ES2991804T3 - Variantes de anticuerpos - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a anticuerpos que se unen al TNF± y presentan una unión modificada a FcRn. Los anticuerpos de la invención tienen buenas funciones efectoras y/o propiedades farmacocinéticas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Variantes de anticuerpos

Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos modificados que tienen funciones efectoras alteradas y/o propiedades farmacocinéticas alteradas. Los anticuerpos son útiles en el tratamiento terapéutico de diversos trastornos, en particular de afecciones inflamatorias.

Antecedentes

Los anticuerpos monoclonales han adquirido una importancia creciente como reactivos terapéuticos en medicina clínica durante los últimos 20 años. Durante muchos años, los esfuerzos por mejorar los anticuerpos se centraron en reducir su posible inmunogenicidad, lo que dio lugar a anticuerpos humanizados o incluso totalmente humanos. Otro enfoque pretende optimizar los anticuerpos mejorando sus funciones efectoras. Mientras que los efectos directos están mediados por la región variable de unión al antígeno del anticuerpo, los efectos indirectos están mediados por la región Fc constante. Los esfuerzos para mejorar las funciones efectoras se centran principalmente en la modulación de la región Fc. Además, es deseable mejorar la semivida sérica de los anticuerpos terapéuticos, lo que puede reducir la cantidad de anticuerpos necesarios y aumentar su conveniencia para los pacientes al prolongar los intervalos de tratamiento.

Para aplicaciones terapéuticas, la inmunoglobulina G (IgG) ha sido la clase preferente por varias razones: las IgG son fáciles de purificar, son relativamente estables al almacenamiento, pueden administrarse por vía intravenosa, tienen una semivida biológica prolongada in vivo y son capaces de participar en una serie de funciones efectoras biológicas como la activación de la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y el reclutamiento de células efectoras a través de diversas interacciones Fc-receptor (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos; ADCC). De las cinco clases de inmunoglobulinas, la IgG presenta la semivida biológica más larga debido a su interacción única con el receptor de reciclaje de IgG, el receptor Fc neonatal (FcRn). Una de las funciones conocidas del receptor es rescatar a la IgG de la degradación catalítica. Una estructura de cocristal FcRn-Fc resuelta ha demostrado que la interacción con Fc se produce en la región bisagra-CH2-CH3 de IgG. Esta interacción se produce de forma estrictamente dependiente del pH a un pH ácido de 6,0-6,5 en los endosomas. Las moléculas de IgG unidas se reciclan de nuevo a la superficie celular, donde se liberan a un pH fisiológico de 7,4 en la circulación, mientras que las moléculas de IgG no complejas se destinan a la degradación lisosomal. La modulación de la interacción FcRn-IgG permitirá, por tanto, un control específico de la semivida sérica de las inmunoglobulinas gamma y de las proteínas de fusión Fc.

Dependiendo de la aplicación, puede ser deseable aumentar o reducir el tiempo de residencia en suero de la IgG. Para la aplicación terapéutica es deseable una semivida más larga, ya que se necesitarán dosis más pequeñas y menos inyecciones. Se han investigado varios enfoques para aumentar la semivida, como el uso de polietilenglicol (PEG), la generación de proteínas de fusión con albúmina o Fc y el refuerzo de la interacción FcRn-IgG. Los fármacos pEGilados están en la clínica desde 1990 y la pEGilación es una tecnología establecida para prolongar la residencia del fármaco en la sangre. Dado que la albúmina sérica humana (HSA) también es reciclada por el FcRn a través de una interacción dependiente del pH, también se han producido varias proteínas de fusión con albúmina para mejorar la estabilidad y la semivida. Además, los fragmentos de anticuerpos fusionados a albúmina o a dominios de unión a albúmina han demostrado un tiempo de residencia en suero prolongado en estudios preclínicos. La generación de proteínas de fusión Fc es otra estrategia que dotará a las proteínas o péptidos de propiedades similares a las de un anticuerpo intacto.

Las modificaciones de la región Fc que se han investigado se resumen en Saxena (2016) Frontiers in Immunology, Vol. 7, Artículo 580.

Deng et al. (2010) Drug Metabolism and Disposition, vol. 38, no. 4, páginas 600-605 investigaron la farmacocinética de un anticuerpo monoclonal humanizado contra el factor de necrosis tumoral y sus variantes neonatales del receptor Fc en ratones y monos cynomolgus.

Yeung et al. (2009) The Journal of Immunology, Vol. 182, No. 12, páginas 7663-7671 describe la ingeniería de la afinidad de la IgG1 humana a los receptores Fc neonatales humanos e investiga el impacto de la mejora de la afinidad en la farmacocinética en primates.

Kuo et al. (2011) MABS, Vol. 3, n° 5, páginas 422-430 es una revisión sobre los receptores Fc neonatales y la terapéutica basada en IgG.

Suzuki et al. (2010) The Journal of Immunology, Vol. 184, No. 4, páginas 1968-1976 analiza la importancia del FcR neonatal en la regulación de la semivida sérica de las proteínas terapéuticas que contienen el dominio Fc de la IgG1 humana.

Yasmina Noubia Abdiche et al. (2015) comprobaron que el receptor Fc neonatal (FcRn) se une independientemente a ambos sitios del homodímero IgG con idéntica afinidad (MABS, vol. 7, n° 2, páginas 331-343).

Ward et al. (2015) Molecular Immunology, vol. 67, n° 2, páginas 131-141 es una revisión sobre el FcRn como diana para la modulación de la dinámica de los anticuerpos.

Rajpal et al. (2014) capítulo 1, páginas 1-44 en "Therapeutic Fc-fusion proteins", Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, Alemania, ofrece una visión general de la estructura y la función de los anticuerpos.

Existe una necesidad continua de anticuerpos que tengan funciones efectoras y/o farmacocinéticas mejoradas.

Sumario de la invención

Los inventores de esta solicitud comprobaron que ciertas mutaciones específicas en la región Fc de un anticuerpo aumentan drásticamente la afinidad del anticuerpo por el FcRn a pH 6, mientras que la afinidad a pH 7,4 sigue siendo baja. Se espera que los anticuerpos con las mutaciones tengan propiedades farmacocinéticas mejoradas. Además, los anticuerpos presentan funciones efectoras superiores a las de anticuerpos conocidos como el infliximab (IFX).

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un anticuerpo IgG<1>que comprende un dominio de unión a TNFa y un sitio de unión a FcRn, que tiene una alta afinidad a FcRn humano a pH 6, caracterizándose dicha alta afinidad por una constante de equilibrio de disociación (K<d>) determinada por resonancia de plasmón superficial de menos de 100 nM, y que además no tiene afinidad o tiene una afinidad baja a FcRn humano a pH 7.4, caracterizándose dicha baja afinidad por una Kd determinada por resonancia de plasmón superficial, de más de 10 pM, en la que la secuencia de aminoácidos del anticuerpo comprende los aminoácidos 311R (numeración UE), 428E (numeración UE) y 434W (numeración UE), y en la que el anticuerpo comprende (i) un dominio Vl que comprende una región CDR1 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:3, una región CDR2 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:4, y una región CDR3 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:5, y (ii) un dominio VH<h>que comprende una región CDR1 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ iD NO:6, una región<c>DR2 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:7, y una región CDR3 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:8.

En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo no fucosilado o un anticuerpo con fucosilación reducida.

En otra realización, el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO:13.

En otra realización, el anticuerpo comprende un dominio V<h>que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:9 y un dominio V<l>que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:10.

En otra realización, el anticuerpo comprende una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:1 y una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:11.

En un segundo aspecto, la invención se refiere al anticuerpo del primer aspecto para su uso en el tratamiento de una afección inflamatoria.

En una realización del segundo aspecto, la afección inflamatoria es un trastorno inflamatorio del tracto gastrointestinal.

En otra realización del segundo aspecto, dicho tratamiento comprende administrar por vía oral una cantidad eficaz de dicho anticuerpo.

En otra realización del segundo aspecto, dicho anticuerpo se aplica tópicamente.

En un tercer aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo del primer aspecto.

La invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas.

Cualquier referencia en la descripción a procedimientos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).

Descripción de las figuras

Figura 1: Potencia de las variantes de anticuerpos anti-TNFa para neutralizar el TNFa humano en el ensayo L929. Se muestran las curvas dosis-respuesta de las variantes de anticuerpos anti-TNFa y del infliximab de referencia.

Figura 2: Transporte de variantes de IgG anti-TNFa a través de células T84 polarizadas. Se muestran las cantidades de variantes de anticuerpos anti-TNFa e Infliximab (IFX) desde el depósito apical al basolateral a las 4 horas después de la adición. Presentado como ng/cm2. Las barras de error indican la DE de dos a cuatro monocapas individuales.

Figura 3: Transporte de variantes de IgG anti-TNFa a través de células T84 polarizadas en presencia de cantidades excesivas de IgG de mieloma. Se muestran las cantidades de las variantes de Ab anti-TNFa y de IFX transportadas desde el reservorio apical al basolateral en presencia de un exceso de 10 veces de IgG de mieloma humano a las 4 horas de la adición. Presentado como ng/cm2 Las barras de error indican la DE de tres a cuatro monocapas individuales.

Figura 4: Actividad ADCC. Inducción de ADCC por variantes de anticuerpos anti-TNFa, anticuerpos de tipo salvaje e IFX.

Figura 5: Unión a C1q humano. Unión de IFX y variantes de anticuerpos anti-TNFa a C1q humano. Cada concentración se analizó por duplicado. Las barras de error indican la DE.

Figura 6: Actividad de los CDC. Porcentaje de muerte celular para las distintas variantes anti-TNFa en comparación con IFX. Cada punto de muestra es la media de 6 réplicas independientes.

Figura 7: Inducción de macrófagos CD14+CD206+ por cada compuesto en relación con la inducción de IFX. Datos resumidos de 4 experimentos independientes. Las barras representan la media, las barras de error representan el SEM.

Figura 8: Supresión de la proliferación de células T por cada compuesto en relación con IFX. Datos resumidos de 3 experimentos independientes. Las barras representan la media, las barras de error representan el SEM.

