ES2992313T3

ES2992313T3 - Captura de dianas en gotitas monodispersas

Info

Publication number: ES2992313T3
Application number: ES19867427T
Authority: ES
Inventors: Robert Meltzer; Kristina Fontanez; Desiree Schenk; Yi Xue
Original assignee: Fluent Biosciences Inc
Current assignee: Fluent Biosciences Inc
Priority date: 2018-09-28
Filing date: 2019-09-27
Publication date: 2024-12-11
Anticipated expiration: 2039-09-27
Also published as: FI3856404T3; WO2020069298A1; CA3114614A1; EP3856404A4; EP3856404A1; DK3856404T3; US20210340596A1; EP4446741A3; EP3856404B1; EP4446741A2

Abstract

Los métodos y sistemas descritos en este documento proporcionan partículas de plantilla de captura y un método mejorado de captura de objetivos basado en gotitas de emulsión y codificación de barras de los mismos. Las partículas de plantilla de captura y los métodos descritos en este documento permiten capturar objetivos de interés a partir de muestras biológicas y codificar con barras ácidos nucleicos específicos contenidos en los objetivos capturados. Los ácidos nucleicos pueden estar contenidos dentro de estructuras vivas o no vivas, incluidas partículas, virus y células. Los ácidos nucleicos pueden incluir, por ejemplo, ADN o ARN. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Captura de dianas en gotitas monodispersas

Antecedentes de la invención

Los fluidos corporales humanos contienen una variedad de dianas de diagnóstico de importancia médica. Estas incluyen dianas de biopsia líquida, tales como células circulantes (tumorales, fetales o madre), componentes celulares (p. ej., núcleos), ácidos nucleicos libres de células, vesículas extracelulares y antígenos proteicos, que están siendo diana para el desarrollo de diagnósticos no invasivos para una variedad de tipos de cáncer. Estas también pueden incluir dianas biológicas indicativas de enfermedades tales como procariotas, hongos y virus. Sin embargo, la detección cuantitativa de proteínas y ácidos nucleicos a nivel unicelular es un desafío debido a la pequeña cantidad de proteína disponible (Shani y col., (2017) “Abseq: Ultrahigh-throughput single cell protein profiling with droplet microfluidic barcoding” . Scientific Reports volumen 7, número de artículo: 44447). El procesamiento y la codificación con códigos de barras de pequeñas cantidades de ácidos nucleicos de manera eficiente y específica de la diana son importantes para aplicaciones que van desde el ensamblaje de genomas microbianos no cultivables hasta la identificación de mutaciones asociadas al cáncer, y sigue siendo un desafío importante. La presente descripción describe un enfoque flexible para capturar y marcar dianas de interés a partir de muestras biológicas, que aprovecha la técnica de emulsificación con modelo de partículas descrita anteriormente (Hatori y col., (2018) “ Particle-Templated Emulsification for Microfluidics-Free Digital Biology” Anal. Chem., 10.1021/acs.analchem.8b01759) y proporciona ventajas relacionadas. En la técnica anterior, el documento WO 2015/164212 A1 se refiere a sistemas y métodos para codificar ácidos nucleicos con códigos de barras.

Resumen de la invención

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Los métodos y sistemas descritos en la presente memoria proporcionan partículas modelo de captura y un método mejorado de captura de dianas y codificación con código de barras basado en gotitas en emulsión de las mismas. Las partículas modelo de captura y los métodos descritos en la presente memoria permiten capturar dianas de interés a partir de muestras biológicas y codificar con códigos de barras los ácidos nucleicos específicos contenidos en las dianas capturadas. Los ácidos nucleicos pueden estar contenidos dentro de estructuras vivas o no vivas, incluyendo partículas, virus y células. Los ácidos nucleicos pueden incluir diversas biomoléculas tales como ADN o ARN.

En ejemplos de realización, la presente descripción proporciona, pero no reivindica, una partícula modelo de captura que comprende una partícula modelo que comprende uno o más restos de anclaje, en donde cada uno de los uno o más restos de anclaje se puede unir a uno o más elementos específicos de la diana.

En algunas realizaciones, los uno o más restos de anclaje se seleccionan entre un resto de captura y un resto identificador genético de elemento de captura. En algunas realizaciones, los uno o más elementos específicos de la diana se seleccionan entre un elemento de captura específico de la diana y un identificador genético de elemento de captura específico de la diana. En algunas realizaciones, el resto de captura comprende un enlazador hidrocarbonado terminado en acrilato con terminación en biotina. En algunas realizaciones, el resto de captura se une a un elemento de captura específico de la diana. En algunas realizaciones, el elemento de captura específico de la diana se selecciona entre secuencias de polinucleótidos poli-T, aptámeros y anticuerpos. En algunas realizaciones, el resto identificador genético de elemento de captura comprende un enlazador hidrocarbonado terminado en acrilato con un polinucleótido adaptador terminal. En algunas realizaciones, el resto identificador genético de elemento de captura está unido a un identificador genético de elemento de captura específico de la diana. En algunas realizaciones, el identificador genético de elemento de captura específico de la diana es un oligonucleótido y comprende elementos seleccionados de una secuencia adaptadora universal, un elemento de tipo modelo, un elemento de identificación de modelo, un elemento de captura específico de la diana y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la partícula modelo comprende además un hidrogel seleccionado entre agarosa, alginato, un polietilenglicol (PEG), una poliacrilamida (PAA), acrilato, matriz de copolímero de acrilamida/bisacrilamida y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la partícula modelo se dimensiona hasta el diámetro deseado mediante un flujo paralelo microfluídico con aceite inmiscible. En otras realizaciones, la partícula modelo se dimensiona hasta un diámetro deseado usando cualquier método conocido en la técnica y/o analizado en la presente memoria.

La presente descripción proporciona, pero no reivindica, un método de captura de dianas y codificación con código de barras en gotitas monodispersas que comprende:

1. combinar una pluralidad de partículas modelo de captura según un método descrito en la presente memoria con un primer fluido para proporcionar una primera mezcla, en donde el primer fluido comprende una pluralidad de partículas diana;

2. incubar la primera mezcla para permitir la asociación de la pluralidad de partículas diana a la pluralidad de partículas modelo de captura, de modo que una porción de la pluralidad de partículas diana se asocia a las partículas modelo de captura;

3. centrifugar la primera mezcla para generar sobrenadante y sedimento;

4. retirar el sobrenadante para separar la pluralidad de partículas modelo de captura y partículas diana asociadas de la solución de la primera mezcla;

5. lavar y resuspender el sedimento en tampón de reacción para proporcionar una segunda mezcla;

6. combinar la segunda mezcla con un segundo fluido para proporcionar una tercera mezcla, en donde el segundo fluido es inmiscible con la segunda mezcla; y cizallar la tercera mezcla de modo que una pluralidad de las partículas modelo de captura se encapsulen en una pluralidad de gotitas monodispersas en el segundo fluido, proporcionando de este modo una pluralidad de gotitas monodispersas que comprenden segundo fluido, una de las partículas modelo de captura y una de la pluralidad de partículas diana asociadas a dichas partículas modelo de captura.

En algunas realizaciones, el segundo fluido comprende un aceite. En algunas realizaciones, el aceite comprende un aceite de fluorocarbono, un aceite de hidrocarburo, aceite de silicona o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el primer fluido comprende una muestra biológica. En algunas realizaciones, la muestra biológica es un fluido corporal. En algunas realizaciones, el fluido corporal comprende partículas diana seleccionadas entre células circulantes, componentes celulares, ácidos nucleicos libres de células, vesículas extracelulares, antígenos proteicos, células procariotas, hongos, virus y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el fluido corporal es un fluido corporal humano. En algunas realizaciones, la asociación de la pluralidad de partículas diana con la pluralidad de partículas modelo de captura es específica de la diana y se genera a través del elemento de captura específico de la diana. En algunas realizaciones, el tampón de reacción es un tampón de reacción de PCR que comprende reactivos de PCR. En algunas realizaciones, el tampón de reacción es un tampón de transcripción inversa que comprende reactivos de transcripción inversa. En algunas realizaciones, el tampón de reacción comprende además tampón de lisis. En algunas realizaciones, las partículas diana asociadas encapsuladas en la pluralidad de gotitas monodispersas se lisan en donde la lisis no perturba la encapsulación de la pluralidad de las gotitas monodispersas. En algunas realizaciones, la lisis libera ácidos nucleicos presentes en las partículas diana asociadas. En algunas realizaciones, una porción de los ácidos nucleicos liberados se asocia a las partículas modelo de captura mediante el identificador genético de elemento de captura de una manera específica de la diana. En algunas realizaciones, el reactivo de lisis (los ejemplos no limitantes de un reactivo de lisis incluyen Triton X-100, SDS, Sarkosil, perfluoropoliéter (PFPE), ácido carboxílico, carboxilato de amonio o carboxilato de potasio) está presente en el segundo fluido y desencadena la lisis celular tras la emulsificación (cizallamiento de la tercera mezcla, como se describió anteriormente en la etapa 6 del método de captura de dianas y codificación con código de barras en gotitas monodispersas).

En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos asociados a la pluralidad de partículas modelo de captura comprenden moléculas de ARNm. En algunas realizaciones, las moléculas de ARNm asociadas a la pluralidad de partículas modelo de captura se transcriben de forma inversa para crear una secuencia de ADNc complementaria. En algunas realizaciones, la encapsulación de la pluralidad de partículas modelo de captura se interrumpe con una química compatible con PCR. En algunas realizaciones, se realiza una PCR con una secuencia específica del adaptador universal para liberar ácidos nucleicos asociados a la pluralidad de partículas modelo de captura a partir de dicha pluralidad de partículas modelo de captura. En algunas realizaciones, los productos de PCR pueden usarse para preparar una biblioteca de secuenciación.

La presente descripción proporciona, pero no reivindica, un método de preparación de partículas modelo de captura que comprende:

1. preparación de partículas modelo combinando una matriz de copolímero de acrilamida/bisacrilamida, un enlazador hidrocarbonado terminado en acrilato con terminación de biotina y un enlazador hidrocarbonado terminado en acrilato con un polinucleótido adaptador terminal;

2. dimensionar las partículas modelo al diámetro deseado mediante un flujo paralelo microfluídico en una fase oleosa inmiscible;

3. combinar las partículas modelo con elementos de captura específicos de la diana, provocando de este modo la unión de los elementos de captura específicos de la diana a las partículas modelo;

4. combinar las partículas modelo con identificadores genéticos de elementos de captura específicos de la diana, provocando de este modo la unión de los identificadores genéticos de elementos de captura a las partículas modelo; y generando de este modo las partículas modelo de captura.

En algunas realizaciones, los elementos de captura específicos de la diana comprenden estreptavidina, y los elementos de captura específicos de la diana se unen a las partículas modelo por medio de afinidad biotinaestreptavidina. En algunas realizaciones, los identificadores genéticos de elementos de captura específicos de la diana comprenden una secuencia de oligonucleótidos adaptadora universal, y dichos identificadores genéticos de elementos de captura específicos de la diana se unen a las partículas modelo mediante interacción de cadenas complementarias entre las secuencias de oligonucleótidos adaptadoras universales.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona, pero no reivindica, un método para generar una pluralidad de particiones, que comprende: (a) proporcionar un recipiente que contiene una composición que comprende (i) un primer líquido, (ii) un segundo líquido, (iii) una o más partículas diana que comprenden un polinucleótido y (iv) una pluralidad de partículas modelo de captura, en donde cada partícula diana de la una o más partículas diana que comprenden un polinucleótido está unida a una superficie exterior de una partícula modelo de captura de la pluralidad de partículas modelo de captura; en donde el segundo líquido es inmiscible con el primer líquido; y (b) agitar el recipiente o la composición en su totalidad para generar una pluralidad de particiones dentro del segundo líquido, en donde al menos una partición de la pluralidad de particiones comprende (i) al menos una porción del primer líquido, (ii) una única partícula modelo de captura de la pluralidad de partículas modelo de captura, y (iii) una única partícula diana que comprende un polinucleótido de la una o más partículas diana que comprenden un polinucleótido; y en donde la única partícula diana que comprende un polinucleótido está en contacto con una superficie interior de la partición.

En algunas realizaciones, la única partícula diana es una única célula o exosoma. En algunas realizaciones, el método comprende además lisar la única célula o exosoma. En algunas realizaciones, cada partícula modelo de captura de la pluralidad de partículas modelo de captura comprende además un resto identificador genético de elemento de captura. En algunas realizaciones, el resto identificador genético de elemento de captura comprende una secuencia específica de la diana. En algunas realizaciones, el resto identificador genético de elemento de captura comprende además una secuencia de código de barras. En algunas realizaciones, el resto identificador genético de elemento de captura comprende además una secuencia adaptadora. En algunas realizaciones, el segundo líquido comprende un aceite.

Breve descripción de los dibujos

Las características novedosas de la invención se exponen con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Se obtendrá una mejor comprensión de las características y ventajas de la presente invención haciendo referencia a la siguiente descripción detallada que expone realizaciones ilustrativas, en las cuales se utilizan los principios de la invención, y cuyos dibujos adjuntos:

la figura 1es un esquema que representa los elementos de una partícula modelo de captura según una realización de la presente descripción. Se muestra una representación esquemática de una partícula modelo de captura. La partícula modelo de captura puede comprender un resto de anclaje, o restos de anclaje, que incluyen un resto de captura (denominado “ resto A” ) y un resto identificador genético de elemento de captura (denominado “ resto B” ). En la realización mostrada, el resto de captura comprende un enlazador hidrocarbonado terminado en acrilato con terminación en biotina, y puede unirse a elementos de captura específicos de la diana, tales como un anticuerpo conjugado con estreptavidina. Se ilustran anticuerpos conjugados con estreptavidina específicos de la diana: Anticuerpo 1, 2 y 3. El resto identificador genético de elemento de captura comprende un enlazador hidrocarbonado con un polinucleótido adaptador terminal, en donde el polinucleótido adaptador terminal comprende una secuencia enlazadora y un oligonucleótido adaptador universal (la secuencia enlazadora y el oligonucleótido adaptador universal se denominan en la presente memoria “ LR” ), y puede unir un identificador genético de elemento de captura específico de la diana que comprende un oligonucleótido LR por medio de interacción de cadenas complementarias. El identificador genético de elemento de captura representado es un oligonucleótido que comprende un LR, un elemento de tipo modelo (denominado “TIPO” ), un elemento de ID de modelo (denominado “ ID” ) y un elemento de captura específico de la diana (denominado “ región de captura” ).

La figura 2es un esquema que muestra en general el método de captura de dianas y codificación con código de barras según una realización de la presente descripción. Se representan partículas modelo de captura que comprenden anticuerpos específicos de la diana (representados esquemáticamente por círculos grises rodeados de cruces, panel izquierdo de la figura 2). Las partículas modelo de captura se combinan con las partículas diana (representadas como pequeños círculos, panel izquierdo de la figura 2), lo que permite la captura específica de la diana de una porción de las partículas diana. Cada partícula modelo de captura, esté o no asociada con una partícula diana capturada, se encapsula en gotitas monodispersas (representadas por los círculos grises más grandes, panel central de la figura 2). Las partículas diana asociadas se lisan a continuación dentro de la encapsulación para liberar ácidos nucleicos (representados por líneas negras dentro de la gotita monodispersa, panel derecho de la figura 2). A continuación, una porción de los ácidos nucleicos se asocia de manera específica de sitio con el elemento de captura específico de la diana de la partícula modelo de captura, y los ácidos nucleicos asociados se amplifican. Los productos de amplificación se marcan para el elemento de captura específico de la diana utilizado (representado por “Tipo” ) y para la partícula diana específica de la que se originaron (“ ID” ). La secuencia amplificada se muestra como el segmento unido al segmento “ ID” en la figura.

La figura 3es una parte 1 de un esquema que muestra un flujo de trabajo de casos del método de captura de dianas y codificación con código de barras en gotitas monodispersas según una realización de la presente descripción. Una muestra biológica que comprende vesículas de exosoma (círculos grises) se incuba con partículas modelo de captura (denominadas “ PIPS de captura” ) para proporcionar una primera mezcla. En la realización representada, las partículas modelo de captura comprenden anticuerpos antitetraspanina que permiten la asociación específica de los exosomas con las partículas modelo de captura. Las partículas modelo de captura comprenden además un identificador genético de elemento de captura que comprende una secuencia poli-T. Cada asociación específica de la diana comprende un exosoma y una partícula modelo de captura. La mezcla se centrifuga y los exosomas asociados y las partículas de captura diana sedimentan. El sobrenadante se desecha (no se muestra) y el sedimento se resuspende en un tampón de reacción que comprende una mezcla de tampón de lisis y reactivos de rtPCR para proporcionar una segunda mezcla. Se añade aceite (“ aceite de partición” ) a la segunda mezcla para proporcionar una tercera mezcla.

