1 humano de la familia GDNF (GFRα1) con una K<D>de 20 a 20.000 pM.

[0029] En algunas realizaciones, el polipéptido de fusión GDNF está codificado por un único marco de lectura abierto.

[0030] En otro aspecto, la invención presenta una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión GDNF como se define en las reivindicaciones.

[0031] En otro aspecto más, la invención presenta un vector que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión GDNF como se define en las reivindicaciones.

[0032] En otro aspecto más, la invención presenta una célula huésped que expresa un polipéptido de fusión GDNF como se define en las reivindicaciones, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión GDNF como se define en las reivindicaciones, o un vector que contiene dicha molécula de ácido nucleico.

[0033] En ciertas realizaciones, la célula huésped es una célula de mamífero (por ejemplo, una célula de ovario de hámster chino (CHO)). En otras realizaciones, la célula huésped es un riñón embrionario humano (HEK) (p. ej, HEK293, HEK 293F), HeLa, COS, PC3, Vero, MC3T3, NS0, Sp2/0, VERY, BHK, MDCK, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20, T47D, NS0 (una línea celular de mieloma murino que no produce endógenamente ninguna cadena de inmunoglobulina), CRL7O3O, o célula HsS78Bst.

[0034] En otras realizaciones, la célula huésped es una célula bacteriana (por ejemplo, una célulaE. coli). Ejemplos de cepas deE. coliincluyen, pero no se limitan a,E. coli294 (ATCC<®>31,446),E. coliλ 1776 (ATCC<®>31,537,E.coliBL21 (DE3) (ATCC<®>BAA-1025), yE. coliRV308 (ATCC<®>31,608).

[0035] Un método de preparación de un polipéptido de fusión GDNF de la invención incluye los pasos de a) proporcionar una célula huésped que incluya una molécula de ácido nucleico que codifique un polipéptido de fusión GDNF descrito en el presente documento o un vector que contenga dicha molécula de ácido nucleico, y b) expresar la molécula de ácido nucleico o el vector en la célula huésped en condiciones que permitan la producción del polipéptido de fusión GDNF.

[0036] En algunas realizaciones, la célula huésped utilizada en el método de preparación de cualquier polipéptido de fusión GDNF de la invención es una célula CHO. En otras realizaciones, la célula huésped utilizada en el método es un riñón embrionario humano (HEK) (p. ej, HEK293, HEK 293F), HeLa, COS, PC3, Vero, MC3T3, NS0, Sp2/0, VERY, BHK, MDCK, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20, T47D, NS0 (una línea celular de mieloma murino que no produce endógenamente ninguna cadena de inmunoglobulina), CRL7O3O, o célula HsS78Bst.

[0037] En otras realizaciones, la célula huésped utilizada en el método es una célula bacteriana (por ejemplo, una célulaE. coli). Ejemplos de cepas deE. coliincluyen, pero no se limitan a,E. coli294 (ATCC<®>31,446),E. coliλ 1776 (ATCC<®>31,537,E. coli BL21(DE3) (ATCC<®>BAA-1025), yE. coliRV308 (ATCC<®>31,608).

[0038] En otro aspecto, la invención presenta una composición farmacéutica que incluye un polipéptido de fusión GDNF de la invención, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión GDNF de la invención, o un vector que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión GDNF de la invención, y uno o más portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables, en los que el polipéptido de fusión GDNF está en una cantidad terapéuticamente eficaz.

[0039] En otro aspecto más, la invención presenta un polipéptido de fusión GDNF como se define en las reivindicaciones para su uso en un método de tratamiento y/o prevención de una enfermedad metabólica en un sujeto. El método incluye el paso de administrar al sujeto un polipéptido de fusión con GDNF, una molécula de ácido nucleico, un vector, o una composición farmacéutica descritos en el presente documento.

[0040] En algunas realizaciones, la enfermedad metabólica se selecciona del grupo formado por la obesidad, la diabetes de tipo 1 y la diabetes de tipo 2.

[0041] En algunas realizaciones, la enfermedad metabólica es la obesidad. En otras realizaciones, la enfermedad metabólica es la diabetes de tipo 1. En otras realizaciones, la enfermedad metabólica es la diabetes de tipo 2.

[0042] En otras realizaciones, el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad metabólica en un sujeto reduce el peso corporal y/o el porcentaje de aumento de peso corporal del sujeto.

[0043] En algunas realizaciones, el tratamiento y/o la prevención no afectan al apetito por la ingesta de alimentos del sujeto. En otras realizaciones, el tratamiento y/o la prevención reducen la adiposidad del sujeto. En otras realizaciones, el tratamiento y/o la prevención reducen la adiposidad del sujeto sin afectar a la masa magra. En otras realizaciones, el tratamiento y/o la prevención reducen el peso de las bolsas de grasa epididimarias y perirrenales del sujeto. En otras realizaciones, el tratamiento y/o la prevención reducen el nivel de insulina en ayunas del sujeto, aumentan la tasa de eliminación de glucosa del sujeto, y/o mejoran el perfil lipídico sérico del sujeto.

[0044] En aún otro aspecto, la invención presenta un polipéptido de fusión GDNF como se define en las reivindicaciones para su uso en un método de tratamiento y/o prevención de una enfermedad neurológica en un sujeto. El método incluye el paso de administrar al sujeto un polipéptido de fusión GDNF, una molécula de ácido nucleico, un vector o una composición farmacéutica descrita en el presente documento.

[0045] En algunas realizaciones, la enfermedad neurológica se selecciona del grupo que consiste en esquizofrenia, epilepsia, esclerosis lateral amiotrófica (ALS), enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, ansiedad, ictus, un tumor cerebral, y una metástasis cerebral.

[0046] Definiciones

[0047] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "variante de GDNF" se refiere a un polipéptido que contiene un mutante o fragmento de GDNF humano de tipo salvaje (definido más adelante en el presente documento) que tiene una semivida sérica más larga que el GDNF humano de tipo salvaje. Las variantes de GDNF reivindicadas tienen al menos un 95%, 97%, o 100% de identidad de secuencia con una secuencia de GDNF de referencia (definida en el presente documento) consistente en los aminoácidos 118-211, 117-211, 110-211, o 92-211 de SEQ ID N.º: 1. En algunas realizaciones, una variante de GDNF contiene sustituciones de aminoácidos en relación con el GDNF humano de tipo salvaje que reducen la proteólisis entre los residuos de aminoácidos 85 y 120 de SEQ ID N.º: 1. Dichas sustituciones de aminoácidos se describen en detalle más adelante.

[0048] Tal como se utiliza aquí, el término "GDNF humano de tipo salvaje" se refiere a la forma natural del factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF) humano que tiene la secuencia de SEQ ID N.º: 1.

[0049] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "dominio Fc" se refiere a una proteína que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 85%, 90%, 95%, 97%, o 100% de identidad de secuencia) con un dominio Fc humano que incluye al menos un dominio C<H>2 y un dominio C<H>3. Opcionalmente, el dominio Fc contiene una o más sustituciones de aminoácidos que reducen o inhiben la dimerización del dominio Fc. Opcionalmente, el dominio Fc contiene un dominio bisagra. El dominio Fc puede ser de anticuerpos de inmunoglobulina de isotipo IgG, IgE, IgM, IgA, o IgD. Además, el dominio Fc puede ser un subtipo IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, o IgG4). El dominio Fc también puede ser un dominio Fc no natural, por ejemplo, un dominio Fc recombinante.

[0050] Tal como se utiliza aquí, el término "péptido de unión a albúmina" se refiere a una secuencia de aminoácidos de 12 a 16 aminoácidos que tiene afinidad por la albúmina sérica y funciona para unirse a ella. Un péptido de unión a albúmina puede ser de diferentes orígenes, por ejemplo, humano, de ratón, o de rata. En algunas realizaciones, un péptido de unión a albúmina tiene la secuencia DICLPRWGCLW (SEQ ID N.º: 2).

[0051] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "dominio de fibronectina" se refiere a una glicoproteína de alto peso molecular de la matriz extracelular, o a un fragmento de la misma, que se une, por ejemplo, a proteínas receptoras de membrana como las integrinas y a componentes de la matriz extracelular como los colágenos y las fibrinas. En algunas realizaciones, un dominio de fibronectina es un dominio de fibronectina tipo III (SEQ ID N.º: 30) que tiene los aminoácidos 610-702 de la secuencia de UniProt ID N.º: P02751. En otras realizaciones, un dominio de fibronectina es una proteína adnectina.

[0052] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "albúmina sérica humana" se refiere a la proteína albúmina presente en el plasma sanguíneo humano. La seroalbúmina humana es la proteína más abundante en la sangre. Constituye aproximadamente la mitad de las proteínas del suero sanguíneo. En algunas realizaciones, una albúmina sérica humana tiene la secuencia de UniProt ID N.º: P02768 (SEQ ID N.º: 31).

[0053] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "enlazador" se refiere a un enlace entre dos elementos, por ejemplo, dominios proteicos. Un enlazador puede ser un enlace covalente o un espaciador. El término "enlace" se refiere a un enlace químico, por ejemplo, un enlace amida o un enlace disulfuro, o cualquier tipo de enlace creado a partir de una reacción química, por ejemplo, la conjugación química. El término "espaciador" se refiere a una fracción (por ejemplo, un polímero de polietilenglicol (PEG)) o una secuencia de aminoácidos (por ejemplo, una secuencia de 3-200 aminoácidos) que se encuentra entre dos polipéptidos o dominios polipeptídicos para proporcionar espacio y/o flexibilidad entre los dos polipéptidos o dominios polipeptídicos. Un espaciador de aminoácidos puede formar parte de la secuencia primaria de un polipéptido (por ejemplo, unido a los polipéptidos o dominios polipeptídicos espaciados a través del esqueleto polipeptídico).

[0054] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "unido" se utiliza para describir la combinación o unión de dos o más elementos, componentes, o dominios proteicos, por ejemplo, polipéptidos, por medios que incluyen la conjugación química, medios recombinantes, y enlaces químicos, por ejemplo, enlaces disulfuro y enlaces amida. Por ejemplo, dos polipéptidos simples pueden unirse para formar una estructura proteica contigua mediante conjugación química, un enlace químico, un enlazador peptídico o cualquier otro medio de enlace covalente. En algunas realizaciones, un dominio Fc se une a una variante de GDNF mediante un enlazador peptídico, en el que el N-terminal del enlazador peptídico se une al C-terminal del dominio Fc mediante un enlace químico, por ejemplo, un enlace peptídico, y el C-terminal del enlazador peptídico se une al N-terminal de la variante de GDNF mediante un enlace químico, por ejemplo, un enlace peptídico. En otras realizaciones, el C-terminal de un péptido de unión a albúmina se une al N-terminal de una variante de GDNF mediante un enlazador del mismo modo que se ha mencionado anteriormente.

[0055] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "receptor alfa-1 humano de la familia GDNF (GFRα1)" se refiere a una proteína de la superficie celular unida a glucosilfosfatidilinositol (GPI) que pertenece al subtipo de receptor α de la familia GDNF que consta de al menos cuatro miembros: GFRα1, GFRα2, GFRα3, y GFRα4.

