ES2972498T3

ES2972498T3 - Composición y método para la prevención y tratamiento de la diabetes tipo 2

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Publication number: ES2972498T3
Application number: ES19842687T
Authority: ES
Inventors: Peter Novak; Maxim Temnikov; Oleksandr Balakin
Original assignee: Vector Vitale IP LLC
Current assignee: Vector Vitale IP LLC
Priority date: 2019-12-20
Filing date: 2019-12-20
Publication date: 2024-06-13
Anticipated expiration: 2039-12-20
Also published as: JP7455978B2; AU2019479120B2; JP2023507623A; EP4076431A1; WO2021126228A1; EP4076431B1; CA3162362A1; AU2019479120A1

Abstract

Un método para prevenir o tratar la diabetes tipo 2 que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de zinc enriquecido con 64Zn. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composición y método para la prevención y tratamiento de la diabetes tipo 2

CAMPO TÉCNICO

[0001]Esta divulgación se refiere a la prevención y terapia de la diabetes tipo 2.

ANTECEDENTES

[0002]La diabetes tipo 2 (o diabetes que aparece en la edad adulta o no insulinodependiente) es una afección crónica y progresiva que afecta la capacidad de una persona para controlar la cantidad de azúcar (glucosa) en la sangre. En las personas con diabetes tipo 2, se produce muy poca insulina para mantener los niveles de glucosa normales o el cuerpo no responde a la insulina.

RESUMEN

[0003]En un aspecto, esta divulgación proporciona una composición que comprende zinc enriquecido con<64>Zn (el término "<64>Zn<e>" se usa en el presente documento para referirse al zinc enriquecido con<64>Zn); la composición se proporciona en una dosis profiláctica o terapéuticamente eficaz para prevenir o tratar la diabetes tipo 2. En otro aspecto, se proporciona un método de uso de dicha composición. En algunas formas de realización, el zinc enriquecido con<64>Zn<e>stá en forma de un compuesto de<64>Zn<e>o una sal de<64>Zn<e>.

[0004]Las composiciones descritas contienen zinc enriquecido con<64>Zn. En ciertas formas de realización, las composiciones de la invención contienen zinc que es al menos 80 %<64>Zn<e>, al menos 90 %<64>Zn<e>, al menos 95 %<64>Zn<e>o al menos 99 %<64>Zn<e>, por ejemplo, zinc que es 80 %<64>Zn<e>, 85 %<64>Zn<e>, 90 %<64>Zn<e>, 95 %<64>Zn<e>, 99 %<64>Zn<e>o 99,9 %<64>Zn<e>.

[0005]Las composiciones descritas pueden administrarse a un sujeto para prevenir o tratar la diabetes tipo 2.

[0006]Se proporcionan muchos otros aspectos de acuerdo con estos y otros aspectos de la invención. Otras características y aspectos de la presente invención resultarán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y de las reivindicaciones adjuntas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0007]

FIG. 1muestra la dinámica del aumento de peso corporal para animales en grupos experimentales (M ± n, n=10).

FIG. 2muestra el contenido calórico de los alimentos consumidos por los animales de los grupos experimentales (M ± n, n = 10).

Nota: 1- Control; 2- Control+<64>Zn<e>isótopo estable en forma de aspartato; 3 - obesidad inducida por la dieta isótopo estable<64>Zn<e>en forma de aspartato; 4 - Obesidad Inducida por la dieta.

FIG. 3muestra los niveles de insulina en la sangre de animales de experimentación (M ± n, n=10).

FIG. 4muestra el área de los islotes pancreáticos de animales de experimentación (M ± n, n=10).

FIG. 5muestra la dinámica del aumento del peso corporal de los animales en grupos experimentales (M ± n, n=10). Nota: C - control; C+zinc: control en el contexto de la administración del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato; DIO -obesidad inducida por dieta; DIO+zinc: obesidad inducida por la dieta en el contexto de la administración del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato.

FIG. 6muestra el contenido calórico de los alimentos consumidos por animales de grupos experimentales (M ± n, n=10). Nota: 1- Control; 2- Control+Isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato; 3 - Obesidad+isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato; 4 - Obesidad.

FIG. 7A-FIG. 7Fmuestra micrografías de secciones de páncreas en animales de los grupos control (FIG. 7A-FIG. 7C)y obesidad (FIG. 7D-FIG. 7F), hematoxilina y eosina, las flechas muestran células exocrinas con marcada degeneración grasa, ojo. obj. 10x. 10, ojo. obj. 10x. 40.

FIG. 8A - FIG. 8Fmuestra micrografías de secciones de páncreas en animales del grupo de control (FIG. 8A-FIG. 8C)tratados con isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato y animales del grupo de obesidad (FIG. 8D-FIG. 8F)tratados con Zn-64 isótopo estable en forma de aspartato, hematoxilina y eosina, ojo. obj. 10x. 10, ojo. obj. 10x. 40.

FIG. 9muestra la superficie en sección transversal de los islotes de Langerhans.

* - la diferencia entre el grupo control y experimental es significativa cuando p < 0,05; # - la diferencia entre el grupo de obesidad y el grupo de obesidad tratado con isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato es significativa cuando p < 0,05.

FIG. 10A-FIG. 10Dmuestra micrografías de secciones de hígado en animales de los grupos control (FIG. 10AyFIG. 10B)y obesidad (FIG. 10CyFIG. 10D), hematoxilina y eosina, ojo. obj. 10x. 10, ojo. obj. 10x. 40.

FIG. 11A-FIG. 11Dmuestra micrografías de secciones de hígado en animales de los grupos control (FIG. 11AyFIG. 11B)y obesidad (FIG. 11CyFIG. 11D), todos los animales tratados con isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato, hematoxilina y eosina., ojo. obj. 10x. 10, ojo. obj. 10x. 40.

FIG. 12A(área del núcleo de hepatocitos),FIG. 12b(área de hepatocitos), y laFIG. 12C(relación núcleocitoplasma de hepatocitos) muestran análisis morfológico del hígado.

FIG. 13A-FIG. 13Dmuestra micrografías de secciones de hígado en animales de los grupos control(FIG. 13AyFIG. 13B)y obesidad (FIG. 13CyFIG. 13D), método de tinción de Van Gieson para la detección de fibras de colágeno (fibrosis) del ojo. obj. 10x. 10, ojo. obj. 10x. 40.

FIG. 14A-FIG. 14Dmuestra micrografías de secciones de hígado en animales de los grupos control(FIG. 14AyFIG. 14B)y obesidad (FIG. 14CyFIG. 14D), todos los animales tratados con isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato, método de tinción de Van Gieson para la detección de fibras de colágeno (fibrosis), ojo. obj. 10x. 10, ojo. obj. 10x. 40.

FIG. 15muestra el análisis morfométrico de la fibrosis hepática. * - la diferencia entre el grupo control y experimental es significativa cuando p < 0,05; # - la diferencia entre el grupo de obesidad y el grupo de obesidad tratado con isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato es significativa cuando p < 0,05.

FIG. 16A-FIG. 16Emuestra el análisis del peso corporal, el consumo de alimentos y agua por grupos experimentales de animales.FIG. 16ATasas de consumo de alimentos en gramos por animal;FIG. 16BTasas de consumo de agua en ml por 1 animal;FIG. 16CConsumo medio diario de alimentos (durante el experimento) por 1 animal;FIG. 16DConsumo medio diario de agua (durante el experimento) por 1 animal;FIG. 16EAumento de peso en ratas 2 semanas después de la administración del fármaco.

FIG. 17es un gráfico que muestra el nivel de insulina en suero (CU/mg de proteína total).

FIG. 18A(suero) yFIG. 18B(hígado) son gráficos que muestran la actividad de superóxido dismutasa (enzima antioxidante dependiente de Zn) CU/mg*min.

FIG. 19es un gráfico que muestra la medición del área de los islotes de Langerhans en el páncreas de animales de laboratorio (microscópicamente, el día 7 después de la última administración de fármacos).

FIG. 20A-FIG. 20Fson fotografías microscópicas de los islotes de Langerhans.FIG. 20AyFIG. 20B- panel superior;FIG. 20CyFIG. 20D- panel central;FIG. 20EyFIG. 20F- panel inferior.

FIG. 21A-FIG. 21Cmuestra acumulación de metales en tejidos hepáticos de animales de laboratorio.

FIG. 22A-FIG. 22Cmuestra acumulación de metales en tejidos renales de animales de laboratorio.

FIG. 23A-FIG. 23Fson fotografías microscópicas de los islotes de Langerhans, Figs. 23A y 23B - grupo de control, aumento x10 y x40, respectivamente, Figs. 23C y 23D - acetato de zinc, grupo de comparación, aumento x10 y x40, respectivamente, Figs. 23E y 23F - zinc isótopo, grupo terapéutico, aumento x10 y x40, respectivamente.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0008]Como se usa en el presente documento, la palabra "un" o "pluralidad" antes de un sustantivo representa uno o más del sustantivo particular.

[0009]Para los términos "por ejemplo" y "tales como", y sus equivalencias gramaticales, se entiende que sigue la frase "y sin limitación", a menos que se indique explícitamente lo contrario. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "aproximadamente" pretende dar cuenta de las variaciones debidas al error experimental. Se entiende que todas las mediciones aquí informadas están modificadas por el término "acerca de", ya sea que el término se use explícitamente o no, a menos que se indique explícitamente lo contrario. Tal como se utilizan en este documento, las formas singulares “un”, “una”, “el” y “ella” incluyen referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

[0010]"Cantidad eficaz", "cantidad profilácticamente eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un agente o composición que proporciona un efecto beneficioso o resultado favorable a un sujeto, o alternativamente, una cantidad de un agente o composición que presenta la actividadin vivooin vitrodeseada. "Cantidad eficaz", "cantidad profilácticamente eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un agente o composición que proporciona el resultado biológico, terapéutico y/o profiláctico deseado. Ese resultado puede ser una reducción, mejora, paliación, disminución, retraso y/o alivio de uno o más de los signos, síntomas o causas de una enfermedad, trastorno o afección en un paciente/sujeto, o cualquier otra alteración deseada de un sistema biológico. Una cantidad eficaz puede administrarse en una o más administraciones.

[0011]Primero se puede estimar una "cantidad eficaz", "cantidad profilácticamente eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" de acuerdo con ensayos de cultivo celular o utilizando modelos animales, normalmente ratones, ratas, cobayas, conejos, perros o cerdos. Puede usarse un modelo animal para determinar un rango de concentración y vía de administración apropiados. A continuación, dicha información puede usarse para determinar dosis y vías de administración apropiadas para humanos. Al calcular una dosis equivalente humana, se utiliza una tabla de conversión como la proporcionada en Guidance for Industry: Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers (Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE. UU., Administración de Alimentos y Medicamentos, Centro para Evaluación e Investigación de Medicamentos (CDER), julio de 2005). El experto en la técnica conoce directrices adicionales que también pueden usarse para desarrollar dosis terapéuticas humanas basadas en datos no humanos. Una dosis eficaz es generalmente de 0,01 mg/kg a 2000 mg/kg de un agente activo, preferiblemente de 0,05 mg/kg a 500 mg/kg de un agente activo. Una dosis eficaz exacta dependerá de la gravedad de la enfermedad, el estado general de salud del paciente, la edad, el peso corporal y el sexo, la nutrición, el tiempo y la frecuencia de la administración, la(s) combinación(es) de medicamentos, la sensibilidad de respuesta y la tolerancia/respuesta a la administración y otros factores que serán tenidos en cuenta por un experto en la técnica al determinar la dosis y vía de administración para un paciente particular basándose en su conocimiento de la técnica. Dicha dosis puede determinarse mediante la forma de realización de experimentos de rutina y a criterio del médico. Las dosis efectivas también variarán dependiendo de la posibilidad de su uso combinado con otros procedimientos terapéuticos, como el uso de otros agentes.

[0012]Tal como se utilizan en el presente documento, "paciente" y "sujeto" son términos intercambiables y pueden referirse a un paciente/sujeto humano, un perro, un gato, un primate no humano, etc.

[0013]A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención.

DIABETES TIPO 2

[0014]La diabetes tipo 2 es una afección crónica y progresiva que afecta la capacidad de una persona para controlar la cantidad de azúcar (glucosa) en la sangre. La diabetes tipo 2 se desarrolla cuando el cuerpo se vuelve resistente a la insulina o cuando el páncreas no puede producir suficiente insulina. La genética y los factores ambientales, como el sobrepeso y la inactividad, son factores que contribuyen. El sobrepeso o la obesidad es un factor de riesgo principal para la diabetes tipo 2, aunque no es un requisito previo.

[0015]El manejo de la diabetes tipo 2 incluye: pérdida de peso; alimentación saludable; ejercicio regular; y posiblemente, medicamentos para la diabetes o terapia con insulina. Los medicamentos para la diabetes incluyen metformina, sulfonilureas, meglitinidas, tiazolidinedionas, inhibidores de DPP-4, agonistas del receptor de GLP-1 e inhibidores de SGLT2.

ZINC

[0016]El zinc se atribuye a los oligoelementos esenciales para garantizar un estado metabólico adecuado del cuerpo humano. Más de 200 enzimas en todo el cuerpo dependen del zinc. Este elemento es un constituyente de las enzimas o un regulador de su actividad que abarca todas las clases de enzimas: transferasas (ARN y ADN polimerasas, transcriptasa inversa, timidina quinasa, nucleotidil transferasa, carboxipeptidasas y otras peptidasas), hidrolasas (fosfatasa alcalina, 5-nucleotidasa, aminopeptidasa, etc.), liasas (aldolasa, anhidrasa carbónica, etc.), oxidorreductasas (alcohol deshidrogenasa, superóxido dismutasa, etc.), ligasas e isomerasas. Sin zinc, no es posible el metabolismo de proteínas, grasas o carbohidratos.

[0017]También se ha demostrado que el zinc exhibe un efecto antioxidante mediado. El zinc es un inhibidor de la NADPH oxidasa, un complejo enzimático que cataliza la producción de radicales aniónicos superóxido altamente agresivos. Además, puede tener un efecto directo sobre la oxidación de los radicales libres en la etapa de inicio de reacciones en cadena; es un componente estructural de algunas enzimas del sistema de defensa antioxidante, incluida la superóxido dismutasa que contiene Cu/Zn. Al unirse a los grupos tiol de las proteínas, el zinc las protege de la oxidación por especies reactivas de oxígeno. Este oligoelemento induce la síntesis de metalotioneínas, proteínas ricas en cisteína que actúan como eliminadores de radicales libres. El zinc suprime la formación de óxidos metálicos reactivos de valencia mixta y participa en la estabilización de la estructura de la membrana.

[0018]La importancia metabólica y estructural del zinc está determinada por un amplio espectro de su actividad biológica. Por tanto, el zinc es necesario para el funcionamiento normal de los procesos asociados con la división y diferenciación celular (crecimiento, regeneración de tejidos, espermatogénesis y otros) y participa activamente en el metabolismo de los ácidos nucleicos y la síntesis de proteínas. Este oligoelemento es importante para el metabolismo de los ácidos grasos poliinsaturados y las reacciones de transformación de las prostaglandinas. Muestra una actividad lipotrópica pronunciada y tiene propiedades hepatoprotectoras. Haase H., Rink L. Zinc Signaling. Zinc in Human Health // Ámsterdam, Países Bajos: IOS Press. 2011.243.

[0019]Además, el zinc desempeña un papel muy importante en las reacciones inmunológicas, ya que es un regulador de la actividad de los fagocitos y linfocitos y tiene un efecto sobre la quimiotaxis de los neutrófilos. La 5-nucleotidasa, una enzima que contiene zinc, es de gran importancia en el estado funcional de los linfocitos T y B. La deficiencia aislada de zinc causa graves alteraciones en diversos parámetros de la función de las células T, incluida la involución del timo, la inhibición de la citotoxicidad mediada por células y la reducción del número total de linfocitos. El zinc participa en el metabolismo y la estimulación de la actividad de las hormonas pituitarias, las glándulas suprarrenales, el páncreas, la próstata y los testículos. El zinc juega un papel claro en la síntesis, almacenamiento y secreción de insulina. Haase H., Rink L. Zinc Signaling. Zinc in Human Health // Ámsterdam, Países Bajos: IOS Press. 2011.243.

[0020]El zinc también actúa como sinérgico/antagonista de la absorción de muchos oligoelementos y vitaminas (hierro, cobre, magnesio, vitaminas A, E, ácido fólico y otros) y tiene un efecto sobre su metabolismo.

[0021]Ruz, Manuel et al. describe que la suplementación con zinc mejora el control glucémico en la diabetes tipo 2 en pacientes con deficiencia de zinc.

[0022]En resumen, el zinc participa en una variedad de procesos y funciones vitales en el cuerpo humano. Aún no se ha completado del todo un estudio detallado de algunas de estas funciones y muchos de los mecanismos de acción de este oligoelemento aún no se comprenden ni reconocen del todo. Sin embargo, los estudios experimentales y clínicos presentados en la literatura muestran que el zinc es uno de los elementos clave, cuya disminución en el nivel en el cuerpo se asocia con la aparición y progresión de varias de las enfermedades no epidémicas más comunes. Dado que los principales procesos metabólicos en el cuerpo ocurren con la participación activa de enzimas que contienen zinc y dependientes de zinc, su deficiencia causa una violación de muchos procesos vitales.

[0023]El uso de formas farmacológicas clásicas de zinc (sales de zinc y sus quelatos) no siempre permite lograr el efecto adecuado de compensación de la deficiencia de zinc debido a la baja biodisponibilidad de este elemento.

MÉTODOS DE TRATAMIENTO Y COMPOSICIONES

[0024]Las referencias a métodos de tratamiento en el resumen y descripción detallada de la invención en esta descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia.

[0025]En un aspecto, esta divulgación proporciona una composición que comprende zinc enriquecido con<64>Zn<e>n una dosis profiláctica y/o terapéuticamente eficaz para usar en la prevención y/o el tratamiento de la diabetes tipo 2. En algunas formas de realización, el zinc enriquecido con<64>Zn<e>stá en forma de un compuesto de<64>Zn<e>o una sal de<64>Zn. En algunas formas de realización, la composición divulgada comprende<64>Zn<e>en una forma de sal seleccionada del grupo que consiste en asparaginato (fórmula química - C<4>H<5>O<4>N<64>Zn<e>) con 2 moléculas de ácido aspártico, sulfato y citrato.

[0026]El término "<64>Zn<e>" se utiliza en el presente documento para referirse al zinc enriquecido con<64>Zn. Es decir, zinc que está enriquecido en<64>Zn de manera que<64>Zn se enriquece mayor que su porcentaje habitual en zinc en la naturaleza.

[0027]Las composiciones descritas contienen zinc enriquecido con<64>Zn<e>. El zinc en forma del isótopo ligero<64>Zn<e>se absorbe en el cuerpo mucho mejor que el zinc natural. En ciertas formas de realización, las composiciones divulgadas contienen zinc que es al menos 80 %<64>Zn<e>, al menos 90 %<64>Zn<e>, al menos 95 %<64>Zn<e>o al menos 99 %<64>Zn<e>, por ejemplo, zinc que es 80 %<64>Zn<e>, 85 %<64>Zn<e>, 90 %<64>Zn<e>, 95 %<64>Zn<e>, 99 %<64>Zn<e>o 99,9 %<64>Zn<e>.

[0028]En otro aspecto, esta divulgación proporciona un método para tratar y/o prevenir la diabetes tipo 2 mediante la administración de una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de una composición divulgada a un sujeto que la necesita.

[0029]Las composiciones divulgadas pueden administrarse a un sujeto para prevenir o tratar la diabetes tipo 2. El sujeto puede ser un ser humano o un mamífero no humano, tal como un primate no humano o un perro o gato domesticado.

[0030]Se proporciona un método para prevenir o tratar la diabetes tipo 2 que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una composición en cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz que comprende un compuesto de<64>Zn<e>o una sal del mismo. Se proporciona un método para disminuir los niveles de triglicéridos, colesterol y ácidos grasos libres en el suero de un sujeto que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de una composición que comprende un compuesto de<64>Zn<e>o una sal del mismo. Se proporciona un método para disminuir los niveles de citocinas proinflamatorias en el suero y tejido adiposo de un sujeto que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de una composición que comprende un compuesto de<64>Zn<e>o una sal del mismo. En algunas formas de realización, la composición comprende además un diluyente o un excipiente. En algunas formas de realización, el diluyente es agua. En formas de realización adicionales, el diluyente de agua es agua empobrecida en deuterio. En algunas formas de realización, el compuesto de<64>Zn<e>o una sal del mismo tiene entre 20 y 100 % de<64>Zn<e>. En formas de realización adicionales, el compuesto de<64>Zn<e>o una sal del mismo es al menos 80 % de<64>Zn<e>. En formas de realización adicionales, el compuesto<64>Zn<e>o una sal del mismo es al menos 95 % de<64>Zn<e>. En algunas formas de realización, la composición contiene entre 0,05 mg y 110 mg de<64>Zn<e>. En algunas formas de realización, la composición contiene entre 1 y 10 mg de<64>Zn<e>. En algunas formas de realización, el compuesto de<64>Zn<e>o una sal del mismo es al menos 90 % de<64>Zn<e>y la composición es una solución acuosa en la que el<64>Zn<e>está presente en una concentración de entre 0,1 mg/ml y 10 mg/ml. En algunas formas de realización, el<64>Zn<e>está en una forma de sal seleccionada del grupo que consiste en asparaginato (fórmula química - C<4>H<5>O<4>N<64>Zn<e>) con 2 moléculas de ácido aspártico, sulfato y citrato. En algunas formas de realización, la composición se administra mediante inyección. En otras formas de realización, la composición se administra por vía oral. En determinadas formas de realización, las citoquinas proinflamatorias son una o más de IL-1, IL-6, IL-12 e IFN-y.

FORMULACIÓN Y ADMINISTRACIÓN DE COMPOSICIONES

[0031]La composición divulgada puede administrarse a un sujeto que la necesite mediante cualquier modo de administración adecuado, cualquier frecuencia adecuada y en cualquier dosis adecuada y eficaz.

[0032]En algunas formas de realización, la cantidad total de 64Zne administrada es la misma que la cantidad o ingesta diaria de zinc recomendada en los EE. UU. En algunas formas de realización, la cantidad total de 64Zne administrada es 1/2, dos, tres, cinco o diez veces la cantidad o ingesta diaria de zinc recomendada en los EE. UU. En algunas formas de realización, la cantidad total de 64Zne es entre 1/2 y 10 veces la cantidad o ingesta diaria de zinc recomendada en EE. UU. Una composición divulgada puede comprender la cantidad diaria prescrita que se administrará una vez al día o una fracción de la misma que se administrará un número correspondiente de veces al día. Una composición divulgada también puede comprender una cantidad de 64Zne para administrarse una vez cada dos días, una vez cada tres días, una vez por semana o con cualquier otra frecuencia adecuada.

[0033]La composición divulgada puede estar en cualquier forma adecuada y puede formularse para cualquier medio de administración adecuado. En algunas formas de realización, la composición descrita se proporciona en una forma adecuada para la administración oral, tal como una tableta, píldora, pastilla, cápsula, suspensión líquida, solución líquida o cualquier otra forma de dosificación oral convencional. Las formas de dosificación oral pueden proporcionar liberación inmediata, liberación retardada, liberación sostenida o liberación entérica y, si es apropiado, comprender uno o más recubrimientos. En algunas formas de realización, la composición divulgada se proporciona en una forma adecuada para inyección, tal como subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal o cualquier otra vía de inyección. En algunas formas de realización, las composiciones para inyección se proporcionan en forma estéril y/o apirógena y pueden contener conservantes y/u otros excipientes adecuados, tales como sacarosa, fosfato dibásico de sodio heptahidrato u otro tampón adecuado, un agente de ajuste del pH tal como clorhídrico. ácido o hidróxido de sodio y polisorbato 80 u otro detergente adecuado.

[0034]Cuando se proporciona en forma de solución, en algunas formas de realización, la composición divulgada se proporciona en una botella, vial o ampolla de vidrio o plástico, cualquiera de los cuales puede ser adecuado para uso único o múltiple. El frasco, vial o ampolla que contiene la composición descrita se puede proporcionar en forma de kit junto con una o más agujas de calibre adecuado y/o una o más jeringas, todas las cuales preferiblemente son estériles. Por lo tanto, en ciertas formas de realización, se proporciona un kit que comprende una solución líquida como se describió anteriormente, que se envasa en una botella, vial o ampolla de vidrio o plástico adecuada y que puede comprender además una o más agujas y/o una o más jeringas. El kit puede comprender además instrucciones de uso.

[0035]En determinadas formas de realización, la dosis de 64Zne es proporcional a diversas pautas de ingesta diaria autorizadas (por ejemplo, cantidad diaria recomendada (USRDA), ingesta adecuada (AI), ingesta dietética recomendada (RDI)) del elemento correspondiente. En algunas formas de realización, la dosificación de isótopos ligeros está entre aproximadamente 1/2 y aproximadamente 20 veces la cantidad de guía, más preferiblemente entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10 veces la cantidad de guía, incluso más preferiblemente entre aproximadamente 1 y aproximadamente 3 veces la cantidad de guía. Por lo tanto, en ciertas formas de realización, una dosis única de una composición divulgada para administración diaria se formularía para comprender una cantidad dentro de estos rangos, tal como aproximadamente 1/2, aproximadamente 1, aproximadamente 3, aproximadamente 5, aproximadamente 10 y aproximadamente 20 veces la cantidad de orientación. Estas cantidades generalmente son para ingesta oral o aplicación tópica. En algunas formas de realización, la dosis intravenosa es menor, tal como de aproximadamente 1/10 a aproximadamente 1/2 de la cantidad guía. Las dosis en el extremo inferior de estos rangos son apropiadas para cualquier persona con una mayor sensibilidad a un elemento o clase de elementos específicos (p. ej., personas con problemas renales). Para el zinc, la cantidad diaria recomendada oscila entre 2 mg en bebés y 8 a 11 mg (según el sexo) para edades de 9 años en adelante. Las dosis diarias analizadas a lo largo de esta solicitud pueden subdividirse en dosis fraccionadas y las dosis fraccionadas se pueden administrar el número adecuado de veces al día para proporcionar la cantidad de dosificación diaria total (por ejemplo, 1/2 de la dosis diaria administrada dos veces al día, 1/3 de la dosis diaria administrada tres veces al día, etc.). Ver Tabla 1.

Tabla 1

[0036]La composición divulgada puede producirse mediante métodos empleados de acuerdo con la práctica general en la industria farmacéutica, tales como, por ejemplo, los métodos ilustrados en Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Pharmaceutical Press; 21a edición revisada (2011) (en adelante "Remington").

[0037]En algunas formas de realización, las composiciones divulgadas comprenden al menos un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Estos incluyen, por ejemplo, diluyentes, vehículos, excipientes, cargas, desintegrantes, agentes solubilizantes, agentes dispersantes, conservantes, agentes humectantes, conservantes, estabilizadores, agentes tampón (por ejemplo, fosfato, citrato, acetato, tartrato), agentes de suspensión, emulsionantes y agentes potenciadores de la penetración como DMSO, según corresponda. La composición también puede comprender sustancias auxiliares adecuadas, por ejemplo, agentes solubilizantes, agentes dispersantes, agentes de suspensión y emulsionantes.

[0038]En determinadas formas de realización, la composición comprende además diluyentes, deslizantes, lubricantes, acidulantes, estabilizadores, cargas, aglutinantes, plastificantes o coadyuvantes de liberación adecuados y otros excipientes farmacéuticamente aceptables.

[0039]Se puede encontrar una descripción completa de excipientes farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub., Co., NJ 1991) u otros textos estándar de ciencia farmacéutica, tales como el Handbook of Pharmaceutical Excipients (Shesky et al. eds., 8a ed. 2017).

