ES3032258B2 - Long mitochondrial non-coding RNAs as biomarkers of colorectal cancer - Google Patents

Long mitochondrial non-coding RNAs as biomarkers of colorectal cancer

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ES3032258B2 ES202430028A ES202430028A ES3032258B2 ES 3032258 B2 ES3032258 B2 ES 3032258B2 ES 202430028 A ES202430028 A ES 202430028A ES 202430028 A ES202430028 A ES 202430028A ES 3032258 B2 ES3032258 B2 ES 3032258B2
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Description

[0001] DESCRIPCIÓN[0001] DESCRIPTION

[0003] ARNs largos no codificantes mitocondriales como biomarcadores de cáncer colorrectal[0003] Mitochondrial long non-coding RNAs as biomarkers of colorectal cancer

[0004] Campo técnico[0004] Technical field

[0006] La presente invención pertenece al campo técnico de la medicina, en particular pertenece al campo de la oncología y la neurología y, más particularmente, se refiere a ARNs largos no codificantes útiles como marcador para la detección y/o seguimiento de tumores y enfermedad de Alzheimer, y como diana terapéutica para dichas patologías.[0006] The present invention belongs to the technical field of medicine, in particular to the field of oncology and neurology and, more particularly, relates to long non-coding RNAs useful as a marker for the detection and/or monitoring of tumors and Alzheimer's disease, and as a therapeutic target for these pathologies.

[0008] Antecedentes de la invención[0008] Background of the invention

[0010] El cáncer es la principal causa de muerte en el mundo, siendo el cáncer colorrectal el tercero más común, con una incidencia anual mundial de 1,9 millones y una mortalidad estimada de 935.000 casos anuales. La mayoría de los cánceres colorrectales tienen su origen en mutaciones esporádicas, aunque hay un pequeño grupo que tiene su origen en mutaciones hereditarias. Otro grupo de enfermedades con gran impacto en nuestra sociedad son las enfermedades neurodegenerativas. Esto se debe a que el incremento en la esperanza de vida de las sociedades occidentales se traduce en un aumento significativo de estas enfermedades.[0010] Cancer is the leading cause of death worldwide, with colorectal cancer being the third most common, having an annual global incidence of 1.9 million and an estimated mortality of 935,000 cases annually. Most colorectal cancers originate from sporadic mutations, although a small group arises from hereditary mutations. Another group of diseases with a significant impact on our society are neurodegenerative diseases. This is because the increase in life expectancy in Western societies has resulted in a significant rise in these diseases.

[0012] Un biomarcador es una molécula, organismo o secuencia de material genético, que puede utilizarse para medir la presencia o ausencia de una enfermedad, su progresión o su respuesta frente a un tratamiento. Para ser útil, un biomarcador debe ofrecer una alta sensibilidad, especificidad y seguridad (Zvirblyte y Mazutis (2022)Microfluidics for Cancer Biomarker Discovery, Research, and Clinical Application. Adv Exp Med Biol 1379:499-524). En el cáncer colorrectal, las alteraciones producidas por inestabilidad cromosómica (CIN), inestabilidad de microsatélites (MSI) o el fenotipo metilado de islas CpG (CIMP) producen cambios en el ADN, ARN, proteínas y/o metabolitos que pueden medirse tanto en el tumor, como en la sangre o en las heces y que se pueden usar como biomarcadores de diagnóstico o de progresión/pronóstico. Estos biomarcadores se pueden utilizar para predecir el resultado de una intervención quirúrgica o farmacológica o para tener información sobre la respuesta a un tratamiento.[0012] A biomarker is a molecule, organism, or sequence of genetic material that can be used to measure the presence or absence of a disease, its progression, or its response to treatment. To be useful, a biomarker must offer high sensitivity, specificity, and safety (Zvirblyte and Mazutis (2022) Microfluidics for Cancer Biomarker Discovery, Research, and Clinical Application. Adv Exp Med Biol 1379:499-524). In colorectal cancer, alterations caused by chromosomal instability (CIN), microsatellite instability (MSI), or the CpG island methylation phenotype (CIMP) produce changes in DNA, RNA, proteins, and/or metabolites that can be measured in the tumor, blood, or stool and can be used as diagnostic or progression/prognostic biomarkers. These biomarkers can be used to predict the outcome of a surgical or pharmacological intervention or to obtain information about the response to a treatment.

[0014] A pesar de que los biomarcadores ayudan a tener mejores resultados gracias al uso de tratamientos personalizados, en el cáncer y las enfermedades neurodegenerativas los biomarcadores disponibles son muy escasos. Por ejemplo, en el cáncer colorrectal se ha demostrado que en pacientes con MSI elevado, el tratamiento con 5-fluorouracil no es eficaz, pero el oxaliplatino surge efecto en este tipo de cáncer (Fekete y Gyorffy (2023)New Transcriptomic Biomarkers of 5-Fluorouracil Resistance. Int J Mol Sci 24(2):1508. También se ha comprobado que las mutaciones en RAS, KRAS o BRAF actúan como biomarcadores de respuesta al tratamiento, ya que los tumores con mutaciones en estos genes producen resistencia al tratamiento anti- receptor del factor de crecimiento epidérmico (anti-EGFR) con cetuximab (Malki et al. (2020)Molecular Mechanisms of Colon Cancer Progression and Metastasis: Recent Insights and Advancements. Int J Mol Sci 22(1):130). En el caso de las enfermedades neurodegenerativas, se han descrito biomarcadores a partir del líquido cefalorraquídeo, obtenidos mediante neuroimagen funcional y algunos biomarcadores sanguíneos, pero la mayor parte de ellos tienen un alto coste, son muy invasivos o presentan una aplicación clínica limitada. Por todo ello, hay una gran necesidad de encontrar biomarcadores con alta sensibilidad y especificidad que sirvan para identificar a los pacientes en las primeras fases de su dolencia.[0014] Although biomarkers help to achieve better results through the use of personalized treatments, in cancer and neurodegenerative diseases the available biomarkers are very scarce. For example, in colorectal cancer, it has been shown that in patients with high MSI, treatment with 5-fluorouracil is ineffective, but oxaliplatin is effective in this type of cancer (Fekete and Gyorffy (2023) New Transcriptomic Biomarkers of 5-Fluorouracil Resistance. Int J Mol Sci 24(2):1508). Mutations in RAS, KRAS, or BRAF have also been shown to act as biomarkers of treatment response, since tumors with mutations in these genes produce resistance to anti-epidermal growth factor receptor (anti-EGFR) treatment with cetuximab (Malki et al. (2020) Molecular Mechanisms of Colon Cancer Progression and Metastasis: Recent Insights and Advancements. Int J Mol Sci 22(1):130). In the case of neurodegenerative diseases, biomarkers from cerebrospinal fluid, obtained through functional neuroimaging, have been described. While some blood biomarkers exist, most are expensive, highly invasive, or have limited clinical application. Therefore, there is a great need to find biomarkers with high sensitivity and specificity that can identify patients in the early stages of their illness.

[0016] Los distintos tipos de ARN, y especialmente los no codificantes, han atraído recientemente la atención como posibles biomarcadores, dado su alto número y grado de especialización. Por ejemplo, el miR-31-3p se ha propuesto como un biomarcador en pacientes de cáncer colorrectal sin mutación de KRAS sometidos al tratamiento con anti-EGFR. En estos pacientes, una baja expresión de miR-31-3p se correlaciona con una mayor supervivencia (Boisteau et al. (2022)MiR-31-3p do not predict anti-EGFR efficacy in first-line therapy of RAS wild-type metastatic right-sided colon cancer. Clin Res Hepatol Gastroenterol 46:101888). Entre estos ARNs, los ARNs largos no codificantes (lncRNAs de aquí en adelante) merecen una mención especial ya que regulan diferentes funciones celulares como la proliferación, la migración, la angiogénesis, la muerte celular y la metástasis, además de ser buenos candidatos a biomarcadores. Algunos ejemplos incluyen los lncRNAs ZEB1-AS1, FAM83H-AS1, LINC01296 y LINC01234, que se correlacionan con parámetros clinicopatológicos y la supervivencia de los pacientes con cáncer colorrectal (Qu et al. (2023)Prognostic and predictive value of a lncRNA signature in patients with stage II colon cancer. Sci Rep 13:1350).[0016] Different types of RNA, and especially non-coding RNAs, have recently attracted attention as potential biomarkers, given their large number and degree of specialization. For example, miR-31-3p has been proposed as a biomarker in KRAS-nonmutated colorectal cancer patients undergoing anti-EGFR therapy. In these patients, low miR-31-3p expression is correlated with improved survival (Boisteau et al. (2022) MiR-31-3p do not predict anti-EGFR efficacy in first-line therapy of RAS wild-type metastatic right-sided colon cancer. Clin Res Hepatol Gastroenterol 46:101888). Among these RNAs, long non-coding RNAs (lncRNAs from now on) deserve special mention because they regulate various cellular functions such as proliferation, migration, angiogenesis, cell death, and metastasis, and are also good candidates for biomarkers. Some examples include the lncRNAs ZEB1-AS1, FAM83H-AS1, LINC01296 and LINC01234, which correlate with clinicopathological parameters and survival in patients with colorectal cancer (Qu et al. (2023) Prognostic and predictive value of an lncRNA signature in patients with stage II colon cancer. Sci Rep 13:1350).

[0018] Los lncRNAs pueden ser producidos tanto en el núcleo celular como en las mitocondrias. Las mitocondrias son orgánulos críticos que intervienen en la proliferación tumoral, la supervivencia, la metástasis y la resistencia a fármacos. El genoma mitocondrial contiene cientos de ARNs no codificantes. Sin embargo, muy pocos son a los que se les ha encontrado una aplicación clínica eficaz.[0018] lncRNAs can be produced in both the cell nucleus and mitochondria. Mitochondria are critical organelles involved in tumor proliferation, survival, metastasis, and drug resistance. The mitochondrial genome contains hundreds of non-coding RNAs. However, very few have been found to have effective clinical applications.

[0020] Los autores de la presente invención han identificado el lncRNA MDL1AS como un excelente biomarcador de diagnóstico y pronóstico en pacientes de cáncer y de la enfermedad de Alzheimer, y como diana terapéutica. Además, han identificado el lncRNA MDL1 como biomarcador de pronóstico en pacientes de cáncer colorrectal.[0020] The inventors of the present invention have identified lncRNA MDL1AS as an excellent diagnostic and prognostic biomarker in cancer and Alzheimer's disease patients, and as a therapeutic target. Furthermore, they have identified lncRNA MDL1 as a prognostic biomarker in colorectal cancer patients.

[0022] Objeto de la invención[0022] Object of the invention

[0024] Con el fin de resolver los inconvenientes del estado de la técnica y, en concreto, la falta de biomarcadores fiables para determinar el diagnóstico y pronóstico de cáncer y de la enfermedad de Alzheimer (también referida como Alzheimer de aquí en adelante), se han caracterizado los lncRNAs mitocondriales MDL1AS y MDL1. Como se muestra en los Ejemplos, el nivel de expresión de MDL1AS correlaciona con la presencia/ausencia de cáncer o Alzheimer, y predice la supervivencia de los pacientes de cáncer colorrectal. Este poder predictivo de la supervivencia también lo tiene MDL1. Además, se han diseñado técnicas para cuantificar adecuadamente estos lncRNAs y para reducir significativamente su expresión en células. La reducción de la expresión de MDL1AS tiene utilidad terapéutica, ya que se ha demostrado que propicia una disminución en el metabolismo mitocondrial de las células tumorales y en la capacidad proliferativa de dichas células.[0024] In order to address the limitations of the prior art, and specifically the lack of reliable biomarkers for diagnosing and predicting the prognosis of cancer and Alzheimer's disease (also referred to as Alzheimer's hereafter), the mitochondrial lncRNAs MDL1AS and MDL1 have been characterized. As shown in the Examples, the expression level of MDL1AS correlates with the presence/absence of cancer or Alzheimer's disease and predicts survival in colorectal cancer patients. MDL1 also exhibits this predictive power for survival. Furthermore, techniques have been developed to accurately quantify these lncRNAs and to significantly reduce their expression in cells. Reducing MDL1AS expression has therapeutic applications, as it has been shown to decrease mitochondrial metabolism in tumor cells and their proliferative capacity.

[0026] Teniendo en cuenta lo anterior, la presente invención se refiere en unprimer aspectoa un métodoin vitropara el diagnóstico de cáncer o de Alzheimer en un sujeto, que comprende las siguientes etapas:[0026] Taking into account the foregoing, the present invention relates in a first aspect to an in vitro method for the diagnosis of cancer or Alzheimer's in a subject, comprising the following steps:

[0027] a) determinar el nivel de expresión del ARN largo no codificante MDL1AS en una muestra tomada de dicho sujeto;[0027] a) determine the expression level of the long non-coding RNA MDL1AS in a sample taken from said subject;

[0028] b) comparar el nivel de expresión determinado en la etapa a) con una referencia;[0028] b) compare the level of expression determined in step a) with a reference;

[0029] c) identificar al sujeto como que padece o es susceptible de padecer cáncer colorrectal, si el nivel de expresión de la muestra es inferior a la referencia, o[0029] c) identify the subject as having or being susceptible to having colorectal cancer, if the expression level of the sample is lower than the reference, or

[0030] identificar al sujeto como que padece o es susceptible de padecer cáncer de laringe, cáncer de mama o Alzheimer si el nivel de expresión de la muestra es superior a la referencia.[0030] Identify the subject as suffering from or being susceptible to laryngeal cancer, breast cancer, or Alzheimer's if the expression level of the sample is higher than the reference.

