ES2956382T3 - Benzoato de estradiol como esterilizante - Google Patents
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Abstract
Se presentan métodos, composiciones y sistemas para administrar benzoato de estradiol a un animal con el fin de esterilizarlo. Se utiliza un aceite fisiológicamente aceptable u otro vehículo en una cápsula para administrar el benzoato de estradiol. El benzoato de estradiol se administra por vía intraperitoneal, intramuscular o subcutánea a un animal de compañía o de ganado. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Benzoato de estradiol como esterilizante
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica prioridad sobre la solicitud de patente provisional estadounidense n.° 62/772.878, presentada el 29 de noviembre de 2018.
Antecedentes
La esterilización, también denominada castración/esterilización de hembras (o inducción de infertilidad), se refiere a hacer que un animal (macho o hembra) sea incapaz de reproducirse. La esterilización implica la extirpación o bien parcial o bien completa de los órganos reproductores o hacer que los órganos reproductores no sean funcionales. La esterilización ha asumido un importante papel para animales de compañía y animales para la producción de alimentos a lo largo del tiempo para diversos fines. En animales de compañía tales como perros y gatos, los animales se esterilizan principalmente para el control de la población, la mitigación de la sobrepoblación de mascotas y los costes posteriores asociados con el cuidado de estos animales.
En animales para la producción de alimentos tales como bovinos y porcinos, la esterilización se realiza principalmente en machos mediante castración como medio de disminuir la producción de testosterona. La presencia de testosterona en un animal para la producción de alimentos provoca olores desagradables y penetrantes cuando se procesa y se cocina su carne, particularmente en carne de cerdo. La castración también puede dar como resultado una calidad superior de la carne, es decir, carne que es más magra y tiene un mayor contenido de grasa intramuscular, también conocido como veteado, particularmente en carne de vacuno. Además, la castración reduce la agresión, particularmente por parte de animales macho, reduciendo el posible riesgo físico para el resto del ganado o para las personas que los manipulan.
Actualmente, la esterilización de tanto animales de compañía como para la producción de alimentos se logra principalmente mediante métodos quirúrgicos: extirpación física de los testículos en machos y extirpación de los ovarios y úteros en hembras. Sin embargo, existen múltiples problemas con el uso de métodos de esterilización quirúrgicos. Por ejemplo, la esterilización quirúrgica puede ser dolorosa para el animal, costosa para el propietario del animal y puede conducir a complicaciones secundarias tales como infección. Tales complicaciones pueden conducir a costes de tratamiento adicionales y a un aumento del riesgo de lesiones adicionales o muerte del animal. En algunos animales macho para la producción de alimentos tales como toros, la castración se logra mediante métodos no quirúrgicos, tales como el uso de un anillo elastomérico para bloquear o dañar de otro modo el suministro de sangre a los testículos, conduciendo a la muerte del tejido testicular. Normalmente, tanto la castración quirúrgica como la no quirúrgica del ganado se realizan sin anestesia u otra gestión del dolor, lo que provoca inevitablemente un gran malestar/dolor en los animales.
Gorski RA, American Journal of Physiology, vol. 205, n.° 5, 1963, páginas 842-844 da a conocer la esterilización de ratas hembra de 100 días de edad a las que se les inyectó una única dosis de benzoato de estradiol a la edad de 5 días. Kind FA et al.; Acta Endrocrinologica, Scandinavian University Press, vol. 49, n.° 2, 1965, páginas 193-206 dan a conocer la inhibición del desarrollo sexual en ratas de 45 días de edad tratadas con estradiol y derivados a la edad de 5 días.
Por estos motivos, existe la necesidad de un método no invasivo y humanitario para esterilizar animales.
Sumario
En el presente documento se describe el uso de benzoato de estradiol (EB) como método novedoso de esterilización de un animal no humano.
La invención proporciona un método para inducir esterilidad permanente en un animal no humano que comprende administrar a dicho animal en el plazo de semanas después del nacimiento y antes de la pubertad una cantidad eficaz de estradiol, benzoato de estradiol, dipropionato de estradiol, valerato de estradiol, cipionato de estradiol o una combinación de los mismos para hacer que el animal sea estéril, formulándose el estradiol, benzoato de estradiol, dipropionato de estradiol, valerato de estradiol, cipionato de estradiol o una combinación de los mismos en una formulación de liberación prolongada que libera estradiol, benzoato de estradiol, dipropionato de estradiol, valerato de estradiol, cipionato de estradiol o una combinación de los mismos a lo largo de 15 a 20 días.
Una realización proporciona un método para inducir infertilidad en un animal no humano administrando a dicho animal una cantidad eficaz de benzoato de estradiol (EB) para hacer que el animal sea infértil/estéril permanentemente. En una realización, el EB se administra con un portador, tal como un aceite. En otra realización, el EB se formula como una formulación de liberación lenta. En una realización, la administración es una única dosis,
una vez. En algunas realizaciones, las composiciones pueden administrarse por vía intraperitoneal, por vía intramuscular, o por vía subcutánea. En una realización, el animal es un animal de compañía. En otra realización, el animal es un animal de ganadería. En una realización, el EB se administra antes de la pubertad. También se proporciona en el presente documento el uso de EB para inducir esterilidad.
Otra realización no cubierta por las reivindicaciones proporciona un sistema para administrar un esterilizante a un animal, comprendiendo el sistema: una cápsula que comprende benzoato de estradiol, y un dispositivo para administrar la cápsula al animal. En una realización, no cubierta por las reivindicaciones, la cápsula está formulada para liberar el EB durante un periodo predeterminado. En una realización, no cubierta por las reivindicaciones, el dispositivo de administración es un inyector que comprende un cuerpo principal y un elemento de fuerza. En otra realización, el EB se administra por vía intraperitoneal, por vía intramuscular o por vía subcutánea. En una realización, el animal es un animal de compañía. En otra realización, el animal es un animal de ganadería.
Este sumario pretende proporcionar una visión general de la materia de la presente divulgación. No pretende proporcionar una explicación exclusiva o exhaustiva de la invención. La descripción detallada se incluye para proporcionar información adicional sobre la presente divulgación.
Abreviaturas
EB Benzoato de estradiol
E2 Estradiol
AVPV Núcleo periventricular anteroventral
ARC Núcleo arcuato
POA Área preóptica
KISS1 Proteína kisspeptina
Kissl Gen o ARNm de kisspeptina
LHp Subunidad beta de hormona luteinizante
GH Hormona del crecimiento
CASA Análisis de semen asistido por ordenador
Breve descripción de los dibujos
Los dibujos ilustran en general, a modo de ejemplo pero no a modo de limitación, diversas realizaciones comentadas en el presente documento. En los dibujos, que no están necesariamente dibujados a escala, números similares pueden describir componentes similares en diferentes vistas. Números similares que tienen diferentes sufijos de letras pueden representar diferentes casos de componentes similares.
Las figuras 1 A-B representan los niveles de E2 séricos e hipotalámicos después de implantar EB300 en crías de rata el día del nacimiento (EB300 es una cápsula silástica que contiene 300 microgramos de EB; la implantación se define en el presente documento como método de colocación de una cápsula por vía subcutánea en un animal). Se implantó EB300 el día del nacimiento, y se midieron las concentraciones de E2 en los sueros del día postnatal 0 (PND 0) a PND 30 (A) y los hipotálamos del PND 0 al PND 10. Los niveles de E2 séricos se mantienen a altos niveles hasta PND 10 y disminuyeron significativamente para PND 21, mientras que el nivel de E2 hipotalámico disminuyó hasta el nivel basal para PND 10. Obsérvese también la diferencia de las unidades de medición de E2 entre el suero (pg/ml) y el hipotálamo (mg/ml). Los números de animales usados para cada punto de tiempo de las mediciones de E2 séricas e hipotalámicas fueron 3-8 y 3-7 para cada punto de ensayo, respectivamente. Los datos son de números mixtos de machos y hembras. La figura 2 muestra datos de machos y hembras por separado. Las figuras 2A-B representan los niveles de E2 séricos e hipotalámicos después de la implantación de EB300. Se implantó EB300 el día del nacimiento, y se midieron las concentraciones de E2 en los sueros del PND 0 al PND 30 (A) y los hipotálamos del PND 0 al PND 10. Los números de animales usados para cada punto de tiempo de mediciones de E2 séricas e hipotalámicas fueron 3-8 y 3-7 para cada punto de los ensayos, respectivamente.
Las figuras 3A-B muestran la expresión de KISS en el ARC del hipotálamo. (A) Se tiñeron hipotálamos de ratas de 2,5 meses de edad mediante anticuerpo anti-KISS1. Se muestran imágenes de bajo y alto aumento tomadas del ARC del hipotálamo. (B) Se tiñeron hipotálamos de ratas de 6-7 meses de edad mediante anticuerpo anti-KISS1. Se muestran imágenes de alto aumento tomadas del ARC. Obsérvese la menor inmunorreactividad de KISS en los
hipotálamos con EB300.
Las figuras 4A-K representan el patrón de expresión de KISS1 y la identificación de células y genes expresados en hipotálamos de PND 29 de ratas de control (intactas) y con implante de EB300. KISS1 se expresa en las regiones del AVPV y ARC (figura 4A). Se examinó la expresión de KISS1 en la región del ARC mediante anticuerpo anti-KISS1, proteína KISS1 (puntos blancos en las imágenes) (los planos de las secciones de tejido están marcados como una línea de puntos rojos en la figura 4A). La expresión de KISS1 disminuyó visiblemente en el hipotálamo con EB300 en comparación con la del grupo de control (figura 4B; menos señales blancas hay en el EB300). Para medir cuantitativamente la expresión de KISS1 entre los grupos de control y de EB300, se diseccionó la región hipotalámica incluidos el AVPV y ARC y se examinó mediante secuenciación de ARN de células individuales (scRNAseq) (figura 4C). En hembras, se identificaron 10 tipos de células diferentes (agrupaciones de células) (figura 4D) de un total de 4.049 y 4.223 células respectivamente de los grupos de control y de EB300 (figura 4E). A partir de las agrupaciones de células hipotalámicas, se identificó una agrupación de expresión de Kissl (agrupación 9) (figura 4F), y se comparó el número de células que expresan Kissl y el nivel de expresión de Kissl entre los grupos de control y de EB300. En la agrupación 9, se encontraron 307 y 194 células en los grupos de control y de EB300, respectivamente. Se identificaron sesenta y ocho y 30 células positivas para Kissl de cada grupo, respectivamente. Este resultado indica que los números de células totales en la agrupación 9 y células que expresan Kissl disminuyeron ambas en el hipotálamo con EB300 en comparación con el del grupo de control (figura 4G). En machos, se identificaron diez agrupaciones diferentes (figura 4H), de las cuales se examinó un total de 4.674 y 4.229 células en los grupos de control y de EB300, respectivamente (figura 4I). A partir de las agrupaciones de células hipotalámicas, se identificó una agrupación de expresión de Kissl (agrupación 8) (figura 4J). Se compararon los números de células que expresan Kissl y el nivel de expresión de Kissl entre los grupos intacto y de EB300. En la agrupación 8, se encontraron 178 y 83 células en los grupos de control y de EB300, respectivamente. Se identificaron sesenta y cinco y 37 células positivas para Kissl de cada grupo, respectivamente. Este hallazgo indica que el número total de células en la agrupación 8 y células que expresan Kissl disminuyó en el hipotálamo con EB300 en comparación con el del grupo de control (figura 4K).