La figura 4es una parte 2 de un esquema que muestra un flujo de trabajo de casos del método de captura de dianas y codificación con código de barras en gotitas monodispersas según una realización de la presente descripción. Cizallar o dividir la tercera mezcla de modo que las partículas modelo de captura y los exosomas asociados se encapsulen en una pluralidad de gotitas monodispersas en el aceite de partición. Cada partícula modelo de captura y el exosoma asociado se encapsulan en una única gotita monodispersa. A continuación, los exosomas asociados se lisan, usando lisis activada por temperatura, para liberar su contenido, incluyendo ácidos nucleicos (representados como líneas negras), sin romper la encapsulación en gotitas monodispersas. Las moléculas de ARNm liberadas pueden asociarse, a continuación, con las secuencias poli-T (“ captura de poli-T” ) del identificador genético de elemento de captura de la partícula modelo de captura. Los otros elementos del identificador genético de elemento de captura representado incluyen un oligonucleótido LR que comprende una secuencia enlazadora (denominada “ enlazador” , representada en gris oscuro) y un oligonucleótido adaptador universal (denominado “ adaptador de PCR universal” ) y un elemento de ID de modelo (denominado “ código de barras específico de modelo” ). A continuación, se realiza una reacción de transcripción inversa para generar modelos de ADNc de los ARNm asociados. La figura 4 representa múltiples moléculas de ADNc unidas a múltiples identificadores genéticos de elementos de captura de la partícula modelo de captura.

La figura 5es una parte 3 de un esquema que muestra un flujo de trabajo de casos del método de captura de dianas y codificación con código de barras en gotitas monodispersas según una realización de la presente descripción. Se ilustra una reacción de amplificación de los ADNc de la figura 4 (líneas discontinuas con puntas de flecha), usando cebadores hexámeros (denominados “ cebadores hexámeros (a granel)” ) que comprenden una “ cola” de secuencia adaptadora universal (denominada “ adaptador de PCR universal” , representada en rojo) para crear productos de amplificación de longitud de secuencia diana variable. Los productos de amplificación de los cebadores hexámeros contienen la cola del hexámero, que comprende el elemento adaptador universal en sus extremos 3', y los elementos ID, TIPO y universal, derivados del identificador genético de elemento de captura, en sus extremos 5'. Todos los fragmentos (productos de amplificación de ADN) procedentes del mismo exosoma portan el mismo elemento de ID de modelo (también denominado “ código de barras” ).

La figura 6es un esquema que representa una realización del resto de captura de la partícula modelo de captura. En la realización mostrada, el resto de captura comprende un enlazador hidrocarbonado terminado en acrilato con terminación en biotina, y se puede unir a elementos de captura específicos de la diana, tales como un anticuerpo conjugado con estreptavidina. En la realización ilustrada, los anticuerpos conjugados con estreptavidina, específicos de la diana, representados por las letras “A” y “ B” . A y B representan cualquier anticuerpo elegido y adecuado y se pueden crear versiones prácticamente infinitas de elementos de captura específicos de la diana usando diversos anticuerpos, tal como se indica mediante puntos suspensivos y se ilustra con el anticuerpo “ n” .

La figura 7es un esquema que representa el resto identificador genético de elemento de captura de la partícula modelo de captura. El resto identificador genético de elemento de captura comprende un enlazador hidrocarbonado de acrilato con un polinucleótido adaptador terminal, en donde el polinucleótido adaptador terminal comprende una secuencia enlazadora y un oligonucleótido adaptador universal (la secuencia enlazadora y el oligonucleótido adaptador universal se denominan en la presente memoria “ LR” ), y en donde el LR se puede unir un identificador genético de elemento de captura específico de la diana que comprende un oligonucleótido L<r>por medio de interacción de cadenas complementarias. Las realizaciones del identificador genético de elemento de captura representado son oligonucleótidos que comprenden un LR, un elemento de tipo modelo (denominado “ TIPO” ), un elemento de ID de modelo (denominado “ ID” ) y un elemento de captura específico de la diana (denominado “ región de captura” ). El esquema muestra elementos de tipo modelo específicos “A” y “ B” . El tipo de modelo puede ser cualquier secuencia de ácido nucleico deseada, tal como se indica mediante puntos suspensivos y se ilustra mediante la secuencia de ácido nucleico de elementos de tipo modelo “ n” .

Las figuras 8A-B son esquemas que representan dos realizaciones diferentes de la partícula modelo de captura. La partícula modelo de captura de la figura 8A presenta una partícula modelo de captura que comprende un resto de captura unido al anticuerpo específico de la diana conjugado con estreptavidina “A” , y un resto identificador genético de elemento de captura unido al identificador genético de elemento de captura específico de la diana que comprende un elemento de tipo modelo “A” . La partícula modelo de captura de la figura 8B representa una partícula modelo de captura que comprende un resto de captura unido al anticuerpo conjugado con estreptavidina “ n” , y un resto identificador genético de elemento de captura unido al identificador genético de elemento de captura específico de la diana que comprende un elemento de tipo modelo “ n” .

Las figuras 9A-F son esquemas que muestran en general el método de captura de dianas y codificación con código de barras según una realización de la presente descripción. Se representan (figura 9A) partículas modelo de captura que comprenden anticuerpos específicos de la diana (representados esquemáticamente por “A” , “ B” y “ n” ). Las partículas modelo de captura se combinan (figuras 9A-B) con partículas diana (círculos marcados con A y B), lo que permite la captura específica de la diana de una porción de las partículas diana. La mezcla que comprende partículas modelo de captura y partículas diana representadas en la figura 9B se denomina en la presente memoria primera mezcla. La adición de un segundo fluido (figura 9C), tal como aceite, y el cizallamiento se usan para generar encapsulaciones (también denominadas en la presente memoria “ particiones” ) que comprenden partículas modelo de captura, en donde una porción de las partículas modelo de captura se une a las partículas diana (figura 9D). La lisis de las partículas diana dentro de las encapsulaciones libera ácidos nucleicos contenidos en las partículas modelo (figura 9E). Los identificadores genéticos de elementos de captura específicos de la diana (no mostrados) se usan para capturar porciones específicas de los ácidos nucleicos derivados de las partículas diana. A continuación, los ácidos nucleicos capturados pueden amplificarse. La figura 9F representa los productos de amplificación de ácidos nucleicos derivados de las partículas diana A y B. Como los identificadores genéticos de elementos de captura específicos de la diana comprenden elementos de tipo modelo que identifican la partícula diana de la que se derivan los ácidos nucleicos, los amplicones comprenden en consecuencia los elementos de tipo modelo “A” y “ B” .

Las figuras 10A-J son esquemas que muestran un flujo de trabajo de casos del método de captura de dianas y codificación con código de barras en gotitas monodispersas según una realización de la presente descripción. Una muestra biológica que comprende partículas diana (figura 10A, círculos grises) se incuba con partículas modelo de captura (círculos blancos) para proporcionar una primera mezcla (figura 10B). Cada asociación específica de la diana generalmente comprende una partícula diana y una partícula modelo de captura. La mezcla se centrifuga y los exosomas asociados y las partículas de captura diana sedimentan, y el sedimento se resuspende en un tampón de reacción que comprende una mezcla de tampón de lisis y reactivos de rtPCR para proporcionar una segunda mezcla (figura 10C). Se añade aceite (“ aceite de partición” , capa representada en gris más oscuro) a la segunda mezcla para proporcionar una tercera mezcla (figura 10D). La tercera mezcla se cizalla o se divide, de modo que las partículas modelo de captura y las partículas diana asociadas se encapsulen en una pluralidad de gotitas monodispersas en el aceite de partición. Cada partícula modelo de captura y partícula diana asociada se encapsulan en una única gotita monodispersa (figura 10E). En la figura 10F se representa una única encapsulación que comprende una partícula modelo de captura asociada a una partícula diana. A continuación, las partículas diana asociadas se lisan para liberar su contenido, incluyendo ácidos nucleicos (representados como líneas discontinuas), sin romper la encapsulación en las gotitas monodispersas (figura 10G). Las partículas modelo de captura comprenden además un identificador genético de elemento de captura que comprende una secuencia poli-T representada en la figura 10H. Las moléculas de ARNm liberadas pueden asociarse, a continuación, con las secuencias poli-T (elemento bordeado por una línea discontinua y marcado con “TTTTT” ) del identificador genético de elemento de captura de la partícula modelo de captura. Los otros elementos del identificador genético de elemento de captura representado incluyen una secuencia enlazadora (“ enlazador” ) y un oligonucleótido adaptador universal (“ universal” ), y un elemento índice de modelos (“ índ. de mod.” ). A continuación, se realiza una reacción de transcripción inversa para generar modelos de ADNc de los ARNm asociados. La figura 10I representa múltiples moléculas de ADNc unidas a múltiples identificadores genéticos de elementos de captura de la partícula modelo de captura. A continuación, se realiza una reacción de amplificación tal como se ilustra (figura 10J), en donde se usan cebadores hexámeros (líneas grises continuas) que comprenden una “ cola” de secuencia adaptadora universal (líneas discontinuas) para amplificar porciones de longitud variable de los ADNc de la figura 10I. Los productos de amplificación de los cebadores hexámeros contienen la cola del hexámero, que comprende un elemento adaptador universal en sus extremos 3', y los elementos índ. de mod. y universal, derivados del identificador genético de elemento de captura, en sus extremos 5'.

La figura 11es una micrografía de encapsulación generada según una realización de los métodos descritos en la presente memoria. Algunas encapsulaciones comprenden una partícula modelo de captura. Se proporciona una vista en primer plano de una encapsulación que comprende una partícula modelo de captura asociada con una vesícula capturada.

Descripción detallada de la invención

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. La presente descripción proporciona un método mejorado de captura de dianas y codificación con código de barras basado en gotitas en emulsión. La presente descripción proporciona además partículas modelo de captura que permiten capturar dianas de interés a partir de muestras biológicas, y codificar con códigos de barras los ácidos nucleicos específicos contenidos en las dianas capturadas. Los ácidos nucleicos pueden estar contenidos dentro de estructuras vivas o no vivas, incluyendo partículas, virus y células. Los ácidos nucleicos pueden incluir, por ejemplo, ADN o ARN, que después pueden detectarse, cuantificarse y/o clasificarse, por ejemplo, basándose en su secuencia detectada con técnicas de amplificación de ácidos nucleicos, por ejemplo, PCR y/o<m>D<a>. Los métodos descritos implican el uso de las partículas modelo de captura para modelizar la formación de gotitas monodispersas.

Antes de que la presente descripción se describa con más detalle, debe entenderse que esta descripción no se limita a las realizaciones particulares descritas, ya que, por supuesto, pueden variar. Debe entenderse también que la terminología usada en la presente memoria tiene el propósito de describir realizaciones particulares únicamente y no pretende ser limitante.

Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto indique claramente lo contrario, entre el límite superior y el inferior de ese intervalo y cualquier otro valor establecido o intermedio en ese intervalo establecido, está incluido en la presente descripción. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse de forma independiente en los intervalos más pequeños, y también están englobados en la presente descripción, sujetos a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo establecido. Cuando el intervalo establecido incluye uno o ambos de los límites, los intervalos que excluyen uno o ambos de los límites incluidos también se incluyen en la presente descripción.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que el entendido habitualmente por un experto en la técnica a la que pertenece la presente descripción. Aunque cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria pueden usarse en la práctica o prueba de la presente descripción, a continuación se describen algunos métodos y materiales potenciales y de ejemplo.

Cabe señalar que, como se utiliza en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “ un” , “ uno” , “ una” , “ el” y “ la” incluyen referentes plurales salvo que el contexto indique claramente lo contrario.

Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a “ una gotita” incluye una pluralidad de dichas gotitas y la referencia a “ el ácido nucleico” incluye la referencia a uno o más ácidos nucleicos y equivalentes de los mismos conocidos por los expertos en la técnica, etc.

Cabe señalar, además, que las reivindicaciones pueden redactarse para excluir cualquier elemento que pueda ser opcional. Así pues, esta declaración tiene por objeto servir de base antecedente para el uso de terminología exclusiva tal como “ exclusivamente” , “ únicamente” y similares en relación con la enumeración de los elementos de reivindicación, o el uso de una limitación “ negativa” .

Las publicaciones comentadas en la presente memoria se proporcionan exclusivamente para su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicación reales, que puede ser necesario confirmar de forma independiente.

Métodos

Como se resumió anteriormente, los métodos y sistemas descritos en la presente memoria proporcionan partículas modelo de captura y un método mejorado de captura de dianas y codificación con código de barras basado en gotitas en emulsión en gotitas monodispersas de las mismas. Las partículas modelo de captura y los métodos descritos en la presente memoria permiten capturar dianas de interés a partir de muestras biológicas y codificar con códigos de barras los ácidos nucleicos específicos contenidos en las dianas capturadas. El método de captura de dianas basado en gotitas en emulsión y codificación con código de barras en gotitas monodispersas proporciona un enfoque flexible y sensible para capturar dianas de interés a partir de muestras biológicas, seleccionar y extraer ácidos nucleicos específicos contenidos en los dianas de interés capturados y asignarles códigos de barras de polinucleótidos que identifican la diana, amplificar el material de ácido nucleico codificado con código de barras y preparar bibliotecas listas para su análisis en la instrumentación de secuenciación.

Estas descritas en la presente memoria, pero no reivindicadas, partículas modelo de captura y un método mejorado de captura de dianas y codificación con código de barras basado en gotitas en emulsión de las mismas aprovecha la tecnología de emulsificación basada en modelos de partículas descrita anteriormente. Esencialmente, se usan perlas a escala micrométrica (tales como hidrogeles) o “ partículas modelo” para definir un volumen de fluido aislado rodeado por un fluido de partición inmiscible y estabilizado por tensioactivos insensibles a la temperatura.

Como se utiliza en la presente memoria, el término “ muestra biológica” abarca una variedad de tipos de muestras obtenidas de una variedad de fuentes, generalmente los tipos de muestra contienen material biológico. Por ejemplo, el término incluye muestras biológicas obtenidas de un sujeto mamífero, por ejemplo, un sujeto humano, y muestras biológicas obtenidas de un alimento, agua u otra fuente ambiental, etc. La definición abarca muestras de sangre y otras muestras líquidas de origen biológico, así como muestras de tejido sólido tales como una muestra de biopsia o cultivos de tejidos o células derivadas de los mismos y su descendencia. La definición también incluye muestras que se han manipulado de alguna manera después de su obtención, tal como mediante el tratamiento con reactivos, la solubilización o el enriquecimiento de ciertos componentes, tales como los polinucleótidos. El término “ muestra biológica” abarca una muestra clínica y también incluye células en cultivo, sobrenadantes celulares, lisados celulares, células, suero, plasma, fluido biológico y muestras de tejido. La “ muestra biológica” incluye células, por ejemplo, células bacterianas o células eucariotas; fluidos biológicos tales como sangre, líquido cefalorraquídeo, semen, saliva y similares; bilis; médula ósea; piel (por ejemplo, biopsia de piel); y anticuerpos obtenidos de un individuo. Algunos ejemplos no limitantes de una muestra biológica incluyen dianas de biopsia líquida, tales como células circulantes (tumorales, fetales o madre), componentes celulares (por ejemplo, núcleos), ácidos nucleicos libres de células, vesículas extracelulares y antígenos proteicos, que están siendo diana para el desarrollo de diagnósticos no invasivos para una variedad de tipos de cáncer. El término muestra biológica también incluye dianas biológicas indicativas de enfermedades tales como procariotas, hongos y virus.

Como se describe más detalladamente en la presente memoria, en diversos aspectos, los métodos en cuestión pueden usarse para detectar una variedad de componentes a partir de dichas muestras biológicas. Los componentes de interés incluyen, pero no se limitan necesariamente a, células (por ejemplo, células circulantes y/o células tumorales circulantes), virus, polinucleótidos (por ejemplo, ADN y/o ARN), polipéptidos (por ejemplo, péptidos y/o proteínas) y muchos otros componentes que pueden estar presentes en una muestra biológica.