[0040]En algunas formas de realización, la composición divulgada se puede administrar por vía intragástrica, oral, intravenosa, intraperitoneal o intramuscular, pero también son posibles otras vías de administración.

[0041]Se puede utilizar agua como vehículo y diluyente en la composición. También es aceptable el uso de otros disolventes y diluyentes farmacéuticamente aceptables además del agua o en lugar de ella. En determinadas formas de realización, se utiliza agua empobrecida en deuterio como diluyente.

[0042]Como compuestos portadores para la composición también se pueden utilizar macromoléculas grandes que se metabolizan lentamente, tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos. Los vehículos farmacéuticamente aceptables en composiciones terapéuticas pueden contener adicionalmente líquidos, tales como agua, solución salina, glicerol o etanol. Además, dichas composiciones pueden comprender además excipientes, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tampón y similares. Dichos excipientes incluyen, entre otros, diluyentes y vehículos convencionales en la técnica y/o sustancias que promueven la penetración del compuesto activo en la célula, por ejemplo, DMSO, así como conservantes y estabilizadores.

[0043]La composición divulgada podrá presentarse en diversas formas farmacéuticas dependiendo del objeto de aplicación; en particular, puede formularse como una solución inyectable.

[0044]La composición descrita puede administrarse sistémicamente. Las vías de administración adecuadas incluyen, por ejemplo, administración oral o parenteral, tal como intravenosa, intraperitoneal, intragástrica así como a través del agua potable. Sin embargo, dependiendo de la forma de dosificación, la composición divulgada puede administrarse por otras vías.

[0045]En determinadas formas de realización, la composición descrita que comprende 64Zne se administra por vía intragástrica a una concentración de 2,25 mg/ml para prevenir y/o tratar el sobrepeso o la obesidad en un sujeto animal. En formas de realización adicionales, la composición descrita es de aproximadamente 2 ml. En formas de realización adicionales, el nivel de enriquecimiento de 64Zne es aproximadamente el 99 % o más. En otras formas de realización adicionales, el 64Zne de la composición de 2 ml comprende o consiste en asparaginato de zinc (fórmula química -C4H5O4N64Zne) con 2 moléculas de ácido aspártico. La dosis de la composición divulgada puede variar dependiendo del sujeto que se está tratando, la gravedad de la enfermedad, la condición del paciente y otros factores que serán tenidos en cuenta por un experto en la técnica al determinar la dosis y vía de administración para un paciente particular en base a sus conocimientos en la técnica.

[0046]Se pueden comprar isótopos ligeros. El óxido de Zn-64 con el grado de enriquecimiento necesario se puede adquirir, por ejemplo, en el laboratorio nacional Oak Ridge, Oak Ridge, TN, EE. UU.

[0047]El asparaginato de zinc tiene una fórmula química: C4H5O4N64Zne, con 2 moléculas de ácido aspártico. La estructura del asparaginato de zinc es:

[0048]En determinadas formas de realización, la composición descrita comprende 64Zne en aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 100 % de la composición.

[0049]La composición descrita que comprende<64>Zn<e>se metaboliza en el cuerpo mucho mejor que las composiciones que comprenden zinc natural en forma de sales o quelatos (que no están enriquecidos con<64>Zn) que se usan convencionalmente en la técnica. Además, dicha composición ayuda a reducir los efectos tóxicos inherentes a las medicinas tradicionales con un nivel comparable de eficacia en la prevención y el tratamiento de la diabetes tipo 2.

[0050]La composición divulgada se puede coadministrar con otro agente o terapia.

EJEMPLOS

[0051]Para que esta invención se comprenda mejor, se exponen los siguientes ejemplos. Estos ejemplos tienen fines ilustrativos únicamente y no deben interpretarse como limitativos del alcance de la invención de ninguna manera.

EJEMPLO 1. Comparación entre 64Zne y zinc natural

[0052]Un estudio comparativo de los efectos potenciales del<64>Zn<e>y el acetato de Zn - Zn(CH<3>COO)<2>sobre la absorción y utilización de la glucosa por el organismo demostró que el isótopo de zinc tuvo un mejor efecto sobre la absorción y utilización de la glucosa por el organismo en una serie de parámetros:

[0053]Se registró la dinámica positiva del aumento de peso en los animales de control (frente al grupo de animales a los que se les inyectó acetato de Zn (Zn(CH<3>COO)<2>) (FIG. 1).

[0054]El séptimo día después de la interrupción de<64>Zn<e>, los niveles de insulina en la sangre de los animales aumentaron (frente al grupo de animales a los que se les inyectó acetato de Zn (Zn(CH<3>COO)<2>) (Figura 3).

[0055]Se observó un aumento significativo en el área de los islotes pancreáticos en animales de experimentación (examen microscópico el séptimo día después de la última administración de las sustancias) (frente al grupo de animales a los que se les inyectó acetato de Zn (Zn(CH<3>COO)<2>) (FIG. 4). Esta es una dinámica positiva, ya que con el desarrollo de la diabetes tipo I hay una falta significativa de insulina debido a problemas con su síntesis por estos islotes. Los resultados obtenidos se correlacionan con los resultados de la determinación de los niveles de insulina en el torrente sanguíneo (FIG. 3).

[0056]La prueba de tolerancia a la glucosa mostró una disminución de los niveles de glucosa en los animales después de la administración del isótopo de zinc en comparación con el grupo de control y el grupo de animales inyectados con acetato de Zn (Zn(CH<3>COO)<2>) cuyos niveles de glucosa también disminuyeron, aunque no tan fuertemente. Esto puede indicar que el isótopo de zinc tiene un efecto sobre los niveles de insulina en la sangre, lo que a su vez conduce a la puesta en marcha de mecanismos asociados con la utilización de la glucosa del torrente sanguíneo. Teniendo en cuenta que la insulina es una proteína dependiente del zinc, se puede suponer que la administración de zinc conduce a un aumento de la actividad de esta proteína en relación con su receptor en los tejidos o a un aumento de la cantidad de esta hormona en el sangre.

Tabla 2 Prueba de tolerancia a la glucosa.

[0057]Los resultados obtenidos en el modelo de diabetes tipo I muestran que esta sustancia tiene un efecto más positivo en el curso del desarrollo de la diabetes tipo I (en comparación con el acetato de Zn (Zn(CH3COO)2)) y puede usarse potencialmente para reducir los efectos tóxicos del aumento de glucosa. niveles en el torrente sanguíneo durante el desarrollo de esta patología.

[0058]El análisis de la acumulación de metales en los tejidos del riñón y del hígado (zinc, manganeso y cobre) mostró que solo el zinc aumentó significativamente en ambos grupos de animales a los que se les inyectó zinc (acetato de Zn (Zn(CH3COO)2) o 64Zne) tanto el día 1 y el día 7 después de la interrupción de las sustancias. Esto indica que el zinc inyectado a los animales se acumuló y su utilización por el organismo no aumentó. Todos los demás metales analizados estaban dentro de las mismas concentraciones que en el grupo de animales de control. Los datos obtenidos indican la ausencia de efectos negativos del 64Zne sobre la acumulación y utilización del zinc y metales asociados por el organismo.

[0059]Todos estos datos sugieren un efecto más pronunciado y de mayor calidad del 64Zne sobre la absorción y utilización de la glucosa por el organismo en comparación con el acetato de Zn (Zn(CH3COO)2).

[0060]En este Ejemplo, se administró acetato de zinc (zinc natural) a un grupo experimental de animales, a una dosis de 3750 mcg de zinc (por metal) por 1 kg de peso corporal del animal (rata). También se administró zinc-64 en forma de aspartato de zinc al grupo experimental de animales, a una dosis de 3750 mcg de zinc (por metal) por 1 kg de peso corporal del animal (rata). La administración de estas composiciones fue por vía intraperitoneal.

EJEMPLO 2: Efectos antropométricos de la composición basada en64Zn<e en modelos animales de obesidad>

[0061]Para evaluar los efectos de la composición a base de 64Zne sobre el desarrollo de la obesidad inducida por una dieta alta en grasas, se evaluaron algunos valores antropométricos en modelos animales de obesidad no tratados y en modelos animales de obesidad tratados con solución de 64Zne.

[0062]En el experimento se utilizaron ratas blancas sin pedigrí con un peso inicial de 195-205±10 g. Los animales se mantuvieron en un vivarium acreditado del Centro Académico y de Investigación "Instituto de Biología y Medicina" de la Universidad Nacional Taras Shevchenko de Kiev de acuerdo con las normas estándar sobre la disposición, equipamiento y mantenimiento de clínicas biológicas experimentales (vivarios). El estudio se llevó a cabo cumpliendo con las normas y recomendaciones internacionales del Convenio Europeo para la Protección de los Animales Vertebrados utilizados con Fines Experimentales y otros Fines Científicos (Estrasburgo, 18/03/1986) y aprobado por la Comisión de Bioética del Centro Académico y de Investigación "Instituto de Biología y Medicina".

[0063]El procesamiento estadístico de los resultados se realizó mediante los métodos de estadística de variación y análisis de correlación utilizando el software OrginLab Orgin® Pro 9.1 y StatSoft STaStica® 10 (Brandt, Z. Statistical methods for analysis of observations. M.: Mir, 1975. - 312p.). La hipótesis de distribución normal de las muestras se probó mediante la prueba de ShapiroWilk. Si una muestra cumplía los criterios de distribución normal, la importancia de las diferencias entre muestras se determinaba mediante la prueba t de Student. Si una muestra no cumplía con los criterios de distribución normal, la importancia de las diferencias entre muestras se determinaba mediante la prueba U de Mann-Whitney. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando p<0,05.

[0064]Antes del inicio del experimento, los animales se mantuvieron con una dieta estándar del vivarium. Para inducir la obesidad en animales de experimentación, se les alimentó con una dieta rica en grasas que consistía en pienso estándar (60 %), manteca de cerdo (10 %), huevos de gallina (10 %), sacarosa (9 %), maní (5 %), leche seca (5 %) y aceite de girasol (1 %) (1 %) (ver X. H. Shen et al., Exp. Biol. and Med. 235: 47-51 (2010)). El pienso fue preparado por los presentes inventores. Las primeras 4 semanas del experimento, todos los animales se mantuvieron con una dieta alta en grasas, después de lo cual se dividieron aleatoriamente en dos grupos experimentales:

- los animales del primer grupo (obesidad) continuaron comiendo su dieta alta en grasas y tuvieron libre acceso a agua durante las próximas 6 semanas del experimento;

- los animales del segundo grupo (obesidad solución de 64Zne) también siguieron su dieta rica en grasas y tuvieron libre acceso al agua durante las siguientes 6 semanas del experimento, pero cada tres días y hasta el final del experimento se les administró una solución de 64Zne por vía intragástrica a una concentración de 2,25 mg/ml en un volumen de 2 ml. Esta solución contenía 2,25 mg/ml de una sal de zinc farmacéuticamente aceptable, particularmente asparaginato de zinc, en el que el nivel de enriquecimiento con 64Zn no era inferior al 80 por ciento. Para la preparación de la composición reivindicada se utilizó como diluyente (vehículo líquido) solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (indicado por el fabricante) (basada en agua de Langway empobrecida en deuterio).

[0065]También hubo un grupo de animales (control) que recibió una dieta estándar preparada por el vivarium y tuvo libre acceso al agua durante todo el experimento.

[0066]Los animales de todos los grupos se pesaron una vez por semana después de un ayuno nocturno. Diariamente se determinó la cantidad de alimento a consumir por los animales. Al final de un período de 10 semanas de desarrollo de modelos de obesidad, 24 horas después de la última administración de la solución de isótopo de zinc, los animales fueron retirados de sus jaulas y decapitados.

[0067]El índice de masa corporal (IMC) (la relación entre el peso corporal (g) y el cuadrado de la longitud corporal (cm2)) se calculó al final del experimento. Un aumento del IMC es un signo morfológico característico de la obesidad que se desarrolla como resultado de la acumulación y redistribución del tejido adiposo en el cuerpo. El IMC permite evaluar la relación entre el peso corporal y la altura (longitud corporal) y, por tanto, evaluar indirectamente si el peso es insuficiente, normal o excesivo. Además, el IMC se utiliza como valor integral que caracteriza la composición del cuerpo y el grado de depósitos de grasa, debido a que la distribución del tejido adiposo en el cuerpo determina el riesgo de complicaciones metabólicas asociadas a la obesidad, lo cual debe ser considerado al examinar a los pacientes. que desarrollan obesidad. El IMC no es sólo un criterio de diagnóstico de obesidad, sino también una buena medida del riesgo de un paciente de padecer enfermedades que pueden ocurrir con el sobrepeso y la obesidad.

[0068]Los datos obtenidos durante el experimento (Tabla 3) muestran que en la décima semana del experimento, el índice de masa corporal medio de los animales de control fue de 0,60 g/cm2, valor que está dentro de un rango de referencia para animales de este grupo de edad. El IMC de los animales que consumieron una dieta rica en grasas fue 1,14 veces mayor que el IMC de los animales del grupo de control (0,71 g/cm2). El índice de masa corporal de las ratas que recibieron la solución de 64Zne durante el experimento fue inferior al de los modelos animales de obesidad no tratados, pero ligeramente superior al valor de control (0,65 g/cm2), lo que indica que la solución de 64Zne tiene un efecto positivo en el estado general metabólico de los animales.

Tabla 3. Algunos valores antropométricos, cantidad y contenido calórico de los alimentos (M±m, n = 10

[0069]Dado que el IMC se calcula en función del peso, una disminución en el valor del IMC puede estar directamente relacionada con el menor peso de los animales que recibieron la solución de 64Zne. Por lo tanto, se investigó más a fondo si la administración de la solución 64Zne tenía algún efecto sobre el peso y el aumento de peso en modelos animales de obesidad. Los datos obtenidos (FIG. 1)muestran que la dinámica del aumento de peso de los animales de los grupos experimentales difería significativamente. Por lo tanto, los animales que se mantuvieron con una dieta alta en grasas y recibieron la solución de 64Zne ganaron menos peso que los animales que solo fueron alimentados con una dieta alta en grasas. Una diferencia particularmente notable en el aumento de peso de los animales de ambos grupos se observó a partir de la cuarta semana del experimento. El aumento en el peso corporal de los animales que consumieron una dieta rica en grasas alcanzó el 103% al final del experimento, mientras que los animales que recibieron inyecciones intragástricas de la solución 64Zne no ganaron mucho más peso que los animales del grupo de control (62 % vs. 59 %).

[0070]Se sabe que el desarrollo de la obesidad, debido a la alteración del trabajo coordinado de una serie de neurotransmisores y sistemas hormonales del cuerpo, conduce a alteraciones en el nivel de control del apetito y en la regulación de la sensación de saciedad. Estas alteraciones promueven una ingesta excesiva de alimentos y a menudo van acompañadas del desarrollo de hiperfagia, un estado de un deseo anormalmente grande de energía alimentaria cuyo equivalente excede las necesidades energéticas del cuerpo (L. Zhou et al., Cell Metabolism 6: 398 (2007)).

[0071]Para definir posibles mecanismos de disminución en la ganancia de peso corporal de los animales tratados con la solución de 64Zne, se analizó la cantidad de alimento consumido por los animales. Los datos obtenidos se presentan en la Tabla 3.

[0072]Cuando se compararon los datos calculados para todos los grupos experimentales, no se encontraron diferencias particulares en la cantidad de alimento que los animales comieron en promedio por día. Así, los animales del grupo de control y del grupo de modelos de obesidad consumieron alrededor de 35 g de alimento al día. Sin embargo, cabe señalar que los animales del grupo de control se mantuvieron con una dieta estándar, mientras que los animales del grupo de modelos de obesidad inducida por la dieta consumieron una dieta rica en grasas especialmente preparada, cuyo contenido calórico era significativamente mayor.

[0073]El análisis de los resultados obtenidos, teniendo debidamente en cuenta el contenido calórico de los alimentos consumidos por los animales, muestra una diferencia significativa en los valores. A pesar de la misma cantidad de alimento consumido por los animales, el contenido calórico de los alimentos consumidos por el grupo de modelos de obesidad inducida por la dieta a los que se les administró la composición reclamada fue menor que el contenido calórico del grupo de control de animales con obesidad inducida por la dieta (sin administración de la composición descrita). Además, en la semana 10, el contenido calórico para el grupo de modelos de obesidad inducida por dieta a los que se les administró la composición descrita, fue casi el mismo que para el grupo de control que consumió alimentos estándar, y para el grupo que consumió alimentos estándar con simultáneamente administración de la composición divulgada.

[0074]La dinámica del contenido calórico de los alimentos consumidos por los animales durante las 10 semanas del experimento se muestra en laFIG. 2.

[0075]Los datos obtenidos sugieren que la composición a base de 64Zne tiene un efecto sobre la sensación de saciedad porque, al tener libre acceso a los alimentos, los animales tratados con la composición descrita de un método divulgado consumieron significativamente menos alimentos en comparación con los animales no tratados que sólo se mantuvieron en un dieta alta en grasas. En otras palabras, los animales que recibieron la solución de 64Zne comieron menos y ganaron menos peso que los animales que no recibieron la solución de 64Zne. Esta diferencia puede explicarse por los efectos tanto directos como indirectos del zinc sobre la homeostasis energética.

[0076]Así se demostró que la administración de la composición a base de 64Zne provocó una disminución en la cantidad de alimento consumido por día, lo que, en consecuencia, fue acompañado por un aumento de peso menos pronunciado en los animales y una normalización de su índice de masa corporal en comparación con valores similares en modelos animales de obesidad no tratados.

EJEMPLO 3: Efectos bioquímicos de la composición basada en64Zn<e en modelos animales de obesidad>

[0077]Se llevó a cabo un experimento para estudiar los efectos del isótopo ligero de zinc 64Zne sobre las variables bioquímicas sanguíneas que sufren cambios patológicos en la obesidad, particularmente el perfil lipídico. Para este fin, se indujo obesidad por dieta alta en grasas en animales de experimentación como se describe en el Ejemplo 2. Para el experimento, se utilizaron los siguientes animales: animales control que consumieron dieta estándar; animales que recibieron una dieta rica en grasas durante las siguientes 6 semanas; y animales que fueron alimentados con una dieta alta en grasas pero que también recibieron la composición a base de 64Zne (se administró asparaginato de zinc con 64Zne con un enriquecimiento del 80 % o más a una concentración de 2,25 mg/ml por vía intragastral en un volumen de 2 ml) durante todas 6 semanas del experimento. Los resultados del experimento se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4. Variables bioquímicas séricas en animales de grupos experimentales (M±m, n=10)

[0078]Se descubrió que la composición a base de 64Zne tenía un efecto positivo sobre el metabolismo de los lípidos en el cuerpo. La disminución de los niveles de triglicéridos, colesterol y ácidos grasos libres en el suero de los animales alimentados con una dieta rica en grasas y tratados con 64Zne fue casi al mismo nivel que en el grupo de animales de control.

EJEMPLO 4: Efectos del64Zn<e sobre el estado redox en animales de experimentación>

[0079]Varios estudios han demostrado que la obesidad está estrechamente asociada con un estado redox alterado y un mayor riesgo metabólico. El estrés oxidativo es uno de los factores que causan la disfunción de los adipocitos. El estrés oxidativo y el daño tisular resultante y la muerte celular son la base para el desarrollo de muchas afecciones patológicas crónicas. La producción excesiva de radicales libres y/o el agotamiento de su sistema de desintoxicación conducen a un desequilibrio prooxidante-antioxidante, que a su vez afecta las estructuras de los lípidos, proteínas y ácidos nucleicos de las membranas celulares. La peroxidación lipídica (LPO) mediada por radicales libres es una de las causas importantes de la destrucción de las membranas celulares y de un mayor daño celular. La degradación de los lípidos de la membrana induce un aumento de la fluidez de la membrana y de su permeabilidad a los iones, lo que altera la homeostasis celular en su conjunto. Los productos de oxidación de radicales libres (4-hidroxialquenos, dialdehído malónico, etc.) son altamente mutagénicos y citotóxicos.

[0080]Además, el estrés oxidativo activa la diferenciación de los preadipocitos y estimula la hipertrofia de las células adiposas maduras. La producción excesiva de ROS en el tejido adiposo acumulado conduce además a la inducción de estrés oxidativo en el torrente sanguíneo, lo que contribuye a la propagación del estrés oxidativo a órganos alejados del depósito de grasa.

[0081] El equilibrio prooxidante-antioxidante en animales se evaluó utilizando los modelos de obesidad como se describe en el Ejemplo 2. El grupo de control, el grupo de modelos animales de obesidad no tratados y el grupo de animales que fueron alimentados con una dieta rica en grasas y tratados con 64Zne fueron utilizados en el experimento.

[0082] Las concentraciones de productos de peroxidación lipídica sirven como criterio informativo que permite sacar una conclusión sobre la intensidad de los procesos oxidativos. Hay productos de peroxidación lipídica primaria (como los dienos conjugados) y productos de peroxidación lipídica secundaria (como los aldehídos, en particular el aldehído malónico), que se forman como resultado de la ruptura de los dobles enlaces carbono-carbono en los esqueletos de carbono de las moléculas oxidadas. Después, el inicio de la LPO conduce a la formación de bases de Schiff conjugadas de fosfolípidos y productos similares al malonaldehído, que causan alteraciones en la orientación ordenada de las moléculas de fosfolípidos y afectan las interacciones intermoleculares de las lipoproteínas y la configuración de la membrana basal.

[0083] Considerando lo anterior, se determinaron las concentraciones de productos primarios de LPO (dienos conjugados (DC)), productos secundarios de LPO (sustancias reactivas a TBA (TBARS)) y productos finales de LPO (bases de Schiff (BS)) en animales tratados con 64Zne. Teniendo en cuenta que la obesidad se acompaña del desarrollo de estrés oxidativo sistémico que cubre la mayoría de los tejidos en diversos grados y conduce a la alteración de la integridad de las membranas celulares y la admisión de productos de peroxidación lipídica al torrente sanguíneo, valores que caracterizan el estado del prooxidante-antioxidante. El sistema se determinó en el suero sanguíneo de animales.

[0084] Se encontró que los modelos de obesidad tenían niveles séricos elevados de productos primarios de la oxidación de lípidos por radicales libres (1,86 veces más altos que en el control) (Tabla 5). Este resultado puede explicarse desde el punto de vista de la alteración del metabolismo de los lípidos, la alteración de los procesos de transporte de ácidos grasos en particular y, en consecuencia, el aumento de los niveles plasmáticos de ácidos grasos libres y esterificados, que son sustratos directos para la acción de especies de oxígeno reactivas.

[0085] Por otro lado, la acumulación de productos de peroxidación lipídica en el suero puede ser un resultado directo de la violación de la integridad de las membranas celulares debido a la destrucción oxidativa de su componente lipídico y la entrada de productos de peroxidación lipídica al torrente sanguíneo.

Tabla 5. Niveles séricos de productos de peroxidación lipídica en animales de grupos experimentales (M ± m, n=10)

[0086] Así, los niveles elevados de productos de peroxidación lipídica en la décima semana del desarrollo de la obesidad indican claramente que el estrés oxidativo tiene una naturaleza sistémica y que este proceso es crónico, lo que es un marcador de pronóstico desfavorable ya que estos metabolitos son compuestos extremadamente tóxicos y su impacto negativo se manifiesta a diferentes niveles y conduce a daños en las moléculas de ADN, destrucción de moléculas de proteínas y glucosaminoglicanos, cambios en la composición lipídica de las membranas celulares y alteración de los procesos asociados a las membranas.

[0087] La administración de una composición a base de 64Zne a animales ayudó a normalizar los niveles de productos LPO primarios, secundarios y finales, lo que sirve como evidencia adicional de la capacidad del 64Zne para influir en el estado prooxidante-antioxidante general del cuerpo.

[0088] Según los conceptos modernos, las especies reactivas de oxígeno no sólo activan los procesos de peroxidación lipídica sino que también causan la destrucción oxidativa de las moléculas de proteínas, provocando una alteración de la conformación de enzimas, receptores y canales iónicos tanto solubles como unidos a membrana, lo que finalmente conduce a la pérdida de su actividad biológica (enzimático, receptor, transporte, por ejemplo). La oxidación de proteínas da como resultado la formación de grupos aldehído y cetona de residuos de aminoácidos (grupos carbonilo) en las proteínas.

[0089] Por lo tanto, un aumento en el número de proteínas modificadas oxidativamente puede considerarse como un criterio temprano de daño tisular por radicales libres y un marcador del agotamiento del sistema de defensa antioxidante en el cuerpo. Este estudio reveló niveles séricos elevados de proteínas modificadas oxidativamente en modelos animales de obesidad (Tabla 6).

Tabla 6 Niveles séricos de productos de modificación oxidativa de proteínas en animales de grupos experimentales (M ± m, n=10)

[0090] Los datos experimentales mostraron que en los animales que fueron alimentados con una dieta alta en grasas durante todo el experimento y recibieron inyecciones de soluciones de 64Zne, los niveles de aldehído-dinitrofenilhidrazonas excedieron el punto de referencia pero fueron más bajos en comparación con los valores en animales no tratados con obesidad. En cuanto a las cetonas-dinitrofenil-hidrazonas, su concentración se mantuvo dentro del valor de control. Dichos resultados se correlacionan con los datos que muestran una disminución en los niveles de productos LPO y sugieren una disminución en la intensidad de las reacciones de oxidación de radicales libres.

EJEMPLO 5: Efectos de la composición basada en<64>Zn<e>sobre el perfil de citoquinas en modelos animales de obesidad

[0091] El perfil de citocinas en animales se evaluó usando los modelos de obesidad como se describe en el Ejemplo 2. El grupo de control, el grupo de modelos animales de obesidad no tratados y el grupo de animales que fueron alimentados con una dieta rica en grasas y tratados con 64Zne se usaron en el experimento.

[0092] La patogénesis de la obesidad se acompaña de un proceso inflamatorio crónico sistémico, cuyo grado de intensidad puede evaluarse mediante los niveles séricos de citocinas pro y antiinflamatorias.

[0093] El análisis del perfil de citocinas séricas en modelos animales de obesidad mostró un aumento en los niveles de citocinas proinflamatorias (Tabla 7). En los animales alimentados con una dieta rica en grasas y a los que se les administró la solución 64Zne, se produjo una disminución de los niveles séricos de citocinas proinflamatorias en contraste con un aumento de los niveles de citocinas antiinflamatorias, que eran incluso mayores que en los animales. del grupo de control.

Tabla 7. Perfil de citoquinas séricas en animales de grupos experimentales (M ± m, n=10)

[0094] Uno de los mecanismos básicos de los efectos del zinc enriquecido con el isótopo 64Zne sobre el perfil de citocinas puede ser su inhibición de factores de transcripción sensibles al estrés oxidativo. Un cierto efecto normalizador de la composición basada en 64Zne sobre el perfil de citocinas en modelos animales de obesidad puede servir como prueba de un posible potencial antiinflamatorio de la composición reivindicada en la obesidad.

[0095] Así, los datos experimentales confirmaron efectos positivos de la composición basada en 64Zne sobre una serie de variables patológicas en modelos animales de obesidad. En particular, se demostró que la administración de la composición a base de 64Zne a animales de experimentación provocó una disminución del índice de masa corporal y una reducción del aumento de peso corporal y de la cantidad de alimento consumido; se descubrió que el 64Zne tiene un efecto positivo sobre el metabolismo de los lípidos en el cuerpo de los animales; se demostró la normalización de la homeostasis prooxidante-antioxidante debido a una disminución en la intensidad de los procesos de radicales libres; se reveló la capacidad de 64Zne para influir en el perfil de citocinas séricas en animales. Los efectos observados en este estudio respaldan la eficacia de la composición a base de 64Zne reivindicada para la prevención y el tratamiento de la obesidad.