Las figuras 5A-B representan la histología y los niveles de expresión de LH y GH en las hipófisis. (A) Se examinaron las hipófisis de machos de cinco a seis meses de edad mediante histología (tinción de H&E) e inmunohistoquímica para la subunidad p de la hormona luteinizante (LHp) y la hormona del crecimiento (GH). Se muestran imágenes representativas de tejidos de los grupos de control y de EB300. (B) Se examinaron hipófisis de machos de cinco a seis meses de edad mediante histología e inmunohistoquímica para LHp y GH. Se muestran imágenes representativas de tejidos de los grupos de control y de EB300.
Las figuras 6A-B muestran las concentraciones de LH séricas antes y después de la exposición a KISS-10. Se midieron los niveles séricos de LH 30 minutos después de la inyección intraperitoneal de 50 nmoles/animal de KISS-1 a las edades de 2-2,5 meses. (A) Medición en machos. Número de animales usados: Grupo de control (n=6) y grupo de EB300 (n=3). (B) Medición en hembras. Número de animales usados: Grupo de control (n=4) y grupo de EB300 (n=2). Los asteriscos indican diferencias significativas (p<0,05) de las inyecciones de KISS-1. “a” y “b” indican diferencias significativas (p<0,05) entre todos los grupos antes de las inyecciones de KISS-1.
Las figuras 7A-C representan el desarrollo neonatal de las gónadas en machos. Se tiñeron testículos de PND 1, 3 y 10 con H&E (A) o TUNEL (B), y DDX4 (helicasa-4 de caja de muerte, Dead-box helicase-4) (C). Se muestran imágenes representativas de testículos de cuatro animales por grupo.
Las figuras 8A-D representan el desarrollo neonatal de las gónadas en hembras. Se tiñeron ovarios de PND 1, 3 y 10 con H&E (A) o TUNEL (B), DDX4 (C) y FOXL2 (D). Se muestran imágenes representativas de ovarios de cuatro animales por grupo.
La figura 9 representa el ovario, el útero y la hipófisis a los 5,5 meses. Se tomaron imágenes inmediatamente después de la recogida del tejido o después de la tinción de H&E.
La figura 10 representa el ovario, el útero y la hipófisis a los 2,5 y 7 meses. Se tomaron imágenes inmediatamente después de la recogida del tejido o después de la tinción de H&E. El gráfico es de ratas de siete meses de edad. La figura 11 muestra la cifra y la movilidad de espermatozoides (cinco a seis meses). Las concentraciones y la movilidad de los espermatozoides se midieron mediante CASA a los cinco a seis meses de edad. Se usaron cuatro animales para el grupo de control y tres para el grupo de EB300. Los datos son la media EEM, * indica p<0,05 en comparación con el grupo de control.
Las figuras 12A-B representan las gónadas, el epidídimo y las glándulas auxiliares de machos. Se recogieron las gónadas, el epidídimo y las glándulas auxiliares a la edad de 2,5 meses, y se examinaron su morfología e histología (A) seguido por inmunohistoquímica con anticuerpos para StAR (proteína reguladora aguda esteroidogénica, Steroidogenic Acute Regulatory Protein) y DDX4 (B). Las puntas de flecha indican células de Leydig. Las flechas blancas indican células germinales. Las flechas negras indican células germinales apoptóticas mediante tinción de TUNEL (que permite identificar células moribundas). Se muestran imágenes representativas de tejidos de cuatro
animales de cada grupo.
La figura 13 representa las gónadas, el epidídimo y las glándulas auxiliares de machos recogidas a las edades de 5 6 meses.
La figura 14 representa las gónadas, el epidídimo y las glándulas auxiliares de machos recogidas a las edades de 6 7 meses.
La figura 15 muestra gráficos de barras que representan la longitud del epidídimo, el peso de los testículos y las razones de peso de órganos sexuales auxiliares/peso corporal (6-7 meses; n=8, 3).
La figura 16 muestra gráficos de barras que representan el comportamiento de apareamiento mostrado por los machos. Se permitió que ratas macho de cuatro meses de edad montaran a hembras ovariectomizadas, y se midió el comportamiento sexual durante un periodo de tiempo de 30 minutos. (A) Latencia hasta la primera monta durante el tiempo experimental (segundos). (B) Número total de montas por machos durante el tiempo experimental. Número de ratas, grupo de control=5, grupo de EB300=3. Los gráficos muestran la media EEM, * indica p<0,05 en comparación con el grupo de control.
La figura 17 muestra gráficos de barras que representan los niveles séricos de T y E2 en animales adultos jóvenes y maduros. Se midieron las concentraciones séricas de testosterona a las edades de 2-3 y 6-7 meses en machos. Se midieron las concentraciones séricas de estradiol a las edades de dos meses y seis meses en hembras. Obsérvense las diferencias en las escalas Y de los niveles séricos de estradiol en hembras. Se muestra la media EEM; * indica p<0,05 en comparación con el grupo de control. Se midieron las concentraciones séricas de estradiol a los dos y seis meses de edad.
La figura 18 muestra gráficos de barras que representan los niveles séricos de T y E2 en animales adultos jóvenes. Se midieron las concentraciones séricas de testosterona a las edades de 2-3 y 6-7 meses en hembras. Se midieron las concentraciones séricas de estradiol a las edades de dos meses y 6-7 meses en machos. Se muestra la media EEM; * indica p<0,05 en comparación con el grupo de control. Se midieron las concentraciones séricas de estradiol a los dos meses y seis meses de edad.
Las figuras 19A-B representan cambios en el peso corporal a lo largo del tiempo. Se midió el peso corporal a PND 0, 6, 14, 21, 28, 42, 60, 90, 120, 150 y 180 en los machos (A) y las hembras (B). Los datos son la media EEM. (n=3-7 para cada punto de tiempo).
La figura 20 muestra el peso de los órganos en los machos. Se dividieron cada uno del hueso del fémur (peso/longitud), cerebro (peso), hipófisis (peso), hígado (peso), bazo (peso), riñón (peso), y corazón (peso) entre el peso corporal para investigar el crecimiento alterado de órganos esenciales. Las barras de error indican el EEM; * indica una diferencia significativa respecto al control (prueba de la t de Student, p<0,05). (6-7 meses; n=7,8).
La figura 21 muestra el peso de los órganos en las hembras. Se dividieron cada uno del hueso del fémur (peso/longitud), cerebro (peso), hipófisis (peso), hígado (peso), bazo (peso), riñón (peso) y corazón (peso) entre el peso corporal para investigar el crecimiento alterado de órganos esenciales. Las barras de error indican el EEM. * indica una diferencia significativa respecto al control (prueba de la t de Student, p<0,05). (6-7 meses; n=7,8).
La figura 22 muestra la histología representativa del riñón y el hígado en machos (5-6 meses).
La figura 23 muestra glándulas mamarias representativas en hembras. Se diseccionaron cuatro glándulas mamarias de ratas hembra y se sometieron a análisis histológico de secciones completas. Se fijaron los tejidos en disolución de Carnoy y se tiñeron con disolución de alumbre de carmín seguido por lavado con etanol ácido. Las puntas de flecha indican puntos de ramificación de las glándulas mamarias. Las flechas indican yemas mamarias.
La figura 24 representa la ventana temporal eficaz en machos (testículos). A crías macho de rata se les implantó EB300 el día indicado de la edad, y se diseccionaron y examinaron sus gónadas a los tres meses de edad.
La figura 25 representa la ventana temporal eficaz en machos (tracto reproductivo). A crías macho de rata se les implantó EB300 los días indicados de la edad, y se diseccionaron y examinaron sus gónadas a los tres meses de edad.
La figura 26 representa la ventana temporal eficaz en hembras. A crías hembra de rata se les implantó EB300 los días indicados de la edad, y se diseccionaron y examinaron sus gónadas a los tres meses de edad.
La figura 27 es una vista lateral en sección transversal de un dispositivo inyector de ejemplo para su uso en un sistema de administración de esterilizante químico (por ejemplo, administración subcutánea a un cachorro/canino neonatal).
La figura 28 demuestra el impacto de EB125 sobre el desarrollo de las gónadas en hámsteres. A hámsteres de veintiún días de edad se les implantó o bien una cápsula vacía (control) o bien 125 microgramos de EB contenidos en una cápsula silástica (EB125). Se recogieron los tejidos reproductivos de los hámsteres a PND30.
Descripción detallada
La siguiente descripción detallada incluye referencias a los dibujos adjuntos, que forman una parte de la descripción detallada. Los dibujos muestran, a modo de ilustración, realizaciones específicas en las que puede ponerse en práctica la invención. Estas realizaciones, que pueden denominarse también en el presente documento “ejemplos”, se describen con suficiente detalle como para permitir a los expertos en la técnica poner en práctica la invención. Las realizaciones de ejemplo pueden combinarse, pueden usarse otras realizaciones, o pueden hacerse cambios estructurales y lógicos sin apartarse del alcance de la presente invención. Aunque la materia dada a conocer se describirá conjuntamente con las reivindicaciones enumeradas, se entenderá que la materia ejemplificada no pretende limitar las reivindicaciones a la materia dada a conocer. La siguiente descripción detallada, por tanto, no debe tomarse en un sentido limitativo, y el alcance de la presente invención se define por las reivindicaciones adjuntas.
En este documento, los términos “un” o “una” se usan para incluir uno o más de uno y el término “o” se usa para referirse a un “o” no exclusivo a menos que se indique lo contrario. Además, la fraseología o terminología empleada en el presente documento y no definida de otra forma es para el fin de descripción sólo y no de limitación.
Las referencias en la memoria a “una realización”, “una realización de ejemplo”, etc., indican que la realización descrita puede incluir un rasgo, estructura, o característica particular, pero puede que cada realización no incluya necesariamente el rasgo, estructura, o característica particular. Además, tales frases no se refieren necesariamente a la misma realización. Además, cuando se describe un rasgo, estructura, o característica particular en relación con una realización, se afirma que está dentro del conocimiento de un experto en la técnica afectar a tal rasgo, estructura, o característica en relación con otras realizaciones, ya se describan explícitamente o no.
Los valores expresados en un formato de intervalo deben interpretarse de una manera flexible para que incluyan no sólo los valores numéricos explícitamente mencionados como límites del intervalo, sino también para que incluyan todos los subintervalos o valores numéricos individuales abarcados dentro de ese intervalo como si cada valor y subintervalo numérico se mencionara explícitamente. Por ejemplo, un intervalo de concentración de “aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 5 %” debiera interpretarse que incluye no sólo la concentración explícitamente mencionada de aproximadamente el 0,1 % en peso a aproximadamente el 5 % en peso, sino también las concentraciones individuales (por ejemplo, el 1 %, 2 %, 3 % y 4 %) y los subintervalos (por ejemplo, del 0,1 % al 0,5 %, del 1,1 % al 2,2 % y del 3,3 % al 4,4 %) dentro del intervalo indicado.
