ES3069726T3

ES3069726T3 - Method and apparatus for detecting pathogens

Info

Publication number: ES3069726T3
Application number: ES23700316T
Authority: ES
Inventors: Matthew Clark; Raju Misra; Richard Leggett; Mark Alston; Samuel Martin
Original assignee: Earlham Entpr Ltd; Natural History Museum Trading Co Ltd
Current assignee: Earlham Entpr Ltd; Natural History Museum Trading Co Ltd
Priority date: 2022-01-07
Filing date: 2023-01-06
Publication date: 2026-06-10
Anticipated expiration: 2043-01-06
Also published as: EP4460830B1; EP4752886A2; WO2023131795A1; EP4460830A1; EP4752886A3; US20250095779A1; EP4460830C0

Abstract

Describimos un método y un sistema para detectar patógenos en una muestra, en particular una muestra de aire. El método está diseñado para ejecutarse en tiempo real junto con el procesamiento de secuenciación de la muestra, de modo que los resultados estén disponibles rápidamente para el usuario. Cada secuencia de entrada, dentro del conjunto de secuencias leídas, se compara mediante un primer algoritmo de clasificación y se asigna a un taxón. Una secuencia de entrada se clasifica como potencialmente patógena cuando el taxón al que se asigna corresponde a un taxón patógeno. Cada secuencia de entrada clasificada como potencialmente patógena se compara, mediante un segundo algoritmo de clasificación, con varias secuencias objetivo en una segunda base de datos, seleccionada en función del taxón patógeno. Se utiliza un índice de confianza como parte del proceso de toma de decisiones para determinar si una lectura individual representa una coincidencia genuina con un patógeno. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Método y aparato para la detección de patógenos

[0003] CAMPO TÉCNICO

[0004] Describimos un método implementado por ordenador para detectar patógenos en una muestra y un sistema para poner en práctica dicho método, en particular mediante el análisis metagenómico.

[0005] ANTECEDENTES

[0006] En el estado de la técnica se conocen diversos métodos para la caracterización de microbiomas, incluyendo muchos que utilizan el análisis metagenómico. El documento US2021/222231 describe un método para supervisar y gestionar el microbioma de una instalación y la adopción de medidas correctivas para prevenir daños a los ocupantes. El documento US 2018/365375 A1 da a conocer un método para la clasificación de lecturas metagenómicas y la detección de patógenos basado en un procedimiento de dos etapas que consiste en una primera comparación de secuencias con una base de datos general de patógenos, seguida de una segunda comparación con secuencias seleccionadas en función de una asignación preliminar derivada de la primera comparación. Sin embargo, no se da a conocer ninguna puntuación de confianza incremental basada en ambas comparaciones. El documento US 2018/365375 A1 también describe la inclusión de la cobertura de un genoma de referencia en la evaluación, pero no calcula una puntuación de dispersión genómica dividiendo el genoma de referencia en segmentos y teniendo en cuenta cuántas lecturas se asignan a cada segmento.

[0007] El artículo «Optimized DNA extraction and metagenomic sequencing of airborne microbial communities» (Extracción optimizada de ADN y secuenciación metagenómica de comunidades microbianas presentes en el aire), de Jiang et al., publicado en Nature Protocols 10, 768-799 (2015), describe un protocolo optimizado para extraer hasta decenas de nanogramos de ADN genómico microbiano presente en el aire a partir de partículas recogidas. Tal y como se explica en el artículo, con el fin de identificar especies microbianas, las lecturas de HiSeq se alinean con una cohorte de genomas completos no redundantes del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) utilizando la herramienta de alineación Short Oligonucleotide Analysis Package (SOAP), que suele ser más rápida de ejecutar que la herramienta Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) o la herramienta BLAST-1 like Alignment Tool (BLAT).

[0008] El artículo «Longitudinal survey of microbiome associated with particulate matter in a megacity» (Estudio longitudinal del microbioma asociado a las partículas en suspensión en una megaciudad), de Qin et al., publicado en Genome Biology 21, número de artículo: 55 (2020), describe un estudio metagenómico longitudinal de muestras de aire en Pekín. El artículo «Characterization of the public transit air microbiome and resistome reveals geographical specificity» (Caracterización del microbioma y el resistoma del aire en el transporte público que revela especificidad geográfica), de Leung et al., publicado en Microbiome 9, número de artículo: 112 (2021), describe un estudio de los microbiomas del aire en el transporte público de seis ciudades. Ambos artículos describen el uso de MetaPhlAn2, que funciona mediante la identificación de genes marcadores específicos.

[0009] El solicitante ha identificado la necesidad de un método en tiempo real más preciso para determinar si un patógeno está presente en una muestra, p.ej., una muestra de aire. Es necesario que el método presente una alta sensibilidad hacia los patógenos y una tasa de falsos positivos extremadamente baja para evitar la activación de alertas innecesarias.

[0010] RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0011] La invención se describe en las reivindicaciones adjuntas.

[0012] RESUMEN DE LA DIVULGACIÓN RELACIONADA

[0013] De conformidad con la presente invención, se proporciona un aparato y un método tal y como se describen en las reivindicaciones adjuntas. Otras características de la invención se desprenderán de las reivindicaciones dependientes y de la descripción siguiente.

[0014] Describimos un método en tiempo real para detectar un patógeno en una muestra, el cual comprende: introducir una pluralidad de lecturas de secuencia obtenidas a partir de la muestra mediante secuenciación de ácidos nucleicos. Para cada lectura de secuencia de entrada de entre la pluralidad de lecturas de secuencia, el método comprende comparar, utilizando un primer algoritmo de clasificación, la lectura de secuencia de entrada con una pluralidad de secuencias objetivo en una primera base de datos, en donde la primera base de datos comprende secuencias genómicas de patógenos; identificar, utilizando el primer algoritmo de clasificación, un conjunto de coincidencias para la lectura de secuencia de entrada, en donde cada coincidencia es una secuencia objetivo que coincide con la lectura de secuencia de entrada; asignar, utilizando el conjunto de coincidencias, la lectura de secuencia de entrada a un taxón; y clasificar la lectura de secuencia de entrada como potencialmente patógena cuando el taxón asignado corresponde a un taxón patógeno. Para cada lectura de secuencia de entrada clasificada como potencialmente patógena, el método comprende, además: comparar, utilizando un segundo algoritmo de clasificación, la lectura de secuencia de entrada potencialmente patógena con una pluralidad de secuencias objetivo en una segunda base de datos, en donde la segunda base de datos se selecciona en función del taxón patógeno correspondiente; y confirmar la clasificación de la lectura de secuencia de entrada potencialmente patógena como patógena cuando la lectura de secuencia de entrada potencialmente patógena coincide con una o más secuencias objetivo de la segunda base de datos. El método comprende, además, calcular una puntuación de confianza para cada lectura de la secuencia de entrada, incrementando la puntuación de confianza en una primera cantidad fija cuando la lectura de la secuencia de entrada se clasifica como potencialmente patógena e incrementando la puntuación de confianza en una segunda cantidad fija cuando se confirma que cada lectura de la secuencia de entrada clasificada como potencialmente patógena es patógena, y comparar la puntuación de confianza con un umbral de puntuación de confianza para determinar si cada lectura de la secuencia de entrada coincide con un patógeno.

[0016] Por lo tanto, el método utiliza dos algoritmos de clasificación diferentes, lo que permite obtener una tasa de detección más precisa. El método puede considerarse un proceso de clasificación en dos etapas, en donde la segunda etapa de clasificación se utiliza para reforzar la fiabilidad de la clasificación de la primera etapa cuando ambas coinciden. Por el contrario, los métodos conocidos suelen utilizar solamente una única etapa de clasificación. El segundo algoritmo de clasificación puede ser más preciso o más específico que el primero. La precisión (o especificidad) puede medirse utilizando la tasa de falsos positivos más baja, es decir, el porcentaje de especies estrechamente relacionadas que se clasifican de manera errónea como patógenos. Un algoritmo más preciso puede tener una tasa de falsos positivos cercana al 0 %, mientras que uno menos preciso puede tener una tasa de falsos positivos superior a la del algoritmo más preciso, que puede llegar hasta el 6 %.

[0018] Garantizar que la tasa global de falsos positivos sea baja (es decir, una tasa cercana al 0 %) puede resultar especialmente importante cuando se realizan pruebas de detección de patógenos en un entorno ambiental, en lugar de clínico. La detección de un patógeno puede dar lugar a que se active una alerta, y el impacto de una falsa alerta puede resultar especialmente perjudicial, p.ej., si se inicia una evacuación que no es necesaria. La detección precisa de un patógeno en una muestra ambiental se complica aún más debido a que, por lo general, el número de lecturas de secuencia del patógeno es muy bajo (p.ej., tal vez tan solo 5 lecturas del patógeno por cada 50.000 lecturas). Es importante lograr una detección precisa, incluso con niveles tan bajos. Por lo general, un algoritmo de clasificación más preciso funciona más lentamente que uno menos preciso, ya que suele tener una mayor complejidad computacional. No obstante, el método puede seguir aplicándose en tiempo real, ya que el segundo algoritmo de clasificación solamente se utiliza una vez que el primer algoritmo ha identificado un posible patógeno, y mediante el uso de una segunda base de datos seleccionada en función del género del posible patógeno.

[0019] El primer algoritmo de clasificación puede ser una herramienta de búsqueda de alineaciones locales con semilla (BLAST), p.ej., o una herramienta de coincidencia de k-mero, como Kraken. BLAST se describe, p.ej., en «Basic Local Alignment Search Tool» (Herramienta básica de búsqueda de alineaciones locales), de Altschul et al., publicado en “Journal of Molecular Biology” 1009, 5 de octubre; 215(3):403-10. Kraken se describe, p.ej., en «Improved metagenomic analysis with Kraken 2» (Análisis metagenómico mejorado con Kraken 2), de Wood et al., en Genome Biol, 2019; 20(1): 257.

[0021] El patógeno puede ser bacteriano, fúngico o viral. Tal y como se ha indicado con anterioridad, la primera base de datos contiene secuencias genómicas de patógenos. La primera base de datos puede contener únicamente secuencias de ácido nucleico que tengan una identificación taxonómica como patógeno, p.ej., un patógeno bacteriano, fúngico o viral. De manera alternativa, la primera base de datos puede comprender secuencias de todos los dominios (p.ej., secuencias de plantas, animales, bacterias y virus) o de dominios seleccionados (p.ej., secuencias de bacterias y virus) y, por lo tanto, puede comprender secuencias de patógenos y de no patógenos. La primera base de datos puede generarse utilizando una base de datos de nucleótidos estándar, p.ej., la base de datos de nucleótidos (nt) publicada por el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI), que se filtra según la identificación taxonómica. La primera base de datos puede limitarse a secuencias bacterianas, fúngicas y/o víricas (es decir, tanto patógenas como no patógenas), con lo que la etapa de identificar un conjunto de coincidencias debería llevar menos tiempo que si la primera base de datos contuviera todas las secuencias (p.ej., incluyendo secuencias vegetales y animales). Sin embargo, es posible que la primera base de datos contenga todas las secuencias si el primer algoritmo de clasificación es capaz de identificar un conjunto de coincidencias en tiempo real. La primera base de datos puede denominarse base de datos de nucleótidos.

[0023] El segundo algoritmo de clasificación puede ser un algoritmo de asignación metagenómica a nivel de cepa y de estimación de la composición, conocido como MetaMaps. La segunda base de datos puede ser una base de datos a nivel de género, es decir, una base de datos de secuencias de un patógeno concreto y sus parientes. La segunda base de datos puede generarse utilizando una base de datos estándar, p.ej., RefSeq, identificando cada secuencia genómica de la base de datos estándar perteneciente a un género concreto y seleccionando cada genoma identificado para incluirlo en la segunda base de datos. La base de datos RefSeq se describe, p.ej., en «Reference sequence (RefSeq) database at NCBI: current status, taxonomic expansion and functional annotation» (Base de datos de secuencias de referencia (RefSeq) del NCBI: situación actual, ampliación taxonómica y anotación funcional), de O'Leary et al., publicado en Nucleic Acids Res el 4 de enero de 2016; 44(D1): D733-45.