[0032] Unsegundo aspectode la presente invención se refiere a un métodoin vitropara el pronóstico de la supervivencia de un sujeto que padece cáncer colorrectal que comprende las siguientes etapas:[0032] A second aspect of the present invention relates to an in vitro method for predicting the survival of a subject suffering from colorectal cancer, comprising the following steps:

[0033] a) determinar el nivel de expresión de lncRNA MDL1AS y/o lncRNA MDL1 en una muestra tomada de dicho sujeto;[0033] a) determine the expression level of lncRNA MDL1AS and/or lncRNA MDL1 in a sample taken from said subject;

[0034] b) comparar el nivel de expresión determinado en la etapa a) con una referencia; donde un nivel de expresión igual o superior a dicha referencia es indicativo de un pronóstico positivo y un nivel de expresión inferior a dicha referencia es indicativo de un pronóstico negativo.[0034] b) compare the expression level determined in step a) with a reference; where an expression level equal to or higher than said reference is indicative of a positive prognosis and an expression level lower than said reference is indicative of a negative prognosis.

[0036] Untercer aspectode la presente invención se refiere a un método para evaluar la respuesta a un tratamiento de un sujeto con cáncer colorrectal que comprende determinar la expresión de lncRNA MDL1AS y/o lncRNA MDL1 en una muestra tomada de dicho sujeto antes y después del tratamiento, donde un aumento en el nivel de expresión de lncRNA MDL1AS y/o de lncRNA MDL1 en la muestra obtenida después del tratamiento es indicativo de buena respuesta al tratamiento.[0036] A third aspect of the present invention relates to a method for evaluating the response to treatment of a subject with colorectal cancer comprising determining the expression of lncRNA MDL1AS and/or lncRNA MDL1 in a sample taken from said subject before and after treatment, wherein an increase in the level of expression of lncRNA MDL1AS and/or lncRNA MDL1 in the sample obtained after treatment is indicative of a good response to treatment.

[0038] Uncuarto aspectode la presente invención se refiere a un kit para llevar a cabo el método según el primer aspecto de la invención, que comprende medios para determinar el nivel de expresión de lncRNA MDL1AS, y se refiere también a un kit para llevar a cabo el método según el segundo y tercer aspecto de la invención que comprende medios para determinar el nivel de expresión de lncRNA MDL1AS y/o lncRNA MDL1.[0038] A fourth aspect of the present invention relates to a kit for carrying out the method according to the first aspect of the invention, comprising means for determining the expression level of lncRNA MDL1AS, and also relates to a kit for carrying out the method according to the second and third aspects of the invention comprising means for determining the expression level of lncRNA MDL1AS and/or lncRNA MDL1.

[0040] Unquinto aspectode la presente invención se refiere al uso de un kit según el cuarto aspecto de la invención para llevar a cabo el método de uno cualquiera de los aspectos primero, segundo o tercero de la invención, según corresponda.[0040] A fifth aspect of the present invention relates to the use of a kit according to the fourth aspect of the invention to carry out the method of any one of the first, second, or third aspects of the invention, as appropriate.

[0042] Unsexto aspectode la presente invención se refiere al uso del nivel de expresión del lncRNA MDL1AS como marcador para el diagnósticoin vitrode cáncer colorrectal, cáncer de laringe, cáncer de mama o Alzheimer. Asimismo, el sexto aspecto de la invención se refiere al uso del nivel de expresión del lncRNA MDL1AS y/o del lncRNA MDL1 como marcador para el pronósticoin vitrode cáncer colorrectal.[0042] A sixth aspect of the present invention relates to the use of the expression level of lncRNA MDL1AS as a marker for the in vitro diagnosis of colorectal cancer, laryngeal cancer, breast cancer, or Alzheimer's disease. Likewise, the sixth aspect of the invention relates to the use of the expression level of lncRNA MDL1AS and/or lncRNA MDL1 as a marker for the in vitro prognosis of colorectal cancer.

[0044] Unséptimo aspectode la presente invención se refiere a un inhibidor de la expresión del lncRNA MDL1AS seleccionado del grupo formado por DsiRNA, shRNA, siRNA, miRNA, CRISPR, oligómero antisentido, oligonucleótido gápmero, TALEN, nucleasa con dedos de Zinc y combinaciones de los mismos.[0044] A seventh aspect of the present invention relates to an inhibitor of the expression of lncRNA MDL1AS selected from the group consisting of DsiRNA, shRNA, siRNA, miRNA, CRISPR, antisense oligomer, gapmer oligonucleotide, TALEN, zinc finger nuclease and combinations thereof.

[0046] Unoctavo aspectode la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un inhibidor según el séptimo aspecto de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.[0046] An eighth aspect of the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising an inhibitor according to the seventh aspect of the invention and a pharmaceutically acceptable vehicle.

[0047] Unnoveno aspectode la presente invención se refiere a un inhibidor de la expresión del ARN largo no codificante MDL1AS para su uso como medicamento.[0047] A ninth aspect of the present invention relates to an inhibitor of the expression of the long non-coding RNA MDL1AS for use as a drug.

[0049] Undécimo aspectode la presente invención se refiere a un inhibidor de la expresión del ARN largo no codificante MDL1AS para su uso en el tratamiento de un cáncer o de la enfermedad de Alzheimer.[0049] Eleventh aspect of the present invention relates to an inhibitor of the expression of the long non-coding RNA MDL1AS for use in the treatment of cancer or Alzheimer's disease.

[0051] Otros objetos, características, ventajas y aspectos de la presente solicitud serán evidentes para el experto en la materia a partir de la descripción y las reivindicaciones adjuntas.[0051] Other objects, features, advantages and aspects of the present application will be evident to a person skilled in the art from the description and the attached claims.

[0053] Breve descripción de las figuras[0053] Brief description of the figures

[0055] LaFigura 1muestra un esquema de la estructura del genoma mitocondrial tal como aparece en la base de datos del genoma humano actual, como un ADN lineal interrumpido en el codón de iniciación de la replicación (A). En (B) se muestra la nueva representación del genoma mitocondrial necesaria para cuantificar correctamente la expresión de MDL1 y MDL1AS. Los genes MDL1 y MDL1AS se representan con una flecha negra rodeada de una elipse.[0055] Figure 1 shows a schematic representation of the mitochondrial genome structure as it appears in the current human genome database, as linear DNA interrupted at the replication start codon (A). (B) shows the new representation of the mitochondrial genome required to accurately quantify MDL1 and MDL1AS expression. The MDL1 and MDL1AS genes are represented by a black arrow surrounded by an ellipse.

[0057] LaFigura 2muestra la expresión de MDL1 y MDL1AS en distintos tumores (blanco) comparada con la de los tejidos sanos adyacentes (tejido normal, negro). Los distintos tumores son tumor de colon (A), de recto (B), de mama (C) y de laringe (D). En los tumores de colon y recto se observa una disminución de MDL1AS cuando se compara con el tejido normal, mientras que en los de mama y laringe se observa un aumento de MDL1AS. RPKM:Reads per kilobase per million mapped reads. Cada barra representa la media y la desviación estándar (sd). Las diferencias estadísticas se muestran con asteriscos. *: p<0,05; **: p<0,01; ****: p<0,0001.[0057] Figure 2 shows the expression of MDL1 and MDL1AS in various tumors (white) compared to that of adjacent healthy tissue (normal tissue, black). The tumors are colon (A), rectal (B), breast (C), and laryngeal (D). Colon and rectal tumors show decreased MDL1AS compared to normal tissue, while breast and laryngeal tumors show increased MDL1AS. RPKM: Reads per kilobase per million mapped reads. Each bar represents the mean and standard deviation (SD). Statistical differences are shown with asterisks. *: p<0.05; **: p<0.01; ****: p<0.0001.

[0059] LaFigura 3muestra la expresión de MDL1 y MDL1AS en donantes sanos (negro) y en pacientes con la enfermedad de Alzheimer (blanco) en RPKM. Cada barra representa la media ± sd. Las diferencias estadísticas se muestran con asteriscos. **: p<0,01[0059] Figure 3 shows the expression of MDL1 and MDL1AS in healthy donors (black) and in patients with Alzheimer's disease (white) in RPKM. Each bar represents the mean ± SD. Statistical differences are shown with asterisks. **: p<0.01

[0061] LaFigura 4muestra las curvas de supervivencia (A) y la curva Característica Operativa del Receptor (ROC, del inglésReceiver Operating Characteristic) (B) para los pacientes de adenocarcinoma de recto según la expresión del lncRNA MDL1AS. En (A), la alta expresión se denota con la línea negra marcada con “a” y la baja expresión se denota con la línea gris marcada con “b”. En (B)se presenta la curva ROC con un área bajo la curva (AUC, del inglésArea Under the Curve)de 0,930 (p<0,0001), con una sensibilidad del 92,6% y una especificidad del 100%.[0061] Figure 4 shows the survival curves (A) and the Receiver Operating Characteristic (ROC) curve (B) for rectal adenocarcinoma patients according to the expression of lncRNA MDL1AS. In (A), high expression is denoted by the black line marked “a” and low expression is denoted by the gray line marked “b”. In (B), the ROC curve is presented with an area under the curve (AUC) of 0.930 (p<0.0001), with a sensitivity of 92.6% and a specificity of 100%.

[0063] LaFigura 5muestra las curvas de supervivencia (A) y la curva ROC (B) para los pacientes de adenocarcinoma de recto según la expresión del lncRNA MDL1. En (A), la alta expresión se denota con la línea negra marcada con “a” y la baja expresión se denota con la línea gris marcada con “b”. En (B)se presenta la curva ROC con un AUC de 0,820 (p<0,0001), con una sensibilidad del 79,17% y una especificidad del 100%.[0063] Figure 5 shows the survival curves (A) and the ROC curve (B) for rectal adenocarcinoma patients according to MDL1 lncRNA expression. In (A), high expression is denoted by the black line marked “a” and low expression is denoted by the gray line marked “b”. In (B), the ROC curve is presented with an AUC of 0.820 (p<0.0001), with a sensitivity of 79.17% and a specificity of 100%.

[0065] LaFigura 6muestra los resultados del silenciamiento del gen MDL1AS en células de carcinoma colorrectal HCT-116 (A) y en células de carcinoma de mama triple negativo MDA-MB-231 (B), relativos al control sin tratar, mediante un ARN de interferencia de doble hebra (DsiRNA) específico. Cada barra representa la media ± sd. La expresión del lncRNA se ha comparado con un gen de referencia nuclear (GAPDH) y con uno mitocondrial (ND1), con resultados idénticos. Las columnas en negro representan el control no tratado y las columnas en blanco las muestras silenciadas con DsiRNA.[0065] Figure 6 shows the results of MDL1AS gene silencing in HCT-116 colorectal carcinoma cells (A) and MDA-MB-231 triple-negative breast carcinoma cells (B), relative to the untreated control, using a specific double-stranded interfering RNA (DsiRNA). Each bar represents the mean ± SD. lncRNA expression was compared with a nuclear reference gene (GAPDH) and a mitochondrial reference gene (ND1), with identical results. Black columns represent the untreated control and white columns represent the DsiRNA-silenced samples.

[0067] LaFigura 7muestra los resultados de un experimento de actividad mitocondrial en la línea celular MDA-MB-231 normal (control, negro y círculos) y silenciada (DsiRNA, gris y triángulos) realizado con el dispositivo “Seahorse”. Las gráficas obtenidas en el dispositivo a medida que se añaden distintos inhibidores (A) ya indican claras diferencias debidas al silenciamiento, que se pueden ver cuantificadas en los histogramas (B-D). Cada barra representa la media ± sd de 15 medidas independientes. Las diferencias estadísticas se muestran con asteriscos. ****: p<0,0001.[0067] Figure 7 shows the results of a mitochondrial activity experiment in the normal (control, black and circles) and silenced (DsiRNA, gray and triangles) MDA-MB-231 cell line performed using the Seahorse device. The graphs obtained on the device as different inhibitors were added (A) already indicate clear differences due to silencing, which can be quantified in the histograms (B-D). Each bar represents the mean ± SD of 15 independent measurements. Statistical differences are shown with asterisks. ****: p<0.0001.