[0096] Para los Ejemplos 2-5, la composición descrita enriquecida con zinc-64 tiene una sal/compuesto de zinc con la siguiente fórmula estructural:

[0097] El compuesto es un hidrato cristalino que contiene 2 moléculas de agua. La masa molar es 364 g/mol. 2,2 H2O debe considerarse como ^2 H2O, porque el 0,2 H2O es agua libre que puede evaporarse al secar el polvo. ^2 H2O es un hidrato cristalino y forma parte de la molécula. Se utilizaron 4,5 mg de aspartato de zinc (que estaba en un volumen de solución de 2 ml), que contenía 17,8 % de zinc-64 puro (en metal). Así, cada dosis, que era de 4,5 mg de aspartato de zinc, contenía 800 ug de zinc-64 (por metal).

EJEMPLO 6: ISOTOPO ESTABLE Zn64 EN FORMA DE ASPARTATO SOBRE LA OBESIDAD Y LA PREDIABETES TIPO 2 EN ANIMALES EXPERIMENTALES (RATAS) ALIMENTADOS CON DIETAS RICAS EN GRASAS DURANTE UN TIEMPO ESPECIFICADO

LISTA DE ABREVIATURAS

[0098]

ROS - especies reactivas de oxígeno

AOD - defensa antioxidante

FFA - ácidos grasos libres

Tracto gastrointestinal - tracto gastrointestinal

IMC - índice de masa corporal

IDO - indoleamina-2,3-dioxigenasa

IR - resistencia a la insulina

MAO - monoaminooxidasa

OMP - modificación oxidativa de proteínas

OS - oxidativo estrés

SOD - superóxido dismutasa

IL - interleucina

[0099] Este estudio evalúa los efectos del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato sobre el desarrollo de obesidad inducida por una dieta rica en grasas en animales de experimentación. Se establecieron las siguientes tareas:

Investigar los efectos del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato en una serie de factores antropométricos (índice de masa corporal, peso, aumento de peso) y valores bioquímicos (concentración de glucosa, nivel de insulina, actividad de la fosfatasa alcalina, contenido de albúmina) en modelos animales de obesidad.

[0100] Investigar los efectos del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato sobre las propiedades morfofuncionales del páncreas y el hígado de animales alimentados con una dieta rica en grasas.

[0101] Evaluar los efectos del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato sobre las funciones de los sistemas serotoninérgicos central y periférico (niveles de triptófano y serotonina, triptófano hidroxilasa, triptófano descarboxilasa, monoaminooxidasa y actividad de indoleamina 2,3-dioxigenasa) en modelos animales de obesidad.

[0102] Evaluar los efectos del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato sobre los procesos de radicales libres (niveles de productos primarios, secundarios y finales de la peroxidación lipídica, niveles de productos de modificación oxidativa de proteínas) y la actividad de enzimas antioxidantes clave (superóxido dismutasa, catalasa) en suero y tejido adiposo en modelos animales de obesidad.

[0103]Evaluar los efectos del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato sobre el perfil de citocinas (niveles de citocinas pro y antiinflamatorias) en suero y tejido adiposo, así como los niveles de resistina y grelina en modelos animales de obesidad.

[0104]Investigar los efectos del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato sobre la distribución de metales divalentes (zinc, cobre, manganeso, etc.) entre diferentes órganos en modelos animales de obesidad.

MATERIALES Y MÉTODOS

Desarrollo de modelos de obesidad

[0105]En los estudios se utilizaron ratas blancas sin pedigrí. Los animales se mantuvieron en un vivarium acreditado del Instituto del Centro Académico y de Investigación de Biología y Medicina de la Universidad Nacional Taras Shevchenko de Kiev de acuerdo con las reglas estándar sobre la disposición, equipamiento y mantenimiento de clínicas biológicas experimentales (vivarios). El estudio se llevó a cabo cumpliendo con las normas y recomendaciones internacionales del Convenio Europeo para la Protección de los Animales Vertebrados utilizados con Fines Experimentales y Otros Fines Científicos (Estrasburgo, 18/03/1986) y aprobado por la Comisión de Bioética del Centro Académico y de Investigación. Instituto de Biología y Medicina. Murzin, O.B., Convenio europeo para la protección de los animales vertebrados utilizados con fines experimentales y otros fines científicos / O.B. Murzin, // Libro práctico sobre fisiología humana. - Dnipropetrovsk: Editorial de la Universidad de Dnipropetrovsk, 2004. - p. 135-148.

[0106]En los experimentos se utilizaron animales con un peso inicial de 195-205±10 g mantenidos con la dieta estándar del vivarium antes de realizar modelos de obesidad. Para inducir la obesidad en animales de experimentación, se les alimentó con una dieta rica en grasas que consistía en pienso estándar (60 %), manteca de cerdo (10 %), huevos de gallina (10 %), sacarosa (9 %), maní (5 %), harina seca. leche (5 %) y aceite de girasol (1 %), Shen X. et al., Experimental Biology and Medicine. - 2010. - n° 235. - p. 47-51. Durante las primeras 4 semanas del experimento, todos los animales se mantuvieron con una dieta alta en grasas, después de lo cual se dividieron aleatoriamente en dos grupos experimentales:

- los animales del primer grupo (obesidad) continuaron comiendo su dieta alta en grasas y tuvieron acceso al agua durante las próximas 6 semanas del experimento.

- los animales del segundo grupo (obesidad solución del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato) también siguieron su dieta rica en grasas y tuvieron libre acceso al agua durante las siguientes 6 semanas del experimento. Pero cada tres días y hasta el final del experimento se les administró por vía intragástrica una solución del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato. La dosis de aspartato de zinc administrada a cada animal fue de 4,5 mg (sustancia por animal), la cual se administró mediante sonda nasogástrica en un volumen de 2 ml de solución.

[0107]También hubo un grupo de animales (control) que recibió una dieta estándar preparada por el vivarium y tuvo libre acceso al agua durante todo el experimento.

[0108]Para comprobar la presencia o ausencia del efecto del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato sobre los parámetros antropométricos y bioquímicos estudiados, se formó un grupo de animales (control solución de isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato) que comieron vivarium estándar y tuvieron libre acceso al agua durante todo el período del experimento pero cada tercer día y hasta el final del experimento a los animales se les administró por vía intragástrica el isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato. La dosis de aspartato de zinc administrada a cada animal fue de 4,5 mg (sustancia por animal), la cual se administró mediante sonda nasogástrica en un volumen de 2 ml de solución.

[0109]Los animales de todos los grupos se pesaron una vez por semana después de un ayuno nocturno. Diariamente se determinó la cantidad de alimento a consumir por los animales. Al final de un período de 10 semanas de desarrollo de modelos de obesidad, 24 horas después de la última administración del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato, los animales fueron retirados de sus jaulas y decapitados.

[0110]El índice de masa corporal (IMC) (la relación entre el peso corporal (g) y el cuadrado de la longitud corporal (cm2)) se calculó al final del experimento.

Preparación de suero sanguíneo

[0111]Se preparó suero animal a partir de sangre completa. Para eliminar las proteínas relacionadas con el fibrinógeno, la sangre se incubó a 37 °C durante 30 minutos, después de lo cual se separó cuidadosamente un coágulo de sangre de las paredes del tubo con una varilla de vidrio limpia y seca para acelerar la producción de suero. Las muestras se centrifugaron durante 15 min a 2500 g. El sobrenadante resultante (suero) se separó inmediatamente de las células sanguíneas y se congeló y almacenó a -20 °C hasta los experimentos.

Preparación de homogeneizado de tejido adiposo

[0112]Al final del experimento, los animales fueron sacrificados por decapitación. Todas las manipulaciones durante la extracción del tejido se llevaron a cabo a una temperatura de 1-4 °C.

[0113]El tejido adiposo se trituró con unas tijeras frías y luego se transfirió a un homogeneizador con una mano de teflón holgada. El tejido se homogeneizó utilizando aproximadamente 30 golpes de mortero en tampón de homogeneización frío (Tris-HCl 50 mM (pH 7,4) que contenía NaCl 130 mM). El homogeneizado primario así obtenido se centrifugó a 600 g durante 15 minutos. El sobrenadante se recogió cuidadosamente y se volvió a centrifugar a 15.000 g durante 15 minutos. A continuación, el sobrenadante se congeló y se almacenó a -80 °C hasta los experimentos.

Preparación de homogeneizado de tejido cerebral

[0114]Al final del experimento, los animales fueron sacrificados por decapitación. Todas las manipulaciones durante la extracción del órgano se llevaron a cabo a una temperatura de 1-4 °C.

[0115]Se separó la cabeza del animal del cuerpo y se cortó cuidadosamente el cráneo. Se levantó cuidadosamente el cerebro con un bisturí de la bóveda ósea, se amputaron todos los nervios craneales y se extrajo el cerebro del cráneo. El cerebro se dividió en dos partes mediante una incisión longitudinal entre los hemisferios.

[0116]El tejido cerebral se trituró con unas tijeras frías y luego se transfirió a un homogeneizador con una mano de teflón holgada. El tejido se homogeneizó utilizando aproximadamente 30 golpes de mortero en tampón de homogeneización frío (Tris-acetato 50 mM, pH 7,4, que contenía EDTA 5 mM y sacarosa al 10%). La relación tejido:tampón fue de 1:10. El homogeneizado así obtenido se centrifugó a 1500 g durante 20 minutos. A continuación, se recogió cuidadosamente el sobrenadante, se congeló y se almacenó a -80 °C hasta los experimentos.

Preparación de homogeneizado de tejido duodenal

[0117]Al final del experimento, los animales fueron sacrificados por decapitación. Todas las manipulaciones durante la extracción del órgano se llevaron a cabo a una temperatura de 1-4 °C.

[0118]Después de abrir el abdomen, se extrajo el duodeno del cuerpo del animal y se lavó en una placa de Petri en una solución de cloruro de sodio al 0,9 %. La mucosa duodenal se aisló mecánicamente usando un bisturí y luego se homogeneizó en tampón Tris-HCl 10 mM, pH 7,4, que contenía EDTA 1 mM y sacarosa 0,25 M. La relación tejido:tampón fue de 1:10. El homogeneizado así obtenido se centrifugó a 1500 g durante 10 minutos. A continuación, se recogió cuidadosamente el sobrenadante, se congeló y se almacenó a -80 °C hasta los experimentos.

Determinación de la concentración de glucosa en suero

[0119]La concentración de glucosa se midió en la sangre de animales que habían ayunado durante al menos 2 horas. Se extrajo sangre de la vena de la cola mediante un catéter. La concentración de glucosa se determinó utilizando un medidor de glucosa GLUTOFOT-II (Ucrania) según las instrucciones del fabricante. Prueba médica "Glyukofot-M": [manual de usuario de "Glyukofot-M - Hemoglan]. - Kiev: Norma, 2008. - 12 p. La tira reactiva contenía todos los componentes reactivos necesarios para determinar la concentración de glucosa mediante el método de la glucosa oxidasa, incluyendo la absorción de las enzimas glucosa oxidasa y peroxidasa en una membrana hidrófila porosa. La formación de un complejo coloreado fue el resultado de la reacción. Se aplicó una gota de sangre completa a la tira y se dejó a temperatura ambiente durante 30 segundos. A continuación, se lavó la tira con agua destilada y colocado en un glucómetro, la concentración de glucosa se expresó en mmol/L.

Determinación de los niveles de insulina, interleucinas y adipocinas en suero y homogeneizado de tejido adiposo

[0120]Los niveles de insulina, interleucinas y adipocinas se determinaron mediante el método inmunoenzimático (Halenova TI et al. RSC Adv. 2016;6: 100046-55), que se llevó a cabo en microplacas con capacidad de sorción de acuerdo con el procedimiento de prueba de proteínas solubles. La solución de antígeno, previamente diluida con tampón NaHCOs 0,1 M, pH 9,6, hasta una concentración de 10 pg/ml, se incubó en los pocillos de la placa durante 12 horas a 4 °C. El material no unido se eliminó lavando los pocillos tres veces con tampón TBS, primero con Tween-20 al 0,05 % y luego sin Tween-20. Los sitios de unión no específicos se bloquearon añadiendo una solución de leche desnatada al 5 % o una solución de albúmina sérica bovina al 1 % a los pocillos de la placa e incubándolos durante 60 minutos a 37 °C. Después de la incubación, los pocillos se lavaron tres veces con TBS, primero con Tween-20 al 0,05 % y luego sin Tween-20. Los anticuerpos primarios se diluyeron en TBS de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se incubaron con el antígeno durante 60 minutos a 37 °C. Después de lavar con tampón de trabajo TBS, primero con la adición de Tween-20 al 0,05 %, luego sin Tween-20, se añadió el conjugado de anticuerpos secundarios a los pocillos y se incubó durante 60 min a 37 °C. Al igual que con los anticuerpos primarios, los anticuerpos secundarios se diluyeron en TBS de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después del procedimiento de lavado, se utilizó diclorhidrato de fenildiamina como sustrato en fósforo 0,05 M. A cada pocillo se añadió tampón fosfato-citrato, seguido de la adición de peróxido de hidrógeno al 0,3 %. Después de 10 minutos, el tiempo de reacción necesario para el desarrollo, se añadió H2SO42,5 n.

[0121]La absorbancia a una longitud de onda de 492 nm se midió utilizando un espectrofotómetro de microplacas mQuant (BioTek Instruments).

Determinación de la actividad de la fosfatasa alcalina sérica

[0122]La actividad de la fosfatasa alcalina sérica en los animales se midió espectrofotométricamente utilizando un analizador bioquímico Microlab 300 y kits de prueba estándar PLIVA-Lachema Diagnostika (República Checa). Kit de prueba // Pliva-Lachema Diagnostika. - 2008.

[0123]Como resultado de la escisión hidrolítica del fosfato de p-nitrofenilo catalizada por la fosfatasa alcalina, se forma p-nitrofenol, que da un color amarillo intenso en medio alcalino. La densidad óptica de las muestras se midió a una longitud de onda de 405 nm. La actividad de la fosfatasa alcalina se expresó en unidades relativas.

Determinación de albúmina sérica

[0124]Los niveles de albúmina sérica en los animales se determinaron espectrofotométricamente utilizando un analizador de bioquímica Microlab 300 y kits de prueba estándar PLIVA-Lachema Diagnostika (República Checa). Kit de prueba // Pliva-Lachema Diagnostika. - 2008.

Determinación de la actividad de superóxido dismutasa sérica

[0125]Para medir la actividad de la superóxido dismutasa se utilizó un método basado en la capacidad de esta enzima para inhibir la autooxidación de la adrenalina. Syrota TV Preguntas de med. clin. - 1999. - V. 5, n° 3. - p. 263-272.

[0126]Se añadieron alícuotas de suero a los pocillos de la microplaca que contenían tampón bicarbonato 0,2 M, pH 10. La reacción se inició añadiendo solución de adrenalina al 0,1 % en cada pocillo. Se añadió un volumen relevante de tampón a los pocillos "en blanco" a los que no se añadió ninguna muestra de prueba. La densidad óptica se midió a una longitud de onda de 347 nm usando un espectrofotómetro de microplacas mQuant (BioTek Instruments) en el minuto 4 y 8 después de agregar adrenalina a los pocillos. La actividad enzimática se expresó en unidades relativas/min/mg.

Determinación de la actividad catalasa

[0127]Para determinar la actividad catalasa se utilizó un método espectrofotométrico que depende de la capacidad del peróxido de hidrógeno para formar un complejo coloreado estable con las sales de molibdeno. Korolyuk M.A. et al., Lab. Business. - 1988. - n° 1. - p. 44-67. Durante la incubación, la concentración de peróxido de hidrógeno disminuyó debido a la actividad enzimática mediada por catalasa en la muestra de prueba. Se utilizó una solución de molibdato de amonio al 4 % y peróxido de hidrógeno al 0,03 %. La reacción se inició añadiendo la muestra de prueba a peróxido de hidrógeno al 0,03 %. En lugar de proteína, se añadió un volumen apropiado de agua destilada a la muestra en blanco. La reacción se detuvo después de 10 minutos mediante la adición de una solución de molibdato de amonio al 4 % al medio de incubación. La densidad óptica se midió a una longitud de onda de 410 nm utilizando un espectrofotómetro de microplacas mQuant (BioTek Instruments). La actividad catalasa se calculó utilizando una curva de calibración y se expresó como pmol de H2O2/mg de proteína durante x min.

Determinación de los niveles de conjugados dienos y bases de Schiff en homogeneizados de suero y tejido adiposo.

[0128]Se colocó una alícuota de la muestra de prueba que contenía 0,1-0,5 mg de proteína en un homogeneizador de vidrio hermético, al que se añadió una mezcla de heptano/alcohol isopropílico en una proporción de 1:1 y se homogeneizó durante 10 minutos. A continuación, las muestras se centrifugaron a 1000 g durante 15 minutos en tubos de ensayo cerrados con un tapón hermético. La fracción sobrenadante se recogió cuidadosamente y se añadió agua destilada para separar las fases de heptano y alcohol isopropílico. Los niveles de bases de Schiff se determinaron en la fase superior de heptano midiendo la densidad óptica de las muestras a una longitud de onda de excitación de 360 nm y una longitud de onda de emisión de 420 nm usando un espectrofotómetro. Los niveles de bases de Schiff representaron el número de unidades por 1 mg de proteína.

[0129]Para determinar los niveles de conjugados de dieno, se tomó una alícuota de la fase de heptano a la que se le añadió etanol al 96 % y las muestras se mezclaron completamente. La densidad óptica de las muestras se midió a una longitud de onda de 233 nm utilizando un espectrofotómetro. Los niveles de conjugados de dieno se calcularon utilizando un coeficiente de extinción molar (2,2x105 cirr1 x M'1) para dienos conjugados que se producen cuando se oxidan ácidos grasos superiores poliinsaturados y se expresan en nmol por mg de proteína. Nedzvetsky V et al., J Diabetes Metab.

2012;3(8): 1-9.

Determinación de los niveles séricos de productos activos de TBA y homogeneizados de tejido adiposo

[0130]Se añadió una alícuota de la muestra de prueba a la muestra y se añadió un volumen igual de ácido tricloroacético (TCA) al 17 %. Las muestras se centrifugaron a 1000 g durante 15 min. Nedzvetsky V et al., J Diabetes Metab. 2012;3(8): 1-9. Se añadió una solución de ácido tiobarbitúrico al 0,8%al sobrenadante y se incubó en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos antes de que se desarrollara el color. La densidad óptica de las muestras se midió a una longitud de onda de 532 nm utilizando un espectrofotómetro. La concentración de productos activos de TBA se expresó en nmol por 1 mg de proteína y se calculó utilizando un coeficiente de extinción molar (1,56 x 105 cm-1 x M-1).

Determinación de los niveles de productos de modificación oxidativa de proteínas.

[0131]La estimación de la intensidad de la modificación oxidativa de las proteínas se basa en la reacción entre los carbonilos de las proteínas y las bases de Schiff y la 2,4-dinitrofenilhidracina (DNPH) con la formación de 2,4-dinitrofenilhidrazonas de naturaleza neutra y básica. Vartanyan L.S., Gurevich S.M. Biochemistry.-1989.-Vol. 54, n° 6. - p.

1020-1025.

[0132]Se añadió una alícuota de la muestra de ensayo (0,2 mg de proteína) a los tubos de ensayo que contenían tampón fosfato potásico 0,15 M, pH 7,4. Las proteínas se precipitaron añadiendo una solución de TCA al 20 %. Después de que las muestras se centrifugaran a 1000 g durante 15 minutos, se añadió una solución 0,1 M de 2,4-DNPH en HCl 2M al precipitado de proteínas desnaturalizadas. Después de una hora de incubación a temperatura ambiente, el precipitado se lavó tres veces con una mezcla de etanol:acetato de etilo (1:1) para eliminar los lípidos y el 2,4-DNPH, que no estaban unidos a carbonilos. El precipitado así lavado se secó y se disolvió en urea 8 M en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos.

[0133]Para determinar los productos de aldehído y cetona de la modificación oxidativa de proteínas, se midió la densidad óptica a una longitud de onda de 356 nm y 370 nm, respectivamente. Los valores obtenidos se recalcularon utilizando un coeficiente de extinción molar apropiado.

Determinación de los niveles de serotonina y triptófano en el cerebro y homogeneizados duodenales y suero.

[0134]Se mezclaron alícuotas de homogeneizados de suero y tejido con ácido perclórico 0,4 M en una proporción de 1:5 para precipitar las proteínas. Las muestras se incubaron a 4 °C durante 60 minutos y luego se centrifugaron a 800 g durante 5 minutos en una centrífuga refrigerada a 4 °C. Después de la separación de fases, se recogió el sobrenadante y se ajustó el pH a 5-6 con KOH 2 M. Las muestras se reprecipitaron mediante centrifugación. El sobrenadante se aplicó a una columna KM-Sepharose previamente equilibrada con tampón fosfato sódico 0,01 M, pH 6,2. El material unido se eluyó a temperatura ambiente usando tampón 1 (tampón fosfato sódico 0,01 M, pH 6,2) y tampón 2 (tampón fosfato sódico 0,03 M, pH 6,2). El triptófano se eluyó utilizando el tampón 1 y la serotonina se eluyó utilizando el tampón 2.

[0135]Los niveles de triptófano se midieron con un espectrofluorómetro a una longitud de onda de excitación de 295 nm y una longitud de onda de absorción de 550 nm, frente a una muestra en blanco que, en lugar de la muestra de prueba, contenía un volumen correspondiente de agua destilada.

[0136]Los niveles de serotonina se midieron con un espectrofluorómetro a una longitud de onda de excitación de 359 nm y una longitud de onda de absorción de 485 nm, frente a una muestra en blanco que, en lugar de la muestra de prueba, contenía un volumen correspondiente de agua destilada. Gaitonde MK // Biochemistry. S. - 1974. - Vol. 139. - p. 625-631. Maksymenko EG, Savchenko VN // Visnyk de VN Karazin Kharkiv Nat. University. Medicine. - 2000. - 1, n° 494. - p. 40 43. H. Weissbach et al., / J Biol Chem // - 1957. - Vol. 230, n° 2.- p. 865-71.

Determinación de la actividad triptófano hidroxilasa en homogenados cerebrales y duodenales

[0137]La actividad triptófano hidroxilasa se determinó como describe Donald M. Kuhn, et al., Biochemistry. - 1980. -Vol. 77. - p. 4688-4691. Los homogeneizados de tejido se descongelaron a temperatura ambiente y se centrifugaron a 12000 g durante 30 min. El sobrenadante se utilizó en estudios posteriores.

[0138]Se preparó un medio de incubación en tubos de microcentrífuga Ependorf que contenían Tris-HCl 500 mM, pH 7,4, ditiotrietol 20 mM, CaCh 1 mM, L-triptófano 4 mM y 50 |jg de catalasa, al que luego se añadió una alícuota del sobrenadante. Las muestras se incubaron en un termostato a 37 °C durante 15 min. La reacción se detuvo precipitando proteínas con HCO46M. Para separar las proteínas precipitadas, las muestras se centrifugaron a 600 g durante 5 minutos.

[0139]La densidad óptica de las muestras se midió a 295/540 nm con un espectrofluorómetro. Como control se utilizó una muestra en blanco que contenía el medio de incubación y agua destilada.

Determinación de la actividad de la indolamina-2,3-dioxigenasa en homogenados cerebrales y duodenales

[0140]La actividad de la indolamina-2,3-dioxigenasa se determinó como describen Y. Kudo, C.A.R. Boyd, I.L. Sargent et al. // mol. Human reproduction. - 2000. - Vol. 6, n° 4. - p. 369-374. Los homogeneizados de tejido se descongelaron a temperatura ambiente y se centrifugó a 12.000 g durante 30 min. El sobrenadante se utilizó en estudios posteriores.

[0141]Se preparó un medio de incubación en tubos de microcentrífuga Ependorf que contenían tampón fosfato de potasio 100 mM, pH 7,5, L-triptófano 5 mM, ascorbato 10 mM, azul de metileno 0,2 mM, catalasa 50 mg, al que luego se añadió una alícuota del sobrenadante. Las muestras se incubaron en un termostato a 37 °C durante 30 min. La reacción se detuvo precipitando proteínas con ácido tricloroacético al 10 %. Para separar las proteínas precipitadas, las muestras se centrifugaron a 600 g durante 5 minutos. A continuación, se añadió Tris-Hcl 1 M, pH 7,0 a la alícuota del sobrenadante.

[0142]La densidad óptica de las muestras se midió a 360 nm usando un espectrofluorómetro versus una muestra en blanco que contenía el medio de incubación y agua destilada.

Determinación de la actividad de la monoaminooxidasa sérica.

[0143]La actividad de la monoaminooxidasa sérica se determinó utilizando un método descrito por Balakleevsky A.I. // Lab. business. - 1976. - 3. - p. 151-152. El método consiste en la formación de benzaldehído a partir de clorhidrato de bencilamina bajo la acción de MAO. El benzaldehído interactúa con la 2,3-dinitrofenilhidrazina y forma hidrazona insoluble que puede precipitar mediante centrifugación. El precipitado de hidrazona, a su vez, forma un compuesto estable de color frambuesa en medio alcalino, cuyo contenido puede determinarse espectrofotométricamente.

[0144]Se preparó un medio de incubación en tubos de microcentrífuga Ependorf que contenían tampón fosfato 0,2 M, pH 7,4, agua destilada y una solución al 1 % de clorhidrato de bencilamina. Una muestra en blanco no contenía clorhidrato de bencilamina. La reacción se inició añadiendo una alícuota de suero. Las muestras se incubaron en un termostato a 37 °C durante 3 horas. La reacción se detuvo precipitando proteínas con ácido tricloroacético al 10 %. Para separar las proteínas precipitadas, las muestras se centrifugaron a 600 g durante 5 minutos. Al sobrenadante resultante se le añadió una solución al 0,1 % de 2,3-dinitrofenilhidrazina preparada en HCl 2M. Las muestras se agitaron y se incubaron durante 25 minutos a temperatura ambiente. Después de eso, se precipitó la hidrazona mediante centrifugación de las muestras a 600 g durante 25 minutos. Se añadieron secuencialmente NaOH 3M y etanol al 96 % al precipitado de hidrazona y se observó el desarrollo de un color frambuesa.

[0145]La densidad óptica de las muestras se midió usando un espectrofluorómetro con excitación a 460 nm versus etanol.

Análisis morfofuncional de tejidos pancreáticos y hepáticos

[0146]Al final del experimento, los animales fueron sacrificados por decapitación. El hígado y el páncreas preparados de 0,5 a 0,5 cm de tamaño se colocaron inmediatamente en un fijador. Los órganos se fijaron en una solución de paraformaldehído al 4 % a una temperatura de 25 °C durante 72 horas. Después de la fijación, las piezas se enjuagaron con agua del grifo. A continuación, se deshidrató el material. Esto se logró pasando los trozos de órganos por concentraciones crecientes de alcohol (70 % > 80 % > 90 % > 96 %) dejándolos durante un día en cada concentración. Finalmente, una vez reemplazada el agua por alcohol al 96 %, el material se colocó en dioxano durante 15 minutos, y luego en xileno durante 15 minutos. Después de la limpieza completa, el material se colocó en un baño de parafina (mezcla de parafina y xileno en una proporción de 1:1) en un termostato durante 30 minutos a 37 °C. A continuación, se sumergió el material en dos cambios de parafina (30-35 minutos) en un termostato a 56 °C y se produjeron bloques de parafina.

