ES2994965B2 - Metodo de conversion de gases para la produccion de una combinacion de carotenoides y lipidos - Google Patents

Abstract

Método de conversión de gases para la producción de una combinación de carotenoides y lípidos. La presente invención se refiere a un procedimiento de producción de carotenoides, lípidos o una combinación de carotenoides y lípidos a partir de gases o mezclas de gases, mediante un proceso de fermentación en dos etapas, con fermentación de gases en ácidos en la primera etapa en un primer reactor y posterior bioconversión de estos ácidos en carotenoides, lípidos o una combinación de carotenoides y lípidos en un segundo reactor.

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0004] MÉTODO DE CONVERSIÓN DE GASES PARA LA PRODUCCIÓN DE UNA

[0005] COMBINACIÓN DE CAROTENOIDES Y LÍPIDOS

[0007] SECTOR DE LA TÉCNICA

[0009] La presente invención se refiere a un procedimiento de bioconversión de gases en carotenoides, lípidos o una combinación de carotenoides y lípidos, en biorreactores. Por tanto, se encuadra dentro del sector de la industria química y, particularmente, en la industria alimentaria y nutricional o en la industria cosmética o el sector industrial de producción de combustible.

[0011] ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0013] Los carotenoides son compuestos que se utilizan en varias industrias y tienen varias aplicaciones, por ejemplo, como complementos alimenticios, compuestos nutracéuticos, colorantes, pigmentos, o en la industria cosmética. Son antioxidantes, por lo que también se considera que podrían reducir ciertas enfermedades.

[0015] Existen dos tipos de carotenoides, los carotenos y las xantofilas. El β-caroteno tiene un especial interés ya que es un potente precursor de la vitamina A. Una de las vías de producción de carotenoides es mediante síntesis química, aunque el consumidor prefiere alternativas más naturales que están también en vía de desarrollo. En este sentido, estos compuestos se encuentran también en plantas y los sintetizan algas, así como algunas bacterias y levaduras. Las plantas, a diferencia de la mayoría de los microorganismos, necesitan extensas superficies para su cultivo y se suelen caracterizar por un crecimiento lento y estacional. En este sentido los microorganismos, como las bacterias y las levaduras, no presentan estos inconvenientes.

[0017] Los lípidos se pueden utilizar en industrias alimentarias y como biocombustibles, entre otras aplicaciones. Al igual que los carotenoides, se encuentran también en plantas y se pueden extraer de ellas, pero su comercialización a partir de estas últimas presenta las mismas desventajas que para los carotenoides. Otra alternativa consiste en producirlos con microorganismos, por ejemplo, bacterias o levaduras oleaginosas. Los carotenoides son compuestos lipo-solubles e hidrófobos, al igual que los lípidos y a menudo, los suelen sintetizar microorganismos oleaginosos. Independientemente de su origen, plantas o microrganismos, en general, la composición de estos lípidos es bastante parecida.

[0019] Otras de las ventajas de los microorganismos para la producción de carotenoides y lípidos, comparado con la vía sintética o con su extracción de plantas, es que pueden metabolizar contaminantes, lo que permite valorizarlos, por ejemplo, residuos agroindustriales, aguas residuales, o algunas emisiones industriales. Además, tienen tasas de crecimiento elevadas y pueden alcanzar altas densidades celulares.

[0021] Los sustratos más comunes para el cultivo de bacterias y levaduras oleaginosas son carbohidratos cómo, por ejemplo, la glucosa. Sin embargo, estas fuentes de carbono no son las más interesantes desde un punto de vista económico y medioambiental. Otra opción consiste en producirlos a partir de sustratos más atractivos como pueden ser los ácidos carboxílicos o incluso a partir de gases contaminantes como el CO<2>, o a partir del gas de síntesis.

[0023] El CO<2>y el CO son contaminantes que preocupan cada vez más, sobre todo en el caso del CO<2>, por su efecto sobre el calentamiento global y el cambio climático. A parte de la aprobación de normativas nacionales e internacionales que exigen una paulatina reducción de estas emisiones, existe la posibilidad de valorizar estos gases y considerarlos como un recurso en vez de tratarlos simplemente como contaminantes a eliminar. Los procesos de valorización de CO<2>y CO se pueden también aplicar al gas de síntesis, ya que, dependiendo de las condiciones de gasificación, el gas de síntesis contiene estos mismos gases, además de H<2>, en proporciones variables. Una de las vías de obtención del gas de síntesis es mediante la gasificación de residuos o de otros contaminantes, lo cual resulta también en un beneficio medioambiental. En este sentido, ya existen algunos procesos que permiten aprovechar el CO<2>, el CO, y el gas de síntesis para su conversión catalítica o su bioconversión en productos de interés industrial. En el caso de los bioprocesos conviene ampliar la gama de productos que se pueden obtener por bioconversión, lo cual representa uno de los objetivos de esta invención.

[0025] También se conocen en el estado de la técnica documentos de patente donde se describen procedimientos de obtención de carotenoides o de lípidos a partir de gases o mezclas de gases, mediante un proceso de fermentación, aunque no existe ningún estudio previo de conversión de gases, como el CO<2>y el CO, en ácidos carboxílicos (por ejemplo, ácido acético), y su posterior conversión en carotenoides.

[0027] El documento US2014141477A1 hace referencia a métodos y sistemas para la producción de productos lipídicos a partir de un sustrato gaseoso utilizando un proceso de fermentación en dos etapas. El método comprende proporcionar un sustrato gaseoso que comprende CO, CO<2>y H<2>o mezclas de los mismos, a un primer biorreactor que contiene un cultivo de uno o más microorganismos comoAcetobacterium, Moorella, Clostridium, Pyrococcus, Eubacterium, Desulfobacterium, Carboxydothermus Acetogenium, Acetoanaerobium, Butyribacterium, Peptostreptococcus, Ruminococcus, Oxobacter y Metanosarcina, y fermentar el sustrato para producir un producto que comprende acetato. El acetato del primer biorreactor luego se proporciona a un segundo biorreactor, donde se usa como sustrato para la fermentación de lípidos por una o más levaduras como sonCryptococcus, Candida, Lipomyces, Rhodosporidium, Saccharomyces y Yarrowia. No obstante, este sistema no contempla la obtención de carotenoides que, a día de hoy, en el caso de los bioprocesos, se obtienen principalmente a partir de sustratos cómo la glucosa, u otros similares, con un coste económico relativamente elevado, mientras que su obtención a partir de ácidos carboxílicos (acetato, pero también ácidos de cadenas más largas) es más novedoso, más económico y más sostenible y no existe ningún estudio previo que describa la obtención de estos carotenoides a partir de ácidos producidos como resultado de la valorización de gases como el CO<2>.