[0024] La segunda base de datos puede basarse en el taxón del patógeno correspondiente, seleccionando como segunda base de datos una de las siguientes: una base de datos a nivel de género, una base de datos a nivel de familia, una base de datos a nivel de especie o una base de datos a nivel de subespecie. Por ejemplo, se puede crear una base de datos a nivel de género calculando una puntuación relativa a un patógeno concreto para cada secuencia de referencia dentro de un género y descartando al menos algunas de las secuencias de referencia que no cumplan un criterio de puntuación, p.ej., descartando las referencias con una puntuación inferior a una puntuación umbral. Se pueden conservar todas las secuencias de referencia que cumplan los criterios de puntuación. La puntuación puede ser cualquier puntuación adecuada, p.ej., la puntuación de identidad de nucleótidos media (ANI) al compararla con un patógeno concreto. La puntuación umbral puede ser cualquier valor de puntuación adecuado, p.ej., especificado como X %. A modo meramente ilustrativo, unos valores adecuados para X son 87 o 95, dependiendo del tamaño deseado de la base de datos. La base de datos a nivel de género puede comprender solamente una proporción fija de las secuencias de referencia que no cumplen los criterios de puntuación. La proporción fija puede ser del 50 % (es decir, 1 de cada 2), del 20 % (es decir, 1 de cada 5), del 10 % (es decir, 1 de cada 10) o del 5 % (es decir, 1 de cada 20). Dicho de otro modo, pueden conservarse todas las secuencias de referencia que se encuentren dentro del X % del patógeno, junto con al menos algunas de las secuencias de referencia que se encuentren por debajo del X %.

[0025] La identificación de un conjunto de coincidencias para la lectura de la secuencia de entrada puede consistir en identificar una secuencia de consulta como coincidencia cuando dicha secuencia cumple un umbral mínimo de coincidencia que puede ser configurado por el usuario. El número de coincidencias dentro de cada conjunto puede definirse identificando la coincidencia con la puntuación más alta del conjunto y seleccionando todas las coincidencias que tengan una puntuación dentro de un umbral de puntuación (p.ej., el 90 %) de la puntuación más alta. El número de coincidencias dentro del conjunto puede limitarse a un número máximo (p.ej., 20 coincidencias). El umbral de puntuación y el número máximo pueden ser configurados por el usuario. Dicho de otro modo, el conjunto de coincidencias puede comprender únicamente coincidencias de alta calidad.

[0026] La asignación de la lectura de la secuencia de entrada a un taxón puede realizarse utilizando un algoritmo de ancestro común más reciente sobre el conjunto de coincidencias. Por ejemplo, pueden compararse las rutas taxonómicas de cada coincidencia dentro del conjunto de coincidencias y seleccionarse como taxón el ancestro común más reciente dentro de cada ruta taxonómica comparada. El ancestro común más reciente puede ser el último nodo dentro de cada ruta taxonómica que sea el mismo. Por ejemplo, si una lectura devolviera coincidencias con Escherichia coli O25 y Escherichia coli PCN061 (dos cepas de E. coli), el ancestro común más reciente sería Escherichia coli. Sin embargo, si una lectura arroja coincidencias con «Escherichia coli» (especie) y «Klebsiella pneumoniae» (especie), el ancestro común más reciente sería Enterobacteriaceae (familia). Dicho de otro modo, a una secuencia de entrada se le asigna un único taxón, que puede ser una especie o un nivel superior (p.ej., un género), dependiendo del conjunto de coincidencias. Una vez asignada a un taxón, una lectura de secuencia de entrada se clasifica como patógeno cuando el taxón asignado corresponde a un taxón patógeno. Se puede determinar que el taxón asignado corresponde a un taxón patógeno comparando dicho taxón con una lista de taxones patógenos. Cuando el taxón asignado coincide con un taxón de la lista de taxones patógenos, se puede determinar que el taxón asignado corresponde a uno de ellos. Cuando el taxón asignado no coincide con ningún taxón de la lista de taxones patógenos, la lectura de secuencia puede clasificarse como no patógena.

[0027] Además, de hacer coincidir el taxón asignado con la lista, es posible que sea necesario cumplir diversos criterios antes de que la lectura de secuencia de entrada se clasifique como patógena. Dichos criterios pueden incluir uno o varios de los siguientes: un valor de identidad que supere un umbral de identidad, un valor de cobertura de consulta que supere un umbral de cobertura de consulta, una puntuación combinada basada en el valor de identidad y el valor de cobertura de consulta que supere un umbral de puntuación combinada, y que la lectura de secuencia de entrada tenga una longitud mínima. El valor de identidad puede ser la cantidad (p.ej., el porcentaje) de la lectura de secuencia de entrada que coincide con una secuencia objetivo, y un umbral de identidad de ejemplo es del 70 %. El valor de cobertura de la consulta puede ser la cantidad (p.ej., el porcentaje) de la longitud total de la lectura de secuencia de entrada que coincide con una secuencia objetivo, y un umbral de cobertura de la consulta de ejemplo es del 40 %. La longitud mínima puede definirse como 100 pares de bases.

[0028] El método puede comprender, además, determinar si la lectura de la secuencia de entrada está asociada a un factor de virulencia e incrementar la puntuación de confianza en una tercera cantidad fija cuando se determina que la secuencia de entrada es virulenta. Determinar si la lectura de la secuencia de entrada está asociada a un factor de virulencia puede comprender comparar la lectura de la secuencia de entrada con una base de datos de factores de virulencia utilizando el primer algoritmo de clasificación (p.ej., BLAST). La tercera cantidad fija puede ser menor que la primera y la segunda cantidad fija. De este modo, la clasificación como patógeno por parte del primer y segundo algoritmo de clasificación es más importante (o tiene mayor peso) que la determinación de que la lectura de la secuencia de entrada está asociada a un factor de virulencia. Lo que antecede refleja el hecho de que los virus y las bacterias no patógenos también pueden tener un factor de virulencia. La primera cantidad fija puede ser igual a la segunda cantidad fija para reflejar la ponderación igual aplicada tanto al primero como al segundo algoritmo de clasificación.

[0029] El método que antecede describe un procedimiento para determinar si cada lectura de secuencia de entrada coincide con un patógeno bacteriano o viral. Se puede generar una alerta cuando haya un número de lecturas de la secuencia de entrada superior a un umbral, las cuales se determinen que coinciden con un patógeno bacteriano o viral. El número umbral puede ser uno o puede ser mayor, p.ej., tres, para aumentar la sensibilidad y reducir el riesgo de que una muestra sea identificada erróneamente como portadora de un patógeno.

[0031] Cuando se determina que varias lecturas de secuencias de entrada coinciden con un patógeno bacteriano o viral y, por lo tanto, se han clasificado como patógenas en función de la puntuación de confianza, el método puede incluir, además, un análisis adicional para reducir aún más el riesgo de un falso positivo. Por ejemplo, para cada patógeno identificado, el método puede consistir en determinar el número de lecturas de secuencia de entrada clasificadas como patógenas para dicho patógeno concreto; y calcular una puntuación de confianza del patógeno asociada a dicho patógeno a partir de cada puntuación de confianza de una lectura de secuencia de entrada para ese patógeno concreto. La puntuación de confianza del patógeno puede ser la media de todas las puntuaciones de confianza para cada lectura de secuencia de entrada que se clasifique como patógena para el patógeno concreto. La puntuación de confianza del patógeno puede compararse con un umbral de puntuación de confianza del patógeno para confirmar si el patógeno se ha identificado correctamente.

[0033] También describimos otro método que puede combinarse con el método anterior o utilizarse de forma independiente de este cuando existen varias lecturas de secuencia de entrada clasificadas como patógenas. Para cada patógeno identificado, el método puede consistir en determinar el número de lecturas de secuencia de entrada clasificadas como patógenas para dicho patógeno concreto, determinar el número de lecturas de secuencia de entrada n<g>clasificadas en el mismo género que el patógeno concreto y calcular una relación patógeno-pariente utilizando los números de lecturas de secuencia de entrada determinados en las etapas anteriores. La relación patógeno-pariente Rpuede calcularse como

[0035]

[0038] en donde nes el número de lecturas del patógeno, n<g>es el número de lecturas clasificadas en el mismo género que el patógeno, y m<g>es un multiplicador por género. El multiplicador por género puede establecerse en 1 como valor por defecto. El multiplicador por género puede tener un valor inferior a 1 cuando es conocido que existe un elevado ruido de fondo del mismo género para el patógeno concreto. La relación patógeno-pariente puede compararse con un umbral de relación patógeno-pariente para confirmar si el patógeno se ha identificado de manera correcta.

[0040] También describimos otro método que puede combinarse con los métodos anteriores o utilizarse de forma independiente de ellos cuando existe una pluralidad de lecturas de secuencias de entrada que se ha determinado que coinciden con un patógeno bacteriano o viral. Para cada patógeno identificado, el método puede consistir en dividir el patógeno identificado en una pluralidad de segmentos, realizar el recuento del número de lecturas de secuencia de entrada en cada segmento que se han clasificado como patógenas y calcular, utilizando el número contado de lecturas de secuencia de entrada en cada segmento, un valor de dispersión genómica que es indicativo de una distribución de las lecturas de secuencia de entrada patógenas a lo largo del patógeno. La dispersión genómica g<s>puede calcularse entonces como

[0042] en donde V<d>es una distancia de variación total que se calcula comparando la distribución del número de lecturas de secuencia de entrada contabilizadas en cada segmento con una distribución uniforme, a lo largo del patógeno, de las lecturas de secuencia de entrada que se han clasificado como patógenas. La distribución uniforme puede determinarse utilizando el número medio de lecturas de secuencia de entrada patógenas por segmento. La dispersión genómica g<s>puede ser una distribución de probabilidad en donde un número cercano a uno representa una distribución uniforme y un número cercano a cero indica que la distribución no se asemeja en absoluto a una distribución uniforme. El valor de la dispersión genómica puede compararse con un umbral de dispersión genómica para confirmar si el patógeno se ha identificado correctamente. Cuando la dispersión genómica es inferior al umbral de dispersión genómica, es probable que las lecturas se agrupen en segmentos y, por lo tanto, es más probable que se produzca una clasificación errónea de cada lectura como portadora de un patógeno.

[0044] También describimos otro método que puede combinarse con los métodos anteriores o utilizarse de forma independiente de ellos cuando existen varias lecturas de secuencias de entrada clasificadas como patógenas. Para cada patógeno identificado, el método puede comprender, además, determinar el número de lecturas de secuencia de entrada nclasificadas como patógenas para un patógeno concreto y que son únicas de dicho patógeno concreto; determinar el número de lecturas de secuencia de entrada n<n>clasificadas como patógenas para el patógeno concreto y que no son únicas de dicho patógeno concreto; y calcular una relación de unicidad utilizando los números de lecturas de secuencia de entrada determinados en las etapas anteriores. La relación de unicidad puede calcularse como:

[0046]

[0048] en donde nes el número de lecturas patógenas únicas y n<n>es el número de lecturas patógenas no únicas. La relación de unicidad puede compararse con un umbral de unicidad para confirmar si el patógeno se ha identificado correctamente. La relación de unicidad también puede incorporarse al cálculo de la puntuación de confianza, p.ej., mediante una suma ponderada.

[0049] Como alternativa, o, además, de utilizar la relación de unicidad, cuando se identifica que una lectura de secuencia de entrada es única, la puntuación de confianza de dicha lectura concreta puede incrementarse en una cuarta cantidad fija. La cuarta cantidad fija puede ser mayor que cualquiera de las cantidades fijas primera, segunda y tercera para reflejar la importancia de la coincidencia de una secuencia dentro de un patógeno que sea única para dicho patógeno. Una lectura de secuencia de entrada puede identificarse como única comparando cada lectura de secuencia de entrada con una base de datos que contenga únicamente secuencias objetivo dentro del genoma de un patógeno que sean únicas para dicho patógeno.

[0050] Algunos o la totalidad de los métodos descritos con anterioridad pueden combinarse para generar una puntuación global para el patógeno en cuestión, utilizando una suma ponderada de algunos o todos los siguientes elementos: la puntuación de confianza del patógeno, la relación patógeno-pariente, el valor de dispersión genómica y la relación de unicidad.

[0051] Al menos uno de los siguientes elementos: el número de lecturas de secuencia de entrada nque se determina que coinciden con un patógeno concreto y la puntuación de confianza del patógeno, puede utilizarse como multiplicador en la suma ponderada.

[0052] La puntuación global para el patógeno concreto puede calcularse utilizando

[0054] en donde nes el número de lecturas de secuencia de entrada que se determina que coinciden con un patógeno concreto, s<mean>es la puntuación de confianza del patógeno, Res la relación patógeno-pariente, S<g>es el valor de dispersión genómica, Ues la relación de unicidad y α,β,δ son constantes (p.ej., 1 inicialmente y configurables para modificar la importancia de cada término).

[0055] Una vez calculada la puntuación de un patógeno concreto, el método puede incluir, además, la determinación de si se ha identificado algún otro patógeno. A continuación, los métodos descritos con anterioridad pueden repetirse para cada patógeno adicional que se identifique. Se puede obtener una puntuación global de la muestra sumando todas las puntuaciones de los patógenos, es decir:

[0057]

[0059] en donde Ses la puntuación de un patógeno concreto,qes el número de patógenos identificados en la muestra y S<s>es la puntuación global de la muestra.