[0147]Se cortó una serie de secciones histológicas de tejido de 5 pm de espesor utilizando un micrótomo deslizante MS-2 y se colocaron en portaobjetos de vidrio tratados con una mezcla 1:1 de proteína y glicerol.

[0148]Las preparaciones secas se tiñeron con hematoxilina y eosina. Previo a la tinción, las secciones fueron desparafinadas en 2 cambios de xileno durante 5 minutos y pasadas por grados de alcohol decrecientes (96 % > 90 % > 80 % > 70 % durante 3 minutos en cada uno) y finalmente agua destilada durante 5 minutos. Las secciones se tiñeron con hematoxilina de Bomer durante 1,5 minutos, luego se lavaron con agua corriente durante 15-20 minutos y se tiñeron con eosina durante 1 minuto. Una vez teñidas, las secciones se deshidrataron nuevamente en alcoholes de 70 % y 96 % (30 segundos en cada uno) y se aclararon en dioxano y xileno durante 2,5 minutos. Las secciones teñidas se encerraron en Canada Balsam y se cubrieron con cubreobjetos. Los núcleos de las células tenían un color azul violeta y el citoplasma era rosado.

[0149]Para realizar una reacción histoquímica para determinar el nivel de fibrosis hepática, se utilizó el método de tinción con picrofucsina de Van Gieson. Para ello, primero se empaparon las secciones con agua y luego se volvieron a teñir con hematoxilina de Bomer durante 3-4 minutos. A continuación, las secciones se enjuagaron con agua destilada y se tiñeron con picrofucsina de Van Gierson durante 3 minutos. Una vez teñidas, las secciones se enjuagaron con agua destilada, se deshidrataron en alcohol al 96 %, se aclararon con dioxano y xileno y se encerraron en un bálsamo bajo un cubreobjetos. Como resultado, los núcleos de los hepatocitos tenían un color marrón oscuro, las fibras de colágeno eran rojas y el citoplasma era amarillo. Todos los parámetros se midieron utilizando el software ImageJ.

Determinación de la concentración de proteínas

[0150]La concentración de proteínas se midió utilizando el ensayo de proteínas de Bradford. Bradford MM. Anal Biochem. 1976;86: 193-200. Para medir la concentración de proteínas se añadió NaOH al 10 %, agua destilada y reactivo de Bradford a la muestra. El reactivo de Bradford se preparó mezclando la solución inicial (95 % de etanol, 85 % de H<3>PO<4>y colorante Coomassie Brilliant Blue) con 95%de etanol y 85%de H<3>PO<4>, y ajustando la mezcla resultante al volumen deseado con agua destilada.

[0151]La absorbancia se midió espectrofotométricamente a 595 nm frente a una muestra de control que contenía agua destilada en lugar de la muestra de prueba. La concentración de proteína se determinó mediante una curva de calibración y se expresó en mg/ml.

Procesamiento estadístico de los resultados

[0152]El procesamiento estadístico de los resultados obtenidos se realizó mediante los métodos de estadística de variación y análisis de correlación utilizando el software OrginLab Orgin<®>Pro 9.1 y StatSoft STaStica<®>10. Brandt Z. Métodos estadísticos para observaciones. - M.: Mir, 1975. - 312 p. La hipótesis de distribución normal de las muestras se probó mediante la prueba de ShapiroWilk. Si una muestra cumplía los criterios de distribución normal, la importancia de las diferencias entre muestras se determinaba mediante la prueba t de Student. Si una muestra no cumplía con los criterios de distribución normal, la importancia de las diferencias entre muestras se determinaba mediante la prueba U de Mann-Whitney. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando p<0,05.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Efectos bioquímicos y antropométricos del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato en modelos animales de obesidad

[0153]Según los conceptos modernos, el tejido adiposo, que produce una amplia gama de sustancias biológicamente activas, participa activamente en la patogénesis de la obesidad. Por lo tanto, el sobrepeso que surge debido al aumento de los depósitos de grasa se considera no solo como una consecuencia de los trastornos metabólicos durante el desarrollo de la obesidad, sino también como un factor importante que provoca y complica enormemente el curso de la enfermedad, contribuyendo al desarrollo de una serie de de los trastornos relacionados con la obesidad.

[0154]Para evaluar los efectos del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato sobre el desarrollo de obesidad inducida por el consumo de alimentos ricos en grasas, se evaluaron algunos valores antropométricos en modelos animales de obesidad y en animales tratados con isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato.

[0155]Un signo morfológico característico del desarrollo de la obesidad es un aumento significativo del peso corporal debido a la acumulación y redistribución del tejido adiposo. Para confirmar el desarrollo de obesidad, primero se determinó el índice de masa corporal (IMC) o índice de Quetelet, que es el peso corporal en kilogramos dividido por el cuadrado de la altura en metros. Novelli E., Diniz Y., Galhardi C. Anthropometrical parameters and markers of obesity in rats // Laboratory Animals. - 2007. - n° 41. - p. 111-119. El IMC permite evaluar la relación entre la masa corporal y la altura y, por tanto, evaluar indirectamente si la masa es insuficiente, normal o excesiva. Además, se utiliza el IMC como valor integral, lo que permite caracterizar la composición corporal y el grado de depósito de grasa, debido a que el carácter de distribución del tejido adiposo en el cuerpo determina el riesgo de desarrollar complicaciones metabólicas asociadas a la obesidad, las cuales deben ser consideradas. al examinar a pacientes obesos. El IMC no sólo se utiliza para clasificar la obesidad sino también para determinar los riesgos de desarrollar enfermedades relacionadas con la obesidad.

[0156]Los datos obtenidos durante el experimento muestran (Tabla 8) que en la décima semana del experimento, el índice de masa corporal medio de los animales de control fue de 0,60 g/cm<2>, valor que estaba dentro de un rango de referencia para animales de este grupo de edad. Novelli E., Diniz Y., Galhardi C. Anthropometrical parameters and markers of obesity in rats // Laboratory Animals. - 2007. - n° 41. - p. 111-119. El IMC de los animales que consumieron una dieta rica en grasas fue 1,14 veces mayor que el IMC de los animales del grupo de control (0,71 g/cm<2>). Cabe señalar que el índice de masa corporal de las ratas que recibieron el isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato durante el experimento fue inferior al de los animales obesos, pero ligeramente superior a los valores de control (0,65 g/cm<2>). El resultado obtenido indica que el isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato tiene un efecto positivo sobre el estado metabólico general de los animales y sienta las bases para futuros estudios destinados a descubrir los mecanismos de los efectos del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato sobre la obesidad.

[0157]Dado que el IMC se calcula en función del peso, una disminución en el valor del IMC puede estar directamente relacionada con el menor peso de los animales que recibieron el isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato. Por lo tanto, se investigó más a fondo si la administración del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato afectaba el peso y el aumento de peso en modelos animales de obesidad. Los datos obtenidos en el experimento muestran (FIG. 5)que la dinámica del aumento de peso de los animales de los grupos experimentales difería significativamente. Por lo tanto, los animales que se mantuvieron con una dieta alta en grasas y recibieron el isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato ganaron menos peso que los animales que solo fueron alimentados con una dieta alta en grasas. Una diferencia particularmente notable en el aumento de peso de los animales de ambos grupos se observó a partir de la cuarta semana del experimento. El aumento en el peso corporal de los animales que comieron una dieta rica en grasas alcanzó el 103 % al final del experimento, mientras que los animales que recibieron inyecciones intragástricas del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato ganaron casi tanto peso como los animales del grupo de control (62 %).

[0158]Se sabe que el desarrollo de la obesidad, debido a la alteración del trabajo coordinado de una serie de sistemas neurotransmisores y hormonales del cuerpo, conduce a alteraciones a nivel de control del apetito y regulación de la sensación de saciedad, lo que promueve una ingesta excesiva de alimentos y a menudo va acompañado del desarrollo de hiperfagia, un estado de deseo anormalmente grande de equivalente energético de comida que excede las necesidades energéticas del cuerpo. L. Zhou, G. Sutton, J. Rochford. // Cell Metabolism. - 2007. - Vol. 6, n° 5. - p. 398 405.

[0159]Para determinar los posibles mecanismos del efecto de disminución del peso corporal de los animales que recibieron el isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato, se analizó la cantidad de alimento que consumieron los animales. Tabla 8.

[0160]Al comparar los datos calculados para todos los grupos experimentales, se puede ver que no hay diferencias particulares en la cantidad de alimento que los animales comieron en promedio por día. Así, los animales del grupo de control y del grupo de animales obesos consumieron alrededor de 35 g de alimento al día. Pero cabe señalar aquí que los animales del grupo de control se mantuvieron con una dieta estándar, mientras que los animales del grupo de modelos de obesidad inducida por la dieta consumieron una dieta especialmente preparada con alto contenido de grasas, cuyo contenido calórico era significativamente mayor.

Tabla 8 Algunos valores antropométricos, la cantidad y contenido calórico de los alimentos (M ± m, n = 10)

[0161]El análisis de los resultados obtenidos, teniendo debidamente en cuenta el contenido calórico de los alimentos consumidos por los animales, muestra una diferencia significativa en los valores. A pesar de que los animales del grupo de control y del grupo de modelos de obesidad inducida por la dieta comieron la misma cantidad de alimentos, el contenido calórico de los alimentos difirió casi el doble. Un resultado obtenido del grupo al que se le administró el isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato parece bastante interesante. Así, los animales del grupo de control y del grupo de modelos de obesidad inducida por la dieta comieron cantidades más pequeñas de dietas estándar y ricas en grasas, respectivamente.

[0162]La dinámica del contenido calórico de los alimentos consumidos por los animales durante las 10 semanas del experimento se muestra en laFIG. 6.

[0163]Los datos obtenidos sugieren que el isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato tiene un efecto sobre la sensación de saciedad porque, al tener libre acceso a los alimentos, los animales inyectados con isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato consumieron significativamente menos alimentos en comparación con los animales que fueron mantenidos sólo con una dieta alta en grasas. Una disminución en la cantidad de alimento consumido y, en consecuencia, un aumento de peso insignificante en los animales que recibieron el isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato en comparación con los animales en el grupo de modelos inducidos por la dieta, puede explicarse por los efectos directos e indirectos del zinc sobre homeostasis energética.

[0164]Así, resumiendo los resultados de esta fase del estudio, la administración del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato provocó una disminución en la cantidad de alimento consumido por día, lo que, en consecuencia, fue acompañado por un aumento de peso menos pronunciado en los animales y una normalización de la su índice de masa corporal en comparación con valores similares en animales obesos que no fueron tratados con el isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato.

[0165]La detección temprana de estados carenciales de Zn es de suma importancia para prevenir la aparición y desarrollo de trastornos metabólicos. Un signo de laboratorio de deficiencia de zinc es una disminución de sus niveles en el plasma sanguíneo (suero), pero los niveles plasmáticos de zinc son lábiles y están influenciados por muchos factores.

[0166]Existen otros enfoques para determinar el estado del zinc. En particular, se basan en la medición de la concentración de proteínas dependientes del zinc y, en primer lugar, de enzimas como la anhidrasa carbónica, la superóxido dismutasa, la lactato deshidrogenasa y la fosfatasa alcalina, así como la metalotioneína, una proteína sérica fijadora de retinol, en plasma (suero). Uno de los primeros marcadores de deficiencia de zinc es una disminución en la actividad de la fosfatasa alcalina sérica y de la anhidrasa carbónica. Como resultado, se desarrollan en el tracto gastrointestinal úlceras por estrés causadas por un alto contenido de una enzima que contiene zinc como la anhidrasa carbónica en la mucosa. Por lo tanto, para determinar indirectamente si el desarrollo de la obesidad va acompañado de cambios en el estado del zinc, se estudió la actividad de la fosfatasa alcalina en el suero sanguíneo de animales obesos y de animales tratados con el isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato.

[0167]Se observó una disminución significativa en la actividad de esta enzima en animales mantenidos con una dieta rica en grasas (Tabla 9). Por tanto, la actividad enzimática en estos animales fue 1,5 veces menor que en los animales del grupo de control. En animales tratados con isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato, la actividad de la fosfatasa alcalina fue mayor tanto en el grupo de modelos de obesidad inducida por dieta como en el grupo de control.

[0168]Por tanto, los resultados obtenidos confirman indirectamente la deficiencia de zinc en modelos animales de obesidad y los niveles séricos normales de zinc en animales que recibieron el isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato.

[0169]El tracto gastrointestinal mantiene la homeostasis del zinc en todo el cuerpo. No existen verdaderos depósitos de este oligoelemento en el cuerpo humano. El zinc absorbido desde el intestino ingresa al torrente sanguíneo. La sangre total contiene aproximadamente 7-8 mg/L de zinc; además, aproximadamente 2/3 de esta cantidad es transportada por los glóbulos rojos. En el plasma, alrededor del 80 % del zinc está unido a la albúmina y el otro 20 % está unido a la p2-macroglobulina y a la transferrina. Los datos publicados confirman la dependencia de los niveles de este oligoelemento de la concentración de albúmina en el plasma sanguíneo. Brown, K.H. International Zinc Nutrition Consultative Group (IZiNCG) documento técnico n.° 1. Assessment of the risk of zinc deficiency in populations and options for its control / K.H. Brown, J.A. Rivera, Z. Bhutta [et al.] // Food Nutr. Bull. - 2004. - Vol. 25. - p. 99-203.

[0170]Por lo tanto, se investigaron más a fondo los niveles de albúmina en modelos animales de obesidad no tratados y en animales obesos tratados con isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato. Los datos disponibles del experimento muestran que la patogénesis de la obesidad va acompañada de una disminución de los niveles de albúmina sérica en los animales. Al mismo tiempo, la administración del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato no tuvo efecto sobre los valores de albúmina, que permanecieron similares a los valores en animales obesos no tratados (Tabla 9).

Tabla 9 Bioquímica sérica de animales experimentales (M±m, n=10)

[0171]Teniendo en cuenta que la albúmina actúa como la principal proteína transportadora de zinc, una disminución en su concentración provocará una interrupción en el suministro oportuno de zinc a los órganos, incluido el hígado, donde se produce la síntesis de las principales proteínas que contienen zinc.

[0172]En general, este resultado es totalmente consistente con una disminución en la actividad de la fosfatasa alcalina establecida anteriormente.

[0173]También se ha descubierto que el isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato tiene un efecto positivo sobre el metabolismo de los lípidos en el cuerpo. La disminución de los niveles de triglicéridos, colesterol y ácidos grasos libres en el suero de los animales que fueron alimentados con una dieta rica en grasas y tratados con el isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato fue casi al mismo nivel que en el grupo de animales de control.

[0174]La patogénesis de la obesidad por trastornos metabólicos, principalmente debidos a alteraciones en el metabolismo de los hidrocarburos, suele ir acompañada de un aumento de los niveles de glucosa que, si permanecen altos durante mucho tiempo, desencadenan una serie de procesos patológicos y se convierten en un factor importante que induce el desarrollo de resistencia a la insulina y diabetes. Hoy en día, es un hecho comprobado que existe una relación entre los cambios en los niveles de oligoelementos, en particular el zinc, y la aparición de prediabetes y, en ausencia de una corrección farmacológica adecuada, el desarrollo de diabetes. Según los resultados de la investigación, las concentraciones de la mayoría de los oligoelementos en el organismo son constantes, pero en el caso del zinc se ha demostrado una disminución de sus niveles en el suero sanguíneo de mujeres con prediabetes. Se sabe que este elemento desempeña un papel importante en la síntesis de insulina en las células beta del páncreas y también mejora la susceptibilidad de los tejidos a esta hormona. Chausmer, A.B. Zinc, insulin and diabetes. . J. Am. Coll. Nutr. 1998, 17,109 115.

[0175]En vista de lo anterior, se investigaron los efectos del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato sobre las concentraciones de glucosa y los niveles de insulina en el suero sanguíneo de animales que comían una dieta rica en grasas.

[0176]Según la literatura, los niveles de glucosa en sangre en ayunas dentro del rango de 3,5 a 5,5 mmol/L se consideran normales. Un aumento de este valor durante un determinado período de tiempo a 7,0 mmol/l o más se considera un estado de hiperglucemia y puede ser un predictor del desarrollo de diabetes mellitus.

[0177]Los niveles de glucosa sérica en animales del grupo control y animales del grupo control que recibieron el isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato estuvieron dentro de los valores de referencia (Tabla 10). El desarrollo de la obesidad estuvo acompañado de un ligero aumento en los niveles de glucosa, que se normalizaron mediante la administración del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato.

[0178]El efecto del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato sobre los niveles de glucosa puede estar directamente relacionado con su capacidad para estimular el movimiento del transportador de glucosa desde los compartimentos celulares internos hasta las membranas de los adipocitos, lo que contribuye a mejorar el transporte intracelular de glucosa. También se ha descubierto que el isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato aumenta la fosforilación de tirosina de la subunidad p del receptor de insulina, mejorando así el transporte de glucosa en ausencia de insulina. Los datos indican que el isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato puede actuar como inhibidor de la tirosina-IB-fosfatasa, una enzima implicada en la supresión de la señalización de la insulina.

Tabla 10. Concentraciones de glucosa sérica y niveles de insulina en animales de experimentación (M ± m, n=10)

[0179]Un aumento de las concentraciones de glucosa en la obesidad puede ser consecuencia de una disminución de la secreción de insulina en las células p del páncreas o de su utilización inadecuada por los tejidos del cuerpo. Los niveles elevados de glucosa en la sangre y otros fluidos corporales provocan un aumento de la presión osmótica que resulta en el desarrollo de diuresis osmótica (aumento de la pérdida de agua y sales a través de los riñones), lo que provoca deshidratación del cuerpo y deficiencias de sodio, potasio y calcio y cationes de magnesio, aniones de cloro, fosfatos e hidrocarbonatos. Además, los niveles elevados de glucosa provocan una glicosilación no enzimática de proteínas y lípidos, cuya intensidad es directamente proporcional a las concentraciones de glucosa. Como consecuencia de esto, las funciones de muchas proteínas vitales se ven afectadas, lo que resulta en diversos cambios patológicos en el cuerpo. Skybchyk V. // Periódico médico ucraniano. - 2006. - N°6. - p. 6l-68. Campos. // Postgrado en Medicina. - 2012. - n° 126. - p. 90-97.

[0180]Teniendo en cuenta los cambios en los niveles de glucosa sérica en animales, la siguiente fase de este estudio fue determinar los niveles de insulina. Además, el nivel de insulina sérica es un parámetro importante en el diagnóstico del desarrollo de resistencia a la insulina y prediabetes. En la obesidad y el síndrome metabólico, la hiperinsulinemia a menudo es causada por una producción y secreción excesivas de insulina en las células p del páncreas, que es una respuesta compensatoria a una disminución en la sensibilidad de los tejidos periféricos a la acción de la insulina. Sin embargo, en etapas posteriores del desarrollo de la diabetes mellitus tipo 2, los niveles séricos de insulina se reducen significativamente, lo que está directamente relacionado con una capacidad deficiente de las células p para producir insulina, un procesamiento deficiente de la proinsulina y la secreción de insulina madura, así como una reducción. en el número de células secretoras y depósito de amiloide en los islotes de Langerhans. Al mismo tiempo, la disfunción de las células p en desarrollo provoca una mayor progresión de la diabetes mellitus. Boden. // Diabetes. - 1997. - Vol. 46, n°3.-p. 3-10. Robertson RP et al. // Diabetes mellitus. - 2000. - p. 125-132.

[0181]Se encontró un aumento en los niveles séricos de insulina en animales obesos y un efecto normalizador del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato sobre el parámetro estudiado en el grupo de animales mantenidos con una dieta rica en grasas y que recibieron el isótopo estable Zn-64 en aspartato. forma. Cabe destacar que la administración del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato a los animales del grupo de control provocó un ligero aumento en los niveles de insulina.

[0182]El efecto del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato sobre los niveles de insulina puede estar asociado con la participación directa de este oligoelemento en los procesos de síntesis, deposición y liberación de insulina de las células p en los islotes de Langerhans así como su capacidad para inhibir la acción de la insulinasa. Se sabe que el zinc participa en la formación de proinsulina hexamérica y contribuye a la cristalización de la insulina. Se ha demostrado que los iones de zinc contribuyen a la incorporación de la insulina al complejo de transporte que asegura su llegada a las células diana. Otro posible mecanismo fue establecido en 1980 por Caulston y Dandona, quienes demostraron que el zinc tiene un efecto potente y estimulante, independiente y complementario de la acción de la insulina, sobre la lipogénesis en adipocitos de rata. Este descubrimiento confirmó la implicación del zinc en el control de los efectos de la insulina, ya que este catión se secreta junto con la insulina en respuesta a niveles elevados de glucosa.

[0183]Además, el zinc desempeña un papel importante en la protección de la insulina y las células beta pancreáticas de los radicales libres, ya que es un componente estructural de las enzimas antioxidantes, como la superóxido dismutasa, y un competidor de los metales redox, como el hierro. El zinc estimula la expresión de metalotioneínas en las células pancreáticas, que se sabe que participan en la neutralización de varios metabolitos activos del oxígeno y pueden prevenir la destrucción de las células beta.

[0184]Dada la importancia de mantener los niveles fisiológicos de zinc en el cuerpo para asegurar la síntesis y secreción de insulina, así como su importante papel en la función del páncreas, se determinaron los efectos del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato sobre las propiedades morfofuncionales generales del páncreas. investigado más a fondo.

Efectos del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato sobre las propiedades morfofuncionales del páncreas y el hígado de modelos animales de obesidad

[0185]El páncreas es una glándula mixta que tiene funciones tanto exocrinas como endocrinas. La mayor parte del páncreas está compuesta por células exocrinas dispuestas en acinos. Las secreciones de los acinos salen del páncreas a través de los conductos intercalados, intralobulillares e interlobulillares y el conducto pancreático principal. Los grupos de células exocrinas, los acinos, en animales del grupo de control (FIG. 7A - FIG. 7F)tienen una estructura típica: el citoplasma en el polo apical es granular y brillantemente acidófilo, mientras que el polo basal contiene núcleos que son fuertemente basófilos.

[0186]En los modelos animales de DIO (grupo de obesidad) (FIG. 7A - FIG. 7F), se encontraron acinos con citoplasma apical no muy notablemente eosinofílico (FIG.7a - FIG.7F,flechas), lo que puede deberse a la acumulación de inclusiones lipídicas, degeneración grasa pancreática.

[0187]La administración del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato a ratas que fueron alimentadas con una dieta estándar no cambió la morfología de las células exocrinas (FIG. 8A-FIG.8F). Después de la administración del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato a ratas obesas (FIG. 8A-FIG. 8F), no se encontró degeneración grasa.

[0188]La parte endocrina del páncreas está compuesta por islotes de Langerhans ubicados de manera difusa. Un estudio morfométrico del estado funcional del páncreas endocrino durante el desarrollo de la obesidad inducida mostró diferencias claras entre los valores obtenidos de todos los grupos (FIG. 9). En los animales del grupo obeso, la superficie transversal de los islotes de Langerhans se redujo significativamente (en un 60 %), lo que indica una disminución significativa de la actividad funcional de su páncreas endocrino. Después de la administración del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato a ratas obesas, la superficie transversal de los islotes de Langerhans aumentó en un 43 % en comparación con el grupo de obesidad, pero aún no alcanzó el nivel de control (inferior al nivel de control). valor en un 29 %). La administración del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato a ratas que comieron una dieta estándar provocó una disminución notable de este valor del 39 % en comparación con el grupo de control.

[0189]Dado que existe una relación directa entre los indicadores morfológicos y funcionales del estado del páncreas, los datos obtenidos muestran que la actividad sintetizadora de hormonas del páncreas en modelos de ratas con obesidad inducida por la dieta se reduce significativamente pero aumenta notablemente con la administración de isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato, aunque no se recupera completamente a los niveles observados en el grupo de control. Además, se registró una mejora en el estado de la parte exocrina del páncreas después de la administración de la sustancia de prueba en el contexto del desarrollo de obesidad, lo que se evidencia por la desaparición de la degeneración grasa, sin un efecto notable sobre las células exocrinas en ratas alimentadas con una dieta estándar.

[0190]El hígado de ratas de control (FIG. 10A-FIG. 10D)tiene una organización lobular clásica con una vena central que discurre a lo largo del eje de cada lóbulo. Los hepatocitos de morfología poligonal con núcleos claramente definidos, que contienen varios nucléolos cada uno, están dispuestos en cordones hepáticos ordenados que se extienden desde la vena central. También se encuentran hepatocitos binucleares.

[0191]En animales del grupo de obesidad (FIG. 10A-FIG. 10D), la forma de los hepatocitos cambia de poligonal a redondeada debido a la deposición de inclusiones lipídicas, lo que es un signo de degeneración grasa del hígado. La estructura de los cordones hepáticos se altera y se reduce el número de células binucleadas en el campo de visión.

[0192]Como resultado de la administración del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato a ratas obesas (FIG. 11A-FIG. 11D), se restableció la estructura de los cordones hepáticos, la mayoría de los hepatocitos de morfología poligonal no mostraron signos de degeneración grasa, a menudo se encontraron las células binucleadas. La administración del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato a ratas que comían una dieta estándar (FIG. 11A-FIG. 11D)no provocó ningún cambio en la morfología de los hepatocitos ni en la estructura de los lóbulos hepáticos.

[0193]Con el desarrollo de la obesidad inducida por la dieta, se produjeron cambios morfométricos significativos en los hepatocitos (FIG. 25 12A-FIG. 12C). Así, en los animales del grupo de obesidad, el área del núcleo disminuyó en un 25 % (lo que evidencia una disminución en la actividad transcripcional del núcleo, confirmada también por su color oscuro y su estructura homogénea sin nucléolos en el campo de visión), pero el área de hepatocitos aumentó en un 48 % debido al depósito de una gran cantidad de inclusiones lipídicas. Al mismo tiempo, la proporción núcleo-citoplasma se redujo significativamente (en un 45 %), un nivel bajo de lo cual indica que disminuyó la actividad funcional de las células.

[0194]La administración de la sustancia de prueba a ratas obesas mejoró sus parámetros morfométricos. Así, el área de hepatocitos en animales tratados con el isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato disminuyó un 41 % en comparación con los modelos animales de obesidad no tratados (solo un aumento del 13% en comparación con los valores de control, lo que es un signo de una disminución en la deposición de inclusiones de lípidos por los hepatocitos) y su relación núcleo-citoplasma aumentó en un 31 % en comparación con el grupo de obesidad (una disminución del 30 % en comparación con el grupo de control).

[0195]Sin embargo, el área del núcleo se reduce en comparación con los valores de control en un 35 % (es decir, disminuye en relación con los valores en el grupo de obesidad en un 14 %, lo que puede ser el resultado de un efecto combinado de dos factores: una dieta rica en grasas y isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato - sobre la actividad nuclear).

[0196]El efecto del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato sobre los parámetros morfométricos en ratas mantenidas con dieta estándar consistió en la reducción del área del núcleo en un 26 %, el área de hepatocitos en un 12 % y la relación núcleo-citoplasma en un 17 %.

[0197]La fibrosis hepática se caracteriza por un crecimiento excesivo del tejido conectivo, una mayor síntesis y depósito de colágeno en la sustancia extracelular. En las muestras tomadas de animales del grupo control (FIG. 13A-FIG. 13D), la mayoría de las fibras de colágeno estaban en la región de las tríadas formadas por pequeños vasos interlobulillares.

[0198]Las muestras tomadas de los animales del grupo de obesidad (FIG. 13A-FIG. 13D)mostraron un aumento notable en el número de fibras de colágeno en la región de la tríada formada, como en el grupo de control, por pequeños plexos capilares perilobulillares y vasos interlobulillares más grandes.

