ES2952389T3 - Composición y método de regeneración o reemplazo de células ciliadas sensoriales del oído interno - Google Patents

Composición y método de regeneración o reemplazo de células ciliadas sensoriales del oído interno Download PDF

Info

Publication number
ES2952389T3
ES2952389T3 ES11790406T ES11790406T ES2952389T3 ES 2952389 T3 ES2952389 T3 ES 2952389T3 ES 11790406 T ES11790406 T ES 11790406T ES 11790406 T ES11790406 T ES 11790406T ES 2952389 T3 ES2952389 T3 ES 2952389T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
composition
sirna
seq
sirna molecule
inner ear
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES11790406T
Other languages
English (en)
Inventor
Richard Kopke
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hough Ear Institute
Original Assignee
Hough Ear Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hough Ear Institute filed Critical Hough Ear Institute
Application granted granted Critical
Publication of ES2952389T3 publication Critical patent/ES2952389T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0046—Ear
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5115—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5146—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyamines, polyanhydrides
    • A61K9/5153—Polyesters, e.g. poly(lactide-co-glycolide)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/5005—Wall or coating material
    • A61K9/5021—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/5031—Organic macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, poly(lactide-co-glycolide)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Se proporciona una composición y un método para la sustitución y regeneración de células ciliadas del oído interno. La composición comprende un agente activo en una cantidad eficaz para disminuir la expresión del gen Hesl en un tejido del oído interno. El agente activo pueden ser moléculas cortas de ARN de interferencia (ARNip) encapsuladas en una nanopartícula biodegradable. El método implica administrar una solución al oído interno donde la solución contiene un agente activo en una cantidad eficaz para disminuir la expresión del gen Hesl. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Composición y método de regeneración o reemplazo de células ciliadas sensoriales del oído interno
Antecedentes
La sordera y los trastornos del equilibrio son discapacidades humanas comunes. En la mayoría de los casos, estas discapacidades se deben a la pérdida de células ciliadas sensoriales en el (1) órgano de Corti (OC) de la cóclea, (2) el epitelio vestibular de las crestas o (3) el sáculo o utrículo del órgano vestibular. Actualmente, no existe un tratamiento aprobado por la FDA que pueda curar estos trastornos mediante el restablecimiento de las células ciliadas sensoriales en estos tejidos.
Los enfoques actuales del problema implican la rehabilitación vestibular para permitir la adaptación a la lesión de los órganos vestibulares. La rehabilitación requiere mucho tiempo y no restablece la función perdida. Para la sordera neurosensorial, la rehabilitación se puede lograr con audífonos o implantes cocleares. Sin embargo, estos dispositivos son caros, requieren una cirugía extensa y producen una calidad del sonido por debajo de lo normal y solo un retorno parcial de la función.
Otro enfoque en el tratamiento de trastornos auditivos es la administración de péptidos u otras moléculas pequeñas. A menudo, los resultados del tratamiento están limitados con el uso de los mismos debido a las concentraciones cocleares relativamente altas que se deben lograr (micromolar o milimolar). Asimismo, los inhibidores proteínicos o peptídicos son difíciles de administrar sistémicamente para tratar el oído debido a la barrera hematolaberíntica y al aclaramiento de proteínas en el torrente circulatorio, así como a la potencial antigenicidad. También existen dificultades en cuanto al suministro de las concentraciones adecuadas de péptido y proteína directamente a la cóclea, particularmente mediante suministro tópico debido al tamaño de la molécula.
Una posible alternativa a estos enfoques tradicionales es el uso de la genoterapia dirigida para inducir la regeneración y el reemplazo de las células ciliadas del oído interno. Por ejemplo, se ha logrado la regeneración o el reemplazo de células ciliadas en roedores mediante el uso de un vector vírico para introducir el gen Atoh1 en el epitelio sensorial del oído interno. Sin embargo, este enfoque conlleva el riesgo inherente a la terapia con vectores víricos, entre los que se incluyen la inducción de la infección, una respuesta inmunitaria inflamatoria, mutación genética, desarrollo de neoplasias y otros. Se ha demostrado que el silenciamiento del ARN de kip 1 p27 induce la regeneración de las células ciliadas, pero de forma ectópica sin retorno de la función. La modulación del gen del retinoblastoma también puede producir células ciliadas adicionales, pero puede existir un peligro inherente a la manipulación de un oncogén o un gen cancerígeno. Por tanto, las genoterapias actuales dirigidas a la regeneración o el reemplazo de las células ciliadas del oído interno no han logrado identificar una diana molecular segura y eficaz ni un método de suministro.