[0060] La muestra puede obtenerse del entorno, p.ej., del aire, del agua o del suelo. De manera alternativa, la muestra puede ser una muestra clínica. La muestra puede obtenerse utilizando cualquier método o dispositivo adecuado. La mayoría de lecturas de secuencia se obtienen mediante secuenciación de ácidos nucleicos, p.ej., la secuenciación «shotgun» del genoma completo, que es una técnica estándar para el muestreo aleatorio de uno o varios genomas. Por lo general, el número de lecturas de secuencia del patógeno en el medio ambiente es muy bajo (p.ej., tal vez tan solo 5 lecturas de patógeno por cada 50.000 lecturas). La sensibilidad objetivo del método puede ser de 0,1 partes por litro (PPL). El número de lecturas depende del nivel de fondo de bacterias en el entorno (tal y como se explica, p.ej., en el libro de texto «Microbial Ecology», de Bowers et al., publicado en 2011). Tal como se indica en la tabla siguiente, puede haber tan solo 5 lecturas del patógeno en toda la muestra y, por lo tanto, es importante asegurarse de que una sola lectura se identifique de forma fiable.

[0061]

[0063] También describimos un soporte de datos no transitorio que contiene código el cual, cuando se ejecuta en un procesador, hace que este lleve a cabo cualquiera de los métodos descritos en el presente documento. Asimismo describimos código de control del procesador para implementar los métodos con anterioridad descritos, p.ej., en un sistema informático de uso general o en un procesador de señales digitales (DSP). El código puede proporcionarse en un soporte, tal como un disco, un microprocesador, un CD-ROM o un DVD-ROM, una memoria programable, tal como una memoria no volátil (p.ej., memoria instantánea) o una memoria de solamente lectura (firmware), o en un soporte de datos, tal como un soporte de señales ópticas o eléctricas. El código (y/o los datos) para poner en práctica el método aquí descrito puede comprender código fuente, código objeto o código ejecutable en un lenguaje de programación convencional (interpretado o compilado), tal como Python, C o código ensamblador; código para configurar o controlar un ASIC (circuito integrado de aplicación específica) o una FPGA (matriz de puertas programables en campo); o código para un lenguaje de descripción de hardware, tal como Verilog (RTM) o VHDL (lenguaje de descripción de hardware para circuitos integrados de muy alta velocidad). Como comprenderá el experto en esta técnica, dicho código y/o datos pueden distribuirse entre una pluralidad de componentes acoplados que se comunican entre sí.

[0064] También describimos un sistema, p.ej., un sistema informático que comprende uno o más procesadores —por ejemplo, microprocesadores—, memoria de trabajo y memoria de programa conectadas a uno o más de los componentes del sistema. El procesador o procesadores pueden estar configurados para ejecutar instrucciones contenidas en dicha memoria con el fin de que el sistema lleve a cabo el método descrito con anterioridad. El sistema también puede comprender uno o más dispositivos configurados para capturar una muestra y realizar la secuenciación de ácido nucleico en la muestra capturada. El dispositivo o dispositivos pueden incluir un dispositivo para la extracción de ácido nucleico y, de manera opcional, un dispositivo para la amplificación del ácido nucleico extraído.

[0065] Aunque se han mostrado y descrito algunas formas de realización preferidas de la presente invención, los expertos en esta técnica comprenderán que pueden realizarse diversos cambios y modificaciones sin apartarse del alcance de la invención, tal y como se define en las reivindicaciones adjuntas.

[0066] BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0067] Para una mejor comprensión del método y el aparato aquí descritos, y para mostrar cómo pueden llevarse a cabo las formas de realización de los mismos, se hará ahora referencia, a modo de ejemplo solamente, a los diagramas adjuntos, en los que:

[0068] La Figura 1 es un diagrama de flujo de un método para determinar si una lectura individual en una muestra es patógena;

[0069] La Figura 2 es un extracto de una ruta taxonómica;

[0070] Las Figuras 3a a 3e son diagramas de flujo de diversos métodos para determinar si una muestra contiene un patógeno utilizando el método de la Figura 1;

[0071] Las Figuras 4a y 4b son ilustraciones esquemáticas de un genoma de un patógeno que muestran las ubicaciones de las lecturas clasificadas como patógenas dentro del genoma;

[0072] La Figura 5 es un diagrama de bloques esquemático para la puesta en práctica de los métodos;

[0073] La Figura 6a muestra gráficamente el recuento frente a la puntuación ANI para la puntuación ANI entre la secuencia de referenciade Bacillus anthracisy todas las demás secuencias de referencia completas del género Bacillus; La Figura 6b muestra una distribución sobre el gráfico de la Figura 6a;

[0074] La Figura 7a muestra el número de lecturasde Bacillus anthracisque se clasificaron comoBacillus anthracis; y En la Figura 7b muestra el número de lecturasde Bacillus thuringiensisque se clasificaron comoBacillus thuringiensis.

[0075] DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LOS DIBUJOS

[0077] En general, describimos un método y un sistema para detectar patógenos en una muestra, en particular en una muestra de aire. El método está diseñado para ejecutarse en tiempo real junto con el procesamiento de secuenciación de la muestra, de modo que los resultados estén disponibles con rapidez para el usuario. Se utiliza una puntuación de confianza como parte del proceso de toma de decisiones para determinar si una lectura individual representa una coincidencia genuina con un patógeno. Tal como se comprenderá, el método debe ser muy sensible a los patógenos y el proceso de toma de decisiones debe tener una tasa de falsos positivos extremadamente baja.

[0079] La Figura 1 es un diagrama de flujo que ilustra las etapas del método para la detección de patógenos, que puede denominarse proceso Airscreen, especialmente cuando se procesan muestras de aire ambiental. En este diagrama de flujo, las etapas se llevan a cabo para cada lectura de secuencia obtenida de la muestra. En una primera etapa, se introduce una lectura de secuencia (etapa S100). Las lecturas de secuencia pueden convertirse desde una señal a una secuencia (es decir, identificación de bases) mediante cualquier método adecuado, p.ej., el software MinKNOW o Guppy creado por Oxford Nanopore. Las lecturas de secuencia pueden obtenerse mediante cualquier método adecuado. En general, se obtendrá una lectura de secuencia mediante la secuenciación de una muestra que puede contener un patógeno. La muestra puede obtenerse del entorno, p.ej., del aire, del agua o del suelo, o puede ser una muestra médica, p. ej., para obtener una muestra del aire, puede utilizarse un dispositivo especializado de muestreo de aire, como el muestreador de aire Coriolis Micro. Estos dispositivos pueden utilizar un filtro para capturar los patógenos que circulan en el aire; los patógenos pueden retirarse del filtro y analizarse posteriormente para determinar la secuencia de su ácido nucleico. De manera alternativa, el dispositivo puede no utilizar un filtro; por ejemplo, el muestreador de aire Coriolis Micro captura una muestra en un líquido. En la técnica se conocen métodos para aislar y secuenciar ácido nucleico a partir de una muestra que puede contener patógenos. Estos métodos pueden consistir en extraer el ácido nucleico de la muestra y amplificarlo, seguido de la secuenciación. La extracción del ácido nucleico puede realizarse mediante extracción orgánica o extracción en fase sólida. La amplificación del ácido nucleico puede realizarse mediante amplificación por PCR o amplificación del genoma completo. La secuenciación del ácido nucleico puede realizarse mediante cualquier método adecuado de secuenciación de genoma completo tipo shotgun.

[0081] En una segunda etapa opcional, se puede determinar la calidad de la lectura de secuencia de entrada y, si la calidad no es suficiente, se puede eliminar dicha lectura (etapa S102). Esta etapa puede considerarse una etapa de filtrado o prefiltrado y puede llevarse a cabo mediante un módulo de filtrado que aplique criterios basados en la longitud y/o la calidad de la lectura de secuencia. Se eliminan las lecturas que son más cortas que un umbral de longitud (normalmente 500 pares de bases) o que tienen un valor de calidad medio por debajo de un umbral de calidad (normalmente inferior a 9). El valor de calidad medio puede calcularse asociando cada letra del ADN a una puntuación de calidad y calculando a continuación la media. Conviene señalar que los umbrales de longitud y calidad son configurables por el usuario. Si la lectura de secuencia de entrada no va a ser procesada, el método vuelve a la primera etapa para introducir otra lectura de secuencia.

[0083] Tal como se muestra, cada lectura de la secuencia de entrada que se va a procesar se somete, por lo general, a dos vías de análisis independientes que pueden llevarse a cabo en paralelo (tal como se muestra) o de forma secuencial. La primera vía de análisis consta de dos fases: una fase de clasificación y una fase de confirmación. La segunda vía de análisis es opcional y, tal y como se describe a continuación, puede utilizarse para verificar o complementar el análisis realizado en la primera vía de análisis.

[0085] En la fase de clasificación, la primera etapa consiste en comparar la lectura secuenciada con una primera base de datos o biblioteca (etapa S106) de secuencias, p.ej., la base de datos nt del NCBI. La primera base de datos puede comprender secuencias de todos los dominios (p.ej., plantas, animales, bacterias y virus), secuencias de dominios seleccionados (p.ej., secuencias bacterianas y víricas) o puede limitarse únicamente a secuencias de patógenos, p.ej., secuencias de patógenos bacterianos, fúngicos y/o víricos. La comparación puede realizarse utilizando cualquier algoritmo o herramienta adecuada que encuentre coincidencias entre la lectura de secuencia de entrada (también denominada consulta o secuencia de consulta) y las secuencias almacenadas en la base de datos. Por ejemplo, puede utilizarse la herramienta básica de búsqueda de alineación local (BLAST) o un algoritmo de búsqueda de k-mero como Kraken. BLAST se describe, p.ej., en «Basic Local Alignment Search Tool» (Herramienta básica de búsqueda de alineaciones locales), de Altschul et al., publicado en Journal of Molecular Biology 1009, 5 de octubre; 215(3):403-10. BLAST implementa un algoritmo denominado semilla y extensión para encontrar coincidencias entre la secuencia de consulta y las secuencias objetivo de la base de datos. En una primera etapa de semilla, la herramienta intenta identificar coincidencias cortas entre la secuencia de consulta y las secuencias objetivo; dicho de otro modo, encontrar subsecuencias coincidentes en ambas secuencias. En la segunda etapa de ampliación, una vez encontrada una coincidencia corta, la herramienta intenta ampliarla buscando a ambos lados de la subsecuencia coincidente. Kraken se describe, p.ej., en «Improved metagenomic analysis with Kraken 2» (Análisis metagenómico mejorado con Kraken 2), de Wood et al., en Genome Biol, 2019; 20(1): 257.

[0087] Tal como se muestra, la siguiente etapa consiste en determinar si se ha identificado alguna coincidencia (etapa S108). Se puede considerar que se ha encontrado una coincidencia cuando la secuencia de consulta se asemeja a una secuencia de la primera base de datos. Cuando la base de datos contiene secuencias tanto de patógenos como de organismos no patógenos, la secuencia de consulta puede asemejarse a una secuencia de un patógeno o a una secuencia de un organismo no patógeno. El umbral de coincidencia (es decir, el umbral mínimo que debe cumplirse para que se considere que una secuencia de consulta se asemeja a una secuencia objetivo) puede ser configurado por el usuario. Para cada lectura de secuencia de entrada, se obtiene un conjunto resultante de entre 0 y muchos resultados. El número de coincidencias dentro de cada conjunto puede refinarse identificando la coincidencia con la puntuación más alta dentro del conjunto y seleccionando todas las coincidencias que tengan una puntuación dentro de un umbral de puntuación (p.ej., el 90 %) de la puntuación más alta. El número dentro del conjunto puede limitarse a un número máximo (p.ej., 20 coincidencias). El umbral de puntuación y el número máximo pueden ser configurados por el usuario.

[0089] Por ejemplo, en la etapa S108 pueden utilizarse algoritmos de coincidencia BLAST o k-mero. BLAST implementa varios algoritmos y, a los efectos descritos en la presente solicitud, entre los algoritmos adecuados se incluyen los algoritmos MegaBLAST y BLASTN, que comparan secuencias de nucleótidos (las 4 letras A, C, G y T del ADN) con bases de datos de nucleótidos. Por el contrario, BLASTP y BLAST X, que se utilizan en algunos artículos de la técnica anterior, realizan comparaciones con bases de datos de proteínas compuestas por aminoácidos (representados por 20 letras). Dichos algoritmos suelen ser más lentos y, por lo tanto, pueden no ser adecuados para esta primera comparación. Se puede encontrar más información sobre algunos de los algoritmos BLAST, p.ej., en «BLAST: at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools» (BLAST: el núcleo de un potente y variado conjunto de herramientas de análisis de secuencias), de McGinnis et al., publicado en nucleic Acids Research, volumen 32, número supl_2, 1 de julio de 2004, páginas W20-W25. A modo de otra comparación, conviene señalar que MetaPhlAn2 funciona identificando genes marcadores específicos, lo cual es un proceso más rápido y puede resultar útil para hacerse una idea de la composición aproximada de toda la comunidad. Sin embargo, MetaPhlAn2 no suele ser un procedimiento tan preciso ni tan específico como uno basado en el genoma completo y, por lo tanto, es probable que no sea fiable para la identificación de patógenos.