[0056] [0051]Tal como se utiliza aquí, el término "afinidad de unión" se refiere a la fuerza de la interacción de unión entre dos moléculas. En general, la afinidad de unión se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre una molécula y su pareja de unión, como un polipéptido de fusión GDNF de la invención y su receptor diana (por ejemplo, el receptor alfa-1 humano de la familia GDNF (GFRα1)). A menos que se indique lo contrario, la afinidad de unión se refiere a la afinidad de unión intrínseca, que refleja una interacción 1:1 entre los miembros de un par de unión. La afinidad de unión entre dos moléculas suele describirse mediante la constante de disociación (K<D>) o la constante de afinidad (K<A>). Dos moléculas que tienen una baja afinidad de unión entre sí generalmente se unen lentamente, tienden a disociarse con facilidad y muestran una gran K<D>. Dos moléculas que tienen una gran afinidad entre sí generalmente se unen con facilidad, tienden a permanecer unidas más tiempo, y presentan una K<D>pequeña. La K<D>de dos moléculas que interactúan puede determinarse utilizando métodos y técnicas bien conocidos en la técnica, por ejemplo, la resonancia de plasmón superficial. K<D>se calcula como la relación entre k<off>/k<on>. En el presente documento se describen otras realizaciones ilustrativas específicas (véase, por ejemplo, el Ejemplo 2). El polipéptido de fusión GDNF como se define en las reivindicaciones se une al receptor alfa-1 humano de la familia GDNF (GFRα1) con una K<D>de, por ejemplo, 20 a 20.000 pM.

[0058] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "semivida sérica" se refiere, en el contexto de la administración de una proteína terapéutica a un sujeto, al tiempo necesario para que la concentración plasmática de la proteína en el sujeto se reduzca a la mitad. La proteína puede redistribuirse o eliminarse del torrente sanguíneo, o degradarse, es decir, mediante proteólisis. Por ejemplo, un polipéptido de fusión GDNF de la invención que incluye una variante de GDNF, que tiene el sitio de escisión proteolítica (es decir, los aminoácidos 85-120 de SEQ ID N.º: 1) eliminado o contiene sustituciones de aminoácidos dentro del sitio de escisión proteolítica, tiene una semivida sérica más larga que el GDNF humano de tipo salvaje. La semivida sérica de una proteína puede medirse utilizando técnicas bien conocidas en la técnica, por ejemplo, el ensayo inmunoenzimático (ELISA) (véanse, por ejemplo, el Ejemplo 4 y la FIG.2), western blot, microcopia, y espectrometría de masas. En algunas realizaciones, un polipéptido de fusión GDNF como el descrito en el presente documento tiene una semivida sérica de, por ejemplo, 3 a 60 días.

[0060] Tal y como se utiliza aquí, el término "proteólisis" se refiere al proceso de descomposición de las proteínas en polipéptidos o aminoácidos más pequeños mediante la hidrólisis de la espina dorsal peptídica. El GDNF humano de tipo salvaje incluye un sitio de corte proteolítico potencial entre los residuos de aminoácidos 85 y 120 de SEQ ID N.º: 1 y, por tanto, tiene una semivida sérica corta. Los polipéptidos de fusión GDNF de la invención incluyen variantes de GDNF que tienen el sitio de escisión proteolítica eliminado o sustituciones de aminoácidos dentro del sitio de escisión proteolítica de tal manera que los polipéptidos de fusión GDNF tienen una proteólisis reducida y una semivida sérica aumentada en comparación con el GDNF humano de tipo salvaje. En algunas realizaciones, la variante GDNF en un polipéptido de fusión GDNF tiene el sitio de corte proteolítico (es decir, los residuos de aminoácidos 85 y 120 de SEQ ID N.º: 1) suprimido o alterado en el sitio de escisión proteolítica.

[0062] Como se usa aquí, el término "aminoácido no básico" se refiere a un aminoácido cuya cadena lateral no tiene una carga positiva a, por ejemplo, pH fisiológico, por ejemplo, pH 7,4. Los aminoácidos no básicos son la glicina, la alanina, la valina, la isoleucina, la leucina, la fenilalanina, el triptófano, la metionina, la cisteína, la asparagina, la glutamina, la serina, la treonina, la tirosina, la prolina, el ácido aspártico, y el ácido glutámico.

[0064] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "marco de lectura abierto único" se refiere a la disposición de los residuos de ácido nucleico (es decir, ADN) en una cadena única que puede ser traducida y expresada en un solo polipéptido por la maquinaria molecular dentro de una célula huésped. Los residuos de ácido nucleico de un único marco de lectura abierto pueden codificar uno o varios genes dispuestos secuencialmente en serie.

[0066] Tal como se utiliza aquí, el término "molécula de ácido nucleico" se refiere a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud, e incluye ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos o bases modificados, y/o sus análogos, o cualquier sustrato que pueda ser incorporado a un polímero por la ADN o ARN polimerasa, o por una reacción sintética. Una molécula de ácido nucleico puede contener nucleótidos modificados, como los nucleótidos metilados y sus análogos. Si está presente, la modificación de la estructura nucleotídica puede impartirse antes o después del ensamblaje del polímero. La secuencia de nucleótidos puede estar interrumpida por componentes no nucleotídicos. Una molécula de ácido nucleico puede modificarse aún más después de la síntesis, por ejemplo conjugándola con una etiqueta. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, la sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales por un análogo, las modificaciones internucleotídicas como, por ejemplo, las que tienen enlaces no cargados (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriesteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), las que contienen elementos colgantes, como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, ply-L-lisina, etc.), los que contienen intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), los que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radiactivos, boro, metales oxidantes, etc.), los que contienen alquiladores, los que tienen enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), así como formas no modificadas la molécula o moléculas de ácido nucleico. Además, cualquiera de los grupos hidroxilo normalmente presentes en los azúcares puede sustituirse, por ejemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegerse mediante grupos protectores estándar o activarse para preparar enlaces adicionales con nucleótidos adicionales, o puede conjugarse con soportes sólidos o semisólidos. Los OH terminales 5' y 3' pueden fosforilarse o sustituirse con aminas o grupos orgánicos de cobertura de 1 a 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos también pueden derivarse a grupos protectores estándar. Las moléculas de ácido nucleico también pueden contener formas análogas de azúcares ribosa o desoxirribosa generalmente conocidas en la técnica, incluyendo, por ejemplo, 2'-O-metilo-, 2'-O-alilo-, 2'-fluoro-, o 2'-azido-ribosa, análogos de azúcares carbocíclicos, azúcares alfa-anoméricos, azúcares epiméricos como la arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares piranosas, azúcares furanosas, sedoheptulosas, análogos acíclicos, y análogos de nucleósidos básicos como el ribosido de metilo. Uno o más enlaces fosfodiéster pueden sustituirse por grupos enlazantes alternativos. Estos grupos enlazantes alternativos incluyen, entre otros, realizaciones en los que el fosfato se sustituye por P(O)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), (O)NR<2>("amidato"), P(O)R, P(O)OR', CO, o CH<2>("formacetal"), en los que cada R o R' es independientemente H o alquilo sustituido o no sustituido (1-20 C) que contiene opcionalmente un enlace éter (-O-), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, o araldilo. No es necesario que todos los enlaces de una molécula de ácido nucleico sean idénticos. La descripción anterior se aplica a todas las moléculas de ácido nucleico mencionadas en el presente documento, incluidos el ADN y el ARN.

[0068] [0057]Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "polipéptido" describe un polímero único en el que los monómeros son residuos de aminoácidos que se unen mediante enlaces amida. Por polipéptido se entiende cualquier secuencia de aminoácidos, ya sea natural, recombinante, o producida sintéticamente.

[0069] Como se usa aquí, el término "tratar y/o prevenir" se refiere al tratamiento y/o prevención de una enfermedad, por ejemplo, una enfermedad metabólica (por ejemplo, obesidad, diabetes Tipo 1 y Tipo 2) o una enfermedad neurológica (por ejemplo, ALS y enfermedad de Parkinson), usando composiciones de la invención. Generalmente, el tratamiento de una enfermedad metabólica o neurológica tiene lugar después de que un sujeto haya desarrollado la enfermedad metabólica o neurológica y/o ya se le haya diagnosticado la enfermedad metabólica o neurológica. La prevención de una enfermedad metabólica o neurológica se refiere a los pasos o procedimientos tomados cuando un sujeto está en riesgo de desarrollar la enfermedad metabólica o neurológica. El sujeto puede mostrar signos o síntomas leves que un médico considere indicios o factores de riesgo de desarrollar la enfermedad metabólica o neurológica, pero aún no ha desarrollado la enfermedad.

[0070] Como se usa aquí, el término "enfermedad metabólica" se refiere a una enfermedad, trastorno, o síndrome que está relacionado con el metabolismo de un sujeto, como la descomposición de carbohidratos, proteínas, y grasas en los alimentos para liberar energía, y la conversión de sustancias químicas en otras sustancias y su transporte dentro de las células para la utilización y/o almacenamiento de energía. Algunos síntomas de una enfermedad metabólica incluyen triglicéridos séricos elevados, colesterol de baja densidad (LDL) elevado, colesterol de alta densidad (HDL) bajo, y/o niveles elevados de insulina en ayunas, glucosa plasmática en ayunas elevada, obesidad abdominal (central), y tensión arterial elevada. Las enfermedades metabólicas aumentan el riesgo de desarrollar otras enfermedades, como las cardiovasculares. En la presente invención, las enfermedades metabólicas incluyen, entre otras, la obesidad, la diabetes de tipo 1 y la diabetes de tipo 2.

[0071] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "porcentaje de aumento de peso corporal" se refiere al porcentaje de peso corporal ganado en comparación con un peso corporal previo de un sujeto en un momento anterior. El porcentaje de aumento de peso corporal puede calcularse del siguiente modo:

[0072] 100 × [(peso corporal en un momento posterior − peso corporal en un momento anterior) / (peso corporal en un momento anterior)]

[0073] En la presente invención, la administración de un polipéptido de fusión GDNF, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión GDNF, o un vector que contiene dicha molécula de ácido nucleico a un sujeto reduce el porcentaje de aumento de peso corporal del sujeto (véanse, por ejemplo, el Ejemplo 5 y la FIG.3).

[0074] Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "apetito por la ingesta de alimentos" se refiere al deseo o necesidad natural de comida de un sujeto. El apetito por la ingesta de alimentos de un sujeto puede monitorizarse midiendo la cantidad de alimentos consumidos tras la administración del polipéptido de fusión GDNF (véanse, p. ej., el Ejemplo 6 y la FIG.4). En la presente invención, la administración de un polipéptido de fusión GDNF, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión GDNF, o un vector que contiene dicha molécula de ácido nucleico a un sujeto no afecta al apetito del sujeto para la ingesta de alimentos.