[0069] LaFigura 8muestra los resultados de un experimento de actividad mitocondrial en la línea celular HCT-116 normal (control, negro y círculos) y silenciada (DsiRNA, gris y cuadrados) realizado con el dispositivo “Seahorse”. Las gráficas obtenidas en el dispositivo a medida que se añaden distintos inhibidores (A) ya indican claras diferencias debidas al silenciamiento, que se pueden ver cuantificadas en los histogramas (B-D). Cada barra representa la media ± sd de 15 medidas independientes. Las diferencias estadísticas se muestran con asteriscos. ****: p<0,0001.[0069] Figure 8 shows the results of a mitochondrial activity experiment in the normal (control, black and circles) and silenced (DsiRNA, gray and squares) HCT-116 cell lines performed using the Seahorse device. The graphs obtained on the device as different inhibitors were added (A) already indicate clear differences due to silencing, which can be quantified in the histograms (B-D). Each bar represents the mean ± SD of 15 independent measurements. Statistical differences are shown with asterisks. ****: p<0.0001.

[0071] LaFigura 9muestra los resultados del silenciamiento del gen MDL1AS sobre la capacidad de proliferación de la línea celular HCT-116 normal, sin silenciar (control, negro y círculos) y silenciada (DsiRNA, gris y cuadrados). Las diferencias estadísticas se muestran con asteriscos. ****: p<0,0001.[0071] Figure 9 shows the results of MDL1AS gene silencing on the proliferative capacity of the normal, unsilenced (control, black and circles), and silenced (DsiRNA, gray and squares) HCT-116 cell line. Statistical differences are shown with asterisks. ****: p<0.0001.

[0072] Descripción de la invención[0072] Description of the invention

[0074] Como se usa en la presente solicitud, las formas en singular “un/uno”, “una” y “el/la" incluyen sus correspondientes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el significado que un experto en la técnica a la que esta invención pertenece entiende habitualmente.[0074] As used herein, the singular forms “a/an”, “an” and “the” include their corresponding plurals unless the context clearly indicates otherwise. Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the meanings commonly understood by a person skilled in the art to which this invention pertains.

[0076] Como se muestra en el Ejemplo 2, el nivel de expresión de MDL1AS correlaciona con la presencia/ausencia de ciertos cánceres y de la enfermedad de Alzheimer. Así, la presente invención se refiere en unprimer aspectoa un método para el diagnóstico, en particular un métodoin vitropara el diagnóstico (también referido método para el diagnósticoin vitro),de cáncer o de Alzheimer en un sujeto (referido de aquí en adelante como método de diagnóstico de la invención), que comprende las siguientes etapas:[0076] As shown in Example 2, the expression level of MDL1AS correlates with the presence/absence of certain cancers and Alzheimer's disease. Thus, the present invention relates, in a first aspect, to a method for diagnosis, in particular an in vitro method for the diagnosis (also referred to as the in vitro diagnostic method), of cancer or Alzheimer's disease in a subject (hereinafter referred to as the diagnostic method of the invention), comprising the following steps:

[0077] a) determinar el nivel de expresión de MDL1AS en una muestra tomada de dicho sujeto; b) comparar el nivel de expresión determinado en la etapa a) con una referencia;[0077] a) determine the level of MDL1AS expression in a sample taken from said subject; b) compare the level of expression determined in step a) with a reference;

[0078] c) identificar al sujeto como que padece o es susceptible de padecer cáncer colorrectal, si el nivel de expresión de la muestra es inferior a la referencia, o[0078] c) identify the subject as having or being susceptible to having colorectal cancer, if the expression level of the sample is lower than the reference, or

[0079] identificar al sujeto como que padece o es susceptible de padecer cáncer de laringe, cáncer de mama o Alzheimer si el nivel de expresión de la muestra es superior a la referencia.[0079] Identify the subject as suffering from or being susceptible to laryngeal cancer, breast cancer, or Alzheimer's if the expression level of the sample is higher than the reference.

[0081] Los términos "sujeto", "paciente", e "individuo" se pueden usar indistintamente y se refieren a un ser humano o un animal no humano. Estos términos incluyen mamíferos tales como seres humanos, primates, animales de ganado (por ejemplo, bovinos, cerdos), animales de compañía (por ejemplo, caninos, felinos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas).[0081] The terms "subject," "patient," and "individual" may be used interchangeably and refer to a human being or a non-human animal. These terms include mammals such as humans, primates, livestock (e.g., cattle, pigs), companion animals (e.g., canines, felines), and rodents (e.g., mice and rats).

[0083] En el contexto de la presente invención, el término "referencia" o "nivel de referencia" se refiere a un valor o nivel que se ha determinado midiendo el nivel de expresión del mismo gen que la muestra de ensayo en una muestra biológica tomada de un sujeto o una población de sujetos que no padecen cáncer o Alzheimer (también denominados sujetos sanos). La muestra tomada de un sujeto que no padece cáncer o Alzheimer también se denomina "muestra de control", por lo que la referencia también se refiere al nivel de expresión de una muestra control. Preferiblemente, la muestra control es una muestra de sujetos emparejados en edad e índice de masa corporal con el sujeto analizado, o el tejido sano que rodea a un tumor en muestras patológicas. Preferiblemente, la referencia es un valor de referencia, un valor de corte o un umbral.[0083] In the context of the present invention, the term "reference" or "reference level" refers to a value or level determined by measuring the expression level of the same gene as the test sample in a biological sample taken from a subject or population of subjects who do not have cancer or Alzheimer's disease (also referred to as healthy subjects). The sample taken from a subject who does not have cancer or Alzheimer's disease is also called a "control sample," and the reference also refers to the expression level of a control sample. Preferably, the control sample is a sample of subjects matched for age and body mass index to the test subject, or the healthy tissue surrounding a tumor in pathological samples. Preferably, the reference is a reference value, a cutoff value, or a threshold.

[0084] En el contexto de la presente invención, el término “susceptible de padecer” se refiere a que el sujeto tiene un riesgo de padecer (o desarrollar) una enfermedad, siendo la enfermedad cáncer colorrectal, cáncer de laringe, cáncer de mama o enfermedad de Alzheimer. Un sujeto se considera que tiene un riesgo, en particular un riesgo elevado, de desarrollar una enfermedad cuando tiene una probabilidad de desarrollar esta enfermedad de al menos 50%, o al menos 60%, o al menos 70%, o al menos 80%, o al menos 90%, o al menos 95%, o al menos 97%, o al menos 98%, o al menos 99%, o al menos 100%.[0084] In the context of the present invention, the term “susceptible to” means that the subject has a risk of suffering from (or developing) a disease, the disease being colorectal cancer, laryngeal cancer, breast cancer, or Alzheimer's disease. A subject is considered to have a risk, in particular a high risk, of developing a disease when they have a probability of developing this disease of at least 50%, or at least 60%, or at least 70%, or at least 80%, or at least 90%, or at least 95%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99%, or at least 100%.

[0086] Como entenderá un experto en la materia, la susceptibilidad (o riesgo), aunque preferida, no necesita ser correcta para el 100% de los sujetos que se van a evaluar, pero es preferible que lo sea. La susceptibilidad (o riesgo), sin embargo, requiere que una parte estadísticamente significativa de los sujetos se puede identificar con una probabilidad más alta de tener un resultado particular. El experto en la materia puede determinar sin dificultad si una parte es estadísticamente significativa usando diversas herramientas estadísticas para evaluación bien conocidas, por ejemplo, determinación de intervalos de confianza, determinación del valor p, índices de clasificación de validación cruzada, etc. Los intervalos de confianza preferidos son al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% o al menos 95%. Los valores de p son preferiblemente 0,05, 0,02, 0,01 o menor.[0086] As a subject matter expert will understand, susceptibility (or risk), although preferred, does not need to be correct for 100% of the subjects to be tested, but it is preferable that it be. Susceptibility (or risk), however, requires that a statistically significant subset of subjects can be identified with a higher probability of having a particular outcome. The subject matter expert can easily determine whether a subset is statistically significant using various well-known statistical assessment tools, e.g., determining confidence intervals, determining p-values, cross-validation classification indices, etc. Preferred confidence intervals are at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, or at least 95%. Preferred p-values are 0.05, 0.02, 0.01, or lower.

[0088] Los “ARN largos no codificantes" (lncRNAs), según se utiliza en la presente invención, son transcripciones no codificantes de proteínas que tienen más de 200 nucleótidos, más particularmente de entre 200 nucleótidos hasta 100 kilobases.[0088] “Long non-coding RNAs” (lncRNAs), as used in the present invention, are non-coding transcripts of proteins that have more than 200 nucleotides, more particularly from 200 nucleotides up to 100 kilobases.

[0090] Las secuencias de los lncRNAs MDL1 y MDL1AS se encuentran en la región denominada región bucle D, que contiene el origen de replicación del genoma mitocondrial. Como se muestra en los ejemplos, solo MDL1AS tiene utilidad como biomarcador para determinar el diagnóstico de cáncer y del Alzheimer.[0090] The lncRNA sequences MDL1 and MDL1AS are located in the region called the D-loop region, which contains the origin of replication of the mitochondrial genome. As shown in the examples, only MDL1AS is useful as a biomarker for diagnosing cancer and Alzheimer's disease.

[0092] MDL1AS o lncRNA MDL1AS se refiere a un gen que es un fragmento del ADN mitocondrial, así como al ARN que se transcribe a partir de dicho gen. Al tratarse de un gen no codificador de proteínas, no existe producto proteico. En la presente invención, MDL1AS incluye tanto el MDL1AS humano como los MDL1AS homólogos de otras especies animales. La secuencia completa del ADN mitocondrial humano aparece en NC_012920.1 (NCBI Reference Sequence).[0092] MDL1AS or lncRNA MDL1AS refers to a gene that is a fragment of mitochondrial DNA, as well as to the RNA transcribed from that gene. Since it is a non-protein-coding gene, there is no protein product. In the present invention, MDL1AS includes both human MDL1AS and homologous MDL1AS from other animal species. The complete human mitochondrial DNA sequence appears in NC_012920.1 (NCBI Reference Sequence).

[0093] La secuencia del gen MDL1AS humano se muestra en la secuencia SEC ID Nº: 1:[0093] The sequence of the human MDL1AS gene is shown in the sequence SEC ID No: 1:

[0095] [0095]

[0096] [0096]

[0099] Así, cuando MDL1AS es el RNA transcrito a partir de la SEC ID Nº: 1, la secuencia de ARN es complementaria al ADN de la secuencia SEC ID Nº:1, tal y como se muestra en la secuencia SEC ID Nº: 21.[0099] Thus, when MDL1AS is the RNA transcribed from SEC ID No: 1, the RNA sequence is complementary to the DNA of the sequence SEC ID No: 1, as shown in the sequence SEC ID No: 21.

[0101] En una realización particular, el nivel de expresión de MDL1AS (también referido como el nivel de expresión del lncRNA MDL1AS) se mide a nivel de ARN.[0101] In one particular embodiment, the expression level of MDL1AS (also referred to as the expression level of lncRNA MDL1AS) is measured at the RNA level.

[0103] La determinación del nivel de expresión de MDL1AS se puede llevar a cabo mediante cualquier método conocido por el experto en la materia. En una realización particular según una cualquiera de las realizaciones del método del primer aspecto de la invención, la determinación del nivel de expresión de MDL1AS se lleva a cabo mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa, preferentemente PCR cuantitativa a tiempo real (qRT-PCR),Northern blot, o secuenciación masiva. Preferentemente, la expresión se determina mediante qRT-PCR. En otra realización preferente según una cualquiera de las realizaciones anteriores, la expresión se determina usando al menos un cebador seleccionado de los cebadores de las secuencias SEQ ID Nº: 2-5 o combinaciones de los mismos. Más preferentemente se determina usando alguna de las parejas de cebadores indicadas en la Tabla 3, SEC ID Nº:2 y 3, o SEC ID Nº: 4 y 5.[0103] The expression level of MDL1AS can be determined by any method known to the person skilled in the art. In one particular embodiment according to any one of the embodiments of the method of the first aspect of the invention, the expression level of MDL1AS is determined by quantitative polymerase chain reaction (PCR), preferably quantitative real-time PCR (qRT-PCR), Northern blot, or next-generation sequencing. Preferably, the expression is determined by qRT-PCR. In another preferred embodiment according to any one of the foregoing embodiments, the expression is determined using at least one primer selected from the primers in sequences SEQ ID Nos. 2-5 or combinations thereof. More preferably, it is determined using one of the primer pairs indicated in Table 3, either SEQ ID Nos. 2 and 3, or SEQ ID Nos. 4 and 5.

[0104] La muestra en la que se analiza la expresión de MDL1AS puede ser cualquier muestra biológica que comprenda material mitocondrial. En una realización particular según una cualquiera de las realizaciones del método según el primer aspecto de la invención, la muestra es una biopsia sólida, una necropsia, una biopsia líquida, sangre, un derivado de la sangre (por ejemplo, células blancas de la sangre, plasma sanguíneo o suero sanguíneo) o líquido cefalorraquídeo. Preferentemente, la muestra es una biopsia sólida.[0104] The sample in which MDL1AS expression is analyzed can be any biological sample comprising mitochondrial material. In a particular embodiment according to any one of the embodiments of the method according to the first aspect of the invention, the sample is a solid biopsy, a necropsy, a liquid biopsy, blood, a blood derivative (for example, white blood cells, blood plasma, or blood serum), or cerebrospinal fluid. Preferably, the sample is a solid biopsy.