[0091] Por ejemplo, utilizando algoritmos BLAST adecuados, una coincidencia suficientemente cercana entre subsecuencias se denomina «par de alta puntuación» (HSP), y se dice que una secuencia de consulta «coincide» con una secuencia objetivo si ambas comparten uno o más HSP. Cada HSP puede estar asociado a una puntuación que puede denominarse «puntuación de bits o bitscore» y que se basa en la similitud de las subsecuencias. La puntuación de bits puede utilizarse para identificar la coincidencia con mayor puntuación, tal y como se ha descrito con anterioridad. Al comparar la secuencia de consulta con secuencias objetivo en una base de datos más amplia, existe una mayor probabilidad de que se produzcan algunas coincidencias válidas por casualidad. Por lo tanto, cada HSP también se asocia a un «valor E» que representa el número esperado de coincidencias con una puntuación similar o superior que es probable encontrar en una base de datos del mismo tamaño. Por ejemplo, un valor E de 0,05 significa que se espera una coincidencia por casualidad en 1 de cada 20 búsquedas similares, mientras que un valor E de 2,0 significa que se esperarían dos coincidencias por casualidad en una búsqueda similar. A modo meramente ilustrativo, el usuario puede configurar el umbral del valor E o puede optar por aceptar el umbral mínimo típico del valor E de 0,001. Una vez configurado el umbral del valor E, solamente se notificarán los resultados con valores E inferiores al umbral del valor E. Dicho de otro modo, al configurar el umbral del valor E, se puede considerar que el usuario está configurando el umbral de coincidencia descrito con anterioridad.

[0093] Una vez identificado el conjunto de coincidencias, la siguiente etapa consiste en comparar las rutas taxonómicas de cada coincidencia dentro de la etapa (etapa S110) para identificar un taxón para la lectura de secuencia de entrada. Dicho de otro modo, a cada lectura de secuencia de entrada se le asigna un único taxón. Cada ruta taxonómica puede determinarse tomando como referencia una taxonomía estándar, p.ej., la taxonomía del NCBI. Dichas taxonomías pueden dar lugar a rutas tales como: raíz, organismos celulares, bacterias, proteobacterias, gammaproteobacterias, Enterobacterales, Enterobacteriaceae, Klebsiella, Klebsiella pneumoniae. La asignación a un taxón puede realizarse utilizando cualquier algoritmo o herramienta adecuada, p.ej., un algoritmo de ancestro común más reciente (LCA). El uso de BLAST seguido de LCA puede denominarse BLAST/LCA.

[0095] La Figura 2 ilustra un extracto de una ruta taxonómica que puede utilizarse en esta etapa. Se comparan las rutas taxonómicas de todas las coincidencias identificadas para determinar un ancestro común. Por ejemplo, esto puede hacerse partiendo del nodo raíz y descendiendo por la ruta taxonómica, comparando cada nodo, «raíz», «organismos celulares», «bacterias», etc., hasta que las rutas se separan. El último nodo que cada una de las coincidencias tiene en común, antes de que las rutas se separen, es el ancestro común más reciente para el conjunto de coincidencias, y la lectura se asigna a este taxón. Con referencia a la Figura 2, si una lectura arrojara coincidencias con Escherichia coli 025 y Escherichia coli PCN061 (dos cepas de E. coli), el ancestro común más reciente sería Escherichia coli. Sin embargo, si una lectura devolviera coincidencias con «Escherichia coli» (especie) y «Klebsiella pneumoniae» (especie), entonces el ancestro común más reciente sería Enterobacteriaceae (familia).

[0097] Una vez que se ha asignado una lectura a un taxón, la siguiente etapa S112 consiste en determinar si se ha identificado un patógeno. Lo que antecede puede hacerse comparando el taxón asignado con una lista de taxones patógenos para determinar si existe una coincidencia. Una lectura que se haya asignado a un taxón que coincida (es decir, que se corresponda) con un taxón patógeno se clasifica como un patógeno potencial. Una lectura que no se haya asignado a un taxón que coincida (es decir, que se corresponda) con un taxón patógeno puede clasificarse como no patógeno o puede quedar sin clasificar, además, de la coincidencia del taxón asignado con un taxón patógeno de la lista, puede ser necesario cumplir diversos criterios antes de que la lectura de secuencia de entrada se clasifique como un resultado de patógeno putativo o potencial. Los criterios pueden incluir uno o más de los siguientes: un valor de identidad que supere un umbral de identidad, un valor de cobertura de consulta que supere un umbral de cobertura de consulta, una puntuación combinada basada en el valor de identidad y el valor de cobertura de consulta que supere un umbral de puntuación combinada, y una longitud mínima de la secuencia coincidente. El valor de identidad puede ser la cantidad (p.ej., el porcentaje) de la lectura de secuencia que coincide con una secuencia objetivo, y un ejemplo de umbral de identidad es el 70 %. El valor de cobertura de la consulta puede ser la cantidad (p.ej., el porcentaje) de la longitud total de la lectura de secuencia que coincide con una secuencia objetivo, y un ejemplo de umbral de cobertura de la consulta es el 40 %. Cuando se suman el valor de identidad y el valor de cobertura de la consulta para obtener una puntuación combinada, el umbral de puntuación combinada puede ser, p.ej., el 120 %. A modo meramente ilustrativo, la longitud mínima puede definirse como 100 pares de bases. Cuando se identifica una coincidencia con la puntuación más alta en cada conjunto de coincidencias, p.ej., tal y como se ha descrito con anterioridad en referencia a BLAST, el valor de identidad, el valor de cobertura de la consulta y la longitud mínima pueden determinarse para la coincidencia con la puntuación más alta. Conviene señalar que cada uno de estos umbrales es configurable.

[0099] Tal y como se explica con más detalle a continuación, puede utilizarse una puntuación de confianza para determinar si cada lectura individual coincide realmente con un patógeno. En consecuencia, cuando se identifica una coincidencia con un patógeno putativo o potencial durante la fase de clasificación, puede actualizarse la puntuación de confianza (etapa S114), p.ej., incrementándola en una cantidad fija. Si no se identifica un patógeno putativo, no se realiza ningún cambio en la puntuación de confianza. Esta etapa puede realizarse antes de la fase de confirmación o al mismo tiempo que esta última.

[0101] La fase de confirmación consiste en un análisis más detallado de cualquier lectura de secuencia de entrada que haya sido clasificada como un posible patógeno en la fase de clasificación. La fase de confirmación también puede denominarse una segunda fase de clasificación, que se completa una vez que la primera etapa de clasificación ha identificado un posible patógeno. Las lecturas de secuencia de entrada que no se clasifican como posibles patógenos no se procesan en la fase de confirmación, y a continuación se procesa otra lectura de secuencia de entrada. Se puede generar el resultado de la clasificación de la lectura de secuencia de entrada como no patógena. Cuando se inicia la fase de confirmación, la primera etapa S116 consiste en comparar la lectura con una segunda base de datos. La comparación puede realizarse utilizando cualquier algoritmo o herramienta adecuada que encuentre coincidencias entre la lectura de secuencia de entrada (también denominada consulta o secuencia de consulta) y las secuencias objetivo, almacenadas en la base de datos. La fase de confirmación utiliza un segundo algoritmo de clasificación que es significativamente más preciso que el primer algoritmo de clasificación utilizado en la fase de clasificación.

[0103] Un ejemplo de algoritmo adecuado es MetaMaps, que se describe, p.ej., en «MetaMaps - Strain-level metagenomic assignment and compositional estimation for long reads» (MetaMaps: asignación metagenómica a nivel de cepa y estimación de la composición para lecturas largas), de Dilthey et al., publicado en *Nature Communications*, doi: 10.1038/s41467-019-10934-2. MetaMaps es un algoritmo de clasificación de secuencias diseñado para lecturas largas. MetaMaps pone en práctica un procedimiento de análisis en dos etapas. En una primera etapa, se genera una lista de posibles ubicaciones de mapeo para cada lectura larga utilizando una estrategia de mapeo aproximado basada en un minimizador. En una segunda etapa, se puntúa probabilísticamente cada ubicación de mapeo utilizando un modelo descrito en el artículo y se estima la composición total de la muestra.

[0105] La siguiente etapa S118 consiste en clasificar el posible patógeno identificado en la primera fase de clasificación como patógeno o no patógeno. Cuando se confirma que un posible patógeno detectado es efectivamente un patógeno durante la fase de confirmación, se puede actualizar la puntuación de confianza (etapa S120), p.ej., incrementándola en una cantidad fija. Si no se confirma que el posible patógeno es un patógeno, no se realiza ningún cambio en la puntuación de confianza.

[0107] El uso de un segundo algoritmo de clasificación, mucho más preciso que el primero, implica que la clasificación realizada por este segundo algoritmo sería significativamente más lenta —por ejemplo, en varios órdenes de magnitud— si se llevara a cabo utilizando los mismos parámetros, tal como la misma base de datos. Lo que antecede puede mitigarse reduciendo el número de comparaciones que realiza el segundo algoritmo de clasificación. Tal y como se ha descrito con anterioridad, el segundo algoritmo de clasificación solamente procesa las lecturas de secuencia que podrían corresponder a patógenos. Se puede lograr un mayor ahorro de tiempo reduciendo el espacio de búsqueda de las secuencias objetivo. La segunda base de datos con la que se compara la lectura puede seleccionarse en función del posible patógeno que se haya identificado. Por ejemplo, si la fase de clasificación indica que se ha detectado potencialmente«bacillusanthracis», puede utilizarse la base de datos de bacilos. Conviene señalar que solamente algunos de los bacilos de la base de datos de bacilos son patógenos y que la segunda base de datos puede considerarse una base de datos que discrimina entre patógenos y parientes inofensivos. Dicho de otro modo, la lectura se compara con una base de datos a nivel de género. Dichas bases de datos a nivel de género pueden crearse a partir de bases de datos conocidas, como RefSeq, tal y como se describe a continuación.

[0108] Las tablas que figuran a continuación comparan el rendimiento de BLAST/LCA y MetaMaps, que son ejemplos del primero y segundo algoritmo de clasificación que pueden utilizarse en las fases de clasificación y confirmación, respectivamente.

[0109] Se seleccionan cuatro patógenos de un conjunto de lecturas simuladas para la comparación:Bacillus anthracis,Clostridium botulinum,Clostridium perfringensyYersinia pestis.

[0110] Para la tasa de verdaderos positivos, cada lectura clasificada como un posible patógeno se comparó con la base de datos correspondiente a nivel de género al utilizar MetaMaps, p.ej., la base de datos de Bacillus, la de Clostridium y la de Yersinia, respectivamente.

[0111] Se selecciona una cepa relacionada con cada uno de estos cuatro patógenos para determinar la tasa de falsos positivos:Bacillus thuringiensis,Clostridium drakei, Clostridium saccharoperbutylacetonicumyYersinia pseudotuberculosis.

[0112] Verdaderos positivos (TP)

[0114]

[0116] Conviene señalar que las tasas de verdaderos positivos mostradas con anterioridad, en las que se utilizó la base de datos adecuada a nivel de género para clasificar las lecturas deBacillus anthracis, Clostridium botulinum y Clostridium perfringens, son idénticas a las obtenidas con la base de datos predeterminada de MetaMaps. Se observa una pequeña mejora en las tasas de verdaderos positivos para Yersinia pestis, ya que la base de datos a nivel de género de Yersinia de MetaMaps clasifica ahora todas las lecturas de patógenos de Blast/LCA como patógenos. En cuanto a las tasas de falsos positivos que se muestran a continuación, conviene señalar que una mayor proporción de lecturas de Yersinia pseudo tuberculosis clasificadas incorrectamente como lecturas de Yersinia pestis por el primer algoritmo de clasificación (BLAST/LCA) se clasificaron correctamente como lecturas relacionadas mediante la base de datos de Yersinia de MetaMaps

[0117] Falsos positivos (FP)

[0119]

[0121] Volviendo a la Figura 1, existe una fase de análisis opcional que se muestra como si se llevara a cabo al mismo tiempo que la fase de clasificación, aunque conviene señalar que también puede ejecutarse antes o después de una o ambas fases de clasificación y confirmación. En la etapa S206, una lectura de secuencia que no haya sido eliminada por la etapa de filtrado opcional se compara con secuencias objetivo en una base de datos de factores de virulencia, tal como la VFDB que se describe con más detalle a continuación. Si en la etapa S208 se encuentra una coincidencia entre la lectura de secuencia de entrada y una o más secuencias objetivo, la puntuación de confianza se actualiza en la etapa S214. Si no se encuentra ninguna coincidencia, no se realiza ningún cambio en la puntuación de confianza.