Un posible enfoque de genoterapia es mediante el uso de ARN de interferencia pequeño (ARNip). Una vez introducido en una célula, las moléculas de ARNip forman complejos con las secuencias complementarias del ARN mensajero (ARNm) expresado por un gen diana. La formación de este complejo de ARNip y ARNm produce la degradación del ARNm a través de un proceso intracelular natural conocido como interferencia por el ARN (iARN). La iARN es una herramienta bien establecida para identificar la función de un gen en un proceso celular particular y para identificar posibles dianas terapéuticas en modelos de enfermedades. Aunque la iARN se ha utilizado tradicionalmente en el cultivo celular y en aplicaciones in vitro, ahora se están explorando agentes terapéuticos basados en genoterapias mediante este proceso.
Como se ha analizado anteriormente, se han explorado varias dianas génicas con respecto a la regeneración de las células ciliadas del oído interno sin mucho éxito. Se ha identificado que los genes básicos de hélice-bucle-hélice (bHLH, basic Helix-Loop-Helix) Hes1 y Hes5 desempeñan un papel en el desarrollo de las células ciliadas sensoriales de la cóclea y las estructuras vestibulares del oído. Adicionalmente, una posible diana génica para prevenir la pérdida de células ciliadas es la proteína cinasa 1 activada por mitógeno (MAPK1, Mitogen-Activated Protein Kinase 1), que desempeña un papel en la muerte celular programada o apoptosis. Sin embargo, aún no se ha demostrado ni identificado como un enfoque viable el potencial de que sean dianas terapéuticas eficaces para la regeneración o protección de las células ciliadas sensoriales del oído interno.
El documento WO 2009/147684 A2 describe una composición ótica que comprende, entre otros, una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un compuesto oligonucleotídico que inhibe la expresión de un gen diana humano asociado con un trastorno del oído en el oído interno y/o en el oído medio. El oligonucleótido es un ARNip y el gen diana incluye, entre otros, HES1.
Sumario
Para abordar las deficiencias en las opciones de tratamiento actuales para la audición y otros trastornos relacionados con el oído interno, las composiciones y los métodos descritos en el presente documento proporcionan un medio seguro y eficaz para promover el reemplazo, la regeneración o la protección de las células ciliadas sensoriales del oído interno.
La presente invención se refiere a una composición para usar en el tratamiento de reemplazo, regeneración o protección de las células ciliadas del oído interno, en donde dicha composición comprende un agente activo que comprende una molécula de ARNip que disminuye la expresión de un gen Hes 1 en un tejido del oído interno, en donde el agente activo comprende una o más de:
(i) una molécula de ARNip que comprende la SEQ ID NO: 3;
(ii) una molécula de ARNip que comprende la SEQ ID NO: 4;
(iii) una molécula de ARNip que comprende la SEQ ID NO: 5;
(iv) una molécula de ARNip que comprende la SEQ ID NO: 6;
(v) una molécula de ARNip que comprende la SEQ ID NO: 7; y
(vi) una molécula de ARNip que comprende la SEQ ID NO: 8.
El alcance de la invención se define por medio de las reivindicaciones. Cualquier materia objeto que esté fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona únicamente con fines informativos.
Las referencias a métodos de tratamiento médico en la descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas, combinaciones, medicamentos, etc. descritos en el presente documento para usar en esos métodos.
En un punto, se describe una composición para regenerar las células ciliadas del oído interno. La composición comprende un agente para disminuir la expresión del gen diana encapsulado o incorporado en una nanopartícula. El agente se encuentra en una cantidad eficaz para disminuir la expresión de genes diana seleccionados del grupo que consiste en Hes1, Hes5 y MAPK1. La nanopartícula preferida comprende un polímero biocompatible y biodegradable, y es más preferentemente poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA). En un aspecto, el agente comprende una o más moléculas de ARNip suficientes para disminuir los niveles de ARNm de Hes1, Hes5 o MAPK1.