[0106] En una realización particular según una cualquiera de las realizaciones del método del primer aspecto de la invención, el cáncer colorrectal (también referido como carcinoma colorrectal) se selecciona de adenocarcinoma de recto, cáncer de colon o cáncer de recto, y/o el cáncer de mama es cáncer de mama triple negativo.[0106] In a particular embodiment according to any one of the embodiments of the method of the first aspect of the invention, the colorectal cancer (also referred to as colorectal carcinoma) is selected from rectal adenocarcinoma, colon cancer or rectal cancer, and/or the breast cancer is triple-negative breast cancer.

[0108] Las definiciones y realizaciones particulares y preferentes dadas para el primer aspecto de la invención son aplicables al resto de los aspectos de la presente invención.[0108] The particular and preferred definitions and embodiments given for the first aspect of the invention are applicable to the remaining aspects of the present invention.

[0110] Como se muestra en el Ejemplo 3, los niveles de expresión de MDL1AS y MDL1 son un predictor excelente para la prognosis del cáncer colorrectal. Así, unsegundo aspectode la presente invención se refiere a un método, en particular un métodoin vitro,para el pronóstico de supervivencia de un sujeto que padece cáncer colorrectal (de aquí en adelante referido como método de pronóstico de la presente invención) que comprende las siguientes etapas:[0110] As shown in Example 3, the expression levels of MDL1AS and MDL1 are an excellent predictor of colorectal cancer prognosis. Thus, a second aspect of the present invention relates to a method, in particular an in vitro method, for predicting the survival of a subject suffering from colorectal cancer (hereafter referred to as the prognostic method of the present invention) comprising the following steps:

[0111] a) determinar el nivel de expresión de lncRNA MDL1AS y/o lncRNA MDL1 en una muestra tomada de dicho sujeto;[0111] a) determine the expression level of lncRNA MDL1AS and/or lncRNA MDL1 in a sample taken from said subject;

[0112] b) comparar el nivel de expresión determinado en la etapa a) con una referencia;[0112] b) compare the level of expression determined in step a) with a reference;

[0113] donde un nivel de expresión de lncRNA MDL1AS y/o lncRNA MDL1 igual o superior a dicha referencia es indicativo de un pronóstico positivo y un nivel de expresión inferior a dicha referencia es indicativo de un pronóstico negativo.[0113] where an expression level of lncRNA MDL1AS and/or lncRNA MDL1 equal to or greater than said reference is indicative of a positive prognosis and an expression level lower than said reference is indicative of a negative prognosis.

[0115] MDL1 o lncRNA MDL1 se refiere a un gen que es un fragmento del ADN mitocondrial, así como al ARN que se transcribe a partir de dicho gen. Al tratarse de un gen no codificador de proteínas, no existe producto proteico. En la presente invención, MDL1 incluye tanto el MDL1 humano como los MDL1 homólogos de otras especies animales.[0115] MDL1 or lncRNA MDL1 refers to a gene that is a fragment of mitochondrial DNA, as well as to the RNA transcribed from that gene. Since it is a non-protein-coding gene, there is no protein product. In the present invention, MDL1 includes both human MDL1 and homologous MDL1s from other animal species.

[0117] La secuencia del gen MDL1 se muestra en la secuencia SEC ID Nº: 6:[0117] The MDL1 gene sequence is shown in the sequence SEC ID No: 6:

[0119] [0119]

[0120] [0120]

[0123] Así, cuando MDL1 es el RNA transcrito a partir de la SEC ID Nº: 6, la secuencia de ARN es complementaria al ADN de la secuencia SEC ID Nº: 6, tal y como se muestra en la secuencia SEC ID Nº: 22.[0123] Thus, when MDL1 is the RNA transcribed from SEC ID No: 6, the RNA sequence is complementary to the DNA of the sequence SEC ID No: 6, as shown in the sequence SEC ID No: 22.

[0125] En una realización particular del método de pronóstico de la presente invención, el pronóstico de supervivencia es pronóstico de la supervivencia a 5 años.5 años se considera la etapa crítica a partir de la cual, si el paciente sobrevive, se considera que el cáncer se ha curado.[0125] In a particular embodiment of the prognostic method of the present invention, the survival prognosis is the 5-year survival prognosis. 5 years is considered the critical stage from which, if the patient survives, the cancer is considered to have been cured.

[0127] En otra realización particular según una cualquiera de las realizaciones del método de pronóstico de la presente invención, el cáncer colorrectal es adenocarcinoma de recto.[0127] In another particular embodiment according to any one of the embodiments of the prognostic method of the present invention, colorectal cancer is adenocarcinoma of the rectum.

[0129] En otra realización particular según una cualquiera de las realizaciones del método de pronóstico de la presente invención, el sujeto ha sido tratado con quimio-radioterapia neoadyuvante.[0129] In another particular embodiment according to any one of the embodiments of the prognostic method of the present invention, the subject has been treated with neoadjuvant chemo-radiotherapy.

[0131] En otra realización particular según una cualquiera de las realizaciones del método de pronóstico de la presente invención, la referencia del método de pronóstico es el valor 1980 unidades para MDL1AS y/o 2382 para MDL1, tal y como se utiliza en el Ejemplo 3.[0131] In another particular embodiment according to any one of the embodiments of the forecasting method of the present invention, the reference of the forecasting method is the value 1980 units for MDL1AS and/or 2382 for MDL1, as used in Example 3.

[0132] Como se ha indicado anteriormente, las realizaciones particulares dadas para el primer aspecto de la presente invención son aplicables al segundo aspecto de la invención (por ejemplo, determinación de la expresión, muestra, etc.).[0132] As stated above, the particular embodiments given for the first aspect of the present invention are applicable to the second aspect of the invention (e.g., determination of the expression, sample, etc.).

[0134] El nivel de expresión de MDL1AS y/o MDL1, sirve como biomarcador de pronóstico, por lo que también encuentra utilidad para evaluar la respuesta a un tratamiento terapéutico. Así, untercer aspectode la presente invención se refiere a un método para evaluar la respuesta a un tratamiento de un sujeto con cáncer colorrectal que comprende determinar la expresión de lncRNA MDL1AS y/o lncRNA MDL1 en una muestra tomada de dicho sujeto antes y después del tratamiento, donde un aumento en el nivel de expresión de lncRNA MDL1AS y/o lncRNA MDL1 en la muestra obtenida después del tratamiento es indicativo de buena respuesta al tratamiento. En una realización particular, el método es un métodoin vitro.[0134] The expression level of MDL1AS and/or MDL1 serves as a prognostic biomarker, and is therefore also useful for evaluating the response to therapeutic treatment. Thus, a third aspect of the present invention relates to a method for evaluating the response to treatment in a subject with colorectal cancer, comprising determining the expression of lncRNA MDL1AS and/or lncRNA MDL1 in a sample taken from said subject before and after treatment, wherein an increase in the expression level of lncRNA MDL1AS and/or lncRNA MDL1 in the sample obtained after treatment is indicative of a good response to treatment. In one particular embodiment, the method is an in vitro method.

[0136] En una realización particular, el aumento es un aumento estadísticamente significativo. El experto en la materia puede determinar sin dificultad si el aumento es estadísticamente significativo usando diversas herramientas estadísticas bien conocidas, por ejemplo, determinación de intervalos de confianza, determinación del valor p, índices de clasificación de validación cruzada, etc. Los intervalos de confianza preferidos son al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% o al menos 95%. Los valores de p son preferiblemente 0,05, 0,02, 0,01 o menor.[0136] In a particular embodiment, the increase is a statistically significant increase. A person skilled in the art can readily determine whether the increase is statistically significant using various well-known statistical tools, e.g., determining confidence intervals, determining the p-value, cross-validation ranking indices, etc. Preferred confidence intervals are at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, or at least 95%. Preferably, p-values are 0.05, 0.02, 0.01, or less.

[0138] Como se ha indicado anteriormente, las realizaciones particulares dadas para el primer aspecto de la presente invención son aplicables al tercer aspecto de la invención (por ejemplo, determinación de la expresión, muestra, etc.).[0138] As stated above, the particular embodiments given for the first aspect of the present invention are applicable to the third aspect of the invention (e.g., determination of the expression, sample, etc.).

[0140] Los reactivos para llevar a cabo los métodos de la invención se pueden agrupar en un kit de partes. Así, uncuarto aspectode la presente invención se refiere a un kit para llevar a cabo el método del primer aspecto, que comprende o consiste en medios para determinar el nivel de expresión del lncRNA MDL1AS. Igualmente, el cuarto aspecto de la presente invención se refiere a un kit para llevar a cabo el método del segundo o tercer aspecto de la invención, que comprende o consiste en medios para determinar el nivel de expresión del lncRNA MDL1AS y/o lncRNA MDL1.[0140] The reagents for carrying out the methods of the invention can be grouped into a kit of parts. Thus, a fourth aspect of the present invention relates to a kit for carrying out the method of the first aspect, comprising or consisting of means for determining the expression level of lncRNA MDL1AS. Likewise, the fourth aspect of the present invention relates to a kit for carrying out the method of the second or third aspect of the invention, comprising or consisting of means for determining the expression level of lncRNA MDL1AS and/or lncRNA MDL1.

[0142] Optativamente, dichos kits adicionalmente comprenden o consisten en medios para determinar el nivel de expresión de los genes ND1 y/o GAPDH y/o instrucciones de uso del kit.[0142] Optionally, such kits additionally comprise or consist of means for determining the expression level of the ND1 and/or GAPDH genes and/or instructions for use of the kit.

[0143] En una realización particular, los medios para determinar el nivel de expresión de MDL1AS comprende cebadores, más particularmente cebadores que comprenden o consisten en al menos una cualquiera de las secuencias SEC ID Nº: 2 a SEC ID Nº: 5, preferentemente la pareja de cebadores de secuencia SEC ID Nº: 2 y 3, o de secuencia SEC ID Nº: 4 y 5. En una realización particular, los medios para determinar el nivel de expresión de MDL1 comprende cebadores, más particularmente cebadores que comprenden o consisten en al menos una cualquiera de las secuencias SEC ID Nº: 7 a SEC ID Nº: 10, preferentemente la pareja de cebadores de secuencia SEC ID Nº: 7 y 8, o SEC ID Nº: 9 y 10. En otra realización particular, los medios para determinar el nivel de expresión de ND1 comprende cebadores que comprenden o consisten en una o dos de las secuencias SEC ID Nº: 11 y SEC ID Nº: 12, y para determinar el nivel de expresión de GAPDH comprende cebadores que comprenden o consisten en una o dos de las secuencias SEC ID Nº: 13 y SEC ID Nº: 14. Estos cebadores son los usados en los Ejemplos (ver Tabla 3).[0143] In one particular embodiment, the means for determining the expression level of MDL1AS comprises primers, more particularly primers comprising or consisting of at least one of the sequences SEC ID No.: 2 to SEC ID No.: 5, preferably the primer pair of sequences SEC ID No.: 2 and 3, or of sequences SEC ID No.: 4 and 5. In one particular embodiment, the means for determining the expression level of MDL1 comprises primers, more particularly primers comprising or consisting of at least one of the sequences SEC ID No.: 7 to SEC ID No.: 10, preferably the primer pair of sequences SEC ID No.: 7 and 8, or SEC ID No.: 9 and 10. In another particular embodiment, the means for determining the expression level of ND1 comprises primers comprising or consisting of one or two of the sequences SEC ID No.: 11 and SEC ID No.: 12. No: 12, and to determine the level of expression of GAPDH comprises primers comprising or consisting of one or two of the sequences SEC ID No: 13 and SEC ID No: 14. These primers are the ones used in the Examples (see Table 3).

[0145] El kit de la invención es útil para llevar a cabo los métodos de la invención. Así, unquinto aspectode la invención se refiere al uso del kit según una cualquiera de las realizaciones del cuarto aspecto de la invención para llevar a cabo el método según una cualquiera de las realizaciones del primer, segundo y tercer aspecto de la invención.[0145] The kit of the invention is useful for carrying out the methods of the invention. Thus, a fifth aspect of the invention relates to the use of the kit according to any one of the embodiments of the fourth aspect of the invention to carry out the method according to any one of the embodiments of the first, second, and third aspects of the invention.