[0029] El documento US2014154755A1 divulga una invención similar a la anterior donde la segunda fermentación se lleva a cabo por una microalga comoChlorella, Chlamamydomonas, Dunaliella, Euglena, Parvum, Tetraselmis, Porphyridium, Spirulina, Synechoccus, Anabaena, Schizochytrium, Botyrococcus, Fucus, Parachlorella, Pseudochlorella, Brateococcus, Prototheca and Scenedesmus. Cabe señalar que este sistema sólo aborda la producción de lípidos y las características de las algas, comparado con las levaduras que se utilizan en esta solicitud de patente, son bastante distintas. Por ejemplo, las algas suelen necesitar luz (implicando un coste adicional) para su crecimiento o actividad, lo cuál no es el caso para las levaduras, y, por lo tanto, necesitan configuraciones de reactores y modos de operación muy distintos. Además, las algas suelen crecer y metabolizar el CO<2>en condiciones aerobias, mientras que, en la invención que se propone en esta solicitud de patente, la valorización de gases (por ejemplo, CO<2>) se hace con bacterias anaerobias.

[0031] El documento WO2018048382A1 presenta un método de conversión integrado que comprende un sistema de dos etapas. En la primera etapa un biorreactor anaerobio convierte mezclas de gases de CO<2>y CO o H<2>en ácido acético utilizando el acetógeno anaerobioMoorella thermoacetica. El ácido acético se alimenta como sustrato a un segundo biorreactor, donde se convierte aeróbicamente en lípidos mediante una levadura oleaginosaYarrowia lipolytica. Primero se describe el proceso llevado a cabo en cada reactor y luego se presenta un sistema integrado que produce aceite microbiano utilizando gas de síntesis como insumo. El sistema de reactor integrado produjo 18 g/L de triacilglicéridos C16-C18 directamente del gas de síntesis. Sin embargo, esta solicitud de patente internacional no describe ni sugiere la producción de carotenoides, ni tampoco considera otros ácidos a parte del acetato, o mezclas de estos, cómo los ácidos butírico o caproico, por ejemplo.

[0033] El documentoCecilia Naveira-Pazos, María C. Veiga, Christian Kennes. Accumulation of lipids by the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica grown on carboxylic acids simulating syngas and carbon dioxide fermentation. Bioresource Technology. Volume 360, September 2022, 127649demuestra que una mezcla de ácidos grasos volátiles puede usarse en una segunda fermentación aerobia con la levaduraYarrowia lipolyticapara obtener lípidos como precursores de biodiesel. En los experimentos se demostró la preferencia de la levadura nativaYarrowia lipolyticaW29 por el ácido acético sobre los ácidos butírico y caproico, alcanzando la mayor tasa de consumo de 0.664 g/L·h. Los ácidos oleico, linoleico y palmítico representan alrededor del 80 % de los ácidos grasos de los lípidos formados en el proceso, lo que los hace aptos para biodiésel. Cabe señalar que la cepa inoculada en el sistema descrito en esta publicación no es capaz de producir carotenoides.

[0035] El documento WO2022171860A1 divulga un proceso de fermentación conYarrowia lipolyticaen un biorreactor agregando al medio de cultivo ácido fórmico y un azúcar. En una realización, el proceso comprende capturar CO<2>del biorreactor, reducir el CO<2>a ácido fórmico en una unidad de reducción y alimentar al menos una parte del ácido fórmico desde la unidad de reducción al biorreactor. Entre los compuestos producidos en el proceso se encuentran, lípidos, carotenoides, tales como β-caroteno, retinoides o vitaminas. No obstante, este documento no describe ni sugiere producción de carotenoides ni la producción simultánea de carotenoides y lípidos a partir de ácidos carboxílicos como los ácidos acético, butírico, caproico obtenidos mediante fermentación acetogénica de gases. En este documento se requiere además el uso de dos sustratos y de una mezcla de ácido fórmico y glucosa. Los azúcares, como la glucosa, se suelen considerar más costosos que los ácidos.

[0037] Por ende, se identifica una necesidad de desarrollar métodos alternativos a los protocolos convencionales, más económicos y sostenibles, donde se produzcan simultáneamente carotenoides y lípidos o la producción exclusiva de carotenoides a partir de ácidos carboxílicos producidos como resultado de la valorización de gases con un rendimiento elevado y de manera sostenible, en comparación con las técnicas preexistentes.

[0039] DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

[0041] BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

[0043] El objeto de la presente invención es un método de obtención de carotenoides, lípidos o una combinación de carotenoides y lípidos, que comprende:

[0044] (a) administrar un sustrato gaseoso en un primer reactor que comprende un primer caldo de fermentación, donde el primer caldo de fermentación comprende una cantidad de 2% a 20% de al menos un primer microorganismo en un medio líquido de cultivo, a una temperatura comprendida entre 30 a 38ºC, a un pH comprendido entre 6 a 9, y fermentare el sustrato gaseoso mediante el al menos primer organismo para producir un producto intermedio que comprende al menos un ácido carboxílico,

[0045] (b) pasar el producto intermediario desde el primer reactor a un segundo reactor y (c) administrar el producto intermediario en un segundo reactor que comprende un segundo caldo de fermentación, donde el segundo caldo de fermentación comprende una cantidad de 1% a 10% de al menos un segundo microorganismo en un medio líquido de cultivo a una temperatura comprendida entre 28 a 35ºC, a un pH comprendido entre 4 a 10, y fermentar mediante el segundo microorganismo el producto intermediario para producir carotenoides, lípidos o combinación de los anteriores.