[0122] Una vez completadas la fase de clasificación, la fase de confirmación y la fase de análisis opcional, los resultados de cada fase se introducen en un módulo de toma de decisiones para determinar si existe una coincidencia auténtica entre la lectura de secuencia de entrada y un patógeno (etapa S216). El módulo de toma de decisiones puede utilizar un mecanismo de puntuación de confianza para decidir si una lectura individual representa una coincidencia genuina con un patógeno, es decir, si debe clasificarse como patógena o no patógena. Tal como se ha descrito con anterioridad, la puntuación de confianza se actualiza (es decir, se incrementa) cuando el primer algoritmo de clasificación identifica un patógeno (etapa S114), cuando el segundo algoritmo de clasificación confirma el patógeno identificado (etapa S120) y cuando existe una coincidencia con un factor de virulencia (etapa S214). El incremento de la puntuación de confianza puede ser el mismo para cada resultado o puede ponderarse de modo que algunos resultados sean más importantes a la hora de determinar si existe una coincidencia genuina con un patógeno. Por ejemplo, la puntuación de confianza puede incrementarse en la misma cantidad (p.ej., dos) cuando un patógeno es identificado por el primer algoritmo de clasificación (etapa S114) y cuando el patógeno identificado es confirmado por el segundo algoritmo de clasificación (etapa S120). La puntuación de confianza puede incrementarse en una cantidad menor (p.ej., uno) cuando existe una coincidencia con un factor de virulencia (etapa S214). Dicho de otro modo, las coincidencias obtenidas mediante el primero y el segundo algoritmo de clasificación se ponderan con mayor peso que la coincidencia en la base de datos de factores de virulencia. Una lectura se clasifica como patógena cuando la puntuación de confianza recibida por el módulo de toma de decisiones es mayor o igual que un umbral de puntuación de confianza configurable, y se clasifica como no patógena cuando la puntuación de confianza es inferior a dicho umbral. El umbral de la puntuación de confianza puede configurarse de modo que solamente se genere una coincidencia genuina cuando al menos uno de los dos algoritmos de clasificación dé como resultado una coincidencia con un patógeno y exista una coincidencia en la base de datos de factores de virulencia. Por ejemplo, utilizando la puntuación simple que antecede, en donde la puntuación de confianza se incrementa en dos cuando se identifica un patógeno mediante el primero o el segundo algoritmo de clasificación y en uno cuando se confirma un factor de virulencia, el umbral de la puntuación de confianza puede fijarse en tres.

[0123] De manera opcional, es posible que también sea necesario cumplir otros criterios para que una lectura se marque como patógena. Dichos criterios pueden incluir criterios relativos al resultado del primer algoritmo de clasificación, como, p.ej., que el valor de identidad supere un umbral de identidad, que el valor de cobertura de la consulta supere un umbral de cobertura de la consulta y/o que la secuencia coincidente tenga una longitud mínima.

[0124] Cuando el módulo de toma de decisiones clasifica una lectura como patógena en la etapa S218, se puede enviar una alerta al usuario, tal y como se muestra en la etapa S220. La alerta puede consistir en un mensaje de audio o visual que se envía al usuario, p.ej., mostrando el mensaje en una pantalla., además, de emitir una alerta, se puede enviar un informe resumido que incluya las clasificaciones de los algoritmos de clasificación primero y segundo a un tercero (p.ej., una red de terceros) para su posterior procesamiento, tal como la comparación con resultados obtenidos de otros tipos de sensores, p.ej., sensores químicos, biológicos y radiológicos.

[0125] La Figura 1 muestra el proceso para clasificar cada lectura individual de entre el conjunto de lecturas obtenidas de una muestra como patógena o no patógena. Aunque la Figura 1 muestra que se genera una alerta cuando una sola lectura se clasifica como patógena, normalmente no basta con que una sola lectura se clasifique como patógena para que se cumplan los requisitos de sensibilidad necesarios para activar una alerta. Por consiguiente, una forma sencilla de mejorar la sensibilidad puede consistir en repetir el proceso de la Figura 1 para múltiples lecturas que se hayan extraído de la muestra. Una alerta solamente se activará cuando más de un número umbral de lecturas (p.ej., tres) se clasifiquen como un patógeno concreto.

[0126] Las Figuras 3a a 3d son diagramas de flujo que muestran cómo se pueden combinar de diferentes maneras los resultados de cada lectura individual para mejorar la clasificación general de cada muestra. Conviene señalar que uno o varios de los procesos de las Figuras 3a a 3d pueden utilizarse conjuntamente, tal y como se muestra en la Figura 3e.

[0127] La Figura 3a ilustra un proceso que puede utilizarse para determinar una puntuación de confianza media cuando existen más de una lectura clasificada como un patógeno concreto. En una primera etapa S300 se introducen varias lecturas de secuencia de una muestra. Cada una de las lecturas de secuencia se clasifica como patógena o no patógena (etapa S302) utilizando el método descrito en la Figura 1. Si no se identifican patógenos en la muestra en la etapa S304, el proceso puede comenzar de nuevo con una nueva muestra.

[0128] Cuando se identifica al menos un patógeno, se lleva a cabo la siguiente secuencia de etapas para cada uno de los patógenos identificados. Tal y como se muestra en la etapa S306, se determina (u obtiene) el número de lecturas nclasificadas como patógenas para el patógeno en cuestión. Para cada una de estas lecturas clasificadas como patógenas, se obtiene la puntuación de confianza correspondiente (etapa S308). La puntuación de confianza es la puntuación determinada por el proceso de la Figura 1. A continuación, se calcula la puntuación de confianza media (o promedio) s<mean>(etapa S310). A continuación, se compara la puntuación de confianza media con un umbral de puntuación de confianza media (etapa S312). Cuando la puntuación de confianza media es mayor o igual que el umbral de puntuación de confianza media, se emite una alerta (etapa S314). Cuando la puntuación de confianza media es inferior al umbral de puntuación de confianza media, el proceso puede comenzar de nuevo con una nueva muestra.

[0129] El umbral de la puntuación de confianza media puede configurarse para mejorar la precisión. A modo de ejemplo, el umbral de la puntuación de confianza media puede ser superior al umbral de la puntuación de confianza utilizado para determinar si una lectura concreta debe clasificarse como patógena. Por ejemplo, en el ejemplo de puntuación utilizado con anterioridad, el umbral de la puntuación de confianza media puede fijarse en cuatro cuando el umbral de la puntuación de confianza se establece en tres.

[0130] La Figura 3b ilustra un proceso en donde se compara el número de lecturas patógenas correspondientes a un patógeno concreto con el número de lecturas clasificadas en el mismo género que dicho patógeno, con el fin de determinar una proporción que podría denominarse relación patógeno-pariente. El motivo de dicha comparación es que la presencia de bacterias del mismo género que el patógeno reduce la confianza en la clasificación correcta del patógeno. Por ejemplo, si muchas lecturas de secuencia se clasifican comoBacillus thuringiensis, es más probable que las clasificaciones de un pequeño número de lecturas de secuencia comoBacillus anthracissean clasificaciones erróneas que una detección verdadera del patógeno.

[0131] Las primeras etapas de la Figura 3b coinciden con los de la Figura 3a. Dicho de otro modo, en una primera etapa S300 se introducen varias lecturas de secuencia procedentes de una muestra. Cada una de estas lecturas se clasifica como patógena o no patógena (etapa S302) utilizando el método descrito en la Figura 1. Cuando se identifica al menos un patógeno en la etapa S304, se lleva a cabo la siguiente secuencia de etapas para cada patógeno identificado. Tal y como se muestra en la etapa S306, se determina (u se obtiene) el número de lecturas nclasificadas como patógenas para dicho patógeno concreto. La siguiente etapa difiere de la Figura 3a y, tal y como se muestra en la etapa S408, se determina (u obtiene) el número de lecturas n<g>clasificadas en el mismo género que el patógeno concreto.

[0132] En el caso de algunos patógenos, existe una mayor probabilidad de que haya parientes naturales pertenecientes al mismo género que en el caso de otros patógenos. Lo que antecede significa que, cuando existe una gran presencia de fondo del mismo género, la relación patógeno-pariente será muy baja. Por lo tanto, un patógeno no se detectaría a menos que estuviera presente en niveles excesivamente altos. En consecuencia, en la etapa S410, se puede proporcionar un multiplicador opcional por género m<g>para mitigar este problema.

[0133] A continuación, se calcula la relación patógeno-pariente Ren la etapa S412. La relación patógeno-pariente Rpuede calcularse simplemente como:

[0135]

[0137] en donde nes el número de lecturas del patógeno y n<g>es el número de lecturas clasificadas en el mismo género que el patógeno. Por otra parte, una vez obtenido el multiplicador por género, la relación patógeno-pariente Rpuede calcularse como

[0139]

[0141] en donde nes el número de lecturas del patógeno, n<g>es el número de lecturas clasificadas en el mismo género que el patógeno y m<g>es el multiplicador por género. El multiplicador por género puede establecerse en 1 como valor por defecto. Al aumentar el valor del multiplicador por género, aumenta la importancia del fondo y, por lo tanto, disminuye el valor de la relación patógeno-pariente. Al disminuir el valor del multiplicador por género, disminuye la importancia del fondo y, por lo tanto, aumenta el valor de la relación patógeno-pariente. En consecuencia, puede utilizarse un valor inferior a 1 cuando existe un fondo considerable del mismo género. Una relación patógeno-pariente Rcon un valor cercano a cero indica que las lecturas de patógenos constituyen una pequeña parte de una asignación general al género. Un valor de la relación patógeno-pariente Rmás cercano a uno indica que las lecturas de patógenos representan una proporción significativa de las lecturas asignadas al género. La relación patógeno-pariente Rse compara con un umbral de relación patógeno-pariente en la etapa S414. A modo meramente ilustrativo, el umbral de relación patógeno-pariente puede fijarse en 0,5, pero es configurable para proporcionar la precisión deseada del método. Cuando la relación patógeno-pariente Res superior o igual al umbral de relación patógeno-pariente, se emite una alerta en la etapa S416.

[0143] La Figura 3c ilustra un proceso en donde se tiene en cuenta la distribución por todo el genoma de las lecturas clasificadas como patógenas. Cuando las lecturas clasificadas como patógenas se concentran en una región específica del genoma del patógeno, es más probable que dichas lecturas también puedan pertenecer a parientes inofensivos del mismo género, ya que representan secuencias comunes y, por lo tanto, la muestra podría clasificarse erróneamente como portadora de un patógeno. Cuando las lecturas clasificadas como patógenas se distribuyen por todo el genoma del patógeno, es más probable que la clasificación de la muestra como portadora de un patógeno sea correcta.

[0145] Las primeras etapas de la Figura 3c coinciden con las de la Figura 3a. Dicho de otro modo, en una primera etapa S300 se introducen varias lecturas de secuencia procedentes de una muestra. Cada una de estas lecturas de secuencia se clasifica como patógena o no patógena (etapa S302) utilizando el método descrito en la Figura 1. Cuando se identifica al menos un patógeno en la etapa S304, se lleva a cabo la siguiente secuencia de etapas para cada patógeno identificado. En primer lugar, el genoma del patógeno identificado se divide en una pluralidad de segmentos (etapa S506). Los segmentos pueden denominarse «bins» y pueden ser relativamente grandes. A modo meramente ilustrativo, el genoma puede dividirse, p.ej., en 10 bins, lo que, para un genoma bacteriano típico con entre 2 y 6 millones de pares de bases de secuencia, significa que cada bin representa unos pocos cientos de miles de pares de bases de secuencia.

[0147] La siguiente etapa consiste, pues, en determinar cuántos compartimentos contienen lecturas clasificadas como patógenas y contar cuántas lecturas existen en cada compartimento (etapa S508). Cuando una lectura se solapa con dos compartimentos, la lectura puede asignarse al compartimento con el que presenta un mayor solapamiento o puede asignarse a ambos compartimentos. Dado un total dencompartimentos ymlecturas que son coincidencias, el número medioNmde lecturas por segmento (compartimento) puede calcularse en la etapa S510 a partir de:

[0149]

[0152] El número medioNmde lecturas por segmento puede considerarse el número teórico de coincidencias por bin y se combina con el número real de lecturas en cada bin para determinar la distribución de las lecturas a lo largo del genoma. Se puede utilizar un valor denominado «distribución genómica<»>g<s>para representar la distribución de las lecturas a lo largo del genoma. La distribución genómica g<s>puede ser una distribución de probabilidad en donde un número cercano a uno representa una distribución uniforme, mientras que un número cercano a cero indica que la distribución no se asemeja en absoluto a una distribución uniforme.