[0147] Como se ha mostrado en los Ejemplos 2 y 3, el nivel de expresión del lncRNA MDL1AS sirve de biomarcador para el diagnóstico y pronóstico de diversas enfermedades. Así, unsexto aspectode la presente invención se refiere al uso del lncRNA o del nivel de expresión del lncRNA MDL1AS como marcador para el diagnósticoin vitrode cáncer colorrectal, cáncer de laringe, cáncer de mama o Alzheimer. También se refiere al uso del lncRNA MDL1 o del nivel de expresión del lncRNA MDL1 como marcador para el pronósticoin vitrode cáncer colorrectal.[0147] As shown in Examples 2 and 3, the expression level of lncRNA MDL1AS serves as a biomarker for the diagnosis and prognosis of various diseases. Thus, a sixth aspect of the present invention relates to the use of lncRNA or the expression level of lncRNA MDL1AS as a marker for the in vitro diagnosis of colorectal cancer, laryngeal cancer, breast cancer, or Alzheimer's disease. It also relates to the use of lncRNA MDL1 or the expression level of lncRNA MDL1 as a marker for the in vitro prognosis of colorectal cancer.

[0149] De manera interesante, estos marcadores son independientes de otros marcadores normalmente utilizados en el diagnóstico y/o pronóstico de cáncer (por ejemplo, cáncer colorrectal) como pueden ser el gen KRAS mutado o el ser fumador (ver Tabla 1, Ejemplo 3). Esto supone una gran ventaja al poder sumarse su capacidad predictiva a la de otros marcadores ya conocidos.[0149] Interestingly, these markers are independent of other markers commonly used in the diagnosis and/or prognosis of cancer (e.g., colorectal cancer), such as the mutated KRAS gene or smoking status (see Table 1, Example 3). This is a significant advantage, as their predictive capacity can be combined with that of other known markers.

[0151] En una realización particular según una cualquiera de las realizaciones del sexto aspecto de la invención, el cáncer colorrectal se selecciona de adenocarcinoma de recto, cáncer de colon o cáncer de recto, y/o el cáncer de mama es cáncer de mama triple negativo.[0151] In a particular embodiment according to any one of the embodiments of the sixth aspect of the invention, the colorectal cancer is selected from rectal adenocarcinoma, colon cancer or rectal cancer, and/or the breast cancer is triple-negative breast cancer.

[0152] Como se muestra en las Figuras 2 y 3, en los cánceres de laringe y mama, y en la enfermedad de Alzheimer, el nivel de expresión de MDL1AS es mayor que en el tejido normal circundante. Sin embargo, en las células tumorales de colon y recto en muestras clínicas expresan niveles de MDL1AS inferiores a los del tejido normal circundante. A pesar de esta diferencia en el patrón de expresión de MDL1AS, los inventores han visto que, sorprendentemente, la disminución de la expresión de MDL1AS tiene propiedades beneficiosas para el paciente incluso en los cánceres con niveles de expresión de MDL1AS inferiores a los del tejido normal circundante (Ejemplo 4). Sin querer ceñirnos a ninguna teoría en particular, debemos señalar que los ARNs no codificantes regulan la expresión de un alto número de genes celulares y por lo tanto tienen un impacto pleiotrópico en las actividades celulares. De esta manera, la reducción de MDL1AS podría tener un efecto protector debido a, por ejemplo, propiedades antiinflamatorias o a influir sobre el sistema inmunitario o sobre otras vías celulares o fisiológicas.[0152] As shown in Figures 2 and 3, in laryngeal and breast cancers, and in Alzheimer's disease, the expression level of MDL1AS is higher than in the surrounding normal tissue. However, colon and rectal tumor cells in clinical samples express lower levels of MDL1AS than the surrounding normal tissue. Despite this difference in the MDL1AS expression pattern, the inventors have surprisingly observed that decreased MDL1AS expression has beneficial properties for the patient, even in cancers with lower MDL1AS expression levels than the surrounding normal tissue (Example 4). Without adhering to any particular theory, it should be noted that non-coding RNAs regulate the expression of a large number of cellular genes and therefore have a pleiotropic impact on cellular activities. Thus, the reduction of MDL1AS could have a protective effect due to, for example, anti-inflammatory properties or by influencing the immune system or other cellular or physiological pathways.

[0154] En consecuencia, unséptimo aspectode la presente invención se refiere a un inhibidor de la expresión del lncRNA MDL1AS, más particularmente dicho inhibidor se selecciona del grupo formado por ARN de interferencia de cadena doble (DsiRNA, dedouble strand interference RNA), ARN de horquilla corta (shRNA, desmall hairpin RNA), ARN pequeño de interferencia (siRNA, desmall intereference RNA), micro ARN (miRNA), repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y espaciadas regularmente (CRISPR), oligómero antisentido, oligonucleótido gápmero, nucleasa efectora de tipo activador de la transcripción (TALEN, deTranscription activator-like effector nuclease), nucleasa de dedos de Zinc y combinaciones de los mismos.[0154] Accordingly, a seventh aspect of the present invention relates to an inhibitor of the expression of lncRNA MDL1AS, more particularly said inhibitor being selected from the group consisting of double-strand interference RNA (DsiRNA), small hairpin RNA (shRNA), small interference RNA (siRNA), microRNA (miRNA), clustered regularly spaced short palindromic repeats (CRISPR), antisense oligomer, gapmer oligonucleotide, transcription activator-like effector nuclease (TALEN), zinc finger nuclease and combinations thereof.

[0156] En la presente invención se entiende por “inhibidor de la expresión” a aquel compuesto o molécula que disminuye o inhibe total o parcialmente la expresión de MDL1AS con respecto a una referencia. La definición de referencia dada en el primer aspecto de la invención es aplicable al séptimo aspecto de la invención. En una realización particular, inhibe la expresión al menos un 40%, más particularmente al menos un 50% y preferentemente al menos un 60%.[0156] In the present invention, an “expression inhibitor” means a compound or molecule that reduces or inhibits, totally or partially, the expression of MDL1AS with respect to a reference. The definition of reference given in the first aspect of the invention is applicable to the seventh aspect of the invention. In a particular embodiment, it inhibits expression by at least 40%, more particularly by at least 50%, and preferably by at least 60%.

[0158] Si se desea lograr la inhibición a nivel del ADN, esto puede hacerse mediante terapia génica para eliminar o interrumpir el gen objetivo. Según se utiliza aquí, un "knock-out" puede ser una reducción del gen o el gen puede ser eliminado mediante una mutación como una mutación puntual, una inserción, una eliminación, mediante técnicas conocidas en el arte, incluyendo, pero no limitadas a, la transferencia génica retroviral. Otra forma de realizarknock-outsde genes es mediante el uso de nucleasas de dedos de zinc. Las nucleasas de dedos de zinc (ZFNs) son enzimas de restricción artificiales generadas al fusionar un dominio de unión al ADN de dedo de zinc con un dominio de escisión del ADN. Los dominios de dedo de zinc pueden diseñarse para dirigirse a secuencias de ADN deseadas, lo que permite a las nucleasas de dedos de zinc dirigirse a secuencias únicas dentro de un genoma complejo. Aprovechando la maquinaria endógena de reparación del ADN, estos agentes pueden utilizarse para alterar con precisión los genomas de organismos superiores.[0158] If inhibition at the DNA level is desired, this can be achieved through gene therapy to eliminate or disrupt the target gene. As used here, a "knockout" can be a reduction of the gene, or the gene can be eliminated by a mutation such as a point mutation, an insertion, or a deletion, using techniques known to the art, including, but not limited to, retroviral gene transfer. Another way to achieve gene knockouts is by using zinc finger nucleases. Zinc finger nucleases (ZFNs) are artificial restriction enzymes generated by fusing a zinc finger DNA-binding domain with a DNA-cleaving domain. Zinc finger domains can be engineered to target desired DNA sequences, allowing zinc finger nucleases to target unique sequences within a complex genome. By harnessing the endogenous DNA repair machinery, these agents can be used to precisely alter the genomes of higher organisms.

[0160] Otras tecnologías para la personalización del genoma que pueden usarse para eliminar genes son las meganucleasas y las TALENs. Una TALEN está compuesta por un dominio de unión al ADN de efectores TAL para el reconocimiento específico de secuencias fusionado al dominio catalítico de una endonucleasa que introduce roturas de doble cadena (DSB). El dominio de unión al ADN de un TALEN es capaz de dirigirse con alta precisión a un sitio de reconocimiento grande (por ejemplo, 17 pares de bases). Las meganucleasas son endonucleasas específicas de secuencia, que tienen sitios de reconocimiento largos de entre 12 y 30 pares de bases. El sitio de reconocimiento de las meganucleasas naturales puede modificarse para dirigirse a secuencias de ADN genómico nativo (como genes endógenos).[0160] Other genome customization technologies that can be used to delete genes include meganucleases and TALENs. A TALEN consists of a DNA-binding domain of TAL effectors for sequence-specific recognition fused to the catalytic domain of an endonuclease that introduces double-strand breaks (DSBs). The DNA-binding domain of a TALEN is capable of targeting a large recognition site (e.g., 17 base pairs) with high precision. Meganucleases are sequence-specific endonucleases with long recognition sites of 12 to 30 base pairs. The recognition site of natural meganucleases can be modified to target native genomic DNA sequences (such as endogenous genes).

[0162] Otro método para la inhibición de la expresión génica se basa en el uso de oligómeros antisentido que consisten en ADN u otros tipos estructurales sintéticos como fosforotioatos, quimeras de ribonucleótidos de 2'-O-alquilo, ácido desoxirribonucleico bloqueado (LNA), ácido nucleico peptídico (PNA) o morfolinos. Un "oligómero antisentido" se refiere a una molécula antisentido que comprende un oligómero de al menos unos 10 nucleótidos de longitud. En ciertas realizaciones, un oligómero antisentido comprende al menos 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40 o 50 nucleótidos. Los enfoques antisentido implican el diseño de oligonucleótidos (ya sea de ADN o ARN, o derivados de estos) que son complementarios a un ARN codificado por secuencias polinucleotídicas de MDL1AS. El ARN antisentido puede introducirse en una célula para inhibir la traducción de un ARN mensajero complementario mediante el emparejamiento de bases y obstrucción física de la maquinaria de traducción. Este efecto es, por lo tanto, estequiométrico. Aunque se prefiere la complementariedad absoluta, no es necesario. Una secuencia "complementaria" a una porción de un ARN, según se menciona aquí, significa una secuencia que tiene suficiente complementariedad como para poder hibridarse con el ARN, formando un dúplex estable.[0162] Another method for inhibiting gene expression is based on the use of antisense oligomers consisting of DNA or other synthetic structural types such as phosphorothioates, 2'-O-alkyl ribonucleotide chimeras, blocked deoxyribonucleic acid (LNA), peptide nucleic acid (PNA), or morpholinos. An "antisense oligomer" refers to an antisense molecule comprising an oligomer of at least about 10 nucleotides in length. In certain embodiments, an antisense oligomer comprises at least 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, or 50 nucleotides. Antisense approaches involve the design of oligonucleotides (either DNA or RNA, or derivatives thereof) that are complementary to an RNA encoded by polynucleotide sequences of MDL1AS. Antisense RNA can enter a cell to inhibit the translation of a complementary messenger RNA by base pairing and physically blocking the translation machinery. This effect is therefore stoichiometric. Although absolute complementarity is preferred, it is not required. A sequence "complementary" to a portion of an RNA, as referred to here, means a sequence that has sufficient complementarity to hybridize with the RNA, forming a stable duplex.

[0164] Los oligonucléotidos gápmeros son estructuras cortas de oligonucleótidos antisentido de ADN con segmentos similares al ARN en ambos lados de la secuencia. Estas estructuras genéticas están diseñadas para hibridarse con una región diana de ARN y silenciar el gen a través de la inducción de la escisión por la RNasa H.[0164] Gamper oligonucleotides are short antisense DNA oligonucleotide structures with RNA-like segments on both sides of the sequence. These genetic structures are designed to hybridize to a target RNA region and silence the gene through RNase H-induced cleavage.

[0166] El sistema CRISPR, también conocida como CRISPR/Cas o CRISPR/Cas9, es un sistema bien conocido por el experto en la materia, al igual que lo son dsiRNA, shRNA, siRNA y miRNA.[0166] The CRISPR system, also known as CRISPR/Cas or CRISPR/Cas9, is a system well known to the expert in the field, as are dsiRNA, shRNA, siRNA and miRNA.

[0168] Generalmente, la longitud de los siRNA es de entre 20 y 25 nucleótidos. El siRNA típicamente consta de una cadena de ARN sentido y una cadena de ARN antisentido complementaria unidas mediante interacciones estándar de apareamiento de Watson-Crick (en adelante "apareadas"). La cadena sentido comprende una secuencia de ácidos nucleicos idéntica a una secuencia diana contenida en el ARN mensajero objetivo. Las siRNA de la presente invención pueden comprender ARN sintético, ARN recombinante o ARN producido químicamente, así como ARN alterado que difiere del ARN natural mediante la adición, eliminación, sustitución y/o alteración de uno o más nucleótidos. Dichas alteraciones pueden incluir la adición de material no nucleotídico, como en los extremos del siRNA o en uno o más nucleótidos internos del siRNA, incluyendo modificaciones que hagan que el siRNA sea resistente a la digestión por nucleasas.[0168] Generally, siRNAs are between 20 and 25 nucleotides long. A siRNA typically consists of a sense RNA strand and a complementary antisense RNA strand joined by standard Watson-Crick pairing interactions (hereafter "paired"). The sense strand comprises a nucleic acid sequence identical to a target sequence contained in the target messenger RNA. The siRNAs of the present invention may comprise synthetic RNA, recombinant RNA, or chemically produced RNA, as well as altered RNA that differs from natural RNA by the addition, deletion, substitution, and/or alteration of one or more nucleotides. Such alterations may include the addition of non-nucleotide material, such as at the ends of the siRNA or in one or more internal nucleotides of the siRNA, including modifications that render the siRNA resistant to digestion by nucleases.