[0047] DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0049] Para complementar la descripción que se está realizando y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las características de la invención, se acompaña como parte integrante de dicha descripción, un juego de dibujos en donde, con carácter ilustrativo y no limitativo, se ha representado lo siguiente:

[0051] Figura 1. Esquema de configuración de los dos reactores, para la fermentación de gases (R1, reactor 1) y la fermentación de ácidos (R2, reactor 2) en carotenoides y lípidos. (A)-Reactores discontinuos (batch) (para la fase líquida), (B)-Reactores continuos, (C)- Reactores continuos con concentración de ácidos entre la primera y la segunda etapa, (D)-Reactores continuos con recirculación de efluentes del segundo reactor al primer reactor, después de separar la biomasa. Referencias: 1: Entrada de gases; 2: Salida de gases; 3: Medio de la fermentación anaerobia; 4: Biomasa; 5: Medio de la fermentación aerobia; 6: Ácidos concentrados de R1; 7: Recirculación.

[0053] Figura 2. Producción de ácido acético en la fermentación de gases porClostridium aceticumen el primer reactor.

[0055] Figura 3. Consumo de ácido acético por la levaduraYarrowia lipolytica, a pH 8, en el medio deClostridium aceticum. Se pueden también observar las dos adiciones, posteriores, de ácido.

[0057] Figura 4. Perfil de producción de β-caroteno a lo largo de la fermentación a pH 8,0, en el medio deClostridium aceticum.

[0059] Figura 5. Distribución de lípidos, de acuerdo con su abundancia en la célula (%), al final de la fermentación a pH 8,0, en el medio deClostridium aceticum.

[0061] Figura 6. Consumo de ácido acético por la levaduraYarrowia lipolytica, a pH 6,0, en el medio deClostridium aceticum. Se pueden también observar las dos adiciones, posteriores, de ácido.

[0063] Figura 7. Perfil de producción de β-caroteno a lo largo de la fermentación a pH 6,0, en el medio deClostridium aceticum.

[0065] Figura 8. Distribución de lípidos, de acuerdo con su abundancia en la célula (%), al final de la fermentación a pH 6,0, en el medio deClostridium aceticum.

[0066] Figura 9. Consumo de ácido acético por la levaduraYarrowia lipolytica, a pH 6,0, en el medio deClostridium carboxidivorans. Se pueden también observar las dos adiciones, posteriores, de ácido

[0068] Figura 10. Distribución de lípidos, de acuerdo con su abundancia en la célula (%), al final de la fermentación a pH 6,0, en el medio deClostridium carboxidivorans.

[0070] Figura 11. Consumo de distintas concentraciones de ácidos carboxilos (mezclas de ácidos acético y butírico en cada botella) por la levadura productora de carotenoides y lípidos.

[0072] DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0074] Tras numerosas investigaciones, los inventores han desarrollado un método de producción de carotenoides, y en unas realizaciones preferidas es un método de producción de una combinación de carotenoides y lípidos.

[0076] Es, por tanto, objeto de la presente invención un método para conversión de un sustrato gaseoso en carotenoides, lípidos o una combinación de carotenoides y lípidos, que comprende:

[0077] (a) administrar un sustrato gaseoso en un primer reactor que comprende un primer caldo de fermentación, donde el primer caldo de fermentación comprende una cantidad de 2% a 20% (v/v) de al menos un primer microorganismo y un medio líquido de cultivo, a una temperatura comprendida entre 30 a 38ºC, a un pH comprendido entre 6 a 9, y fermentar sustrato gaseoso mediante el al menos primer organismo para producir un producto intermedio que comprende al menos un ácido carboxílico,

[0078] (b) pasar el producto intermediario desde el primer reactor a un segundo reactor, y (c) administrar el producto intermediario en un segundo reactor que comprende un segundo caldo de fermentación, donde el segundo caldo de fermentación comprende una cantidad de 1% a 10% (v/v) de al menos un segundo microorganismo y un medio líquido de cultivo a una temperatura comprendida entre 28 a 35ºC, a un pH comprendido entre 4 a 10, y fermentar mediante el segundo microorganismo el producto intermediario para producir carotenoides, lípidos o combinación de los anteriores.

[0080] En el contexto de la presente invención, se entiende por fermentar un proceso donde un microorganismo al crecer en un medio de cultivo y las condiciones de crecimiento optimas de dicho microorganismo para su crecimiento, es capaz de transformar un sustrato en un producto. En una realización de la presente invención, el primer microorganismo fermenta el sustrato gaseoso y produce el producto intermedio que comprende al menos un ácido carboxílico. En una realización de la presente invención, el segundo microorganismo fermenta el producto intermedio que comprende al menos un ácido carboxílico y produce carotenoides, lípidos o combinación de anteriores.

[0082] En realizaciones preferidas de la presente invención, el objeto de la presente invención es un método de conversión de un sustrato gaseoso en carotenoides o en una combinación de carotenoides y lípidos.

[0084] En realizaciones preferidas de la presente invención, el sustrato gaseoso se selecciona del grupo que consiste en CO, CO<2>, H<2>y combinación de los anteriores.

[0086] En el contexto de la presente invención, el sustrato gaseoso, tal y como se describe en el presente documento, se encuentran en emisiones de industrias metalúrgicas, industrias cementeras, refinerías, biorrefinerías, entre otras. El proceso propuesto, catalizado por bacterias acetogénicas, es muy versatíl y permite utilizar gases puros, mezclas binarias y mezclas ternarias en distintas proporciones, a diferencia de los procesos catalíticos/químicos, que permiten también convertir estos gases, que son CO, CO<2>, H<2,>en distintos productos permite necesitan proporciones muy específicas de cada uno de estos gases.

[0088] En realizaciones más preferida de la presente invención, el sustrato gaseoso comprende 100% de CO cómo único gas y única fuente de carbono y energía, ya que suele ser el gas más abundante en emisiones industriales, como en el caso de la producción de acero.

[0090] En realizaciones más preferida de la presente invención, el sustrato gaseoso comprende una mezcla binaria de una cantidad comprendida entre 20% - 40% de CO<2>y una cantidad comprendida entre 60% - 80% de H<2.>

[0092] En realizaciones particulares de la presente invención, el sustrato gaseoso comprende una cantidad de CO<2>comprendida entre 25%-35%, siendo más preferida entre 25%-30%. En realizaciones preferidas de la presente invención, el sustrato gaseoso comprende una cantidad de CO<2>que es de 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% o 39%.