El término “aproximadamente” tal como se usa en el presente documento puede permitir un grado de variabilidad en un valor o intervalo, por ejemplo, dentro del 10 %, dentro del 5 %, dentro del 1 %, dentro del 0,5 %, dentro del 0,1 %, dentro del 0,05 %, dentro del 0,01 %, dentro del 0,005 %, o dentro del 0,001 % de un valor establecido o de un límite establecido de un intervalo e incluye el valor o intervalo establecido exacto.
Tal como se usa en el presente documento, un “sujeto” es un animal. Los animales incluyen mamíferos, incluidos animales de compañía tales como perros o gatos; animales de granja tales como equinos, bovinos o porcinos; animales de laboratorio tales como un ratón o una rata; así como primates no humanos. El sujeto también incluye un ave.
El término 'infertilidad” o “esterilidad” se refiere al estado de no ser fértil no ser capaz de concebir descendencia. La infertilidad puede producirse o bien en el macho o bien en la hembra, o en ambos.
Tal como se usa en el presente documento, una “cantidad eficaz” significa una cantidad suficiente para inducir infertilidad (es decir, hacer que el animal sea estéril). Puede administrarse una cantidad eficaz en una o más administraciones. En algunas realizaciones, puede lograrse una cantidad eficaz de EB conjuntamente con otro fármaco, compuesto, o composición farmacéutica. En otras realizaciones, puede lograrse una cantidad eficaz de EB de manera aislada respecto al uso de otro fármaco, compuesto, o composición farmacéutica.
Tal como se usa en el presente documento, la palabra “eSpay” se refiere a cualquier realización de las composiciones y/o métodos que usan EB tal como se describe en el presente documento.
Los términos “portador”, “portador farmacéuticamente aceptable” o “portador fisiológicamente aceptable” tal como se usan en el presente documento se refieren a uno o más materiales de formulación adecuados para lograr o potenciar la administración de EB como una composición (es decir, composición farmacéutica).
Composiciones y métodos
Se describen en el presente documento composiciones que comprenden benzoato de estradiol (EB) y métodos para
usar benzoato de estradiol como esterilizante/inductor de infertilidad en un animal no humano. Otros compuestos que pueden usarse en los métodos descritos incluyen, pero no se limitan a, estradiol, dipropionato de estradiol, valerato de estradiol, cipionato de estradiol (de manera que puede usarse cualquier forma de compuesto químico que libere estradiol o actúe funcionalmente como el estradiol in vivo). El EB tiene la siguiente estructura:
Concentración/cantidad de EB
Las composiciones de esterilizante (inductor de infertilidad) comprenden una cantidad de EB inductora de infertilidad. Una cantidad eficaz de EB para inducir infertilidad puede depender, por ejemplo, de la vía de administración, la edad del animal y su tamaño (peso corporal). Por consiguiente, el experto en la técnica puede titular la dosificación y modificar la vía de administración de EB para obtener el efecto óptimo para un animal particular. Una dosificación típica de EB puede oscilar entre aproximadamente 0,01 mg/kg y hasta aproximadamente 100 mg/kg o más. En otras realizaciones, la dosificación de EB puede oscilar entre 0,1 mg/kg y aproximadamente 100 mg/kg; o entre 1 mg/kg y aproximadamente 100 mg/kg; o entre 5 mg/kg y aproximadamente 100 mg/kg. Por ejemplo, en ratas y hámsteres, pueden administrarse 300, 100 o 30 |ig para inducir infertilidad. En animales más grandes, una dosis similar sería eficaz.
Momento de la administración
Las composiciones que comprenden EB para inducir esterilidad se administran antes de la pubertad (antes de alcanzar la madurez sexual/capacidad de reproducción). Las composiciones pueden administrarse días, semanas, meses, o incluso años después del nacimiento, siempre que las composiciones se administren antes de que el animal alcance la pubertad. La administración de EB inhibe/bloquea eficazmente la maduración de los órganos sexuales/gónadas.
Vía de administración
La vía de administración de la composición proporcionada en el presente documento es según métodos conocidos, por ejemplo, inyección (intraperitoneal, intramuscular, subcutánea) y nasal (inhalación). En una realización, se administra EB para la esterilización de un animal en una única dosis, una vez. En otras realizaciones, pueden llevarse a cabo múltiples administraciones de EB para producir la esterilización.
Composiciones
En una realización, las composiciones de EB para la administración inyectable pueden estar en forma de suspensiones oleaginosas, que incluyen aceite, tal como aceite vegetal (por ejemplo, aceite de maíz), aceite de semilla de algodón, aceite de cacahuete, y/o aceite de sésamo. Pueden usarse otros portadores o cargas en lugar de, o además de, el aceite. Los portadores/cargas pueden incluir lactosa, sacarosa, polvo de almidón, ésteres de celulosa de ácidos alcanoicos, ésteres alquílicos de celulosa, talco, ácido esteárico, estearato de magnesio, óxido de magnesio, sales de sodio y calcio de ácidos fosfórico y sulfúrico, gelatina, goma arábiga, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, y/o poli(alcohol vinílico). Estas suspensiones pueden formularse según métodos disponibles en la técnica para dispersar y suspender componentes.
En otra realización no cubierta por las reivindicaciones, la composición descrita anteriormente puede encapsularse para su administración. En una realización no cubierta por las realizaciones, puede formarse una cápsula a partir de tubos de silicona con tapones en cada extremo para contener una mezcla de, por ejemplo, EB y aceite. Las cápsulas pueden colocarse, tal como mediante inyección (descrito adicionalmente a continuación), en el cuerpo del sujeto. Las composiciones de EB descritas en el presente documento pueden formularse para liberación inmediata o en una formulación de liberación prolongada (por ejemplo, liberación lenta). Por ejemplo, puede prepararse EB con portadores que protegen el EB de una liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada.
Los expertos en la técnica conocen muchos métodos para la preparación de formulaciones de liberación controlada/lenta. Por ejemplo, los expertos en la técnica conocen también técnicas para formular una variedad de medios de administración sostenida o controlada, tales como portadores liposomales, polímeros (por ejemplo, copolímeros de etileno-acetato de vinilo, polianhídridos, silicona, poli(ácido glicólico), colágeno, poliortoésteres, poli(ácido láctico) y polilácticos, poliglicólicos (PLG)), micropartículas, nanopartículas o perlas porosas, e inyecciones de depósito). Por ejemplo, véase el documento PCT/US93/00829, que describe la liberación controlada de micropartículas poliméricas porosas para la administración de composiciones farmacéuticas.
Los ejemplos adicionales de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices de polímeros semipermeables en forma de partículas conformadas, por ejemplo, películas o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida pueden incluir poliésteres, hidrogeles, polilactidas (patente estadounidense n.° 3.773.919, documento EP 58.481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers, 22:547-556, 1983), poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15; 167-277, 1981; Langer et al., Chem. Tech. 12:98-105,1982), etileno-acetato de vinilo (Langer et al., citado anteriormente) o poli-ácido D(-)-3-hidroxibutírico (documento EP 133.988).
Las composiciones de liberación sostenida también incluyen liposomas, que pueden prepararse mediante cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692, 1985; documentos EP 36.676; EP 88.046; EP 143.949.
En algunas realizaciones, la composición tiene diversas velocidades de liberación (por ejemplo, liberación controlada o liberación inmediata). Liberación inmediata se refiere a la liberación de EB inmediatamente tras la administración. En otra realización, se produce la liberación inmediata cuando hay disolución de EB en el plazo de 1-20 minutos después de la administración. La disolución puede ser de la totalidad o menos que la totalidad (por ejemplo, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 91 %, aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 93 %, aproximadamente el 94 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 99 %, aproximadamente el 99,5 %, el 99,9 % o el 99,99 %) de EB. En otra realización, la liberación inmediata da como resultado una disolución completa o menos que completa en el plazo de aproximadamente una hora tras la administración.
Liberación controlada, liberación lenta, o liberación sostenida se refieren a la liberación de un principio activo, tal como EB, de una composición o forma de dosificación en la que el principio activo se libera a lo largo de un periodo de tiempo prolongado. En una realización, la liberación controlada da como resultado la disolución de EB en el plazo de 20-180 minutos después de la administración. En otra realización, la liberación controlada da como resultado la disolución a lo largo de varias horas a unos pocos días o semanas. En otra realización, se libera EB a lo largo de un periodo de unas pocas semanas, incluidos de aproximadamente 15 a 20 días.
En otra realización, la composición se formula para inhalación; por ejemplo, puede formularse EB como un polvo seco. También pueden formularse disoluciones de inhalación con un propelente para la administración de aerosol. En otra realización, las disoluciones de inhalación pueden nebulizarse.
Una realización proporciona kits para producir una unidad de administración de una sola dosis. Los kits pueden contener jeringas precargadas de una sola y múltiples cámaras que contienen EB e instrucciones para su uso (esterilización de un animal).
Realización del sistema de administración
La presente divulgación también describe sistemas y métodos no cubiertos por las reivindicaciones para administrar una composición de esterilizante químico (también denominado “sistema de administración de esterilizante químico”) a un animal para iniciar la esterilización química del animal. En una realización, el esterilizante es EB.
La figura 27 muestra una vista conceptual de un sistema 10 de administración de esterilizante químico de ejemplo no cubierto por las reivindicaciones (denominado a continuación en el presente documento “sistema 10 de esterilizante” o simplemente “el sistema 10”). Este ejemplo de sistema 10 incluye un dispositivo 12 inyector (también denominado a continuación en el presente documento “inyector 12”) que está configurado para administrar un cuerpo 14 de contención de esterilizante (por ejemplo, cápsula) sobre o en un animal 2 (mostrado como un cachorro/canino neonatal 2 en la figura 27, que podría ser un cachorro/canino neonatal macho o hembra). Los expertos en la técnica apreciarán que el animal 2 podría ser un macho o una hembra y podría ser otro tipo de ganado, tal como un lechón o un cordero, o podría ser un animal de compañía, tal como un perro o un gato. El cuerpo 14 de contención de esterilizante incluye una dosis especificada del esterilizante químico (por ejemplo, EB) y está configurado para liberar el esterilizante químico en o sobre el animal 2 después de que el cuerpo 14 de contención de esterilizante haya administrado al animal 2 mediante el inyector 12. En un ejemplo, el cuerpo 14 de contención de esterilizante está generalmente en forma de una cápsula, por ejemplo, un cuerpo cilíndrico o sustancialmente cilíndrico, de modo que puede pasar a través del inyector 12 y dentro de o sobre el animal 2, tal como se describe en más detalle a continuación. Por este motivo, el cuerpo 14 de contención de esterilizante se denominará también “cápsula 14 de
administración de esterilizante”, “cápsula 14 de administración” o simplemente “cápsula 14”. Los expertos en la técnica apreciarán que no es necesario que el cuerpo 14 de administración de esterilizante tenga la forma cilíndrica o sustancialmente cilíndrica que podría considerarse normalmente como una “cápsula”.