Más específicamente, los términos “ componente de interés” , “ diana de interés” y “ partícula diana” se usan indistintamente en la presente memoria y abarcan cualquier componente que pueda estar presente en una muestra biológica.

Los “ polinucleótidos” u “ oligonucleótidos” , tal como se utilizan en la presente memoria, se refieren a polímeros lineales de monómeros de nucleótidos y pueden usarse indistintamente. Los polinucleótidos y oligonucleótidos pueden tener cualquiera de una variedad de configuraciones estructurales, por ejemplo, ser monocatenarios, bicatenarios o una combinación de ambas, además de tener estructuras terciarias/secundarias intra o intermoleculares de orden superior, por ejemplo, horquillas, bucles, regiones tricatenarias, etc. Los polinucleótidos normalmente varían en tamaño desde unas pocas unidades monoméricas, por ejemplo, 5-40, cuando habitualmente se denominan “ oligonucleótidos” , hasta varios miles de unidades monoméricas. Siempre que un polinucleótido u oligonucleótido esté representado por una secuencia de letras (mayúsculas o minúsculas), tal como “ATGCCTG” , se entenderá que los nucleótidos están en un orden de 5' → 3' de izquierda a derecha y que “A” indica desoxiadenosina, “ C” indica desoxicitidina, “ G” indica desoxiguanosina y “T” indica desoxitimidina, “ I” indica desoxiinosina, “ U” indica desoxiuridina, a menos que se indique lo contrario o sea evidente por el contexto. A menos que se indique lo contrario, las convenciones de terminología y numeración de átomos seguirán las descritas en Strachan y Read, Human Molecular Genetics 2 (Wiley-Liss, Nueva York, 1999).

Los términos “ polipéptido” , “ péptido” y “ proteína” , usados indistintamente en la presente memoria, se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud. NH2 se refiere al grupo amino libre presente en el extremo amino de un polipéptido. COOH se refiere al grupo carboxilo libre presente en el extremo carboxilo de un polipéptido. De conformidad con la nomenclatura polipeptídica estándar, se usa J. Biol. Chem., 243 (1969), 3552-3559.

En ciertos aspectos, se proporcionan métodos para contar y/o genotipar células, incluyendo células normales o células tumorales, tales como las CTC. Una característica de dichos métodos es el uso de microfluídica.

Los métodos descritos en la presente memoria generalmente implican permitir la captura específica de la diana de una pluralidad de dianas de interés mediante una pluralidad de partículas modelo de captura, y encapsular las partículas diana y partículas modelo de captura asociadas en una pluralidad de gotitas monodispersas que incluyen gotitas monodispersas en emulsión única o gotitas en emulsión múltiple y/o GUV, que pueden ir seguidas, por ejemplo, de una o más etapas de síntesis de ácidos nucleicos y/o una o más etapas de detección y/o clasificación. La “ captura” de la partícula diana por la partícula modelo de captura también se puede describir en la presente memoria como unión, fijación, interacción o asociación de otro tipo. Por consiguiente, los términos “ captura” , “ unión” , “ fijación” , “ interacción” y “ asociación” se usan indistintamente en la presente memoria.

Partículas modelo de captura y preparación de las mismas

La figura 1, la figura 6 y la figura 7.son esquemas que representan los elementos de una partícula modelo de captura según una realización de la presente descripción, cuya descripción no se reivindica. En algunas realizaciones, la partícula modelo de captura comprende una partícula modelo que comprende una o más restos de anclaje, en donde cada uno de los una o más restos de anclaje se puede unir a elementos específicos de la diana. Los restos de anclaje de la presente descripción que no se reivindican incluyen el resto de captura (figura 1- resto A, en la figura 6, elemento 10) y el resto identificador genético de elemento de captura (figura 1- resto B, en la figura 7, elemento 40). El resto de captura y el resto identificador genético de elemento de captura (40) pueden comprender un enlazador que forma parte de, y/o se puede unir a, la partícula modelo. Diversas realizaciones del enlazador y los elementos unidos al mismo incluyen el enlazador hidrocarbonado terminado en acrilato (1), el enlazador hidrocarbonado terminado en acrilato (1) con terminación en biotina (2), el enlazador hidrocarbonado terminado en acrilato (1), el enlazador terminado en alquino (1) con terminación en biotina (2) o el enlazador terminado en alquino (1) sin terminación en biotina. En algunas realizaciones, el resto identificador genético de elemento de captura (figura 1- resto B, en la figura 7 elemento 40) comprende un enlazador hidrocarbonado terminado en acrilato (1) con un polinucleótido adaptador terminal (figura 1-LR, en la figura 7 elemento 6). La partícula modelo se prepara combinando un material de hidrogel, por ejemplo, una matriz de copolímero de acrilamida/bisacrilamida, con uno o más de los restos de anclaje (10, 40) según la presente descripción. En algunas realizaciones, la partícula modelo puede comprender material de hidrogel y el resto de captura (10). En dichas realizaciones, la partícula modelo se prepara combinando material de hidrogel, por ejemplo, matriz de copolímero de acrilamida/bisacrilamida y un enlazador hidrocarbonado terminado en acrilato con terminación en biotina. En otras realizaciones, la partícula modelo puede comprender material de hidrogel y el resto identificador genético de elemento de captura (40). En dichas realizaciones, la partícula modelo se prepara combinando material de hidrogel, por ejemplo, matriz de copolímero de acrilamida/bisacrilamida y un enlazador hidrocarbonado terminado en acrilato con un polinucleótido adaptador terminal. En otras realizaciones más, la partícula modelo comprende material de hidrogel, el resto de captura (10) y el resto identificador genético de elemento de captura (40). Por consiguiente, en la realización en donde la partícula modelo comprende el resto de captura (10) y el resto identificador genético de elemento de captura (40), esta se prepara combinando material de hidrogel, por ejemplo, matriz de copolímero de acrilamida/bisacrilamida, enlazador hidrocarbonado terminado en acrilato (1) con terminación de biotina (4) y enlazador hidrocarbonado terminado en acrilato (1) con polinucleótido adaptador terminal (6). Tras la formación de las partículas modelo, se dimensionan hasta el diámetro deseado. En algunas realizaciones, el dimensionamiento de las partículas modelo se realiza mediante un flujo paralelo microfluídico en una fase oleosa inmiscible. La generación de partículas modelo bajo control microfluídico se analiza con más detalle a continuación.

En algunas realizaciones de las partículas modelo, una variación en el diámetro o la dimensión más grande de las partículas modelo tal que al menos el 50 % o más, por ejemplo, el 60 % o más, el 70 % o más, el 80 % o más, el 90 % o más, el 95 % o más o el 99 % o más de las partículas modelo varíe en diámetro o dimensión más grande en menos de un factor de 10, por ejemplo, menos de un factor de 5, menos de un factor de 4, menos de un factor de 3, menos de un factor de 2, menos de un factor de 1,5, menos de un factor de 1,4, menos de un factor de 1,3, menos de un factor de 1,2, menos de un factor de 1,1, menos de un factor de 1,05 o menos de un factor de 1,01.

Tal como se utilizan en la presente memoria, los términos “ partículas modelo” y “ partícula modelo” se usan indistintamente para referirse a partículas pequeñas, generalmente esféricas. Las partículas modelo pueden ser porosas o no porosas. En cualquier realización adecuada de la presente memoria, las partículas modelo pueden incluir microcompartimentos, que pueden contener componentes y/o reactivos adicionales, por ejemplo, componentes y/o reactivos adicionales que pueden liberarse en gotitas monodispersas como se describe en la presente memoria. En cualquier realización adecuada de la presente invención, las partículas modelo pueden incluir un polímero, por ejemplo, un hidrogel. En algunas realizaciones, por ejemplo, las realizaciones descritas en la presente memoria en las cuales el primer fluido es un fluido acuoso, el polímero es un polímero hidrófilo. En algunas realizaciones, por ejemplo, las realizaciones descritas en la presente memoria en las cuales el primer fluido es un fluido no acuoso, por ejemplo, un aceite, el polímero es un polímero lipófilo. Las partículas modelo generalmente varían de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1000 pm de diámetro o dimensión más grande. En algunas realizaciones, las partículas modelo tienen un diámetro o una dimensión más grande de aproximadamente 1,0 pm a 1000 pm, inclusive, tal como 1,0 pm a 750 pm, 1,0 pm a 500 pm, 1,0 pm a 250 pm, 1,0 pm a 200 pm, 1,0 pm a 150 pm, 1,0 pm a 100 pm, 1,0 pm a 10 pm o 1,0 pm a 5 pm, inclusive. En algunas realizaciones, las partículas modelo tienen un diámetro o una dimensión más grande de aproximadamente 10 pm a aproximadamente 200 pm, por ejemplo, de aproximadamente 10 pm a aproximadamente 150 pm, de aproximadamente 10 pm a aproximadamente 125 pm, o de aproximadamente 10 pm a aproximadamente 100 pm.

Al poner en práctica los métodos descritos en la presente memoria que no se reivindican, la composición y la naturaleza de las partículas modelo pueden variar. Por ejemplo, en ciertos aspectos, las partículas modelo pueden ser partículas de microgel que son esferas de matriz de gel a escala micrométrica. En algunas realizaciones, los microgeles están compuestos de un polímero hidrófilo que es soluble en agua, incluyendo alginato o agarosa. En otras realizaciones, los microgeles están compuestos por un microgel lipófilo.

Las partículas modelo según la invención son un hidrogel. En ciertas realizaciones, el hidrogel se selecciona entre materiales de origen natural, materiales de origen sintético y combinaciones de los mismos. Los ejemplos de hidrogeles incluyen, pero no se limitan a, colágeno, hialuronano, quitosano, fibrina, gelatina, alginato, agarosa, sulfato de condroitina, poliacrilamida, polietilenglicol (PEG), alcohol polivinílico (PVA), matriz de copolímero de acrilamida/bisacrilamida, poliacrilamida/poli(ácido acrílico) (PAA), metacrilato de hidroxietilo (HEMA), poli-N-isopropilacrilamida (NIPAM) y polianhídridos, fumarato de polipropileno) (PPF).

En algunas realizaciones, las partículas modelo tienen un volumen promedio, y un método como se describe en la presente memoria incluye contraer las partículas modelo para disminuir el volumen promedio. La contracción puede producirse tras la aplicación de un estímulo externo, por ejemplo, calor. Por ejemplo, las partículas modelo pueden encapsularse en un fluido mediante cizallamiento, seguido de la aplicación de calor, lo que hace que las partículas modelo contraigan su tamaño. La gotita monodispersa en emulsión única o gotita en emulsión doble o GUV no se contraerá porque el volumen de la gotita es constante y está dictado por el tamaño original de la partícula modelo, pero la partícula modelo dentro de la gotita se contraerá alejándose de la superficie de la gotita.

En cualquier realización adecuada de la presente memoria, las partículas modelo pueden incluir al menos uno de células, genes, moléculas de fármacos, agentes terapéuticos, partículas, agentes bioactivos, agentes osteogénicos, agentes osteoconductores, agentes osteoinductores, agentes antiinflamatorios, factores de crecimiento, partículas de polipéptidos derivados de fibroína, reactivos de síntesis de ácidos nucleicos, reactivos de detección de ácidos nucleicos, partículas diana, moléculas de ADN, moléculas de ARN, moléculas de ADN genómico y las combinaciones de los mismos. En realizaciones que implican la combinación de múltiples reactivos dentro de una gotita monodispersa en emulsión única o una gotita en doble emulsión o GUV, las partículas modelo pueden contener múltiples compartimentos. Las partículas modelo pueden usarse para encapsular reactivos que pueden activarse para liberar un compuesto deseado, por ejemplo, un sustrato para una reacción enzimática. Por ejemplo, una gotita en emulsión doble puede encapsularse en las partículas modelo que se activan para romperse tras la aplicación de un estímulo, por ejemplo, calor. El estímulo inicia una reacción después de que las partículas modelo se hayan encapsulado en un fluido de fase portadora inmiscible.

Las partículas modelo pueden generarse bajo control microfluídico, por ejemplo, usando los métodos descritos en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2015/0232942. Los dispositivos microfluídicos pueden formar emulsiones que consisten en gotitas de tamaño extremadamente uniforme. El proceso de generación de partículas modelo se puede llevar a cabo bombeando dos fluidos inmiscibles, tales como aceite y agua, a una unión. La forma de la unión, las propiedades del fluido (viscosidad, tensión interfacial, etc.) y los caudales influyen en las propiedades de las partículas modelo generadas, pero, para una gama relativamente amplia de propiedades, se pueden generar partículas modelo de tamaño uniforme y controlado usando métodos tales como las uniones en T y el enfoque de flujo. Para variar el tamaño de las partículas modelo, los caudales de los líquidos inmiscibles pueden variar ya que, para las metodologías de unión en T y enfoque de flujo en una cierta gama de propiedades, el tamaño de las partículas modelo depende del caudal total y de la proporción de los dos caudales de fluido. Para generar una partícula modelo con métodos microfluídicos, los dos fluidos se cargan normalmente en dos depósitos de entrada (por ejemplo, jeringas, tubos de presión) y a continuación se presurizan según sea necesario para generar los caudales deseados (por ejemplo, usando bombas de jeringa, reguladores de presión, gravedad, etc.). Esto bombea los fluidos a través del dispositivo a los caudales deseados, generando de este modo gotitas del tamaño y la velocidad deseados.

En algunas realizaciones, las partículas modelo pueden generarse usando técnicas de generación de gotitas paralelas, que incluyen, pero no se limitan a, placas de división y distribución en serie. Las técnicas de generación de gotitas paralelas de interés incluyen además las descritas por Abate y Weitz, Lab Chip 2011, 7 de junio;11(11):1911 -5; y Huang y col, RSC Advances 2017, 7, 14932-14938.

En algunas realizaciones, se permite que las partículas modelo se solidifiquen activando un mecanismo de gelificación, que incluye, pero no se limita a, la polimerización o reticulación de una matriz de gel. Por ejemplo, los geles de poliacrilamida se forman por copolimerización de acrilamida y bis-acrilamida. La reacción es una polimerización por adición de vinilo iniciada por un sistema generador de radicales libres. En ciertos aspectos, los hidrogeles de agarosa se gelifican enfriando los hidrogeles por debajo de la temperatura de gelificación.

En algunas realizaciones, las partículas modelo pueden retirarse del fluido, secarse y almacenarse en forma estable durante un período de tiempo. Los ejemplos de enfoques de secado incluyen, pero no se limitan a, calentamiento, secado al vacío, liofilización y secado supercrítico. En algunas realizaciones, las partículas modelo secas pueden combinarse con un fluido, pero aún conservan la forma y la estructura como partículas de gel independientes, a menudo esféricas. En algunas realizaciones, las partículas modelo secas se combinan con un fluido apropiado, lo que hace que una porción del fluido sea absorbida por las partículas modelo. En algunas realizaciones, la porosidad de las partículas modelo puede variar, para permitir que al menos una de una pluralidad de partículas diana se absorba en las partículas modelo cuando se combinan con el fluido apropiado. Se puede usar cualquier fluido conveniente que permita realizar la absorción deseada en las partículas modelo.

Tal como se utilizan en la presente memoria, los términos “ absorber” , “ hincharse” y “ expandirse” , tal como se aplican a las partículas modelo, pueden usarse indistintamente para referirse al proceso en el cual un fluido impregna una sustancia, o en el que una sustancia incorpora un fluido. En algunas realizaciones, la sustancia que se absorbe puede conservar al menos una porción de su forma y estructura. En algunas realizaciones, la sustancia que se absorbe puede incorporarse a un fluido para formar una solución.

En ciertos aspectos, se puede usar un tensioactivo para estabilizar las partículas modelo. Por consiguiente, una partícula modelo puede implicar una emulsión estabilizada con tensioactivo, por ejemplo, una emulsión única estabilizada con tensioactivo o una emulsión doble estabilizada con tensioactivo. Se puede usar cualquier tensioactivo conveniente que permita realizar las reacciones deseadas en las partículas modelo. En otros aspectos, una partícula modelo no se estabiliza mediante tensioactivos o partículas.