[0094] En realizaciones particulares de la presente invención, el sustrato gaseoso comprende una cantidad de H<2>comprendida entre 65%-75%, siendo más preferida entre 65%-70%. En realizaciones preferidas de la presente invención, el sustrato gaseoso comprende una cantidad de H<2>es de 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78% o 79%.

[0096] En realizaciones más preferida de la presente invención, el sustrato gaseoso es una mezcla ternaria, que comprende de 20 a 40% de una mezcla de CO:CO<2>, que está en una proporción de 3:1 a 3:5, y una cantidad de H<2>comprendida entre 60% a 80%<.>

[0098] En realizaciones particulares de la presente invención, donde el sustrato gaseoso comprende una mezcla ternaria de CO:CO<2>, y H<2>el sustrato gaseoso comprende cantidad de H<2>comprendida entre 60%- 90%, siendo más preferida entre 65% -85%, y aún más preferida entre 70% -80%. En realizaciones preferidas de la presente invención, el sustrato gaseoso comprende una cantidad de H<2>es de 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78% o 79%. En realizaciones preferidas de la presente invención, el sustrato gaseoso comprende una cantidad de H<2>es de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87% o 89%.

[0100] En una realización particular de la presente invención, la etapa a) del método se realiza en condiciones anaerobias, que en el contexto de la presente invención quiere decir en ausencia de oxígeno.

[0102] En una realización particular de la presente invención, el medio de cultivo que se emplea para cultivar el primer microorganismo, es un medio mineral acuoso para crecimiento microbiano anaeróbico mínimo, tal y como se describe en “Cecilia Naveira-Pazos, María C. Veiga, Christian Kennes. Accumulation of lipids by the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica grown on carboxylic acids simulating syngas and carbon dioxide fermentation. Bioresource Technology. Volume 360, September 2022, 127649”.

[0104] En realizaciones particulares de la presente invención, el primer microorganismo, que es el responsable de la fermentación de los gases, es una bacteria acetogénica que se selecciona del género que consiste enClostridium, Acetobacterium, Moorella, Eubacterium,Butyribacterium

o combinación de las anteriores. En realizaciones preferidas, el primer microorganismo esClostridium aceticum. En otras realizaciones preferidas, el primer microorganismo esClostridium carboxidivorans.En otras realizaciones preferidas, el primer microorganismo esAcetobacterium woodii.

[0106] En realizaciones particulares de la presente invención, el primer microorganismo que se cultiva en el primer reactor se encuentra en la cantidad comprendida entre 2% a 20% en volumen con respecto al volumen total del primer reactor. En realizaciones preferidas, el primer microorganismo se encuentra en una cantidad comprendida entre 10% a 15%, siendo de forma más preferida, 10% en volumen con respecto al volumen total del primer reactor. En realizaciones particulares de la presente invención, el primer microorganismo que se cultiva en el primer reactor se encuentra en una cantidad de 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% o 20%.

[0108] En realizaciones preferidas de la presente invención, la temperatura en la que se cultiva el primer microorganismo en la primera etapa (a) está comprendida entre 30 a 38 ºC, siendo de forma preferida 30ºC, 31ºC, 32ºC, 33ºC, 34ºC, 35ºC, 36ºC, 37ºC o 38 ºC.

[0110] En otras realizaciones preferidas de la presente invención, el pH en el que se cultiva el primer microorganismo en la primera etapa (a) está comprendido entre 6 y 9, siendo de forma preferida un pH de 6, 7 u 8. De esta forma, en una realización preferida de la presente invención, cuando el cultivo bacteriano es un cultivo deClostridium aceticumel pH de la fermentación de gases es un pH alcalino que se encuentra comprendido entre 7.5-8.5, siendo en realizaciones preferidas, un pH de 7.5, 8.0 o 8.5. En otra realización preferida, cuando el cultivo bacteriano es un cultivo deAcetobacterium woodiiel pH de la fermentación de gases es un pH ácido que se encuentra comprendido entre 6.5-7.0, siendo en realizaciones preferidas, un pH de 6 o 7.

[0112] En una realización particular de la invención, en la primera etapa (a) se obtiene un producto intermedio que comprende uno o más ácidos carboxílicos, donde dichos ácidos son de cadena de 2 a 6 átomos de carbono (C<2>-C<6>). En realizaciones preferidas, el ácido carboxílico se selecciona del grupo que consiste en ácido acético, ácido butírico, ácido caproico o combinación de los anteriores. En realizaciones preferidas de la presente invención, donde el producto intermediario comprende al menos un ácido carboxílico en una concentración entre 10 - 18 g/L.

[0113] De forma preferida, dicho producto intermedio comprende al menos un 80% de ácido acético, siendo de forma preferida, al menos un 85% a 99,99% de ácido acético. En otras realizaciones preferidas, la cantidad de ácido acético que está comprendida en el producto intermedio es de 90% a 99,99%. Otras realizaciones preferidas, la cantidad de ácido acético en el producto intermedio es de 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99%. En otras realizaciones aún más preferidas, la cantidad de ácido acético en el producto intermedio es de 99,1%,99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% o 99,9%. En otra realización preferida, el producto intermedio comprende al menos 80% de ácido acético y el resto es ácido butírico o una combinación de ácido butírico y caproico.

[0115] En el presente documento, el porcentaje que describe para definir la cantidad de ácidos carboxílicos que se encuentran en el producto intermedio esta descrito en volumen/volumen.

[0117] En realizaciones particulares de la presente invención, la cantidad de al menos un ácido carboxílico que se produce en la primera etapa (a) está comprendida entre 5g/L a 25 g/L, siendo en una realización preferida, de 14g/L a 18g/L con respecto al volumen. En otras realizaciones preferidas, la cantidad de al menos de ácido carboxílico que se obtiene en la primera etapa (a) es de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 g/L.

[0119] En una realización preferida de la presente invención, el producto intermedio obtenido en la primera etapa (a) es filtrado mediante nanofiltración u ósmosis inversa, siendo preferida la nanofiltración debido a su alta selectividad y menores costes. Dicha metodología de nanofiltración se describe enBóna, Á.; Bakonyi, P.; Galambos, I.; Bélafi-Bakó, K.; Nemestóthy, N. Separation of Volatile Fatty Acids from Model Anaerobic Effluents Using Various Membrane Technologies. Membranes 2020, 10, 252. https://doi.org/10.3390/membranes10100252. Se realiza la filtración para concentrar el producto obtenido en la primera etapa del primer reactor y posteriormente trasladarlo al segundo reactor, pudiéndose recircular la biomasa de nuevo al primer reactor.