En un ejemplo, el inyector 12 comprende un cuerpo 16 principal, un elemento 20 de fuerza (por ejemplo, émbolo) y, en algunos ejemplos, una estructura 18 de inserción y/o uno o más elementos 22 de agarre. En el ejemplo mostrado en la figura 27, la configuración del inyector 12 es similar a una jeringa médica de manera que, en algunos ejemplos, el inyector 12 se denominará “jeringa 12”, el cuerpo 16 principal se denominará “cilindro 16”, y el elemento 20 de fuerza se denominará “pistón 20”. En un ejemplo, el cuerpo 16 principal encierra al menos parcialmente una cámara 24 en la que se emplaza una porción del elemento 20 de fuerza. En un ejemplo, el elemento 20 de fuerza puede deslizarse a lo largo de la cámara 24 para cambiar el volumen interno experimentado por el gas o fluido en la cámara 24 para cambiar la presión del gas o fluido en la cámara 24 y, por tanto, cambiar la fuerza impulsora ejercida por el gas o fluido en la cámara 24.
En un ejemplo, la estructura 18 de inserción (opcional) comprende la estructura a través de la cual pasará la cápsula 14 de administración para proporcionar la colocación de la cápsula 14 de administración en una ubicación especificada en o sobre el animal 2. En un ejemplo, la estructura 18 de inserción comprende una estructura estrecha con un área de sección transversal pequeña que permite que la estructura 18 de inserción se use para perforar una o más capas epidérmicas del animal 2 de modo que la cápsula 14 de administración pueda inyectarse en el mismo. Por este motivo, la estructura 18 de inserción puede denominarse también a continuación en el presente documento “aguja 18 hipodérmica”, o simplemente “aguja 18”. Por ejemplo, la aguja 18 puede incluir una cánula 26 que se extiende desde un extremo proximal acoplado al cilindro 16 y un extremo distal configurado para su inserción en el animal 2. El extremo distal de la cánula 26 puede incluir una punta relativamente afilada y puntiaguda que puede perforar la una o más capas epidérmicas del animal 2 objetivo. Una luz 30 pasa a través de la cánula 26 desde el extremo proximal hasta el extremo distal. En un ejemplo, la cápsula 14 de administración puede estar situada en la luz 30 donde la cápsula 14 de administración puede impulsarse fuera de la cánula 26. En un ejemplo, la luz 30 está en comunicación de fluido con la cámara 24 de jeringa de modo que el elemento 20 de fuerza, cuando se mueve hacia delante, puede impulsar la cápsula 14 de administración a través de la luz 30 y fuera de la punta distal con suficiente fuerza como para inyectarse en el animal 2 objetivo.
El elemento 20 de fuerza incluye una estructura móvil que, cuando se mueve desde una primera posición hasta una segunda posición, puede hacer que la cápsula 14 de administración se mueva fuera del inyector 12 de modo que la cápsula 14 de administración pueda administrarse en o sobre el animal 2. En el ejemplo donde el inyector 12 es un dispositivo de tipo jeringa, el cuerpo 16 principal puede estar conformado en una configuración de tipo tubo cilíndrico, de manera que el cuerpo 16 principal puede denominarse también en el presente documento “cilindro 16”. El elemento 20 de fuerza puede comprender un pistón que se ajusta estrechamente dentro del cilindro 16 cilíndrico (por ejemplo, con una estructura que tiene sustancialmente el mismo tamaño y forma de sección transversal que una sección transversal del cilindro 16) de modo que, cuando el elemento 20 de fuerza se mueve axialmente a lo largo del cilindro 16, comprime el gas ubicado dentro de la cámara 24 (por ejemplo, aire), y el aumento de presión actúa como fuerza impulsora para impulsar la cápsula 14 de administración a través de la estructura 18 de inserción. En otro ejemplo, el elemento 20 de fuerza incluye una estructura 28 de empuje que está acoplada a o forma parte del pistón 20, en donde la estructura 28 de empuje se acopla con la cápsula 14 de administración y empuja la cápsula 14 de administración fuera del inyector 12. Por ejemplo, si el inyector 12 incluye una estructura 18 de inserción, entonces la estructura 28 de empuje empuja la cápsula 14 de administración a través de la luz 30 de la estructura de inserción y fuera de la punta distal de la cánula 26 para su inserción en el animal objetivo. En un ejemplo, el uno o más elementos 22 de agarre están dispuestos sobre el cuerpo 16 principal del inyector 12 y permiten que un usuario sostenga y estabilice el inyector 12 al tiempo que acciona el elemento 20 de fuerza para impulsar la cápsula 14 de administración dentro del animal 2 objetivo.
En un ejemplo, la cápsula 14 de administración está dimensionada y conformada de modo que se ajusta dentro de la luz 30 en la estructura 18 de inserción. En un ejemplo, la cápsula 14 de administración está dimensionada y conformada para inyección intramuscular, intraperitoneal, o subcutánea en el animal 2.
Se ha encontrado que el sistema 10 de esterilizante, no cubierto por las reivindicaciones, mostrado en la figura 27, es eficaz para proporcionar esterilización de mamíferos basada en productos químicos. Por ejemplo, en experimentos (descritos en más detalle en los EJEMPLOS a continuación y tal como se mencionó anteriormente) donde se inyectó por vía subcutánea la cápsula 14 de administración de esterilizante que contiene una composición 34 de esterilizante que incluye benzoato de estradiol a ratas macho prematuras, se encontró que la composición 34 de esterilizante es eficaz en la inhibición del desarrollo de la kisspeptina neuronal en el hipotálamo del cerebro, los testículos (por ejemplo, el sitio de producción de testosterona y esperma), y la vesícula seminal y la próstata (por ejemplo, glándulas reproductoras masculinas auxiliares que producen componentes del semen). En las ratas macho a las que se les inyectó la cápsula 14 de administración que contenía EB se impidió que experimentaran la pubertad y se volvieron permanentemente estériles. Específicamente, los testículos de las ratas macho no produjeron testosterona ni esperma. Cuando la cápsula 14 de administración de esterilizante con la composición 34 de esterilizante de benzoato de estradiol se inyectó en ratas hembra prematuras, se encontró que el benzoato de estradiol inhibía los sistemas reproductores de las hembras, impidiendo que las hembras experimentaran el ciclo
menstrual y que produjeran óvulos.
Las ratas sujeto tampoco tuvieron efectos negativos obvios en su salud como resultado de la inyección del benzoato de estradiol por medio de la cápsula 14 de administración de esterilizante. Un examen de las funciones del sistema inmunitario, el hígado, y el riñón de los animales no encontró ninguna patología clínica en las ratas sujeto o bien macho o bien hembra. Además, después de someter a prueba más de 200 animales con la cápsula 14 de administración que contiene benzoato de estradiol, ningún sujeto animal murió o presentó enfermedad durante un periodo de prueba de seis meses.
El desarrollo y la función del sistema reproductor son constantes en todas las especies de mamífero. Todos los mamíferos usan las mismas hormonas reproductivas con variaciones mínimas entre las especies. Por ejemplo, hormonas reproductivas tales como estrógeno, progesterona, kisspeptina, hormona luteinizante (LIT) y hormona foliculoestimulante (FSH) extraídas de una especie tienen el mismo efecto biológico o uno sustancialmente similar en todas o casi todas las demás especies de mamíferos. Debido al alto nivel de conservación, la composición 34 de esterilizante de benzoato de estradiol (y otras composiciones de tipo estradiol) será eficaz en la esterilización de todos los mamíferos y aves.
Ejemplos
Diversas realizaciones pueden entenderse mejor mediante la referencia a los siguientes ejemplos, que se ofrecen a modo de ilustración. La divulgación no se limita a los ejemplos facilitados en el presente documento.
EJEMPLO 1
Un implante eSpay, no cubierto por las reivindicaciones, induce esterilidad permanente en machos y hembras. Introducción
En mamíferos, la kisspeptina inicia la pubertad estimulando directamente la liberación de hormona liberadora de gonadotropina (GnRH), también conocida como gonadoliberina. Por tanto, la kisspeptina facilita la sincronización correcta de la pubertad y el desarrollo normal de las gónadas. Se ha encontrado que la inactivación de un gen Kissl, responsable de la codificación de la kisspeptina, o su receptor, GPR54, da como resultado esterilidad tanto en ratones macho como hembra (usándose el ratón como organismo modelo). La kisspeptina se expresa principalmente en dos regiones del hipotálamo, el área preóptica (POA) y el núcleo arcuato (ARC). Mientras que se cree que las neuronas de kisspeptina en el POA tienen un papel crítico en los aumentos de hormona luteinizante en hembras, las neuronas de kisspeptina del núcleo arcuato median en efectos de retroalimentación negativa de los esteroides sobre la liberación de GnRH tanto en adultos macho como hembra. Aunque la kisspeptina en mamíferos prepúberes es necesaria para iniciar la pubertad, la contribución de poblaciones específicas, ya se originen del núcleo arcuato o el área preóptica, todavía no está clara.
El desarrollo de una neurona de kisspeptina y la expresión de kisspeptina difieren probablemente entre el POA y el ARC. En el área preóptica, aparecen células que expresan Kiss1 entre los días postnatales (PND) 8-10 en ambos sexos de animales de laboratorio (ratones y ratas). Se revela dimorfismo sexual a los 10-12 días postnatales, donde las hembras presentan más células de kisspeptina que los machos en el área preóptica. En cambio, la kisspeptina en el núcleo arcuato se expresa durante el desarrollo embrionario. En ambos sexos, aparecen ARN mensajero y expresión de proteínas alrededor del día embrionario 14,5, aumentando hasta el día embrionario 18,5, y disminuyendo justo antes del nacimiento. Se detecta ARN mensajero de Kiss1 en el arcuato en el día postnatal 0 tan solo 0-4 horas después del nacimiento. A diferencia del área preóptica, Kiss1 del arcuato se expresa normalmente en los primeros diez días de vida en roedores. La expresión disminuye luego durante la tercera semana postnatal pero comienza a mostrar aumentos en la pubertad.
En contraste adicional con la expresión en el área preóptica, la expresión de kisspeptina en el arcuato no es altamente dimórfica sexualmente en adultos, compatible con la función de mediar en la retroalimentación negativa que se produce en ambos sexos. Se ha encontrado que la expresión de kisspeptina en el arcuato parece aumentar alrededor del momento de inicio de la pubertad precoz en ambos sexos. En las ratas hembra, por ejemplo, tanto el ARN mensajero de Kiss1 como la densidad de fibras neuronales aumentan antes del inicio de la pubertad, produciéndose los aumentos en primer lugar en el núcleo arcuato y posteriormente en el área preóptica. Esto sugiere que la kisspeptina en el núcleo arcuato puede ser responsable del inicio de la pubertad.