Para generar las partículas modelo de captura, los elementos específicos de la diana se unen a las partículas modelo dimensionadas. Los elementos específicos de la diana de la presente descripción se seleccionan entre elementos de captura específicos de la diana y el identificador genético de elemento de captura específico de la diana. Los elementos de captura específicos de la diana comprenden secuencias de polinucleótidos poli-T, aptámeros y anticuerpos. En algunas realizaciones, los elementos de captura específicos de la diana comprenden estreptavidina (3) y, por lo tanto, pueden unirse al resto de captura por afinidad entre la biotina y la estreptavidina. Se muestra (20) una representación esquemática de los anticuerpos conjugados con estreptavidina específicos de la diana (el tipo de anticuerpo representado por diferentes tonos de gris y marcado en la figura 1, y con las letras “A” , “ B” , etc., a “ n” en la figura 6). En algunas realizaciones, los anticuerpos (4) se conjugan con la estreptavidina (3) mediante un enlazador hidrocarbonado (5).

El identificador genético de elemento de captura específico de la diana (figura 1 y en la figura 7 elemento 50) es un oligonucleótido y comprende elementos seleccionados entre un oligonucleótido LR (en la figura 7, elemento 6), un elemento de tipo modelo (también denominado en la presente memoria “ TIPO” y en la figura 7 elemento 7), un elemento de ID de modelo (también denominado en la presente memoria “ ID” , y en la figura 7 elemento 8), y elemento de captura específico de la diana (también denominado en la presente memoria “ región de captura” , y en la figura 7 elemento 9), y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el identificador genético de elemento de captura específico de la diana (50), que comprende una secuencia LR (6) complementaria a la secuencia LR del resto identificador genético de elemento de captura, puede unirse al resto identificador genético de elemento de captura (40) mediante la interacción de cadenas complementarias entre las secuencias LR (6).

La unión de los elementos específicos de la diana (20, 50) a las partículas modelo se produce incubando dichos elementos específicos de la diana (20, 50) con partículas modelo. La incubación puede ser durante la cantidad de tiempo, temperatura y otras condiciones suficientes para permitir que los elementos específicos de la diana (20, 50) se unan a las partículas modelo. En algunas realizaciones, la incubación comprende sacudir, mezclar, hacer fluir o agitar para aumentar la exposición de los elementos específicos de la diana a las partículas modelo.

El elemento de captura específico de la diana (50) comprende un polinucleótido complementario a una sección del ácido nucleico diana (en la figura 7, el elemento 9, también denominado en la presente memoria “ elemento de captura específico de la diana” o “ región de captura” ) y se usa para capturar dicha diana de ácido nucleico.

En algunas realizaciones, el identificador genético de elemento de captura específico de la diana (50) corresponde al elemento de captura específico de la diana (20) presente en/sobre la misma partícula modelo de captura, es decir, codifica con códigos de barras el tipo de elemento de captura específico de la diana (20) utilizado (dicho código de barras se representa en la figura 1 como “TIPO” y en la figura 7 como elemento 7). Como se ilustra esquemáticamente, cuando una partícula modelo de captura comprende un anticuerpo-anticuerpo 1 específico, el identificador genético de elemento de captura específico de la diana unido a la misma partícula modelo de captura tendrá una secuencia de código de barras determinada que corresponde solo al anticuerpo 1. Esta realización también se ilustra en las figuras 8A-B, que se analizan con más detalle a continuación. Además, las secuencias de ID (8) del identificador genético de elemento de captura específico de la diana (50) son otro código de barras que puede rastrearse hasta la partícula modelo de captura a la que están unidas. Por lo tanto, los códigos de barras de polinucleótidos de identificación la diana, TIPO (7) e ID (8), permiten rastrear el origen del ácido nucleico amplificado usando el método de codificación con código de barras y captura de la diana basado en gotitas en emulsión.

El “ código de barras” o la “ secuencia de código de barras” , como se denominan en la presente memoria, son secuencias de polinucleótidos que son únicas, es decir, distinguibles de otras secuencias de códigos de barras. Las secuencias pueden tener cualquier longitud adecuada que sea suficiente para distinguir la secuencia de códigos de barras de otras secuencias de códigos de barras. Una secuencia de código de barras puede tener una longitud de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 nucleótidos o más. En algunas realizaciones, los códigos de barras están predefinidos y se seleccionan al azar.

Las realizaciones de la partícula modelo de captura descrita en la presente memoria se representan en las figuras 8A-B. La partícula modelo de captura de la figura 8A (70) comprende un resto de captura unido al anticuerpo “A” conjugado con estreptavidina (30), y un resto identificador genético de elemento de captura unido al identificador genético de elemento de captura específico de la diana que comprende un elemento tipo modelo “A” (60). Por lo tanto, el origen de los ácidos nucleicos capturados por el identificador genético de elemento de captura específico de la diana puede rastrearse hasta la partícula diana capturada de la que se derivaron. La figura 8B ejemplifica esta realización en donde una partícula modelo de captura comprende un resto de captura unido al anticuerpo “ n” conjugado con estreptavidina (30), y también un resto identificador genético de elemento de captura unido al identificador genético de elemento de captura específico de la diana que comprende un elemento tipo modelo “ n” (60). Por lo tanto, el tipo de modelo corresponde e identifica el anticuerpo utilizado.

Partículas modelo de captura y método de captura de dianas basado en gotitas en emulsión y de codificación con código de barras de las mismas

La figura 2es un esquema que muestra en general el flujo de trabajo del método de captura de dianas y codificación con código de barras en gotitas monodispersas según una realización de la presente descripción. Las partículas modelo de captura que comprenden elementos de captura específicos de la diana y elementos identificadores genéticos de elementos de captura específicos de la diana se representan esquemáticamente mediante círculos grises rodeados de cruces, en donde las cruces representan los elementos de captura específicos de la diana. Las partículas modelo de captura se combinan con partículas diana (representadas como pequeños círculos). La mezcla de partícula modelo de captura y partículas diana se incuba durante un período de tiempo suficiente para permitir la asociación específica de la diana de las partículas diana con los elementos de captura. En algunas realizaciones, se usa la agitación o la mezcla para aumentar la probabilidad de dicha asociación específica de la diana. Para formar encapsulaciones (también denominadas en la presente memoria “ particiones” ), la mezcla que comprende las partículas diana y las partículas modelo de captura unidas se combina con un segundo fluido para proporcionar una nueva mezcla, en donde el segundo fluido es inmiscible con dicha mezcla que comprende las partículas diana y las partículas modelo de captura unidas. En algunas realizaciones, el segundo fluido es un aceite. La siguiente etapa incluye el cizallamiento de la nueva mezcla de modo que se forme una pluralidad de gotitas monodispersas. En algunas realizaciones, una porción de las gotitas monodispersas comprende una partícula modelo de captura. En algunas realizaciones, cada partícula modelo de captura, esté o no asociada con una partícula diana, se encapsula en consecuencia en gotitas monodispersas (representadas por los círculos grises más grandes). Las partículas diana asociadas se lisan a continuación dentro de la encapsulación para liberar ácidos nucleicos (representados por líneas negras dentro de la gotita monodispersa). Los ácidos nucleicos liberados están suficientemente libres de cualquier compartimentación previa como para poder interactuar con los elementos de la partícula modelo de captura.

La lisis de las partículas diana dentro de la encapsulación se puede realizar usando cualquier método conocido en la técnica. En algunas realizaciones, el método de lisis se selecciona entre degradación a alta temperatura, liberación del reactivo de lisis a alta temperatura desde el interior de la matriz de hidrogel de la partícula modelo de captura, copartición rápida o lisis con un tampón de lisis activo. La lisis de las partículas diana capturadas se analiza con más detalle a continuación.

Tras la liberación de los ácidos nucleicos desde la partícula diana lisada, una porción seleccionada de los ácidos nucleicos puede asociarse a continuación, mediante la interacción de cadenas complementarias, con la secuencia de región de captura del identificador genético de elemento de captura específico de la diana. Los ácidos nucleicos asociados pueden amplificarse a continuación usando cebadores específicos para la secuencia de ácido nucleico diana y la secuencia LR del identificador genético de elemento de captura específico de la diana. Los productos de amplificación comprenden las secuencias ID y TIPO del identificador genético de elemento de captura específico de la diana y pueden rastrearse usando estos códigos de barras hasta el elemento de captura específico de la diana utilizado para capturar la partícula diana de la que se originaron, y hasta las partículas modelo de captura individuales a las que estaba unido dicho elemento de captura específico de la diana. En cualquiera de las aplicaciones del método de captura de dianas y codificación con código de barras descrito en la presente memoria, se puede preparar una biblioteca de secuenciación a partir de los productos de amplificación usando métodos estándar en la técnica.

De manera similar, las figuras 9A-F son esquemas que muestran generalmente el flujo de trabajo del método de captura de dianas y codificación con código de barras en gotitas monodispersas según una realización de la presente descripción. Las partículas modelo de captura (70) comprenden elementos de captura específicos de la diana y elementos identificadores genéticos de elementos de captura específicos de la diana, en donde diferentes porciones de las partículas modelo de captura (70) comprenden diferentes anticuerpos. En este ejemplo, una porción de las partículas modelo de captura comprende el anticuerpo “A” específico, mientras que otra porción comprende el anticuerpo “ B” y otra porción más comprende el anticuerpo “ n” . Por lo tanto, las partículas modelo de captura del ejemplo de las figuras 9A-F están diseñadas para capturar tres partículas diana específicas diferentes. Los anticuerpos representados por “A” , “ B” o “ n” pueden ser cualquier anticuerpo adecuado para su uso en relación con los métodos descritos en la presente memoria. Las partículas modelo de captura (70) se combinan con partículas diana (11). La mezcla de partícula modelo de captura y partículas diana se incuba durante un período de tiempo suficiente para permitir la asociación específica de la diana de las partículas diana con los elementos de captura. En algunas realizaciones, se usa la agitación o la mezcla para aumentar la probabilidad de dicha asociación específica de la diana. Para formar encapsulaciones (también denominadas “ particiones” ), la mezcla que comprende las partículas diana y las partículas modelo de captura unidas se combina con un segundo fluido (14) para proporcionar una nueva mezcla, en donde el segundo fluido es inmiscible con dicha mezcla que comprende las partículas diana y las partículas modelo de captura unidas. En algunas realizaciones, el tampón (12) en el cual se combinan las partículas modelo de captura (70) y las partículas diana (11) comprende la mezcla de uno o más reactivos de lisis y/o reactivos de rtPCR. En algunas realizaciones, el segundo fluido es un aceite. La siguiente etapa incluye el cizallamiento de la nueva mezcla de modo que se forme una pluralidad de gotitas monodispersas. En algunas realizaciones, una porción de las gotitas monodispersas comprende una partícula modelo de captura (80). En algunas realizaciones, cada partícula modelo de captura, esté o no asociada con una partícula diana, se encapsula en consecuencia en gotitas monodispersas. Las partículas diana asociadas se lisan a continuación (figura 9E) dentro de la encapsulación para liberar ácidos nucleicos (17). Los ácidos nucleicos liberados están suficientemente libres de cualquier compartimentación previa como para poder interactuar con los elementos de la partícula modelo de captura (no se muestra). La lisis se realiza usando cualquier método conocido en la técnica y descrito en la presente memoria.

Tras la liberación de los ácidos nucleicos desde la partícula diana lisada, una porción seleccionada de los ácidos nucleicos puede asociarse a continuación, mediante la interacción de cadenas complementarias, con la secuencia de región de captura del identificador genético de elemento de captura específico de la diana. Los ácidos nucleicos asociados pueden amplificarse a continuación usando, por ejemplo, cebadores específicos para la secuencia de ácido nucleico diana y la secuencia LR del identificador genético de elemento de captura específico de la diana. Cada producto de amplificación (90) comprende las secuencias específicas ID y TIPO del identificador genético de elemento de captura específico de la diana y pueden rastrearse usando estos códigos de barras hasta el elemento de captura específico de la diana que se usó para capturar la partícula diana de la que se derivaron, y hasta las partículas modelo de captura individuales a las que estaba unido dicho elemento de captura específico de la diana. En cualquiera de las aplicaciones del método de captura de dianas y codificación con código de barras descrito en la presente memoria, se puede preparar una biblioteca de secuenciación a partir de los productos de amplificación usando métodos estándar en la técnica.

Los esquemas de las figuras 10A-J desarrollan con más detalle una realización del método de captura de dianas y codificación con código de barras. El ejemplo presenta una muestra biológica que comprende partículas diana (por ejemplo, vesículas de exosoma) (11) que se incuban con partículas modelo de captura (también denominadas en la presente memoria “ PIPS de captura” , 70) para proporcionar una primera mezcla. Las partículas modelo de captura comprenden además un identificador genético de elemento de captura que comprende una secuencia poli-T (no se muestra). En algunas realizaciones, cada asociación comprende un exosoma y una partícula modelo de captura. En la siguiente etapa, la primera mezcla se centrifuga y los exosomas asociados y las partículas de captura diana sedimentan. El sobrenadante se desecha (no se muestra) y el sedimento se resuspende en un tampón (15) que puede comprender una mezcla de reactivos de lisis y reactivos de PCR de transcripción inversa para proporcionar una segunda mezcla. La etapa de centrifugación, como se ha descrito anteriormente, puede aumentar la proporción de las partículas modelo de captura unidas a una partícula diana (este aumento también se denomina en la presente memoria “ enriquecimiento” ). También permite la adición de la mezcla de reactivos de lisis y reactivos de transcripción inversa para facilitar la generación de ADNc dentro de las encapsulaciones. Otros métodos de enriquecimiento se analizan más adelante. A continuación, se añade a la segunda mezcla un segundo fluido generalmente inmiscible con la segunda mezcla, tal como un aceite (“ aceite de partición” , 16) para proporcionar una tercera mezcla. En algunas realizaciones, se omiten las etapas de centrifugación y resuspensión, y la primera mezcla se combina, después de la etapa de incubación como se describe en la presente memoria, con el segundo fluido (16) para permitir la etapa de cizallamiento que se describe a continuación. En la realización en que se omiten las etapas de centrifugación y resuspensión, la mezcla de reactivos de lisis y/o reactivos de rtPCR puede estar presentes en el tampón de incubación (figuras 10A, 15); como alternativa, pueden añadirse a la primera mezcla después de la etapa de incubación o, en algunas otras realizaciones, pueden estar presentes en el segundo fluido. La adición de los reactivos de lisis a través del segundo fluido se analiza con más detalle a continuación.

La siguiente etapa comprende cizallar (también denominado en la presente memoria “ dividir” ) la tercera mezcla, encapsulando así las partículas modelo de captura y los exosomas asociados en una pluralidad de gotitas monodispersas en el aceite de partición (figuras 10E, 80). En algunas realizaciones, cada partícula modelo de captura y el exosoma asociado se encapsulan en una sola gotita monodispersa. En la figura 11 se muestra una micrografía de una partícula de captura diana (70) asociada con una vesícula (11) y encapsulada en una gotita monodispersa (80). En la realización en la cual el tampón de resuspensión de la etapa de la figura 10C comprendía una mezcla de agentes de lisis y reactivos de transcripción inversa, cada gotita monodispersa contiene la mezcla de agentes de lisis y reactivos de PCR de transcripción inversa. Las partículas diana asociadas se lisan a continuación dentro de las gotitas monodispersas usando cualquier método de lisis adecuado y posteriormente liberan su contenido, incluidos los ácidos nucleicos (17). Las moléculas de ARNm liberadas pueden a continuación asociarse, a través de sus colas poli A (18), con las secuencias poli-T (9) del identificador genético de elemento de captura (50) de la partícula modelo de captura. Los otros elementos del identificador genético de elemento de captura representado (50) incluyen un oligonucleótido LR que comprende una secuencia enlazadora y un oligonucleótido adaptador universal (26, 21), y un elemento índice de modelos (19). El elemento índice de modelos (19) puede comprender elementos tales como el elemento TIPO y/o el elemento de ID descritos anteriormente, o incluso cualquier secuencia utilizable para rastrear el origen de los ácidos nucleicos asociados hasta una partícula diana particular. En algunas realizaciones, se pueden unir múltiples moléculas de ARNm a los múltiples identificadores genéticos de elementos de captura de la partícula modelo de captura.