Figura 9: Presentación esquemática de la mutagénesis dirigida al sitio.

Figura 10: Ilustración esquemática de las formas dominantes de N-glicanos unidos a N297 de las variantes de anticuerpos anti-TNFa. Los dos perfiles de N-glicano que dominaron entre el panel de variantes de anticuerpos anti-TNFa ensayados fueron 4GlcNac-1Fuc-3Man y 4GlcNac-1Fuc-3Man-1Gal mientras que para las variantes de IgG producidas en presencia de 2FF se produjeron las mismas estructuras bi-antenarias excepto que éstas carecían de la fucosa.

Descripción detallada

La presente invención se refiere a un anticuerpo IgG1 que es capaz de unirse a TNFa y comprende un sitio de unión a FcRn. De acuerdo con la presente solicitud, un anticuerpo comprende un sitio de unión a FcRn si es capaz de unirse a FcRn, preferentemente a FcRn humano, a pH 6. La unión a FcRn a pH 6 puede determinarse mediante SPR, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 4 de la presente solicitud. Si la unión de un anticuerpo a FcRn a pH 6 puede detectarse mediante SPR, dicho anticuerpo tiene un sitio de unión a FcRn. El anticuerpo de la invención tiene una alta afinidad por el FcRn humano a pH 6, caracterizada por una constante de equilibrio de disociación (K<d>) inferior a 100 nM. El anticuerpo tiene además una baja afinidad por el FcRn humano a pH 7,4, caracterizada por una K<d>superior a 10|jM. La secuencia de aminoácidos del anticuerpo comprende el aminoácido triptófano en la posición 434 (numeración UE).

A lo largo de la presente memoria descriptiva y reivindicaciones, se utiliza generalmente el sistema de numeración de Kabat cuando se hace referencia a un residuo en el dominio variable (aproximadamente, residuos 1-107 de la cadena ligera y residuos 1-113 de la cadena pesada)(Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5a Ed. Servicio de Salud Pública, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Md. (1991)). El "sistema de numeración UE" o "índice UE" se utiliza generalmente para referirse a un residuo de la región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina (por ejemplo, el índice UE descrito en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Servicio de Salud Pública, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Md. (1991). A menos que se indique lo contrario, las referencias al número de residuos en el dominio variable de los anticuerpos se refieren a la numeración de residuos según el sistema de numeración de Kabat. A menos que se indique lo contrario, las referencias a números de residuos en el dominio constante de los anticuerpos se refieren a la numeración de residuos según el sistema de numeración de la UE (véase, por ejemplo, WO 2006/073941).

Anticuerpo

En el contexto de la presente solicitud, el término "anticuerpo" se utiliza como sinónimo de "inmunoglobulina" (Ig), que se define como una proteína perteneciente a la clase IgG1, e incluye todos los anticuerpos conocidos convencionalmente y sus fragmentos funcionales. En el contexto de la presente invención, un "fragmento funcional" de un anticuerpo/inmunoglobulina se define como un fragmento de unión a antígeno u otro derivado de un anticuerpo parental que mantiene esencialmente una o más de las propiedades de dicho anticuerpo parental. Un "fragmento de unión a antígeno" o "dominio de unión a antígeno" de un anticuerpo/inmunoglobulina se define como un fragmento(por ejemplo,una región variable de un lgG1) que conserva la región de unión a antígeno. Una "región de unión a antígeno" de un anticuerpo se encuentra típicamente en una o más regiones hipervariables de un anticuerpo, es decir, las regiones CDR-1, -2, y/o -3. Los anticuerpos de la presente invención pueden formar parte de construcciones bi- o multifuncionales.

Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. El término "anticuerpo monoclonal", tal como se utiliza en el presente documento, no se limita a los anticuerpos producidos mediante la tecnología del hibridoma. El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo derivado de un único clon, incluido cualquier clon eucariota, procariota o fago, y no al procedimiento por el que se produce. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse utilizando una amplia variedad de técnicas conocidas en la técnica, incluido el uso de tecnologías de hibridoma, recombinantes y de visualización de fagos, o una combinación de las mismas. (Harlow y Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual" CSH Press 1988, Cold Spring Harbor N.Y).

En otro aspecto de la divulgación, incluidas las realizaciones relativas al usoin vivode los anticuerpos anti-TNFa en seres humanos, pueden utilizarse anticuerpos quiméricos, primatizados, humanizados o humanos. En una realización preferente, el anticuerpo es un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado, más preferiblemente un anticuerpo monoclonal humano o un anticuerpo monoclonal humanizado.

Dominio de unión aTNFa

Preferiblemente, el anticuerpo de la invención se une específicamente al TNFa. Como se utiliza en el presente documento, un anticuerpo "reconoce específicamente", o "se une específicamente a" TNFa humano, cuando el anticuerpo es capaz de discriminar entre TNFa humano y una o más molécula(s) de referencia. Preferiblemente, el valoricso de unión a cada una de las moléculas de referencia es al menos 1.000 veces mayor que el valoricso de unión a TNFa. En su forma más general (y cuando no se menciona ninguna referencia definida), "unión específica" se refiere a la capacidad del anticuerpo para discriminar entre el TNFa humano y una biomolécula no relacionada, como se determina, por ejemplo, de acuerdo con los procedimientos de ensayo de especificidad conocidos en la técnica. Dichos procedimientos comprenden, entre otros, Western blots y pruebas ELISA. Por ejemplo, puede realizarse un ensayo ELISA estándar. Normalmente, la determinación de la especificidad de unión se realiza utilizando no una única biomolécula de referencia, sino un conjunto de unas tres a cinco biomoléculas no relacionadas, como leche en polvo, BSA, transferrina o similares. En una realización, la unión específica se refiere a la capacidad del anticuerpo para discriminar entre TNFa humano y TNFp humano.

El anticuerpo de la invención comprende un dominio V<l>y un dominio V<h>. El dominio V<l>comprende una región CDR1 (CDRL1), una región CDR2 (CDRL2), una región CDR3 (CDRL3) y regiones marco. El dominio V<h>comprende una región CDR1 (CDRH1), una región CDR2 (CDRH2), una región c DR3 (CDRH3) y regiones marco.

El término "CDR" se refiere a una de las seis regiones hipervariables dentro de los dominios variables de un anticuerpo que contribuyen principalmente a la unión al antígeno. Una de las definiciones más utilizadas para las seis CDR fue proporcionada por Kabat E. A. et al., (1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publicación 91 3242). Tal como se utiliza en el presente documento, la definición de CDR de Kabat sólo se aplica a CDR1, CDR2 y CDR3 del dominio variable de la cadena ligera (CDR L1, CDR L2, CDR L3, o L1, L2, L3), así como a CDR2 y CDR3 del dominio variable de la cadena pesada (CDR H2, CDR H3, o H2, H3). Sin embargo, la CDR1 del dominio variable de la cadena pesada (CDR H1 o H1), tal como se utiliza en el presente documento, se define por los siguientes residuos (numeración de Kabat): Comienza con la posición 26 y termina antes de la posición 36.

El anticuerpo de la invención comprende (i) un dominio V<l>que comprende una región CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:3, una región CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:4, y una región CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:5, y (ii) un dominio V<h>que comprende una región CDR1 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:6, una región CDR2 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:7, y una región CDR3 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:8.

En una realización más preferente, el anticuerpo de la invención de la invención comprende un dominio V<h>que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO:9. En otra realización más preferente, el anticuerpo comprende un dominio V<l>que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:10. Más preferentemente, el anticuerpo de la invención comprende (i) un dominio V<h>que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:9, y (ii) un dominio V<l>que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:10.

El anticuerpo de la invención tiene una alta afinidad por el TNFa humano. El término "K<d>" se refiere a la constante de equilibrio de disociación de una determinada interacción anticuerpo-antígeno. Típicamente, el anticuerpo de la invención se une al TNFa humano con una constante de equilibrio de disociación (K<d>) determinada utilizando la tecnología de resonancia de plasmón superficial (SPR) en un instrumento BIACORE. En particular, la determinación de K<d>se lleva a cabo como se describe en el Ejemplo 1.

Modificaciones que afectan a la afinidad por el FcRn

El anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia nativa de un anticuerpo de tipo salvaje en virtud de al menos una "modificación de aminoácidos" como se define en el presente documento. La modificación de al menos un aminoácido afecta a la afinidad del anticuerpo por el FcRn humano. Típicamente, la modificación de al menos un aminoácido aumenta la afinidad del anticuerpo al FcRn humano a pH 6. En una realización, la modificación de al menos un aminoácido aumenta la afinidad del anticuerpo por el FcRn humano a pH 6, en la que no cambia sustancialmente la afinidad por el FcRn humano a pH 7,4. Preferiblemente, el anticuerpo modificado tiene al menos una sustitución de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de tipo salvaje o de un anticuerpo progenitor, por ejemplo, de aproximadamente una a aproximadamente diez sustituciones de aminoácidos, y preferiblemente de aproximadamente una a aproximadamente cinco sustituciones de aminoácidos. Preferiblemente, la modificación de al menos un aminoácido se encuentra dentro del sitio de unión al FcRn del anticuerpo. El anticuerpo puede tener una o más modificaciones de aminoácidos fuera del sitio de unión al FcRn del anticuerpo que afecten a la unión al FcRn, por ejemplo, mediante cambios estructurales. La modificación o modificaciones de aminoácidos pueden generarse por procedimientos conocidosper se,por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al sitio, como se describe en "Antibody Engineering - Methods and Protocols", editado por Patrick Chames, 2.a ed., 2012, capítulo 31 (ISBN 978-1-61779-973-0).

El anticuerpo de la invención comprende el aminoácido triptófano en la posición 434 (numeración UE). En el presente documento se denomina "434W". El aminoácido nativo en la posición 434 de los anticuerpos IgG humanos no modificados es la asparagina (N). Así, el anticuerpo de la invención puede obtenerse introduciendo la mutación N434W en un anticuerpo. Preferentemente, el anticuerpo de la invención se puede obtener u obtiene sustituyendo triptófano por asparagina en la posición 434.