[0075] Como se usa aquí, el término "adiposidad" se refiere a la grasa almacenada en el tejido adiposo de un sujeto. En la presente invención, la administración de un polipéptido de fusión GDNF, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión GDNF, o un vector que contiene dicha molécula de ácido nucleico a un sujeto reduce la adiposidad del sujeto sin afectar a la masa magra.

[0076] Como se usa aquí, el término "masa magra" se refiere a un componente de la composición corporal que incluye, por ejemplo, masa magra, grasa corporal, y fluido corporal. Normalmente, la masa magra se calcula restando los pesos de la grasa y los fluidos corporales del peso corporal total (véanse, por ejemplo, el Ejemplo 7 y la FIG.5). Normalmente, la masa magra de un sujeto se sitúa entre el 60% y el 90% del peso corporal total. En la presente invención, la administración de un polipéptido de fusión GDNF, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión GDNF, o un vector que contiene dicha molécula de ácido nucleico a un sujeto reduce la adiposidad (es decir, la grasa) del sujeto sin afectar a la masa magra.

[0077] Tal como se utiliza aquí, el término "almohadillas de grasa epididimaria y perirrenal" se refiere a las células de grasa estrechamente empaquetadas en el epidídimo y alrededor del riñón. En la presente invención, la administración de un polipéptido de fusión GDNF, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión GDNF, o un vector que contiene dicha molécula de ácido nucleico a un sujeto reduce los pesos de las almohadillas de grasa epididimaria y perirrenal del sujeto.

[0078] [0065]Como se usa aquí, el término "insulina en ayunas" se refiere al nivel de insulina de un sujeto mientras que el sujeto no ha tenido ninguna ingesta de alimentos durante un período de tiempo (es decir, 12-24 horas). El nivel de insulina en ayunas se utiliza en el diagnóstico de enfermedades metabólicas. El nivel de insulina en ayunas también se utiliza como indicador de si un sujeto corre el riesgo de desarrollar una enfermedad metabólica. Normalmente, en un sujeto que padece diabetes de tipo 1, su nivel de insulina en ayunas es bajo en comparación con el de un sujeto sano. En un sujeto que padece resistencia a la insulina (es decir, diabetes de tipo 2), el nivel de insulina en ayunas del sujeto es elevado en comparación con el de un sujeto sano. En la presente invención, la administración de un polipéptido de fusión GDNF, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión GDNF, o un vector que contiene dicha molécula de ácido nucleico a un sujeto disminuye el nivel de insulina en ayunas del sujeto.

[0079] Como se usa aquí, el término "tasa de eliminación de glucosa" se refiere a la tasa a la cual la glucosa es eliminada de la sangre. La tasa de eliminación de glucosa puede medirse en una prueba de tolerancia a la glucosa (GTT) (véanse, p. ej., el Ejemplo 8 y la FIG. 6). En una GTT, se administra a un sujeto una determinada cantidad de glucosa y posteriormente se toman muestras de sangre para determinar la rapidez con la que se elimina de la sangre. La tasa de eliminación de glucosa puede utilizarse como parámetro para diagnosticar y/o determinar el riesgo de desarrollar enfermedades metabólicas como la obesidad, la diabetes y la resistencia a la insulina.

[0080] Tal como se utiliza aquí, el término "perfil lipídico sérico" se refiere a la medición de la distribución de diferentes tipos de lípidos y lipoproteínas en el suero de un sujeto. Dicha medición puede realizarse mediante un panel de análisis de sangre. Los tipos de lípidos y lipoproteínas en el suero de un sujeto incluyen, entre otros, colesterol (por ejemplo, lipoproteína de alta densidad [HDL] y lipoproteína de baja densidad [LDL]), triglicéridos, y ácidos grasos libres (FFA). La distribución de los distintos tipos de lípidos y lipoproteínas puede utilizarse como parámetro para diagnosticar y/o determinar el riesgo de desarrollar enfermedades metabólicas como la obesidad, la diabetes, y la resistencia a la insulina. Un nivel elevado de colesterol, especialmente de lipoproteínas de baja densidad, se considera generalmente un indicio o un factor de riesgo para desarrollar determinadas enfermedades metabólicas o, en algunos casos médicos graves, enfermedades cardiovasculares. En la presente invención, la administración de un polipéptido de fusión GDNF, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión GDNF, o un vector que contiene dicha molécula de ácido nucleico a un sujeto mejora el perfil lipídico sérico del sujeto, de forma que se reducen los niveles de colesterol (especialmente lipoproteína de baja densidad) y triglicéridos.

[0081] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "inyección hidrodinámica" se refiere a un método de administración de genesin vivoen el que un plásmido de ingeniería (por ejemplo, un plásmido viral) que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de interés (por ejemplo, un polipéptido de fusión GDNF de la invención) en un gran volumen de fluido se inyecta rápidamente por vía intravenosa en un sujeto. La inyección hidrodinámica utiliza una presión hidrodinámica controlada en las venas para aumentar la permeabilidad celular de forma que la presión elevada de la inyección rápida del gran volumen de fluido provoque la extravasación de fluido y plásmidos de la vena. Generalmente, la molécula de ácido nucleico se pone bajo el control de un promotor fuerte en el plásmido diseñado. La expresión de la molécula de ácido nucleico es impulsada principalmente por el hígado. En ratones, la inyección hidrodinámica suele realizarse mediante la inyección del plásmido en la vena de la cola.

[0082] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "porcentaje (%) de identidad de secuencia" se refiere al porcentaje de residuos de aminoácidos (o ácidos nucleicos) de una secuencia candidata, por ejemplo, la secuencia de una variante del GDNF, que son idénticos a los residuos de aminoácidos (o ácidos nucleicos) de una secuencia de referencia, por ejemplo, un GDNF humano de tipo salvaje, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia (es decir, se pueden introducir huecos en una o ambas secuencias candidata y de referencia para una alineación óptima y se pueden descartar las secuencias no homólogas a efectos de comparación). La alineación para determinar el porcentaje de identidad puede lograrse de varias maneras que están dentro de la técnica, por ejemplo, utilizando software informático disponible públicamente como BLAST, ALIGN, o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros adecuados para medir la alineación, incluidos los algoritmos necesarios para lograr la máxima alineación en toda la longitud de las secuencias comparadas. En algunas realizaciones, el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos (o ácidos nucleicos) de una secuencia candidata dada con, o frente a una secuencia de referencia dada (que puede expresarse alternativamente como una secuencia candidata dada que tiene o incluye un cierto porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos (o ácidos nucleicos) con, o frente a una secuencia de referencia dada) se calcula como sigue:

[0083] 100 x (fracción de A/B)

[0084] donde A es el número de residuos de aminoácidos (o ácidos nucleicos) considerados idénticos en el alineamiento de la secuencia candidata y la secuencia de referencia, y donde B es el número total de residuos de aminoácidos (o ácidos nucleicos) en la secuencia de referencia. En algunas realizaciones en las que la longitud de la secuencia candidata no es igual a la longitud de la secuencia de referencia, el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos (o ácidos nucleicos) de la secuencia candidata con la secuencia de referencia no sería igual al porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos (o ácidos nucleicos) de la secuencia de referencia con la secuencia candidata.

[0085] Una secuencia de referencia alineada para su comparación con una secuencia candidata puede mostrar que la secuencia candidata presenta una identidad de entre el 50% y el 100% en toda la longitud de la secuencia candidata o en una porción seleccionada de residuos de aminoácidos (o ácidos nucleicos) contiguos de la secuencia candidata. La longitud de la secuencia candidata alineada a efectos de comparación es al menos el 30%, por ejemplo, al menos el 40%, por ejemplo, al menos el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 90%, o el 100% de la longitud de la secuencia de referencia. Cuando una posición de la secuencia candidata está ocupada por el mismo residuo de aminoácido (o ácido nucleico) que la posición correspondiente de la secuencia de referencia, las moléculas son idénticas en esa posición.

[0086] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "secuencia GDNF de referencia" se refiere a una secuencia base con la que se pueden comparar otras secuencias, es decir, la secuencia de una variante GDNF, para calcular el porcentaje de identidad de secuencia de, por ejemplo, la secuencia de una variante GDNF, con la secuencia GDNF de referencia. El número total de residuos de aminoácidos (o ácidos nucleicos) en la secuencia GDNF de referencia se utiliza normalmente en dicha comparación. En la fórmula descrita anteriormente, 100 x (fracción de A/B), que calcula el porcentaje de identidad de secuencia de una secuencia candidata, por ejemplo, la secuencia de una variante de GDNF, con una secuencia de referencia, por ejemplo, una secuencia de GDNF de referencia, A es el número de residuos de aminoácidos (o ácidos nucleicos) en la secuencia de una variante de GDNF que son idénticos a los residuos en las posiciones correspondientes en la secuencia de GDNF de referencia, y B es el número total de residuos de aminoácidos (o ácidos nucleicos) en la secuencia de GDNF de referencia.

[0088] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "célula huésped" se refiere a un vehículo que incluye los componentes celulares necesarios, por ejemplo, orgánulos, necesarios para expresar proteínas a partir de sus correspondientes ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos suelen estar incluidos en vectores de ácidos nucleicos que pueden introducirse en la célula huésped mediante técnicas convencionales conocidas en la técnica (por ejemplo, transformación, transfección, electroporación, precipitación de fosfato cálcico, microinyección directa, etc.). Una célula huésped puede ser una célula procariota, por ejemplo, una célula bacteriana, o una célula eucariota, por ejemplo, una célula de mamífero (por ejemplo, una célula CHO). Como se describe en el presente documento, se utiliza una célula huésped para expresar moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos de fusión GDNF de la invención.

[0090] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otra molécula de ácido nucleico a la que se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle circular de ADN de doble cadena en el que se pueden ligar segmentos adicionales de ADN. Otro tipo de vector es el vector fago. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que se pueden ligar segmentos adicionales de ADN al genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicarse de forma autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores episómicos de mamíferos). Otros vectores (p. ej., los vectores no episomales de mamíferos) pueden integrarse en el genoma de una célula huésped tras su introducción en la célula huésped, y de este modo se replican junto con el genoma huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de los genes a los que están vinculados operativamente. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión recombinante" (o simplemente, "vectores recombinantes"). En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante suelen adoptar la forma de plásmidos. En algunas realizaciones, un vector puede incluir un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) que permite la expresión de múltiples polipéptidos de fusión GDNF. En algunas realizaciones de la invención, se utilizan vectores virales para la administración y expresiónin vivode moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos de fusión GDNF de la invención. Los vectores virales para la administración de genes incluyen, entre otros, vectores retrovirales, vectores adenovirales, vectores poxvirales (por ejemplo, vectores virales de vaccinia, como la Vaccinia Ankara Modificada (MVA)), vectores virales adenoasociados, y vectores alfavirales.

[0092] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "sujeto" se refiere a un mamífero, por ejemplo, preferiblemente un ser humano. Entre los mamíferos se incluyen, entre otros, los seres humanos y los animales domésticos y de granja, como monos (por ejemplo, un mono cynomolgus), ratones, perros, gatos, caballos, y vacas, etc.