[0121] En realizaciones particulares de la presente invención, el segundo microorganismo que se cultiva en la segunda etapa (b) es una levadura oleaginosa que se selecciona del género que consiste enYarrowiasp.,Rhodotorulasp.,Rhodosporidiumsp.,Sporidiobolussp. u otras cepas capaces de acumular carotenoides de forma natural o mediante modificación genética.

[0122] En realizaciones preferidas de la presente invención, el segundo microorganismo que se cultiva en la segunda etapa (b) es una levadura oleaginosa queYarrowia lipolytica.

[0124] En una realización preferida de la presente invención, el segundo microorganismo es una cepa deYarrowia lipolyticacuyo número de identificación de la levadura es el JMY6862 y el número de registro del material microbiano recibido es CNCM I-5978 y que ha sido depositada en la Colección nacional de Cultivos del Instituto Pasteur (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes Institut Pasteur)el pasado 10 de julio de 2023 bajo los términos del Tratado de Budapest.

[0126] Las características y modificaciones genéticas de la cepa JMY6862 han sido descritas en M. Larroude,E. Celinska, A. Back, S. Thomas, J.M. Nicaud, R. Ledesma-Amaro, A synthetic biology approach to transform Yarrowia lipolytica into a competitive biotechnological producer of β-carotene, Biotechnol. Bioeng.115 (2018) 464–472. https://doi.org/10.1002/bit.26473

[0128] En realizaciones particulares de la presente invención, el producto intermediario de la etapa (a) es filtrado mediante membranas de nanofiltración tal y como se describe en el artículo (Bóna, Á.; Bakonyi, P.; Galambos, I.; Bélafi-Bakó, K.; Nemestóthy, N. Separation of Volatile Fatty Acids from Model Anaerobic Effluents Using Various Membrane Technologies. Membranes 2020, 10, 252. https://doi.org/10.3390/membranes10100252) antes de la etapa (b) y así recuperar el primer microorganismo.

[0130] En realizaciones particulares de la presente invención, el segundo microorganismo que se cultiva en el segundo reactor se encuentra en la cantidad comprendida entre 1% y 10% con respecto al volumen total del segundo reactor. En realizaciones preferidas, el segundo microorganismo se encuentra en una cantidad comprendida entre 5% a 10%, siendo de forma más preferida, 6% a 10% con respecto al volumen total del segundo reactor. En realizaciones particulares de la presente invención, el segundo microorganismo que se cultiva en el segundo reactor se encuentra en una cantidad inicial de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% y 10%.

[0132] En una realización particular de la presente invención, el medio de cultivo que se emplea para cultivar el primer microorganismo, es un medio mineral acuoso para crecimiento microbiano anaeróbico mínimo, tal y como se describe enR. Robles-Iglesias, M.C. Veiga, C. Kennes, Carbon dioxide bioconversion into single cell oils (lipids) in two reactors inoculated withAcetobacterium woodii and Rhodosporidium toruloides. J CO2 Util, 52 (2021), https://10.1016/j.jcou.2021.101668.

[0134] En realizaciones preferidas de la presente invención, la temperatura en la que se cultiva el segundo microorganismo en la segunda etapa (c) está comprendida entre 28 a 35ºC, siendo de forma preferida 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 o 35ºC.

[0136] En otras realizaciones preferidas de la presente invención, el pH en el que se cultiva el segundo microorganismo en la segunda etapa (c) está comprendida entre 4 a 10, siendo de forma preferida un pH de 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10.

[0138] En realizaciones particulares de la invención, la relación carbono/nitrógeno (C/N) inicial a la que se cultiva el segundo microorganismo en la segunda etapa (c) está comprendida entre 10 y 100, siendo de forma preferida de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100. En el contexto de la presente invención, la relación C/N se refiere a la cantidad de carbono comparada con la cantidad de nitrógeno que se encuentra en el ambiente en el que el microorganismo está creciendo, es decir, en el segundo caldo de fermentación.

[0140] En realizaciones particulares de la presente invención, al final de la etapa (c) se obtiene por fermentación un producto final que es carotenoides, lípidos o una combinación de carotenoides y lípidos.

[0142] En una realización de la presente invención, los carotenoides producidos en el segundo reactor son carotenos, siendo de forma preferida el β-caroteno.

[0144] En realizaciones particulares de la presente invención, la cantidad de carotenoides que se produce en la etapa (c) es de al menos 50 mg/L, siendo de forma preferida entre 50 mg/L a 760 mg/L, siendo en una realización preferida, de 50 mg/L a 220 mg/L, siendo aún más preferida de 220 g/L a 760 mg/L. En otras realizaciones preferidas, la cantidad de carotenoides que se produce en la etapa (c) está comprendida entre de 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 o 210 mg/L. En otras realizaciones preferidas, la cantidad de carotenoides que se produce en la etapa (c) está comprendida entre de 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750 o 760 mg/L.

[0145] En una realización de la presente invención, los lípidos producidos durante la etapa (c) son seleccionados del grupo que consiste en C16:0, C16:1, C18:0, C18:1, C18:2 y combinación de los anteriores.

[0147] En realizaciones particulares de la presente invención, la cantidad de lípidos que se produce en la segunda etapa (c) es de al menos 4,40g/L, siendo de forma preferida entre 0,40 g/L a 2,64 g/L siendo en una realización preferida, de 0,40 g/L a 0,62 g/L, siendo aún más preferida de 0,62 g/L a 2,64 g/L. En otras realizaciones preferidas, la cantidad de lípidos que se produce en la etapa (c) está comprendida entre de 0,40, 0,45, 0,50, 0,50 y 0,60 g/L. En otras realizaciones preferidas, la cantidad de lípidos que se produce en la etapa (c) está comprendida entre de 0,65 g/L, 0,70 g/L, 0,75 g/L, 0,80 g/L, 0,85 g/L, 0,90 g/L, 0,95 g/L, 1,00 g/L, 1,05 g/L, 1,10 g/L, 1,15 g/L, 1,20 g/L, 1,25 g/L, 1,30 g/L, 1,35 g/L, 1,40 g/L, 1,45 g/L, 1,50 g/L, 1,55 g/L, 1,60 g/L, 1,65 g/L, 1,70 g/L, 1,75 g/L, 1,80 g/L, 1,85 g/L, 1,90 g/L, 1,95 g/L, 2,00 g/L, 2,05 g/L, 2,10 g/L, 2,15 g/L, 2,20 g/L, 2,25 g/L, 2,30 g/L, 2,35 g/L, 2,40 g/L, 2,45 g/L, 2,50 g/L, 2,55 g/L, 2,60 g/L o 2,64 g/L.