Parecen ser necesarios esteroides sexuales para el desarrollo y la organización apropiados de las neuronas de kisspeptina así como para la expresión de Kiss1. En ratones deficientes en receptor alfa de estrógenos específico de células de kisspeptina, el número de fibras de kisspeptina en el hipotálamo se reduce. Esto también es cierto cuando se agotan las hormonas mediante gonadectomía en roedores en desarrollo. El estrógeno y la testosterona inhiben la expresión de Kiss1 en el núcleo arcuato, pero aumentan la expresión de Kiss1 en el área preóptica. Se ha encontrado que las neuronas de kisspeptina pueden localizarse junto con los receptores de estrógenos; además, antes de la pubertad, la señalización de estrógenos puede reprimir la kisspeptina en el núcleo arcuato, lo que podría
interrumpir la activación del eje hipotalámico-hipofisario-gonadal (HPG), impidiendo de ese modo el inicio prematuro de la pubertad.
Además, la exposición de una hembra a estrógenos durante los días postnatales 0-10 puede dar como resultado una supresión permanente de la expresión de kisspeptina en el núcleo arcuato. Las ratas no presentaron supuestamente secreción de hormona luteinizante o ciclicidad estral. Aunque se produjo GnRH, su liberación parecía estar alterada. El número de células que expresan Kiss1 e inmunorreactivas con kisspeptina observadas se redujo significativamente. Sin embargo, no está claro si la exposición a estrógenos afecta a la proliferación y diferenciación de neuronas de kisspeptina o a la transcripción y expresión del gen de Kiss1.
Materiales y métodos
Animales. Se adquirieron ratas macho y hembra Sprague-Dawley de tres meses de edad de Charles River Laboratory y se usaron como reproductores. Los recién nacidos se designaron como reproductores sucesivos si no se usaron para fines experimentales. Cuando los reproductores alcanzaron la edad de reproducción (seis semanas de edad para las hembras y diez semanas de edad para los machos), se instalaron parejas reproductoras en jaulas individuales para una reproducción continua hasta que se produjo el número deseado de crías o los reproductores alcanzaron un año de edad. La preñez se indicó por el cambio del peso corporal de las hembras reproductoras y el abultamiento del vientre. Al nacer, (día postnatal o PND 0), se sexaron las crías y se asignaron a experimentos específicos. Las crías se destetaron cuando alcanzaron la edad de 21 días.
Implantación de la cápsula de benzoato de estradiol. Se disolvió polvo de EB (3-benzoato de 17p-estradiol, Sigma E8515) en aceite de sésamo (Sigma S3547) para producir una disolución de concentración de 300 |ig/5 |il. Se preparó una cápsula de EB-300 |ig (EB300) usando tubos de silicona (Dow Corning 508-005) que contenían 5 |il de disolución de EB que luego se sellaron con sellante de silicona (Factor II, Inc. Medical Adhesive A-100). La cápsula (en el presente documento denominada EB300 o eSpay) se dejó a temperatura ambiente durante una hora para permitir que se secara el sellante y luego se sumergió en aceite de sésamo. El tamaño de la cápsula era de 8 mm de largo y 2,16 mm de diámetro. Se desinfectó la piel del sitio de implante (en la espalda entre los hombros) aplicando una disolución de povidona yodada. Se cortó una incisión transversal de 2 mm de largo en la piel con tijeras quirúrgicas estériles en la espalda cerca del hombro. Se creó un bolsillo entre la piel y las capas musculares insertando la punta de pinzas de extremos romos. Se insertó la cápsula en el bolsillo y se empujó lateralmente de modo que la cápsula apuntara hacia fuera de la incisión. Se selló la incisión aplicando adhesivos quirúrgicos.
Medición hormonal. Se recogió sangre de la vena de la cola o mediante punción cardíaca. Se centrifugó la sangre a 2000xg durante 10 minutos; entonces se recogió el suero y se conservó a -20 °C hasta análisis adicionales. Se midieron las concentraciones séricas de estradiol usando kits de ELISA (DRG EIA4399) con un intervalo notificable de 1,4-200 pg/ml. Se usaron kits de ELISA (DRG EIA1559) con un intervalo notificable de 0,083-16 ng/ml para medir las concentraciones de testosterona circulante. Se midieron las concentraciones séricas de hormona luteinizante (LH) en el University of Virginia Center for Research in Reproduction Ligand Assay and Analysis Core mediante un inmunoensayo de tipo sándwich usando anticuerpos monoclonales contra tanto la LH bovina (n.° 581B7) como la subunidad beta de LH humana (n.° 5303: Medix Biochemica, Kauniainen, Finlandia) tal como se describió anteriormente (PMID: 8462469), con un intervalo notificable de 0,04-37,4 ng/ml.
Pruebas del comportamiento de apareamiento de los machos. Para investigar el comportamiento sexual, se emparejaron ratas macho de cuatro meses de edad con hembras ovariectomizadas con estro inducido. Se indujo el estro mediante tratamiento con estradiol exógeno (50 |ig/kg s.c., 54 h antes de las pruebas) y progesterona (2,0 mg/kg s.c., 6 h antes de las pruebas). Se observó el comportamiento sexual de los machos en una jaula transparente nueva (56x35x31 cm) iluminada mediante una lámpara de 40 W con un filtro rojo. Cada rata macho virgen se colocó individualmente en una jaula de prueba durante cinco min. Entonces se introdujo una hembra receptiva, y se observó el comportamiento sexual durante 30 min. Se registraron el tiempo hasta la primera monta (latencia) y el número de montas para cada animal tal como se describió anteriormente (PMTD: 17016704).
Análisis del esperma. Se extirpó el epidídimo caudal y se trituró con tijeras finas en una solución salina tamponada con fosfato templada (37 °C). Se incubó la suspensión de esperma a 37 °C durante diez minutos para permitir que los espermatozoides nadaran fuera del epidídimo triturado. Entonces se analizó la movilidad de los espermatozoides mediante un analizador de esperma asistido por ordenador (CASA; Sperm Vision II, Minitube of America, Vernon, WI, EE.UU.). Se examinaron al menos diez campos microscópicos que cubrían toda el área visible de la cámara de análisis de semen sin solapar campos sucesivos. Se midió la movilidad de los espermatozoides mediante el porcentaje de espermatozoides móviles, espermatozoides móviles progresivos, y espermatozoides inmóviles. Para la cifra de espermatozoides total, se recogieron dos alícuotas de muestras de semen de cada ratón y se diluyeron en 1:200 de formalina para la inmovilización. Se contó el número de espermatozoides usando un hemocitómetro, y se calculó el número promedio de concentración de espermatozoide por mililitro y se notificó como millones de espermatozoides/ml.
Respuesta hipotalámica-hipofisaria tras la inyección de KISS-10. Se recogió sangre periférica (50 |il) de la vena de la
cola ventral en ratas macho y hembra adultas de 60-70 días de edad. Inmediatamente después de la recogida de sangre, a las ratas se les inyectó por vía intraperitoneal 50 nmoles/animal de kisspeptina-10 (Metastin 45-54, Millipore-Sigma, San Diego, CA), y se recogió otra muestra de sangre 30 minutos tras la inyección. Se centrifugaron las muestras a 2000 x g durante diez minutos, y se recogió suero y se almacenó a -20 °C hasta análisis adicionales. Se midieron las concentraciones séricas de hormona luteinizante (LH) en el University of Virginia Center for Research in Reproduction Ligand Assay and Analysis Core mediante un inmunoensayo de tipo sándwich usando anticuerpos monoclonales contra tanto la LH bovina (n.° 581B7) como la subunidad beta de LH humana (n.° 5303: Medix Biochemica, Kauniainen, Finlandia) tal como se describió anteriormente (PMID: 8462469), con un intervalo notificable de 0,04-37,4 ng/ml.
Prueba de fertilidad. Para evaluar la fertilidad de las ratas macho, cada una se alojó con una hembra reproductora durante dos semanas a la edad de cuatro meses. Se registraron el porcentaje de fertilidad de los machos (número de machos que produjeron una camada/número total de machos x 100) y el tamaño de la camada (número de crías por camada). Para evaluar la fertilidad de las ratas hembra, cada rata hembra se alojó con un macho reproductor durante dos semanas a la edad de tres meses. Se registraron el porcentaje de fertilidad de las hembras (número de hembras que produjeron una camada/número total de hembras x 100) y el tamaño de la camada (número de crías por camada).
Histopatología. A sus respectivas edades de muestreo, se sacrificaron las ratas mediante asfixia con CO2 seguido por toracotomía bilateral. Se diseccionaron órganos completos o porciones de órganos (cerebro, hipófisis, gónadas, tracto reproductor, corazón, hígado, riñón, bazo, glándulas mamarias y fémur) y se fijaron inmediatamente en paraformaldehído al 4 % recién preparado durante 24 horas, seguido por lavado en PBS (solución salina tamponada con fosfato pH 7,4) y luego se almacenaron en etanol al 70 % a 4 °C hasta su uso. Los tejidos fijados se procesaron por medio de un procesador de tejido automatizado (Miles Scientific Tissue Tek VIP 2000) y se incrustaron en bloques de parafina. Los tejidos incrustados se cortaron en secciones de 7 μm de grosor usando un micrótomo (Leica Biocut Model 3011) y se montaron sobre portaobjetos de vidrio cargados positivamente (tipo). Después de la desparafinización, se procesó el tejido para o bien la tinción con hematoxilina y eosina o bien inmunohistoquímica (IHC) para diversos biomarcadores. Se realizó la recuperación de antígenos para IHC usando tampón citrato (pH 6,0) y se sometió a microondas al 10 % de potencia durante 15 minutos. Se bloqueó la actividad peroxidasa endógena usando H2O2 al 3 % durante 20 minutos, y se bloquearon los portaobjetos con suero del huésped al 5 % durante una hora antes de incubar con anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C. Se usaron los siguientes anticuerpos primarios: kisspeptina (conejo-anti-kisspeptina 1:250, AB9754-Millipore-Sigma), DDX4/MVH (conejoanti-DDX4/MVH 1:2.000, AB13840 Abcam), LHp (conejo-anti-LHp 1:100, National Hormone & Peptide Program), StAR (conejo-anti-StAR 1:2.000, SC-25806 Santa Cruz), GH (conejo-anti-GH 1:100, National Hormone & Peptide Program), Cyp17A1 (conejo-anti-Cyp17A1 bovino 1:5.000, una donación del Dr. Alan Conley de UC Davis). Se usaron anticuerpos secundarios de asno o cabra anti-conejo conjugados con peroxidasa a una concentración de 1:200 y se detectaron usando un kit de DAB (VectorLabs). El análisis y la preparación de la glándula mamaria de montaje completo se realizaron tal como se describió anteriormente (10.21769/BioProtoc.2915). Se realizó un ensayo apoptótico usando un kit de detección de apoptosis in situ S7100 (Millipore) teñido con cromógeno de DAB (diaminobencidina) y contrateñido con hematoxilina según las instrucciones del fabricante.