[0170] Los inhibidores pueden estar formulados en una composición farmacéutica. Así, unoctavo aspectode la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un inhibidor según el séptimo aspecto de la invención y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.[0170] Inhibitors may be formulated in a pharmaceutical composition. Thus, an eighth aspect of the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising an inhibitor according to the seventh aspect of the invention and a pharmaceutically acceptable vehicle or excipient.

[0172] El término "vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera de los vehículos o excipientes farmacéuticos estándares. Los vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables para uso terapéutico son bien conocidos en la técnica farmacéutica. Por ejemplo, se puede usar solución salina estéril y solución salina tamponada con fosfato a pH ligeramente ácido o fisiológico. Los agentes de tamponamiento del pH adecuados pueden ser, por ejemplo, fosfato, citrato, acetato, lactato, maleato, tris/hidroximetil) aminometano (TRIS), ácido N-Tris (hidroximetil) metil-3-aminopropansulfónico (TAPS), bicarbonato de amonio, dietanolamina, histidina, que en ciertas realizaciones es un tampón preferido, arginina, lisina, o acetato o mezclas de los mismos. El término abarca además los agentes enumerados en la Farmacopea US para su uso en animales, que incluye los seres humanos.[0172] The term "pharmaceutically acceptable vehicle or excipient" includes any of the standard pharmaceutical vehicles or excipients. Pharmaceutically acceptable vehicles or excipients for therapeutic use are well known in pharmaceutical practice. For example, sterile saline and phosphate-buffered saline at slightly acidic or physiological pH may be used. Suitable pH buffering agents may include, for example, phosphate, citrate, acetate, lactate, maleate, tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS), N-Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropansulfonic acid (TAPS), ammonium bicarbonate, diethanolamine, histidine (which in certain embodiments is a preferred buffer), arginine, lysine, or acetate, or mixtures thereof. The term further covers agents listed in the U.S. Pharmacopeia for use in animals, including humans.

[0174] La composición farmacéutica que comprende dichos vehículos o excipientes pueden formularse mediante métodos convencionales bien conocidos. La composición puede estar en forma sólida, líquida o gaseosa y puede estar, entre otras, en forma de polvo(s), comprimido(s), solución(es) o aerosol(es).[0174] The pharmaceutical composition comprising said vehicles or excipients may be formulated by well-known conventional methods. The composition may be in solid, liquid, or gaseous form and may be, among others, in the form of powder(s), tablet(s), solution(s), or aerosol(s).

[0176] Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse al sujeto a una dosis adecuada. El régimen de dosificación será determinado por el médico tratante y los factores clínicos. Como es bien sabido, las dosis para cualquier paciente dependen de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, el área de superficie corporal, la edad, el sexo, el tiempo y la vía de administración, la salud general y otros fármacos que se administran simultáneamente. La cantidad terapéuticamente eficaz para una situación dada se determinará fácilmente mediante la experimentación rutinaria y está dentro de las habilidades y el juicio del clínico o médico ordinario. Generalmente, el régimen como administración regular de la composición farmacéutica está en el rango de 1 µg a 5 g unidades por día. Sin embargo, una dosificación más preferida está en el intervalo de 0,01 mg a 100 mg, más preferiblemente de 0,01 mg a 50 mg y aún más preferiblemente de 0,01 mg a 10 mg al día.[0176] Pharmaceutical compositions may be administered to the subject at an appropriate dose. The dosage regimen will be determined by the attending physician and clinical factors. As is well known, the dosage for any patient depends on many factors, including the patient's size, body surface area, age, sex, time and route of administration, general health, and other drugs being administered concurrently. The therapeutically effective amount for a given situation will be readily determined by routine experimentation and is within the skills and judgment of the average clinician or physician. Generally, the regimen for regular administration of the pharmaceutical composition is in the range of 1 µg to 5 g units per day. However, a more preferred dosage is in the range of 0.01 mg to 100 mg, more preferably 0.01 mg to 50 mg, and even more preferably 0.01 mg to 10 mg per day.

[0178] Como se muestra en el Ejemplo 4, el silenciamiento de la expresión de MDL1AS resulta en una pérdida de potencia mitocondrial por parte del tumor lo que es positivo para los pacientes con cáncer, ya que se ha demostrado que la inhibición de la fosforilación oxidativa mitocondrial reduce significativamente la producción de metástasis (Davis et al. (2020)Transcriptional diversity and bioenergetic shift in human breast cancer metastasis revealed by single-cell RNA sequencing. Nat Cell Biol 22:310-320). Además, el silenciamiento también resulta en una disminución de la capacidad de proliferación de las células tumorales. En consecuencia, unnoveno aspectode la presente invención se refiere a un inhibidor de la expresión del lncRNA MDL1AS para su uso como medicamento.[0178] As shown in Example 4, silencing MDL1AS expression results in a loss of mitochondrial potency by the tumor, which is beneficial for cancer patients, since inhibition of mitochondrial oxidative phosphorylation has been shown to significantly reduce metastasis production (Davis et al. (2020) Transcriptional diversity and bioenergetic shift in human breast cancer metastasis revealed by single-cell RNA sequencing. Nat Cell Biol 22:310-320). Furthermore, silencing also results in a decrease in the proliferative capacity of tumor cells. Accordingly, a ninth aspect of the present invention relates to an inhibitor of MDL1AS lncRNA expression for use as a medicament.

[0180] El noveno aspecto de la invención se refiere también al uso de un inhibidor de la expresión del lncRNA MDL1AS para la preparación de un medicamento.[0180] The ninth aspect of the invention also relates to the use of an inhibitor of lncRNA MDL1AS expression for the preparation of a drug.

[0182] Más concretamente, undécimo aspectode la presente invención se refiere a un inhibidor de la expresión del lncRNA MDL1AS para su uso en el tratamiento de un cáncer o Alzheimer.[0182] More specifically, the eleventh aspect of the present invention relates to an inhibitor of the expression of lncRNA MDL1AS for use in the treatment of cancer or Alzheimer's disease.

[0184] Asimismo, el décimo aspecto de la invención se refiere al uso de un inhibidor de la expresión del lncRNA MDL1AS para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer o Alzheimer.[0184] Likewise, the tenth aspect of the invention relates to the use of an inhibitor of lncRNA MDL1AS expression for the preparation of a drug for the treatment of cancer or Alzheimer's disease.

[0185] Igualmente, el décimo aspecto de la invención se refiere a un método de tratamiento de un cáncer o de Alzheimer que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de la expresión de MDL1AS.[0185] Likewise, the tenth aspect of the invention relates to a method of treating cancer or Alzheimer's disease comprising administering a therapeutically effective amount of an inhibitor of MDL1AS expression.

[0187] En una realización particular del décimo aspecto de la invención, el cáncer es cáncer colorrectal, cáncer de laringe o cáncer de mama. Más particularmente, el cáncer colorrectal es adenocarcinoma de recto, cáncer de colon o cáncer de recto, y/o el cáncer de mama es cáncer de mama triple negativo.[0187] In a particular embodiment of the tenth aspect of the invention, the cancer is colorectal cancer, laryngeal cancer, or breast cancer. More particularly, the colorectal cancer is rectal adenocarcinoma, colon cancer, or rectal cancer, and/or the breast cancer is triple-negative breast cancer.

[0189] En otra realización particular del décimo aspecto de la invención, el cáncer es un cáncer en el que se sobreexpresa MDL1AS. En la presente invención, un cáncer en el que se sobreexpresa MDL1AS se refiere a un cáncer en el que la expresión de MDL1AS es mayor, preferentemente significativamente mayor, que la expresión de MDL1AS de una referencia. Más particularmente, se considera que es mayor cuando hay un aumento de la expresión de al menos el 30% o más, preferentemente al menos un 50% o más, con respecto a una referencia. La definición de referencia dada en el primer aspecto de la invención es aplicable a este aspecto.[0189] In another particular embodiment of the tenth aspect of the invention, cancer is a cancer in which MDL1AS is overexpressed. In the present invention, a cancer in which MDL1AS is overexpressed refers to a cancer in which the expression of MDL1AS is greater, preferably significantly greater, than the expression of MDL1AS in a reference. More particularly, it is considered to be greater when there is an increase in expression of at least 30% or more, preferably at least 50% or more, compared to a reference. The definition of reference given in the first aspect of the invention is applicable to this aspect.

[0191] En otra realización particular según una cualquiera de las realizaciones de los aspectos noveno y décimo de la invención, el inhibidor se selecciona del grupo formado por DsiRNA, shRNA, siRNA, miRNA, CRISPR, oligómero antisentido, oligonucleótido gápmero, TALEN, nucleasa con dedos de Zinc y combinaciones de los mismos. Preferentemente el inhibidor es un DsiRNA. Las definiciones dadas en el séptimo aspecto de la invención son aplicables a los aspectos noveno y décimo de la presente invención. Más preferentemente, el DsiRNA comprende o consiste al menos una secuencia seleccionada del grupo formado por las secuencias SEC ID Nº: 15 a SEC ID Nº: 20, que son los usados en los ejemplos y han demostrado un silenciamiento de aproximadamente el 70%. Más preferiblemente el DsiRNA comprende o consiste en SEC ID Nº: 15 y 16, o SEC ID Nº: 17 y 18, o SEC ID Nº: 19 y 20.[0191] In another particular embodiment according to any one of the embodiments of aspects nine and ten of the invention, the inhibitor is selected from the group consisting of dsiRNA, shRNA, siRNA, miRNA, CRISPR, antisense oligomer, gapmer oligonucleotide, TALEN, zinc finger nuclease, and combinations thereof. Preferably, the inhibitor is a dsiRNA. The definitions given in aspect seven of the invention are applicable to aspects nine and ten of the present invention. More preferably, the dsiRNA comprises or consists of at least one sequence selected from the group consisting of sequences SEC ID No. 15 to SEC ID No. 20, which are those used in the examples and have demonstrated approximately 70% silencing. More preferably, the dsiRNA comprises or consists of either SEC ID No. 15 and 16, or SEC ID No. 17 and 18, or SEC ID No. 19 and 20.

[0193] La cantidad terapéuticamente eficaz de inhibidor para la administración a un sujeto puede determinarse teniendo en cuenta factores como el tamaño y peso del sujeto, la extensión de la penetración de la enfermedad, la edad, la salud y el sexo del sujeto, la vía de administración y si la administración es regional o sistémica. Generalmente, una cantidad terapéuticamente eficaz comprende una concentración intracelular de aproximadamente 1 nanomolar (nM) a aproximadamente 100 nM, preferiblemente de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 50 nM.[0193] The therapeutically effective amount of inhibitor for administration to a subject can be determined by taking into account factors such as the subject's size and weight, the extent of disease penetration, the subject's age, health, and sex, the route of administration, and whether the administration is regional or systemic. Generally, a therapeutically effective amount comprises an intracellular concentration of approximately 1 nanomolar (nM) to approximately 100 nM, preferably from approximately 2 nM to approximately 50 nM.

[0194] En otra realización particular según una cualquiera de las realizaciones de los aspectos noveno y décimo de la invención el inhibidor está vehiculizado mediante liposomas, nanopartículas o nanocomplejos peptídicos. Ventajosamente, esto facilita la administración y asimilación del inhibidor.[0194] In another particular embodiment according to any one of the embodiments of aspects nine and ten of the invention, the inhibitor is delivered by means of liposomes, nanoparticles, or peptide nanocomplexes. Advantageously, this facilitates the administration and assimilation of the inhibitor.

[0196] Las definiciones dadas a lo largo de la presente memoria son aplicables a todos los aspectos de la presente invención.[0196] The definitions given throughout this document are applicable to all aspects of the present invention.

[0198] EJEMPLOS[0198] EXAMPLES

[0200] Los siguientes ejemplos tienen únicamente carácter ilustrativo de esta invención, y no deben ser interpretados en sentido limitativo de la misma.[0200] The following examples are for illustrative purposes only and should not be interpreted in a limiting sense.