Además, el anticuerpo de la invención comprende el aminoácido ácido glutámico en la posición 428 (numeración UE). En el presente documento se denomina "428E". El aminoácido nativo en la posición 428 de los anticuerpos IgG humanos no modificados es la metionina (M). Así, el anticuerpo de la invención puede obtenerse introduciendo la mutación M428E en un anticuerpo. Preferentemente, el anticuerpo de la invención se puede obtener u obtiene sustituyendo el ácido glutámico por metionina en la posición 428.

Además, el anticuerpo de la presente invención comprende además el aminoácido arginina en la posición 311 (numeración UE). En el presente documento se denomina "311R". El aminoácido nativo en la posición 311 de los anticuerpos IgG humanos no modificados es la glutamina (Q). Así, el anticuerpo de la invención puede obtenerse introduciendo la mutación Q311R en un anticuerpo. Preferentemente, el anticuerpo de la invención se puede obtener u obtiene sustituyendo la glutamina por arginina en la posición 311.

El anticuerpo de la presente invención comprende los aminoácidos 434W, 428E y 311R. Este anticuerpo se obtiene introduciendo las mutaciones Q311R, M428E y N434W en un anticuerpo.

La secuencia de aminoácidos restante del dominio constante puede ser idéntica a la secuencia de aminoácidos nativa de una IgG humana típica. Es posible, sin embargo, que la secuencia de aminoácidos del anticuerpo comprenda una o más mutaciones o sustituciones adicionales a la secuencia de aminoácidos nativa de la región Fc de un anticuerpo nativo, siempre que el anticuerpo siga teniendo actividad de unión a TNFa y funciones efectoras.

En una realización preferente, la región Fc del anticuerpo de la invención, incluida la región bisagra, comprende o está formada por la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO:13.

En una realización preferente, la cadena pesada del anticuerpo de la invención tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO:11. Preferiblemente, este anticuerpo comprende además una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:1.

En otro aspecto de la divulgación, que no está cubierto por la invención reivindicada, la cadena pesada del anticuerpo de la invención tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO:12. Preferiblemente, este anticuerpo comprende además una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:23 o SEQ ID NO:24.

En una realización preferente de la invención, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo no fucosilado o un anticuerpo con fucosilación reducida.

El término "anticuerpo con fucosilación reducida", tal como se utiliza aquí, se refiere a un anticuerpo en el que menos del 90% de los N-glicanos del anticuerpo están fucosilados. Los procedimientos para determinar el porcentaje de fucosilación son conocidos en la técnica. Preferentemente, el porcentaje de fucosilación se determina como se describe en el Ejemplo 11 de la presente solicitud.

En otro aspecto de la divulgación, menos del 75%, o menos del 50%, o menos del 25% de los N-glicanos del anticuerpo están fucosilados. Lo más preferible es que menos del 15% de los N-glicanos del anticuerpo estén fucosilados. En una realización particular, los N-glicanos del anticuerpo de la invención no contienen ninguna fucosa.

Preferiblemente, menos del 90% de los N-glicanos en N297 (numeración UE) del anticuerpo están fucosilados. En otra realización, menos del 75%, o menos del 50%, o menos del 25% de los N-glicanos en N297 (numeración UE) del anticuerpo están fucosilados. Más preferiblemente, menos del 15% de los N-glicanos en N297 (numeración UE) del anticuerpo están fucosilados.

En otra realización, los N-glicanos en N297 del anticuerpo no contienen ninguna fucosa.

Los anticuerpos no fucosilados, a veces también denominados anticuerpos afucosilados, pueden generarse por varios procedimientos. Por ejemplo, el bloqueo sinérgico de los genes de la a1,6-fucosiltransferasa('FU78) y de la GDP-manosa 4,6-deshidratasa('GMD) en células CHO puede utilizarse para producir variantes de anticuerpos monoclonales totalmente afucosilados y potenciadores de ADCC (véase, por ejemplo, Imai-Nishiya et al. (2007) BMC Biotechnol. 7, 84). Un procedimiento que utiliza nucleasas de dedos de zinc (ZFN) que escinden el genFUT8en una región que codifica el núcleo catalítico de la a1,6-fucosiltransferasa e interrumpen así la función enzimática correspondiente en células CHO puede utilizarse para producir anticuerpos monoclonales que carecen por completo del núcleo de fucosa (véase, por ejemplo, Malphettes et al. (2010) Biotechnol. Bioeng. 106, 774-783).

Los anticuerpos con fucosilación reducida pueden prepararse añadiendo un sustrato señuelo como la 2-deoxi-2-fluoro-2-fucosa al medio de cultivo (véase, por ejemplo, Dekker et al. (2016) Sci Rep 6:36964), lo que se traduce en una menor incorporación de fucosa en los glicanos IgG-Fc.

En otro aspecto de la divulgación, el anticuerpo tiene un alto contenido de ácido siálico. Se puede conseguir un aumento de la sialilación, por ejemplo, mediante la transfección simultánea de la citidina monofosfato-ácido siálico sintasa (CMP-SAS), la citidina monofosfato-ácido siálico transportador (CMP-SAT) y las a 2,3-sialiltransferasas (véase, por ejemplo, Son et al. (2011) Glycobiology 21, 1019-1028).

Afinidad a FcRn

La afinidad a pH 6 al FcRn humano del anticuerpo de la invención es alta. La unión de alta afinidad del anticuerpo al FcRn humano a pH 6 se caracteriza por un valor K<d>inferior a 100 nM.

La afinidad del anticuerpo de la invención al FcRn humano se determina preferentemente mediante resonancia de plasma superficial (SPR), por ejemplo como se describe en el Ejemplo 4 de la presente solicitud.

El anticuerpo de la presente invención tiene típicamente una afinidad baja al FcRn humano a pH 7,4. La baja afinidad se caracteriza por un valor K<d>superior a 1 pM. Preferentemente, la baja afinidad al FcRn humano a pH 7,4 se caracteriza por un valor Kd superior a 10 pM.

Propiedades funcionales del anticuerpo

El anticuerpo de la invención se transporta eficazmente a través de una monocapa celular polarizada desde el lado apical al lado basolateral. Típicamente, el transporte a través de la monocapa celular polarizada es en mayor cantidad que el de infliximab, donde la cantidad de anticuerpo en infliximab se refiere a la masa/cm2 de la monocapa celular polarizada. La cantidad de anticuerpo transportada a través de la monocapa celular polarizada, en relación con la cantidad de infliximab transportada a través de la monocapa celular polarizada, es de al menos el 110%, preferiblemente de al menos el 125%, más preferiblemente de al menos el 150%, o al menos el 175%, o al menos el 200% (en el que la cantidad de infliximab transportado se fija en el 100%).

Además, el anticuerpo es transportado específicamente a través de la monocapa celular polarizada desde el lado apical al lado basolateral en presencia de un exceso de inmunoglobulinas competidoras. En este caso se habla de transporte específico.

El porcentaje de la masa total de inmunoglobulinas transportadas a través de la monocapa celular polarizada es mayor que el porcentaje de infliximab transportado a través de la monocapa celular polarizada desde el lado apical al lado basolateral en presencia de un exceso 10 veces mayor de inmunoglobulinas competidoras. El porcentaje de anticuerpo de la invención transportado a través de la monocapa celular polarizada en presencia de un exceso de 10 veces de inmunoglobulinas no relacionadas, en relación con el porcentaje de infliximab transportado a través de la monocapa celular polarizada en presencia de un exceso de 10 veces de anticuerpos no relacionados, es de al menos 150%, o al menos 200%, o al menos 250%, o al menos 300% (infliximab se establece en 100%).

Preferiblemente, la monocapa celular polarizada es una monocapa de células T84 polarizadas. El ensayo de transporte que imita el proceso de transcitosis puede llevarse a cabo como se describe en el Ejemplo 5 de la presente solicitud. El anticuerpo aquí descrito se une a CD64, CD32a(H), CD32a(R), CD32b, CD16a(V), CD16a(F) y CD16b(NA2). El anticuerpo aquí descrito se une típicamente a CD64 con Kd inferior a 100 nM, preferiblemente inferior a 10 nM. El anticuerpo descrito en el presente documento se une típicamente a CD32a(H) con Kd inferior a 10 pM.

El anticuerpo descrito en el presente documento se une típicamente a CD32a(R) con Kd inferior a 10 pM.

El anticuerpo descrito en el presente documento se une típicamente a CD32b con Kd inferior a 10 pM.

El anticuerpo descrito en el presente documento se une típicamente a CD16a(V), por ejemplo, con K<d>inferior a 500 nM, preferiblemente inferior a 100 nM.

El anticuerpo descrito en el presente documento se une típicamente a CD16a(F), por ejemplo, con Kd inferior a 10 pM, preferiblemente inferior a 1 pM.

El anticuerpo descrito en el presente documento se une típicamente a CD16b(NA2), por ejemplo, con Kd inferior a 10 |jM, preferiblemente inferior a 1 jM .

El anticuerpo aquí descrito se une además a C1q humano. Preferiblemente, esta unión es más fuerte que la unión de infliximab a C1q humano.

El anticuerpo aquí descrito tiene además citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) de complemento de conejo. Esta CDC del anticuerpo de la invención es preferiblemente mayor que la del infliximab, en términos de ECso relativa y/o muerte máxima relativa.

El anticuerpo aquí descrito es además capaz de inducir macrófagos CD14+CD206+. El nivel de inducción es preferiblemente comparable, igual o superior al de infliximab.

El anticuerpo aquí descrito es además capaz de suprimir la proliferación de células T El grado de supresión de la proliferación de células T es preferiblemente comparable, igual o superior al del infliximab.

Composiciones farmacéuticas y tratamiento

El tratamiento de una enfermedad abarca el tratamiento de pacientes a los que ya se ha diagnosticado cualquier forma de la enfermedad en cualquier estadio o manifestación clínica; el retraso del inicio o evolución o agravamiento o deterioro de los síntomas o signos de la enfermedad; y/o la prevención y/o reducción de la gravedad de la enfermedad.