Hematobioquímica. Se recogió sangre mediante punción cardíaca y se dividió inmediatamente en dos muestras: (a) Para el recuento de sangre completa (CBC), se mezcló la sangre con EDTA en un tubo hematológico (BD Microtainer 365967) y se almacenó a 4 °C antes del análisis en un plazo de 24 horas. (b) Para el perfil bioquímico del suero, se centrifugó la sangre a 2000 xg durante diez minutos; luego se recogió el suero separado y se conservó a -20 °C hasta su análisis. El análisis de la muestra lo realizó el Veterinary Diagnostic Laboratory en la University of Illinois en Urbana-Champaign.
Secuenciación de ARN de células individuales. Para investigar la expresión génica diferencial en la región del hipotálamo entre el vehículo y EB300, se obtuvo el hipotálamo de dos ratas en cada grupo, y se agrupó la suspensión de células individuales del mismo grupo para realizar secuenciación de ARN de células individuales (scRNAseq). Se extrajo sangre mediante perfusión usando medios de cultivo Ml 99 después del sacrificio. Se diseccionó rápidamente el cerebro y se transfirió a medios de cultivo M199 enfriados con hielo que contenían FBS al 10 %. Se diseccionó la región hipotalámica usando pinzas finas curvadas. Se disoció el tejido hipotalámico en células individuales usando el kit Neural Tissue Dissociation Kit-Postnatal Neurons (Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA) según las instrucciones del fabricante. La exclusión de azul trípano confirmó que la viabilidad era >85 % en todas las muestras. Se filtraron las suspensiones celulares usando un filtro de 40 μm, y se sedimentaron las células disociadas y se resuspendieron en PBS con albúmina sérica bovina al 1 % (BSA; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). La suspensión celular (aproximadamente 3000 células) de cada muestra se cargó en un instrumento 10x Chromium (10X Genomics, Pleasanton, CA) según el protocolo del fabricante. Se prepararon bibliotecas de secuenciación de ARN de células individuales usando el kit de reactivos Chromium Single Cell 3' v2 (10X Genomics) según el protocolo del fabricante. La etapa inicial realizó una emulsión donde se aislaron células individuales en gotitas junto con perlas de gel recubiertas con cebadores únicos que llevaban 10x códigos de barras de células, identificadores moleculares únicos (UMI) y secuencias de poli(dT). Se realizaron reacciones de transcripción inversa para generar ADNc de longitud completa con códigos de barras seguido por la alteración de las emulsiones usando el agente de recuperación y limpieza del ADNc con perlas DynaBeads MyOne Silane (Thermo Fisher Scientific). El ADNc a granel
se amplificó usando un sistema de PCR GeneAmp 9700 con un módulo de bloque de muestras Gold de 96 pocilios (Applied Biosystems). El producto de ADNc amplificado se limpió con el kit de reactivos SPRI select (Beckman Coulter). Se construyeron bibliotecas de secuenciación indexadas usando los reactivos del kit de reactivos Chromium Single Cell 3' v2, siguiendo estas etapas: (1) fragmentación, reparación de extremos, y adición de cola de A; (2) selección de tamaño con SPRI select; (3) ligamiento del adaptador; (4) limpieza tras el ligamiento con SPRI select; (5) PCR de índice de muestra y limpieza con perlas de SPRI select. La cuantificación de las bibliotecas y la evaluación de la calidad se realizaron usando un ensayo fluorométrico Qubit (Invitrogen) con un kit de ensayo de ADNbc HS (alta sensibilidad) y un bioanalizador Agilent 2100 usando un chip de ADN de alta sensibilidad (Agilent Genomics). Las bibliotecas indexadas se agruparon de manera equimolar y se secuenciación en un instrumento Illumina HiSeq4000.
Análisis de los datos de scRNA-seq. La expresión de células individuales se analizó inicialmente usando el programa de sofware Cell Ranger Single Cell (v2.1.1) para realizar el control de calidad, la desmultiplexación de muestras, el procesamiento de códigos de barras y el recuento de genes 3' de células individuales. Las lecturas de secuenciación se alinearon en el transcriptoma de rata UCSC m6 usando el programa Cell Ranger con parámetros por defecto. Se fusionaron las muestras usando la función de agregación de Cell Ranger con parámetros por defecto. Se analizaron un total de 3.634 y 3.339 células individuales de los grupos de control y de EB300, respectivamente. Las lecturas sin procesar medias por célula fueron 45.201 y 48.751 respectivamente. La mediana de genes por célula fueron 1.496 y 1.429, respectivamente. Se realizó un análisis adicional en R (v3.5) usando el cellrangerRkit (v2.2.0), Seurat (v2.0) y el paquete Monocle (v2.8.0). La matriz de gen-célula-código de barras de las muestras se transformó logarítmicamente y se filtró basándose en el número de genes detectados por célula (cualquier célula con menos de 300 genes o más de 5.000 genes por célula se filtró), así como células con más del 6 % de recuentos de UMI mitocondriales y más del 50 % de recuentos de UMI ribosómicos. Se realizó la regresión de la expresión génica basándose en el número de recuentos de UMI y el porcentaje de genes mitocondriales. Solo se incluyeron genes detectados en al menos tres células. Entonces se escalaron las células hasta un total de 1e4 moléculas. Conjuntamente, se mantuvieron 6.964 células para el análisis estadístico. Para reducir los datos dimensionalmente, se seleccionaron 2.505 genes variables basándose en su expresión y dispersión (corte de expresión=0 y corte de dispersión=0,5). Se ejecutó PCA sobre la matriz normalizada de gen-código de barras. Entonces se realizó una aproximación de Bames-hut a t-SNE en las primeras 12 componentes principales para visualizar las células en un espacio bidimensional. Las primeras 11 componentes principales se usaron para la proyección de t-SNE y el análisis de agrupación usando el enfoque Elbow Plot. Se identificaron agrupaciones usando la función “FindClusters” en Seurat con un parámetro de resolución de 0,6. Este método de agrupación basado en gráficos se basa en un algoritmo de agrupación basado en la optimización de modularidad de vecino más próximo compartido (SNN). Se identificaron genes únicos específicos de agrupación ejecutando la función “FindAllMarkers” de Seurat usando el marco MAST. Se identificaron un total de 17 agrupaciones a partir de tSNE, y se identificaron cinco genes marcadores en cada agrupación usando la función “FindMarkers”. El gráfico de tSNE, el histograma, el gráfico de dispersión, y los gráficos de violín se representaron gráficamente usando Seurat.
Estadística
Se realizaron análisis de datos generales usando software estadístico (SPSS 22). Se sometieron a prueba la distribución normal de los datos continuos mediante una prueba de Shapiro-Wilk. Tras la confirmación de la homogeneidad de la varianza, se analizaron todos los datos continuos distribuidos normalmente con pruebas paramétricas y una prueba a posteriori HSD de Tukey. Todos los datos continuos no distribuidos normalmente se analizaron mediante pruebas no paramétricas (ANOVA de Kruskal Wallis). Los datos ordinales se analizaron de manera similar. Los datos se presentan gráficamente como la media y el error estándar de la media. Para todos los análisis, el valor de alfa se fijó a 0,05. Para extraer conclusiones de la scRNAseq, se identificaron genes únicos específicos de agrupación ejecutando la función “FindAllMarkers” de Seurat usando el marco MAST. Se identificaron un total de 17 agrupaciones a partir de tSNE; los cinco genes marcadores superiores en cada agrupación se identificaron usando la función “FindMarkers”. Se sometió a prueba la expresión génica diferencial entre el control y EB300 mediante la prueba de razón de probabilidades 'bimodal' por defecto en Seurat (corte, p_val_adj<0,05). El gráfico de tSNE, el histograma, el gráfico de dispersión y los gráficos de violín se representaron gráficamente usando Seurat.
Resultados
La administración controlada de 3-benzoato de 17p-estradiol por medio de eSpay a ratas neonatales suprime irreversiblemente la expresión hipotalámica de kisspeptina y el desarrollo de células germinales tanto en machos como en hembras.
Fabricación de eSpay (o alternativamente denominado EB300). No cubierto por las reivindicaciones
Se usó una cápsula de silicona que contenía 3-benzoato de 17p-estradiol (EB, Sigma E8515) como dispositivo para elevar la concentración en sangre de 17p-estradiol (E2) hasta un nivel suprafisiológico. Una vez implantada por vía subcutánea, la cápsula de silicona con EB (denominada eSpay) libera EB durante un periodo de tiempo prolongado. Se eligió EB en lugar de E2 porque E2 se elimina rápidamente por el metabolismo hepático, mientras que EB se
hidroliza lentamente en E2, produciendo un nivel de E2 en sangre sostenido y alto durante un periodo de tiempo prolongado de aproximadamente tres semanas. Después de varios estudios, se determinó que un implante subcutáneo de 300 |ig de EB sería eficaz en la inducción de esterilidad. Por tanto, se preparó EB que contenía 300 |ig de EB (en el presente documento EB300) disolviendo 300 |ig de EB en 5 |il de aceite de sésamo (Sigma S3547), y se insertó en un tubo de silicona (Dow Corning 508-005) que posteriormente se cerró con sellante de silicona (Factor II, Inc. Medical Adhesive A-100). La cápsula se mantuvo a temperatura ambiente hasta su uso. La cápsula de EB300 tenía aproximadamente 8 mm de largo y 2,16 mm de diámetro. La piel del sitio de implante (en la espalda entre los hombros) se desinfectó aplicando disolución de povidona yodada. Se hizo una incisión transversal de 2 mm de largo en la piel con tijeras quirúrgicas estériles. Se creó un bolsillo entre la piel y las capas musculares insertando la punta de pinzas de extremos romos. Se insertó la cápsula en el bolsillo y se empujó lateralmente de modo que apuntara hacia fuera de la incisión, que se selló aplicando adhesivos quirúrgicos.
La eficacia de la cápsula de EB300 como dispositivo para elevar los niveles de E2 en su receptor se sometió a prueba después de implantarla el día del nacimiento (día postnatal 0, PND 0). Se recogieron suero y los hipotálamos en PND 1, 2, 3, 4, 7, 10, 21 y 30, y se midieron las concentraciones de E2. La concentración sérica de E2 estaba elevada y se mantuvo en una meseta durante 10 días (figuras 1A-B) y disminuyó gradualmente con el tiempo, pero mantuvo todavía niveles ligeramente superiores en los grupos tratados con EB que en los controles sin tratar hasta PND 30 (figura 1A). E2 medido a partir de los hipotálamos (calculado como si 1 mg de volumen de tejido fuera igual a 1 ml) mostró patrones de elevación similares, pero la concentración era 100 veces mayor que en los sueros y luego disminuyó bruscamente para PND 4 y regresó hasta casi el nivel basal para PND 7 (figura 1B). Se observaron los mismos patrones de perfiles hormonales en machos y hembras (figuras 2A-B). Estos resultados muestran que el implante de EB300 induce un nivel alto sostenido de E2 en la sangre circulante durante hasta aproximadamente 30 días. Además, el aumento selectivo de los niveles de E2 hipotalámicos con respecto a los niveles séricos durante los primeros cuatro días y la disminución brusca posterior cuando el nivel de E2 sérico es todavía alto indica que el hipotálamo puede tener un sistema regulador único que acumula temporalmente y elimina E2.