[0094] Como se usa aquí, el término "composición farmacéutica" se refiere a una formulación medicinal o farmacéutica que contiene un ingrediente activo así como excipientes y diluyentes para permitir que el principio activo sea adecuado para el método de administración. La composición farmacéutica de la presente invención incluye componentes farmacéuticamente aceptables que son compatibles con el polipéptido de fusión GDNF, la molécula o moléculas de ácido nucleico que codifican el polipéptido de fusión GDNF, o un vector que contiene dicha molécula o moléculas de ácido nucleico. La composición farmacéutica puede presentarse en forma acuosa para administración intravenosa o subcutánea o en forma de comprimido o cápsula para administración oral.

[0096] Tal como se utiliza aquí, el término "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un excipiente o diluyente en una composición farmacéutica. El portador farmacéuticamente aceptable debe ser compatible con los demás ingredientes de la formulación y no perjudicial para el receptor. En la presente invención, el portador farmacéuticamente aceptable debe proporcionar una estabilidad farmacéutica adecuada al polipéptido de fusión GDNF, a la molécula o moléculas de ácido nucleico que codifican el polipéptido de fusión GDNF, o a un vector que contenga dicha molécula o moléculas de ácido nucleico. La naturaleza del portador difiere según el modo de administración. Por ejemplo, para la administración intravenosa, generalmente se utiliza un portador de solución acuosa; para la administración oral, se prefiere un portador sólido.

[0098] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad, p. ej., dosis farmacéutica, eficaz para inducir un efecto biológico deseado en un sujeto o paciente o para tratar y/o evitar que un paciente padezca una afección o enfermedad descrita en el presente documento. También debe entenderse aquí que una "cantidad terapéuticamente eficaz" puede interpretarse como una cantidad que proporciona un efecto terapéutico deseado, ya sea tomada en una dosis o en cualquier dosificación o vía, tomada sola o en combinación con otros agentes terapéuticos.

[0099] DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0100]

[0101] LaFIG.1Aes un western blot que muestra las expresiones de varios polipéptidos de fusión GDNF (polipéptidos de fusión 1-5, véase el Ejemplo 1) de la invención.

[0102] LaFIG.1Bes una ilustración de tres geles de electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE) que muestran las expresiones de los polipéptidos de fusión 2, 3, y 4, respectivamente, en condiciones reductoras o no reductoras.

[0103] LaFIG. 2es una ilustración que muestra cuatro gráficos con las concentraciones séricas de polipéptidos de fusión GDNF en ratones.

[0104] LaFIG.3es una ilustración que muestra dos gráficos que muestran el efecto del polipéptido de fusión 6 GDNF sobre el peso corporal.

[0105] LaFIG.4es un gráfico de barras que muestra el efecto del polipéptido de fusión 6 del GDNF sobre la ingesta de alimentos.

[0106] LaFIG.5incluye dos gráficos que muestran el efecto del polipéptido de fusión 6 del GDNF sobre la composición corporal.

[0107] LaFIG.6es un gráfico que muestra el efecto del polipéptido de fusión 6 del GDNF sobre la tasa de eliminación de glucosa.

[0108] DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0109] La presente invención presenta composiciones que comprenden polipéptidos de fusión del factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF) como se definen en las reivindicaciones como proteínas terapéuticas. Los polipéptidos de fusión GDNF de la invención se unen al receptor alfa-1 humano de la familia GDNF (GFRα1) y tienen una semivida sérica larga. La invención también presenta composiciones farmacéuticas que comprenden estos polipéptidos de fusión GDNF para tratar y/o prevenir enfermedades metabólicas como la obesidad y la diabetes de tipo 1 y 2, y enfermedades neurológicas como la esquizofrenia, la epilepsia, la esclerosis lateral amiotrófica (ALS), la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Huntington, la ansiedad, el ictus, un tumor cerebral, y una metástasis cerebral.

[0110] I. Polipéptidos de fusión GDNF

[0111] En general, la invención presenta polipéptidos de fusión de GDNF como se definen en las reivindicaciones que tienen la fórmula A-L-B, donde A incluye un dominio Fc, un péptido de unión a albúmina, un dominio de fibronectina, o una albúmina sérica humana, unidos al N-terminal de una variante de GDNF directamente o mediante un enlazador. En realizaciones preferidas, el polipéptido de fusión GDNF definido en las reivindicaciones está codificado por un único marco de lectura abierto. En algunas realizaciones, cuando A incluye un dominio Fc, el polipéptido de fusión GDNF de la invención incluye además un péptido de unión a albúmina, un dominio de fibronectina, o una albúmina sérica humana, unidos al N-terminal del dominio Fc directamente o mediante un enlazador.

[0112] En ciertas realizaciones, los polipéptidos de fusión GDNF de la invención tienen una semivida sérica de 3 a 60 días. Los polipéptidos de fusión GDNF reivindicados se unen al receptor alfa-1 humano de la familia GDNF (GFRα1) con una K<D>de 20 a 20.000 pM.

[0113] II. Variantes del GDNF

[0114] Una variante de GDNF es un polipéptido que contiene un mutante o fragmento de GDNF humano de tipo salvaje (SEQ ID N.º: 1). La variante de GDNF reivindicada tiene al menos un 95%, 97%, o 100% de identidad de secuencia con una secuencia de GDNF de referencia que consta de los aminoácidos 118-211, 117-211, 110-211, o 92-211 de SEQ ID N.º: 1. A continuación se muestran las secuencias de aminoácidos del GDNF humano de tipo salvaje.

[0117]

[0119] Los aminoácidos 78-211 del GDNF humano forman el dominio funcional del GDNF. En ciertas realizaciones, la variante de GDNF consiste en los aminoácidos 92-211 de SEQ ID N.º: 1 o un fragmento del mismo. En algunas realizaciones, la variante de GDNF consiste en los aminoácidos 118-211, los aminoácidos 117-211, los aminoácidos 110-211, o los aminoácidos 92-211 de SEQ ID N.º: 1.

[0120] [0084]El GDNF humano de tipo salvaje contiene un sitio de corte proteolítico potencial que se encuentra aproximadamente entre los aminoácidos 85 y 120 de SEQ ID N.º: 1. Este lugar del GDNF hace que la proteína sea propensa a la proteólisis y la degradación. Así, el GDNF humano de tipo salvaje suele presentar una semivida sérica corta de, por ejemplo, menos de 10 minutos (véase, por ejemplo, la Fig.4 de Boado et al., Drug Metab Dispos.37:2299-304, 2009).

[0121] Para mejorar la semivida sérica de la proteína, una variante de GDNF puede tener suprimido el sitio de escisión proteolítica. En otras realizaciones, una variante de GDNF contiene sustituciones de aminoácidos en relación con el GDNF humano de tipo salvaje que reducen la proteólisis dentro del sitio proteolítico potencial (es decir, entre los residuos de aminoácidos 85 y 120 de SEQ ID N.º: 1). Tales sustituciones de aminoácidos incluyen la sustitución de aminoácidos cargados, por ejemplo, arginina y lisina, en el sitio de corte proteolítico por un aminoácido no básico. Los aminoácidos cargados, por ejemplo, arginina y lisina, entre los aminoácidos 85 y 120 que pueden sustituirse por un aminoácido no básico incluyen R88, R89, R91, R93, R104, K106, R108, R109, R112, K114, y R116. Estos residuos de aminoácidos pueden sustituirse por aminoácidos no básicos como glicina, alanina, valina, isoleucina, leucina, fenilalanina, triptófano, metionina, cisteína, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, prolina, ácido aspártico, y ácido glutámico.

[0122] Los polipéptidos de fusión de GDNF que incluyen las variantes de GDNF descritas anteriormente presentan una semivida sérica larga, por ejemplo, de 3 a 60 días, y mantienen la afinidad de unión deseada a GFRα1 con una K<D>de 20 a 20.000 pM.

[0123] III. Dominio Fc

[0124] En la presente invención, "dominio Fc" se refiere a una proteína que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 85%, 90%, 95%, 97%, o 100% de identidad de secuencia) con un dominio Fc humano que incluye al menos un dominio C<H>2 y un dominio C<H>3. Opcionalmente, el dominio Fc contiene una o más sustituciones de aminoácidos que reducen o inhiben la dimerización del dominio Fc. Opcionalmente, el dominio Fc contiene un dominio bisagra. El dominio Fc puede ser de anticuerpos de inmunoglobulina de isotipo IgG, IgE, IgM, IgA, o IgD. Además, el dominio Fc puede ser un subtipo IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, o IgG4). El dominio Fc también puede ser un dominio Fc no natural, por ejemplo, un dominio Fc recombinante.

[0125] Los métodos de ingeniería del dominio Fc que tienen dimerización reducida son conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, uno o más aminoácidos con cadenas laterales grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano) pueden introducirse en la interfaz del dímero C<H>3-C<H>3 para dificultar la formación del dímero debido al choque estérico. En otras realizaciones, uno o más aminoácidos con cadenas laterales pequeñas (por ejemplo, alanina, valina, o treonina) pueden introducirse en la interfaz del dímero C<H>3-C<H>3 para eliminar las interacciones favorables. Los métodos para introducir aminoácidos con cadenas laterales grandes o pequeñas en el dominio C<H>3 se describen, por ejemplo, en Ying et al. (J Biol Chem. 287:19399-19408, 2012), Publicación de Patente de EE.UU. N.º 2006/0074225, Patentes de EE.UU. N.º 8,216,805 y 5,731,168, Ridgway et al. (Protein Eng. 9:617-612, 1996), Atwell et al. (J Mol Biol. 270:26-35, 1997), y Merchant et al. (Nat Biotechnol.16:677-681, 1998.

[0126] En otras realizaciones, uno o más residuos de aminoácidos en el dominio C<H>3 que forman la interfaz C<H>3-C<H>3 entre dos dominios Fc se sustituyen por residuos de aminoácidos cargados positivamente (por ejemplo, lisina, arginina, o histidina) o residuos de aminoácidos cargados negativamente (por ejemplo, ácido aspártico o ácido glutámico) de manera que la interacción se vuelve electrostáticamente desfavorable dependiendo de los aminoácidos cargados específicos introducidos. Los métodos para introducir aminoácidos cargados en el dominio C<H>3 para desfavorecer o prevenir la formación de dímeros se describen, por ejemplo, en Ying et al. (J Biol Chem.287:19399-19408, 2012), Publicaciones de Patentes de EE.UU. N.º 2006/0074225, 2012/0244578, y 2014/0024111.

[0127] En algunas realizaciones de la invención, un dominio Fc incluye una o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos: T366W, T366Y, T394W, F405W, Y349T, Y349E, Y349V, L351T, L351H, L351N, L352K, P353S, S354D, D356K, D356R, D356S, E357K, E357R, E357Q, S364A, T366E, L368T, L368Y, L368E, K370E, K370D, K370Q, K392E, K392D, T394N, P395N, P396T, V397T, V397Q, L398T, D399K, D399R, D399N, F405T, F405H, F405R, Y407T, Y407H, Y407I, K409E, K409D, K409T, y K409I, en relación con la secuencia de la IgG1 humana. En una realización particular, un dominio Fc incluye la sustitución de aminoácidos T366W, en relación con la secuencia de IgG1 humana. La secuencia del dominio Fc de tipo salvaje se muestra en SEQ ID N.º: 3.