Un "sujeto" o "paciente" al que se administra un anticuerpo anti-TNFa puede ser un mamífero, como un no primate (por ejemplo, vaca, cerdo, caballo, gato, perro, rata, etc.) o un primate (por ejemplo, mono o humano). En ciertos aspectos, el humano es un paciente pediátrico. En otros aspectos, el humano es un paciente adulto.

En el presente documento se describen composiciones que comprenden un anticuerpo anti-TNFa y, opcionalmente, uno o más agentes terapéuticos adicionales, como los segundos agentes terapéuticos descritos a continuación. Las composiciones se suministran típicamente como parte de una composición farmacéutica estéril que incluye un portador farmacéuticamente aceptable. Esta composición puede presentarse en cualquier forma adecuada (dependiendo del procedimiento deseado de administración al paciente).

Los anticuerpos anti-TNFa pueden administrarse a un paciente por diversas vías, como por vía oral, transdérmica, subcutánea, intranasal, intravenosa, intramuscular, intratecal, tópica o local, por ejemplo, mucosa. La vía de administración más adecuada en cada caso dependerá del anticuerpo concreto, del sujeto y de la naturaleza y gravedad de la enfermedad y del estado físico del sujeto. Normalmente, un anticuerpo anti-TNFa se administra por vía intravenosa.

En una realización particularmente preferente, el anticuerpo de la invención se administra por vía oral.

En el presente documento se describe un anticuerpo anti-TNFa presente en una composición farmacéutica a una concentración suficiente para permitir la administración intravenosa de 0,5 mg/kg de peso corporal a 20 mg/kg de peso corporal. En algunas realizaciones, la concentración de anticuerpo adecuada para su uso en las composiciones y procedimientos aquí descritos incluye, pero no se limita a, 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg, 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 13 mg/kg, 14 mg/kg, 15 mg/kg, 16 mg/kg, 17 mg/kg, 18 mg/kg, 19 mg/kg, 20 mg/kg, o una concentración que oscile entre cualquiera de los valores anteriores, por ejemplo, 1 mg/kg a 10 mg/kg, 5 mg/kg a 15 mg/kg, o 10 mg/kg a 18 mg/kg.

La dosis eficaz de un anticuerpo anti-TNFa puede oscilar entre aproximadamente 0,001 y aproximadamente 750 mg/kg por administración única (p. ej., en bolo), administraciones múltiples o administración continua, o para alcanzar una concentración sérica de 0,01-5000 jg/m l por administración única (p. ej., en bolo), administraciones múltiples o administración continua, o cualquier intervalo o valor eficaz dentro de este intervalo en función de la afección tratada, la vía de administración y la edad, el peso y el estado del sujeto. En caso de administración oral, la concentración sérica puede ser muy baja o incluso inferior al límite de detección. En ciertas realizaciones, cada dosis puede oscilar entre aproximadamente 0,5 mg y aproximadamente 50 mg por kilogramo de peso corporal o entre aproximadamente 3 mg y aproximadamente 30 mg por kilogramo de peso corporal. El anticuerpo puede formularse como solución acuosa.

En una realización particularmente preferente, el anticuerpo de la invención se administra por vía oral. Si el anticuerpo se administra por vía oral, la dosis diaria de anticuerpo suele oscilar entre 0,01 mg/kg y 100 mg/kg de peso corporal, o entre 0,05 mg/kg y 50 mg/kg de peso corporal, o entre 0,1 mg/kg y 25 mg/kg de peso corporal, o entre 0,15 mg/kg y 10 mg/kg de peso corporal, o entre 0,16 mg/kg y 5 mg/kg de peso corporal, o entre 0,2 mg/kg y 2 mg/kg de peso corporal, o entre 0,2 mg/kg y 1 mg/kg de peso corporal.15 mg/kg a unos 10 mg/kg de peso corporal, o unos 0,16 mg/kg a unos 5 mg/kg de peso corporal, o unos 0,2 mg/kg a unos 2 mg/kg de peso corporal, o unos 0,2 mg/kg a unos 1 mg/kg de peso corporal, Generalmente, las dosis ventajosas son dosis de 1 a 200 mg al día, preferiblemente de 5 a 100 o de 10 a 50 mg al día.

Las composiciones farmacéuticas pueden presentarse convenientemente en formas de dosis unitarias que contienen una cantidad predeterminada de un anticuerpo anti-TNFa por dosis. Dicha unidad puede contener de 0,5 mg a 5 g, por ejemplo, pero sin limitación, 1 mg, 10 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 750 mg, 1000 mg, o cualquier rango entre dos de los valores anteriores, por ejemplo, de 10 mg a 1000 mg, de 20 mg a 50 mg, o de 30 mg a 300 mg. Los portadores farmacéuticamente aceptables pueden adoptar una amplia variedad de formas dependiendo, por ejemplo, de la afección a tratar o de la vía de administración.

La determinación de la dosis eficaz, el número total de dosis y la duración del tratamiento con un anticuerpo anti-TNFa está dentro de las capacidades de los expertos en la materia, y puede determinarse utilizando un estudio estándar de escalada de dosis.

Las formulaciones terapéuticas de los anticuerpos anti-TNFa adecuados en los procedimientos descritos en el presente documento pueden prepararse para su almacenamiento como formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas mezclando el anticuerpo que tenga el grado de pureza deseado con portadores, excipientes o estabilizadores opcionales farmacéuticamente aceptables típicamente empleados en la técnica (todos los cuales se denominan en el presente documento "portadores"), es decir, agentes tampón, agentes estabilizadores, conservantes, isotonificadores, detergentes no iónicos, antioxidantes y otros aditivos diversos. Véase, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición (Osol, ed. 1980). Dichos aditivos deben ser atóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas.

Los agentes tampón ayudan a mantener el pH en el rango que se aproxima a las condiciones fisiológicas. Pueden presentarse en concentraciones que oscilan entre unos 2 mM y unos 50 mM. Entre los agentes tampón adecuados se encuentran los ácidos orgánicos e inorgánicos y sus sales, como los tampones de citrato (p. ej., mezcla de citrato monosódico y citrato disódico, mezcla de ácido cítrico y citrato trisódico, mezcla de ácido cítrico y citrato monosódico, etc.), los tampones de citrato y fosfato, los tampones de succinato (p. ej, mezcla de ácido succínico y succinato monosódico, mezcla de ácido succínico e hidróxido sódico, mezcla de ácido succínico y succinato disódico, etc.), tampones de tartrato (por ejemplo, mezcla de ácido tartárico y tartrato sódico, mezcla de ácido tartárico y tartrato potásico, mezcla de ácido tartárico e hidróxido sódico, etc.), tampones de fumarato (por ejemplo, mezcla de ácido fumárico y fumarato monosódico, mezcla de ácido fumárico y fumarato disódico, mezcla de fumarato monosódico y fumarato disódico, etc.), tampones de gluconato (por ejemplo, mezcla de ácido glucónico y gliconato sódico, mezcla de ácido glucónico e hidróxido sódico, mezcla de ácido glucónico y gliconato potásico, etc.), tampones de oxalato (por ejemplo, mezcla de oxalato de sodio y ácido oxálico, mezcla de hidróxido de sodio y ácido oxálico, mezcla de oxalato de potasio y ácido oxálico, etc.), tampones de lactato (mezcla de lactato de sodio y ácido láctico, mezcla de hidróxido de sodio y ácido láctico, mezcla de lactato de potasio y ácido láctico, etc.) y tampones de acetato (mezcla de acetato de sodio y ácido acético, mezcla de hidróxido de sodio y ácido acético, etc.). Además, pueden utilizarse tampones de fosfato, tampones de histidina y sales de trimetilamina como Tris.

La composición farmacéutica de la invención puede comprender además al menos una sal, por ejemplo cloruro de sodio. La concentración de sal oscila preferentemente entre 100 mM y 200 mM, por ejemplo, alrededor de 150 mM.

Pueden añadirse conservantes para retardar el crecimiento microbiano, y pueden añadirse en cantidades que oscilen entre 0 ,2% -1% (p/v). Entre los conservantes adecuados se encuentran el fenol, el alcohol bencílico, el metacresol, el metilparabeno, el propilparabeno, el cloruro de octadecildimetilbencilamonio, los haluros de benzalconio (por ejemplo, cloruro, bromuro y yoduro), el cloruro de hexametonio y los alquilparabenos, como el metilparabeno o el propilparabeno, el catecol, el resorcinol, el ciclohexanol y el 3-pentanol. Para garantizar la isotonicidad de las composiciones líquidas pueden añadirse isotonificadores, a veces conocidos como "estabilizadores", que incluyen alcoholes de azúcar polihídricos, preferiblemente alcoholes de azúcar trihídricos o superiores, como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol. Los estabilizantes se refieren a una amplia categoría de excipientes cuya función puede variar desde un agente de volumen a un aditivo que solubiliza el agente terapéutico o ayuda a prevenir la desnaturalización o la adherencia a la pared del envase. Los estabilizantes típicos pueden ser alcoholes polihídricos de azúcar (enumerados anteriormente); aminoácidos como arginina, lisina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, alanina, ornitina, L-leucina, 2-fenilalanina, ácido glutámico, treonina, etc, azúcares orgánicos o alcoholes de azúcar, como lactosa, trehalosa, estaquiosa, manitol, sorbitol, xilitol, ribitol, mioinositol, galactitol, glicerol y similares, incluidos los ciclitoles como el inositol; polietilenglicol; polímeros de aminoácidos; agentes reductores que contengan azufre, como urea, glutatión, ácido tióctico, tioglicolato sódico, tioglicerol, a-monotioglicerol y tiosulfato sódico; polipéptidos de bajo peso molecular (p. ej., polipéptidos de bajo peso molecular); polipéptidos de bajo peso molecular (p. ej., polipéptidos de bajo peso molecular).g., péptidos de 10 residuos o menos); proteínas como la seroalbúmina humana, la seroalbúmina bovina, la gelatina o las inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, como la polivinilpirrolidona monosacáridos, como la xilosa, la manosa, la fructosa, la glucosa; disacáridos, como la lactosa, la maltosa, la sacarosa y los trisacáridos, como la rafinosa; y polisacáridos, como el dextrano. Los estabilizadores pueden estar presentes en el rango de 0,1 a 10.000 pesos por parte de peso de proteína activa.