[0154] Un método para calcular la dispersión genómica g<s>consiste en considerar que los recuentos de lecturas determinados en la etapa S508 representan una distribución de probabilidad que puede compararse con una distribución prevista (o uniforme) de las lecturas a lo largo del genoma. La distribución de recuentos puede compararse con la distribución uniforme utilizando una medida de distancia, p.ej., la distancia de variación total V<d>. Un valor de V<d>igual a 1 indica que la distribución de recuentos no se parece en nada a una distribución uniforme, y un valor de V<d>igual a 0 indica que la distribución de recuentos es una distribución uniforme. La dispersión genómica g<s>puede entonces calcularse como

[0156] A continuación, en la etapa S514, se puede comparar la dispersión genómica con un umbral de dispersión genómica. Cuando la dispersión genómica es superior o igual al umbral de dispersión genómica, existe una buena dispersión de lecturas clasificadas como patógenas a lo largo del genoma y, por lo tanto, se puede generar una alerta en la etapa S516. Cuando la dispersión genómica es inferior al umbral de dispersión genómica, es probable que las lecturas se agrupen en segmentos y, por lo tanto, es más probable que se produzca una clasificación errónea de cada lectura como portadora de un patógeno. En consecuencia, no se emite ninguna alerta y el método puede volver a la siguiente muestra.

[0158] A modo de ejemplo, las Figuras 4a y 4b ilustran dos escenarios en las que tres lecturas 410, 412 y 414 del mismo genoma 420 se clasifican como patógenas. De conformidad con el método de la Figura 3c, el genoma 420 se divide en una pluralidad de segmentos 400 (en este ejemplo existen 11 segmentos, pero conviene señalar que esto es meramente indicativo). Tal como se muestra en la Figura 4a, las tres lecturas se encuentran todas dentro del mismo segmento 400. Por el contrario, en la Figura 4b, cada una de las tres lecturas se encuentra en un segmento distinto y están bien distribuidas por todo el genoma. Por lo tanto, es más probable que el resultado de la Figura 4b sea una identificación correcta del patógeno dentro de la muestra global. Utilizando el método de la Figura 3c, la muestra de la Figura 4a no se clasificará como portadora de un patógeno.

[0159] La Figura 3d ilustra un proceso en donde se tiene en cuenta la unicidad de cada lectura clasificada como patógena. Una coincidencia única es aquella en donde la lectura solamente coincide con una secuencia objetivo dentro de la especie patógena y no presenta una buena coincidencia con secuencias similares dentro de otras especies. Una coincidencia con una parte del genoma que sea una secuencia única puede considerarse una clasificación más fiable como patógeno real que una coincidencia con una parte del genoma que presente similitudes con otras especies del mismo género.

[0160] Las primeras etapas de la Figura 3d coinciden con las de la Figura 3a. Dicho de otro modo, en una primera etapa S300 se introducen varias lecturas de secuencia procedentes de una muestra. Cada una de estas lecturas de secuencia se clasifica como patógena o no patógena (etapa S302) utilizando el método descrito en la Figura 1. Cuando se identifica al menos un patógeno en la etapa S304, se lleva a cabo la siguiente secuencia de etapas para cada patógeno que se haya identificado.

[0161] En la etapa S606, se determina el número de lecturas que se han clasificado como patógenas y que son únicas. En la etapa S608, se determina el número de lecturas que se han clasificado como patógenas y que no son únicas. El algoritmo del «ancestro común más reciente» (Lowest Common Ancestor), que se utiliza en el proceso descrito en la Figura 1, ya tiene en cuenta las «coincidencias válidas» a la hora de asignar lecturas a los taxones. Por consiguiente, cuando se utiliza la misma medida de «calidad» para las etapas S606 y S608, todas las lecturas se considerarán coincidencias «únicas». Por lo tanto, al determinar el número de lecturas patógenas únicas y no únicas en las etapas S606 y S608, es necesario flexibilizar los criterios utilizados en la Figura 1 para determinar el número de coincidencias dentro de cada conjunto de coincidencias. Por ejemplo, el umbral de puntuación puede reducirse (p. ej., del 90 % al 80 %) o puede aumentarse el número de coincidencias a tener en cuenta (p. ej., de 20 a 30).

[0162] En la etapa S610, se calcula la relación de unicidad de la siguiente manera:

[0164]

[0166] en donde nes el número de lecturas patógenas únicas y n<n>es el número de lecturas patógenas no únicas. La relación de unicidad puede compararse con un umbral de unicidad en la etapa S612 y puede emitirse una alerta en la etapa S614 cuando la relación de unicidad sea mayor o igual que el umbral de unicidad. El umbral de unicidad es configurable para proporcionar la precisión deseada del método.

[0167] Como alternativa, o además, de utilizar la relación de unicidad, cuando se identifica una lectura como única, la puntuación de confianza de dicha lectura concreta puede incrementarse en una cantidad fija. Por ejemplo, en el ejemplo anterior, en donde los resultados se puntúan con un dos o un uno, respectivamente, la puntuación de confianza puede incrementarse en tres cuando una lectura patógena es única. La lectura puede identificarse como única determinando qué secuencias objetivo dentro del genoma de un patógeno son únicas. Lo que antecede podría realizarse al crear las bases de datos que se utilizan en las fases de clasificación. A modo de ejemplo, la unicidad de cada secuencia objetivo puede determinarse utilizando una herramienta denominada «Genomic Origin Through Taxonomic Challenge» (GOTTCHA), descrita, p.ej., en «Accurate read-based metagenome characterisation using a hierarchical suite of unique signatures» (Caracterización precisa del metagenoma basada en lecturas mediante un conjunto jerárquico de firmas únicas), de Freitas et al., publicado en nucleic Acids Research, volumen 43, número 10, 26 de mayo de 2015. La herramienta GOTTCHA introduce la idea de identificar partes únicas de un genoma en diferentes niveles taxonómicos. Por ejemplo, puede comparar todos los genomas de un género específico e identificar las partes únicas de cada genoma.

[0168] Los métodos descritos en las Figuras 3a a 3d pueden utilizarse individualmente para clasificar una muestra o pueden combinarse, tal y como se muestra en la Figura 3e, para mejorar aún más la precisión de la clasificación. Las primeras etapas de la Figura 3e coinciden con los de la Figura 3a. Dicho de otro modo, en una primera etapa S300 se introducen varias lecturas de secuencia procedentes de una muestra. Cada una de las múltiples lecturas de secuencia se clasifica como patógena o no patógena (etapa S302) utilizando el método descrito en la Figura 1. Cuando se identifica al menos un patógeno en la etapa S304, se lleva a cabo la siguiente secuencia de etapas para cada patógeno que se haya identificado.

[0169] En la etapa S706 se determina el número de lecturas nclasificadas como patógenas para cada patógeno concreto, y en la etapa S708 se calcula la puntuación de confianza media por lectura s<mean>. Ambas etapas pueden llevarse a cabo tal y como se describe en la Figura 3a. A continuación, en la etapa S710 se calcula la relación patógenopariente<(>R<p),>tal y como se describe en la Figura 3b. En la etapa S712, se calcula el valor de dispersión genómica s<g>tal y como se describe en la Figura 3c. En la etapa S714, se calcula la relación entre lecturas únicas y no únicas Utal y tal como se describe en la Figura 3d. Conviene señalar que, aunque las etapas S706 a S714 se muestran secuencialmente en la Figura 3e, pueden llevarse a cabo en cualquier orden y pueden realizarse de forma simultánea o secuencial.

[0170] A continuación, en la etapa S716 se puede calcular una puntuación global para el patógeno concreto Scomo suma ponderada de las relaciones y puntuaciones determinadas previamente para dicho patógeno. Por ejemplo, la puntuación Sse puede calcular de la siguiente manera:

[0172] en donde nes el número de lecturas del patógeno, s<mean>es la puntuación media por lectura del patógeno, Res la relación patógeno-pariente, s<g>es el valor de dispersión genómica, Ues la relación entre los resultados únicos y el total de resultados, y α,β,δ son constantes utilizadas para ponderar el impacto de la relación patógeno-pariente, el valor de dispersión genómica y la relación entre los resultados únicos y el total de resultados, respectivamente;α,β,δ pueden establecerse inicialmente en 1 (es decir, ponderación igualitaria), pero pueden configurarse según sea necesario para mejorar la precisión. Los términos ny S<mean>actúan como multiplicadores de la suma ponderada.

[0173] Una vez calculada la puntuación de un patógeno concreto, tal y como se ha indicado, el proceso puede volver a la etapa S304 para determinar si existe algún otro patógeno que haya sido identificado. A continuación, se repiten las etapas S706 a S716 para otro patógeno concreto, si lo hay. Este bucle se repite hasta que no haya más patógenos. A continuación, el proceso pasa a la etapa S718, en donde se obtiene una puntuación global de la muestra sumando todas las puntuaciones de los patógenos, es decir

[0175]

[0177] en donde Ses la puntuación de un patógeno concreto,qes el número de patógenos identificados en la muestra y S<s>es la puntuación global de la muestra.

[0178] A continuación, la puntuación global de la muestra puede compararse con un umbral de muestra en la etapa S720 y, si la puntuación de la muestra es superior o igual a dicho umbral, puede emitirse una alerta (etapa S722). El umbral de puntuación de la muestra puede configurarse para mejorar la precisión. Si no se detecta ningún patógeno en la muestra, el proceso puede volver a la siguiente muestra de entrada. El proceso funciona en tiempo real, de modo que se puede supervisar constantemente un entorno para detectar la presencia de patógenos.

[0179] A modo de ejemplo de cómo se puede aplicar el método de la Figura 3e, consideremos dos escenarios en los que se ha procesado una muestra utilizando el método de la Figura 1 y se han clasificado tres lecturas de secuencia de entrada, que posteriormente se han confirmado como patógenos (es decir, clasificadas como patógenos tanto por el primer como por el segundo método de clasificación, por ejemplo, BLAST y MetaMaps). En estos escenarios, nes 3, s<media>es 4, no se han identificado otros patógenos. La tabla siguiente compara las puntuaciones de dos escenarios diferentes:

[0180] Primer escenario

[0183]

[0185] Segundo escenario

[0188]

[0190] A juzgar por las puntuaciones globales, es poco probable que el segundo escenario se clasifique como una muestra que contenga un patógeno. Tal y como se ha descrito con anterioridad, los términos ny s<mean>actúan como multiplicadores; por lo tanto, si el número de lecturas clasificadas como patógenos en el segundo escenario es significativamente superior a tres, la puntuación global será más alta y, por lo tanto, será más probable que la muestra se clasifique como portadora de un patógeno. Por ejemplo, la puntuación global de la muestra en el segundo escenario puede ser similar a la puntuación global de la muestra en el primer escenario cuando se clasifican como patógenos cuatro veces más lecturas.

[0191] El método descrito con anterioridad se probó en muestras ambientales reales (muestras de aire) a las que se habían añadido lecturas de patógenos simuladas. Se crearon conjuntos de lecturas simuladas para 23 patógenos. Todas las lecturas de patógenos tenían una longitud superior a 1 kb, con un tamaño medio de lectura de aproximadamente 2,5 kb. Para cada patógeno, añadimos 500 lecturas a 15 muestras de aire reales recogidas en Londres durante 2019. Cada muestra de aire contaba con 52.000 lecturas en total. Estas lecturas se procesaron a través del flujo de trabajo completo de Airscreen, incluyendo el filtrado de calidad, la búsqueda BLAST y la confirmación de patógenos putativos utilizando las bases de datos a nivel de género de MetaMaps. Aunque añadimos 500 lecturas para cada patógeno, cada lectura se analiza por separado. Dicho de otro modo, estamos analizando lecturas individuales en lugar de la composición de la comunidad.