[0149] Los lípidos y carotenoides se extraen de la célula, de forma independiente. Los lípidos totales acumulados se extraen de la biomasa liofilizada, y se convierten a sus equivalentes de ésteres metílicos (Fatty Acid Methyl Esters), mediante un método descrito enR. Robles-Iglesias, M.C. Veiga, C. Kennes, Carbon dioxide bioconversion into single cell oils (lipids) in two reactors inoculated with Acetobacterium woodii and Rhodosporidium toruloides. J CO2 Util, 52 (2021), https://10.1016/j.jcou.2021.101668.Los carotenoides acumulados se extraen directamente de la biomasa, rompiendo la membrana celular con ayuda de un disolvente de extracción (50:50 v/v; hexano-acetato de etilo), mediante un método descrito enM. Larroude, E. Celinska, A. Back, S. Thomas, J.M. Nicaud, R. Ledesma-Amaro, A synthetic biology approach to transform Yarrowia lipolytica into a competitive biotechnological producer of β-carotene, Biotechnol. Bioeng.115 (2018) 464–472. https://doi.org/10.1002/bit.26473.

[0151] En realizaciones preferidas de la presente invención, el medio obtenido en la etapa (c) es recirculado al primer reactor después de separar y recuperar el producto final que es la combinación de carotenoides y lípidos.

[0153] En otra realización preferida de la presente invención, el medio obtenido en la segunda etapa (b) es filtrado mediante una membrana de nanofiltración antes de que dicho medio se recircula al primer reactor, con el objetivo de extraer la biomasa y recircular al primer reactor la disolución acuosa.

[0155] Cabe señalar, que el medio de cultivo que se emplea en las etapas a) y b) son el mismo, lo que destaca sorprendentemente ya tanto los microorganismos que intervienen en dichas etapas como las condiciones optimas para su crecimiento son diferentes. El primer microorganismo que interviene en la primera etapa del método es un microorganismo anaerobio, por lo que crece en condiciones anaerobias. Por el contrario, el segundo microorganismo, es aerobio, por lo que el segundo tanque donde crece este segundo microorganismo recibe un flujo constante de oxígeno.

[0157] En una realización particular de la presente invención, el segundo tanque recibe una aportación de oxigeno constante, que de forma preferida es una aireación del segundo tanque de 0.5 a 2.0 vvm.

[0159] En realizaciones particulares de la invención, la etapa (c), también denominada en el presente documento, la fermentación de ácidos se lleva a cabo en un biorreactor discontinuo (batch), continuo, o semi-continuo.

[0161] Los inventores han conseguido desarrollar, después de numerosos estudios, un método de síntesis de una combinación de carotenoides y lípidos donde el segundo microorganismo es capaz de asimilar ácidos, en el medio de la primera etapa. Cabe destacar que el segundo microorganismo no se ve inhibido por las concentraciones de ácido que se obtiene de la primera etapa del método objeto de la invención. En realizaciones preferidas, el crecimiento del segundo microorganismo, no se ve inhibido para concentraciones totales de ácidos de hasta 15 g/L. Además, cabe destacar que lo que se conoce ampliamente en el estado de la técnica es la obtención de carotenoides a partir de glucosa mientras que el presente método objeto de la invención es realmente singular ya que este método permite obtener carotenoides a partir de ácidos, los cuales previamente han sido obtenidos a partir de gases, que incluyen gases contaminantes y/o de efecto invernadero (CO<2>, CO), lo cuál permite mitigar un problema medioambiental.

[0163] Una de las principales ventajas del presente método objeto de la invención es que es un procedimiento que es llevado a cabo por microorganismos lo que lo hace más sostenible que los procesos químicos que se emplean en la actualidad, donde los carotenoides se obtienen mediante su extracción de determinadas plantas y/o mediante procesos (reacciones) químicos. Por tanto, la presente invención, puede tener una mayor aceptación por parte de la sociedad, debido a su origen más natural. Además, este procedimiento produce menos residuos o productos secundarios, contaminantes, que los procesos químicos. Al igual que para los lípidos, la obtención de carotenoides de origen vegetal depende de factores geográficos y estacionales y de clima, suelen necesitar extensiones de terreno importantes, y pueden competir, en algunos casos, con otros usos, principalmente para la agricultura, lo cual no es el caso para los de origen microbiano.

[0165] Comparado con los procesos químicos basados en reactivos y compuestos más contaminantes, la obtención de carotenoides microbianos a partir de CO<2>y ácidos carboxílicos es más económica y más sostenible. Así mismo, el uso de estos sustratos, CO<2>y ácidos carboxílicos, en la presente invención es también más económica comparado con otros sustratos más convencionales, cómo la glucosa, utilizados en otros bioprocesos.

[0167] Las levaduras, como es el caso de la presente invención, tienen tasas de crecimiento elevadas, necesitan menor superficie de terreno, y no necesitan luz, comparado con otros posibles organismos productores de carotenoides, como son las algas. Además, existe la posibilidad de modificar estas levaduras genéticamente para mejorar su eficiencia y seleccionar productos específicos.

[0169] Por otro lado, la producción convencional de ésteres metílicos de ácidos grasos (abreviado como FAME, siglas del inglés Fatty Acid Methyl Ester), derivados de lípidos, para la producción de productos como el biodiésel suele estar basado en lípidos de origen vegetal. En la presente invención, los lípidos son de origen microbiano, lo cual presenta distintas ventajas. La obtención de lípidos de origen vegetal, al igual que los carotenoides, depende de factores geográficos y estacionales y de clima, suelen necesitar extensiones de terreno importantes, y pueden competir, en algunos casos, con otros usos. Los de origen microbiano suelen estar caracterizados por mayores productividades, operaciones de separación más sencillas por procesamiento posterior (conocido en inglés comodownstream processing). Los lípidos obtenidos a partir de microorganismos suelen tener perfiles lipídicos similares a los de origen vegetal y, por lo tanto, tienen las mismas aplicaciones.