[0202] Ejemplo 1. Puesta a punto del sistema bioinformático para analizar las muestras[0202] Example 1. Setting up the bioinformatics system to analyze the samples

[0204] Ya que la secuencia que codifica los lncRNAs MDL1 y MDL1AS está a caballo sobre el codón de iniciación de la replicación del DNA mitocondrial, no es posible utilizar el modelo estándar del genoma humano, que corta esta región en dos fragmentos (Fig.1A). Por ello, se utilizó el genoma mitocondrial modificado que describieron Gao y colaboradores (Gao et al. (2018)Two novel lncRNAs discovered in human mitochondrial DNA using PacBio fulllength transcriptome data. Mitochondrion 38:41-47) (Fig. 1B). A partir de esa secuencia modificada se usó la página MITOS2 webServer (http://mitos.bioinf.uni-leipzig.de/index.py) (Bernt et al. (2013)MITOS: improved de novo metazoan mitochondrial genome annotation. Mol Phylogenet Evol 69:313-319) para obtener la anotación del genoma mitocondrial. La expresión de los genes mitocondriales, incluidos los de los lncRNAs, se realizó siguiendo las técnicas indicadas por Dündar y colaboradores (Dündar et al. (2020)Introduction to differential gene expression analysis using RNA-seq. Zenodo 12:1-98). Las cuentas obtenidas para cada región se normalizaron mediante la técnica “Reads per kilobase per million mapped reads” (RPKM).[0204] Since the sequence encoding the lncRNAs MDL1 and MDL1AS straddles the mitochondrial DNA replication initiation codon, it is not possible to use the standard human genome model, which cuts this region into two fragments (Fig. 1A). Therefore, the modified mitochondrial genome described by Gao et al. (2018) Two novel lncRNAs discovered in human mitochondrial DNA using PacBio full-length transcriptome data. Mitochondrion 38:41-47) was used (Fig. 1B). From this modified sequence, the MITOS2 web server (http://mitos.bioinf.uni-leipzig.de/index.py) (Bernt et al. (2013) MITOS: improved de novo metazoan mitochondrial genome annotation. Mol Phylogenet Evol 69:313-319) was used to obtain the mitochondrial genome annotation. The expression of mitochondrial genes, including those of lncRNAs, was performed following the techniques described by Dündar et al. (2020) Introduction to differential gene expression analysis using RNA-seq. Zenodo 12:1-98). The counts obtained for each region were normalized using the Reads per kilobase per million mapped reads (RPKM) technique.

[0206] Ejemplo 2. Minería de datos[0206] Example 2. Data Mining

[0208] Las muestras de transcriptómica se obtuvieron a partir de la página delNational Center for Biotechnology Information(NCIB) buscando proyectos que tuvieran datos de transcriptómica comparando muestras tumorales o muestras de cerebros de pacientes Alzheimer frente a tejidos sanos. Una vez identificados los estudios relevantes, se descargaron los archivos fastq, que a continuación se alinearon con el genoma mitocondrial de referencia descrito más arriba.[0208] Transcriptomic samples were obtained from the National Center for Biotechnology Information (NCIB) website by searching for projects that had transcriptomic data comparing tumor samples or brain samples from Alzheimer's patients against healthy tissues. Once relevant studies were identified, the fastq files were downloaded and then aligned with the reference mitochondrial genome described above.

[0210] Los resultados se muestran en la Fig.2. Con esta tecnología se identificaron ciertos tumores (colon (A), recto (B)) que presentan una menor expresión de MDL1AS que los tejidos sanos, mientras que en otros tumores (mama (C) y laringe (D)) se observó una mayor expresión de MDL1AS (Fig.2). En todos los casos, la expresión de MDL1AS fue mayor que la de MDL1. En el cáncer de colon y de recto la expresión de MDL1AS en el tumor es significativamente menor que en los tejidos sanos. En los tumores de mama y laringe la expresión de este gen es significativamente mayor que en los tejidos sanos.[0210] The results are shown in Fig. 2. Using this technology, certain tumors (colon (A), rectum (B)) were identified that exhibited lower MDL1AS expression than healthy tissue, while other tumors (breast (C) and larynx (D)) showed higher MDL1AS expression (Fig. 2). In all cases, MDL1AS expression was higher than MDL1 expression. In colon and rectal cancer, MDL1AS expression in the tumor is significantly lower than in healthy tissue. In breast and laryngeal tumors, the expression of this gene is significantly higher than in healthy tissue.

[0212] En los pacientes de Alzheimer también se vio que los niveles de MDL1AS aumentan significativamente en comparación con las muestras de cerebros sanos de sujetos de la misma edad (Fig.3).[0212] In Alzheimer's patients, MDL1AS levels were also found to be significantly increased compared to healthy brain samples from subjects of the same age (Fig.3).

[0214] Ejemplo 3. Estudio de supervivencia en pacientes de adenocarcinoma de recto tratados con quimio-radioterapia coadyuvante.[0214] Example 3. Survival study in patients with rectal adenocarcinoma treated with adjuvant chemo-radiotherapy.

[0216] Se revisaron todos los casos de adenocarcinoma de recto diagnosticados y tratados en el Hospital San Pedro de Logroño y en el Hospital de Calahorra (La Rioja, España) entre los años 1998 y 2017 de los que se conservaban bloques de parafina. La recogida del material se hizo de acuerdo con la legislación vigente (Ley 14/2007 de 3 de julio de Investigación Biomédica) y tras aprobación por el Comité Ético local (CEICLAR, código PI-129). Las características clínicas de los pacientes (n=69), divididos según su expresión (alta o baja calculada según el índice de Youden que resulta en un nivel de corte = 1980 unidades) del gen MDL1AS, aparecen en la Tabla 1. Sorprendentemente, sólo la expresión de los dos lncRNAs MDL1AS y MDL1 es significativamente diferente entre los grupos. Otros marcadores típicamente utilizados, como KRAS mutado, ser fumador, etc., no muestras diferencias significativas. Esto sugiere que estos lncRNAs son marcadores independientes de otros marcadores y se pueden usar en combinación con dichos otros marcadores consiguiéndose así una información más fiable.[0216] All cases of rectal adenocarcinoma diagnosed and treated at San Pedro Hospital in Logroño and Calahorra Hospital (La Rioja, Spain) between 1998 and 2017 for which paraffin blocks were preserved were reviewed. Material collection was carried out in accordance with current legislation (Law 14/2007 of July 3, on Biomedical Research) and after approval by the local Ethics Committee (CEICLAR, code PI-129). The clinical characteristics of the patients (n=69), divided according to their expression (high or low, calculated using the Youden index, resulting in a cutoff level of 1980 units) of the MDL1AS gene, are shown in Table 1. Surprisingly, only the expression of the two lncRNAs MDL1AS and MDL1 was significantly different between the groups. Other commonly used markers, such as mutated KRAS, smoking status, etc., did not show significant differences. This suggests that these lncRNAs are markers independent of other markers and can be used in combination with such other markers, thus obtaining more reliable information.

[0218] Tabla 1. Características clínicas de los 69 pacientes estudiados, divididos entre los que tienen una alta o baja expresión del gen MDL1AS.[0218] Table 1. Clinical characteristics of the 69 patients studied, divided between those with high or low expression of the MDL1AS gene.

[0220] [0220]

[0221] [0221]

[0224] Se realizaron uno o dos cortes de 4 μm cada uno de los bloques de parafina en condiciones libres de RNAsas. A partir de este material se purificó el RNA utilizando el High Pure FFPET RNA Isolation Kit (Roche). La calidad del RNA se analizó con el sistema de electroforesis automático Experion (BioRad) y el RNA que pasó los controles de calidad fue sometido a transcripción inversa utilizando los kits específicos de la casa Illumina. Posteriormente, el cDNA obtenido fue sometido a NGS (Next Generation Sequencing) utilizando los protocolos de Illumina y la plataforma Genome Analyzer IIx (Illumina), siguiendo la metodología publicada por Larrayoz et al. 2014 (Larrayoz et al. (2014)Transcriptomic profiling explains racial disparities in pterygium patients treated with doxycycline. Invest Ophthalmol Vis Sci 55:7553-7561).[0224] One or two 4 μm sections were cut from each paraffin block under RNase-free conditions. RNA was purified from this material using the High Pure FFPET RNA Isolation Kit (Roche). RNA quality was analyzed using the Experion automated electrophoresis system (BioRad), and RNA that passed quality control was reverse transcribed using Illumina's proprietary kits. Subsequently, the resulting cDNA was subjected to Next Generation Sequencing (NGS) using Illumina protocols and the Genome Analyzer IIx platform (Illumina), following the methodology published by Larrayoz et al. 2014 (Larrayoz et al. (2014) Transcriptomic profiling explains racial disparities in pterygium patients treated with doxycycline. Invest Ophthalmol Vis Sci 55:7553-7561).

[0226] El análisis de los ficheros fastq y la alineación con el genoma mitocondrial de referencia fue idéntico al descrito en el ejemplo anterior. Las curvas de supervivencia se realizaron según el método de Kaplan-Meier y se analizaron con los tests log-rank y de Cox. Además, se construyeron curvas ROC para evaluar la capacidad discriminativa de este biomarcador. El análisis de los resultados indicó que la capacidad pronóstica de los niveles de expresión de MDL1AS mediante curvas de supervivencia para pacientes de adenocarcinoma de recto con niveles altos (>1980 unidades, línea negra “a”) y bajos (<1980 unidades, línea gris “b”) del lncRNA según el índice de Youden (A). Claramente, los pacientes con niveles altos tienen un pronóstico mucho mejor que los que mostraron niveles más bajos (p=0,007, test de Mantel-Cox) (Fig.4A).[0226] The analysis of the fastq files and alignment with the reference mitochondrial genome was identical to that described in the previous example. Survival curves were generated using the Kaplan-Meier method and analyzed with the log-rank and Cox tests. ROC curves were also constructed to assess the discriminative capacity of this biomarker. The analysis of the results indicated that the prognostic capacity of MDL1AS expression levels, as measured by survival curves, was significant for rectal adenocarcinoma patients with high (>1980 units, black line “a”) and low (<1980 units, gray line “b”) levels of lncRNA, according to the Youden index (A). Clearly, patients with high levels had a much better prognosis than those with lower levels (p=0.007, Mantel-Cox test) (Fig. 4A).

[0228] Cuando se estableció un nivel de corte (1980 unidades) para la expresión de MDL1AS y se calculó el número de falsos positivos y falsos negativos (curva ROC), se obtuvo un valor de AUC = 0,930 (p<0,0001), con una especificidad de 100% y una sensibilidad de 92,6% (Fig. 4B).[0228] When a cutoff level (1980 units) was established for MDL1AS expression and the number of false positives and false negatives was calculated (ROC curve), an AUC value of 0.930 (p<0.0001) was obtained, with a specificity of 100% and a sensitivity of 92.6% (Fig. 4B).

[0229] Se realizó el mismo análisis para MDL1 y se obtuvo una capacidad predictiva algo inferior a la presentada por MDL1AS (punto de corte= 2382 unidades según índice de Youden, p=0,040 test de Mantel-Cox, AUC=0,820 (p<0,0001), especificidad de 100% y una sensibilidad de 79,17%) (Fig.5A y 5B).[0229] The same analysis was performed for MDL1 and a slightly lower predictive capacity was obtained than that presented by MDL1AS (cutoff point= 2382 units according to Youden index, p=0.040 Mantel-Cox test, AUC=0.820 (p<0.0001), specificity of 100% and a sensitivity of 79.17%) (Fig.5A and 5B).

[0231] Estos resultados establecen los niveles de MDL1AS y MDL1 como predictores excelentes para la prognosis del cáncer colorrectal, en particular del adenocarcinoma de recto tratado con quimio-radioterapia coadyuvante.[0231] These results establish MDL1AS and MDL1 levels as excellent predictors for colorectal cancer prognosis, particularly for rectal adenocarcinoma treated with adjuvant chemo-radiotherapy.

[0233] Ejemplo 4. Efectos del silenciamiento del lncRNA MDL1AS.[0233] Example 4. Effects of MDL1AS lncRNA silencing.

[0235] Para entender mejor las funciones del lncRNA en la célula y poner a punto una posible técnica de terapia basada en la regulación de este gen, se procedió a silenciar la expresión del gen MDL1AS con la tecnología de RNA de interferencia de doble hebra (DsiRNA) en líneas celulares de cáncer. Para ello se diseñaron los siguientes fragmentos de RNA de interferencia (Tabla 2):[0235] To better understand the functions of lncRNA in the cell and to develop a potential therapy technique based on the regulation of this gene, the expression of the MDL1AS gene was silenced using double-stranded RNA interference (DsiRNA) technology in cancer cell lines. The following RNA interference fragments were designed for this purpose (Table 2):

[0237] Tabla 2. Secuencias empleadas para silenciar la expresión de MDL1AS (U se representa como T en el listado de secuencias, de acuerdo a la Norma ST.26).[0237] Table 2. Sequences used to silence the expression of MDL1AS (U is represented as T in the sequence list, according to Standard ST.26).