Pueden añadirse tensioactivos o detergentes no iónicos (también conocidos como "agentes humectantes") para ayudar a solubilizar el agente terapéutico, así como para proteger la proteína terapéutica contra la agregación inducida por la agitación, lo que también permite exponer la formulación a tensiones superficiales de cizallamiento sin provocar la desnaturalización de la proteína. Los tensioactivos no iónicos adecuados incluyen polisorbatos (20, 80, etc.), polioxámeros (184, 188, etc.), polioles plurónicos, monoéteres de sorbitán polioxietilenados (TWEEN®-20, TWEEN®80, etc.). Los tensioactivos no iónicos pueden estar presentes en un rango de aproximadamente 0,05 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml, o en un rango de aproximadamente 0,07 mg/ml a aproximadamente 0,2 mg/ml.

Excipientes misceláneos adicionales incluyen agentes de carga (por ejemplo, almidón), agentes quelantes (por ejemplo, EDTA), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metionina, vitamina E), inhibidores de proteasa y co solventes.

La presente formulación también puede contener un segundo agente terapéutico además de un anticuerpo anti-TNFa del mismo. A continuación se ofrecen ejemplos de segundos agentes terapéuticos adecuados.

El programa de dosificación puede variar de una vez al mes a una vez al día en función de una serie de factores clínicos, como el tipo de enfermedad, la gravedad de la enfermedad y la sensibilidad del paciente al anticuerpo anti-TNFa. En realizaciones específicas, un anticuerpo anti-TNFa del mismo se administra diariamente, dos veces por semana, tres veces por semana, cada dos días, cada 5 días, una vez por semana, cada 10 días, cada dos semanas, cada tres semanas, cada cuatro semanas o una vez al mes, o en cualquier intervalo entre dos de los valores anteriores, por ejemplo, de cada cuatro días a cada mes, de cada 10 días a cada dos semanas, o de dos a tres veces por semana, etc.

La dosificación de un anticuerpo anti-TNFa a administrar variará según el anticuerpo concreto, el sujeto y la naturaleza y gravedad de la enfermedad, la condición física del sujeto, el régimen terapéutico (por ejemplo, si se utiliza un segundo agente terapéutico) y la vía de administración seleccionada; la dosificación adecuada puede determinarla fácilmente un experto en la materia.

Un experto en la materia reconocerá que la cantidad y el espaciado óptimos de las dosis individuales de un anticuerpo anti-TNFa vendrán determinados por la naturaleza y el alcance de la afección que se esté tratando, la forma, la vía y el lugar de administración, y la edad y el estado del sujeto concreto que se esté tratando, y que un médico determinará en última instancia las dosis adecuadas que se utilizarán. Esta dosis puede repetirse tantas veces como sea necesario. Si aparecen efectos secundarios, puede modificarse o reducirse la cantidad y/o frecuencia de la dosis, de acuerdo con la práctica clínica habitual.

Trastornos a tratar

La invención se refiere a un anticuerpo según el primer aspecto para su uso en un procedimiento de tratamiento o prevención de una afección inflamatoria, en particular, un trastorno inflamatorio del tracto gastrointestinal.

Más preferentemente, el anticuerpo de la invención se utiliza para tratar un trastorno inflamatorio del tracto gastrointestinal, en particular la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa o la colitis microscópica. La enfermedad de Crohn puede ser ileal, colónica, ileocolónica o enfermedad de Crohn superior aislada (gástrica, duodenal y/o yeyunal), incluyendo un comportamiento de enfermedad no constrictiva/no penetrante, constrictiva, penetrante y perianal, permitiendo cualquier combinación de localización y comportamiento de enfermedad de cualquiera de las mencionadas. La colitis ulcerosa puede ser proctitis ulcerosa, proctosigmoiditis, colitis del lado izquierdo, colitis panulcerosa y pouchitis.

Terapia combinada y otros aspectos

Preferiblemente, el paciente tratado con un anticuerpo anti-TNFa también es tratado con otro medicamento convencional. Por ejemplo, un paciente que padezca una enfermedad inflamatoria intestinal, especialmente si la enfermedad es de moderada a grave, suele tratarse también con mesalazina o derivados o profármacos de la misma, corticosteroides, por ejemplo budesonida o prednisolona (oral o i.v.), inmunosupresores, por ejemplo azatioprina/6-mercaptopurina (6-MP) o metotrexato, ciclosporina o tacrolimus. Otros medicamentos que pueden coadministrarse al paciente son otros anticuerpos anti-TNFa (p. ej. infliximab, adalimumab, etanercept, certolizumab pegol, golimumab), antagonistas de la integrina (p. ej. natalizumab, vedolizumab), anticuerpos anti-IL-23 (p. ej. MEDI2070), anticuerpos anti-p7 (p. ej. etrolizumab).p. ej. natalizumab, vedolizumab), anticuerpos anti-IL-23 (p. ej. MEDI2070), anticuerpos antip7 (p. ej. etrolizumab), inhibidores JAK en la vía JAK/STAT (p. ej. tofacitinib), y otros. Otros medicamentos que pueden ser coadministrados al paciente incluyen inmunosupresores (por ejemplo, azatioprina/6-MP o metotrexato o ciclosporina oral) con el fin de mantener una remisión estable y más prolongada. Otro aspecto de la invención es el uso de un anticuerpo anti-TNFa como se define anteriormente para reducir la inflamación.

Otro aspecto de la invención es un anticuerpo anti-TNFa como se define anteriormente para su uso en la reducción de la inflamación en un paciente que sufre de una enfermedad inflamatoria.

Otro aspecto de esta invención es un anticuerpo anti-TNFa como se define anteriormente para su uso en un procedimiento de tratamiento de una afección inflamatoria, que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de dicho anticuerpo anti-TNFa como se define anteriormente. La enfermedad inflamatoria es preferiblemente una de las enfermedades descritas anteriormente.

Otro aspecto de esta invención es un anticuerpo anti-TNFa como se define anteriormente para su uso en un procedimiento de prevención de una afección inflamatoria, que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de dicho anticuerpo anti-TNFa como se define anteriormente.

Se divulga además en el presente documento un procedimiento para mejorar la transcitosis de un anticuerpo dirigido contra TNFa, que comprende introducir las sustituciones Q311R, M428E y N434W en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo para obtener un anticuerpo modificado que tiene transcitosis mejorada. El anticuerpo modificado es preferiblemente un anticuerpo como el descrito anteriormente.

Se divulga además en el presente documento un procedimiento para extender la semivida plasmática de un anticuerpo dirigido contra TNFa, que comprende introducir las sustituciones Q311R, M428E y N434W en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo para obtener un anticuerpo modificado que tiene una semivida plasmática extendida. El anticuerpo modificado es preferiblemente un anticuerpo como el descrito anteriormente. La semivida plasmática puede aumentar al menos un l0%, o al menos un 20%, o al menos un 30%, o al menos un 40%, o al menos un 50%, en relación con la semivida plasmática del anticuerpo no modificado (es decir, el anticuerpo original que carece de las sustituciones Q311R, M428E y N434W).

Tabla 1. Vista general de las secuencias del listado de secuencias.

Ejemplos

Variantes de anticuerpos

Se generaron varias variantes de un anticuerpo anti-TNFa (en lo sucesivo denominado "anticuerpo padre" o "Ab-wt") introduciendo sustituciones en la región Fc de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo. La cadena ligera de Ab-wt tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:1, y la cadena pesada de Ab-wt tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:2. Las mutaciones se introdujeron mediante mutagénesis dirigida al sitio por procedimientos establecidos. Brevemente, las mutaciones se introdujeron mediante PCR. El cebador directo se diseñó para contener la mutación prevista, mientras que el cebador inverso se diseñó de modo que los extremos 5' de los dos cebadores se unieran uno detrás del otro (pero sin solaparse) (Figura 9). La PCR se ejecutó durante 25 ciclos (98°C durante 10 s, 64°C durante 30s, 72°C durante 3 min). Antes de analizar el producto de la PCR en un gel de agarosa, se eliminó la plantilla de la PCR no mutada del conjunto de productos de la PCR utilizando la enzima de restricción Dpnl. Tras la purificación en gel del producto de la PCR, se ligaron los extremos romos para obtener un plásmido circularizado que se transformó en células E. coli competentes. Tras una incubación de una noche, se recogieron varias colonias, se aisló el ADN plasmídico y se secuenció para confirmar que se había incorporado la mutación.

Las variantes no fucosiladas se generaron añadiendo 0,15 mM del sustrato señuelo 2-deoxi-2-fluoro-2-fucosa al medio de cultivo(Dekkers et al. (2016) Sci Rep 6:36964). Esto dio lugar a una incorporación significativamente reducida de fucosa en el glicano IgG-Fc, como se muestra en el Ejemplo 11 a continuación.

Tabla 2: Variantes generadas de un anticuerpo anti-TNFa (numeración UE)

Los anticuerpos Ab-REW y Ab-REW-2FF son anticuerpos de acuerdo con la presente invención.