[0128] IV. Péptido de unión a albúmina

[0129] La unión a péptidos de proteínas séricas puede mejorar la farmacocinética de los productos farmacéuticos proteicos y, en particular, los polipéptidos de fusión de GDNF aquí descritos pueden unirse a péptidos de unión a proteínas séricas.

[0130] A modo de ejemplo, los péptidos de unión a albúmina que pueden utilizarse en los métodos y composiciones aquí descritos son generalmente conocidos en la técnica. En una realización, el péptido de unión a albúmina incluye la secuencia DICLPRWGCLW (SEQ ID N.º: 2).

[0131] [0093]En la presente invención, los péptidos de unión a albúmina pueden unirse al N-terminal del dominio Fc en un polipéptido de fusión GDNF de la invención para aumentar la semivida sérica del polipéptido de fusión GDNF. Un péptido de unión a albúmina puede unirse, directamente o a través de un enlazador, al extremo N-terminal del dominio Fc. En otras realizaciones, un péptido de unión a albúmina se une, directamente o a través de un enlazador, al N-terminal de una variante de GDNF como se define en las reivindicaciones.

[0132] Los péptidos de unión a albúmina pueden fusionarse genéticamente a polipéptidos de fusión GDNF o unirse a polipéptidos de fusión GDNF por medios químicos, por ejemplo, conjugación química. Si se desea, puede insertarse un espaciador entre el polipéptido de fusión GDNF y el péptido de unión a albúmina. Sin estar atado a una teoría, se espera que la inclusión de un péptido de unión a albúmina en un polipéptido de fusión GDNF de la invención pueda conducir a una retención prolongada de la proteína terapéutica a través de su unión a la albúmina sérica.

[0133] V. Dominio de fibronectina

[0134] La unión a dominios de fibronectina puede mejorar la farmacocinética de productos farmacéuticos proteicos y, en particular, los polipéptidos de fusión de GDNF aquí descritos pueden unirse a dominios de fibronectina.

[0135] El dominio fibronectina es una glicoproteína de alto peso molecular de la matriz extracelular, o un fragmento de la misma, que se une, por ejemplo, a proteínas receptoras de membrana como las integrinas y a componentes de la matriz extracelular como los colágenos y las fibrinas. En algunas realizaciones de la presente invención, un dominio de fibronectina se une al N-terminal del dominio Fc en un polipéptido de fusión de GDNF de la invención para aumentar la semivida sérica del polipéptido de fusión de GDNF. Un dominio de fibronectina puede unirse, directamente o a través de un enlazador, al extremo N-terminal del dominio Fc. En otras realizaciones, un dominio de fibronectina se une, directamente o a través de un enlazador, al N-terminal de una variante de GDNF como se define en las reivindicaciones.

[0136] A modo de ejemplo, los dominios de fibronectina que pueden utilizarse en los métodos y composiciones aquí descritos son generalmente conocidos en la técnica. En una realización, el dominio de fibronectina es un dominio de fibronectina tipo III (SEQ ID N.º: 30) que tiene los aminoácidos 610-702 de la secuencia de UniProt ID N.º: P02751. En otra realización, el dominio de fibronectina es una proteína adnectina.

[0137] Los dominios de fibronectina pueden fusionarse genéticamente a polipéptidos de fusión GDNF o unirse a polipéptidos de fusión GDNF por medios químicos, por ejemplo, conjugación química. Si se desea, puede insertarse un espaciador entre el polipéptido de fusión GDNF y el dominio de fibronectina. Sin estar atado a una teoría, se espera que la inclusión de un dominio de fibronectina en un polipéptido de fusión de GDNF de la invención pueda conducir a una retención prolongada de la proteína terapéutica a través de su unión a integrinas y componentes de la matriz extracelular como colágenos y fibrinas.

[0138] VI. Albúmina sérica

[0139] La unión a albúminas séricas puede mejorar la farmacocinética de los productos farmacéuticos proteicos y, en particular, los polipéptidos de fusión GDNF aquí descritos pueden unirse a albúminas séricas.

[0140] La albúmina sérica es una proteína globular que constituye la proteína sanguínea más abundante en los mamíferos. La albúmina sérica se produce en el hígado y constituye aproximadamente la mitad de las proteínas del suero sanguíneo. Es monomérico y soluble en la sangre. Algunas de las funciones más cruciales de la albúmina sérica son el transporte de hormonas, ácidos grasos y otras proteínas en el organismo, la amortiguación del pH y el mantenimiento de la presión osmótica necesaria para la correcta distribución de los fluidos corporales entre los vasos sanguíneos y los tejidos corporales. En realizaciones preferidas, la albúmina sérica es albúmina sérica humana. En algunas realizaciones de la presente invención, una albúmina sérica humana se une al N-terminal del dominio Fc en un polipéptido de fusión GDNF de la invención para aumentar la semivida sérica del polipéptido de fusión GDNF. Una seroalbúmina humana puede unirse, directamente o mediante un enlazador, al extremo N-terminal del dominio Fc. En otras realizaciones, una albúmina sérica humana se une, directamente o a través de un enlazador, al N-terminal de una variante de GDNF como se define en las reivindicaciones.

[0141] A modo de ejemplo, las albúminas séricas que pueden utilizarse en los métodos y composiciones aquí descritos son generalmente conocidas en la técnica. En una realización, la albúmina sérica incluye la secuencia de UniProt ID N.º: P02768 (SEQ ID N.º: 31).

[0142] Las albúminas séricas pueden fusionarse genéticamente a polipéptidos de fusión GDNF o unirse a polipéptidos de fusión GDNF por medios químicos, por ejemplo, conjugación química. Si se desea, puede insertarse un espaciador entre el polipéptido de fusión GDNF y la albúmina sérica humana. Sin estar atado a una teoría, se espera que la inclusión de una albúmina sérica humana en un polipéptido de fusión GDNF de la invención pueda conducir a una retención prolongada de la proteína terapéutica.

[0143] VII. Engarces

[0144] [0103]En la presente invención, un enlazador se utiliza para describir un enlace o conexión entre polipéptidos o dominios proteicos y/o moléculas no proteicas asociadas. En algunas realizaciones, un enlazador es un enlace o conexión entre un dominio Fc, un péptido de unión a albúmina, un dominio de fibronectina, o una albúmina sérica humana, y una variante de GDNF como se define en las reivindicaciones, para lo cual el enlazador conecta el C-terminal del dominio Fc, el péptido de unión a albúmina, el dominio de fibronectina, o la albúmina sérica humana al N-terminal de la variante de GDNF, de tal manera que los dos polipéptidos se unen entre sí en series en tándem.

[0145] Un enlazador puede ser un enlace covalente simple, por ejemplo, un enlace peptídico, un polímero sintético, por ejemplo, un polímero de polietilenglicol (PEG), o cualquier tipo de enlace creado a partir de una reacción química, por ejemplo, conjugación química. En el caso de que un enlazador sea un enlace peptídico, el grupo ácido carboxílico en el C-terminal de un dominio proteico puede reaccionar con el grupo amino en el N-terminal de otro dominio proteico en una reacción de condensación para formar un enlace peptídico. Específicamente, el enlace peptídico puede formarse por medios sintéticos mediante una reacción de química orgánica convencional bien conocida en la técnica, o por producción natural a partir de una célula huésped, en la que una molécula de ácido nucleico que codifica las secuencias de ADN de ambas proteínas, por ejemplo, un dominio Fc y una variante de GDNF, en series en tándem, puede transcribirse directamente y traducirse en un polipéptido contiguo que codifica ambas proteínas mediante las maquinarias moleculares necesarias, por ejemplo, ADN polimerasa y ribosoma, en la célula huésped.

[0146] En el caso de que un enlazador sea un polímero sintético, por ejemplo, un polímero de PEG, el polímero puede funcionalizarse con grupos funcionales químicos reactivos en cada extremo para reaccionar con los aminoácidos terminales en los extremos de conexión de dos proteínas.

[0147] En el caso de que un enlazador (excepto el enlace peptídico mencionado anteriormente) se haga a partir de una reacción química, grupos funcionales químicos, por ejemplo, amina, ácido carboxílico, éster, azida, u otros grupos funcionales comúnmente utilizados en el técnica, se pueden unir sintéticamente al C-terminal de una proteína y al N-terminal de otra proteína, respectivamente. A continuación, los dos grupos funcionales pueden reaccionar por medios de química sintética para formar un enlace químico, conectando así las dos proteínas entre sí. Estos procedimientos de conjugación química son rutinarios para los expertos en la técnica.

[0148] Espaciador

[0149] En la presente invención, un enlazador entre un dominio Fc, un péptido de unión a albúmina, un dominio de fibronectina, o una albúmina sérica humana, y una variante de GDNF, puede ser un espaciador de aminoácidos que incluye 3-200 aminoácidos. Los espaciadores peptídicos adecuados son conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, enlazadores peptídicos que contienen residuos de aminoácidos flexibles como la glicina y la serina. En ciertas realizaciones, un espaciador puede contener motivos, por ejemplo, motivos múltiples o repetitivos, de GS, GGS, GGG (SEQ ID N.º: 4), GGGGS (SEQ ID N.º: 5), GGSG (SEQ ID N.º: 6), o SGGG (SEQ ID N.º: 7). En ciertas realizaciones, un espaciador puede contener de 2 a 12 aminoácidos que incluyen motivos de GS, por ejemplo, GS, GSGS (SEQ ID N.º: 8), GSGSGS (SEQ ID N.º: 9), GSGSGSGS (SEQ ID N.º: 10), GSGSGSGSGS (SEQ ID N.º: 11), o GSGSGSGSGSGS (SEQ ID N.º: 12). En algunas otras realizaciones, un espaciador puede contener de 3 a 12 aminoácidos que incluyen motivos de GGS, por ejemplo, GGS, GGSGGS (SEQ ID N.º: 13), GGSGGSGGS (SEQ ID N.º: 14), y GGSGGSGGSGGS (SEQ ID N.º: 15). En otras realizaciones, un espaciador puede contener de 4 a 12 aminoácidos que incluyen motivos de GGSG (SEQ ID N.º: 16), por ejemplo, GGSG (SEQ ID N.º: 17), GGSGGGSG (SEQ ID N.º: 18), o GGSGGGSGGGSG (SEQ ID N.º: 19). En otras realizaciones, un espaciador puede contener motivos de GGGGS (SEQ ID N.º: 20), por ejemplo, GGGGSGGGGGSGGGGS (SEQ ID N.º: 21). En otras realizaciones, un espaciador también puede contener aminoácidos distintos de la glicina y la serina, por ejemplo, GGGGAGGGG (SEQ ID N.º: 22), GENLYFQSGG (SEQ ID N.º: 23), SACYCELS (SEQ ID N.º: 24), RSIAT (SEQ ID N.º: 25), RPACKIPNDLKQKVMNH (SEQ ID N.º: 26), GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG (SEQ ID N.º: 27), AAANSSIDLISVPVDSR (SEQ ID N.º: 28), o GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS (SEQ ID N.º: 29). En ciertas realizaciones de la presente invención, se utiliza un espaciador peptídico de 3 o 9 aminoácidos para conectar un dominio Fc, un péptido de unión a albúmina, un dominio de fibronectina o una albúmina sérica humana y una variante de GDNF en series en tándem. Los espaciadores peptídicos de 3 y 9 aminoácidos consistentes en las secuencias GGG (SEQ ID N.º: 4) y GGGGAGGGG (SEQ ID N.º: 22), respectivamente. La longitud del espaciador peptídico y los aminoácidos utilizados pueden ajustarse en función de los dos dominios proteicos implicados y del grado de flexibilidad deseado en el polipéptido de fusión proteica final. La longitud del espaciador puede ajustarse para garantizar el correcto plegamiento de la proteína y evitar la formación de agregados. Por ejemplo, una variante pequeña de GDNF (por ejemplo, una variante de GDNF que tenga los aminoácidos 117-211 o 118-211 de SEQ ID N.º: 1) puede unirse a un espaciador más largo (por ejemplo, un espaciador de la secuencia GGGGAGGGG (SEQ ID N.º: 22)) en lugar de un espaciador más corto (por ejemplo, GGG (SEQ ID N.º: 4)).