[0170] A lo largo de la descripción y reivindicaciones, la palabra "comprende" y sus variaciones no pretenden excluir otras características, aditivos, componentes o etapas técnicas. Objetos, ventajas y características adicionales de la invención se harán evidentes para los expertos en la materia tras el examen de la descripción o pueden aprenderse mediante la práctica de la invención. Además, la presente invención abarca todas las combinaciones posibles de realizaciones particulares y preferidas descritas en la presente memoria.

[0172] EJEMPLOS

[0174] El propósito de los ejemplos indicados a continuación es ilustrativo y no pretende limitar en ningún caso el alcance de la invención.

[0176] Ejemplo 1: Producción simultánea de carotenoides y lípidos en dos reactores con Clostridium aceticum, para la fermentación de gases, en el primer reactor,yYarrowia lipolytica, para la fermentación de ácidos, a pH 8, en el segundo reactor.

[0178] En el primer reactor se introduce un medio de cultivo recomendado para bacterias acetogénicas cuya composición es la siguiente (en gramos por litro de agua destilada): extracto de levadura, 3,00; NH4Cl, 0,20; K2HPO4, 8,45; KH2PO4, 1,75; NaHCO3, 10,00; MgSO4x7H2O, 0,35; cysteine-HCl, 0,30; Na2Sx9H2O, 0,90; y también (en ml por litro de agua destilada): Na-resazurin (0.1%), 1,00; metales-traza, 2,00; vitaminas, 2,50. La disolución de metales-traza tiene la siguiente composición (en gramos por litro de agua destilada): ácido nitriloacético, 15,00; MgSO4x7H2O, 30,00; MnSO4xH2O, 5,00; NaCl, 10,00; FeSO4x7H2O, 1,00; CoSO4x7H2O, 1,80; CaCl<2>x2H2O, 1,00; ZnSO4x7H2O, 1,80; CuSO4x5H2O, 0,10; KAl(SO4)2x12H2O, 0,20; H3BO3, 0,10; Na2MoO4x2H2O, 0,10; NiCl2x6H2O, 0,30; y también (en miligramos por litro de agua destilada): Na2SeO3x5H2O, 3,00; Na2WO4x2H2O, 4,00. La disolución de vitaminas tiene la siguiente composición (en miligramos por litro de agua destilada): biotina, 2,00; ácido fólico, 2,00; piridoxina-HCl, 10,00; tiamina-HCl, 5,00; riboflavina, 5,00 mg; ácido nicotínico, 5,00; Ca-D-pantotenato, 5,00; vitamina B12, 0,10; p-ácido-aminobenzoico, 5,00; (±)-α-ácido lipoico, 5,00. Se introduce el medio en un biorreactor de tanque agitado, de 2 litros, con temperatura constante, de 30 ºC, y una agitación constante a 250 rpm. Se deja pasar nitrógeno durante varios minutos a través del medio, para eliminar los restos de oxígeno y asegurar condiciones anaerobias y se inocula la bacteriaClostridium aceticum(Arslan K., Veiga M.C., Kennes C. 2021. Autotrophic (C1-gas) versus heterotrophic (fructose) accumulation of acetic acid and ethanol in Clostridium aceticum. Bioresour. Technol.337:125485). Se alimenta una mezcla de gases en continuo con un caudal de 10ml/min en un reactor de 1 litro, cuya composición es (%): CO, 30; CO2, 10; H2, 20; N2, 40. El pH, de 7,5, se mantiene constante, mediante la adición de NaOH. La bacteria convierte estos gases en ácido acético. Se detiene la fermentación cuando se alcanza una concentración de aproximadamente 7 g/L de ácido (Figura 2), aunque hemos conseguido alcanzar concentraciones más elevadas, con esta bacteria u otras bacterias acetogénicas, en otros estudios.

[0180] El pH del medio fermentado del primer reactor se ajusta a un valor de pH 8,0, que se mantendrá constante en esté segundo reactor. Se inocula la levadura oleaginosaYarrowia lipolyticacapaz de producir carotenoides y lípidos. A diferencia de la bacteria anaerobia,Clostridium aceticum, la levadura crece en condiciones aerobias. Durante el experimento se alimenta aire en continuo. Además, se mantiene la temperatura constante, a 32ºC, y una agitación constante, de 250 rpm. Tras el consumo total de todo el ácido de la primera fermentación, en este segundo reactor, se realizan, posteriormente, dos adiciones de ácido acético, de forma semi-continua, según se puede observar en la Figura 3. La levadura acumula carotenoides a lo largo de la fermentación, alcanzado una concentración máxima de β-caroteno de 79 mg/l y 27,8 mg/g-célula (Figura 4). Al mismo tiempo, acumula 0,50 g/L de lípidos, siendo más abundantes las cadenas de 16 y 18 átomos de carbono, principalmente el C18:1 (45,5%) y el C16:0 (18,4%) (Figura 5).

[0182] Ejemplo 2: Producción simultánea de carotenoides y lípidos en dos reactores con Clostridium aceticum, para la fermentación de gases, en el primer reactor, e Yarrowia lipolytica, para la fermentación de ácidos, a pH 6, en el segundo reactor.

[0184] Se lleva a cabo el mismo proceso que en el Ejemplo 1, siendo la fermentación de gases y la producción de ácido idénticas que en el ejemplo anterior. Sin embargo, para la segunda etapa, en la bioconversión del ácido acético en carotenoides y lípidos, se analiza el efecto de un cambio de pH, manteniendo, por lo demás, todas las condiciones idénticas a las del Ejemplo 1. En este caso (Ejemplo 2), se mantiene el valor del pH constante a 6,0. Se considera que el pH óptimo para el crecimiento de esta levadura se acerca más a pH 6 que a pH 8. Aunque no tiene que ser necesariamente el mismo valor óptimo para la acumulación de carotenoides o lípidos y para el crecimiento, sí que se observa una mayor producción de ambos productos a este nuevo pH de 6,0. Efectivamente, la velocidad de consumo del ácido acético es bastante parecida a pH 8 (Figura 3) y a pH 6 (Figura 6); sin embargo, la acumulación de carotenoides es significativamente mayor. La levadura acumula carotenoides a lo largo de la fermentación, alcanzado una concentración máxima de β-caroteno de 164 mg/l y 44 mg/g-célula (Figura 7). En cuanto a los lípidos acumulados en la célula, aumentan algo los porcentajes de C16:0 y C18:1 (Figura 8), la concentración final de lípidos es también más elevada a pH 6,0, alcanzando 1,03 g/L.