Tras la unión de las moléculas de ARNm liberadas a las secuencias poli-T, se realiza una reacción de transcripción inversa para generar modelos de ADNc de los ARNm asociados. La figura 10I representa los ADNc generados (22) unidos a la partícula modelo de captura mediante los restos identificadores genéticos de elementos de captura unidos a los identificadores genéticos de elementos de captura específicos de la diana (60). La amplificación del ADNc (22) se puede realizar usando cebadores que comprenden secuencias específicas para un ADNc diana deseado y, de ese modo, amplificarán una porción específica predeterminada de la secuencia de dicho ADNc. Como alternativa, la amplificación de los ADNc asociados (22) se puede realizar usando cebado aleatorio, creando de ese modo una biblioteca de longitud de fragmentos aleatoria (porción de ácido nucleico) que representa diversas porciones de las secuencias de ADNc asociadas. El presente ejemplo representa el cebado aleatorio usando cebadores hexámeros (110), que comprenden una secuencia aleatoria de seis nucleótidos (23) y una “ cola” (25) que comprende una secuencia adaptadora universal (21), para crear amplicones de una longitud de fragmento aleatoria. Los productos de amplificación de los cebadores hexámeros (100) comprenden la cola del hexámero (25), que comprende el elemento adaptador universal (21) en sus extremos 3', y el elemento adaptador universal (21), el elemento índice de modelos (19) y la región de captura (9) derivados del identificador genético de elemento de captura (50), en sus extremos 5'. Todos los fragmentos procedentes del mismo exosoma portan el mismo elemento índice de modelos (19). La amplificación universal se puede realizar posteriormente para crear una biblioteca de longitud de fragmentos aleatoria (24a-c).

Lasfiguras 3-5representan esquemáticamente un flujo de trabajo de casos del método de captura de dianas y codificación con código de barras según una realización de la presente descripción. El ejemplo presenta una muestra biológica que comprende vesículas de exosoma (círculos grises) que se incuban con partículas modelo de captura (también denominadas en la presente memoria “ PIPS de captura” ) para proporcionar una primera mezcla. En la realización representada, los elementos de captura específicos de la diana comprenden anticuerpos antitetraspanina. Las tetraspaninas son proteínas transmembrana abundantes en los exosomas y, por lo tanto, son una diana adecuada para ser capturadas por un elemento de captura específico de la diana del anticuerpo anti-tetraspanina. Las partículas modelo de captura comprenden además un identificador genético de elemento de captura que comprende una secuencia poli-T. En algunas realizaciones, cada asociación comprende un exosoma y una partícula modelo de captura. En la siguiente etapa, la primera mezcla se centrifuga y los exosomas asociados y las partículas de captura diana sedimentan. El sobrenadante se desecha (no se muestra) y el sedimento se resuspende en un tampón de reacción que comprende una mezcla de tampón de lisis y reactivos de PCR de transcripción inversa para proporcionar una segunda mezcla. La etapa de centrifugación, como se ha descrito anteriormente, puede aumentar la proporción de las partículas modelo de captura unidas a una partícula diana (este aumento también se denomina en la presente memoria “ enriquecimiento” ). También permite la adición de la mezcla de tampón de lisis y reactivos de transcripción inversa para facilitar la generación de ADNc dentro de las encapsulaciones. Otros métodos de enriquecimiento se analizan más adelante. Se añade aceite (“ aceite de partición” ), un fluido que es inmiscible con la segunda mezcla, a la segunda mezcla para proporcionar una tercera mezcla (ilustrada en la figura 4).

La siguiente etapa comprende cizallar (también denominado en la presente memoria “ dividir” ) la tercera mezcla de modo que las partículas modelo de captura y los exosomas asociados se encapsulen en una pluralidad de gotitas monodispersas en el aceite de partición. En algunas realizaciones, cada partícula modelo de captura y el exosoma asociado se encapsulan en una sola gotita monodispersa. Además, cada gotita monodispersa contiene la mezcla de tampón de lisis y reactivos de PCR de transcripción inversa. A continuación, los exosomas asociados se lisan dentro de las gotitas monodispersas usando una lisis activada por temperatura para liberar su contenido, incluyendo ácidos nucleicos (representados como líneas negras). Las moléculas de ARNm liberadas pueden asociarse, a continuación, con las secuencias poli-T (“ captura de poli-T” ) del identificador genético de elemento de captura de la partícula modelo de captura. Los otros elementos del identificador genético de elemento de captura representado incluyen un oligonucleótido LR que comprende una secuencia enlazadora (también denominada en la presente memoria “ enlazador” , representada en gris oscuro) y un oligonucleótido adaptador universal (también denominado en la presente memoria “ adaptador de PCR universal” , representado en rojo) y un elemento de ID de modelo (también denominado en la presente memoria “ código de barras específico de modelo” ). En algunas realizaciones, se pueden unir múltiples moléculas de ARNm a los múltiples identificadores genéticos de elementos de captura de la partícula modelo de captura.

Tras la unión de las moléculas de ARNm liberadas a las secuencias poli-T, se realiza una reacción de transcripción inversa para generar modelos de ADNc de los ARNm asociados. A continuación tiene lugar una reacción de transcripción inversa del ADN, usando cebadores hexámeros (también denominados en la presente memoria “ cebadores hexámeros (a granel)” ) que comprenden una secuencia adaptadora universal “ cola” (también denominada en la presente memoria “ adaptador de PCR universal” ) para crear una biblioteca de longitud de fragmentos aleatoria. Los productos de amplificación de los cebadores hexámeros comprenden la cola del hexámero, que comprende el elemento adaptador universal en sus extremos 3', y los elementos ID, TIPO y universal, derivados del identificador genético de elemento de captura, en sus extremos 5'. Todos los fragmentos procedentes del mismo exosoma portan el mismo elemento de ID de modelo (también denominado en la presente memoria “ código de barras” ). Si se desea, se prepara una biblioteca de secuenciación a partir de los productos de amplificación por PCR usando métodos estándar.

Métodos de PCR

Una característica de ciertos métodos descritos en la presente memoria es el uso de un ensayo basado en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para detectar la presencia de ciertos oligonucleótidos y/o genes, por ejemplo, oncogenes presentes en las células. Los ejemplos de ensayos de interés basados en PCR incluyen, pero no se limitan a, PCR cuantitativa (qPCR), PCR fluorescente cuantitativa (QF-PCR), PCR fluorescente múltiple (MF-PCR), PCR digital en gotitas (ddPCR), PCR de células individuales, PCR-RFLP/PCR-RFLP en tiempo real, PCR de inicio en caliente, PCR anidada, PCR de polonía in situ, amplificación por círculo rodante in situ (RCA), PCR puente, PCR con picotítulos, PCR en emulsión y PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR). Otros métodos de amplificación adecuados incluyen la reacción en cadena de la ligasa (LCR), amplificación de la transcripción, replicación de secuencias autosostenida, amplificación selectiva de las secuencias de polinucleótidos diana, reacción en cadena de la polimerasa (CP-PCR) cebada con secuencias consenso, reacción en cadena de la polimerasa (AP-PCR) cebada arbitrariamente, PCR cebada con oligonucleótidos degenerados (DOP-PCR) y amplificación de secuencias basada en ácidos nucleicos (NABSA).

Se puede usar un ensayo basado en PCR para detectar la presencia de ciertos genes, tales como ciertos oncogenes. En dichos ensayos, uno o más cebadores específicos para cada gen de interés se hacen reaccionar con el genoma de cada célula. Estos cebadores tienen secuencias específicas para el gen en particular, de modo que solo hibridarán e iniciarán la PCR cuando sean complementarios al genoma de la célula. Si el gen de interés está presente y el cebador es compatible, se crean muchas copias del gen. Para determinar si un gen en particular está presente, los productos de p Cr pueden detectarse mediante un ensayo que analice el líquido de la gotita monodispersa, por ejemplo, tiñendo la solución con un colorante intercalante, como SybrGreen o bromuro de etidio, hibridando los productos de PCR con un sustrato sólido, tal como una perla (por ejemplo, perlas magnéticas o fluorescentes, tales como las perlas Luminex), o detectándolos mediante una reacción intermolecular, tal como FRET. Estos colorantes, perlas y similares son cada uno un ejemplo de un “ componente de detección” , un término que se usa de manera amplia y genérica en la presente memoria para referirse a cualquier componente que se usa para detectar la presencia o ausencia de productos de amplificación de ácidos nucleicos, por ejemplo, productos de PCR.

Gotitas monodispersas, incluyendo gotitas en emulsión única y gotitas en emulsión múltiple, y generación de las mismas

Las gotitas monodispersas se pueden obtener eficazmente usando partículas de captura para modelizar la formación de gotitas, que pueden incluir, por ejemplo, gotitas monodispersas en emulsión única, gotitas en emulsión múltiple o vesículas unilaminares gigantes (GUV)

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “ monodispersa” , tal como se aplica a las gotitas, por ejemplo, las gotitas monodispersas en emulsión única, se refiere a una variación en el diámetro o la dimensión más grande de las gotitas producidas por cizallamiento en presencia de partículas modelo de captura, que es menor de la que ocurriría cuando las gotitas se producen por cizallamiento en las mismas condiciones en ausencia de las partículas modelo de captura. En general, las gotitas en emulsión única monodispersas o las gotitas en emulsión múltiple pueden tener más variación en el diámetro o la dimensión más grande en comparación con las partículas modelo de captura a partir de las cuales se generan, sin dejar de funcionar en los diversos métodos descritos en la presente memoria. Las gotitas monodispersas generalmente varían de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1000 pm de diámetro o dimensión más grande, y pueden tener una variación en el diámetro o la dimensión más grande de menos de un factor de 10, por ejemplo, menos de un factor de 5, menos de un factor de 4, menos de un factor de 3, menos de un factor de 2, menos de un factor de 1,5, menos de un factor de 1,4, menos de un factor de 1,3, menos de un factor de 1,2, menos de un factor de 1,1, menos de un factor de 1,05 o menos de un factor de 1,01, en diámetro o la dimensión más grande. En algunas realizaciones, las gotitas monodispersas tienen una variación en el diámetro o la dimensión más grande tal que al menos el 50 % o más, por ejemplo, el 60 % o más, el 70 % o más, el 80 % o más, el 90 % o más, el 95 % o más, o el 99 % o más de las gotitas monodispersas, varían en diámetro o dimensión más grande en menos de un factor de 10, por ejemplo, menos de un factor de 5, menos de un factor de 4, menos de un factor de 3, menos de un factor de 2, menos de un factor de 1,5, menos de un factor de 1,4, menos de un factor de 1,3, menos de un factor de 1,2, menos de un factor de 1,1, menos de un factor de 1,05, o menos de un factor de 1,01. En algunas realizaciones, las gotitas monodispersas tienen un diámetro de aproximadamente 1,0 pm a 1000 pm, inclusive, tal como de aproximadamente 1,0 pm a aproximadamente 750 pm, de aproximadamente 1,0 pm a aproximadamente 500 pm, de aproximadamente 1,0 pm a aproximadamente 250 pm, de aproximadamente 1,0 pm a aproximadamente 200 pm, de aproximadamente 1,0 pm a aproximadamente 150 pm, de aproximadamente 1,0 pm a aproximadamente 100 pm, de aproximadamente 1,0 pm a aproximadamente 10 pm, o de aproximadamente 1,0 pm a aproximadamente 5 pm, inclusive. En algunas realizaciones, el volumen interno de las gotitas monodispersas puede ser de aproximadamente 0,01 pl o menos, aproximadamente 0,1 pl o menos, 1 pl o menos, aproximadamente 5 pl o menos, 10 pl o menos, 100 pl o menos, o 1000 pl o menos. En algunas realizaciones, el volumen interno de las gotitas monodispersas puede ser de aproximadamente 1 fl o menos, aproximadamente 10 fl o menos, o 100 fl o menos. En algunas realizaciones, el volumen interno de las gotitas monodispersas puede abarcar un volumen de líquido que oscila entre picolitros y femtolitros (por ejemplo, de aproximadamente 0,001 pl a aproximadamente 1000 pl). En algunas realizaciones, el volumen interno de las gotitas monodispersas se extiende estrictamente por debajo del nivel de nanolitros (por ejemplo, estrictamente picolitros, estrictamente femtolitros o una combinación de los mismos).

Al poner en práctica los métodos descritos en la presente memoria, la composición y la naturaleza de las gotitas monodispersas, por ejemplo, las gotitas en emulsión única y en emulsión múltiple, pueden variar. Por ejemplo, en ciertos aspectos, se puede usar un tensioactivo para estabilizar las gotitas.

Por consiguiente, una gotita puede implicar una emulsión estabilizada con tensioactivo, por ejemplo, una emulsión única estabilizada con tensioactivo o una emulsión doble estabilizada con tensioactivo. Se puede usar cualquier tensioactivo conveniente que permita realizar las reacciones deseadas en las gotitas. En otros aspectos, las gotitas monodispersas no se estabilizan mediante tensioactivos.

Las gotitas descritas en la presente memoria pueden prepararse como emulsiones, por ejemplo, como un fluido de fase acuosa dispersado en un fluido portador de fase inmiscible (por ejemplo, un aceite de fluorocarbono, aceite de silicona o un aceite de hidrocarburo) o viceversa. En particular, las gotitas en emulsión múltiple tal como se describen en la presente memoria pueden proporcionarse como emulsiones dobles, por ejemplo, como un fluido de fase acuosa en un fluido de fase inmiscible, dispersado en un fluido portador de fase acuosa; emulsiones cuádruples, por ejemplo, un fluido de fase acuosa en un fluido de fase inmiscible, en un fluido de fase acuosa, en un fluido de fase inmiscible, dispersado en un fluido portador de fase acuosa; y así sucesivamente. La generación de una gotita en emulsión única monodispersa o una gotita en emulsión múltiple como se describe en la presente memoria puede realizarse sin control microfluídico. En realizaciones alternativas, se puede preparar una emulsión única monodispersa sin el uso de un dispositivo microfluídico, pero a continuación se puede modificar usando un dispositivo microfluídico para proporcionar una emulsión múltiple, por ejemplo, una emulsión doble.

Se pueden generar emulsiones individuales monodispersas sin el uso de dispositivos microfluídicos usando los métodos descritos en la presente memoria. La producción de una emulsión monodispersa usando partículas modelo de captura puede proporcionar emulsiones que incluyen gotitas que tienen un tamaño extremadamente uniforme. El proceso de generación de gotitas se puede lograr combinando una pluralidad de partículas modelo de captura con un primer fluido para proporcionar una primera mezcla, en donde el primer fluido incluye una pluralidad de partículas diana; combinando la primera mezcla con un segundo fluido para proporcionar una segunda mezcla, en donde el segundo fluido es inmiscible con el primer fluido; y cizallando la segunda mezcla de modo que una pluralidad de partículas modelo de captura se encapsulen en una pluralidad de gotitas monodispersas en el segundo fluido, proporcionando de ese modo una pluralidad de gotitas monodispersas que incluyen el primer fluido, una de las partículas modelo de captura y una de la pluralidad de partículas diana. Para variar el tamaño de las gotitas, se pueden variar la velocidad de cizallamiento y los tamaños de partículas modelo de captura. Para los geles de agarosa, las partículas modelo de captura se pueden licuar usando un estímulo externo (por ejemplo, calor) para generar una emulsión líquida monodispersa.

El porcentaje de gotitas monodispersas, por ejemplo, gotitas en emulsión única monodispersas o gotitas en emulsión múltiple, con una partícula modelo de captura, y no más de una, puede ser de aproximadamente el 70 % o más; aproximadamente el 75 % o más; aproximadamente el 80 % o más; aproximadamente el 85 % o más; aproximadamente el 90 % o más; o aproximadamente el 95 % o más. Por ejemplo, el porcentaje de gotitas monodispersas con una partícula modelo de captura, y no más de una, puede ser de aproximadamente el 70 % a aproximadamente el 100 %, por ejemplo, de aproximadamente el 75 % a aproximadamente el 100 %, de aproximadamente el 80 % a aproximadamente el 100 %, de aproximadamente el 85 % a aproximadamente el 100 %, de aproximadamente el 90 % a aproximadamente el 100 %, o de aproximadamente el 95 % a aproximadamente el 100 %. Como ejemplo adicional, el porcentaje de gotitas monodispersas con una partícula modelo de captura, y no más de una, puede ser de aproximadamente el 70 % a aproximadamente el 95 %, por ejemplo, de aproximadamente el 75 % a aproximadamente el 90 %, o de aproximadamente el 80 % a aproximadamente el 85 %. El porcentaje de partículas modelo de captura que están encapsuladas en gotitas monodispersas en el segundo fluido puede ser de aproximadamente el 70 % o más; aproximadamente el 75 % o; aproximadamente el 80 % o más; aproximadamente el 85 % o más; o aproximadamente el 90 % o más. Por ejemplo, el porcentaje de partículas modelo de captura que están encapsuladas en gotitas monodispersas en el segundo fluido puede ser de aproximadamente el 70 % a aproximadamente el 100 %, por ejemplo, de aproximadamente el 75 % a aproximadamente el 100 %, de aproximadamente el 80 % a aproximadamente el 100 %, de aproximadamente el 85 % a aproximadamente el 100 %, de aproximadamente el 90 % a aproximadamente el 100 %, o de aproximadamente el 95 % a aproximadamente el 100 %. Como ejemplo adicional, el porcentaje de partículas modelo de captura que están encapsuladas en gotitas monodispersas en el segundo fluido puede ser de aproximadamente el 70 % a aproximadamente el 95 %, por ejemplo, de aproximadamente el 75 % a aproximadamente el 90 %, o de aproximadamente el 80 % a aproximadamente el 85 %.