[0150] VIII. Vectores, células huésped, y producción de proteínas

[0151] [0108]Los polipéptidos de fusión GDNF de la invención pueden producirse a partir de una célula huésped. Una célula huésped se refiere a un vehículo que incluye los componentes celulares necesarios, por ejemplo, orgánulos, necesarios para expresar los polipéptidos y polipéptidos de fusión descritos en el presente documento a partir de sus correspondientes ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos pueden incluirse en vectores de ácidos nucleicos que pueden introducirse en la célula huésped mediante técnicas convencionales conocidas en la técnica (por ejemplo, transformación, transfección, electroporación, precipitación de fosfato cálcico, microinyección directa, infección, etc.). La elección de los vectores de ácidos nucleicos depende en parte de las células huésped que se vayan a utilizar. Generalmente, las células huésped preferidas son de origen procariota (por ejemplo, bacteriano) o eucariota (por ejemplo, mamífero).

[0152] Construcción de vectores de ácidos nucleicos y células huésped

[0153] Una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de fusión GDNF de la invención puede prepararse mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, entre otros, la mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida al sitio) y la mutagénesis por PCR. Una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión GDNF de la invención puede obtenerse mediante técnicas estándar, por ejemplo, síntesis génica. Alternativamente, una molécula de ácido nucleico que codifica un GDNF humano de tipo salvaje puede truncarse y/o mutarse para contener sustituciones de aminoácidos específicas utilizando técnicas estándar en la técnica, por ejemplo, mutagénesis QuikChange<™>. Las moléculas de ácido nucleico pueden sintetizarse utilizando un sintetizador de nucleótidos o técnicas de PCR.

[0154] Una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión GDNF de la invención puede insertarse en un vector capaz de replicar y expresar la molécula de ácido nucleico en células huésped procariotas o eucariotas. Hay muchos vectores disponibles en la técnica que pueden utilizarse para los fines de la invención. Cada vector puede contener diversos componentes que pueden ajustarse y optimizarse para su compatibilidad con la célula huésped concreta. Por ejemplo, los componentes del vector pueden incluir, entre otros, un origen de replicación, un gen marcador de selección, un promotor, un sitio de unión al ribosoma, una secuencia señal, la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de interés, y una secuencia de terminación de la transcripción.

[0155] En algunas realizaciones, se utilizan células de mamífero como células huésped para la invención. Ejemplos de tipos de células de mamífero incluyen, pero no se limitan a, riñón embrionario humano (HEK) (por ejemplo, HEK293, HEK 293F), ovario de hámster chino (CHO), HeLa, COS, PC3, Vero, MC3T3, NS0, Sp2/0, VERY, BHK, MDCK, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20, T47D, NS0 (una línea celular de mieloma murino que no produce endógenamente ninguna cadena de inmunoglobulina), CRL7O3O, y células HsS78Bst. En otras realizaciones, se utilizan célulasde E. colicomo células huésped para la invención. Ejemplos de cepas deE. coliincluyen, pero no se limitan a,E.coli294 (ATCC<®>31,446),E. coliλ 1776 (ATCC<®>31,537,E. coliBL21 (DE3) (ATCC<®>BAA-1025), yE.coliRV308 (ATCC<®>31,608). Las distintas células huésped poseen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y la modificación postraduccional de los productos proteicos. Pueden elegirse líneas celulares o sistemas huésped adecuados para garantizar la modificación y el procesamiento correctos del polipéptido de fusión GDNF expresado. Los vectores de expresión descritos anteriormente pueden introducirse en células huésped apropiadas mediante técnicas convencionales en la técnica, por ejemplo, transformación, transfección, electroporación, precipitación de fosfato cálcico y microinyección directa. Una vez introducidos los vectores en las células huésped para la producción de proteínas, éstas se cultivan en medios nutritivos convencionales modificados según convenga para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Los métodos para la expresión de proteínas terapéuticas son conocidos en la técnica, véase, por ejemplo, Paulina Balbas, Argelia Lorence (eds.) Recombinant Gene Expression: Reviews and Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press; 2.ª ed.2004 y Vladimir Voynov and Justin A. Caravella (eds.) Therapeutic Proteins: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) Humana Press; 2.ª ed.2012.

[0156] Producción, recuperación, y purificación de proteínas

[0157] Las células huésped utilizadas para producir los polipéptidos de fusión GDNF de la invención pueden cultivarse en medios conocidos en la técnica y adecuados para el cultivo de las células huésped seleccionadas. Algunos ejemplos de medios adecuados para células huésped de mamíferos son el medio esencial mínimo (MEM), el medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), el medio de expresión Expi293<™>, el DMEM con suero bovino fetal (FBS) suplementado y el RPMI-1640. Ejemplos de medios adecuados para células huésped bacterianas incluyen el caldo Luria (LB) más los suplementos necesarios, como un agente de selección, por ejemplo, ampicilina. Las células huésped se cultivan a temperaturas adecuadas, tales como de unos 20 °C a unos 39 °C, por ejemplo, de 25 °C a unos 37 °C, preferiblemente 37 °C, y niveles de CO<2>, tales como de 5 a 10% (preferiblemente 8%). El pH del medio es generalmente de aproximadamente 6,8 a 7,4, por ejemplo, 7,0, dependiendo principalmente del organismo huésped. Si se utiliza un promotor inducible en el vector de expresión de la invención, la expresión de la proteína se induce en condiciones adecuadas para la activación del promotor.

[0158] La recuperación de proteínas suele implicar la alteración de la célula huésped, generalmente por medios como el choque osmótico, la sonicación, o la lisis. Una vez disgregadas las células, los restos celulares pueden eliminarse por centrifugación o filtración. Las proteínas pueden purificarse aún más. Un polipéptido de fusión GDNF puede purificarse por cualquier método conocido en la técnica de la purificación de proteínas, por ejemplo, por cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, y cromatografía en columna de exclusión por tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial, o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. Por ejemplo, la proteína puede aislarse y purificarse seleccionando y combinando adecuadamente columnas de afinidad como la columna de proteína A (por ejemplo, la cromatografía de proteína A de POROS) con columnas de cromatografía (por ejemplo, la cromatografía de intercambio catiónico HS-50 de POROS), procedimientos de filtración, ultrafiltración, desalinización y diálisis. En algunos casos, un polipéptido de fusión GDNF puede conjugarse con secuencias marcadoras, como un péptido para facilitar la purificación.

[0159] Un ejemplo de secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido de hexa-histidina (His-tag), que se une a la columna de afinidad de agarosa funcionalizada con níquel con afinidad micromolar. Otras etiquetas peptídicas útiles para la purificación incluyen, entre otras, la etiqueta hemaglutinina "HA", que corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de la gripe (Wilson et al., Cell 37:767, 1984).

[0160] Alternativamente, los polipéptidos de fusión GDNF pueden ser producidos por las células de un sujeto (por ejemplo, un humano), por ejemplo, en el contexto de la terapia génica, mediante la administración de un vector (tal como un vector viral (por ejemplo, un vector retroviral, vector adenoviral, vector poxviral (por ejemplo, vector viral vaccinia, tal como Vaccinia Ankara Modificada (MVA)), vector viral adeno-asociado, y vector alfaviral)) que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de fusión GDNF de la invención. El vector, una vez dentro de una célula del sujeto (por ejemplo, por transformación, transfección, electroporación, precipitación de fosfato cálcico, microinyección directa, infección, etc.) promoverá la expresión del polipéptido de fusión GDNF, que luego será secretado por la célula. Si el resultado deseado es el tratamiento de una enfermedad o trastorno, puede que no sea necesaria ninguna otra acción. Si se desea recoger la proteína, se puede extraer sangre del sujeto y purificar la proteína de la sangre por métodos conocidos en la técnica.

[0161] IX. Composiciones y preparados farmacéuticos

[0162] La invención presenta composiciones farmacéuticas que incluyen uno o más polipéptidos de fusión GDNF como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la invención contienen uno o más polipéptidos de fusión GDNF de la invención como proteínas terapéuticas. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la invención que contienen uno o más polipéptidos de fusión GDNF pueden usarse en combinación con otros agentes (por ejemplo, biológicos terapéuticos y/o moléculas pequeñas) o composiciones en una terapia. Además de una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido de fusión GDNF, las composiciones farmacéuticas pueden contener uno o más portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables, que pueden formularse por métodos conocidos por los expertos en la técnica. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la invención contienen moléculas de ácido nucleico (ADN o ARN, por ejemplo, ARNm) que codifican uno o más polipéptidos de fusión GDNF de la invención, o vectores que contienen dichas moléculas de ácido nucleico.

[0163] Los portadores y excipientes aceptables en las composiciones farmacéuticas no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas. Los portadores y excipientes aceptables pueden incluir tampones como fosfato, citrato, HEPES, y TAE, antioxidantes como ácido ascórbico y metionina, conservantes como cloruro de hexametonio, cloruro de octadecildimetilbencilamonio, resorcinol y cloruro de benzalconio, proteínas como la albúmina sérica humana, la gelatina, el dextrano y las inmunoglobulinas, polímeros hidrófilos como la polivinilpirrolidona, aminoácidos como la glicina, la glutamina, la histidina y la lisina, y carbohidratos como la glucosa, la manosa, la sacarosa, y el sorbitol. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse por vía parenteral en forma de una formulación inyectable. Las composiciones farmacéuticas inyectables pueden formularse utilizando como vehículo una solución estéril o cualquier líquido farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, entre otros, agua estéril, solución salina fisiológica, y medios de cultivo celular (por ejemplo, Medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), α-Modified Eagles Medium (α-MEM), medio F-12). Los métodos de formulación son conocidos en la técnica, véase, por ejemplo, Banga (ed.) Therapeutic Peptides and Proteins: Formulation, Processing and Delivery Systems (2.ª ed.) Taylor & Francis Group, CRC Press (2006).