[0199]Las muestras tomadas de ratas obesas inyectadas con isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato (FIG. 14)muestran niveles similares de deposición de fibras de colágeno en los lugares indicados en comparación con muestras del grupo de obesidad no tratado. La administración de la sustancia de prueba a ratas que fueron alimentadas con una dieta estándar (FIG. 14A-FIG. 14D)no provocó cambios significativos en la cantidad de fibras de colágeno en los plexos capilares perilobulillares e interlobulillares.

[0200]El análisis del área ocupada por las fibras de colágeno (FIG. 15)muestra cambios significativos con el desarrollo de la obesidad inducida. El área de depósitos de fibra de colágeno en el grupo con obesidad y en el grupo tratado con el isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato aumentó en un factor de 6,25 y en un factor de 6, respectivamente, en comparación con el grupo de control. No se encontraron diferencias significativas entre el grupo de obesidad no tratado y el grupo de obesidad tratado con el isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato. La administración de la sustancia de prueba a ratas que comían una dieta estándar provocó un aumento significativo (2 veces) del área de deposición de fibras de colágeno.

[0201]Así, resumiendo los resultados obtenidos, se puede decir que el isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato tiene un efecto positivo sobre las propiedades morfofuncionales del páncreas y el hígado de modelos animales de obesidad.

Efectos del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato sobre el sistema serotoninérgico en modelos animales de obesidad

[0202]A pesar del hecho comprobado de que el desarrollo de la obesidad es principalmente el resultado de una mayor ingesta calórica y un gasto energético inadecuado, la búsqueda de nuevos mecanismos patogénicos del aumento de peso sigue siendo relevante.

[0203]Según los conceptos modernos, la obesidad, independientemente de su etiología, conduce a una alteración de los mecanismos reguladores centrales que afectan las respuestas conductuales, en particular la conducta alimentaria. En el hipotálamo, principalmente en la región de sus núcleos paraventriculares y zona perifornical lateral, se produce una integración de multitud de impulsos procedentes de la corteza cerebral y estructuras subcorticales hacia los sistemas nerviosos simpático y parasimpático. Una interrupción en cualquier eslabón de esta compleja cascada regulatoria puede conducir a cambios en la ingesta de alimentos, la deposición y movilización de grasas y, en última instancia, al desarrollo de obesidad.

[0204]Entre los neurotransmisores importantes que participan en la regulación de la conducta alimentaria, en particular del apetito, y que influyen en la sensación de saciedad, se encuentran varias aminas biogénicas, entre las que la serotonina desempeña un papel decisivo. C. Portas et al., Progress in Neurobiology. -2000. - Vol. 60, n°1. - p. 13-35.

[0205]Según la teoría del desequilibrio neuroquímico de los sistemas nerviosos central y periférico, comer en exceso es un mecanismo compensatorio para obtener placer debido a una producción o sensibilidad insuficiente de los neurotransmisores.

[0206]Es el sistema serotoninérgico central el que es fundamental para regular la sensación de hambre y saciedad. Los experimentos demostraron que un aumento de la transmisión serotoninérgica en el cerebro provocaba una disminución en la ingesta de alimentos. Las inyecciones de 5-HT en el núcleo paraventricular del hipotálamo de la rata condujeron a la saciedad del animal, mientras que, con el consumo de alimentos, se observó un aumento de la producción de serotonina en el hipotálamo lateral. Se cree que estas dos secciones del hipotálamo realizan la función opuesta en la regulación del apetito: la inhibición insuficiente de la transmisión serotoninérgica en el hipotálamo lateral puede ser una causa de ingesta excesiva de alimentos durante la obesidad, y una mayor liberación de serotonina en el núcleo paraventricular del hipotálamo puede contribuir a la hipofagia inducida por el estrés.

[0207]El cerebro y los intestinos son los principales órganos productores de serotonina en los animales. Como la serotonina no cruza la barrera hematoencefálica, el sistema de síntesis de serotonina se divide en central y periférico, que funcionan por separado uno del otro. Una pequeña cantidad de la hormona se encuentra en el plasma.

[0208]Varios sistemas enzimáticos participan en las transformaciones metabólicas de la serotonina. Estos sistemas incluyen enzimas para la síntesis y degradación de la serotonina, así como una enzima que determina la cantidad de triptófano que ingresa a la vía de la quinurenina. A. Meneses, G. Liy-Salmerón. // Annual Review of Neuroscience. -2012. - N°23. - p. 543-553. M. Donovan, L. Tecott. // Frontiers in Neuroscience. - 2013. - n° 7. - doi: 10.3389/fnins.2013.00036.

[0209]El triptófano, un aminoácido esencial producido naturalmente por el cuerpo, es el precursor inmediato de la serotonina. El triptófano se transporta desde el líquido extracelular a las neuronas serotoninérgicas mediante un transportador de membrana no específico, que se cree que participa en el transporte de otros aminoácidos neutros (valina, leucina, isoleucina). Por tanto, los niveles de triptófano en las neuronas y la intensidad de su transporte dependen no sólo de la concentración de triptófano, sino también de la relación entre las concentraciones de aminoácidos neutros competidores y la concentración de triptófano.

[0210]La serotonina se sintetiza mediante un proceso de dos pasos catalizado por dos sistemas enzimáticos. En primer lugar, como resultado de la hidroxilación en la quinta posición del anillo de indol, el triptófano se convierte en 5-hidroxitriptófano, un precursor directo de la síntesis de serotonina. La reacción de hidroxilación del triptófano es catalizada por la enzima limitante de la velocidad triptófano hidroxilasa (triptófano-5-monooxigenasa, EC 1.14.16.4) en presencia de oxígeno molecular y pterina (tetrahidrobiopterina) como coenzimas. La tasa de hidroxilación del triptófano depende directamente de la disponibilidad del sustrato. El segundo paso en la síntesis de serotonina es la descarboxilación catalizada por la DOPA descarboxilasa (también conocida como L-aminoácido descarboxilasa aromática, EC 4.1.1.28).

[0211]Además de la participación de estas enzimas en la síntesis de serotonina y otras aminas biológicamente activas, ambas enzimas participan activamente en la regulación de los ritmos circadianos, la remodelación ósea, los procesos de diferenciación celular, los mecanismos de respuesta inmune y la inflamación.

[0212]La inactivación de la serotonina se produce por degradación enzimática, que es realizada principalmente por la monoaminooxidasa (EC 1.4.3.4). Bajo la acción de la MAO, la serotonina se convierte en 5-hidroxiindaldehído, que, a su vez, puede convertirse reversiblemente en 5-hidroxitriptofol bajo la acción de la alcohol deshidrogenasa. Bajo la acción de la acetaldehído deshidrogenasa, el 5-hidroxiindaldehído se convierte irreversiblemente en ácido 5-hidroxiindol acético, que luego se excreta con la orina y las heces. Sandler M. et al, Clinical Pathology. -1981. - N°34. - p.292-302. S. Nilsson, N. et al, Acta medica Scandinavica. - 1968. - N°184. - p. 105-108.

[0213]Cuando se libera, la serotonina influye en varios procesos biológicos uniéndose a los receptores de serotonina (HTR). A continuación, su acción finaliza mediante la absorción en las células a través del transportador de serotonina (SERT, Slc6a4).

[0214]Además de la desaminación oxidativa de la serotonina, son posibles otras vías del metabolismo de la serotonina, por ejemplo, las vías de acetilación y las conjugaciones de ácido glucurónico y éster de sulfato. Existe una vía para el metabolismo de la serotonina, que va acompañada de la formación de melatonina.

[0215]Los estudios médicos han demostrado que un trastorno en las transformaciones metabólicas de la serotonina a menudo no es sólo una consecuencia, sino también uno de los principales factores que desencadenan el desarrollo de sobrepeso y obesidad. Los trastornos moleculares y bioquímicos a nivel de las diferentes fases del metabolismo de la serotonina, su transporte a través de las membranas celulares y los mecanismos de deposición que conducen a cambios en las concentraciones de serotonina tanto en el sistema nervioso central como en la periferia pueden ser una de las bases patológicas definitorias para la formación de desequilibrio neuroendocrino inmunológico y mantenimiento de reacciones proinflamatorias. El desequilibrio del sistema serotoninérgico es la causa subyacente del desarrollo de una serie de condiciones patológicas del cuerpo y trastornos mentales, incluida la esquizofrenia, diversas psicosis, depresión y ansiedad. Los estados depresivos suelen ir acompañados de un aumento del apetito, lo que provoca una ingesta excesiva de alimentos, especialmente alimentos ricos en carbohidratos.

[0216]Datos de investigaciones recientes han demostrado que el zinc puede modular la función serotoninérgica a través de los receptores 5-HT1A (5-HT1AR); sin embargo, se desconocen los mecanismos exactos de su acción. Teniendo en cuenta lo anterior, además de la importancia del zinc para el buen funcionamiento del sistema neurohormonal del cerebro, se analizaron más a fondo su implicación en el metabolismo del triptófano, molécula clave en la síntesis de serotonina, y el efecto modulador del zinc sobre el sistema serotoninérgico, los indicadores principales que permitirían una evaluación general del metabolismo de la serotonina en animales de experimentación. Para ello se determinaron los niveles de serotonina y triptófano, así como la actividad de enzimas clave implicadas en el metabolismo de la serotonina (triptófano hidroxilasa, triptófano descarboxilasa, indol amida deshidrogenasa y monoaminooxidasa) en el suero sanguíneo, cerebro y duodeno de animales que fueron alimentados con una dieta rica en grasas y se les inyectó el isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato.

[0217]En general, los resultados de este estudio muestran un desequilibrio significativo del sistema serotoninérgico en animales obesos que se produce tanto en el sistema serotoninérgico periférico como en el central, lo que puede ser uno de los mecanismos desencadenantes del desarrollo y progresión de la obesidad.

[0218]En el sistema periférico, la serotonina se localiza en las células enterocromafines de la mucosa gastrointestinal. Es allí donde se sintetiza entre el 80 % y el 95 % de la cantidad total de esta hormona en el cuerpo. La serotonina también se sintetiza en la glándula pineal. Cote F. et al, PNAS EE. UU.-2003.-Vol. 100.-P. 13525-13530. Eddahibi S. The serotonin pathway in pulmonary hypertension. / Eddahibi S., Adnot S. // Arq. Mai. Coeur. Vaiss. - 2006. - Vol. 99 - p. 621-625.

[0219]La serotonina sintetizada en el intestino se almacena en las plaquetas; también está presente en otros tejidos periféricos, como la glándula mamaria, el hígado, los huesos y también en las células p del páncreas. La serotonina periférica interviene en la regulación de los movimientos intestinales, los procesos de vasoconstricción y la presión arterial. La serotonina también regula los niveles de glucosa en el plasma sanguíneo, la trombogénesis, el ritmo cardíaco y la fuerza de las contracciones del corazón.

[0220]Se ha establecido una inhibición significativa del sistema serotoninérgico periférico, que se manifiesta en una disminución de la actividad de todas las enzimas clave en un contexto de agotamiento de la reserva de triptófano. A pesar de los cambios identificados, los niveles de serotonina en el duodeno de modelos animales de obesidad excedieron significativamente los valores en el grupo de control (Tabla 11).

[0221]Estos resultados son generalmente consistentes con el concepto actual de que la serotonina intestinal se correlaciona con el desarrollo de la obesidad y que los niveles de serotonina en los intestinos de las personas obesas aumentan significativamente. La acumulación de serotonina provoca un aumento de las concentraciones séricas de glucosa, contribuyendo así al desarrollo de diabetes y obesidad.

TABLA 11 Principales indicadores de funcionamiento del sistema serotoninérgico periférico (duodeno) en animales de grupos experimentales (M ± m, n=10)

[0222]El análisis de los niveles séricos de serotonina y triptófano en animales obesos mostró una disminución significativa en las concentraciones de ambas sustancias, lo que puede ser una consecuencia directa de la inhibición de las reacciones de síntesis de serotonina en las células enterocromafines de la mucosa gastrointestinal (Tabla 12).

[0223]Un factor adicional que contribuye a los niveles bajos de serotonina en la sangre es la activación de la monoaminooxidasa.

[0224]La modulación del sistema serotoninérgico periférico puede ser una buena estrategia de tratamiento contra la obesidad, ya que puede reducir la obesidad y aumentar la sensibilidad a la insulina.

[0225]A pesar de la importancia de mantener los niveles fisiológicos de serotonina periférica, es la serotonina central la que juega un papel clave en la regulación de la homeostasis energética. Se estableció una relación inversa entre el nivel central de serotonina y la ingesta de alimentos. En el SNC, la serotonina se sintetiza en el hipotálamo y el tronco del encéfalo. Ayuda a regular el estado de ánimo, los ciclos de sueño-vigilia y la dieta.

[0226]La inhibición de la síntesis de serotonina en el cerebro mediante inyección intraventricular de p-clorofenilalanina, un inhibidor irreversible de la triptófano hidroxilasa, induce hiperfagia y aumento de peso en ratas. Los inhibidores de la recaptación de serotonina y los inhibidores de la monoaminooxidasa reducen la ingesta de alimentos. Así, la serotonina en el sistema nervioso central funciona como un neurotransmisor anorexigénico.

Tabla 12 Niveles séricos de triptófano y actividad de serotonina y monoaminooxidasa en animales de grupos experimentales (M ± m, n=10)

[0227]La patogénesis de la obesidad en ratas estuvo acompañada de una caída significativa en los niveles de triptófano en el cerebro de los animales, que puede deberse a un transporte deficiente de este aminoácido a través de la barrera hematoencefálica (Tabla 13).

[0228]Se sabe que el transporte de aminoácidos aromáticos y aminoácidos de cadena ramificada a través de la barrera hematoencefálica se produce con la participación de un portador específico y es competitivo, por lo que las concentraciones séricas elevadas de aminoácidos de cadena ramificada, típicas de la obesidad, aumentarán. Afecta el transporte de triptófano a través de la barrera hematoencefálica. C. Newgard, J. An, J. Bain. // Cell Metabolism. - 2009. -Vol.9, 4. - p. 311-326. E. del Amo et al., // european journal of pharmaceutical sciences. - 2008. - 35. - p. 161-174.

Tabla 13 Principales indicadores de funcionamiento del sistema serotoninérgico central (cerebro) en animales de grupos experimentales (M ± m, n=10)

[0229]Dada la estrecha conexión metabólica entre la serotonina y el triptófano, una consecuencia natural de la falta de este último será una disminución de los niveles de serotonina.

[0230]La alteración de la transmisión serotoninérgica es uno de los factores que contribuyen a la aparición de estados depresivos y puede considerarse como una de las causas clave de la obesidad. Se sabe que las personas con defectos congénitos o adquiridos del sistema serotoninérgico central desarrollan reacciones subjetivas negativas al hambre, que se acompaña de una disminución en la producción de serotonina. En tales casos, incluso una pequeña inanición puede desencadenar el desarrollo de estados depresivos. Por tanto, estas personas consumen alimentos en cantidades que superan sus necesidades fisiológicas.

[0231]Así, los niveles bajos de serotonina en los núcleos ventromedial y paraventricular del hipotálamo inducen una ingesta excesiva de alimentos y provocan una hipersecreción de insulina, lo que conduce a una disminución de la sensibilidad de los tejidos periféricos a la acción de esta hormona y el desarrollo de resistencia a la insulina.

[0232]Los cambios en la actividad de las enzimas implicadas en la vía metabólica de la serotonina que se identificaron durante este estudio contribuyen a un mayor agotamiento de las reservas de serotonina en el cerebro. Así, se observó una disminución en la actividad de la triptófanohidroxilasa, una enzima que limita el proceso de síntesis de serotonina, que se produce en el contexto de la activación de la monoaminooxidasa, una enzima que asegura la degradación de la serotonina.

[0233]El aumento de la actividad de la indolamina-2,3-dioxigenasa es indicativo de la activación de una vía metabólica alternativa del triptófano, que no sólo contribuye a un mayor agotamiento de la reserva de este aminoácido, sino que también sirve como fuente de formación de una serie de compuestos neurotóxicos.

[0234]La administración del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato a animales alimentados con una dieta rica en grasas condujo a la normalización de la mayoría de las variables experimentales. Así, se observa un aumento de los niveles de serotonina en el cerebro debido a un aumento de los niveles de triptófano y, en consecuencia, la activación de la síntesis de serotonina en el contexto de la inhibición de una forma alternativa de su transformación y la reducción de la tasa de degradación de la serotonina por la monoaminooxidasa. Se encontró un efecto similar en el duodeno y el suero.

[0235]Por tanto, el efecto del zinc es complejo y se produce a nivel del funcionamiento del sistema serotoninérgico central y periférico. Estos resultados corroboran la conveniencia del uso terapéutico de preparaciones de zinc como monoterapia o en combinación con otros fármacos para mejorar el estado metabólico general en el desarrollo de la obesidad y la prevención de los trastornos relacionados con la obesidad.

Efectos del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato sobre el equilibrio prooxidante-antioxidante en modelos animales de obesidad

[0236]Las reacciones de radicales libres necesarias para la formación de enzimas, la activación de factores de transcripción, la oxidación de xenobióticos y la protección bactericida son la base del funcionamiento normal de la célula. Además, intervienen en la expresión de genes, transducen señales hormonales y celulares y regulan los procesos de reproducción celular. Por lo tanto, las especies reactivas de oxígeno y las especies reactivas de nitrógeno se producen naturalmente en el cuerpo humano y son subproductos clave en el proceso metabólico. Los antioxidantes mantienen los niveles de radicales libres dentro de límites fisiológicos. Un equilibrio entre la defensa antioxidante y la oxidación de radicales libres es necesario para el correcto funcionamiento de las células. Cuando la cantidad de radicales libres supera la actividad de defensa antioxidante se genera un fenómeno llamado estrés oxidativo.

[0237]El estrés oxidativo y el daño tisular resultante y la muerte celular contribuyen a muchas condiciones patológicas. La producción excesiva de radicales libres y/o el agotamiento de los sistemas de defensa conduce al desequilibrio prooxidante-antioxidante, lo que a su vez causa daño a las estructuras proteicas de las células, la bicapa lipídica de las membranas celulares y los ácidos nucleicos. Dado que la bicapa lipídica es un componente de todas las membranas celulares, la peroxidación lipídica mediada por radicales libres es una de las razones importantes del daño de la membrana celular seguido de la muerte celular. La degradación de los lípidos de la membrana provoca un aumento de la fluidez de la membrana celular y de su permeabilidad a los iones, alterando la homeostasis celular en su conjunto. Los productos de oxidación de radicales libres (4-hidroxialqueno, dialdehído malónico, etc.) son altamente mutagénicos y citotóxicos.

[0238]Estudios epidemiológicos, clínicos y en animales han demostrado que la obesidad se asocia con un estado redox alterado y un mayor riesgo metabólico. En este caso, el estrés oxidativo puede ser no sólo una consecuencia, sino también un desencadenante del desarrollo de trastornos en personas obesas. El estrés oxidativo es uno de los factores que causan la disfunción de los adipocitos. El exceso de oxidantes, inicialmente producido por una masa creciente de tejido adiposo, estimula las vías de señalización sensibles al estrés oxidativo, que están mediadas por el factor de transcripción NF-kB y las quinasas JNK y p38-MAPK, y activan varias proteínas quinasas (PKB, PKC, etc.).

[0239]Además, el estrés oxidativo activa la diferenciación de los preadipocitos y estimula la hipertrofia de las células adiposas maduras. El aumento de la producción de ROS en el tejido adiposo acumulado conduce además a la inducción de estrés oxidativo en el torrente sanguíneo, lo que contribuye a la propagación del estrés oxidativo a órganos alejados del depósito de grasa.

[0240]Los niveles elevados de glucosa, junto con los trastornos del metabolismo de los lípidos y las concentraciones elevadas de ácidos grasos libres, determinan los mecanismos de formación y progresión del estrés oxidativo específicos de la obesidad. Se cree que el estrés oxidativo inducido por la hiperglucemia se produce como resultado de la activación directa de reacciones de formación de ROS y como resultado de la alteración de la homeostasis redox celular.

[0241]La siguiente fase de este estudio tuvo como objetivo evaluar el equilibrio prooxidante-antioxidante en modelos animales de obesidad tratados con isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato.

[0242]Las concentraciones de productos de peroxidación lipídica (LOP) sirven como criterio informativo que permite sacar una conclusión sobre la intensidad de los procesos oxidativos. Hay productos de peroxidación lipídica primaria (como los dienos conjugados) y productos de peroxidación lipídica secundaria (como los aldehídos, en particular el aldehído malónico), que se forman como resultado de la ruptura de los dobles enlaces carbono-carbono en los esqueletos de carbono de las moléculas oxidadas. Posteriormente, el inicio de la peroxidación lipídica conduce a la formación de bases de Schiff conjugadas de fosfolípidos y productos similares al malonaldehído, que causan alteraciones en la orientación ordenada de las moléculas de fosfolípidos y afectan las interacciones intermoleculares de las lipoproteínas y la configuración de la membrana basal.

[0243]Considerando lo anterior, en animales tratados con Zn se determinaron las concentraciones de LOP primarios -dienos conjugados (DC), productos secundarios - sustancias reactivas a TBA (TBARS) y productos finales - bases de Schiff (BS) con isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato. Teniendo en cuenta que la obesidad va acompañada del desarrollo de estrés oxidativo sistémico que cubre la mayoría de los tejidos en diversos grados y conduce a la alteración de la integridad de las membranas celulares y la entrada de productos de peroxidación lipídica al torrente sanguíneo, los valores que caracterizan el estado del sistema prooxidante-antioxidante fueron determinados en el suero sanguíneo de animales y analizado.

[0244]Los niveles séricos elevados de productos primarios de la oxidación de lípidos por radicales libres (1,86 veces) sugieren que la fase inicial de la peroxidación de lípidos ocurre activamente incluso después de diez semanas de obesidad experimental (Tabla 14). Este resultado puede explicarse desde el punto de vista de una alteración del metabolismo de los lípidos, es decir, una alteración de los procesos de transporte de ácidos grasos y, en consecuencia, un aumento de los niveles plasmáticos de ácidos grasos libres y esterificados, sustratos directos para la acción de las especies activas de oxígeno. Por otro lado, la acumulación de productos de peroxidación lipídica en el suero puede ser un resultado directo de la violación de la integridad de las membranas celulares debido a la destrucción oxidativa de su componente lipídico y la permeabilidad de los productos de oxidación lipídica al torrente sanguíneo.

[0245]Un factor adicional que puede contribuir al aumento del estrés oxidativo en el desarrollo de la obesidad es una activación significativa de la m Ao (demostrada en la fase anterior de este estudio), una enzima involucrada en la producción de ROS.

Tabla 14 Niveles séricos de productos de peroxidación lipídica en animales de grupos experimentales (M ± m, n=10)

[0246]Un aumento en los niveles de DC estuvo acompañado de una acumulación de POL secundarios, es decir, sustancias reactivas al TBA. Así, los niveles séricos de sustancias reactivas al TBA en animales obesos eran 4,8 veces mayores en comparación con el valor de control. En el caso de la acumulación de sustancias reactivas con TBA dependiente de Fe+2-ascorbato, este valor superó en 20 veces el resultado obtenido en el grupo de animales de control, lo que sugiere una contribución significativa de reacciones no enzimáticas de iniciación de procesos de peroxidación lipídica. al desequilibrio prooxidante-antioxidante en animales obesos.

[0247]Un aumento tan significativo en las concentraciones de aldehido POL se considera un marcador desfavorable, ya que estas sustancias pueden unirse a proteínas para formar aductos estables. Su formación puede afectar la función de las proteínas. Además, las proteínas modificadas de esta manera tienen propiedades inmunológicas y pueden provocar la producción de autoanticuerpos.

[0248]Los cambios en los niveles de productos primarios y secundarios van acompañados de la acumulación de los productos finales de la peroxidación lipídica, las bases de Schiff, que se forman como resultado de la condensación de aldehídos, incluido el malondialdehído, o cetonas con grupos amino de proteínas y conducen a una alteración de las características estructurales y funcionales de este último. Según los datos obtenidos (tabla), se observó un aumento significativo en los niveles de bases de Schiff en el suero de animales con obesidad. Así, este valor fue 4 veces mayor que en el grupo de animales control. Los niveles de los productos finales de la peroxidación lipídica caracterizan la duración de los trastornos de la homeostasis oxidativa, por lo tanto, dado un crecimiento significativo de este valor en este estudio, se puede discutir la activación a largo plazo de las reacciones de radicales libres.

[0249]Así, niveles elevados de productos de peroxidación lipídica en la décima semana de desarrollo de la obesidad indican claramente que el estrés oxidativo tiene un carácter sistémico y que este proceso es crónico, lo que es un marcador de pronóstico desfavorable, ya que estos metabolitos son compuestos extremadamente tóxicos y su impacto negativo es se exhibe en diferentes niveles y conduce a daños en las moléculas de ADN, destrucción de moléculas de proteínas y glucosaminoglicanos, cambios en la composición lipídica de las membranas celulares y alteración de los procesos asociados a las membranas.

[0250]La activación de los procesos de peroxidación lipídica puede indicar indirectamente un aumento en las concentraciones de ROS. Un exceso de ROS puede activar directamente varias serina-treonina quinasas, como PKC, AKT/PKB, mTOR, GSK-3 y p38 MAPK. Estas proteínas quinasas que actúan sinérgicamente reducen la sensibilidad de las células a la insulina mediante la fosforilación selectiva de los residuos de serina y treonina en las moléculas del IRS y contribuyen al desarrollo de resistencia de las células dependientes de la insulina a esta hormona.

[0251]La administración del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato a animales ayudó a normalizar los niveles de LOP primarios, secundarios y finales, lo que sirve como evidencia adicional de la capacidad del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato para influir en el estado general prooxidante-antioxidante del cuerpo.

[0252]Según los conceptos modernos, las especies reactivas de oxígeno no sólo activan los procesos de peroxidación lipídica, sino que también provocan la destrucción oxidativa de las moléculas de proteínas, provocando una alteración de la conformación de enzimas, receptores y canales iónicos solubles y unidos a membranas, lo que en última instancia conduce a la pérdida de su actividad biológica (enzimática, receptora, de transporte, etc.). La modificación oxidativa de proteínas y la acumulación de moléculas estructuralmente modificadas es un factor importante que potencialmente puede contribuir a la producción de nuevos anticuerpos, provocando así una reacción autoinmune. Berlett B.S., Stadtman E.R. J Biol. Chem.-1997.-V.272, n° 33.-p. 20313-20316.

[0253]Bajo la acción de ROS, la conformación nativa de las proteínas se altera, lo que resulta en la formación de grandes agregados de proteínas, o viceversa, la fragmentación de las moléculas de proteínas. Los radicales hidroxilo provocan con mayor frecuencia la agregación de proteínas y, en combinación con el anión superóxido, la fragmentación con la formación de fragmentos de bajo peso molecular. Los radicales lipídicos también pueden provocar la fragmentación de las moléculas de proteínas. La formación de grupos carbonilo (grupos aldehído o cetona de residuos de aminoácidos) puede servir como marcador del daño oxidativo de las proteínas.

[0254]Según los conceptos modernos, todos los residuos de aminoácidos de las proteínas pueden modificarse, pero los residuos de triptófano, tirosina, histidina y cisteína son los más sensibles. Las ROS atacan grupos funcionales de aminoácidos que forman las proteínas, lo que lleva a la formación de radicales de aminoácidos primarios capaces de interactuar con residuos de aminoácidos vecinos. En general, nos enfrentamos a un panorama complejo del efecto dañino de las ROS sobre las macromoléculas de proteínas. Los radicales, formados como resultado de la oxidación de la tirosina, pueden interactuar entre sí, formando enlaces cruzados de bitirosina en las proteínas. Los enlaces cruzados de bitirosina aumentan la resistencia de las proteínas a la acción de las proteasas, creando requisitos previos para la acumulación de proteínas funcionalmente inactivas en el cuerpo. La oxidación del triptófano también está asociada con la formación de enlaces cruzados covalentes, que es un factor adicional que provoca la agregación de moléculas de proteínas. Rojas V.C. et al., Arch. Med. Res.-1996.-V.27, 1.-P.1-6. Archakov I.M. Modification of proteins with active oxygen and their decomposition // Biochemistry.-1989.-Vol.54, 2.-P. 179-185.