También se pueden generar emulsiones dobles sin el uso de dispositivos microfluídicos usando los métodos descritos en la presente memoria. Una emulsión doble incluye gotitas contenidas dentro de gotitas, por ejemplo, un fluido de fase acuosa rodeado por una cubierta de fase inmiscible en un fluido portador de fase acuosa (por ejemplo, agua en aceite en agua) o un fluido de fase inmiscible rodeado por una cubierta de fase acuosa en un fluido portador de fase inmiscible (por ejemplo, aceite en agua en aceite). La segunda mezcla descrita en la presente memoria, que incluye gotitas monodispersas en emulsión única en el segundo fluido, se combina con un tercer fluido para producir una tercera mezcla, en donde el tercer fluido es inmiscible con al menos el segundo fluido. La tercera mezcla se cizalla a continuación para encapsular las partículas modelo de captura en gotitas en doble emulsión en el tercer fluido. El tercer fluido puede ser inmiscible tanto con el primer como con el segundo fluidos. Un tipo de emulsión doble particularmente útil incluye una gotita acuosa encapsulada dentro de una gotita de aceite un poco más grande, dispersa a su vez en una fase acuosa portadora. Las emulsiones dobles son valiosas porque el “ núcleo” interno de la estructura se puede usar para proporcionar compuestos activos, como solutos o materiales biológicos disueltos, donde están protegidos del entorno externo por la cubierta de aceite circundante. Una ventaja de generar emulsiones dobles usando partículas modelo de captura es similar a la de la generación de emulsiones únicas, ya que las dimensiones de la emulsión doble (tamaños de las gotitas internas y externas) se pueden controlar en un amplio intervalo y las gotitas se pueden formar con un alto grado de uniformidad. Como se analiza en la presente memoria, en realizaciones adecuadas, las partículas modelo de captura pueden disolverse y/o fundirse dentro de las gotitas monodispersas. Por consiguiente, en algunas realizaciones, se pueden preparar múltiples emulsiones, por ejemplo, emulsiones dobles, a partir de gotitas monodispersas que ya no contienen una partícula modelo intacta pero que conservan su tamaño original. De esta manera, dichas gotitas monodispersas pueden servir como modelos para la preparación de múltiples emulsiones, por ejemplo, emulsiones dobles.

La encapsulación en gotitas de materiales de muestra y/o reactivos, por ejemplo, ácidos nucleicos y/o reactivos de síntesis de ácidos nucleicos (por ejemplo, reactivos de amplificación isotérmica de ácidos nucleicos y/o reactivos de amplificación de ácidos nucleicos), se puede lograr mediante varios métodos, incluyendo métodos microfluídicos y no microfluídicos. En el contexto de los métodos microfluídicos, hay varias técnicas que se pueden aplicar, incluyendo doble emulsificación con microcapilar de vidrio o doble emulsificación usando generación secuencial de gotitas en dispositivos con patrones de humectabilidad. Las técnicas microcapilares forman gotitas al generar chorros coaxiales de las fases inmiscibles que son inducidas a romperse en gotitas por medio de un flujo coaxial que se enfoca a través de una boquilla. Sin embargo, una desventaja potencial de este enfoque es que los dispositivos se fabrican generalmente a partir de tubos microcapilares que están alineados y pegados entre sí. Dado que la boquilla de formación de gotitas tiene una escala de decenas de micras, incluso pequeñas imprecisiones en la alineación de los capilares pueden provocar un fallo del dispositivo. Por el contrario, la formación secuencial de gotas en uniones de generación de gotitas con patrones espaciales se puede lograr en dispositivos fabricados litográficamente, lo que facilita su construcción y creación en grandes cantidades, al tiempo que mantiene la uniformidad en las dimensiones.

Sin embargo, en algunos casos, la naturaleza plana de estos dispositivos puede no ser ideal para generar emulsiones dobles, ya que todas las fases separadas entran en el dispositivo mientras están en contacto con las paredes del canal, por lo que es necesario generar cuidadosamente patrones de humectabilidad para permitir la absorción de las fases apropiadas en los lugares apropiados. Esto puede hacer que los dispositivos sean más difíciles de fabricar y, en algunos casos, puede impedir la emulsificación de líquidos cuyas propiedades humectantes no están optimizadas para el dispositivo. Por consiguiente, en algunos aspectos, la presente descripción proporciona métodos para generar una emulsión monodispersa que encapsula materiales y/o reactivos de muestra, por ejemplo, ácidos nucleicos y/o reactivos de síntesis de ácidos nucleicos (por ejemplo, reactivos de amplificación isotérmica de ácidos nucleicos y/o reactivos de amplificación de ácidos nucleicos) sin el uso de un dispositivo microfluídico.

Por ejemplo, los métodos descritos en la presente memoria pueden incluir combinar una pluralidad de partículas modelo de captura con un primer fluido para proporcionar una primera mezcla, en donde el primer fluido incluye una pluralidad de partículas diana, por ejemplo, ácidos nucleicos, etc. En algunas realizaciones, la combinación de la pluralidad de partículas modelo de captura con el primer fluido para proporcionar la primera mezcla incluye hacer que una porción del primer fluido y las partículas diana y/o reactivos contenidos en el mismo sean absorbidos por, o se les unan, la partículas modelo de captura. En algunas realizaciones, la combinación de la pluralidad de partículas modelo de captura con el primer fluido para proporcionar la primera mezcla incluye hacer fluir una porción del primer fluido hacia las partículas modelo de captura. En algunas realizaciones, la combinación de la pluralidad de partículas modelo de captura con el primer fluido para proporcionar la primera mezcla incluye difundir una porción del primer fluido hacia las partículas modelo de captura. En algunas realizaciones, la combinación de la pluralidad de partículas modelo de captura con el primer fluido para proporcionar la primera mezcla incluye hinchar las partículas modelo de captura con una porción del primer fluido.

En algunas realizaciones, el exceso de primer fluido se retira de la primera mezcla después de hacer que la porción del primer fluido sea absorbida por las partículas modelo de captura. La cantidad de exceso de primer líquido retirado puede variar. Por ejemplo, al retirar la mayor parte del exceso de fluido, las partículas diana que no pueden fluir hacia las partículas modelo de captura pueden encapsularse haciendo que las partículas diana, por ejemplo, células, estén físicamente cerca de al menos una de una pluralidad de partículas modelo de captura. La combinación de esta mezcla con un aceite que es inmiscible con el primer fluido proporciona una segunda mezcla. Al cizallar esta segunda mezcla, una pluralidad de las partículas modelo de captura pueden encapsularse en una pluralidad de gotitas monodispersas en el segundo fluido, proporcionando de ese modo una pluralidad de gotitas monodispersas que incluyen el primer fluido, una de las partículas modelo de captura y una de la pluralidad de partículas diana que no pueden fluir hacia las partículas modelo de captura.

En algunas realizaciones, las moléculas diana son células. En dichas realizaciones, las gotitas monodispersas pueden unirse a una o más células por gotita. Como alternativa, las gotitas monodispersas no contienen más de una célula por gotita. En algunas realizaciones, después del cizallamiento, algunas gotitas en la emulsión no contienen ninguna de la pluralidad de partículas diana.

En algunas realizaciones, los métodos descritos en la presente memoria incluyen combinar la primera mezcla, que incluye una pluralidad de partículas modelo de captura y un primer fluido que incluye una pluralidad de partículas diana, con un segundo fluido para proporcionar una segunda mezcla, en donde el segundo fluido es inmiscible con el primer fluido; y cizallando la segunda mezcla de modo que una pluralidad de partículas modelo de captura se encapsulen en una pluralidad de gotitas monodispersas en el segundo fluido, proporcionando de ese modo una pluralidad de gotitas monodispersas que incluyen el primer fluido, una de las partículas modelo de captura y una de la pluralidad de partículas diana. En algunas realizaciones, después del cizallamiento, el segundo fluido incluye una pluralidad de gotitas que no contienen una de las partículas modelo de captura. Las gotitas que no contienen una de las partículas modelo de captura se pueden eliminar de la emulsión monodispersa mediante una técnica de separación adecuada, tal como filtración o centrifugación. Aquellas gotitas que no contienen una de las partículas modelo de captura pueden tener un diámetro más pequeño que aquellas gotitas que sí contienen una de las partículas modelo de captura. Las gotitas monodispersas que contienen partículas modelo de captura también pueden enriquecerse en relación con las gotitas que no contienen una de las partículas modelo de captura.

Tal como se utilizan en la presente memoria, los términos “ enriquecido” y “ enriquecimiento” pueden usarse indistintamente para referirse al proceso de aumentar la proporción entre las entidades diana (por ejemplo, gotitas monodispersas que contienen partículas modelo de captura) y las entidades no diana (por ejemplo, gotitas monodispersas que no contienen partículas modelo de captura) en la emulsión monodispersa en comparación con la proporción en la emulsión monodispersa original. Usando el método descrito en la presente memoria, las gotitas monodispersas que contienen partículas modelo de captura pueden enriquecerse en relación con gotitas que no contienen una de las partículas modelo de captura, por ejemplo, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 40 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces o más.

En algunas realizaciones, el exceso de segundo fluido se retira de la segunda mezcla, que incluye una pluralidad de partículas modelo de captura encapsuladas en una pluralidad de gotitas monodispersas después del cizallamiento. El exceso de segundo fluido se puede eliminar usando cualquier método adecuado, por ejemplo, mediante centrifugación y retirada del sobrenadante.

Fluidos implicados en la generación de emulsiones monodispersas

Como se analiza en la presente memoria, los métodos descritos generalmente implican combinar una pluralidad de partículas modelo de captura con un primer fluido para proporcionar una primera mezcla, en donde el primer fluido incluye una pluralidad de partículas diana; combinar la primera mezcla con un segundo fluido para proporcionar una tercera mezcla, en donde el segundo fluido es inmiscible con el primer fluido; y cizallar la tercera mezcla de modo que una pluralidad de partículas modelo de captura se encapsulen en una pluralidad de gotitas monodispersas en el segundo fluido, proporcionando de ese modo una pluralidad de gotitas monodispersas que incluyen el primer fluido, tampón de reacción, una de las partículas modelo de captura y una de la pluralidad de partículas diana. En algunas realizaciones, los métodos incluyen la etapa adicional de combinar un tercer fluido con la tercera mezcla, después del cizallamiento de la tercera mezcla, para producir una cuarta mezcla, en donde el tercer fluido es inmiscible con el segundo fluido.

El primer fluido se selecciona generalmente para que sea inmiscible con el segundo fluido y comparta una hidrofilidad/hidrofobicidad común con el material que constituye las partículas modelo de captura. El tercer fluido se selecciona generalmente para que sea inmiscible con el segundo fluido, y puede ser miscible o inmiscible con el primer fluido.

Por consiguiente, en algunas realizaciones, el primer fluido es un fluido de fase acuosa; el segundo fluido es un fluido que es inmiscible con el primer fluido, tal como una fase no acuosa, por ejemplo, un fluorocarbono, aceite de silicona, aceite o aceite de hidrocarburo, o una combinación de los mismos; y el tercer fluido es un fluido de fase acuosa. Como alternativa, en algunas realizaciones, el primer fluido es una fase no acuosa, por ejemplo, un aceite de fluorocarbono, aceite de silicona o un aceite de hidrocarburo, o una combinación de los mismos; el segundo fluido es un fluido que es inmiscible con el primer fluido, por ejemplo, un fluido de fase acuosa; y el tercer fluido es un aceite de fluorocarbono, aceite de silicona o un aceite de hidrocarburo o una combinación de los mismos.

La fase no acuosa puede servir como fluido portador que forma una fase continua que es inmiscible con agua, o la fase no acuosa puede ser una fase dispersa. La fase no acuosa puede denominarse fase oleosa que incluye al menos un aceite, pero puede incluir cualquier compuesto líquido (o licuable) o mezcla de compuestos líquidos que sea inmiscible con agua. El aceite puede ser sintético o de origen natural. El aceite puede o no incluir carbono y/o silicio, y puede incluir o no hidrógeno y/o flúor. El aceite puede ser lipófilo o lipófobo. En otras palabras, el aceite puede ser generalmente miscible o inmiscible con disolventes orgánicos. Los aceites de ejemplo pueden incluir al menos un aceite de silicona, aceite mineral, aceite de fluorocarbono, aceite vegetal o una combinación de los mismos, entre otros.

En ejemplos de realización, el aceite es un aceite fluorado, tal como un aceite de fluorocarbono, que puede ser un disolvente orgánico perfluorado. Los ejemplos de aceites de fluorocarbono adecuados incluyen, pero no se limitan a, C9H5OF15 (HFE-7500), C21F48N2 (FC-40) y perfluorometildecalina (PFMD).

Como se analiza en la presente memoria, en algunas realizaciones, el primer fluido contiene una pluralidad de partículas diana (por ejemplo, moléculas de ADN tales como moléculas de ADN genómico, moléculas de ARN, reactivos de síntesis de ácidos nucleicos tales como reactivos de amplificación de ácidos nucleicos, incluyendo los reactivos de amplificación por PCR y/o isotérmica).

En algunas realizaciones, se pueden añadir agentes gelificantes para solidificar las capas exteriores de la gotita. Los agentes gelificantes incluyen, pero no se limitan a, gelatina, agar, goma xantana, goma gelan, carragenina, isubgol y goma guar.

Tensioactivos

En ciertos aspectos, se puede incluir un tensioactivo en el primer fluido, el segundo fluido y/o el tercer fluido. Por consiguiente, una gotita puede implicar una emulsión estabilizada con tensioactivo, por ejemplo, una emulsión única estabilizada con tensioactivo o una emulsión doble estabilizada con tensioactivo, donde el tensioactivo es soluble en el primer fluido, el segundo fluido y/o el tercer fluido. Se puede usar cualquier tensioactivo conveniente que permita realizar las reacciones deseadas en las gotitas, incluyendo, pero sin limitarse a, etoxilato de octilfenol (Triton X-100), polietilenglicol (PEG), C26H50010 (Tween 20) y/u octilfenoxipolietoxietanol (IGEPAL). En otros aspectos, una gotita no se estabiliza mediante tensioactivos.

El tensioactivo utilizado depende de varios factores, tales como las fases oleosa y acuosa (u otras fases inmiscibles adecuadas, por ejemplo, cualquier fase hidrófoba e hidrófila adecuada) utilizadas para las emulsiones. Por ejemplo, cuando se usan gotitas acuosas en un aceite de fluorocarbono, el tensioactivo puede tener un bloque hidrófilo (PEG-PPO) y un bloque fluorado hidrófobo (Krytox® FSH). Sin embargo, si el aceite se cambiara a un aceite de hidrocarburo, por ejemplo, el tensioactivo puede elegirse de modo que tenga un bloque de hidrocarburo hidrófobo, como el tensioactivo ABIL EM90.

También se pueden contemplar otros tensioactivos, incluyendo tensioactivos iónicos. También se pueden incluir otros aditivos en el aceite para estabilizar las gotitas, incluyendo los polímeros que aumentan la estabilidad de las gotitas a temperaturas superiores a 35 °C.