Impacto del implante de EB300 sobre la expresión de kisspeptina hipotalámica.
La exposición neonatal a estrógenos redujo significativamente la inmunorreactividad de la kisspeptina en el núcleo arcuato (ARC) tanto en machos como en hembras en la edad adulta temprana a los 2,5 meses de edad (figura 3A) y, de manera similar, se observó menor inmunorreactividad en el grupo de EB300 a los 6-7 meses de edad (figura 3B). En general, los machos tenían menor inmunorreactividad de la kisspeptina que las hembras tanto en ratas jóvenes como más viejas, pero EB disminuyó la inmunorreactividad de la kisspeptina (KISS, un producto proteico del gen de Kiss1) en ambos sexos. Este resultado muestra que un implante de EB300 en un neonato disminuye la expresión de KISS, y el efecto persistió durante mucho tiempo. Puesto que las ratas alcanzan la pubertad a la edad de dos meses, y KISS es la hormona maestra clave en el establecimiento de la fertilidad, la disminución de KISS tiene un impacto sobre la fertilidad en las ratas que recibieron el implante de EB300.
Impacto del implante de EB300 sobre la expresión génica hipotalámica. Las figuras 4A-K representan el hipotálamo adulto, KISS1 se expresa en las regiones de AVPV y ARC (figura 4A).
KISS1 se expresa en las regiones del AVPV y ARC (figura 4A). Se examinó la expresión de KISS1 en la región del ARC mediante anticuerpo anti-KISS 1, proteína KISS1 (puntos blancos en las imágenes) (los planos de secciones de tejido se marcan como líneas de puntos rojos en la figura 4A). La expresión de KISS1 disminuyó visiblemente en el hipotálamo con EB300 en comparación con la del grupo intacto (control) (figura 4B). Para comparar cuantitativamente la expresión de KISS1 entre el grupo de control y de EB300, se diseccionó la región hipotalámica (incluidas las regiones del AVPV y ARC) y se examinó mediante secuenciación de ARN de células individuales (scRNAseq) (figura 4C). En hembras, se identificaron diez tipos de células diferentes (agrupaciones de células) (figura 4D) de un total de 4.049 y 4.223 células de los grupos de control y de EB300, respectivamente (figura 4E). A partir de las agrupaciones de células hipotalámicas, se identificó una agrupación de expresión de Kissl (agrupación 9) (figura 4F), y se compararon los números de células que expresan Kissl y el nivel de expresión de Kissl entre los grupos de control y de EB300. En la agrupación 9, se encontraron 307 y 194 células en los grupos de control y de EB300, respectivamente. Se identificaron sesenta y ocho y 30 células positivas para Kissl de cada grupo, respectivamente. Este resultado indica que los números de células totales en la agrupación 9 y células que expresan Kissl disminuyeron ambos en el hipotálamo con EB300 en comparación los del grupo de control (figura 4G). En machos, se identificaron diez agrupaciones diferentes (figura 4H), de las cuales se examinaron un total 4.674 y 4.229 células en los grupos de control y de EB300, respectivamente (figura 4I). De las agrupaciones de células hipotalámicas, se identificó una agrupación de expresión de Kissl (agrupación 8) (figura 4J). Se compararon los números de células que expresan Kissl y el nivel de expresión de Kissl entre los grupos de control y de EB300. En la agrupación 8, se encontraron 178 y 83 células en los grupos de control y de EB300, respectivamente. Se identificaron sesenta y cinco y 37 células positivas para Kissl de cada grupo, respectivamente. Este hallazgo indica que el número de células totales en la agrupación 8 y células que expresan Kissl disminuyó en el hipotálamo con EB300 en comparación con el del grupo de control (figura 4K). Tomados conjuntamente, estos resultados muestran que el tratamiento con EB en ratas macho y hembra neonatales disminuyó el número de células con KISS1 y, en consecuencia, la expresión de proteína KISS1, en el hipotálamo.
Impacto sobre la hipófisis
Se realizó un análisis histopatológico de las hipófisis de machos y hembras para observar si la hipófisis experimentaba cambios tras la inyección de EB300 (figura 5). Se examinaron secciones de parafina de hipófisis obtenidas de los grupos de control y de EB300 mediante histología por tinción con H&E, sin encontrarse diferencias histológicas entre los grupos. La inmunohistoquímica de LHp (subunidad p de hormona luteinizante) y GH (hormona del crecimiento) no encontró diferencias en la expresión de LH y GH entre los grupos de control y tratado con EB (figura 5). Estos resultados indican que el efecto del implante de EB puede no tener un impacto sobre la secreción de hormona del crecimiento o secreción de hormona LH.
Secreción de LH tras la inyección de KISS-10.
Cuando se secreta a partir de una neurona de kisspeptina, KISS se une a su receptor asociado, KISS1R, ubicado en las neuronas de GnRH, y estimula la secreción de GnRH, lo que a su vez estimula la secreción de LH desde los gonadotrofos de la hipófisis. Para determinar si las neuronas de GnRH y los gonadotrofos conservaban su capacidad de respuesta y funcionalidad en animales en los que se implantó EB300, se midieron las concentraciones de LH séricas antes y después de una inyección de kisspeptina-10 (KISS-10; un análogo de 10 aminoácidos de largo de KISS) en animales de 2,5 meses de edad (figura 6). Antes de la inyección de KISS-10, los niveles basales de LH sérica eran menores en machos y hembras tratados con EB. Sin embargo, se observó una robusta respuesta a KISS-10 en machos y hembras de control y tratados con EB (figura 6). Este hallazgo sugiere que el implante de EB300 no altera el desarrollo y la funcionalidad de o bien neuronas de GnRH o bien gonadotrofos de la hipófisis, indicando la especificidad del impacto biológico de EB300.
Impacto de EB300 sobre las gónadas.
Para determinar si la exposición neonatal a estradiol tenía un impacto sobre el desarrollo de las gónadas en machos, se recogieron testículos en PND 1, 3 y 10, y se tiñeron el túbulo seminífero, la red testicular, y el intersticio testicular con H&E y se examinaron microscópicamente. No se detectaron diferencias histopatológicas obvias entre ratas de control y con EB (figura 7A). Sin embargo, cuando se realizó la tinción con TUNEL, que detecta células que experimentan muerte celular programada, varias células germinales del grupo de EB300 mostraron señales positivas a las edades de PND 3 y 10 (figura 7B), indicando que el implante de EB300 induce muerte de células germinales en los testículos. Este hallazgo estaba apoyado por la disminución de la tinción de DDX4 (marcador de células germinales) en los mismos tejidos (figura 7C). En hembras, sin embargo, la tinción con TUNEL en los ovarios, oviductos o úteros no encontró ninguna diferencia significativa entre los grupos de control y de EB300 (figura 8B). En PND 10, sin embargo, en los ovarios de ratas con EB300, varias células germinales se agruparon juntas sin experimentar rotura del quiste de células germinales. La inmunotinción posterior para DDX4 y FOXL2 (marcador de células de la granulosa) confirmó este fenómeno en el grupo de EB300 cuando los ovocitos del grupo de control se separaron como folículos primordiales singulares (figura 8C). Este resultado es consecuente con el informe previo de que E2 inhibe la rotura del nido de células germinales en el ovario neonatal (PMID: 17446182). Conjuntamente, estos resultados muestran que un implante de EB300 puede tener un impacto directo sobre el desarrollo de las gónadas.
Un solo implante de EB300 en ratas prepúberes induce esterilidad completa en machos y hembras.
Fertilidad.
Para determinar si el impacto sobre las neuronas de kisspeptina y las gónadas induce esterilidad, se introdujeron reproductores probados en las jaulas de las ratas de control y con EB300, se mantuvieron con ellas durante dos semanas y se contaron los números de camadas y de crías que nacieron. Las ratas de control produjeron camadas, las ratas tratadas con EB no produjeron crías (tabla 1).
Tabla 1. Fertilidad (machos y hembras)
Impacto sobre los órganos reproductores femeninos.
En hembras, los animales tratados/con implante de EB300 no presentaron ningún signo de ciclicidad estral tal como se determinó mediante citología vaginal, y sus aberturas vaginales permanecieron estrechas y obstruidas (tabla 2). El examen morfológico e histológico de los ovarios y úteros de ratas de 5,5 meses de edad del grupo de EB300
mostró que eran más pequeños y más delgados, respectivamente, que los del grupo de control (figuras 9 y 10). Las ratas tratadas con EB300 tenían glándulas deficientes en el útero y el cuerpo lúteo en el ovario (figuras 9 y 10). Los ovarios y úteros de ratas más jóvenes (2,5 meses) y más viejas (siete meses) tratadas con EB300 mostraron patrones morfológicos e histológicos similares (figura 10), indicando que estos fenotipos persisten. Sin embargo, en la hipófisis, no se observaron diferencias sustanciales (figura 5), lo que sugiere un efecto específico de órgano del implante de EB300.
Tabla 2. Patrón de ciclado estral
Impacto sobre los órganos reproductores masculinos.
Para determinar si la cifra y la movilidad de los espermatozoides se veían afectadas por el implante de EB300 neonatal, se midieron los números y la calidad de los espermatozoides a los cinco meses de edad. La concentración de espermatozoides (millones/ml) era significativamente menor en el grupo tratado con EB (p=0,001) en comparación con el grupo de control (figura 11). El porcentaje de espermatozoides móviles disminuyó significativamente en las ratas con implante de EB300 (p=0,003). Además, el porcentaje de espermatozoide móvil progresivo disminuyó significativamente en las ratas tratadas con EB300 (p=0,02), y tuvieron un porcentaje significativamente superior de espermatozoide móvil (p=0,01) en comparación con las ratas de control (figura 11). Estos resultados indican que el implante de EB300 neonatal afecta a la calidad y concentración de espermatozoides, teniendo un impacto sobre la fertilidad masculina.
Cuando se examinaron a la edad de 2,5 meses, el grupo de EB300 de animales tenían testículos, epidídimos, vesículas seminales, y glándulas prostáticas significativamente más pequeños en comparación con el grupo de control (figura 12A). El epidídimo de los grupos de EBx11 y EB300 tenían diámetros de túbulos más pequeños y contenían pocas o ninguna célula germinal (figura 12A). La menor expresión de StAR (un marcador de células esteroidogénicas; células de Leydig) y DDX4 (marcador de células germinales) y un mayor número de células positivas para TUNEL en los animales con EB300 sugiere que el implante de EB300 provocó una menor capacidad de síntesis de testosterona, menor producción de esperma, y un mayor nivel de apoptosis (figura 12B). Llamativamente, fueron evidentes impactos similares en los testículos y epidídimos en animales más viejos (figuras 13 y 14). No se observaron diferencias significativas en las glándulas hipofisarias entre los animales de control y con EB (figuras 13 y 14). Cuando se compararon los pesos de los tejidos, los testículos, los epidídimos, y las glándulas auxiliares fueron más ligeros en los grupos de EB300 que en los grupos de control (figura 15).