Ejemplo 1. Afinidad al TNFa

Procedimiento:

La afinidad al TNFa fue medida por Biacore. Se preparó un chip CM5 utilizando los procedimientos estándar de inmovilización de aminas de Biacore. Tras la inserción de un chip CM5, el sistema se cebó y luego se normalizó con solución normalizadora de BIA (Biacore Preventative Maintenance Kit 2). El chip se añadió al sistema con tampón de funcionamiento PBS-T; antes de la inmovilización, la superficie del chip se cebó con tres inyecciones de NaOH 50 mM. La proteína A se inmovilizó en la superficie del chip. Para ello, la proteína se diluyó a 5 pg/mL en tampón acetato 10 mM a pH 4,5 y se inyectó de forma que se generara una respuesta ligada de -1000 UI en las 4 celdas de flujo. Para eliminar el material unido de forma no covalente de todas las celdas de flujo del chip, se realizaron tres lavados de 15 segundos con NaOH 50 mM. En el chip de proteína A, el anticuerpo se capturó en las celdas de flujo 2 y 4, y las celdas de flujo 1 y 3 se utilizaron para la sustracción de referencia. Los anticuerpos de prueba se diluyeron en PBS-T a 10 nM y se inyectaron 2,5-7,5 uL para obtener 120 RU de anticuerpo capturado. El analito TNFa se preparó a 500 pg/mL en agua según las indicaciones del proveedor y se diluyó en el tampón de funcionamiento PBS-T. Se utilizó la cinética de ciclo único para estimar la afinidad en estado estacionario. Se utilizó la cinética de ciclo único para estimar la afinidad en estado estacionario. Para cada ciclo de análisis se inyectó una valoración de 5 concentraciones de analito sobre el ligando y luego se midió la disociación del complejo. La superficie se regeneró con glicina pH 1,7. Se empleó un procedimiento de doble referencia en el que los datos de la superficie de captura unida al ligando (fc 2 y 4) se sustrajeron de las superficies de referencia en las que no se capturó ningún ligando (fc 1 y 3 respectivamente). Se realizaron inyecciones en blanco de tampón cada 3-4 ciclos y luego se restaron de los ciclos de inyección de analito, para corregir pequeños cambios en la superficie de captura del ligando. Se repitieron las inyecciones de analito al principio y al final de cada serie analítica para comprobar la degradación de la muestra o los cambios en el rendimiento del instrumento. Todos los análisis se realizaron a 25°C y el portamuestras se incubó a 10°C durante las series experimentales. Cada experimento se realizó al menos tres veces. Se utilizó un modelo de unión 1 a 1 para ajustar los datos cinéticos resultantes.

Resultados:

Todos los anticuerpos mostraron una cinética de unión similar al TNFa, lo que indica que ninguna modificación introducida había provocado cambios significativos en la región de unión al antígeno. Para el anticuerpo Ab-REW-2FF no se pudo medir la velocidad de disociación, por lo que no se pudo determinar la afinidad (K<d>). Sin embargo, la tasa de asociación fue comparable a la de los demás anticuerpos, lo que indica que la introducción de la mutación no afecta significativamente a la unión.

Tabla 3: Cinética de unión de variantes de IgG1 humana al TNFa determinada por SPR

ka(10<6>/Ms) kd(10<-5>/s) K<d>(pM)

Ab-wt 8,37 ± 0,11 3,45 ± 0,20 4,13 ± 0,19

Ab-REW 6,22 ± 0,91 2,04 ± 0,52 3,30 ± 0,74

Ab-REW-2FF 5,80 ± 0,58 nd* nd*

*No se pudo determinar la velocidad de disociación (kd).

Ejemplo 2. Potencia

Procedimiento:

Se incubaron células L929 con 0,25 ng/mL de TNFa y 1 pg/pocillo de actinomicina D en presencia de diluciones seriadas de variantes de anticuerpos anti-TNFa. Tras la incubación durante 20 h a 37°C/5% de CO<2>, se midieron las respuestas proliferativas utilizando MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il )-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio y un reactivo de acoplamiento de electrones (etosulfato de fenazina, PES). Las enzimas deshidrogenasas presentes en las células metabólicamente activas convirtieron el MTS en formazán. La cantidad de producto formazán medida por absorbancia a 492 nm fue directamente proporcional al número de células vivas en cultivo.

Resultados:

Los resultados se muestran en la Figura 1. La introducción de mutaciones en la región Fc del anticuerpo anti-TNFa no afectó a la potencia.

Ejemplo 3. Afinidad con los receptores Fcy (CD64, CD32a, CD32b, CD16a, CD16b)

Procedimiento:

La afinidad a los F<cy>R<s>fue medida por Biacore. Se preparó un chip CM5 utilizando los procedimientos estándar de inmovilización de aminas de Biacore. Tras la inserción de un chip CM5, el sistema se cebó y luego se normalizó con solución normalizadora BIA (Biacore Preventative Maintenance Kit 2). El chip se añadió al sistema con tampón de funcionamiento Phosphate Buffered Saline Tween-20 (PBS-T); antes de la inmovilización, la superficie del chip se cebó con tres inyecciones de NaOH 50 mM. Los F<cy>R se inmovilizaron en la superficie del chip mediante un sistema de captura His-tag. El chip anti-His tag se preparó siguiendo las instrucciones del kit Biacore, con -12000 RU del anticuerpo depositadas en las 4 celdas de flujo. Para eliminar el material no unido covalentemente de todas las celdas de flujo del chip, se realizaron tres lavados de 30 segundos con glicina 10 mM pH 1,5. Los receptores Fcy se diluyeron en PBS-T a un rango de 0,5-2 pg/mL, con 2,5-5,0 pL inyectados en el chip generando niveles de captura entre 60 y 200 RU. Los anticuerpos se diluyeron en PBS-T antes del análisis. Se utilizó la cinética de ciclo único para estimar la afinidad en estado estacionario. Para cada ciclo de análisis se inyectó una titulación de 5 concentraciones de anticuerpo sobre el ligando FcyR y luego se midió la disociación del complejo. La superficie se regeneró utilizando la solución recomendada, 10 mM de glicina pH 1,5 para la superficie de captura anti-His. Se empleó un procedimiento de doble referencia en el que los datos de la superficie de captura unida al ligando (fc 2 y 4) se sustrajeron de las superficies de referencia en las que no se capturó ningún ligando (fc 1 y 3 respectivamente). Se realizaron inyecciones en blanco de tampón para cada ciclo de valoración de anticuerpos y luego se restaron de los ciclos de inyección de analito, para corregir pequeños cambios en la superficie de captura del ligando. Todos los análisis se realizaron a 25°C y el portamuestras se incubó a 10°C durante las series experimentales. Cada experimento se realizó al menos tres veces.

Resultados:

La unión a CD64 no se vio afectada por los anticuerpos anti-TNFa diseñados. La introducción de las mutaciones no afectó a la afinidad con CD32a(H), CD32a(R) y CD32b. Sin embargo, el Ab-REW-2FF mostró una afinidad 5,5 veces mayor por CD16a(V). El anticuerpo no fucosilado Ab-REW-2FF también presentó una unión mejorada al receptor CD16a de baja afinidad y al CD16b.

Tabla 4: Afinidad a los receptores Fcy CD64, CD32a(H), CD32a(R) y CD32b determinada por SPR. Se muestra la afinidad media y la desviación estándar calculada a partir de dos o más experimentos independientes.

Afinidad (Kd)

CD64(nM)CD32a(H)(pM)CD32a(R)(pM)CD32b(pM)

Ab-wt 2,92 ± 0,07 0,67 ± 0,04 nd 3,14 ± 0,80

Ab-REW 2,80 ± 0,24 0,78 ± 0,05 1,60 ± 0,01 1,21 ± 0,32

Ab-REW-2FF 2,93 ± 0,16 1,87 ± 0,37 1,45 ± 0,01 1,13 ± 0,25

Tabla 5: Afinidad a los receptores F<cy>CD16a(V), CD16a(F) y CD16b determinada por SPR. Se muestra la afinidad media y la desviación estándar calculada a partir de dos o más experimentos independientes.

Afinidad (Kd)

CD16a(V)(nM)CD16a(F)(pM)CD16b(NA2)(pM)

Ab-wt 184 ± 31,9 nd >; 3,00

Ab-REW 280 ± 36,1 2,41 ± 0,68 1,65 ± 0,36

Ab-REW-2FF 33,5 ± 0,99 0,15 ± 0,01 0,40 ± 0,07

Ejemplo 4. Afinidad al FcRn

Procedimiento:

La SPR se realizó utilizando un instrumento Biacore 3000 con chips sensores CM5 acoplados con anticuerpos anti-TNFa IgG1 (-500 unidades de resonancia (RU)) utilizando química de acoplamiento de amina según lo descrito por el fabricante. El acoplamiento se realizó inyectando 2,0 ug/mL de cada proteína en acetato sódico 10 mM, pH 4,5, utilizando el kit de acoplamiento con aminas (GE Healthcare). Como tampón de corrimiento y dilución se utilizó el tampón HBS-P pH 7,4 (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,005% tensioactivo P20) o el tampón fosfato pH 6,0 (67 nM tampón fosfato, 150 mM NaCl, 0,005% Tween 20). La cinética de unión se determinó inyectando cantidades tituladas (1000 - 31,2 nM) de FcRn humano monomérico marcado con His (hFcRn) sobre anticuerpos inmovilizados a pH 7,4 o pH 6,0. Todos los experimentos SPR se realizaron a 25°C con un flujo de 40 ul/min. Los datos de unión se ajustaron a cero y se restó el valor de la célula de referencia. Para determinar la cinética de unión se utilizó el modelo de unión de ligandos 1:1 de Langmuir proporcionado por el software BIAevaluation (versión 4.1).

Resultados:

Los resultados mostraron que el anticuerpo de tipo salvaje Ab-wt se unía de forma estrictamente dependiente del pH al hFcRn. Todas las variantes de anticuerpos modificados tenían una mayor afinidad por el FcRn a pH 6,0, pero mantenían su dependencia del pH y no se unían al receptor a pH 7,4. Sorprendentemente, las variantes que contenían REW mostraron una unión > 160 veces más fuerte a pH ácido y ninguna unión detectable en condiciones de pH neutro. Las variantes del anticuerpo mostraron una mejor unión al FcRn en comparación con el infliximab, que contiene una región Fc IgG1 de tipo salvaje.

Tabla 6: Afinidad de variantes de anticuerpos anti-TNFa al FcRn a pH 6,0 y pH 7,4 determinada por SPR

pH 6,0 pH 7,4

Kd (nM) Cambio de pliegues respecto a wt Cambio de pliegues desde IFX Kd (nM)

Ab-wt 1000 NA

Ab-REW 5,61 178 75,8 NA

Ab-REW-2FF 6,24 160 68,1 NA

IFX 425 NA

NA: no se adquiere debido a un enlace débil.