[0255]La modificación oxidativa de las proteínas juega un papel importante en el metabolismo de las proteínas en el cuerpo. La acumulación de proteínas oxidadas se considera uno de los factores que regulan la síntesis y degradación de proteínas y la activación de proteasas multicatalíticas que destruyen selectivamente las proteínas oxidadas. Un cierto grado de daño oxidativo de las moléculas de proteínas puede evaluarse mediante la acumulación de derivados carbonílicos, en particular aldehídos y cetonas dinitrofenilhidrazonas de naturaleza neutra. Las aldehídodinitrofenilhidrazonas, detectadas a una longitud de onda de 356 nm, son marcadores tempranos de la degradación oxidativa de las proteínas e indican las etapas iniciales de daño a las moléculas de proteínas bajo la acción de los radicales libres, mientras que las cetonas-dinitrofenilhidrazonas, que se detectan en 370 nm, se consideran marcadores tardíos de daño oxidativo a las proteínas.

[0256]Dado que, a diferencia de los productos de peroxidación lipídica, los derivados carbonílicos son mucho más estables, esto permite considerar los productos de modificación oxidativa de proteínas como marcadores de daño oxidativo en los tejidos.

[0257]Por tanto, un aumento en el número de proteínas modificadas puede considerarse como un criterio temprano del daño tisular por radicales libres y un marcador del agotamiento del sistema de defensa antioxidante del cuerpo.

[0258]Estos estudios revelaron un aumento en los niveles séricos de proteínas modificadas oxidativamente en modelos animales de obesidad (Tabla 15) con cambios más pronunciados en los niveles de aldehído-dinitrofenil-hidrazonas que indican una etapa activa del desarrollo del estrés oxidativo y trastornos metabólicos acompañados. por una mayor formación de radicales libres. En general, las concentraciones elevadas de derivados carbonílicos en proteínas modificadas oxidativamente en el suero de animales obesos en el contexto de la intensificación de los procesos de peroxidación lipídica pueden considerarse como evidencia indiscutible de estrés oxidativo prolongado. Así, teniendo en cuenta los datos obtenidos, se puede decir que el desarrollo de la obesidad va acompañado de la activación de la oxidación de las proteínas por radicales libres, lo que se hace evidente en el aumento de las cantidades de derivados carbonílicos formados por la modificación oxidativa de las proteínas con picos de absorción en 356 y 370 nm.

Tabla 15 Niveles séricos de productos de modificación oxidativa de proteínas en animales de grupos experimentales (M ± m, n=10)

[0259]Los procesos de modificación de moléculas de proteínas por especies activas de oxígeno ocurren no solo en condiciones patológicas. Así, en condiciones fisiológicas, existe un cierto nivel de proteínas modificadas oxidativamente en las células, lo que refleja el equilibrio entre la tasa de degradación proteolítica de estas moléculas dañadas y "usadas" y la tasa de su síntesis. En algunos casos, la inactivación oxidativa es una etapa marcadora que aumenta la sensibilidad de las proteínas a la acción de las proteasas, ya que las enzimas proteolíticas descomponen las moléculas de proteínas modificadas mucho más rápido que las nativas. Por lo tanto, los niveles elevados de derivados carbonílicos en animales con obesidad pueden no sólo indicar el desarrollo de estrés oxidativo, sino también evidenciar alteraciones significativas en los mecanismos de control y regulación de la degradación de proteínas estructuralmente modificadas y, en particular, de las enzimas proteolíticas que aseguran su implementación de este proceso.

[0260]En los animales que fueron alimentados con una dieta rica en grasas durante todo el experimento y recibieron inyecciones del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato, los niveles de aldehído-dinitrofenil-hidrazonas excedieron el punto de referencia pero fueron más bajos en comparación con los valores en animales no tratados con obesidad. En cuanto a las cetonas-dinitrofenil-hidrazonas, su concentración se mantuvo dentro del valor de control. Dichos resultados se correlacionan con los datos que muestran una disminución en los niveles de LOP y pueden sugerir una disminución en la intensidad de las reacciones de oxidación de los radicales libres.

[0261]Según los conceptos modernos, en las células, además de la modificación de las proteínas por ROS, existe la denominada vía no oxidativa para la formación de derivados carbonílicos, que consiste en la modificación de las moléculas de proteínas por los aldehídos. Así, los experimentos de Burcham P.C. et al. demostraron que la incubación de proteínas con varios aldehídos, incluido MDA, inducía un aumento en el número de proteínas modificadas oxidativamente de una manera dependiente de la concentración. Dado que la administración del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato a animales obesos DIO lugar a una disminución de los niveles de LOP, parece que la disminución observada en el grado de modificación oxidativa de las proteínas puede estar asociada en parte con la inhibición de la formación no oxidativa de derivados carbonílicos.

[0262]La base del efecto positivo del zinc identificado sobre el estado oxidativo general puede ser tanto su influencia directa en los procesos de oxidación de radicales libres en la etapa de inicio de reacciones en cadena como su inclusión en los centros activos de las enzimas antioxidantes. También es importante mencionar el efecto estabilizador de membranas de este oligoelemento, que puede ser también uno de los mecanismos de su acción antioxidante. El papel del zinc como antioxidante se confirma por su capacidad para actuar como estabilizador intramolecular que previene la formación de estructuras disulfuro. Además, el zinc sustituye competitivamente a los iones de cobre y hierro, que provocan la formación de radicales libres.

[0263]Los procesos de radicales libres están controlados y regulados por la defensa antioxidante (AOD), un complejo sistema multicomponente y multinivel. En un estado fisiológicamente normal, se mantiene el equilibrio entre los niveles de reacciones de oxidación de radicales libres y la actividad de este sistema, lo que garantiza el mantenimiento de los procesos de peroxidación lipídica en un nivel estacionario, bastante bajo.

[0264]El sistema de defensa antioxidante consta de unidades enzimáticas y no enzimáticas. Los antioxidantes no enzimáticos proporcionan principalmente una rápida inactivación de los radicales libres de oxígeno y nitrógeno, mientras que los antioxidantes enzimáticos se refieren al sistema terminal de defensa a largo plazo del cuerpo.

[0265]La superóxido dismutasa (EC1.15.1.1) es una de las enzimas clave de la AOD. Esta enzima cataliza una reacción de neutralización de los radicales aniónicos superóxido mediante su dismutación en moléculas menos reactivas de peróxido de hidrógeno y oxígeno triplete. SOD es la única enzima antioxidante más activa que rompe las cadenas de reacciones de radicales libres dependientes de oxígeno en las células aeróbicas. Poberezkina N.B., Osinskaya L.F. Biological role of superoxide dismutase // Ukr. biohim journal.-1989.-Vol.61, 2.-P. 14-27. Dudochnik L.B., Tikhaze A.K., Alesenko A.V. et al. Change in the activity of superoxide dismutase and glutathione peroxidase in the process of lipid peroxidation intensification in liver ischemia // Bul. exp. biol. Med.-1981.-Vol.XCI, 4.-P. 451-453.

[0266]Dado el papel protagónico de la SOD en el metabolismo de las especies reactivas de oxígeno y una contribución significativa de los radicales anión superóxido a la inducción y desarrollo del estrés oxidativo, se investigó la actividad de la SOD dependiente de Cu-Zn en el suero de modelos animales de obesidad tratados y no tratados con el isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato.

[0267]En este experimento, se encontró una disminución estadísticamente significativa en la actividad de SOD en animales que comían una dieta alta en grasas. La administración del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato a animales de experimentación provocó un aumento en la actividad de SOD no sólo en comparación con los valores en modelos animales de obesidad no tratados, sino también en relación con el control (Tabla 16).

Tabla 16 Actividades de superóxido dismutasa y catalasa séricas en animales de grupos experimentales (M ± m, n=10)

[0268]Teniendo en cuenta una determinada deficiencia de zinc, característica de la patogénesis de la obesidad, la restauración de la actividad de esta enzima tras la administración de una solución del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato puede ser consecuencia de la normalización de sus niveles en el organismo y de su participación activa en la regulación y síntesis de enzimas dependientes de zinc, en particular SOD.

[0269]Una disminución de la actividad de la SOD puede verse como consecuencia de un cierto agotamiento del sistema de defensa antioxidante debido al daño gradual de sus componentes por parte de los radicales libres y los LOP. Así, según los conceptos modernos, la actividad de esta enzima está estrechamente relacionada con la intensidad de los procesos LOP, ya que la acumulación excesiva de productos secundarios tóxicos de la oxidación de lípidos provoca la inhibición de la actividad de la SOD y otras enzimas del sistema antioxidante. La revisión de la literatura y el análisis de datos sobre la implicación de las ROS en la degradación oxidativa de proteínas sugieren que una disminución en la actividad enzimática de la SOD puede deberse a una modificación oxidativa de la molécula enzimática. Dado que la SOD es una enzima que contiene metales, se pueden formar radicales de oxígeno que dañan las proteínas directamente en el centro activo de la enzima. En este caso, el radical hidroxilo, OH-, formado en las reacciones de Fenton y Haber-Weiss a partir de hidrógeno y superóxido, actúa como agente directo que inactiva la enzima. Así, los experimentos de Salo DC et al. muestran que la incubación de superóxido dismutasa en un medio que contiene radicales de oxígeno conduce a la escisión de una molécula de enzima, lo que resulta en la formación de fracciones de proteína adicionales. Los autores explican el resultado mediante la inactivación oxidativa de la superóxido dismutasa cuando se expone a H2O2. Esta opinión es consistente con la capacidad de los átomos de cobre en el centro activo de la enzima para acelerar la formación de radicales libres. Otro argumento a favor de la participación de metales con varios estados de oxidación comunes en la inactivación de SOD es el hecho de que la superóxido dismutasa que contiene Mn2+ no es susceptible a la degradación oxidativa cuando se incuba con H2O2.

[0270]Dado que una enzima antioxidante importante en el sistema es la catalasa, que neutraliza el peróxido de hidrógeno formado como resultado de la dismutación del radical aniónico superóxido por la superóxido dismutasa, la actividad de esta enzima en modelos animales de obesidad tratados y no tratados con el isótopo estable Zn-64 en Se evaluó la forma de aspartato. De manera similar a una disminución en la actividad de SOD, se observó una inhibición de la actividad catalasa en animales obesos no tratados.

[0271]Una disminución de la actividad de ambas enzimas en el contexto de la activación de los procesos de peroxidación lipídica se considera un evento de pronóstico negativo que contribuye a una mayor intensificación de los procesos de radicales libres.

[0272]La administración del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato provocó un ligero aumento en la actividad de la catalasa en comparación con los resultados obtenidos en el grupo de modelos animales de obesidad no tratados, que generalmente se correlacionaban con la normalización previamente establecida del equilibrio prooxidante-antioxidante.

[0273]La normalización de la actividad de las enzimas antioxidantes estudiadas tras la administración de la sustancia problema coincide con los datos publicados sobre otras formas de este ion. Así, se demostró que la administración preliminar del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato condujo a un aumento de la actividad de SOD y catalasa en hepatocitos de rata en intoxicación por etanol.

[0274]El efecto positivo revelado del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato sobre la actividad de enzimas antioxidantes clave puede explicarse, en primer lugar, por un aumento en su síntesis debido a un aumento en las concentraciones de zinc, un elemento estructural necesario. asegurando una adecuada actividad funcional de estas enzimas.

[0275]Los resultados obtenidos sobre el efecto normalizador del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato sobre el equilibrio prooxidanteantioxidante confirman un importante potencial antioxidante de este isótopo. Aunque el zinc no pertenece a los antioxidantes típicos que pueden interrumpir directamente las reacciones de los radicales libres, tiene un efecto indirecto sobre el equilibrio general prooxidante-antioxidante. Así, el zinc es un inhibidor de las NADPH oxidasas, un grupo de enzimas implicadas en la formación del radical anión superóxido agresivo.

[0276]Al interactuar directamente con los grupos sulfhidrilo de las proteínas, el zinc los protege de la oxidación por especies activas de oxígeno, induce la síntesis de metalotioneínas, proteínas de unión a metales ricas en cisteína que actúan como una trampa para los radicales, ayuda a inhibir la formación de óxidos metales reactivos de valencia mixta y exhibe un efecto estabilizador de membrana. Se ha descubierto que la deficiencia de zinc en la dieta disminuye las concentraciones de vitamina E en el plasma y en algunos otros órganos, lo que afecta la reserva general de antioxidantes del cuerpo.

[0277]Otro mecanismo para la implementación de las propiedades antioxidantes del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato está asociado con su capacidad para estabilizar las membranas celulares, lo cual es especialmente importante en el estrés oxidativo progresivo. Una posible causa del efecto protector de las membranas del zinc puede explicarse por su papel mediador en la inducción de la síntesis de metalotioneínas directamente implicadas en la desintoxicación de metales pesados y la estabilización de las membranas. Los niveles elevados de metalotioneínas pueden mantener la integridad de las membranas y proteger las células de la acción de los agentes alquilantes.

[0278]Se ha descubierto que el zinc puede estabilizar la membrana celular influyendo en la síntesis de fosfolípidos (activación de PS sintasa, PS descarboxilasa, PEA metiltransferasa y fosfolípido metiltransferasa con una disminución simultánea de la actividad de PHI sintetasa) y su distribución asimétrica.

[0279]Por lo tanto, dada la importancia de controlar la intensidad de las reacciones de los radicales libres y mantener un estado antioxidante adecuado del cuerpo, especialmente para pacientes con enfermedades sistémicas crónicas cuya patogénesis está estrechamente asociada con el desarrollo de estrés oxidativo, el uso del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato como medio adicional en la terapia básica de la enfermedad puede contribuir a la mejora del estado metabólico general.

Efectos del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato sobre el perfil de citocinas, los niveles de resistina y grelina en modelos animales de obesidad

[0280]No hay duda de que el tejido adiposo no es sólo un depósito de energía del cuerpo, sino también un órgano que participa activamente en la regulación del metabolismo a través de un complejo de señales endocrinas, paracrinas y autocrinas que modulan las respuestas de muchos tejidos y órganos, incluido el hipotálamo, hipófisis, páncreas, hígado, músculos esqueléticos, riñones, endotelio, sistema inmunológico, etc. Así, el tejido adiposo secreta más de 50 factores proteicos, hormonas y factores de crecimiento, incluidas las citocinas. Existen citocinas proinflamatorias, como IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, TNF-a, IFN-y y atocinas antiinflamatorias, como IL-4, IL-10, IL -13, TGF Mohamed-Ali V., Pinkney J., Coppacf S. Adipose tissue as endocrine and paracrine organ // Int J Obes Relat Meabol Disord 1998; 22: 1145-1158.

[0281]Una de las consecuencias de la producción excesiva de especies reactivas de oxígeno en los adipocitos es el inicio de cascadas de señalización, que conducen a un aumento en la producción de citocinas proinflamatorias por parte de los macrófagos que se infiltran en el tejido adiposo aumentando su masa. El resultado de tales trastornos es la formación de inflamación crónica sistémica en el cuerpo de una persona que desarrolla obesidad. Según el concepto moderno activamente discutido, se cree que la inflamación crónica subclínica en el tejido adiposo es uno de los eslabones clave en la patogénesis de la obesidad y las enfermedades relacionadas con la obesidad. La inflamación crónica del tejido adiposo se caracteriza por infiltración celular, fibrosis, cambios en la microcirculación, alteración de la secreción de adipocinas y trastornos del metabolismo del tejido adiposo, así como niveles elevados en sangre de marcadores inflamatorios no específicos como la proteína C reactiva, el fibrinógeno y los leucocitos Rajala M., Scherer E. // Endocrinology 2003; 144: 3765-3773.

[0282]Como resultado del proceso inflamatorio en el tejido adiposo se produce un aumento de los niveles de citocinas proinflamatorias no sólo en el tejido adiposo, sino también en el suero sanguíneo.

[0283]Las citocinas, como mediadores endógenos biológicamente activos que regulan las interacciones intercelulares y entre sistemas, tienen un efecto sobre la supervivencia de las células regulando su crecimiento, diferenciación, actividad funcional y apoptosis. Aseguran la coordinación de las acciones de los sistemas inmunológico, endocrino y nervioso en condiciones fisiológicas y en respuesta a efectos patológicos. Anteriormente se creía que las citocinas eran producidas por linfocitos, monocitos y macrófagos tisulares. Sin embargo, los resultados de investigaciones recientes muestran que, en la obesidad, como en cualquier proceso inflamatorio, la infiltración de neutrófilos, linfocitos T y luego macrófagos residentes en el tejido adiposo se produce en una etapa temprana, lo que determina los mecanismos iniciales de inflamación. Se ha demostrado que los macrófagos contribuyen a la hipertrofia de los adipocitos, que se acompaña de un aumento de su actividad funcional y de una mayor síntesis de citoquinas y conduce a una mayor intensificación de la respuesta inflamatoria. Los adipocitos hipertrofiados secretan intensamente quimiocinas y sus receptores, que estimulan la entrada de nuevos neutrófilos, macrófagos y linfocitos, contribuyendo así a un mayor aumento de la hipertrofia de los adipocitos, a la preservación y a la intensificación de la respuesta inflamatoria. Los adipocitos aumentan la secreción de citocinas por los macrófagos, que a su vez actúan sobre los adipocitos, provocando hipertrofia y activación de las células del tejido adiposo. Se ha descubierto que los adipocitos hipertrofiados, al igual que los linfocitos y los macrófagos, producen citoquinas y activan el complemento, desencadenando una cadena de procesos inflamatorios. Como resultado, la inflamación se vuelve constante y sistémica. Además, los productos de peroxidación lipídica, como el trans-4-oxi-2-nonenal y el dialdehído malónico, son quimioatrayentes para monocitos y macrófagos. El fortalecimiento de los procesos de peroxidación lipídica en el tejido adiposo acumulado contribuye a la atracción e infiltración de macrófagos en el tejido adiposo en la obesidad, contribuyendo así activamente al lanzamiento de reacciones de inflamación.

[0284]En consecuencia, una masa creciente de tejido adiposo es una fuente constante de citocinas proinflamatorias sintetizadas tanto por los adipocitos como por los macrófagos incorporados al tejido adiposo, lo que conduce a la formación de un proceso inflamatorio crónico y al mantenimiento de la inflamación en el organismo. Su baja intensidad no da síntomas clínicos directos, pero al mismo tiempo, este proceso es de naturaleza sistémica, lo que significa que afecta a una amplia gama de órganos y tejidos provocando cambios en su metabolismo y perjudicando su función y reacciones del sistema inmunológico.

[0285]Teniendo en cuenta lo anterior, la siguiente fase del estudio fue conocer si la administración del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato tiene efecto sobre el perfil de citoquinas en animales obesos. Para ello, se determinaron las concentraciones de las principales citoquinas proinflamatorias (IL-1, IL-6, IL-12, IFN-y) y antiinflamatorias (IL-4, IL-10, TGF) en el tejido adiposo y en el suero de animales de experimentación, lo que permitió concluir sobre la intensidad del proceso inflamatorio en el tejido adiposo y evaluar si dicho proceso inflamatorio es sistémico.

[0286]Según los resultados obtenidos, el desarrollo de obesidad estuvo acompañado de un aumento en los niveles de todas las citoquinas proinflamatorias analizadas (Tabla 17) en el tejido adiposo de animales alimentados con una dieta rica en grasas, lo que indica la activación del proceso inflamatorio.

[0287]A su vez, un proceso inflamatorio prolongado puede conducir al desarrollo de diversas complicaciones y ser un factor de riesgo de resistencia a la insulina y diabetes. Las citocinas no sólo pueden reducir la sensibilidad de las células a la acción de la insulina, sino que también intensifican los procesos inflamatorios y aumentan la acumulación de intermediarios inflamatorios, provocando daño tisular y disfunción de órganos J. Hirosumi et al. // Nature. - 2002. - Vol.

420, 6913. - p. 333-336. C. Jiang, W. Wang, J. Tang. // Journal of Endocrinological Investigation. -2013. -vol. 36, 11. - p.

986-992.

Tabla 17 Perfil de citocinas en el tejido adiposo de animales de grupos experimentales (M ± m, n=10)

[0288]Se ha demostrado que niveles elevados de citoquinas proinflamatorias, incluidas las mencionadas anteriormente, pueden provocar la apoptosis de las células p. Las altas concentraciones de IL-12, cuya expresión es activada por IFN-y, provocan la infiltración de linfocitos CD8 en el páncreas y el desarrollo de pancreatitis aguda. La IL-1p, mediante su unión a receptores específicos en la superficie de estas células, provoca la activación de la apoptosis mediada por NF-xB, lo que conduce a la fragmentación del ADN y la pérdida de la actividad funcional de las células. Además, la IL-1p también puede considerarse como uno de los factores que contribuyen al desarrollo de resistencia de los tejidos periféricos a la insulina. Se ha demostrado que la IL-1p activa la IkB quinasa-p, que tiene un efecto sobre la señalización de la insulina al fosforilar un residuo de serina en el sustrato del receptor de insulina (IRS)-1. Además, la IL-1p es capaz de aumentar la resistencia a la acción de la insulina de forma indirecta, activando la lipogénesis en el hígado y contribuyendo a un aumento de los niveles de triglicéridos y ácidos grasos libres en los adipocitos.

[0289]Se ha demostrado que la acumulación de IL-6 es directamente proporcional al aumento de la masa de tejido adiposo en sangre periférica. Los adipocitos son la segunda fuente más importante de IL-6 después del sistema inmunológico: el 35% de la IL-6 circulante es sintetizada por las células adiposas. Su concentración en sangre es directamente proporcional al índice de masa corporal y aumenta en la obesidad. Al mismo tiempo, una disminución del peso corporal va acompañada de una disminución de los niveles sanguíneos de IL-6. Cuando hay un exceso, la IL-6 exacerba la resistencia a la insulina al suprimir la síntesis de una de las subunidades del receptor de insulina. Al activar la lipólisis en el tejido adiposo visceral, la IL-6 contribuye al desarrollo progresivo de la hepatosis grasa y la aterosclerosis sistémica. Además, la<i>L-6 induce una mayor producción de proteína C reactiva (PCR), otro factor asociado con la obesidad V. Rotter et al. // Journal of Biological Chemistry. - 2003. - 278.- p. 45777-45784. Fantuzzi G. / Journal of Allergy and Clinical Immunology. - 2005. - Vol. 115, 5. - p. 911-919.

[0290]Uno de los mecanismos de control de los niveles y, en consecuencia, de los efectos biológicos de las citocinas proinflamatorias lo ejerce un grupo de citocinas antiinflamatorias. Estas citocinas pueden inhibir la síntesis de citocinas proinflamatorias al afectar la transcripción de genes específicos, inducir la síntesis de antagonistas de los receptores de interleucinas RAIL, mejorar la producción de receptores solubles y reducir la densidad de receptores proinflamatorios en las células. Por lo tanto, para aclarar los posibles mecanismos de los efectos del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato sobre el perfil de citoquinas proinflamatorias, se determinaron los niveles de IL-4, IL-10 y TGF.

[0291]Los cambios detectados en los niveles de citocinas proinflamatorias se produjeron en el contexto de una ligera disminución en los niveles de citocinas antiinflamatorias en animales obesos. Al mismo tiempo, en los animales tratados con el isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato, los niveles de citoquinas antiinflamatorias no solo fueron más altos que en los modelos animales de obesidad no tratados, sino también más altos que en los animales del grupo de control.

[0292]Cabe destacar que la ausencia de cambios en los animales del grupo de control tratados con la sustancia de prueba sugiere que el uso prolongado del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato es seguro y puede mostrar un efecto terapéutico sólo con el desarrollo de condiciones patológicas.

[0293]Como se mencionó anteriormente, la patogénesis de la obesidad va acompañada de un proceso inflamatorio crónico sistémico, cuya intensidad puede evaluarse mediante los niveles séricos de citocinas pro y antiinflamatorias.

[0294]El análisis del perfil de citocinas en el suero de animales obesos (Tabla 18) mostró un aumento en los niveles de citocinas proinflamatorias, más pronunciado en comparación con los datos obtenidos del tejido adiposo. No se encontraron cambios estadísticamente significativos en los niveles de la citoquina antiinflamatoria IL-4. Un ligero aumento de los niveles séricos de IL-10 en animales obesos puede considerarse como una cierta respuesta compensatoria del organismo ante un trastorno metabólico.

[0295]En los animales tratados con el isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato se observó una disminución de los niveles de citocinas proinflamatorias en comparación con un aumento de los niveles de citocinas antiinflamatorias, que fueron incluso mayores que en los animales del grupo de control.

Tabla 18 Perfil de citoquinas en el suero de animales de grupos experimentales (M ± m, n=10)

[0296] Uno de los mecanismos básicos del efecto del zinc sobre el perfil de citoquinas puede ser su inhibición de factores de transcripción sensibles al estrés oxidativo. El zinc también puede bloquear parcialmente genes que codifican citocinas proinflamatorias, como la IL-6 y la IL-8.

[0297] Un cierto efecto normalizador del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato sobre el perfil de citoquinas en modelos animales de obesidad puede servir como evidencia del posible potencial antiinflamatorio de la sustancia de prueba estudiada en la obesidad.

[0298] Por tanto, una disminución de los niveles de citocinas proinflamatorias en el suero y el tejido adiposo de animales tratados con isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato puede deberse en parte a un aumento de los niveles de citocinas antiinflamatorias. Teniendo en cuenta la existencia de una estrecha relación entre la cantidad de tejido adiposo y los niveles de citocinas proinflamatorias que produce, parece que el efecto positivo revelado del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato sobre el perfil de citocinas se asocia principalmente con su influencia sobre el peso corporal, y por tanto sobre la cantidad de tejido adiposo.

[0299] Además de las citocinas, los adipocitos secretan una serie de sustancias biológicamente activas implicadas en la regulación del metabolismo energético. Una de estas sustancias es la resistina o el factor secretor específico de los adipocitos (ADSF/FIZZ3). La participación de la resistina en la estimulación de los mecanismos de inflamación, la activación del endotelio y la proliferación de las células del músculo liso vascular permite considerarla como un marcador o incluso un factor etiológico en el desarrollo de enfermedades. Esta hormona derivada del tejido adiposo tiene un efecto de retroalimentación sobre el metabolismo de las grasas: por un lado, sus concentraciones aumentan con la diferenciación de los adipocitos y, por otro lado, la resistina suprime la adipogénesis. Resistina, como una de las causas de la resistencia a la insulina, puede ser un vínculo entre la obesidad y el desarrollo de diabetes. Según los datos de la literatura, los niveles de resistina pueden usarse como un predictor de susceptibilidad a la diabetes tipo II y la obesidad. Se ha demostrado que la resistina es capaz de reducir la sensibilidad de los tejidos periféricos a la acción de la insulina, estimulando así el desarrollo de resistencia a la insulina. La resistina activa la expresión dependiente de NP-<k>B y la liberación de citoquinas proinflamatorias y moléculas de adhesión, incluidos TNF-a e IL-6 Fantuzzi G. / Journal of Allergy and Clinical Immunology. -2005. - Vol. 115, 5. - p. 911-919. C. Jiang et al.,// Journal of Endocrinological Investigation. -2013. -vol. 36, 11. - p. 986 992.