[0164] Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden prepararse en microcápsulas, como hidroximetilcelulosa o microcápsula de gelatina y microcápsula de poli(metilmetacrilato). Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden prepararse en otros sistemas de administración de fármacos, como liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas, y nanocápsulas. Estas técnicas se describen en Remington: The Science and Practice of Pharmacy 22.ª edición (2012). Las composiciones farmacéuticas que se utilicen para la administraciónin vivodeben ser estériles. Esto se consigue fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles.

[0165] Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden prepararse como una formulación de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen los polipéptidos de fusión GDNF de la invención. Ejemplos de matrices de liberación sostenida son los poliésteres, hidrogeles, poliácidos ( Patente de EE.UU. n.º 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y etil-L-glutamato, etilvinilacetato no degradable, copolímeros degradables de ácido láctico y ácido glicólico como LUPRON DEPOT<™>, y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Algunas formulaciones de liberación sostenida permiten la liberación de moléculas durante varios meses, por ejemplo, de uno a seis meses, mientras que otras formulaciones liberan composiciones farmacéuticas de la invención durante periodos de tiempo más cortos, por ejemplo, de días a semanas.

[0166] La composición farmacéutica puede presentarse en forma de dosis unitaria según sea necesario. La cantidad de componente activo, por ejemplo, uno o más polipéptidos de fusión GDNF de la invención, incluida en los preparados farmacéuticos es tal que se proporciona una dosis adecuada dentro del intervalo designado (por ejemplo, una dosis dentro del intervalo de 0,01-30 mg/kg de peso corporal).

[0167] [0120]La composición farmacéutica para terapia génica puede estar en un diluyente aceptable, o puede incluir una matriz de liberación lenta en la que se incrusta el vehículo de administración génica. Si se utiliza la inyección hidrodinámica como método de administración, la composición farmacéutica que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión GDNF o un vector (por ejemplo, un vector viral) que contiene la molécula de ácido nucleico se administra rápidamente en un gran volumen de fluido por vía intravenosa. Los vectores que pueden utilizarse como vehículo de administración de genesin vivoincluyen, entre otros, vectores retrovirales, vectores adenovirales, vectores poxvirales (por ejemplo, vectores virales vaccinia, como Vaccinia Ankara modificada), vectores virales adenoasociados, y vectores alfavirales.

[0168] X. Vías, dosis, y administración

[0169] Las composiciones farmacéuticas que contienen uno o más polipéptidos de fusión GDNF de la invención como proteínas terapéuticas pueden formularse para administración intravenosa, parenteral, subcutánea, intramuscular, intraarterial, intratecal, o intraperitoneal. La composición farmacéutica también puede formularse o administrarse por vía oral, nasal, aerosol, rectal, o vaginal. Para las formulaciones inyectables, se conocen en la técnica diversos portadores farmacéuticos eficaces. Véase, por ejemplo, Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J. B. Lippincott Company, Philadelphia, Pa., Banker and Chalmers, eds., páginas 238-250 (1982), y ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4.ª ed., páginas 622-630 (1986).

[0170] En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas que contienen moléculas de ácido nucleico que codifican uno o más polipéptidos de fusión de GDNF de la invención o vectores que contienen tales moléculas de ácido nucleico pueden ser para uso en la administración mediante administración génica. Los métodos de administración de genes son bien conocidos por los expertos en la técnica. Los vectores que pueden utilizarse para la administración y expresión de genesin vivoincluyen, entre otros, vectores retrovirales, vectores adenovirales, vectores poxvirales (por ejemplo, vectores virales de vaccinia, como Vaccinia Ankara Modificada (MVA)), vectores virales adenoasociados, y vectores alfavirales. En algunas realizaciones, un vector puede incluir un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) que permite la expresión de múltiples polipéptidos de fusión GDNF. En ciertas realizaciones, las moléculas de ARNm que codifican uno o más polipéptidos de fusión de GDNF según se definen en las reivindicaciones pueden administrarse directamente a un sujeto.

[0171] En algunas realizaciones de la presente invención, las moléculas de ácido nucleico que codifican uno o más polipéptidos de fusión de GDNF como se define en las reivindicaciones o los vectores que contienen dichas moléculas de ácido nucleico pueden ser para uso en administración usando una plataforma de inyección hidrodinámica. En el método de inyección hidrodinámica, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión GDNF como se define en las reivindicaciones se pone bajo el control de un promotor fuerte en un plásmido diseñado (por ejemplo, un plásmido viral). El plásmido suele administrarse rápidamente en un gran volumen de líquido por vía intravenosa. La inyección hidrodinámica utiliza una presión hidrodinámica controlada en las venas para aumentar la permeabilidad celular de forma que la presión elevada de la inyección rápida del gran volumen de fluido provoque la extravasación de fluido y plásmidos de la vena. La expresión de la molécula de ácido nucleico es impulsada principalmente por el hígado. En ratones, la inyección hidrodinámica suele realizarse mediante la inyección del plásmido en la vena de la cola. En ciertas realizaciones, las moléculas de ARNm que codifican uno o más polipéptidos de fusión de GDNF según se definen en las reivindicaciones pueden administrarse mediante inyección hidrodinámica.

[0172] La dosificación de las composiciones farmacéuticas de la invención depende de factores que incluyen la vía de administración, la enfermedad a tratar y las características físicas, por ejemplo, edad, peso, salud general, del sujeto. Típicamente, la cantidad de un polipéptido de fusión GDNF de la invención contenida en una dosis única puede ser una cantidad que prevenga, retrase o trate eficazmente la enfermedad sin inducir una toxicidad significativa. Una composición farmacéutica de la invención puede incluir una dosis de un polipéptido de fusión GDNF de la invención que oscila entre 0,01 y 500 mg/kg (por ejemplo, 0,01, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, o 500 mg/kg) y, en una realización más específica, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 30 mg/kg y, en una realización más específica, de aproximadamente 1 a aproximadamente 30 mg/kg. La dosis puede ser adaptada por el médico en función de factores convencionales como la extensión de la enfermedad y diferentes parámetros del sujeto.

[0173] Las composiciones farmacéuticas se administran de forma compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad terapéuticamente eficaz para mejorar o remediar los síntomas. Las composiciones farmacéuticas se administran en una variedad de formas de dosificación, por ejemplo, formas de dosificación intravenosa, formas de dosificación subcutánea y formas de dosificación oral (por ejemplo, soluciones ingeribles, cápsulas de liberación de fármacos). Generalmente, las proteínas terapéuticas se dosifican a 0,1-100 mg/kg, por ejemplo, 1-50 mg/kg. Las composiciones farmacéuticas que contienen un polipéptido de fusión GDNF de la invención pueden administrarse a un sujeto que lo necesite, por ejemplo, una o más veces (por ejemplo, 1-10 veces o más) diariamente, semanalmente, mensualmente, bianualmente, anualmente, o según sea médicamente necesario. Las dosis pueden ser únicas o múltiples. El intervalo entre administraciones puede disminuir a medida que mejora el estado médico o aumentar a medida que empeora la salud del paciente.

[0174] XI. Indicaciones

[0175] [0126] Las composiciones farmacéuticas de la invención son útiles para tratar y/o prevenir afecciones médicas, como enfermedades metabólicas, por ejemplo, obesidad y diabetes (diabetes de tipo 1 y 2), y enfermedades neurológicas.

[0176] En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas que contienen los polipéptidos de fusión GDNF de la invención pueden utilizarse para prevenir el desarrollo de la obesidad y/o para tratar a pacientes ya diagnosticados con obesidad. Por ejemplo, la administración de los polipéptidos de fusión GDNF de la invención a un sujeto puede ayudar a reducir el peso corporal del sujeto disminuyendo la cantidad de grasa, mientras se mantiene la cantidad de masa magra (véanse, por ejemplo, los Ejemplos 5 y 7).

[0177] En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas que contienen los polipéptidos de fusión GDNF de la invención pueden utilizarse para prevenir el desarrollo de diabetes (por ejemplo, diabetes de tipo 1 y de tipo 2) y/o para tratar a pacientes ya diagnosticados con diabetes. A los pacientes con probabilidad de desarrollar diabetes, por ejemplo, individuos con disposición genética, antecedentes familiares de diabetes, asociación con otras enfermedades autoinmunes, u otras enfermedades metabólicas, se les pueden administrar los polipéptidos de fusión GDNF de la invención profilácticamente, de tal manera que los polipéptidos de fusión GDNF pueden mantener la función normal y la salud de las células β y prevenir o retrasar el daño inflamatorio autoinmune a las células β. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas que contienen los polipéptidos de fusión GDNF de la invención pueden ser para uso en la administración a individuos antes de que se les diagnostique diabetes (p. ej., diabetes de tipo 1 y de tipo 2) o desarrollen síntomas clínicos de diabetes, p. ej., nivel elevado de glucosa en sangre, nivel elevado de insulina en ayunas, resistencia a la insulina, poliuria, polidipsia, y polifagia. En algunas realizaciones, los polipéptidos de fusión GDNF definidos en las reivindicaciones pueden administrarse a los pacientes antes de que necesiten insulina. En otras realizaciones, la administración de polipéptidos de fusión GDNF como se define en las reivindicaciones puede retrasar o posponer la necesidad de tratamiento con insulina en pacientes diabéticos. Por ejemplo, la administración de los polipéptidos de fusión GDNF de la invención a un sujeto puede ayudar a aumentar la tasa de eliminación de glucosa de la sangre (véase, por ejemplo, el Ejemplo 8).

[0178] Las composiciones farmacéuticas de la invención también son útiles para tratar enfermedades neurológicas que incluyen, pero no se limitan a, esquizofrenia, epilepsia, esclerosis lateral amiotrófica (ALS), enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, ansiedad, apoplejía, un tumor cerebral, y una metástasis cerebral.

[0179] EJEMPLOS

[0180] Ejemplo 1 - Expresión de polipéptidos de fusión GDNF

[0181] Para la expresión de los polipéptidos de fusión GDNF, se transfectaron vectores que contenían moléculas de ácido nucleico que codificaban polipéptidos de fusión GDNF en células de ovario de hámster chino (CHO) mediante electroporación. Tras la expresión de la proteína, los polipéptidos de fusión expresados se purificaron a partir del sobrenadante del cultivo celular mediante cromatografía en columna de afinidad basada en proteína A. Los polipéptidos de fusión GDNF purificados se analizaron mediante western blot utilizando anticuerpos anti-GDNF. La FIG.1A muestra la expresión de cinco polipéptidos de fusión GDNF:

[0182] Polipéptido de fusión 1: Fc-hGDNF<78-211>(SEQ ID N.º: 32)

[0183] Polipéptido de fusión 2: Fc-GGG-hGDNF<92-211>(SEQ ID NO: 33)

[0184] Polipéptido de fusión 3: Fc-GGG-hGDNF<110-211>(SEQ ID N.º: 34)

[0185] Polipéptido de fusión 4: Fc-GGG-hGDNF<117-211>(SEQ ID N.º: 35)

[0186] Polipéptido de fusión 5: Fc-GGGGAGGGG-hGDNF<117-211>(SEQ ID N.º: 36)

[0187] Cada polipéptido de fusión descrito anteriormente está codificado por un único marco de lectura abierto. Cada uno de los cinco polipéptidos de fusión se analizó el día 2 y el día 6. Como se muestra en laFIG.1A, polipéptido de fusión 1, que incluye el sitio de corte proteolítico potencial (es decir, los aminoácidos 85-120 de SEQ ID N.º: 1), parecían generar productos de degradación al sexto día.