Ejemplo 5. Transcitosis

Procedimiento:

Los filtros Transwell (1,12 cm2) con membranas de politetrafluoroetileno (PTFE) recubiertas de colágeno con un tamaño de poro de 0,4 pm se incubaron O/N en medio de crecimiento completo seguido de la siembra de 1,0 x106 células T84 por pocillo. Se controló diariamente la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) utilizando un voltímetro-ohmímetro MILLICELL-ERS-2. Los cultivos crecieron durante 4 - 5 días antes de alcanzar la confluencia con un valor TEER de -1000 - 1300 O xcm2. Antes de los experimentos, las monocapas se dejaron en ayunas durante 1 hora en solución salina equilibrada de Hank (HBSS). A continuación, se añadieron 400 nM de las variantes de anticuerpos o IFX solos o junto con 4000 nM de IgG de mieloma humano con especificidad irrelevante a la cámara Transwell apical. Se recogieron muestras del depósito basolateral a las 0 y 4 h post adición. Las concentraciones de anticuerpos en el reservorio basolateral se determinaron mediante ELISA. Brevemente, se recubrieron placas Maxisorp de 96 pocillos O/N con TNFa recombinante o con un anticuerpo específico anti Fc humano de cabra, ambos diluidos a 1 pg/ml en PBS. Posteriormente, las placas se bloquearon con PBS que contenía un 4% de leche desnatada durante 2 h a temperatura ambiente, y se lavaron 4 veces con PBS que contenía un 0,05% de Tween 20. Las muestras recogidas durante los experimentos de transcitosis se añadieron a los pocillos y se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente antes de lavar como se ha indicado anteriormente. Las variantes de anticuerpos capturadas, IFX o IgG total se detectaron utilizando un anticuerpo específico anti Fc humano de cabra conjugado con fosfatasa alcalina (ALP). La unión se visualizó añadiendo 100 pl de sustrato ALP y se registró el espectro de absorción a 405 nm. La cantidad de variantes de anticuerpos, IFX e IgG total transportada se calculó a partir de curvas estándar de cada una de las variantes de anticuerpos individuales.

Transcitosis de variantes de anticuerpos a través de células epiteliales humanas polarizadas

Resultados:

Las variantes de anticuerpo anti-TNFa de ingeniería se probaron para transcitosis a través de una monocapa celular y se compararon con el anticuerpo wt o IFX como otro anticuerpo anti-TNFa IgG1 humano. Los resultados se muestran en la figura 2. El anticuerpo anti-TNFa wt fue transportado desde el reservorio apical al basolateral. En comparación con IFX, otro anticuerpo IgG1 con una región Fc wt, se transportó 2,8 veces más Ab-REW, lo que también ocurrió con Ab-REW-2FF.

Transcitosis de variantes de anticuerpos a través de células epiteliales humanas polarizadas en presencia de IgG competidoras

Resultados:

La cantidad total de inmunoglobulina transportada a través de una monocapa celular T84 polarizada desde el reservorio apical al basolateral cuando las variantes de anticuerpos anti-TNFa se incubaron con un exceso 10 veces mayor de IgG de mieloma humano a las 4 horas post adición fue comparable para todos los anticuerpos. Sin embargo, una mayor afinidad al FcRn a pH 6,0 dio lugar a un porcentaje significativamente mayor de transporte específico antiTNFa a través de la monocapa celular también en presencia de un exceso de IgG humana competidora con especificidad irrelevante. Los resultados se muestran en la figura 3.

Ejemplo 6. ADCC

Procedimiento:

Se utilizó un kit básico de bioensayo reportero ADCC de Promega. Brevemente, se sembraron células diana mTNFa CHO-K1 a 1 *105/mL en placas de cultivo tisular blancas (fondo transparente), 100 pL por pocillo. Las placas se incubaron O/N a 37°C/5% de CO<2>. El día 2, se retiraron 95 pl del medio de ensayo y se sustituyeron por 25 pl de células efectoras Jurkat modificadas a 3 *106/mL. A continuación, las placas se incubaron durante 6 h a 37 °C/5% de CO<2>. El reactivo BioGlo™ se preparó hacia el final de la incubación. Las placas se equilibraron a RT durante 10 - 20 min antes de añadir 75 pl de reactivo BioGlo™ por pocillo. Tras 5 - 10 min de incubación en la oscuridad, se midió la luminiscencia. Se utilizó un modelo 4-PL para ajustar los datos.

Resultados:

Los resultados (ver Figura 4) mostraron que todos los anticuerpos anti-TNFa indujeron ADCC pero con distintas intensidades. En comparación con el anticuerpo de tipo salvaje Ab-wt, las variantes del anticuerpo mostraron una mayor ADCC. En concreto, la variante no fucosilada del anticuerpo Ab-REW-2FF mejoró significativamente la ADCC.

Ejemplo 7. Unión a C1q

Procedimiento:

La prueba ELISA se realizó utilizando placas MaxiSorp de 96 pocillos en las que los pocillos se recubrieron con TNFa humano diluido a 1 pg/mL en PBS. Tras la incubación O/N a 4°C, las placas se bloquearon con PBS que contenía un 4% de leche desnatada durante 1 h y se lavaron cuatro veces con PBS que contenía un 0,05% de Tween-20 (PBS-T). A continuación, se diluyeron cantidades tituladas de los anticuerpos IgG anti-TNFa en PBS-T, se añadieron y se incubaron durante 1h a RT. Tras el lavado con PBS-T, se diluyó C1q humano (0,5 pg/mL) en tampón Veronal 0,1 M (0,25 mM CaCl<2>y 0,8 mM MgCh pH 7,2), se añadió a los pocillos y se incubó durante 1 h. Posteriormente, se lavaron los pocillos como se ha indicado anteriormente antes de añadir a los pocillos un anti-C1q humano de conejo diluido 1:5000 en PBS-T y se incubó durante 1 h. Posteriormente, se lavaron los pocillos como se ha indicado antes de añadir a los pocillos anti-C1q humano de conejo diluido 1:5000 en PBS-T y se incubó durante 1 h. Tras el lavado, se añadió un IgG anti-conejo de burro conjugado con HRP diluido 1:5000 en PBS-T. Posteriormente, se lavaron los pocillos y se añadieron 100 pl de sustrato 3,3',5,5'-Tetrametilbencidina a cada pocillo. La absorbancia se midió a 620 nm con un espectrofotómetro Sunrise.

Resultados:

Las variantes de anticuerpos anti-TNFa se capturaron sobre TNFa humano antes de añadir C1q humano. Los resultados (véase la Figura 5) mostraron que los anticuerpos se unían a C1q pero con distinta fuerza de unión. En concreto, Ab-REW y Ab-REW-2FF se unen algo más fuerte que IFX. La presencia de fucosa en el N-glucano biantenario unido a<n>297 no influyó en la unión, o lo hizo en menor medida. La jerarquía de unión de más fuerte a más débil fue la siguiente: Ab-REW > Ab-REW-2FF > IFX.

Ejemplo 8. CDC

Procedimiento:

El ensayo CDC anti-TNFa midió la citotoxicidad dependiente de anticuerpos del complemento de conejo. Las células diana que expresaban mTNFa se sembraron en microplacas en presencia de anticuerpos anti-TNFa que promovían el potencial citotóxico del complemento. Se prepararon seis réplicas independientes de muestras (variantes de anticuerpos anti-TNFa) y 4 réplicas de estándar de referencia (IFX) a 60 pg/mL, se diluyeron en serie (pasos de dilución de 1,3 veces) y las placas de dilución se sellaron hasta su uso. Las células diana que contenían un reportero de viabilidad LUC se prepararon a 1,5 *105/m Ly se almacenaron en un baño de agua a 37°C. El complemento de conejo se diluyó hasta multiplicar por 3 la concentración final del ensayo en DMEM con alto contenido en glucosa. Inmediatamente después de la preparación, se combinó el complemento con las células diana en una proporción 1:1 (v/v). Se transfirieron 40 pl de la preparación de células complemento/destino a cada pocillo de la placa de ensayo. Los anticuerpos preparados en la placa de dilución se transfirieron a las células (20 pl/pocillo) y, a continuación, la placa se incubó a 36 °C/1% de CO<2>durante 3,5 h. Las placas de ensayo se equilibraron a RT en la oscuridad durante 35 min. Se añadió Steady Glo, que se equilibró a temperatura ambiente durante 120 minutos antes de su uso, a la placa de ensayo (20 pl/pocillo) y se almacenó a temperatura ambiente en la oscuridad durante 35 minutos antes de medir la luminiscencia. A continuación, se calculó el porcentaje de muerte celular para cada concentración de cada muestra y se utilizó un modelo 4-PL para ajustar los datos.

Resultados:

Los resultados se muestran en la Figura 6 y en la Tabla 7. Los resultados relativos deEC<50>y % de muerte máxima relativa para el rendimiento de la muestra de ensayo en el ensayo CDC proporcionaron una clasificación de actividad clara que fue coherente en ambas medidas de actividad. El Ab-REW mostró una mayor actividad CDC que el IFX, independientemente del contenido en fucosa. En una comparación directa entre muestras de variantes de fucosa, para comprender mejor el impacto del contenido de fucosa en la actividad CDC, Ab-REW-2FF en comparación con Ab-REW, proporcionó respuestas de actividad CDC similares. La comparación mostró una respuesta relativa de EC<50>del 97,1% y una respuesta relativa del % máximo de muerte del 100,4%.