[0300] Por lo tanto, se investigaron los niveles de resistina en el tejido adiposo y el suero de modelos animales de obesidad de todos los grupos experimentales. De acuerdo con los resultados obtenidos en el experimento, hubo una tendencia al aumento de los niveles de esta adipocina, más pronunciada en el tejido adiposo (Tabla 19).

Tabla 19 Niveles de resistina y grelina en te jido adiposo y suero de animales de grupos experimentales (M ± m, n=10)

[0301] Teniendo en cuenta que la resistina es un promotor de la maduración de las células grasas y actúa como regulador autocrino de la formación de factores adiabáticos en el tejido adiposo, incluso un ligero aumento en los niveles de esta adipoquina contribuirá al crecimiento y progresión del tejido adiposo de trastornos metabólicos asociados a la obesidad.

[0302] Los niveles de resistina en modelos animales de obesidad inyectados con isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato estaban dentro de los valores de control.

[0303] Dado que la resistina es secretada principalmente por los preadipocitos y, en menor medida, por los adipocitos maduros del tejido adiposo visceral, el efecto positivo del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato puede explicarse por su capacidad de influir en el peso corporal de los animales y, por tanto, la acumulación de masa grasa en animales mantenidos con una dieta rica en grasas.

[0304] Otro factor directamente implicado en la regulación del apetito es la grelina, una hormona lipófila secretada principalmente por las células P/D1 que recubren el fondo del estómago y, en menor medida, por otros órganos, como el hipotálamo, la hipófisis, las gónadas y células £ de los islotes de Langerhans. Este péptido juega un papel importante en la regulación del hambre y del metabolismo energético, estimulando la ingesta de alimentos y provocando el desarrollo de obesidad. Los receptores de grelina se localizan en las mismas estructuras hipotalámicas que el receptor de leptina, Ob-Rb, y en los núcleos arqueado y ventromedial. Sus altos niveles pueden contribuir al aumento de peso a largo plazo. Cuando se reduce el umbral del nivel de grelina en el cuerpo, el apetito disminuye F. Ferrini et al., // Current Neuropharmacology. - 2009. - vol. 7, 1. - p. 37-49. J. Camiña et al., // Endocrine. - 2003. - Vol. 22, 1. - p. 5-12.

[0305] Estudios realizados en los últimos años han revelado la importancia de la grelina en la regulación del equilibrio energético del organismo mediante la influencia de esta hormona sobre el hipotálamo con la participación del neuropéptido Y y el sistema endocanabinoide.

[0306] La expresión de grelina aumenta en respuesta a la hipoglucemia y se inhibe durante la hiperglucemia. Esto puede indicar que la grelina combina las respuestas metabólicas y hormonales del cuerpo al ayuno, con la participación de la insulina y los mecanismos que mantienen una concentración adecuada de glucosa sérica. La grelina tiene propiedades orexigénicas, adipogénicas y somatotrópicas y actúa como antagonista de la leptina, aumentando la necesidad de alimento. Se ha demostrado que la inmunización activa contra la grelina provoca pérdida de peso. El efecto orexigénico de la grelina consiste en su capacidad para aumentar la actividad neuronal del neuropéptido Y e inhibir las neuronas de proopiomelanocortina.

[0307] Los receptores de grelina se encuentran tanto en el sistema nervioso central (hipófisis, hipotálamo) como en otros órganos (páncreas, intestino, estómago). Este péptido juega un papel importante en la regulación del hambre y del metabolismo energético, estimulando la ingesta de alimentos y provocando el desarrollo de obesidad. Sus niveles aumentan en ayunas, pérdida de peso, ingesta calórica de alimentos e hipoglucemia. Los niveles elevados de grelina en plasma después de la pérdida de peso causada por la dieta son consistentes con la hipótesis de que la grelina desempeña un papel en la regulación a largo plazo del peso corporal. Los niveles de grelina están reducidos en personas con obesidad, diabetes tipo 2 e hipertensión.

[0308] Dada la estrecha relación entre la alteración de la homeostasis energética y el desarrollo de obesidad, se analizaron los niveles séricos de grelina en modelos animales de obesidad tratados y no tratados con el isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato.

[0309] Los datos muestran (FIG. 16) que el desarrollo de obesidad fue acompañado por una disminución en los niveles de esta hormona, y la administración del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato a los animales del grupo de control también provocó una disminución en sus niveles de suero. En general, estos datos concuerdan con la información proporcionada en la literatura, porque se sabe que los niveles de grelina circulante se correlacionan inversamente con un balance energético positivo, el peso corporal total y la masa de tejido adiposo, el tamaño de los adipocitos y los niveles de leptina. Por ejemplo, los niveles de grelina en pacientes con anorexia son más altos que en pacientes que desarrollan obesidad. En modelos animales de obesidad a los que se les inyectó la sustancia de prueba, los niveles de grelina fueron similares a los determinados en animales del grupo de control M. Kojima, K. Kangawa. // Physiological Reviews. - 2005 -vol. 85, 2. - p. 495-522.

[0310] Por lo tanto, los datos sugieren que el isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato tiene un efecto normalizador sobre el estado funcional de los adipocitos, lo que puede resultar en la restauración del equilibrio de citoquinas al estado fisiológicamente normal.

Niveles de iones metálicos divalentes en los órganos de modelos animales de obesidad

[0311] La participación del zinc en los procesos fisiológicos y fisiopatológicos depende en gran medida de sus niveles en el organismo. El zinc se encuentra en todas las células y órganos, pero sus concentraciones en uno u otro órgano varían considerablemente y dependen de la actividad específica del órgano. Las reservas de zinc en el cuerpo humano son bastante pequeñas y ascienden a entre 1,5 y 3 g. Esta figura depende de muchos factores: la edad y el sexo de la persona, el estado de la mucosa gastrointestinal, las enfermedades asociadas, el embarazo, etc. El zinc se encuentra en casi todos los tejidos. Alrededor del 62-63 % de las reservas de zinc se encuentran en los músculos esqueléticos. Según los datos proporcionados por varios investigadores, el zinc se distribuye en el cuerpo humano de la siguiente manera (mg/g): piel, glándulas suprarrenales - 6, ovarios -12, cerebro -13, ganglios linfáticos - 14, tracto gastrointestinal - 21, corazón -27, riñones -37, hígado - 38, músculos - 48, huesos -66, próstata - 87, esperma -125. La sangre entera contiene aproximadamente de 2,5 a 5,3 pg/ml de zinc. Hay menos zinc en el plasma (0,7 a 1,2 pg/ml, que es aproximadamente del 0,2 al 1 % de la cantidad total de zinc en el cuerpo). Los niveles de zinc en el suero sanguíneo son ligeramente superiores (1,1 a 1,3 pg/ml) que en el plasma debido a la destrucción de los glóbulos rojos.

[0312]Se determinaron los niveles de zinc y algunos metales divalentes (cobre y manganeso) en músculos esqueléticos, riñones e hígado de animales con obesidad, así como los efectos del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato sobre los niveles de estos metales.

[0313]La elección del cobre y el manganeso para el análisis se explica por su importancia excepcional y su participación en procesos metabólicos clave. Además, los metales estudiados tienen un efecto sobre la digestibilidad y biodisponibilidad de unos de otros, por lo que un nivel anormal de uno de ellos suele ser resultado o causa de cambios en los niveles de los otros metales mencionados anteriormente. La mayoría de las veces compiten entre sí. Así, por ejemplo, el hierro presente en grandes cantidades en los alimentos reduce aproximadamente el doble la absorción de zinc. La presencia de cobre también reduce la absorción de zinc en el tracto gastrointestinal debido a su asociación competitiva con las metaloenzimas de transporte.

Tabla 20 Niveles de iones metálicos divalentes en músculos, riñones e hígado de animales de grupos experimentales (M ± m, n=10)

[0314]El cobre pertenece a los oligoelementos esenciales. El cuerpo de un adulto contiene entre 110 y 150 mg de cobre. La mitad de esta cantidad se encuentra en los músculos. Las reservas más pequeñas de cobre se concentran en el hígado, la materia gris en los hemisferios cerebrales y en la médula ósea. Este importante oligoelemento se encuentra en enzimas y proteínas (principalmente ceruloplasmina). Esta última es una metaloenzima que cataliza la oxidación de varias sustancias biológicamente activas y asegura el suministro de cobre a diversos tejidos y órganos. Se sabe que el cobre es un activador específico de la citocromo oxidasa, la tirosinasa y la cobre oxidasa. El cobre activa la arginasa y la aminopeptidasa, enzimas del metabolismo de las proteínas, que potencian la síntesis de ácidos nucleicos necesarios para los procesos de curación. Este biótico participa en los procesos de formación de sangre, síntesis de hemoglobina, función del sistema citocromo y forma parte del estroma de los glóbulos rojos. El cobre utilizado en microdosis aumenta los niveles de glucógeno en los músculos esqueléticos y el hígado. Muestra una actividad similar a la de la insulina, acelerando la oxidación de la glucosa e inhibiendo la degradación del glucógeno. El cobre fortalece la función neutralizadora del hígado y normaliza el metabolismo mineral. El cobre forma parte de muchas enzimas, determina su función y regula su acción. Forma parte de todas las oxidasas y, como tal, es un elemento importante de las reacciones redox del organismo. Estas enzimas son necesarias para los procesos de respiración celular y protección de las células de los efectos de los radicales libres y participan en la síntesis de mielina, la biosíntesis del tejido conectivo y el metabolismo de las glándulas. La actividad antioxidante del cobre está asociada a su participación en la formación estructural de la superóxido dismutasa.

[0315] El manganeso es un oligoelemento esencial necesario para garantizar un estado metabólico adecuado del organismo. Sus niveles más altos se encuentran en los huesos, el hígado y la materia gris de los hemisferios cerebrales. Este biótico tiene un efecto similar al de la insulina, reduciendo los niveles de glucosa en sangre y aumentando la síntesis de glucógeno. Se ha descubierto que el manganeso estimula la formación de sangre. Tiene una alta actividad oxidativa y una pronunciada acción lipotrópica (similar a la colina). Este oligoelemento influye en el metabolismo de las grasas y las proteínas y en la síntesis de varias vitaminas. Además, forma parte de los sistemas enzimáticos más importantes. Las sales de manganeso debilitan el efecto hipertensivo de la adrenalina e inducen una disminución de la hiperglucemia de adrenalina. El manganeso tiene efectos reductores del colesterol y antiescleróticos.

[0316] Según los resultados obtenidos (Tabla 20), hubo una tendencia a la redistribución del zinc entre los órganos en el desarrollo de la obesidad. Así, los niveles de zinc aumentaron ligeramente en los riñones y disminuyeron en el hígado y los músculos. Un aumento de los niveles de zinc en los músculos de animales tratados con el isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato es, por un lado, bastante natural, dado que la mayor parte de las reservas de zinc en condiciones fisiológicas normales se encuentran en los músculos esqueléticos, y Por otro lado, esto puede considerarse como una confirmación indirecta de la ausencia de alteraciones funcionales visibles en los procesos de transporte y deposición de zinc en animales obesos a los que se les administró la sustancia de prueba.

[0317] Más significativa es la disminución de los niveles de zinc en el hígado de modelos animales de obesidad. Después de todo, el hígado es el lugar principal para la síntesis de proteínas que contienen zinc. Por tanto, una disminución de las reservas de zinc en este órgano contribuirá al desarrollo y progresión de trastornos asociados con la insuficiencia de enzimas que contienen y dependientes de zinc. Una de las consecuencias de reducir los niveles de zinc en el hígado puede ser una disminución en la actividad sérica de la superóxido dismutasa en animales obesos que se identificó en la fase anterior de este estudio.

[0318] Los niveles de zinc en el hígado de los animales alimentados con una dieta rica en grasas e inyectados con el isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato fueron incluso ligeramente más altos que en los animales del grupo de control, lo que es indicativo de la restauración de la homeostasis del zinc.

[0319] En cuanto al cobre, hubo una tendencia a aumentar sus niveles en los músculos y disminuir en los riñones. Los cambios más pronunciados en las concentraciones de cobre se observaron en el hígado, órgano que desempeña un papel importante en el metabolismo de este oligoelemento.

[0320] Cabe destacar que el zinc compite con el cobre en los procesos de absorción en el intestino y, en concentraciones elevadas, puede provocar el desarrollo de una deficiencia de cobre en el organismo. Por lo tanto, la ausencia de cambios significativos en los niveles de cobre en animales tratados con el isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato indica que el nivel de dosis de este elemento se seleccionó adecuadamente.

[0321] Estos resultados sugieren un efecto positivo del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato en sistemas clave directamente involucrados en el desarrollo y progresión de la obesidad.

[0322] En general, resumiendo los resultados, el isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato, administrado a modelos animales de obesidad, muestra un efecto complejo que se extiende a varios sistemas, cuya función alterada puede tener consecuencias más graves para el organismo.

[0323] Considerando la importancia de preservar la homeostasis del zinc para asegurar un estado fisiológico adecuado de todos los tejidos del cuerpo, en particular el tejido adiposo, parece que los datos obtenidos sobre el efecto positivo del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato en la obesidad están parcialmente asociados con la restauración de los niveles de zinc, reducidos durante la patogénesis de la obesidad.

[0324] Según los datos acumulados sobre el papel fisiológico del zinc, un aumento en sus niveles puede provocar una cascada de cambios bioquímicos que, en última instancia, determinan su efecto positivo general.

[0325] Existen varios mecanismos potenciales para la implementación de los efectos moduladores del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato. En primer lugar, se trata de mejorar la síntesis de enzimas y factores de transcripción dependientes del zinc. Aumentar el número de enzimas antioxidantes clave debido a la disponibilidad de zinc, un componente estructural necesario de estas enzimas, en el contexto de la intensificación de los procesos de radicales libres y la progresión del estrés oxidativo ayudará a mantener una reserva antioxidante adecuada. Un hecho importante es la capacidad del zinc para inducir la síntesis de una serie de antioxidantes, citocinas antiinflamatorias y factores que participan activamente en la regulación de las cascadas de señalización celular y participan en la regulación de procesos básicos. Así, según datos de la literatura, los niveles de zinc-alfa-glicoproteína (ZA<g>), que contribuye a la disminución de los depósitos de grasa al estimular la lipólisis en los adipocitos, se reducen significativamente en la obesidad. Además, el proceso de diferenciación de los adipocitos, en particular del tejido adiposo marrón, está estrictamente determinado y controlado por un grupo de factores de transcripción, muchos de los cuales contienen zinc.

[0326] Así, los resultados de un análisis exhaustivo de los efectos del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato en la patogénesis de la obesidad muestran a este oligoelemento como un aditivo prometedor para ser utilizado en el desarrollo de compuestos biológicamente activos no sólo para el tratamiento de patologías acompañado de un proceso inflamatorio crónico, agotamiento sistémico de la reserva antioxidante y alteraciones en la función del sistema serotoninérgico, pero también para la prevención de enfermedades asociadas con trastornos metabólicos sistémicos.

CONCLUSIONES

[0327] Por primera vez, se llevó a cabo un estudio exhaustivo sobre los efectos del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato sobre los vínculos patogénicos clave del desarrollo y la progresión de la obesidad en modelos de obesidad inducida por la dieta. Los resultados obtenidos proporcionan una base objetiva para la conveniencia del uso del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato como agente terapéutico auxiliar en el tratamiento de pacientes con sobrepeso y obesidad.

[0328] Se ha demostrado que la administración del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato a animales que se mantuvieron con una dieta rica en grasas se acompaña de una disminución de su índice de masa corporal y ayuda a reducir el peso y la cantidad de alimento consumido en comparación con los modelos animales de obesidad no tratados.

[0329] Se ha descubierto que el isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato tiene un efecto positivo sobre el metabolismo de los lípidos en el cuerpo de animales alimentados con una dieta rica en grasas.

[0330] Se ha descubierto que el isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato tiene un efecto positivo sobre las propiedades morfofuncionales del páncreas y el hígado de animales que fueron alimentados con un alto contenido de grasas en comparación con los modelos animales de obesidad no tratados.

[0331] Se ha descubierto que el isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato administrado a animales alimentados con una dieta rica en grasas tiene un efecto modulador sobre la actividad de enzimas clave implicadas en el metabolismo de la serotonina, lo que ayuda a restaurar los niveles de serotonina central y periférica en comparación con los valores en los modelos animales de obesidad no tratados.

[0332] Se ha demostrado que la administración del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato contribuye a la normalización de la homeostasis prooxidante-antioxidante en animales que fueron alimentados con una dieta rica en grasas debido a una disminución en la intensidad de los procesos de radicales libres (disminución de los niveles de productos de peroxidación lipídica y modificación oxidativa de proteínas) en el contexto de la activación de la defensa antioxidante a través del aumento de la actividad de las enzimas antioxidantes (superóxido dismutasa y catalasa).

[0333] La capacidad del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato para influir en el perfil de citocinas en el suero y el tejido adiposo de animales mantenidos con una dieta rica en grasas, concretamente para reducir los niveles de citocinas proinflamatorias (IL-1, IL-6, IL-12, IFN-<y>) en el contexto de un ligero aumento en los niveles de citocinas antiinflamatorias (IL-4, IL-10, TGF), lo que generalmente indica una disminución en la intensidad de la inflamación sistémica.

[0334] Se ha descubierto que el isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato no tiene efectos visibles sobre los niveles de resistina en el tejido adiposo y el suero sanguíneo de animales con obesidad, así como sobre los niveles séricos de grelina.

[0335] Se ha descubierto que la administración del isótopo estable Zn-64 en forma de aspartato provoca la redistribución de iones metálicos divalentes (zinc, cobre, manganeso) entre músculos, riñones e hígado en modelos animales de obesidad y contribuye a la restauración de sus niveles fisiológicos.

EJEMPLO 7 Efectos de fármacos experimentales sobre las fluctuaciones de los niveles de insulina en la sangre de animales de laboratorio (ratas) mediante administración intraperitoneal

[0336]El prim er grupoestaba formado por animales a los que se les inyectó solución salina (peso corporal “ 180-220 gramos).

[0337] Número de animales: 8 (4 animales por grupo); 2 puntos de muestreo: el segundo día después de la administración del fármaco y el séptimo día después de la última inyección de solución salina (4x2 = 8).

[0338]El segundo grupoestaba formado por animales a los que se les inyectó acetato de zinc con distribución natural de isótopos (peso corporal = 180-220 gramos). La dosis actual fue calculada por zinc. A cada animal se le inyectaron 3750 |jg de zinc por 1 kg de peso corporal del animal. Un grupo de comparación para evaluar los efectos del zinc en animales de experimentación. El acetato de zinc es un compuesto de zinc estándar que se utiliza en la mayoría de los experimentos con animales y con diabetes.

[0339] Número de animales: 8 (4 animales por grupo); 2 puntos de muestreo: el segundo día después de la administración del fármaco y el séptimo día después de la última inyección de solución salina (4x2 = 8).

[0340] El tercer grupoestaba formado por animales a los que se les inyectó isótopo de zinc en forma de aspartato (Zn64) (peso corporal “ 180-220 gramos). La dosis actual fue calculada por zinc. A cada animal se le inyectaron 3750 |jg de zinc por 1 kg de peso corporal del animal.

[0341]Número de animales: 8 (4 animales por grupo); 2 puntos de muestreo: el segundo día después de la administración del fármaco y el séptimo día después de la última inyección de solución salina (4x2 = 8).

El esquema del experimento:

[0342]Los animales se colocan en jaulas, 4 por jaula, con libre acceso a comida y agua. Tres días después de que los animales hayan estado en jaulas, se les inyecta el fármaco experimental: zinc natural o zinc isotópicamente ligero. La administración se realiza en días alternos, en la cantidad de 7 inyecciones por animal (método de administración intraperitoneal del fármaco). La dosis del fármaco inyectada a cada animal se calculó basándose en la proporción: 3750 jg de zinc por 1 kg de animal. peso corporal. Después de la última inyección, la mitad de los animales se mantienen hambrientos (durante 12 horas) con libre acceso al agua. Una vez transcurrido este período, los animales se retiran del experimento. La segunda mitad de los animales seguirá teniendo libre acceso a comida/agua durante 7 días más. El día 6 después de la última inyección, los animales se mantienen hambrientos (durante 12 horas) con libre acceso al agua. Una vez transcurrido este período, los animales se retiran del experimento.

Materiales de investigación

Cumplimiento de la normativa de bienestar animal que rige las actividades de investigación con animales

[0343]Recomendaciones internacionales para la forma de realización de investigaciones biomédicas utilizando animales de acuerdo con los Principios Generales del Trabajo con Animales, aprobados por el Primer Congreso Nacional de Bioética (Kiev, Ucrania, 2001) y acordados con las disposiciones del "Convenio Europeo para la Protección de los Vertebrados que se utilizan para fines experimentales y otros fines científicos” (Estrasburgo, Francia, 1986) fueron seguidos mientras se trabajaba con animales de laboratorio. En el vivarium de la Universidad Nacional Taras Shevchenko de Kiev se llevaron a cabo experimentos con ratas. Los estudios con animales estaban regulados por las normas de trabajo experimental con animales de experimentación, que fueron aprobadas por el Consejo Científico de esta institución, que, a su vez, estaban coordinadas con la legislación vigente de Ucrania, adoptada en ese momento.

Condiciones para la forma de realización de investigaciones en ratas.

[0344]Los estudios se realizaron en ratas blancas de 2 a 3 meses de edad y con un peso de 120 a 300 g. Los animales experimentales se mantuvieron con una dieta de vivarium estándar con libre acceso al agua. Durante los experimentos, los animales se mantuvieron a temperatura ambiente de 19-24 °C, humedad no superior al 50 %, en modo de luz natural día-noche en jaulas de plástico. Antes de los experimentos, los animales fueron aclimatados en la sala de investigación durante 7 días.

Preparación de suero sanguíneo de ratas.

[0345]El suero de rata se preparó a partir de sangre entera. Para eliminar las proteínas y el fibrinógeno concomitantes, la sangre entera se dejó sin alterar a 37 °C durante 30 minutos, después de lo cual las muestras se centrifugaron a 2500 g durante 15 minutos. El sobrenadante resultante (suero) se separó inmediatamente de los glóbulos sanguíneos y se congeló a -20 °C para análisis adicionales.

Preparación de homogeneizados de riñón e hígado

[0346]Los homogeneizados totales de riñón, hígado y músculo se prepararon como sigue. La escisión y homogeneización de órganos se llevaron a cabo a una temperatura de 1-4 °C. La homogeneización de los tejidos se llevó a cabo en tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,4) que contenía NaCl 140 mM y EDTA 1 mM. El volumen del tampón utilizado en ml fue 5 veces mayor que la masa de los órganos aislados en gramos. El hígado aislado se perfundió con solución salina fría (NaCl al 0,9 %) a través de la vena porta utilizando una jeringa. El hígado picado se transfirió a un homogeneizador con un mortero de teflón finamente molido y se homogeneizó en tampón enfriado. Se perfundió un par de riñones aislados con solución salina fría, se liberó del tejido adiposo y se picó con tijeras. El tejido picado se transfirió a un homogeneizador con una mano de teflón finamente molida y se homogeneizó en tampón enfriado. Los homogenados totales de riñón e hígado se centrifugaron a 600 g durante 15 minutos. El líquido se decantó después de que la carne picada se asentara y se centrifugó nuevamente a 15.000 g durante 15 minutos. Estos dos procedimientos nos permitieron deshacernos de los desechos nucleares y mitocondriales. Se congelaron alícuotas de los homogeneizados preparados en nitrógeno (Rybalchenko VK, Koganov MM Structure and function of membrane 1988. - 312 pp).

1. Método para determinar el nivel de insulina en suero animal:

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

[0347] (Los niveles de insulina en suero sanguíneo de ratas se determinaron mediante inmunoensayo enzimático basado en el método común utilizado para proteínas solubles. Se llevó a cabo en microplacas de 96 pocillos con capacidad de sorción para proteínas solubles [Crowther JR The ELISA Guidebook / JR Crowther. - Totowa, Nueva Jersey: Humana Press Inc., 2001. - p. 436].

[0348] El suero se preparó como una dilución de 1 a 10 con tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,4) que contenía NaCl 150 mM. Se incubaron muestras en un volumen de 100 pl en pocillos de microplacas a 4°C durante la noche. Después de la incubación, los pocillos se lavaron con el tampón que comprendía tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,4) con NaCl 150 mM y Tween 20 al 0,05 % para eliminar el material no unido. Los sitios de unión no específicos se bloquearon con una solución bloqueadora de leche desnatada al 5 % y se incubaron durante 1 hora a 37 °C. Después del lavado, los pocillos separados de la microplaca se cargaron con anticuerpos primarios antiinsulina de conejo y se incubaron durante 1 hora a 37 °C. Después de la incubación, los pocillos de la microplaca se lavaron y cargaron con anticuerpos secundarios apropiados conjugados con peroxidasa de rábano picante y se incubaron durante 1 hora más a 37 °C. La unión de los anticuerpos secundarios se visualizó añadiendo 100 pl de solución de OPD a cada pocillo a una concentración de 0,4 mg/ml preparada en tampón citrato (pH 5,0) que contenía H2O2 al 0,013 %. La densidad óptica se midió a 492 nm. Las concentraciones de insulina se calcularon utilizando la curva de calibración generada en las condiciones dadas e insulina humana de concentración conocida).

Determinación de la actividad de superóxido dismutasa en el hígado y suero de rata

[0349] Se eligió un método que se basa en la capacidad de la enzima para inhibir el proceso de autooxidación de adrenalina para medir la actividad de la superóxido dismutasa (SOD, EC 1.15.1.1).

[0350] Se colocaron alícuotas de 10 pl de las muestras de prueba (homogenados de hígado y riñón) en pocillos de microplacas. Se añadieron a cada pocillo 200 pl de tampón bicarbonato 0,2 M (pH 10,65). La reacción se inició añadiendo 10 pl de una solución de adrenalina al 0,1 % a cada pocillo. No se añadió ninguna fuente de enzimas a la muestra en blanco. La densidad óptica se midió utilizando un lector de microplacas a una longitud de onda de 347 nm en el minuto 4 y 8 después de agregar adrenalina.

[0351] Un método clásico para medir la actividad enzimática basado en la cantidad acumulada del producto o la disminución en la cantidad de sustrato no es aplicable a la SOD porque es imposible construir una curva de calibración para el producto de reacción que es el producto oxidado de la adrenalina. La actividad de esta enzima se expresó en unidades convencionales/min*mg de proteína que se calcularon usando la siguiente fórmula:

A,- - X* 50

E * 4 * 10 0 * a

donde X es la densidad óptica de las muestras en blanco sin muestra de prueba igual a la diferencia entre la densidad óptica de la muestra en blanco al minuto 8 y densidad óptica de la misma en el minuto 4; Y es la densidad óptica de las muestras en blanco con la muestra de prueba igual a la diferencia entre la densidad óptica de la muestra en blanco en el minuto 8 y la densidad óptica de la misma en el minuto 4;aes una cantidad de proteína en la muestra en blanco, mg;4es el periodo de incubación entre la determinación de la extinción, 4 min;50/100es la conversión a unidades convencionales (Sirota T.V. Novel approach to the study of adrenaline auto-oxidation and its use for the measurements of superoxide dismutase activity // Vopr Med Khim - 1999. - 45 (3). - p. 263-272).

Determinación de la tolerancia a la glucosa.