[0188] Cada uno de los polipéptidos de fusión 2, 3, y 4 también se analizó en condiciones reductoras o no reductoras (FIG.1B).

[0189] Ejemplo 2 - Afinidades de unión

[0190] [0133]Se utilizó la Resonancia de Plasmón Superficial (SPR) para determinar las afinidades de unión de los polipéptidos de fusión GDNF a GFRα1. Los polipéptidos de fusión GDNF de este ejemplo incluyen los polipéptidos de fusión 2-4 descritos en el Ejemplo 1, así como Fc (T366W)-GGG-hGDNF<117-211>(SEQ ID N.º: 37) (polipéptido de fusión 6) que tiene un dominio Fc con la sustitución de aminoácidos T366W (en relación con la secuencia de IgG1 humana) unido al N-terminal de la variante de GDNF que tiene los aminoácidos 117-211 de SEQ ID N.º: 1 a través de un enlazador GGG. El ensayo SPR se configuró para capturar quimeras Fc GFRα1, GFRα2 y GFRα3 humanas (R&D Systems) en una superficie de chip CM5 utilizando el kit de captura His-tag (GE Healthcare) a niveles adecuados para el análisis cinético. Los polipéptidos de fusión GDNF se hicieron fluir sobre los GFR inmovilizados para medir la cinética de asociación y disociación del polipéptido de fusión GDNF y los GFR. La unión de varias concentraciones de polipéptidos de fusión GDNF se midió en tampón HBS-EP (GE Healthcare) a una velocidad de flujo de 30 µl/min. Las curvas de unión se ajustaron utilizando el software Scrubber2 para obtener afinidades de unión aparentes y constantes cinéticas.

[0191] La Tabla 1 muestra que la constante de disociación de equilibrio, K<D>, de los polipéptidos de fusión GDNF de la invención osciló entre 870 pM (polipéptido de fusión 2) y 3,8 nM (polipéptido de fusión 4) para la unión al receptor alfa-1 humano de la familia GDNF (GFRα1) unido a un dominio Fc en su extremo C-terminal.

[0192] Tabla 1. Afinidades de unión de polipéptidos de fusión GDNF a GFRα1

[0195]

[0197] Ejemplo 3 - Ensayo reportero GFRα1

[0198] Las células HEK293T se sembraron en una placa de 96 pocillos recubierta de colágeno a una densidad de 20.000 células/pocillo en DMEM que contenía 10% de FBS y antibióticos. Seis horas después, las células se transfectaron con plásmidos pFR-Luc (62,5 ng), pFA-ELK1 (7,5 ng), hRet (10,5 ng) y GFRα1 (4,5 ng) utilizando Fugene 6 según las instrucciones del fabricante. Al día siguiente, las células se lavaron una vez con PBS y se colocaron en DMEM fresco con 1% de FBS durante 6-8 horas. A continuación, las células se trataron con polipéptidos de fusión GDNF a la concentración indicada durante 16 horas. La actividad luciferasa se determinó utilizando luciferina como sustrato (Bright-Glo, Promega).

[0199] Ejemplo 4 - Concentración sérica in vivo

[0200] Para medir las concentraciones séricasin vivode los polipéptidos de fusión GDNF 2-4 (descritos en el Ejemplo 1) y 6 (descritos en el Ejemplo 2) de la invención, se inyectaron ratones de la cepa de ratón transgénico C57BL/6NTa con 10 µg de molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de fusión GDNF mediante inyección hidrodinámica. Las concentraciones séricas del polipéptido de fusión GDNF se midieron mediante un ensayo inmunoenzimático (ELISA) en diferentes momentos tras la inyección utilizando muestras de sangre tomadas de los ratones. Los resultados mostrados en la FIG.2, indican que la semivida es superior a 48 horas en ratones.

[0201] Ejemplo 5 - Efecto del polipéptido de fusión 6 sobre el peso corporal

[0202] Para medir el efecto del polipéptido de fusión 6 (descrito en el Ejemplo 2) sobre el peso corporal, se inyectó intraperitonealmente a tres ratones de la cepa de ratón transgénico C57BL/6NTa con 0,3, 3,0, o 10,0 mg/kg de polipéptido de fusión 6 o con solución salina tamponada con fosfato (PBS) el día 0. Se registró el peso corporal medio de tres ratones cada dos o tres días. También se calculó y registró el cambio porcentual del peso corporal. La FIG. 3 muestra que el tratamiento con el polipéptido de fusión 6 redujo el peso corporal de forma dependiente de la dosis.

[0203] Ejemplo 6 - Efecto del polipéptido de fusión 6 sobre la ingesta de alimentos

[0204] Utilizando el mismo protocolo que el descrito en el Ejemplo 5, los ratones inyectados con diferentes dosis de polipéptido de fusión 6 o PBS fueron monitorizados en cuanto a la cantidad de ingesta de alimentos (es decir, una dieta alta en grasas (HFD)). La cantidad media diaria de ingesta de alimentos se midió y registró cada dos o tres días a partir del día 0. La FIG.4 muestra que el tratamiento con el polipéptido de fusión 6 no tuvo ningún efecto significativo sobre el apetito de los ratones para la ingesta de alimentos.

[0205] Ejemplo 7 - Efecto del polipéptido de fusión 6 sobre la composición corporal

[0206] Usando el mismo protocolo descrito en el Ejemplo 5, se midió el cambio en la cantidad de grasa, masa magra, y fluido de los ratones inyectados con diferentes dosis de polipéptido de fusión 6 o PBS en el día 18 post inyección.

[0207] Cambio desde el valor basal = (peso final de grasa, masa magra o fluido) − (peso inicial de grasa, masa magra o fluido)

[0208] Cambio porcentual desde el valor basal = 100 × [(peso final − peso inicial) / (peso inicial)]

[0209] Como se muestra en la FIG.5, el tratamiento con el polipéptido de fusión 6 disminuyó significativamente la cantidad de grasa sin afectar a la masa magra del cuerpo, lo que indica que la pérdida de peso de los ratones es totalmente atribuible a una reducción de la adiposidad.

[0210] Ejemplo 8 - Efecto del polipéptido de fusión 6 en la tasa de eliminación de glucosa

[0211] [0141]Utilizando el mismo protocolo descrito en el Ejemplo 5, ratones inyectados con diferentes dosis de polipéptido de fusión 6 o PBS fueron sometidos a una prueba de tolerancia a la glucosa (GTT). Tras un ayuno de 5 horas, se midieron y registraron los niveles de glucosa en sangre en ayunas de los ratones. A los ratones se les inyectó D-glucosa por vía intraperitoneal a una dosis de 2 g/kg de peso corporal. Las mediciones de glucosa en sangre se realizaron a los 15, 30, 60, 90, y 120 minutos tras la inyección de glucosa. Todas las muestras se tomaron de hemorragias venosas de la cola y se midieron con un glucómetro.

[0213] Como se muestra en la FIG.6, el tratamiento con el polipéptido de fusión 6 mejoró significativamente la tasa de eliminación de glucosa. El nivel de glucosa sérica en ratones inyectados con 10 mg/kg de polipéptido de fusión 6 volvió al nivel inicial de glucosa sérica antes de la GTT al cabo de 2 horas.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

1.Un polipéptido de fusión del factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF) que comprende la fórmula A-L-B, donde

A comprende un dominio Fc, un péptido de unión a albúmina, un dominio de fibronectina, o una albúmina sérica humana;

L es un enlazador; y

B es una variante de GDNF que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con una secuencia de GDNF de referencia consistente en los aminoácidos 118-211, 117-211, 110-211, o 92-211 de SEQ ID N.º: 1; donde A se une al extremo N-terminal de la variante del GDNF mediante el enlazador, y

donde el polipéptido de fusión GDNF se une al receptor alfa-1 humano de la familia GDNF con una K<D>de 20 a 20.000 pM.

2.El polipéptido de fusión GDNF de la reivindicación 1, en el que A comprende un dominio Fc.

3.El polipéptido de fusión GDNF de la reivindicación 1, donde

A comprende un péptido de unión a albúmina.

4.El polipéptido de fusión GDNF de la reivindicación 1, donde

A comprende un dominio de fibronectina.

5.El polipéptido de fusión GDNF de la reivindicación 1, donde

A comprende una albúmina de suero humano.

6.El polipéptido de fusión de GDNF de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde B es una variante de GDNF que tiene al menos un 97% de identidad de secuencia con una secuencia de GDNF de referencia consistente en los aminoácidos 118-211, 117-211, 110-211, o 92-211 de SEQ ID N.º: 1.

7.El polipéptido de fusión GDNF de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde dicha variante de GDNF consiste en:

(a) aminoácidos 92-211 de SEQ ID N.º: 1; o

(b) aminoácidos 118-211 de SEQ ID N.º: 1; o

(c) aminoácidos 117-211 de SEQ ID N.º: 1; o

(d) aminoácidos 110-211 de SEQ ID N.º: 1.

8.El polipéptido de fusión GDNF de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 6, y 7, en el que dicho dominio Fc no forma un dímero y/o en el que dicho dominio Fc no comprende un dominio bisagra.

9.El polipéptido de fusión GDNF de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que dicho enlazador en dicho polipéptido de fusión GDNF es un enlace o espaciador, opcionalmente en el que dicho espaciador comprende la secuencia de cualquiera de las SEQ ID N.º: 4-29.

10.Una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de fusión GDNF de cualquiera de las reivindicaciones 1-9.

11.Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 10.

12.Una célula huésped que expresa el polipéptido de fusión GDNF de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en la que la célula huésped comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 10 o el vector de la reivindicación 11.

13.Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de fusión GDNF de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 10, o el vector de la reivindicación 11, y uno o más portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables.

14.El polipéptido de fusión GDNF de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 10, el vector de la reivindicación 11, o la composición farmacéutica de la reivindicación 13, para su uso en un método de tratamiento y/o prevención de una enfermedad metabólica en un sujeto, opcionalmente en el que dicha enfermedad metabólica se selecciona del grupo que consiste en obesidad, diabetes de tipo-1 y diabetes de tipo-2.

15.El polipéptido de fusión GDNF de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 10, el vector de la reivindicación 11, o la composición farmacéutica de la reivindicación 13, para su uso en un método de tratamiento y/o prevención de una enfermedad neurológica en un sujeto, opcionalmente donde dicha enfermedad neurológica se selecciona del grupo que consiste en esquizofrenia, epilepsia, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, ansiedad, accidente cerebrovascular, un tumor cerebral, y una metástasis cerebral.