[0239] [0239]

[0242] Como células de cáncer modelo, se emplearon líneas celulares humanas de carcinoma colorrectal (HCT-116) y de carcinoma de mama triple negativo (MDA-MB-231). Las células fueron cultivadas en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS). Estas células se sembraron en una placa de 6 pocillos con una densidad de 100.000-150.000 células/pocillo y se les añadió 200µl de la mezcla de medio sin suero con lipofectamina y DsiRNA (10 nM) a cada pocillo. A distintos tiempos (24, 48, 72 h) se extrajo el RNA total de las células disolviéndolas en 0,5 ml de Trizol y siguiendo las instrucciones del kit Micro de Quiagen. A partir del ARN obtenido, se sintetizó el cDNA con el kit SuperMix que contiene la transcriptasa inversa SuperScript™ III. Al final del proceso se añadió 1µl deRNase Ha cada muestra para liberar la hebra de cDNA.[0242] Human colorectal carcinoma (HCT-116) and triple-negative breast carcinoma (MDA-MB-231) cell lines were used as model cancer cells. The cells were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS). These cells were seeded in a 6-well plate at a density of 100,000–150,000 cells/well, and 200 µl of the serum-free medium mixture containing lipofectamine and DsiRNA (10 nM) was added to each well. Total RNA was extracted from the cells at different time points (24, 48, 72 h) by dissolving them in 0.5 ml of Trizol, following the instructions in the Quiagen Micro kit. cDNA was synthesized from the obtained RNA using the SuperMix kit, which contains the SuperScript™ III reverse transcriptase. At the end of the process, 1µl of RNase Ha was added to each sample to release the cDNA strand.

[0244] El cDNA se cuantificó mediante la técnica de PCR cuantitativa a tiempo real (qRT-PCR) siguiendo protocolos ya publicados (Larrayoz et al. (2016)Cold Shock Proteins Are Expressed in the Retina Following Exposure to Low Temperatures. PLoS One 11:e0161458) en un instrumento QuantStudio 5 real-Time PCR (Applied Biosystems) con los cebadores indicados en la Tabla 3, siendo el "cebador directo" el cebador que se extiende en la PCR desde el codón de iniciación hacia el codón de detención del ADN molde; y el “cebador inverso" es el cebador que se extiende desde el codón de detención hacia el codón de iniciación del ADN molde.[0244] cDNA was quantified using quantitative real-time PCR (qRT-PCR) following previously published protocols (Larrayoz et al. (2016) Cold Shock Proteins Are Expressed in the Retina Following Exposure to Low Temperatures. PLoS One 11:e0161458) on a QuantStudio 5 real-Time PCR instrument (Applied Biosystems) with the primers indicated in Table 3, the "forward primer" being the primer that extends in the PCR from the start codon to the stop codon of the template DNA; and the "reverse primer" is the primer that extends from the stop codon to the start codon of the template DNA.

[0246] Tabla 3. Cebadores utilizados para cuantificar los genes de interés mediante qRT-PCR.[0246] Table 3. Primers used to quantify the genes of interest by qRT-PCR.

[0248] [0248]

[0251] Todos los DsiRNAs ensayados redujeron la expresión de MDL1AS. El DsiRNA MDL1AS.3 (SEC ID Nº: 19 y 20) resultó ser el más eficaz a la hora de silenciar la expresión del gen MDL1AS, consiguiendo reducir esta expresión en aproximadamente un 70 % (Fig. 6). Además, MDL1 y otros genes mitocondriales no cambiaron su expresión, indicando que el silenciamiento fue muy específico (Fig.6 y datos no mostrados).[0251] All the tested dsiRNAs reduced MDL1AS expression. The dsiRNA MDL1AS.3 (SEC ID Nos. 19 and 20) proved to be the most effective at silencing MDL1AS gene expression, achieving a reduction of approximately 70% (Fig. 6). Furthermore, MDL1 and other mitochondrial genes did not change their expression, indicating that the silencing was highly specific (Fig. 6 and data not shown).

[0252] El lncRNA MDL1AS se encuentra en la mitocondria, por lo que se estudió el impacto de silenciar esta molécula sobre el metabolismo mitocondrial ya que se ha demostrado que la inhibición de la fosforilación oxidativa mitocondrial reduce significativamente la producción de metástasis (Davis et al. (2020)Transcriptional diversity and bioenergetic shift in human breast cancer metastasis revealed by single-cell RNA sequencing. Nat Cell Biol 22:310-320). Se analizó el impacto del silenciamiento en líneas celulares humanas de carcinoma de mama triple negativo (MDA-MB-231, Figura 7) y de carcinoma colorrectal (HCT-116, Figura 8).[0252] The lncRNA MDL1AS is located in the mitochondria, so the impact of silencing this molecule on mitochondrial metabolism was studied since inhibition of mitochondrial oxidative phosphorylation has been shown to significantly reduce metastasis production (Davis et al. (2020) Transcriptional diversity and bioenergetic shift in human breast cancer metastasis revealed by single-cell RNA sequencing. Nat Cell Biol 22:310-320). The impact of silencing was analyzed in human triple-negative breast carcinoma (MDA-MB-231, Figure 7) and colorectal carcinoma (HCT-116, Figure 8) cell lines.

[0254] Para ello, se utilizó el equipo SeahorseXF24 (Agilent) siguiendo protocolos publicados (Plitzko and Loesgen (2018)Measurement of Oxygen Consumption Rate (OCR) and Extracellular Acidification Rate (ECAR) in Culture Cells for Assessment of the Energy Metabolism. Bio Protoc 8:e2850). Las células se sembraron a una densidad de 30.000-40.000 células por pocillo. Una hora antes del análisis, las células se incubaron en una atmósfera sin CO<2>, se retiró el medio de cultivo que se cambió por medio de ensayo y las placas se introdujeron en el aparato, donde se iniciaron las lecturas (de consumo de oxígeno y de acidificación extracelular) y se añadieron los inhibidores que permiten caracterizar los distintos aspectos del metabolismo (1,5 µM oligomicina, 0,5 µM rotenona/antimicina A y 0,5 µM carbonilcianuro p-trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP) (Fig. 7A y 8A). Como se puede ver en las Figuras 7 y 8, el silenciamiento del gen MDL1AS produjo una reducción muy significativa (p<0,0001) en distintos aspectos de la respiración mitocondrial, tales como la respiración basal (Fig. 7B y 8B), la respiración máxima (Fig. 7C y 8C) y la producción de ATP (Fig. 7D y 8D), mientras que no produjo cambios significativos en el oxígeno no consumido por la mitocondria, los protones fugados, la capacidad respiratoria de reserva, o la eficacia de acoplamiento (Fig. 7A y 8A). Todo ello indica una pérdida importante en la capacidad de respiración y de producción de ATP en las mitocondrias tumorales con niveles bajos de MDL1AS y, por lo tanto, una pérdida en la vitalidad de las células tumorales, soportando así el uso de la inhibición de la expresión de MDL1AS para el tratamiento de cáncer.[0254] For this purpose, the SeahorseXF24 instrument (Agilent) was used following published protocols (Plitzko and Loesgen (2018) Measurement of Oxygen Consumption Rate (OCR) and Extracellular Acidification Rate (ECAR) in Culture Cells for Assessment of the Energy Metabolism. Bio Protoc 8:e2850). The cells were seeded at a density of 30,000-40,000 cells per well. One hour before analysis, the cells were incubated in a CO₂-free atmosphere, the culture medium was removed and replaced with assay medium, and the plates were placed in the instrument, where readings (of oxygen consumption and extracellular acidification) were initiated. Inhibitors were then added to characterize the different aspects of metabolism (1.5 µM oligomycin, 0.5 µM rotenone/antimycin A, and 0.5 µM p-trifluoromethoxyphenylhydrazone carbonylcyanide (FCCP)) (Figs. 7A and 8A). As can be seen in Figures 7 and 8, silencing the MDL1AS gene resulted in a highly significant reduction (p<0.0001) in various aspects of mitochondrial respiration, such as basal respiration (Figs. 7B and 8B), maximal respiration (Figs. 7C and 8C), and ATP production (Figs. 7D and 8D), while which did not produce significant changes in unconsumed mitochondrial oxygen, leaked protons, respiratory reserve capacity, or docking efficiency (Figs. 7A and 8A). All of this indicates a significant loss in respiration capacity and ATP production in tumor mitochondria with low levels of MDL1AS and, therefore, a loss in tumor cell viability, thus supporting the use of MDL1AS expression inhibition for cancer treatment.

[0256] Por último, se comparó el crecimiento de las células HCT-116 silenciadas con el DsiRNA MDL1AS.3 (DsiRNA) con las mismas células sin silenciar (control) mediante la técnica de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT). Brevemente, las células se sembraron en placas de 96 pocillos con una densidad de 3.000 células por pocillo. Al cabo de 24, 48, 72 y 96 horas, se añadió 15 µl de CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega) por pocillo y, tras 4 horas de incubación, se leyó la absorbancia a 490 nm con un lector de placas (POLARstar Omega, BMG Labtech). Como se puede ver en la Figura 9, las células silenciadas de carcinoma colorrectal tienen muy reducidas sus capacidades de crecimiento (p<0,0001). Este resultado soporta adicionalmente el uso de la inhibición de la expresión de MDL1AS para el tratamiento de cáncer.[0256] Finally, the growth of HCT-116 cells silenced with the dsiRNA MDL1AS.3 (dsiRNA) was compared with the same unsilenced cells (control) using the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium (MTT) bromide assay. Briefly, the cells were seeded in 96-well plates at a density of 3,000 cells per well. After 24, 48, 72, and 96 hours, 15 µl of CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega) was added to each well, and after 4 hours of incubation, the absorbance was read at 490 nm using a plate reader (POLARstar Omega, BMG Labtech). As can be seen in Figure 9, silenced colorectal carcinoma cells have significantly reduced growth capabilities (p<0.0001). This result further supports the use of MDL1AS expression inhibition for cancer treatment.

Claims (7)

1. REIVINDICACIONES1. CLAIMS 1. Método in vitro para el pronóstico de la supervivencia de un sujeto que padece cáncer colorrectal que comprende las siguientes etapas:1. In vitro method for predicting the survival of a subject suffering from colorectal cancer comprising the following steps: a) determinar el nivel de expresión de lncRNA MDL1AS y/o lncRNA MDL1 en una muestra tomada de dicho sujeto;a) determine the expression level of lncRNA MDL1AS and/or lncRNA MDL1 in a sample taken from said subject; b) comparar el nivel de expresión determinado en la etapa a) con una referencia consistente en un valor de corte de 1980 unidades para MDL1AS y 2382 unidades para MDL1, calculado según el índice de Youden;b) compare the level of expression determined in step a) with a reference consisting of a cutoff value of 1980 units for MDL1AS and 2382 units for MDL1, calculated according to the Youden index; donde un nivel de expresión igual o superior a dicha referencia es indicativo de un pronóstico positivo y un nivel de expresión inferior a dicha referencia es indicativo de un pronóstico negativo.where an expression level equal to or greater than said reference is indicative of a positive prognosis and an expression level lower than said reference is indicative of a negative prognosis. 2. Método según la reivindicación 1, donde el cáncer colorrectal es adenocarcinoma de recto.2. Method according to claim 1, wherein colorectal cancer is adenocarcinoma of the rectum. 3. Método según las reivindicaciones 1 o 2, donde el sujeto ha sido tratado con quimioradioterapia coadyuvante.3. Method according to claim 1 or 2, wherein the subject has been treated with adjuvant chemoradiotherapy. 4. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 3, donde la muestra es una biopsia sólida, una necropsia, una biopsia líquida, sangre, un derivado de la sangre, o líquido cefalorraquídeo.4. Method according to any of claims 1 to 3 above, wherein the sample is a solid biopsy, a necropsy, a liquid biopsy, blood, a blood derivative, or cerebrospinal fluid. 5. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 4, donde la determinación del nivel de expresión de lncRNA MDL1AS y/o lcnRNA MDL1 se lleva a cabo mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa, PCR cuantitativa a tiempo real (qRT-PCR),Northem Blot, o secuenciación masiva, preferiblemente mediante secuenciación masiva.5. Method according to any of claims 1 to 4 above, wherein the determination of the expression level of lncRNA MDL1AS and/or lcnRNA MDL1 is carried out by quantitative polymerase chain reaction (PCR), quantitative real-time PCR (qRT-PCR), Northern Blot, or massive sequencing, preferably by massive sequencing. 6. Uso del nivel de expresión de lncRNA MDL1AS y/o lncRNA MDL1 como marcador para el pronóstico in vitro del cáncer colorrectal, de manera independiente y complementaria con otros marcadores.6. Use of the expression level of lncRNA MDL1AS and/or lncRNA MDL1 as a marker for in vitro prognosis of colorectal cancer, independently and complementarily with other markers. 7. Uso según la reivindicación 6, donde el cáncer colorrectal se selecciona de adenocarcinoma de recto, cáncer de colon y cáncer de recto.7. Use according to claim 6, wherein colorectal cancer is selected from rectal adenocarcinoma, colon cancer, and rectal cancer.
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