[0192] En total, se completaron 345 ejecuciones simuladas del proceso de análisis (pipeline) Airscreen (es decir, 23 patógenos × 15 muestras). La tabla siguiente ofrece los resultados medios por patógeno (es decir, la media de 15 ejecuciones) y muestra el porcentaje de verdaderos positivos (TP), falsos negativos (FN), verdaderos negativos (TN) y falsos positivos (FP):

[0194]

[0196] Al analizar una muestra ambiental para determinar si existen algún patógeno presente, es fundamental no identificar erróneamente la presencia de un patógeno en la muestra y, por lo tanto, provocar una falsa alarma. Dicho de otro modo, la tasa de verdaderos negativos debe ser extremadamente alta (y la de falsos positivos, muy baja). También es importante que, si existen un patógeno presente, este se detecte con un alto nivel de precisión. Tal como se muestra en la tabla anterior, la tasa de verdaderos negativos es muy alta (99,9992 %) y la de falsos positivos, correspondientemente baja (0,0008 %). La tasa de verdaderos positivos es elevada (p.ej., superior al 72 %) para todos los patógenos. Las razones de la mayor tasa de «falsos negativos» pueden explicarse por el hecho de que MetaMaps solamente puede confirmar la asignación a nivel de género o superior, en lugar de confirmar la asignación a nivel de especie, o, en algunos casos, porque MetaMaps no pudo proporcionar una asignación. Si se analiza con más detalle la baja tasa de «falsos positivos», estos se debieron a 6 lecturas de un total de 780.000 y se detallan en la tabla siguiente:

[0199]

[0200]

[0203] Al analizar las especies, es muy posible que se trate, de hecho, de falsos positivos, ya que las coincidencias son buenas (más del 79-95 % de identidad en secuencias largas) y cada una de estas especies puede encontrarse razonablemente en muestras de aerosoles ambientales. Además, tal y como se ha descrito con anterioridad, existe la opción de exigir que se detecte un número mínimo de secuencias antes de declarar que se ha detectado un patógeno. En este ejemplo, ninguna de las series habría alcanzado el umbral de 3-5 lecturas que cabría esperar dado el nivel de sensibilidad previsto. Por lo tanto, los resultados del ejemplo muestran que el método proporciona el resultado preciso necesario para una muestra ambiental que contenga una pequeña cantidad de patógeno.

[0204] La Figura 5 muestra de manera esquemática un sistema 10 para poner en práctica los métodos descritos con anterioridad. El sistema 10 está conectado a una primera base de datos 50, una lista de patógenos 52, una segunda base de datos 54 y una base de datos de factores de virulencia 56. Conviene señalar que los datos de cada tipo de base de datos pueden distribuirse entre más de un dispositivo de almacenamiento y pueden almacenarse en cualquier dispositivo de almacenamiento adecuado, incluida la nube. Las bases de datos pueden ser remotas (es decir, estar en una ubicación diferente) o pueden ser locales para el sistema. El sistema 10 también está conectado a un muestreador 60 que extrae una muestra del aire tal y como se ha descrito con anterioridad. El muestreador 60 también puede comprender un secuenciador 62 para realizar la secuenciación de ácidos nucleicos (p.ej., secuenciación shotgun del genoma completo) en la muestra extraída. Conviene señalar que el muestreador 60 y el secuenciador 62 también pueden ser dispositivos independientes.

[0206] La primera base de datos 50 comprende los datos utilizados para la etapa de comparación en la fase de clasificación (S106 de la Figura 1). La primera base de datos 50 puede ser la base de datos de nucleótidos (nt) publicada por el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) o cualquier otra base de datos adecuada que contenga secuencias de ácido nucleico de todos los dominios (es decir, que incluya secuencias tanto de patógenos como de no patógenos). De manera alternativa, la primera base de datos 50 puede comprender únicamente dominios seleccionados, p.ej., bacterias, hongos y/o virus (tanto patógenos como no patógenos), que puedan compararse con las lecturas de secuencia de la muestra. Por ejemplo, la base de datos de nt del NCBI puede filtrarse según la identificación taxonómica (ID) para crear una base de datos filtrada 50 que contenga únicamente secuencias de ácido nucleico con identificaciones taxonómicas de bacterias, hongos o virus. Dicha base de datos filtrada se adapta mejor al proceso propuesto y, al realizar la búsqueda en una base de datos de tamaño reducido, se reducirá el tiempo total de búsqueda (quizás en más de un 50 %).

[0208] La lista de patógenos 52 es una relación de taxones de patógenos que se utiliza como parte del proceso de confirmación de que se ha identificado un patógeno. Un patógeno es cualquier sustancia capaz de provocar una enfermedad, y su capacidad para hacerlo se denomina patogenicidad. En este método, se pretende identificar patógenos bacterianos, fúngicos y/o víricos, por lo que la lista de patógenos es una relación de taxones de patógenos bacterianos, fúngicos y víricos.

[0210] La segunda base de datos 54 contiene los datos utilizados para la etapa de comparación en la fase de confirmación (S116 de la Figura 1). La segunda base de datos 54 suele ser más pequeña que la primera base de datos 50 y se selecciona en función del taxón del patógeno al que corresponde la lectura de la secuencia de entrada potencialmente patógena. Por ejemplo, la segunda base de datos 54 puede comprender una pluralidad (o conjunto) de bases de datos a nivel de género para patógenos bacterianos, fúngicos y víricos y sus parientes. De manera alternativa, la segunda base de datos 54 puede consistir en una pluralidad de bases de datos a nivel de familia o a nivel de especie. Cada base de datos puede construirse utilizando el conjunto completo de genomas RefSeq. Por ejemplo, para una base de datos a nivel de género y para un género determinado, se identifica cada genoma del conjunto de genomas RefSeq (p.ej., utilizando el nombre del archivo); a continuación, cada secuencia identificada puede marcarse y añadirse a un archivo (p.ej., un archivo FASTA) para el nivel de género. Algunas referencias pueden eliminarse por motivos de eficiencia (p. ej., si son similares a otras referencias) o de calidad (p. ej., si se sabe que son referencias de mala calidad). Por ejemplo, para la base de datos de Bacillus, se identifican todos los genomas que comienzan por «Bacillus_» y cada secuencia se añade al archivo de la base de datos de Bacillus. Se puede utilizar un archivo FASTA como entrada para la herramienta estándar de creación de bases de datos de MetaMaps. Se puede seleccionar una de las bases de datos a nivel de género como segunda base de datos para la etapa de comparación.

[0212] La base de datos de factores de virulencia (VFDB) 56 contiene los datos utilizados para la etapa de comparación opcional en la vía paralela (S206 de la Figura 1). La base de datos de factores de virulencia 56 se utiliza para buscar coincidencias con genes de los que se sabe que confieren virulencia. La virulencia proporciona una medida cuantitativa de la patogenicidad o de la probabilidad de causar enfermedad. Los factores de virulencia se refieren a las propiedades (es decir, los productos génicos) que permiten a un microorganismo establecerse sobre o dentro de un huésped de una especie concreta y potenciar su capacidad para causar enfermedad. Los factores de virulencia incluyen toxinas bacterianas, proteínas de la superficie celular que median la adhesión bacteriana, carbohidratos y proteínas de la superficie celular que protegen a la bacteria, y enzimas hidrolíticas que pueden contribuir a la patogenicidad de la bacteria. Se puede utilizar cualquier base de datos de factores de virulencia adecuada, como la descrita en «VFDB2019: a comparative pathogenomic platform with an interactive web interface» (VFDB2019: una plataforma de patogenómica comparativa con una interfaz web interactiva), de Liu et al., publicada en nucleic Acids Res.47 (D1): D687-D692, y que se puede descargar desdewww.mgc.ac.cn/VFs.

[0213] En la Figura 5 se muestran algunos de los detalles internos del sistema 10. Existen componentes estándar independientemente de la solución de hardware que se ponga en práctica, entre los que se incluyen, p.ej., una pantalla 20, un procesador 30, una memoria 40 y una interfaz 42 para conectarse con las bases de datos 50, 54 y 56. La pantalla puede incluir una pantalla táctil 22 o puede ser cualquier otra pantalla adecuada en donde se pueda mostrar información a un usuario 70. Conviene señalar que puede haber otros componentes estándar que se han omitido para mayor claridad.

[0215] El procesador 30 puede procesar los datos de las bases de datos de cualquier forma adecuada. Tal y como se ilustra, el procesamiento específico puede llevarse a cabo en módulos dedicados, p.ej., un módulo de filtrado 32, al menos un módulo de comparación 34 y un módulo de toma de decisiones 36. Los módulos de comparación 34 también pueden denominarse módulos de clasificación, ya que realizan las comparaciones con las bases de datos para clasificar la muestra (más concretamente, cada lectura de secuencia de muestra individual). A modo meramente ilustrativo, el módulo o módulos de comparación pueden utilizarse, p.ej., para las etapas S106, S116 y S206 de la Figura 1. El módulo de toma de decisiones 36 puede utilizarse para la etapa de determinación S216 de la Figura 1. El módulo de filtrado 32 puede utilizarse para la etapa de filtrado S102 de la Figura 1.

[0217] Los términos como «componente», «módulo», «procesador» o «unidad» utilizados en el presente documento pueden referirse, entre otros, a un dispositivo de hardware, tales como circuitos en forma de componentes discretos o integrados, unidades de procesamiento gráfico (GPU), una matriz de puertas programables en campo (FPGA) o un circuito integrado de aplicación específica (ASIC), que realiza determinadas tareas o proporciona la funcionalidad asociada. En algunas formas de realización, los elementos descritos pueden estar configurados para residir en un medio de almacenamiento tangible, persistente y direccionable, y pueden estar configurados para ejecutarse en uno o más procesadores. Estos elementos funcionales pueden incluir, en algunas formas de realización, a modo de ejemplo, componentes, tales como componentes de software, componentes de software orientados a objetos, componentes de clase y componentes de tarea, procesos, funciones, atributos, procedimientos, subrutinas, segmentos de código de programa, controladores, firmware, microcódigo, circuitos, datos, bases de datos, estructuras de datos, tablas, matrices y variables. Aunque las formas de realización a modo de ejemplo se han descrito con referencia a los componentes, módulos y unidades aquí descritos, dichos elementos funcionales pueden combinarse en un número menor de elementos o separarse en elementos adicionales.

[0219] Las Figuras 6a y 6b ilustran un método alternativo para crear una base de datos a nivel de género que podría incluirse en la segunda base de datos. En una primera etapa, se calcula la identidad media de nucleótidos (ANI) entre una secuencia de referencia (p.ej.,Bacillus anthracis) y todas las demás secuencias de referencia del mismo género (p.ej., el géneroBacillus). La ANI puede calcularse utilizando cualquier método adecuado. A modo meramente ilustrativo, la puntuación ANI puede calcularse tal y como se describe en «Genomics and taxonomy in diagnostics for food security: soft-rotting enterobacterial plant pathogens» (Genómica y taxonomía en el diagnóstico para la seguridad alimentaria: patógenos vegetales enterobacterianos causantes de la pudrición blanda), de Pritchard et al., publicado en el Journal of the Royal Society of Chemistry en 2015. La Figura 6a representa gráficamente el número (es decir, el recuento) de secuencias que tienen la misma puntuación ANI. Tal como se muestra en la Figura 6a, existen un grupo de secuencias con puntuaciones ANI entre 0,825 y 0,86. La Figura 6b ajusta una distribución al histograma de la Figura 6b.

[0221] En una segunda etapa, se conservan todas las referencias cuya puntuación ANI se encuentre dentro de un porcentaje definido (o umbral) con respecto a la referencia del patógeno. Dicho de otro modo, se conservan todas las referencias que cumplan los criterios de puntuación. El porcentaje definido puede ser establecido por el usuario y puede basarse en la distribución de las puntuaciones ANI. Por ejemplo, utilizando la distribución de la Figura 6b, el porcentaje definido (X %) puede fijarse en el 88 % y el 97 %, representando cada uno de estos porcentajes una cola de uno de los dos picos de la Figura 6b.

[0223] En una tercera etapa, solamente se conserva una parte de las referencias que no cumplen los criterios de puntuación, con el fin de reducir el tamaño total de la base de datos a nivel de género. De este modo, el número de referencias por debajo del umbral se reduce conservando únicamente una de cada número definido de referencias (es decir, 1 de cada Y). Por ejemplo, el número definido puede ser 2, 5, 10 o 20 y, por lo tanto, la proporción que se conserva puede ser del 50 %, 20 %, 10 % o 5 %. La tabla siguiente muestra el número de referencias que aparecen en la base de datos a nivel de género utilizando los porcentajes de umbral (88 % y 97 %) y los números definidos (2, 5, 10 y 20):

[0225]

[0228] La Figura 7a muestra los resultados obtenidos al utilizar las bases de datos de nivel de género de tamaño reducido (1 de 2, 1 de 10 y 1 de 20) que se muestran en la tabla anterior para la clasificaciónde Bacillus anthracis. Tal como se muestra, el 100 % de las 10.000 lecturas se clasificaron correctamente comoBacillus anthracispara cada una de las bases de datos, excepto para el umbral del 88 % y la cantidad definida de 5 (es decir, la base de datos BA_88_1_in_5). La Figura 7b muestra los resultados de la clasificación de la bacteria no patógenaBacillus thuringiensisutilizando la misma base de datos de Bacillus que en la Figura 7a.