[0352] En la prueba de tolerancia a la glucosa se utilizaron animales que tuvieron acceso únicamente al agua 16 horas antes del inicio del experimento. Las ratas fueron anestesiadas con una inyección intraperitoneal de tiopental sódico a una dosis de 40 mg/kg. Se utilizaron 5 animales dentro de un mismo grupo experimental. Se determinaron los niveles basales de glucemia en ratas, después de lo cual los animales fueron alimentados con 2 ml de solución acuosa de glucosa a una dosis de 3 g/kg. La concentración de glucosa se determinó 60 minutos después del inicio del experimento. La extracción de sangre se realizó a través de la vena de la cola (Gorbulinska O.V. Sugarlowering effects of water extracts of yakon (Smallanthus sonchifolius poepp. & endl.) / O.V. Gorbulinska, M.R. Khokhla, L.T. Mishenko et. al. // Biological Studios - 2014. - 8 (2). - p. 57-64.) Resultados ver FIG. 16A - FIG. 16E.

[0353] Según todos los datos analizados, no existen diferencias fiables entre los grupos de control (ratas inyectadas con solución salina) y los grupos a los que se les administró zinc. Esto puede deberse a dos factores: o la solución de zinc se administró incorrectamente (por vía intraperitoneal en lugar de por vía oral) o, dado que se utilizaron ratas intactas, pueden tener mecanismos compensatorios que, en caso de un aumento en la cantidad de zinc en el cuerpo, no permitir el desplazamiento del equilibrio del sistema insular hacia la hiperproducción de insulina, ya que esto puede provocar una hipoglucemia con todo lo que ello conlleva.

[0354] Al mismo tiempo, se observó un aumento significativo en el peso corporal de las ratas en el grupo al que se le administró un isótopo de zinc. Este es un resultado positivo, ya que las personas con diabetes tipo 1 suelen tener una disminución del peso corporal. Los datos obtenidos pueden indicar que el isótopo de zinc puede tener un efecto positivo en la dinámica del aumento de peso.

[0355] El análisis de los niveles de insulina en el suero de los grupos experimentales de animales mostró los siguientes resultados: no se observaron cambios significativos en los niveles de insulina durante todo el experimento en el grupo de animales de control. En el grupo de animales inyectados con acetato de zinc, se observó un aumento significativo en los niveles de insulina el primer día después de la retirada del fármaco, y luego una caída en los niveles de insulina al valor de los de los animales intactos/control. La situación inversa se observa en el grupo que recibió inyecciones de isótopo de zinc. El primer día después de la retirada del fármaco, los niveles de insulina fueron ligeramente superiores que en el grupo de animales intactos, y el día 7 después de la retirada se observó un aumento significativo en los niveles de insulina en este grupo de animales. FIG. 17.

[0356] Los resultados muestran que el isótopo de zinc, en comparación con el acetato de zinc, tiene un efecto más prolongado sobre los niveles de insulina en el suero sanguíneo o se libera más lentamente de los lugares de depósito, lo que también provoca un efecto más lento de aumento de los niveles de insulina.

[0357] El análisis de la actividad de la superóxido dismutasa no mostró cambios significativos en su actividad en suero en todos los grupos experimentales de animales. Esto puede deberse a la falta de efecto de los preparados de zinc inyectados sobre la actividad de esta enzima o (lo más probable) a una administración incorrecta de los preparados de zinc. FIG. 18A - FIG. 18B.

[0358] El estudio microscópico de los islotes de Langerhans ha demostrado una dinámica positiva después de la administración de isótopo de zinc: un aumento significativo en el área de los islotes en comparación con el grupo de control y el grupo al que se le inyectó acetato de zinc. FIG. 19.

[0359] Los resultados obtenidos se correlacionan con los resultados del análisis de los niveles de insulina en suero de los animales de laboratorio. Los resultados microscópicos indican que la administración de preparados de zinc, en particular de isótopos de zinc, conduce a un aumento del área de los islotes pancreáticos, lo que a su vez puede indicar la posibilidad de un aumento de la producción de insulina por parte de estos islotes. Se trata de un paso en la dirección correcta, ya que el desarrollo de diabetes tipo I se asocia con una importante deficiencia de insulina debido a problemas con su síntesis por parte de estos islotes. FIG. 20A - FIG. 20F.

Tabla 21 Prueba de tolerancia a la glucosa (noche con hambre, glucosa a una dosis de 3 g/kg de peso corporal en un volumen de 2 ml)

[0360] Se realizó una prueba de tolerancia a la glucosa para determinar un efecto potencial del isótopo de zinc sobre la dinámica de la concentración de glucosa en el flujo sanguíneo. Procedimiento experimental: a los animales de laboratorio se les administran inyecciones intragástricas de solución salina normal o de zinc en solución salina (5 mg/kg) en un volumen de 2 ml. Posteriormente, 60 minutos después de las inyecciones antes mencionadas, se mide el nivel basal de glucosa y se inyecta una solución de glucosa en una cantidad de 3 g/kg en un volumen de 2 ml utilizando la misma vía de administración. Los niveles de glucosa en sangre se miden nuevamente 60 minutos después de inyectar la solución de glucosa. La diferencia en la caída de los niveles de glucosa indica un efecto positivo del efector inyectado sobre la dinámica de los niveles de glucosa en el torrente sanguíneo.

[0361] La prueba de tolerancia a la glucosa mostró una caída en la concentración de glucosa después de la administración de isótopo de zinc en comparación con el grupo de control. Esto puede indicar la influencia de la administración del isótopo de zinc sobre los niveles de insulina en el torrente sanguíneo, lo que a su vez resulta en la activación de mecanismos asociados con la eliminación de glucosa en la sangre. Dado que la insulina es una proteína dependiente del zinc, se puede suponer que la administración de zinc provoca un aumento de la actividad de esta proteína en relación con su receptor en los tejidos o un aumento de la cantidad de esta hormona en el torrente sanguíneo.

[0362] El análisis de la acumulación de metales en los tejidos del hígado (zinc, manganeso y cobre) ha demostrado que sólo el nivel de zinc aumenta significativamente en ambos grupos de animales que recibieron preparaciones de zinc tanto el día 1 después de la retirada del fármaco como el día 7 después de la retirada. Esto indica que el zinc administrado a los animales se acumula y su eliminación no aumenta. Todos los demás metales analizados se encuentran dentro de los límites de sus concentraciones observadas en el grupo de animales de control. FIG. 21A - FIG. 21C.

[0363] El análisis de la acumulación de metales en los tejidos renales (zinc, manganeso y cobre) mostró que sólo el nivel de zinc aumenta significativamente en ambos grupos de animales que recibieron preparaciones de zinc tanto el día 1 después de la retirada del fármaco como el día 7 después de la retirada. Esto indica que el zinc administrado a los animales se acumula y su eliminación no aumenta. Todos los demás metales analizados se encuentran dentro de los límites de sus concentraciones observadas en el grupo de animales de control. FIG. 22A - FIG. 22C. FIG. 23A - FIG. 23F.

Informe de investigación sobre los efectos potenciales de la sustancia de prueba (aspartato Zn64) sobre la diabetes tipo I en animales de experimentación (ratas)

ADMINISTRACIÓN ORAL

[0364]El primer grupo- Control. Peso de los animales “ 140-150 gramos (peso corporal inicial del animal).

[0365] Número de animales: 5 (machos). Los 5 animales se alojaron en grupo en una jaula y se les proporcionó acceso ad libitum a comida y agua. Al comienzo del experimento, a cada animal se le administró una única inyección de tampón citrato 10 mM (pH 4,5) por vía intraperitoneal. 24 horas después se administraron a los animales por vía oral 7 dosis de la sustancia de ensayo. Frecuencia de administración: cada dos días. Dosis de administración: 800 |jg de zinc por animal.

[0366] Después de la última administración, los animales permanecieron en ayunas durante 12 horas con acceso ad libitum al agua. Transcurrido este tiempo, los animales fueron retirados del experimento.

[0367]El segundo grupo- Diabetes. Peso de los animales “ 140-150 gramos (peso corporal inicial del animal).

[0368] Número de animales: 10 (machos). Los animales se alojaron en jaulas, 4 por jaula, y se les proporcionó acceso ad libitum a comida y agua. Para inducir la diabetes en los animales, a cada animal se le administró una única inyección de solución de estreptozotocina a una dosis de 6 mg por 100 g de peso animal disuelta en tampón citrato 10 mM (pH 4,5) por vía intraperitoneal. Dosis de administración: 800 jg de zinc por animal. Los animales en ayunas fueron evaluados para determinar niveles suficientes de glucemia dos días después de la inducción de la diabetes. En los experimentos se utilizaron ratas con concentraciones de glucosa en sangre dentro del rango >20 mmol/l.

[0369]El tercer grupo- Diabetes zinc: Peso de los animales “ 140-150 gramos (peso corporal inicial del animal).

[0370] Número de animales: 10 (machos). Los animales se alojaron en jaulas, 4 por jaula, y se les proporcionó acceso ad libitum a comida y agua. Para inducir la diabetes en los animales, a cada animal se le administró una única inyección de solución de estreptozotocina a una dosis de 6 mg por 100 g de peso animal disuelta en tampón citrato 10 mM (pH 4,5) por vía intraperitoneal. Los animales en ayunas fueron evaluados para determinar niveles suficientes de glucemia dos días después de la inducción de la diabetes. En los experimentos se utilizaron ratas con concentraciones de glucosa en sangre dentro del rango >20 mmol/l.

[0371] 24 horas después se administraron a los animales por vía oral 7 dosis de la sustancia de ensayo. Frecuencia de administración: cada dos días.

[0372] Dosis de administración: 800 jg de zinc por animal.

Materiales de investigación

Cumplim iento de la normativa de bienestar animal que rige las actividades de investigación con animales

[0373] Los animales de laboratorio utilizados en los experimentos se mantuvieron de conformidad con las normas y recomendaciones internacionales sobre investigación clínica y biológica con animales y de conformidad con los Principios Básicos del Manejo Humanitario de Animales aprobados por el 1er Congreso Nacional de Bioética (Kiev, Ucrania, 2001), que están en línea con las normas del Convenio Europeo para la Protección de los Animales Vertebrados utilizados con Fines Experimentales y otros Fines Científicos (Estrasburgo, 18/03/1986). Todos los experimentos con animales se realizaron en el vivarium de la Universidad Nacional Taras Shevchenko de Kiev de acuerdo con las normas de experimentación con animales desarrolladas de conformidad con las leyes aplicables de Ucrania y aprobadas por la Junta Académica de dicha institución.

Condiciones de mantenimiento de animales de laboratorio

[0374]En los experimentos se utilizaron ratas blancas de 2 a 3 meses de edad que pesaban entre 120 y 130 g. Los animales de laboratorio fueron alimentados con una dieta estándar de vivarium y tuvieron libre acceso al agua. Durante los experimentos, los animales se alojaron en jaulas de plástico y se establecieron controles ambientales para mantener condiciones de 19-24 °C y 50 % de humedad relativa con un ciclo de luz-oscuridad de 12 h. A todos los animales se les permitió aclimatarse a su entorno durante 7 días antes del inicio de los experimentos.

Determinación de la concentración de glucosa en suero de ratas

[0375]La concentración de glucosa en sangre total se midió mediante el método de la glucosa oxidasa utilizando un medidor de glucosa en sangre GlucoDr Auto AGM-4000 (Allmedicus Co., Ltd., Corea). Todos los procedimientos se realizaron según las instrucciones del fabricante.

Inducción de diabetes tipo I experimental en ratas

[0376]La diabetes experimental tipo I se indujo mediante una única inyección intraperitoneal de una solución de estreptozotocina a una dosis de 6 mg por 100 g de peso animal disuelta en tampón citrato 10 mM (pH 4,5). A las ratas del grupo control se les administró tampón citrato 10 mM (pH 4,5) mediante el método antes mencionado. Las concentraciones de glucosa en sangre total se midieron dos días después de la inducción de la diabetes en ratas. Los animales se consideraron diabéticos cuando el nivel de glucosa en sangre alcanzaba 22-32 mmol/L (M. Zafar, S. Naqvi // Int. J. Morphol. - 2010. - Vol. 28, n° 1. - p. 135-142.).

Preparación de suero sanguíneo de ratas

[0377]El suero de rata se preparó a partir de sangre completa. Para eliminar las proteínas y el fibrinógeno concomitantes, la sangre entera se dejó sin alterar a 37 °C durante 30 minutos, después de lo cual las muestras se centrifugaron a 2500 g durante 15 minutos. El sobrenadante resultante (suero) se separó inmediatamente de los glóbulos sanguíneos y se congeló a -20 °C para análisis adicionales.

Determinación de hemoglobina glucosilada en sangre de ratas

[0378]Los niveles de hemoglobina glucosilada en sangre total de ratas se midieron espectrofotométricamente de acuerdo con el procedimiento establecido. El ensayo se realizó utilizando un kit de ensayo estándar fabricado por Lachema (República Checa).

[0379]El método para medir la hemoglobina glucosilada se basa en el hecho de que la forma estable de la glucohemoglobina (HbA1c) contiene 1-desoxi-1-(N-valil)fructosa, que se deshidrata con ácido fosfórico para formar un complejo coloreado con un espectro de absorción de 433 millas náuticas. Ni la forma lábil de la glucohemoglobina ni la hemoglobina fetal interfieren con la determinación de la hemoglobina glucosilada.

[0380]La hemoglobina total se midió espectrofotométricamente. Se mezclaron 20 pl de sangre completa con 5 ml de la solución transformadora. La absorbancia se leyó a una longitud de onda de 540 nm frente a la solución transformadora. La fracción de hemoglobina total se calculó según las recomendaciones del fabricante utilizando la siguiente fórmula:

4,92

donde Hb es la hemoglobina total, A es la densidad óptica de la muestra de prueba. La cantidad de hemoglobina total se expresa en g/L.

[0381]El hemolizado se preparó añadiendo un anticoagulante, una solución de citrato de sodio al 3,8 % diluida a 1:10, a sangre recién extraída. Se recogió 1 ml de sangre estabilizada y se centrifugó a 1000 g durante 10 minutos para eliminar el plasma. Se añadieron 3 ml de solución salina al sedimento de eritrocitos obtenido, la mezcla se agitó suavemente y se centrifugó nuevamente, como se describió anteriormente. Se agregaron 3 ml de agua destilada al sedimento y la mezcla bien mezclada se dejó reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de otra centrifugación, se separaron 1,5 ml de sobrenadante (hemolizado) y se mezclaron con 0,25 ml de solución de ácido fosfato al 85 %. Los tubos de ensayo se cerraron con tapones de goma y se calentaron en un baño de agua hirviendo durante 30 minutos. Tras la deshidratación, los tubos se enfriaron en agua corriente durante 10 minutos. A cada tubo se le añadieron 0,5 ml de una solución 2,45 M de ácido tricloroacético. El contenido de los tubos se agitó y centrifugó a 1000 g durante 20 minutos. A una alícuota de 1 ml de sobrenadante pipeteada en otro conjunto de tubos secos, se le añadió una solución de ácido tiobarbitúrico 2,5 pM. El contenido de los tubos se mezcló completamente y se incubó a 37 °C durante 40 min. Se llevaron a cabo las mismas manipulaciones para las muestras de control, se añadió agua a C1 en lugar de ácido y a C2 se añadió ácido y una mezcla de hemolizados de diferentes muestras. La densidad óptica de las muestras se midió en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 443 nm frente a agua destilada.

[0382]La concentración de glicohemoglobina se calculó utilizando la siguiente fórmula:

donde A1 es la densidad óptica de la muestra de prueba, A2 es la densidad óptica de la muestra de control para reactivos, A3 es la densidad óptica de la muestra de control positivo, K es la tangente de un ángulo calculado de acuerdo con la curva de calibración de fructosa, Hb es el contenido total de hemoglobina.

[0383]La concentración de glicohemoglobina se expresó como mmol de fructosa por g de hemoglobina (Glycated hemoglobin / Assay kit // Pliva-lachema diagnostica. - 2008. - 10003258.).

Determinación de los niveles de insulina en suero de rata.

[0384]Los niveles de insulina en el suero sanguíneo de ratas se determinaron mediante inmunoensayo enzimático basado en el método común utilizado para las proteínas solubles. Se realizó en microplacas de 96 pocillos con capacidad de sorción de proteínas solubles.

[0385]El suero se preparó como una dilución de 1 a 10 con tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,4) que contenía NaCl 150 mM. Se incubaron muestras en un volumen de 100 ml en pocillos de microplacas a 4°C durante la noche. Después de la incubación, los pocillos se lavaron con el tampón que comprendía tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,4) con NaCl 150 mM y Tween 20 al 0,05 % para eliminar el material no unido. Los sitios de unión no específicos se bloquearon con una solución bloqueadora de leche desnatada al 5 % y se incubaron durante 1 hora a 37 °C. Después del lavado, los pocillos separados de la microplaca se cargaron con anticuerpos primarios antiinsulina de conejo y se incubaron durante 1 hora a 37 °C. Después de la incubación, los pocillos de la microplaca se lavaron y cargaron con anticuerpos secundarios apropiados conjugados con peroxidasa de rábano picante y se incubaron durante 1 hora más a 37 °C. La unión de los anticuerpos secundarios se visualizó añadiendo 100 pl de solución de OPD a cada pocillo a una concentración de 0,4 mg/ml preparada en tampón citrato (pH 5,0) que contenía H2O2 al 0,013 %. La reacción de peroxidasa se detuvo después de 10 minutos añadiendo 100 pl de H2SO41 M. La densidad óptica se midió a 492 nm. Las concentraciones de insulina, citocinas e IgG se expresaron en unidades relativas relacionadas con las concentraciones de proteína total en suero determinadas mediante el ensayo de proteínas de Bradford.

Determinación de concentraciones de proteínas

[0386]Las concentraciones de proteína se midieron utilizando el ensayo de proteína de Bradford, que se basa en un cambio de absorbancia del colorante Coomassie Brilliant Blue G-250.

[0387] Para medir la concentración de proteína, se agregaron a cada muestra 10 pl de NaOH al 30 %, 70 pl de agua destilada y 2 ml de reactivo de Bradford. Para preparar 100 ml de reactivo de Bradford, se mezclaron 6 ml de solución madre, 3 ml de etanol al 95 %, 6 ml de H3PO4 al 88 % y 35 mg de colorante Coomassie Brilliant Blue y la mezcla resultante se ajustó al volumen de 100 ml con agua destilada. La solución madre contenía 10 ml de etanol al 95 %, 20 ml de H3PO4 al 88 % y 35 mg de Coomassie Brilliant Blue.

[0388] A continuación, se midió espectrofotométricamente a 595 nm la absorbancia, que era visible en 2-5 minutos, frente a una muestra de control que contenía 20 pl de agua destilada en lugar de biomaterial. La concentración de proteína en cada muestra de prueba se determinó usando una curva de calibración y se expresó en mg/ml.

Procesamiento estadístico de los resultados

[0389] El procesamiento estadístico de los resultados obtenidos se realizó mediante los métodos de estadística de variación y análisis de correlación utilizando el software Origin Pro 7.0 y SPSS 16. Los valores estadísticos clave se obtuvieron mediante cálculos de la media (M) y el error estándar de la media (m). La diferencia entre variables se evaluó mediante una técnica estadística paramétrica (ANOVA). Se utilizó la prueba t de Student para evaluar la significación estadística de las diferencias entre dos muestras. La diferencia se consideró estadísticamente significativa cuando p<0,05.

RESULTADOS

[0390] El estudio que examinó los efectos potenciales del aspartato Zn64 sobre el desarrollo de diabetes tipo I en el grupo experimental de ratas mostró los siguientes resultados (Tabla 22). Se demostró que los principales parámetros que caracterizan el desarrollo de la diabetes de tipo I, a saber, las concentraciones de glucosa, hemoglobina glucosilada e insulina, mejoraron después de la administración de la sustancia de prueba. Se registró una disminución significativa de los niveles de glucosa (un 26 %) y de hemoglobina glucosilada (un 30 %). También se encontró que los niveles séricos de insulina aumentaron en un 13 %. Los resultados obtenidos pueden indicar que esta sustancia de prueba tiene un efecto positivo en el curso de la diabetes tipo I y puede usarse como agente profiláctico para reducir los efectos tóxicos del aumento de los niveles de glucosa en el torrente sanguíneo durante el desarrollo de esta patología.

Tabla 22 Valores que confirman el diagnóstico de diabetes tipo I en modelos de ratas con diabetes tipo I inducida por estreptozotocina

[0391]Las citocinas son mediadores polipeptídicos endógenos y biológicamente activos representados por un gran grupo heterogéneo de glicoproteínas y antígenos no específicos de bajo peso molecular que se producen en respuesta a un estímulo extracelular externo y participan en la formación y regulación de respuestas inmunes específicas en el cuerpo. a través de la interacción entre reacciones protectoras no específicas y la inmunidad específica. Las citoquinas proinflamatorias, como IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, TNF-a, IFN-y, participan en el lanzamiento de respuestas inmunes específicas, mientras que las citocinas antiinflamatorias (IL-4, IL-1o, IL-13, TGF) participan en el desarrollo de reacciones antiinflamatorias e inhiben la síntesis de interleucinas proinflamatorias.

Tabla 23 Niveles relativos de citocinas proinflamatorias IL-1p,IL-12 e IFN-yen el suero de animales de experimentación (M+m, n=10)

[0392]Uno de los mecanismos de control de los niveles y, en consecuencia, de los efectos biológicos de las citocinas proinflamatorias es implementado por un grupo de citocinas antiinflamatorias que incluye IL-4, IL-10, IL-13, TGFp. El desequilibrio de citoquinas no sólo es la base para la aparición de procesos inflamatorios, sino que también determina la forma posterior de la respuesta inmune, en particular si será predominantemente celular o humoral. Estas citocinas pueden inhibir la síntesis de citocinas proinflamatorias al afectar la transcripción de genes específicos en las células productoras, inducir la síntesis de antagonistas del receptor de interleucina 1, mejorar la producción de receptores solubles y reducir la densidad de receptores proinflamatorios en las células. Por lo tanto, IL-4 IL-10 inhibe la producción de PGE2, radicales super y nitróxido, y bloquea la formación de IL-1, IL-6, IL-8, TNF, inhibe la síntesis de IL-2, IFN-<y>en los linfocitos.

[0393] Tabla 24 Niveles relativos de citocinas antiinflamatorias IL-4, IL-10 y TGF-Ben el suero de animales de experimentación (M ± m, n=10)

[0394] Los resultados de este estudio mostraron un cierto efecto positivo del aspartato Zn64 en el perfil de citoquinas, que puede considerarse como un factor que normaliza el proceso inflamatorio que ocurre en el cuerpo durante el desarrollo de la diabetes tipo I.

Resumiendo los resultados del estudio

[0395] El presente estudio sobre los efectos potenciales de la sustancia de prueba sobre el metabolismo de la glucosa y los procesos relacionados ha mostrado las perspectivas de su uso para normalizar el metabolismo de la glucosa en el cuerpo en pacientes que desarrollan diabetes tipo I. Presumiblemente, puede usarse como agente independiente, así como en combinación con otros medicamentos.

[0396] La vía de administración intraperitoneal de la sustancia problema no es adecuada como posible regulador del metabolismo de la glucosa. La administración oral mostró un efecto mucho mejor y provocó una disminución de los niveles de glucosa en los animales de control.

[0397] Los resultados muestran que el isótopo de zinc, en comparación con el acetato de zinc (zinc natural), tiene un efecto más prolongado sobre los niveles de insulina en el suero sanguíneo o se libera más lentamente desde los lugares de su depósito, lo que también provoca un efecto más lento de niveles de insulina en aumento.

[0398] Los resultados del examen microscópico indican que la administración de preparados de zinc, en particular de isótopos de zinc, provoca un aumento del área de los islotes pancreáticos, lo que a su vez puede indicar la posibilidad de un aumento de la producción de insulina en estos islotes. Se trata de un paso en la dirección correcta, ya que el desarrollo de diabetes tipo 1 se asocia con una importante deficiencia de insulina debido a problemas con su síntesis por parte de estos islotes. Los resultados obtenidos se correlacionan con los resultados del análisis de los niveles de insulina en suero de los animales de laboratorio.

[0399] La prueba de tolerancia a la glucosa mostró una disminución significativa en los niveles de glucosa después de la administración del isótopo de zinc 64Zn en comparación con el grupo de control. Esto puede indicar la influencia de la sustancia de prueba administrada sobre los niveles de insulina en el torrente sanguíneo, lo que a su vez da lugar a mecanismos desencadenantes asociados con la eliminación de la glucosa de la sangre. Dado que la insulina es una proteína dependiente del zinc, se puede suponer que la administración de zinc provoca un aumento de la actividad de esta proteína en relación con su receptor en los tejidos o un aumento de la cantidad de esta hormona en el torrente sanguíneo.

[0400] Los resultados obtenidos utilizando un modelo de diabetes tipo I pueden indicar que esta sustancia de prueba tiene un efecto positivo en el curso de la diabetes tipo I y puede usarse como agente profiláctico para reducir los efectos tóxicos del aumento de los niveles de glucosa en el torrente sanguíneo durante el desarrollo de la diabetes. esta patología.

[0401] Los resultados de este estudio mostraron un cierto efecto positivo del aspartato Zn64 en el perfil de citocinas, que puede considerarse como un factor que normaliza el proceso inflamatorio que ocurre en el cuerpo durante el desarrollo de la diabetes tipo I.* * *

[0402] Basado en el modelo matemático de un sistema estable, datos experimentales de espectrometría de masas y análisis de fuentes bibliográficas, el cambio de quiralidad de los aminoácidos en las proteínas con la consiguiente violación de la conformación de las proteínas y defectos en el ADN son el resultado de la distorsión en las hélices debido a los isótopos estables. sustitución. Existe una fuerte evidencia que sugiere que la composición isotópica de los mismos elementos químicos afecta la formación de enlaces químicos en estructuras solenoidales/helicoidales de biomoléculas. Los cambios inducidos por isótopos en la conformación de las biomoléculas parecen representar el inicio de patologías. Pero la característica más importante de tales cambios es su reversibilidad. La conformación de biomoléculasse puede corregir con la modulación de las proporciones de isótopos de los elementos de los que están hechos. La conformación perfecta de las proteínas significa una homeostasis perfecta, saludable y juvenil. Permite un efecto complejo sobre cambios patológicos en células, tejidos, órganos y organismos con sistemas inmunológico, endocrino y nervioso, todos movilizados contra enfermedades degenerativas. La terapia selectiva de isótopos puede ser el siguiente paso después de la estrategia de tratamiento basada en firmas moleculares.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende un compuesto de 64Zne o una sal del mismo, en la que el compuesto de 64Zne o una sal del mismo es al menos 80 % de 64Zne, para usar en la prevención o el tratamiento de la diabetes tipo 2.

2. Una composición para uso según la reivindicación 1, que comprende además un diluyente o un excipiente.

3. Una composición para uso según la reivindicación 2, en la que el diluyente es agua empobrecida en deuterio.

4. Una composición para uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el compuesto de 64Zne o una sal del mismo es al menos 95 % de 64Zne.

5. Una composición para uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el compuesto de 64Zne o una sal del mismo es al menos 99 % de 64Zne.

6. Una composición para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que la composición contiene entre 0,05 mg y 110 mg de 64Zne.

7. Una composición para uso según la reivindicación 6, en la que la composición contiene entre 1 y 10 mg de 64Zne.

8. Una composición para uso según la reivindicación 1, en la que el compuesto de 64Zne o una sal del mismo es al menos 90 % de 64Zne y la composición es una solución acuosa en la que el 64Zne está presente en una concentración de entre 0,1 mg/ml y 10 mg/ml.

9. Una composición para usar según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que 64Zne está en forma de sal seleccionada del grupo que consiste en asparaginato (fórmula química - C4H5O4N64Zne) con 2 moléculas de ácido aspártico, sulfato y citrato.

10. Una composición para uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la composición se administra mediante inyección.1

11. Una composición para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en la que la composición se administra por vía oral.