Sin pretender limitarse a ninguna teoría en particular, se propone que la preparación de emulsiones termoestables se basa en el uso de un tensioactivo que sea capaz de formar membranas o interfaces de doble emulsión que puedan soportar altas temperaturas, tales como las asociadas con las reacciones de PCR estándar. Una forma de lograr esto puede ser usar un tensioactivo con un peso molecular relativamente alto, de modo que cuando se ensambla en la interfaz de una gotita o en una configuración de membrana, la energía requerida para eliminar el tensioactivo de la interfaz (o romper la membrana) sea mayor que la que puede proporcionar kT. kT es la cantidad de calor requerida para aumentar la entropía termodinámica de un sistema, en unidades naturales, en una nat.

Los tensioactivos de ejemplo que pueden usarse para proporcionar emulsiones termoestables son los tensioactivos “ biocompatibles” que incluyen copolímeros en bloque de PEG-PFPE (polietilenglicol-perfluoropoliéter), por ejemplo, PEG-Krytox® (véase, por ejemplo, Holtze y col., “ Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions” , Lab Chip, 2008, 8, 1632-1639), y tensioactivos activos que incluyen el Krytox® iónico en la fase oleosa y el Jeffamine® (polieteramina) en la fase acuosa (véase, por ejemplo, DeJournette y col., “ Creating Biocompatible Oil-Water Interfaces without Synthesis: Direct Interactions between Primary Amines and Carboxylated Perfluorocarbon Surfactants” , Anal. Chem. 2013, 85(21):10556-10564). Se pueden usar tensioactivos adicionales y/o alternativos siempre que formen interfaces estables. Por lo tanto, muchos tensioactivos adecuados serán tensioactivos de copolímeros de bloques (como PEG-Krytox®) que tienen un peso molecular alto. Estos ejemplos incluyen moléculas fluoradas y disolventes, pero es probable que también se puedan utilizar moléculas no fluoradas. El término “tensioactivo” se refiere a cualquier molécula que tenga tanto un grupo de cabeza polar, que prefiere energéticamente la solvatación con agua, como una cola hidrófoba que no esté bien solvatada con agua. Los métodos descritos en la presente memoria no se limitan a un tensioactivo particular. Se contempla una variedad de tensioactivos que incluyen, pero no se limitan a, tensioactivos no iónicos e iónicos (por ejemplo, TRITON X-100; TWEEN 20; y TYLOXAPOL) o combinaciones de los mismos.

Por consiguiente, en algunas realizaciones, la presente descripción proporciona emulsiones termoestables. Estas emulsiones son adecuadas para su uso en la realización de reacciones biológicas, tales como PCR, RT-PCR, estudios de interacción proteína-proteína, etc.

Cizallamiento

Para generar una emulsión monodispersa, los métodos descritos incluyen una etapa de cizallamiento de la segunda mezcla proporcionada mediante la combinación de la primera mezcla con un tercer fluido inmiscible con el primer fluido. Se puede utilizar cualquier método o técnica adecuada para aplicar una fuerza de cizallamiento suficiente a la segunda mezcla. Por ejemplo, la segunda mezcla puede cizallarse haciendo fluir la segunda mezcla a través de la punta de una pipeta. Otros métodos incluyen, pero no se limitan a, agitar la segunda mezcla con un homogeneizador (por ejemplo, un agitador de vórtice) o agitar la segunda mezcla con un homogeneizador de tipo Bead Beater. La aplicación de una fuerza de cizallamiento suficiente rompe la segunda mezcla en gotitas monodispersas que encapsulan una de una pluralidad de partículas modelo de captura. También puede haber algunas gotitas que no contengan una de la pluralidad de partículas modelo de captura.

En general, si se aumenta el cizallamiento, el tamaño promedio de las gotitas generadas será inferior al tamaño de las partículas modelo de captura. Sin embargo, dado que las partículas modelo de captura están en forma sólida, las gotitas que las contienen no serán de menor tamaño, generando de ese modo una emulsión monodispersa. Si la velocidad de cizallamiento es sustancialmente mayor que el módulo de la partícula modelo de captura, entonces el cizallamiento puede exprimir el líquido fuera de las partículas modelo de captura. Sin pretender limitarse a ninguna teoría en particular, se propone que una velocidad de cizallamiento adecuada es aquella que coincide adecuadamente con el módulo de las partículas modelo de captura. Por ejemplo, puede ser deseable seleccionar una velocidad/fuerza de cizallamiento mayor que la presión de Laplace de las gotitas del tamaño deseado, pero menor que el módulo de las partículas modelo

Adición de reactivos a gotitas en emulsión única, gotitas en emulsión múltiple y/o GUV

Al poner en práctica los métodos en cuestión, puede ser necesario añadir varios reactivos a las gotitas, en una o más etapas (por ejemplo, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4 o aproximadamente 5 o más etapas). Los medios para añadir reactivos a las gotitas pueden variar de varias maneras dependiendo, por ejemplo, de la etapa de emulsificación de las gotitas; por ejemplo, pueden aplicarse diferentes enfoques a la adición de reactivos a gotitas en emulsión única monodispersas en relación con gotitas en emulsión múltiple, tales como gotitas en emulsión doble. Los enfoques de interés incluyen, pero no se limitan a, los descritos por Ahn, y col., Appl. Phys. Lett. 88, 264105 (2006); Priest y col., Appl. Phys. Lett. 89, 134101 (2006); Abate y col., p Na S, 9 de noviembre de 2010, vol. 107, n.° 45, 19163-19166; y Song y col., Anal.Chem., 2006, 78 (14), págs. 4839-4849. En algunas realizaciones, los reactivos pueden añadirse a las gotitas durante el proceso de emulsificación tal como se describe en la presente memoria, por ejemplo, como componentes del primer fluido, por ejemplo, sin el uso de un dispositivo o sistema microfluídico. En otras realizaciones, se pueden utilizar técnicas, dispositivos y/o sistemas microfluídicos para añadir reactivos y/o modificar las gotitas monodispersas una vez preparadas, como se describe de otro modo en la presente memoria.

Por ejemplo, se puede añadir un reactivo a una gotita en emulsión única monodispersa, tal como se describe en la presente memoria, mediante un método que implica la fusión de una gotita con una segunda gotita que contiene el o los reactivos. El o los reactivos que están contenidos en la segunda gotita pueden añadirse mediante cualquier medio conveniente, incluyendo específicamente los descritos en la presente memoria. Esta gotita puede fusionarse con la primera gotita para crear una gotita que incluya el contenido tanto de la primera gotita como de la segunda gotita. En algunas realizaciones, la primera gotita es sustancialmente más grande que la segunda gotita y supera en número a la segunda gotita.

Pueden añadirse también, o como alternativa, uno o más reactivos a gotitas en emulsión única monodispersas, tal como se describe en la presente memoria, usando técnicas tales como la coalescencia de gotitas y/o la picoinyección. En la coalescencia de gotitas, se puede hacer fluir una gotita diana junto a una gotita que contiene el o los reactivos que se van a añadir a la gotita diana. Las dos gotitas se pueden hacer fluir de modo que estén en contacto entre sí, pero sin tocar otras gotitas.

Estas gotitas pueden pasar entonces a través de electrodos u otros medios para aplicar un campo eléctrico, en donde el campo eléctrico puede desestabilizar las gotitas de modo que se fusionen entre sí.

En la picoinyección, una gotita diana puede fluir más allá de un canal que contiene el o los reactivos que se van a añadir, en donde el o los reactivos están a una presión elevada. Sin embargo, debido a la presencia de los tensioactivos, en ausencia de un campo eléctrico, la gotita pasará fluyendo sin ser inyectada, porque los tensioactivos que recubren la gotita pueden impedir la entrada del o de los fluidos. Sin embargo, si se aplica un campo eléctrico a la gotita cuando pasa por el inyector, el fluido que contiene el o los reactivos se inyectará en la gotita. La cantidad de reactivo añadido a la gotita puede controlarse mediante varios parámetros diferentes, tales como ajustando la presión de inyección y la velocidad de las gotas que fluyen, activando y desactivando el campo eléctrico, y similares.

En otros aspectos, uno o más reactivos también, o como alternativa, se pueden añadir a una gotita en emulsión única monodispersa como se describe en la presente memoria mediante un método que no se basa en la fusión de dos gotitas o en la inyección de líquido en una gotita. Más bien, se pueden añadir uno o más reactivos a una gotita mediante un método que implica las etapas de emulsionar un reactivo en una corriente de gotas muy pequeñas y fusionar estas pequeñas gotas con una gotita diana. Dichos métodos se denominan en la presente memoria “ adición de reactivos mediante coalescencia de múltiples gotas” . Estos métodos aprovechan el hecho de que, debido al pequeño tamaño de las gotas que se van a añadir en comparación con el de la gotita diana, las gotas pequeñas fluirán más rápido que las gotitas diana y se acumularán detrás de ellas. A continuación, la acumulación se puede fusionar, por ejemplo, aplicando un campo eléctrico. Este enfoque puede usarse también, o como alternativa, para añadir múltiples reactivos a una gotita usando varias corrientes que fluyen en paralelo de pequeñas gotas de diferentes fluidos. Para permitir una fusión eficaz de las gotitas diminutas y dianas, es importante hacer que las gotas diminutas sean más pequeñas que el canal que contiene las gotitas diana, y también hacer que la distancia entre el canal que inyecta las gotitas diana desde los electrodos que aplican el campo eléctrico sea lo suficientemente larga como para que las gotas diminutas tengan tiempo de “ alcanzar” a las gotitas diana. Si este canal es demasiado corto, no todas las gotas diminutas se fusionarán con la gotita diana y se puede añadir menos cantidad de reactivo de la deseada. Hasta cierto punto, esto se puede compensar aumentando la magnitud del campo eléctrico, lo que tiende a permitir que las gotas que están más separadas se fusionen. Además de preparar las gotas diminutas en el mismo dispositivo microfluídico, pueden también, o como alternativa, prepararse sin conexión usando otro generador de gotas microfluídicas o mediante homogeneización y, a continuación, inyectándolas en el dispositivo que contiene las gotitas diana.

Por consiguiente, en ciertos aspectos, se añade un reactivo a una gotita preparada como se describe en la presente memoria mediante un método que implica emulsionar el reactivo en una corriente de gotitas, en donde las gotitas son más pequeñas que el tamaño de las gotitas diana (por ejemplo, gotitas en emulsión única monodispersas o gotitas en emulsión múltiple o GUV); hacer fluir las gotitas junto con las gotitas diana; y fusionar una gotita con la gotita diana. El diámetro de las gotitas contenidas en la corriente de gotitas puede variar desde aproximadamente el 75 % o menos que el diámetro de la gotita diana, por ejemplo, el diámetro de las gotitas que fluyen es aproximadamente el 75 % o menos que el diámetro de la gotita diana, aproximadamente el 50 % o menos que el diámetro de la gotita diana, aproximadamente el 25 % o menos que el diámetro de la gotita diana, aproximadamente el 15 % o menos que el diámetro de la gotita diana, aproximadamente el 10 % o menos que el diámetro de la gotita diana, aproximadamente el 5 % o menos que el diámetro de la gotita diana, o aproximadamente un 2 % o menos que el diámetro de la gotita diana. En ciertos aspectos, una pluralidad de gotitas que fluyen puede fusionarse con la gotita diana, tal como 2 o más gotitas, 3 o más, 4 o más, o 5 o más. Dicha fusión se puede lograr mediante cualquier medio conveniente, incluyendo, pero sin limitarse a, la aplicación de un campo eléctrico, en donde el campo eléctrico es efectivo para fusionar la gotita que fluye con la gotita diana.

Como una variación de los métodos descritos anteriormente, los fluidos pueden estar formando chorros. Es decir, en lugar de emulsionar el fluido que se va a añadir en gotitas que fluyen, se puede formar un chorro largo de este fluido y hacerlo fluir a lo largo de la gotita diana. Estos dos fluidos se pueden fusionar, por ejemplo, aplicando un campo eléctrico. El resultado es un chorro con protuberancias donde están las gotitas, que naturalmente pueden romperse en gotitas de aproximadamente el tamaño de las gotitas diana antes de la fusión, debido a la inestabilidad de la meseta de Rayleigh. Se contemplan varias variantes. Por ejemplo, se pueden añadir uno o más agentes al fluido de inyección para facilitar la inyección, tales como agentes gelificantes y/o tensioactivos. Además, la viscosidad del fluido continuo también podría ajustarse para permitir la inyección, tal como la descrita por Utada, y col., Phys. Rev. Lett. 99, 094502 (2007).

En otros aspectos, se pueden añadir uno o más reactivos usando un método que usa el propio fluido de inyección como electrodo, explotando los electrolitos disueltos en solución.

En otro aspecto, se añade un reactivo a una gotita formada en un momento anterior envolviendo la gotita a la que se va a añadir el reactivo (es decir, la “ gotita diana” ) dentro de una gota que contiene el reactivo que se va a añadir (el “ reactivo diana” ). En ciertas realizaciones, dicho método se lleva a cabo encapsulando primero la gotita diana en una cubierta de una fase hidrófoba adecuada, por ejemplo, aceite, para formar una emulsión doble. La emulsión doble se encapsula a continuación mediante una gotita que contiene el reactivo diana para formar una emulsión triple. Para combinar la gota diana con la gota que contiene el reactivo diana, a continuación la doble emulsión se revienta usando cualquier método adecuado, incluyendo, pero sin limitarse a, aplicar un campo eléctrico, añadir productos químicos que desestabilicen la interfaz de gotitas, hacer fluir la triple emulsión a través de constricciones y otras geometrías microfluídicas, aplicar cizallamiento o ultrasonidos, aumentar o reducir la temperatura o encapsular partículas magnéticas en la gotita que pueden romper la doble interfaz de emulsión cuando son atraídas por un campo magnético.

Los aspectos de los métodos descritos anteriormente para añadir reactivos a las gotitas se describen con más detalle en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2015/0232942.

Lisis

En algunas realizaciones, también se pueden añadir uno o más agentes de lisis a las gotitas en emulsión única monodispersas, a las gotitas en emulsión múltiple y/o a las GUV que contienen una célula, en condiciones en las cuales se puede hacer que la o las células estallen, liberando de ese modo su contenido celular, tal como los genomas. Los agentes de lisis se pueden añadir después de que las células se encapsulen en gotitas monodispersas en emulsión única, gotitas en emulsión múltiples y/o GUV. Se puede emplear cualquier agente de lisis conveniente, tal como la proteinasa K o las citotoxinas. En realizaciones particulares, las células pueden coencapsularse en gotitas en emulsión única monodispersas, gotitas en emulsión múltiple y/o GUV con detergentes que contienen tampón de lisis, tales como Triton X-100 y/o proteinasa K. Las condiciones específicas en las cuales se puede hacer que la o las células estallen variarán dependiendo del agente de lisis específico utilizado. Por ejemplo, si la proteinasa K se incorpora como agente de lisis, las gotitas en emulsión única monodispersas, las gotitas en emulsión múltiple y/o las GUV pueden calentarse a aproximadamente 37-60 °C durante aproximadamente 20 minutos para lisar las células y permitir que la proteinasa K digiera las proteínas celulares, después de lo cual pueden calentarse a aproximadamente 95 °C durante aproximadamente 5-10 minutos para desactivar la proteinasa K.

En algunas realizaciones, el agente o agentes de lisis (los ejemplos no limitantes de un agente de lisis incluyen Triton X-100, SDS o Sarkosyl) están presentes en el segundo fluido y desencadenan la lisis celular tras la emulsificación (cizallamiento de la tercera mezcla). La codisolución del agente de lisis y el segundo fluido (por ejemplo, aceite de fluorocarbono, aceite de silicona o un aceite de hidrocarburo, o una combinación de los mismos) puede facilitarse mediante un proceso de micelización, opcionalmente con la adición de cualquier tensioactivo adecuado para encapsular el agente de lisis. En la presente descripción se describen ejemplos no limitantes de tensioactivos. Como alternativa, la codisolución del agente de lisis y el segundo fluido puede facilitarse con el uso de micro/nanocápsulas modificadas sintéticamente, tales como micro/nanopartículas de cera de parafina (por ejemplo, cápsulas), generando de ese modo nanopartículas y/o micropartículas de cera de parafina que contienen el agente o agentes de lisis.

En algunas realizaciones, el proceso de lisis también puede desencadenarse directamente por los tensioactivos adecuados contenidos (por ejemplo, en forma de cápsula) en el segundo fluido, tales como, sin limitación, el perfluoropoliéter (PFPE) con un grupo terminal iónico, el ácido carboxílico, el carboxilato de amonio, el carboxilato de potasio o combinaciones de los mismos.