El comportamiento sexual de los machos depende principalmente de la testosterona, la hormona que secretan las células de Leydig de los testículos en todas las especies de vertebrados. Para evaluar el comportamiento sexual de ratas tratadas con EB, se alojaron machos de cuatro meses de edad con hembras que estaban en estro, un estadio reproductivo en el que las hembras son receptivas a los machos, lo que permite que los machos las monten. Se registraron y compararon el tiempo transcurrido hasta la primera monta (latencia) y el número de montas en 30 minutos. Los animales tratados con EB300 tuvieron una latencia significativamente más prolongada (p=0,01) e hicieron menos intentos de monta (p=0,02) en comparación con los animales de control (figura 16), lo que indica que el implante de EB disminuyó significativamente el comportamiento de apareamiento en machos.
Tomados conjuntamente, estos rasgos reproductivos muestran que el implante neonatal de la cápsula de EB inhibe significativamente el desarrollo de las gónadas y las glándulas auxiliares, la gametogénesis, y el comportamiento sexual, haciendo que tanto los machos como las hembras sean estériles.
Las ratas en las que se implantó una cápsula de silicona que contiene benzoato de estradiol (EB) producen significativamente menos esteroides sexuales de las gónadas que los controles, tanto en machos como en hembras. El desarrollo defectuoso del sistema reproductor tendrá inevitablemente un impacto sobre la síntesis de hormonas esteroideas sexuales, de modo que se examinaron las concentraciones en sangre de esteroides sexuales. Se recogió sangre periférica de los machos a los dos y seis meses de edad y se midieron sus niveles séricos de hormonas. A los 2-3 meses de edad, los niveles séricos de testosterona del grupo tratado con EB300 eran significativamente menores que los del grupo de control (figura 17). También se observó la misma tendencia cuando se midieron las concentraciones de testosterona a los 6-7 meses de edad (figura 17). En hembras, los niveles séricos de E2 no fueron significativamente diferentes entre los grupos tratado con EB300 y de control cuando eran jóvenes. Sin embargo, los niveles de E2 en el grupo de animales tratados con EB300 eran significativamente menores que los del grupo de control (figura 17). Por otro lado, los niveles de testosterona en hembras no fueron diferentes entre los grupos tratado con EB300 y de control independientemente de sus edades. De manera
interesante, los machos en los que se implantó una cápsula de EB300 tenían una concentración de E2 significativamente mayor en comparación con el grupo de control de machos (figura 18), lo que puede deberse a un aumento de la actividad aromatasa en la gónada masculina. Por otro lado, se esperaban los bajos niveles de testosterona en machos y los bajos niveles de E2 en las hembras adultas de animales tratados con EB debido al defectuoso desarrollo de los testículos y desarrollo de los ovarios, respectivamente (figuras 7-14). El desarrollo defectuoso de las vesículas seminales y las próstatas y el bajo comportamiento de apareamiento en los animales tratados con EB puede deberse a estos bajos niveles de testosterona, ya que su desarrollo depende de la testosterona.
Los animales con implante de EB300 no presentan patología
El peso corporal se mide a menudo como una aproximación del estado de salud. Los animales tratados con EB300 y de control se pesaron desde el nacimiento hasta los 180 días de edad (figura 19). En machos, el peso corporal de los grupos tratados con EBx11 y EB300 fue menor que el peso corporal en el grupo de control. A los 180 días de edad, el peso corporal del grupo tratado con EB300 fue significativamente menor que el peso corporal en el grupo de control, pero no era significativamente diferente entre los otros grupos experimentales (figura 19A). En hembras, las ratas tratadas con EB aumentaron de peso corporal más rápidamente que las ratas del grupo de control. A los 180 días de edad, todos los grupos tratados con EB tenían un peso corporal significativamente mayor que el grupo de control (figura 19B).
Cuando las ratas alcanzaron las edades de 6-7 meses, se sacrificaron, y se compararon las razones de longitud de órganos/peso corporal o peso de órganos/peso corporal. La longitud del hueso del fémur/peso corporal no difirió entre el grupo de control y el de EB300 en machos (figura 20). Las razones de peso del cerebro/peso corporal y peso de la hipófisis/peso corporal del grupo de EB300 fueron mayores, y la razón de peso del riñón/peso corporal del grupo de EB300 fue menor, que las del grupo de control. El peso del hígado, bazo, y corazón permanecieron sustancialmente igual entre los grupos de control y de EB300 en machos (figura 20). En hembras, el grupo de EB300 mostró una disminución de las razones de peso de órganos/peso corporal en todos los órganos del grupo de EB300 (figura 21). Sin embargo, estas diferencias pueden deberse al impacto sobre el crecimiento del peso corporal; las hembras con EB300 fueron significativamente más pesadas (aproximadamente el 20 %) que los controles (figura 21) . En apoyo, el examen histológico del riñón y el hígado no encontró patologías en ninguno de los grupos (figura 22) . La química sanguínea tampoco reveló patologías en el riñón y el hígado (datos no mostrados). La tinción de Carnoy en glándulas mamarias de montaje completo reveló una ramificación normal de las glándulas mamarias en los grupos de EB300. Sin embargo, era evidente un encogimiento/subdesarrollo de las yemas de extremos terminales en el grupo de EB300. Se cree que una baja formación de yemas está provocada por los bajos niveles de E2 en el grupo de EB300 (figura 23).
Para investigar el efecto de la inyección de EB sobre la hematopoyesis, se contaron las células sanguíneas, los glóbulos rojos (RBC), la hemoglobina, las plaquetas, y la cantidad de hemoglobina por glóbulo rojo (MCH), la concentración de hemoglobina corpuscular media (MCHC) y los glóbulos blancos (WBC) (tabla 3). Tanto en machos como en hembras, los recuentos de RBC, plaquetas y w Bc no fueron diferentes de los de los controles, ni hubo diferencias en las concentraciones de hemoglobina, MCH y MCHC. Tomados conjuntamente, los datos globales de histología y hematología indican que la hematopoyesis no se ve afectada por el implante de EB.
EB300 tiene una ventana temporal eficaz más amplia.
Sabiendo que el implante de EB300 el PND 1 indujo infertilidad completa e irreversible, se sometió a prueba entonces si podría inducirse infertilidad cuando la cápsula se implantó en un punto de tiempo posterior. Se implantó la EB300 el PND 1, 5, 12 y 21. Sorprendentemente, todas las implantaciones en estos momentos diferentes inhibieron eficazmente el desarrollo de las gónadas en machos tal como se determinó por los tamaños de los testículos y la histología testicular acompañados por inmunohistoquímica usando anticuerpos para Cyp17 (marcador de células de Leydig), DDX4, y tinción con TUNEL (figura 24). Las vesículas seminales y las próstatas eran también notablemente más pequeñas (figura 25). En hembras, los ovarios eran más pequeños y no se encontró el cuerpo lúteo, lo que indica la ausencia de ovulación (figura 26). Tomado conjuntamente, EB300 tiene una amplia ventana temporal de eficacia en la inducción de esterilidad tanto en machos como en hembras.
EB100 y EB30 son también eficaces en la inducción de esterilidad.
Los datos presentados a continuación demuestran que EB30 (30 |ig de EB) fue eficaz en la esterilización de animales macho y hembra (rata; con implante de EB el PND1 o 2).
EB es eficaz en la inducción de esterilidad en hámsteres.
Se determinó el impacto de un implante de EB125 sobre el desarrollo de las gónadas en hámsteres. A hámsteres de veintiún días de edad se les implantó o bien una cápsula vacía (control) o bien 125 microgramos de EB contenidos en una cápsula silástica. Se recogieron los tejidos reproductivos de los sujetos en PND30. Los testículos de los hámsteres en los que se implantó EB125 eran sustancialmente más pequeños que los de los animales de control. La descripción anterior incluye referencias a los dibujos adjuntos, que forman una parte de la descripción detallada. Los dibujos muestran, a modo de ilustración, realizaciones específicas en las que puede ponerse en práctica la invención. Estas realizaciones también se denominan en el presente documento “ejemplos”. Tales ejemplos pueden incluir elementos además de los mostrados o descritos. Sin embargo, los presentes inventores también contemplan ejemplos en los que solo se proporcionan los elementos mostrados o descritos. Además, los presentes inventores también contemplan ejemplos que usan cualquier combinación o permutación de esos elementos mostrados o descritos (o uno o más aspectos de los mismos), o bien con respecto a un ejemplo particular (o uno o más aspectos de los mismos) o con respecto a otros ejemplos (o uno o más aspectos de los mismos) mostrados o descritos en el presente documento.
La descripción anterior pretende ser ilustrativa y no restrictiva. Por ejemplo, los ejemplos descritos anteriormente (o uno o más aspectos de los mismos) pueden usarse en combinación entre sí. Pueden usarse otras realizaciones, tal como “por un experto habitual en la técnica” tras la revisión de la descripción anterior. El resumen se proporciona para permitir que el lector determine rápidamente la naturaleza de la divulgación técnica. Se presenta con el entendimiento de que no se usará para interpretar o limitar el alcance o el significado de las reivindicaciones. Además, en la descripción detallada anterior, pueden agruparse diversas características entre sí para simplificar la divulgación. Esto no debe interpretarse como una intención de que una característica dada a conocer no reivindicada sea esencial para cualquier reivindicación. Más bien, la materia de la invención puede basarse en menos de todas las características de una realización dada a conocer particular. Por tanto, las siguientes reivindicaciones se incorporan por el presente documento en la descripción detallada como ejemplos o realizaciones, siendo cada reivindicación por sí sola una realización separada, y se contempla que tales realizaciones puedan combinarse entre sí en diversas combinaciones o permutaciones. El alcance de la invención debe determinarse con referencia a las reivindicaciones adjuntas.
Claims (6)
1. Método para inducir esterilidad permanente en un animal no humano que comprende administrar a dicho animal en el plazo de semanas después del nacimiento y antes de la pubertad una cantidad eficaz de estradiol, benzoato de estradiol, dipropionato de estradiol, valerato de estradiol, cipionato de estradiol o una combinación de los mismos para hacer que el animal sea estéril,
formulándose el estradiol, benzoato de estradiol, dipropionato de estradiol, valerato de estradiol, cipionato de estradiol o una combinación de los mismos en una formulación de liberación prolongada que libera el estradiol, benzoato de estradiol, dipropionato de estradiol, valerato de estradiol, cipionato de estradiol o una combinación de los mismos a lo largo de 15 a 20 días.
2. Método según la reivindicación 1, en el que el estradiol, benzoato de estradiol, dipropionato de estradiol, valerato de estradiol, cipionato de estradiol, o una combinación de los mismos se administra en una composición que comprende un portador.
3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la administración es una administración de una sola dosis, una vez.
4. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que el estradiol, benzoato de estradiol, dipropionato de estradiol, valerato de estradiol, cipionato de estradiol, o una combinación de los mismos se administra por vía intraperitoneal, por vía intramuscular o por vía subcutánea.
5. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que el animal es un animal de compañía.
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el animal es una animal de ganadería.
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