Tabla 7: Actividad CDC de las variantes de anticuerpos anti-TNFa en términos de rendimiento relativo EC<50>y % relativo de muerte en comparación con IFX

Muestra ID EC50 relativa (%) Muerte máxima relativa (%)

IFX 100 100

Ab-REW 123,7 113,8

Ab-REW-2FF 120,1 114,2

Ejemplo 9. Inducción de macrófagos reguladores

Procedimiento:

Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a partir de buffy coats sanos. Las células se aislaron mediante centrifugación en gradiente de Ficoll. Se mezclaron células de dos donantes individuales en igual número y se sembraron 2 *105 células de la mezcla en placas de 96 pocillos en un volumen total de 100 pl/pocillo. Las células se incubaron durante 48 h a 37 °C/5% de CO<2>. Tras 48 h, se añadieron variantes de anticuerpos anti-TNFa o IFX hasta alcanzar una concentración final de 10 pg/mL. Cada compuesto se añadió en réplicas de cinco o seis. El volumen final fue de 150 pl/pocillo. Como control se utilizó suero humano IgG1 (Sigma #15154). Tras la adición de los compuestos, se cultivaron reacciones linfocitarias mixtas (MLR) durante otros 4 días a 37°C/5% de CO<2>. Después, las placas se lavaron con PBS/5 mM EDTA (PBS/EDTA) y se incubaron con 50 pl/pocillo de PBS/EDTA durante 20 min a RT Se centrifugaron las placas y se eliminó el líquido. El anticuerpo se diluyó en PBS/EDTA (anti-CD14-PE, anti-CD206-APC, ambos diluidos 1:10). Las células se resuspendieron en 50 pl de solución de anticuerpos y se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después, las células se lavaron con PBS/EDTA y se resuspendieron en 50 pl de PBS/EDTA. Las muestras teñidas se analizaron en un FACS Fortessa utilizando el software FACSDiva. El análisis se realizó con el programa informático FlowJo.

Resultados:

La inducción de macrófagos reguladores se analizó en cuatro MLR independientes y tuvo éxito en todos los experimentos (comparando IFX con el control IgG). Los resultados se muestran en la figura 7. Los niveles de inducción por IFX pueden diferir entre experimentos debido a que cada experimento se realizó utilizando diferentes donantes con variación interindividual. Todas las variantes de anticuerpos anti-TNFa ensayadas indujeron macrófagos reguladores CD14+CD206+con ligeras variaciones entre los compuestos. Ab-REW y Ab-REW-2FF indujeron ligeramente más macrófagos reguladores que IFX, sin embargo, sólo en el caso de Ab-REW-2FF el aumento fue significativo.

Ejemplo 10. Inhibición de la proliferación de células T

Procedimiento:

Se aislaron PBMC de buffy coats sanos. Las células se aislaron mediante centrifugación en gradiente de Ficoll. Se mezclaron células de dos donantes individuales en igual número y se sembraron 2 *105 células de la mezcla en placas de 96 pocillos en un volumen total de 100 pl/pocillo. Las células se incubaron durante 48 h a 37 °C/5% de CO<2>. Tras 48 h, se añadieron variantes de anticuerpos anti-TNFa o IFX hasta alcanzar una concentración final de 10 pg/mL. Cada compuesto se añadió en réplicas de cinco o seis. El volumen final fue de 150 pl/pocillo. Como control se utilizó suero humano IgG1 (Sigma #15154). Tras la adición de los compuestos, se cultivaron reacciones linfocitarias mixtas (MLR) durante otros 2 días a 37°C/5% de CO<2>. A continuación, se añadió timidina tritiada (3H timidina, 0,5 microCurie/pocillo) a los cultivos. Los cultivos se incubaron durante 18 h a 37 °C/5% de CO<2>. Las muestras se recogieron con un recolector de células Microbeta Filtermat 96 y se analizaron con un Microbeta MicroplateCounter equipado con un detector único. Las muestras se contaron durante 10 segundos/pocillo y se convirtieron en recuentos por minuto (cpm).

Resultados:

La inhibición de la proliferación de células T se midió en tres MLR independientes y se definió como exitosa si IFX como control positivo inducía la supresión. Los niveles de supresión por IFX en experimentos individuales pueden diferir presumiblemente debido a la variación en la inducción de macrófagos reguladores. En cada experimento, se calculó el potencial de las variantes de anticuerpos anti-TNFa para suprimir la proliferación de células T en relación con el control positivo IFX. El anticuerpo Ab-REW-2FF mostró una supresión significativamente mayor en comparación con IFX, mientras que la supresión por Ab-REW fue comparable a la de IFX (véase la Figura 8).

Ejemplo 11. Análisis de N-glicanos

Procedimiento:

Se centrifugaron 50 j l de cada variante de IgG (1 mg/ml) durante 10 min a 13.000*g antes de añadir 1 |jg de tripsina disuelta en 100 j l de bicarbonato de amonio 50 mM (pH 7,8) y se incubaron durante toda la noche a 37°C. El flujo se transfirió a un tubo Eppendorf y se secó en un SpeedVac (Heto Maxi dry). Los dispositivos centrífugos se centrifugaron a 13.000*g durante 10 minutos, y el flujo se transfirió a un tubo Eppendorf y se secó en un SpeedVac (Heto Maxi dry). Las muestras desecadas se disolvieron en 20 j l de ácido fórmico al 1%, se sonicaron durante 30 s y se centrifugaron durante 10 min a 16.100*g. Posteriormente, cada muestra se transfirió a nuevos viales y se realizó un análisis de cromatografía líquida en fase inversa (C18) nano en línea-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) de los péptidos proteolíticos utilizando un sistema UHPLC Dionex Ultimate 3000 (Thermo Fisher Scientific, EE.UU.). se inyectaron 5 j l de solución peptídica en la columna de extracción y los péptidos se eluyeron en el modo back-flush de la columna de extracción a la columna analítica. La fase móvil consiste en acetonitrilo y agua de grado espectrometría de masas, ambos con 0,1 % de ácido fórmico. La separación cromatográfica se consiguió utilizando un gradiente binario del 3 al 50 % de acetonitrilo en agua durante 60 minutos con un caudal de 0,3 jl/min. El sistema LC se acopló mediante una fuente de iones nanoelectropulverización a un espectrómetro de masas orbitrap cuadrupolar híbrido Q exactive (Thermo Fisher Scientific, EE.UU.). Las muestras de péptidos se analizaron con un procedimiento de fragmentación por disociación colisional de alta energía (HCD) con energía de colisión normalizada a 20, adquiriendo un barrido de sondeo Orbitrap en el rango de masas de m/z 300-2000 seguido de MS/MS de los diez iones más intensos en el Orbitrap.

El análisis de datos se realizó en Xcalibur v2.0. Los espectros MS/MS de todos los N-glicopéptidos se extrajeron mediante la búsqueda de iones oxonio; 204,086 (N-acetilhexosamina) y 366,1388 (N-acetilhexosamina-hexosa). Utilizando la fragmentación HCD con energía de colisión normalizada a 20 se detectó la estructura del glicano y la masa del péptido para la IgG. Los cromatogramas de iones extraídos para los glicopéptidos diana (EEQYNSTYR para IgG1) se extrajeron con una precisión de 10 ppm y los espectros MS/MS correspondientes se verificaron manualmente. Se utilizó la fragmentación HCD con energía de colisión normalizada a 35 para detectar la secuencia peptídica y verificar que la masa peptídica correspondía a la secuencia peptídica correcta. Se calculó el área bajo la curva de todos los glicopéptidos extraídos y se determinó la proporción porcentual de cada glicoforma.

Resultados:

Para el Ab-REW, dos formas de N-glicanos dominaron y correspondieron a >; 90% del conjunto total de N-glicanos, a saber 4GIcNac-1 Fuc-3Man y 4GIcNac-1 Fuc-3Man-1Gal. Las dos formas de N-glicano dominantes contenían una fucosa en el núcleo. Para producir la versión "no fucosilada" de Ab-REW (Ab-REW-2FF), se utilizó el sustrato señuelo 2-deoxi-2-fluoro-1-fucosa (2FF). El mapeo por EM de este anticuerpo reveló que esta estrategia consiguió reducir considerablemente la incorporación de fucosa, ya que se detectó un descenso de > 90% a 13%. Las formas de N-glicano dominantes tras el tratamiento eran las mismas que las variantes producidas en ausencia de 2FF, salvo que estas estructuras carecían de fucosa (véase también la Figura 10).

Tabla 8: Porcentaje de formas de N-glicano unidas a N297 de anticuerpos IgG anti-TNFa

Estructura delN-glicanoAb-REW (%) Ab-REW-2FF (%)

4GlcNac-1Fuc-3Man 69,1 8,5

4GlcNac-1Fuc-3Man-1Gal 21,7 4,5

4GlcNac-3Hombre 0,7 64,3

4GlcNac-3Man-1Gal 0 17,3

Otros patrones de glicosilación 8,5 5,4

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo IgGi que comprende un dominio de unión al TNFa y un sitio de unión al FcRn, que tiene una alta afinidad por el FcRn humano a pH 6, estando dicha alta afinidadcaracterizada poruna constante de equilibrio de disociación (K<d>) determinada por resonancia de plasmón de superficie inferior a 100 nM, y que además no tiene afinidad o tiene una afinidad baja por el FcRn humano a pH 7,4, estando dicha baja afinidadcaracterizada poruna K<d>determinada por resonancia de plasmón superficial, de más de 10 j M, en el que la secuencia de aminoácidos del anticuerpo comprende los aminoácidos 311R, 428E y 434W según se define en la numeración UE, y en el que el anticuerpo comprende (i) un dominio V<l>que comprende una región CDR1 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:3, una región CDR2 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:4, y una región CDR3 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:5, y (ii) un dominio V<h>que comprende una región CDR1 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:6, una región CDR2 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:7, y una región CDR3 con la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:8.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, que es un anticuerpo no fucosilado o un anticuerpo con fucosilación reducida.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1 o 2, que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO:13.

4. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende un dominio V<h>que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:9 y un dominio V<l>que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:10.

5. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:1 y una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:11.

6. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes para su uso en el tratamiento de una afección inflamatoria.

7. El anticuerpo para su uso según la reivindicación 6, en el que la afección inflamatoria es un trastorno inflamatorio del tracto gastrointestinal.

8. El anticuerpo para su uso según la reivindicación 6 o 7, en el que dicho tratamiento comprende administrar por vía oral una cantidad eficaz de dicho anticuerpo.

9. El anticuerpo para su uso según la reivindicación 6 o 7, en el que dicho anticuerpo se aplica tópicamente.

10. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 5.