[0186] Ejemplo 3: Producción simultánea de carotenoides y lípidos en dos reactores con Clostridium carboxidivorans, para la fermentación de gases, en el primer reactor, e Yarrowia lipolytica, para la fermentación de ácidos, a pH 6, en el segundo reactor.

[0188] A diferencia del ejemplo 1 y el ejemplo 2, en este caso, se inocula la bacteriaClostridium carboxidivoransen el primer reactor.Clostridium aceticum, y la mayoría de las bacterias acetogénicas producen ácido acético en la fermentación de gases, mientras queClostridium carboxidivoranses una de las pocas bacterias que produce ácido butírico y ácido hexanoico, a parte del ácido acético, aunque este último sigue siendo el producto dominante. Este ejemplo permite comprobar si la composición y la concentración de estos ácidos, y también si las características del medio fermentado porClostridium carboxidivorans, comparado con el deClostridium aceticum, podrían afectar la producción de carotenoides y lípidos en el segundo reactor. Para la segunda etapa, con la levaduraYarrowia lipolytica, se lleva a cabo el mismo proceso que en el Ejemplo 1, aunque se realizan ocho adiciones de ácidos, en vez de sólo dos, para comprobar hasta qué punto aumentan las concentraciones de carotenoides y de lípidos al aumentar la disponibilidad de sustrato para la levadura (Figura 9). Como se observa que esta levadura en concreto no metaboliza el ácido hexanoico producido por la bacteria, sólo se añade ácido acético y ácido butírico en las sucesivas adiciones. Como se puede observar, después de la segunda adición se alcanzan concentraciones similares a las alcanzadas conClostridium aceticum. Sin embargo, a medida que se va alimentando más sustrato, sigue aumentando la producción de carotenoides hasta llegar a un valor máximo de 759 mg/L y 90,6 mg/g-célula, cuando se para la adición de sustrato (Figura 10). Para los lípidos, la concentración final es también significativamente más elevada, llegando a 3,11 g/L, mientras que la distribución es bastante parecida en todos los ejemplos, siendo dominantes el C18:1 y el C16:0 (Figura 10).

[0190] Se pudo comprobar que no se observan fenómenos de inhibición de las levaduras utilizadas para la producción de carotenoides y lípidos en presencia de concentraciones de ácidos (que sea sólo ácido acético o mezclas de esté último con otros ácidos descritos en esta solicitud) de hasta 20 g/L lo cuál se ve ilustrado, en el presente ejemplo, para mezclas de ácidos, típicos de la fermentación acetogénica de gases, en proporción en masa 81 % ácido acético, 14 % ácido butírico, 5 % ácido caproico. Se observa el consumo total de todos los ácidos, independientemente de la concentración, hasta la concentración más alta, de 16 g/L, estudiada en este ejemplo (Figura 11).

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES

1. Un método para la obtención de carotenoides, lípidos o una combinación de carotenoides y lípidos, que comprende:

a) administrar un sustrato gaseoso que comprende:

i) 100% de CO; o

ii) una mezcla binaria de CO₂ y H₂, en la que CO₂ está en una cantidad comprendida entre 20%–40% y H₂ está en una cantidad comprendida entre 60%– 80%, referidos ambos porcentajes al total de la mezcla binaria (CO₂+H₂); o iii) una mezcla ternaria que comprende CO y CO₂ en una proporción CO:CO₂ de 3:1 a 3:5, y H₂, en la que la fracción CO+CO₂ está en una cantidad comprendida entre 20%–40% y H₂ está en una cantidad comprendida entre 60%–80%, referidos ambos porcentajes al total de la mezcla ternaria (CO+CO₂+H₂);;

en un primer reactor que comprende un primer caldo de fermentación, donde el primer caldo de fermentación comprende una cantidad de 2% a 20% (v/v) de un primer microorganismo que es una bacteria acetogénica que se selecciona del género que consiste enClostridium, Acetobacterium, Moorella, Eubacterium, Butyribacteriumy combinación de las anteriores y un medio líquido de cultivo, a una temperatura comprendida entre 30 a 38ºC, a un pH comprendido entre 6 a 9, y fermentar el sustrato gaseoso mediante el primer organismo para producir un producto intermedio que comprende al menos un ácido carboxílico,

b) pasar el producto intermediario desde el primer reactor a un segundo reactor, c) y administrar el producto intermediario en un segundo reactor que comprende un segundo caldo de fermentación, donde el segundo caldo de fermentación comprende una cantidad de 1% a 10% (v/v) de al menos un segundo microorganismo

y un medio líquido de cultivo a una temperatura comprendida entre 28 a 35ºC, a un pH comprendido entre 4 a 10, y fermentar mediante el segundo microorganismo el producto intermediario para producir carotenoides, lípidos o combinación de los anteriores; y

donde dicho segundo microorganismo es una cepa deYarrowia lipolyticadepositada en la Colección nacional de Cultivos del Instituto Pasteur (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes Institut Pasteur)el pasado 10 de julio de 2023 y cuyo número de identificación es el JMY6862.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde el sustrato gaseoso comprende entre 25%-35% de CO<2>y una cantidad entre 65%-75% de H<2>.

3. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el primer microorganismo esClostridium aceticum.

4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el primer microorganismo esClostridium carboxidivorans.

5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el primer microorganismo esAcetobacterium woodii.

6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el método comprende una etapa adicional antes de la etapa b) donde el producto intermediario es filtrado mediante membrana de nanofiltración.

7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el segundo caldo de cultivo comprende una de relación carbono/nitrógeno de entre 10 a 100.

8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde el método comprende una etapa adicional después de la etapa c) donde el segundo caldo de fermentación se recircula al primer reactor.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, donde el segundo caldo de fermentación es filtrado mediante membrana de nanofiltración antes de recircular al primer reactor.