[0230] La tabla siguiente muestra indicaciones de velocidad relativa utilizando la base de datos de nivel de género de tamaño reducido. Los tiempos son meramente ilustrativos, ya que se espera que el hardware definitivo en donde se lleve a cabo el proceso tenga unas especificaciones superiores a las del equipo de prueba. Sin embargo, la tabla siguiente muestra que la base de datos del 97 %, 1 de cada 20, ofrece un rendimiento idéntico (es decir, todas las lecturas identificadas correctamente tanto paraBacillus anthraciscomo paraBacillus thuringiensis), pero solamente tarda el 20 % del tiempo en procesar los resultados:

[0232]

[0235] En el presente documento se han descrito diversas combinaciones de características opcionales, y se comprenderá que las características descritas pueden combinarse de cualquier forma adecuada. En particular, las características de cualquier ejemplo de forma de realización pueden combinarse con las características de cualquier otra forma de realización, según proceda, salvo en los casos en que dichas combinaciones sean mutuamente excluyentes. A lo largo de la presente memoria, el término «que comprende» o «comprende» significa que incluye los componentes especificados, pero sin excluir la presencia de otros.

[0237] Se remite la atención a todos los escritos y documentos que se han presentado simultáneamente con esta memoria descriptiva o con anterioridad a ella en relación con esta solicitud y que están a disposición del público para su inspección junto con esta memoria descriptiva.

[0239] Todas las características descritas en la presente memoria (incluyendo las reivindicaciones, el resumen y los dibujos que la acompañan), y/o todas las etapas de cualquier método o proceso así descrito, pueden combinarse de cualquier forma, salvo aquellas combinaciones en las que al menos algunas de dichas características y/o etapas sean mutuamente excluyentes. Cada característica descrita en la presente memoria (incluidas las reivindicaciones, el resumen y los dibujos adjuntos) puede sustituirse por características alternativas que cumplan el mismo propósito, o uno equivalente o similar, salvo que se indique expresamente lo contrario. Por lo tanto, salvo que se indique expresamente lo contrario, cada característica descrita es solamente un ejemplo de una serie genérica de características equivalentes o similares.

[0241] La invención no se limita a los detalles de las formas de realización anteriores.

[0242] Lista de referencias citadas

[0243] «Optimized DNA extraction and metagenomic sequencing of airborne microbial communities» (Extracción optimizada de ADN y secuenciación metagenómica de comunidades microbianas presentes en el aire), de Jiang et al., publicado en *Nature Protocols* 10, 768-799 (2015).

[0244] «Longitudinal survey of microbiome associated with particular matter in a megacity» (Estudio longitudinal del microbioma asociado a partículas en suspensión en una megaciudad), de Qin et al., publicado en Genome Biology 21, número de artículo: 55 (2020) «Characterization of the public transit air microbiome and resistome reveals geographical specificity» (La caracterización del microbioma y el resistoma del aire en el transporte público revela especificidad geográfica), de Leung et al., publicado en Microbiome 9, número de artículo: 112 (2021).

[0245] «Basic Local Alignment Search Tool» (Herramienta básica de búsqueda de alineaciones locales), de Altschul et al., publicado en Journal of Molecular Biology 1009, 5 de octubre; 215(3):403-10 «Improved metagenomic analysis with Kraken 2» (Análisis metagenómico mejorado con Kraken 2), de Wood et al., en Genome Biol, 2019; 20(1): 257 «BLAST: at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tolos» (BLAST: en el núcleo de un potente y diverso conjunto de herramientas de análisis de secuencias), de McGinn is et al., publicado en nucleic Acids Research, volumen 32, número supl_2, 1 de julio de 2004, páginas W20-W25

[0246] «MetaMaps - Strain-level metagenomic assignment and compositional estimation for long reads» (MetaMaps: asignación metagenómica a nivel de cepa y estimación de la composición para lecturas largas), de Dilthey et al., publicado en *Nature Communications*, doi: 10.1038/s41467-019-10934-2.

[0247] «Accurate read-based metagenome characterisation using a hierarchical suite of unique signatures» (Caracterización precisa del metagenoma basada en lecturas mediante un conjunto jerárquico de firmas únicas), de Freitas et al., publicado en nucleic Acids Research, volumen 43, número 10, 26 de mayo de 2015.

[0248] «VFDB2019: a comparative pathogenomic platform with an interactive web interface» (VFDB2019: una plataforma patogenómica comparativa con una interfaz web interactiva), de Liu et al., publicado en nucleic Acids Res.47 (D1): D687-D692.

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Método informático en tiempo real para detectar un patógeno en una muestra, comprendiendo el método: introducir una pluralidad de lecturas de secuencia obtenidas a partir de la muestra mediante secuenciación de ácido nucleico; y

para cada lectura de secuencia de entrada de entre la pluralidad de lecturas de secuencia:

comparar, mediante un primer algoritmo de clasificación, la lectura de secuencia de entrada con una pluralidad de secuencias objetivo en una primera base de datos, en donde la primera base de datos comprende secuencias de ácidos nucleicos de patógenos;

identificar, utilizando el primer algoritmo de clasificación, un conjunto de coincidencias para la lectura de secuencia de entrada, en donde cada coincidencia es una secuencia objetivo que coincide con la lectura de secuencia de entrada;

asignar, utilizando el conjunto de coincidencias, la lectura de secuencia de entrada a un taxón; y

clasificar la lectura de secuencia de entrada como potencialmente patógena cuando el taxón al que se asigna la lectura de secuencia de entrada corresponde a un taxón patógeno;

y cuando la lectura de secuencia de entrada se clasifica como potencialmente patógena:

comparar, utilizando un segundo algoritmo de clasificación distinto del primer algoritmo de clasificación, la lectura de secuencia de entrada potencialmente patógena con una pluralidad de secuencias objetivo en una segunda base de datos, en donde la segunda base de datos se selecciona en función del taxón patógeno que corresponde al taxón al que se asigna la lectura de secuencia de entrada; y

confirmar la clasificación de la lectura de secuencia de entrada potencialmente patógena como patógena cuando dicha lectura de secuencia de entrada potencialmente patógena coincide con una o más secuencias objetivo de la segunda base de datos; en donde el método comprende, además

calcular una puntuación de confianza para cada lectura de secuencia de entrada, incrementando dicha puntuación en una primera cantidad fija cuando la lectura de secuencia de entrada se clasifica como potencialmente patógena, e incrementándola en una segunda cantidad fija cuando se confirma que cada lectura de secuencia de entrada clasificada como potencialmente patógena es patógena;

comparar la puntuación de confianza con un umbral de puntuación de confianza para determinar si cada lectura de la secuencia de entrada coincide con un patógeno; y

para cada patógeno que se identifique como coincidente con una lectura de la secuencia de entrada: determinar el número de lecturas de secuencias de entrada nque se determina que coinciden con el patógeno; calcular una puntuación de confianza del patógeno, asociada al patógeno a partir de cada puntuación de confianza de una lectura de secuencia de entrada para el patógeno;

dividir el genoma del patógeno identificado en varios segmentos;

recuento del número de lecturas de secuencias de entrada en cada segmento que se determina que coinciden con el patógeno,

calcular, utilizando el número contabilizado de lecturas de secuencias de entrada en cada segmento, un valor de dispersión genómica que indique la distribución de las lecturas de secuencias de entrada patógenas a lo largo del genoma del patógeno identificado; y

generar una puntuación global para el patógeno utilizando una suma ponderada de, al menos, la puntuación de confianza del patógeno y el valor de dispersión genómica.

2. El método según la reivindicación 1, en donde el primer algoritmo de clasificación se selecciona entre una herramienta de búsqueda de alineaciones locales de tipo iniciación y extensión(seed and extend) y una herramienta de coincidencia de k-mero, y en donde el segundo algoritmo de clasificación es un algoritmo de asignación metagenómica a nivel de cepa y de estimación de la composición, denominado MetaMaps.

3. El método según cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, en donde la asignación de la lectura de la secuencia de entrada a un taxón comprende:

comparar las rutas taxonómicas de cada resultado dentro del conjunto de resultados, y

seleccionar el ancestro común más reciente dentro de cada ruta taxonómica comparada como el taxón.

4. El método según cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, en donde la clasificación de la lectura de la secuencia de entrada como potencialmente patógena comprende, además, determinar si se cumplen criterios adicionales, y

en donde los criterios adicionales incluyen uno o varios de los siguientes: un valor de identidad que supera un umbral de identidad, un valor de cobertura de consulta que supera un umbral de cobertura de consulta y una lectura de secuencia de entrada que tiene una longitud mínima.

5. El método según cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, que comprende, además: determinar si la lectura de secuencia de entrada está asociada a un factor de virulencia e incrementar la puntuación de confianza en una tercera cantidad fija cuando se determina que la secuencia de entrada es virulenta en donde la tercera cantidad fija es menor que la primera y la segunda cantidad fija.

6. El método según cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, en donde la primera cantidad fija es igual a la segunda cantidad fija.

7. El método según cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, en donde se calcula una relación patógenopariente Rde la siguiente forma:

en donde nes el número de lecturas de secuencias de entrada que se ha determinado que coinciden con un patógeno concreto, n<g>es el número de lecturas de secuencias de entrada clasificadas en el mismo género que el patógeno concreto y m<g>es un multiplicador por género, y

la puntuación global se determina utilizando una suma ponderada que incluye la relación patógeno-pariente.

8. El método según cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, en donde el valor de dispersión genómica g<s>se calcula como:

en donde V<d>es una distancia de variación total que se calcula comparando la distribución del número de lecturas de secuencias de entrada contabilizadas en cada segmento con una distribución uniforme, a lo largo del patógeno, de las lecturas de secuencias de entrada que se han clasificado como patógenas.

9. El método según cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, que comprende, además

determinar el número de lecturas de secuencias de entrada nque se determina que coinciden con un patógeno concreto y que son únicas de dicho patógeno concreto;

determinar el número de lecturas de secuencias de entrada n<n>que se determina que coinciden con el patógeno concreto y que no son únicas de dicho patógeno;

calcular una relación de unicidad a partir de:

en donde nes el número de lecturas patógenas únicas y n<n>es el número de lecturas patógenas no únicas; y incluyendo la relación de unicidad en la puntuación global.

10. El método según cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, que comprende, además, para cada lectura de secuencia de entrada que se determine que coincide con un patógeno concreto:

determinar si la lectura de secuencia de entrada es única, y

cuando la lectura de secuencia de entrada sea única, incrementar la puntuación de confianza en una cuarta cantidad fija.

11. El método según cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, que comprende, además: determinar el número de lecturas de secuencias de entrada nque se determina que coinciden con un patógeno concreto y que son únicas para dicho patógeno concreto;

determinar el número de lecturas de secuencia de entrada n<n>que se ha determinado que coinciden con el patógeno concreto y el número de lecturas de secuencia de entrada que no son únicas de dicho patógeno concreto; calcular una relación patógeno-pariente utilizando el número de lecturas de secuencias de entrada nque coinciden con un patógeno concreto y el número de lecturas de secuencia de entrada n<g>que coinciden con el género de dicho patógeno;

calcular una relación de unicidad utilizando el número de lecturas patógenas únicas ny el número de lecturas patógenas no únicas n<n>; y

generar una puntuación global Spara el patógeno concreto utilizando una suma ponderada de la puntuación de confianza del patógeno, la relación patógeno-pariente, el valor de dispersión genómica y la relación de unicidad, en donde la suma ponderada se define como:

en donde nes el número de lecturas de la secuencia de entrada que se ha determinado que coinciden con un patógeno concreto, s<mean>es la puntuación de confianza del patógeno, Res la relación patógeno-pariente, S<g>es el valor de dispersión genómica, Ues la relación de unicidad y α,β,δ son constantes.

12. El método según cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, que comprende, además, la obtención de una puntuación global para la muestra a partir de

en donde Ses la puntuación para un patógeno concreto,qes el número de patógenos identificados en la muestra y S<s>es la puntuación global de la muestra.

13. El método según cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, en donde el patógeno que se detecta es un patógeno bacteriano, fúngico o viral y/o en donde la muestra es una muestra ambiental.

14. Un soporte de datos no transitorio que contiene código de control de procesador, el cual, cuando es ejecutado por un procesador, hace que este último lleve a cabo el método descrito según cualquiera de las reivindicaciones que anteceden.

15. Un sistema que comprende uno o más procesadores y una memoria, estando dichos uno o más procesadores configurados para ejecutar instrucciones en dicha memoria con el fin de hacer que el sistema lleve a cabo el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.