En ciertos aspectos, la lisis celular puede también, o como alternativa, basarse en técnicas que no implican la adición de un agente de lisis. Por ejemplo, la lisis puede lograrse mediante técnicas mecánicas que pueden emplear diversas características geométricas para efectuar la perforación, el cizallamiento, la abrasión, etc., de las células. También se pueden usar otros tipos de rotura mecánica, tales como técnicas acústicas. Además, también se puede usar energía térmica para lisar las células. Se puede emplear cualquier medio conveniente para efectuar la lisis celular en los métodos descritos en la presente memoria.

PCR

Como se resumió anteriormente, al poner en práctica los métodos de la presente descripción, se puede usar un ensayo basado en PCR para detectar la presencia de ciertos ácidos nucleicos de interés, por ejemplo, genes de interés y/o marcadores genéticos, por ejemplo, uno o más oncogenes, presentes en células o en una muestra heterogénea de ácidos nucleicos. Dichos ensayos basados en PCR se pueden realizar en la misma gotita monodispersa, por ejemplo, una gotita en emulsión única monodispersa o una gotita monodispersa en emulsión múltiple como una etapa de amplificación por MDA, anterior o posterior. En otras realizaciones, las reacciones de PCR pueden realizarse en gotitas monodispersas de forma independiente. Las condiciones de dichos ensayos basados en PCR pueden variar de una o más maneras.

Por ejemplo, el número de cebadores de PCR que pueden añadirse a una gotita en emulsión única monodispersa o a una gotita en emulsión múltiple y/o GUV puede variar. El término “ cebador” puede referirse a más de un cebador y se refiere a un oligonucleótido, ya sea de origen natural, como en una digestión de restricción purificada, o producido sintéticamente, que es capaz de actuar como punto de inicio de la síntesis a lo largo de una cadena complementaria cuando se coloca en condiciones en las cuales se cataliza la síntesis de un producto de extensión del cebador que es complementario a una cadena de ácido nucleico. Dichas condiciones incluyen la presencia de cuatro desoxirribonucleósidos trifosfatos diferentes y un agente inductor de la polimerización, tal como la ADN polimerasa o la transcriptasa inversa, en un tampón adecuado (el “tampón” incluye sustituyentes que son cofactores o que afectan al pH, la fuerza iónica, etc.) y a una temperatura adecuada. El cebador es preferiblemente monocatenario para una máxima eficacia en la amplificación.

El complemento de una secuencia de ácido nucleico, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un oligonucleótido que, cuando se alinea con la secuencia de ácido nucleico de modo que el extremo 5' de una secuencia se empareja con el extremo 3' de la otra, está en “ asociación antiparalela” . La complementariedad no necesita ser perfeccionada; los dúplex estables pueden contener pares de bases emparejadas incorrectamente o bases no emparejadas. Los expertos en la técnica de la tecnología de ácidos nucleicos pueden determinar empíricamente la estabilidad del dúplex teniendo en cuenta una serie de variables que incluyen, por ejemplo, la longitud del oligonucleótido, el porcentaje de concentración de bases de citosina y guanina en el oligonucleótido, la fuerza iónica y la incidencia de pares de bases emparejadas incorrectamente.

Los cebadores que se pueden añadir a una gotita en emulsión única monodispersa o a una gotita en emulsión múltiple y/o GUV pueden oscilar de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 o más, por ejemplo, aproximadamente 2 a 100 cebadores, aproximadamente 2 a 10 cebadores, aproximadamente 10 a 20 cebadores, aproximadamente 20 a 30 cebadores, aproximadamente 30 a 40 cebadores, aproximadamente 40 a 50 cebadores, aproximadamente 50 a 60 cebadores, aproximadamente 60 a 70 cebadores, aproximadamente 70 a 80 cebadores, aproximadamente 80 a 90 cebadores, aproximadamente 90 a 100 cebadores, aproximadamente 100 a 150 cebadores, aproximadamente 150 a 200 cebadores, aproximadamente 200 a 250 cebadores, aproximadamente 250 a 300 cebadores, aproximadamente 300 a 350 cebadores, aproximadamente 350 a 400 cebadores, aproximadamente 400 a 450 cebadores, aproximadamente 450 a 500 cebadores o aproximadamente 500 cebadores o más.

Estos cebadores pueden contener cebadores para uno o más genes de interés, por ejemplo, oncogenes. El número de cebadores para los genes de interés que se añaden puede ser de aproximadamente uno a 500, por ejemplo, aproximadamente 1 a 10 cebadores, aproximadamente 10 a 20 cebadores, aproximadamente 20 a 30 cebadores, aproximadamente 30 a 40 cebadores, aproximadamente 40 a 50 cebadores, aproximadamente 50 a 60 cebadores, aproximadamente 60 a 70 cebadores, aproximadamente 70 a 80 cebadores, aproximadamente 80 a 90 cebadores, aproximadamente 90 a 100 cebadores, aproximadamente 100 a 150 cebadores, aproximadamente 150 a 200 cebadores, aproximadamente 200 a 250 cebadores, aproximadamente 250 a 300 cebadores, aproximadamente 300 a 350 cebadores, aproximadamente 350 a 400 cebadores, aproximadamente 400 a 450 cebadores, aproximadamente 450 a 500 cebadores o aproximadamente 500 cebadores o más. Los genes y oncogenes de interés incluyen, pero no se limitan a, BAX, BCL2L1, CASP8, CDK4, ELK1, ETS1, HGF, JAK2, JUNB, JUND, KIT, KITLG, MCL1, MET, MOS, MYB, NFKBIA, EGFR, Myc, EpCAM, NRAS, PIK3CA, PML, PRKCA, RAF1, RARA, REL, ROS1, RUNX1, SRC, STAT3, CD45, citoqueratinas, CEA, CD133, HER2, CD44, CD49f, CD146, MUC1/2, ABL1, AKT1, APC, ATM, BRAF, CDH1, CDKN2A, CTNNB1, EGFR, ERBB2, ERBB4, EZH2, FBXW7, FGFR2, FGFR3, FLT3, GNAS, GNAQ, GNA11, HNF1A, HRAS, IDH1, IDH2, JAK2, JAK3, KDR, KIT, KRAS, MET, MLH1, NOTCH1, NPM1, NRAS, PDGFRA, PIK3CA, PTEN, PTPN11, RB1, RET, SMAD4, STK11, TP53, VHL y ZHX2.

Dichos cebadores y/o reactivos pueden añadirse a una gotita en emulsión única monodispersa o a una gotita en emulsión múltiple y/o GUV en una etapa, o en más de una etapa. Por ejemplo, los cebadores pueden añadirse en dos o más etapas, tres o más etapas, cuatro o más etapas o cinco o más etapas. Independientemente de si los cebadores se añaden en una etapa o en más de una etapa, pueden añadirse después de la adición de un agente de lisis, antes de la adición de un agente de lisis o de forma concomitante con la adición de un agente de lisis. Cuando se añaden antes o después de la adición de un agente de lisis, los cebadores de PCR se pueden añadir en una etapa separada de la adición de un agente de lisis.

Una vez que se han añadido los cebadores a una gotita en emulsión única monodispersa o a una gotita en emulsión múltiple y/o la GUV, la gotita en emulsión única monodispersa o la gotita en emulsión múltiple monodispersa y/o la GUV se puede incubar en condiciones que permitan la PCR. En algunas realizaciones, la gotita en emulsión única monodispersa o la gotita en emulsión múltiple y/o la GUV se pueden incubar en el mismo dispositivo microfluídico que se usó para añadir el o los cebadores, o se pueden incubar en un dispositivo diferente. En ciertas realizaciones, la incubación de la gotita en emulsión única monodispersa o la gotita en emulsión múltiple y/o la GUV en condiciones que permiten la amplificación por PCR se realiza en el mismo dispositivo microfluídico utilizado para encapsular y lisar las células. En algunas realizaciones, cualquiera de las técnicas/etapas descritas anteriormente, incluida la incubación de gotitas y/o GUV en emulsión múltiple, la adición del o de los cebadores y la amplificación por PCR, se realiza sin requerir el uso de un dispositivo o dispositivos microfluídicos. La incubación de la gotita en emulsión única monodispersa o la gotita en emulsión múltiple y/o la GUV puede adoptar una variedad de formas. En ciertos aspectos, la gotita en emulsión única monodispersa o la gotita en emulsión múltiple y/o la GUV que contienen la mezcla de PCR pueden fluir a través de un canal que incuba las gotitas monodispersas en condiciones efectivas para la PCR. En algunas realizaciones, las reacciones de PCR se realizan sin el uso de dispositivos y/o sistemas microfluídicos. En algunas realizaciones, hacer fluir la gotita en emulsión única monodispersa o la gotita en emulsión múltiple y/o la GUV a través de un canal puede implicar un canal que serpentea sobre diversas zonas de temperatura mantenidas a temperaturas efectivas para la PCR. Dichos canales pueden, por ejemplo, recorren cíclicamente dos o más zonas de temperatura, en donde al menos una zona se mantiene a aproximadamente 65 °C y al menos una zona se mantiene a aproximadamente 95 °C. Como alternativa, se pueden utilizar zonas para 86 °C, 60 °C y 20 °C. A medida que las gotitas en emulsión única monodispersas o en emulsión múltiple y/o las GUV se mueven a través de dichas zonas, su temperatura sigue un ciclo, según sea necesario para la PCR. Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente el número exacto de zonas y la temperatura respectiva de cada zona para lograr la amplificación por PCR deseada.

Sujetos y/o muestras adecuadas

Los métodos descritos se pueden aplicar a muestras biológicas tomadas de una variedad de sujetos diferentes. En muchas realizaciones, los sujetos son “ mamíferos” , donde este término se usa ampliamente para describir organismos que pertenecen a la clase de los mamíferos, incluidos los órdenes carnívoros (por ejemplo, perros y gatos), roedores (por ejemplo, ratones, cobayas y ratas) y primates (por ejemplo, seres humanos, chimpancés y monos). En muchas realizaciones, los sujetos son seres humanos. Los métodos en cuestión se pueden aplicar a sujetos humanos de ambos géneros y en cualquier fase del desarrollo (es decir, recién nacidos, lactantes, jóvenes, adolescentes, adultos), donde en ciertas realizaciones el sujeto humano es un joven, adolescente o adulto. Si bien la presente descripción puede aplicarse a un sujeto humano, debe entenderse que los métodos en cuestión también pueden llevarse a cabo en otros sujetos animales (es decir, en “ sujetos no humanos” ) tales como, pero sin limitarse a, aves, ratones, ratas, perros, gatos, ganado y caballos. Por consiguiente, debe entenderse que cualquier sujeto que necesite una evaluación tal como se describe en la presente memoria es adecuado.

Además, los sujetos adecuados incluyen aquellos a los que se les ha diagnosticado y a los que no se les ha diagnosticado una afección, tal como cáncer. Los sujetos adecuados incluyen aquellos que presentan y no presentan presentaciones clínicas de uno o más cánceres. En ciertos aspectos, un sujeto puede estar en riesgo de desarrollar cáncer, debido a uno o más factores tales como antecedentes familiares, exposición química y/o ambiental, mutaciones genéticas (por ejemplo, la mutación en BRCA1 y/o BRCA2), hormonas, agentes infecciosos, exposición a la radiación, estilo de vida (por ejemplo, dieta y/o tabaquismo), presencia de una o más enfermedades diferentes y similares.

Como se ha descrito con más detalle anteriormente, se puede obtener una variedad de diferentes tipos de muestras biológicas de dichos sujetos. En ciertas realizaciones, se extrae sangre completa de un sujeto. Cuando se desee, la sangre completa se puede tratar antes de poner en práctica los métodos en cuestión, tales como mediante centrifugación, fraccionamiento, purificación y similares. El volumen de la muestra de sangre completa que se extrae de un sujeto puede ser de 100 ml o menos, por ejemplo, aproximadamente 100 ml o menos, aproximadamente 50 ml o menos, aproximadamente 30 ml o menos, aproximadamente 15 ml o menos, aproximadamente 10 ml o menos, aproximadamente 5 ml o menos, o aproximadamente 1 ml o menos.

Los métodos y dispositivos en cuestión, tal como se describen en la presente memoria, son compatibles con células tanto fijadas como vivas. En ciertas realizaciones, los métodos y dispositivos en cuestión se ponen en práctica con células vivas. En otras realizaciones, los métodos y dispositivos en cuestión se ponen en práctica con células fijadas. La fijación de una muestra celular permite lavarla para extraer pequeñas moléculas y lípidos que pueden interferir en el análisis posterior. Además, la fijación y permeabilización de células permite que las células se tiñan con anticuerpos para las proteínas de superficie, así como para las proteínas intracelulares. Combinada con los métodos de amplificación nucleica descritos en la presente memoria, dicha tinción se puede usar para lograr altos niveles de multiplexación porque los anticuerpos se localizan en la muestra celular, mientras que los productos de amplificación nucleica están libres dentro de una gotita en emulsión única monodispersa, una gotita monodispersa en emulsión múltiple y/o GUV. Dicha configuración permite usar colorantes del mismo color para anticuerpos y amplicones producidos por amplificación de ácidos nucleicos. Se puede usar cualquier método adecuado para fijar células, incluyendo, pero sin limitarse a, fijación mediante el uso de soluciones acuosas tales como formaldehído, metanol y/o acetona. Las células fijadas se pueden incluir además en bloques de soporte sólidos, tales como los compuestos por parafina, lo que permite el almacenamiento a largo plazo. En algunas realizaciones, para realizar los métodos en cuestión en células que se han fijado e incluido como se ha descrito anteriormente, dichas células se desparafinizan, seccionan y permeabilizan. La desparafinización se puede realizar usando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, sin limitación, lavados con xileno y/o etanol. La permeabilización se puede realizar usando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, sin limitación, lavados con reactivos tales como acetona, metanol, Triton-X, Tween 20 y NP-40.

Ejemplos de aspectos no limitantes de la descripción

Los aspectos, incluyendo las realizaciones, de la presente materia objeto descrita anteriormente pueden ser beneficiosos solos o en combinación, con uno o más aspectos o realizaciones adicionales.

Claims

REIVINDICACIONES

i.Un método de captura de dianas en gotitas monodispersas que comprende:

combinar una pluralidad de partículas modelo de captura que comprenden un hidrogel y que comprenden además uno o más restos de anclaje, en donde cada uno de los restos de anclaje puede unirse a una o más partículas diana, con un primer fluido para proporcionar una primera mezcla, en donde el primer fluido comprende una pluralidad de partículas diana;

incubar la primera mezcla para permitir la asociación de la pluralidad de partículas diana a la pluralidad de partículas modelo de captura, de este modo una porción de la pluralidad de partículas diana se asocia a las partículas modelo de captura;

generar un sobrenadante y un sedimento a partir de la primera mezcla, opcionalmente mediante centrifugación;

retirar el sobrenadante para separar la pluralidad de partículas modelo de captura y partículas diana asociadas de la solución de la primera mezcla;

lavar y resuspender el gránulo en un tampón de reacción para proporcionar una segunda mezcla; combinar la segunda mezcla con un segundo fluido para proporcionar una tercera mezcla, en donde el segundo fluido es inmiscible con la segunda mezcla; y

tundir la tercera mezcla de modo que una pluralidad de las partículas modelo de captura se encapsulen en una pluralidad de gotitas monodispersas en el segundo fluido, proporcionando de este modo una pluralidad de gotitas monodispersas que comprenden el tampón de reacción, una de las partículas modelo de captura y una de la pluralidad de partículas diana asociadas a dichas partículas modelo de captura.
2. El método de la reivindicación 1, en donde el segundo fluido comprende un aceite.
3. El método de la reivindicación 2, en donde el aceite comprende un aceite de fluorocarbono, un aceite de silicona, un aceite de hidrocarburo o una combinación de los mismos.
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el primer fluido comprende una muestra biológica.
5. El método de la reivindicación 4, en donde la muestra biológica es un fluido corporal.
6. El método de la reivindicación 5, en donde el fluido corporal comprende partículas diana seleccionadas del grupo que consiste en células circulantes, componentes celulares, ácidos nucleicos libres de células, vesículas extracelulares, antígenos proteicos, células procariotas, hongos, virus y combinaciones de los mismos.
7. El método de la reivindicación 6, en donde el fluido corporal es un fluido corporal humano.
8. El método de la reivindicación 1, en donde la asociación de la pluralidad de partículas diana a la pluralidad de partículas modelo de captura es específica de la diana.