En otro punto, la nanopartícula comprende además nanopartículas de óxido de hierro superparamagnético (SPION, Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles) recubiertas con ácido oleico para hacer que la nanopartícula sea susceptible de ser movida o transportada por gradientes magnéticos aplicados a una ubicación deseada del oído interno. Por otra parte, las nanopartículas que comprenden SPION se pueden usar para confirmar la ubicación adecuada de la nanopartícula en el tejido diana mediante, por ejemplo, la formación de imágenes mediante resonancia magnética (IRM).
En un punto distinto, se describe un método para regenerar células ciliadas sensoriales del oído interno. El método comprende las etapas de: a) aplicar una solución directamente en el oído interno, en donde dicha solución comprende una suspensión de nanopartículas, en donde las nanopartículas tienen incorporado un agente para disminuir la expresión de los genes seleccionados del grupo que consiste en Hes 1, Hes5 y MAPK1.
En otro punto, la solución se aplica en el oído medio. En este punto, las nanopartículas comprenden SPION y una o más moléculas de ARNip en una cantidad eficaz para disminuir la expresión de Hes1, Hes5 o MAPK1 y el método comprende además la etapa de aplicar una fuerza magnética para mejorar el transporte de las nanopartículas magnéticas a través de la membrana de la ventana redonda y hacia el oído interno.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 proporciona imágenes de microscopía electrónica de transmisión de máculas utriculares de cobaya explantadas de los siguientes grupos de tratamiento: (1) control (ARNip de control aleatorio): imágenes A, E; (2) neomicina: imágenes B, F; y (3) neomicina ARNip de Hes1: imágenes C, D, G, H.
La FIG. 2 es un gráfico de barras que representa la media ± ETM de ADNp (μg) aislado de la cóclea de cobayas a las que se administró una solución que contenía nanopartículas de PLGA portadoras de una carga útil de ADNp y SPION en presencia y ausencia de una fuerza magnética externa.
La FIG. 3 es un gráfico de barras que representa la media ± ETM del número de células ciliadas inmaduras (células ciliadas nuevas) presentes en utrículos de cobayas explantados después de lesión inducida por toxina (Neo o 4-HNE) en presencia y ausencia de ARNip de Hes 1 transfectado.
La FIG. 4 proporciona imágenes de IRM de 7 teslas de la cóclea de cobayas de los siguientes grupos de tratamiento: (1) control: imagen A; (2) solución que contiene nanopartículas de PLGa portadoras de una carga útil de SPION administrada a la membrana de la ventana redonda: imagen B; y (3) solución que contiene nanopartículas de PLGA portadoras de una carga útil de SPION administrada a la membrana de la ventana redonda en presencia de un campo magnético externo.
La FIG. 5 proporciona imágenes de IRM de 7 teslas de la cóclea de cobayas de los siguientes grupos de tratamiento: (1) control: imagen A; (2) solución que contiene nanopartículas de PLGa portadoras de una carga útil de SPION administrada a la membrana de la ventana redonda: imagen B; y (3) solución que contiene nanopartículas de PLGA portadoras de una carga útil de SPION administrada a la membrana de la ventana redonda en presencia de un campo magnético externo.
La FIG. 6 es un gráfico de barras que representa los niveles de ARNm de Hes1 como porcentaje del control de la cóclea de ratones P3 CD-1 transfectada con ARNip de control aleatorio (control) o ARNip de Hes1.
La FIG. 7 es un gráfico de barras que representa la media ± ETM del número de células ciliadas presentes en el órgano de Corti de ratones P3 CD-1 cultivado después de la lesión inducida por toxina (4-HNE) en presencia y ausencia de ARNip de Hes1 transfectado.
La FIG. 8 es un gráfico de barras que representa la media ± ETM del número de células ciliadas presentes en el órgano de Corti de ratones P3 CD-1 cultivado después de una lesión inducida por toxina (4-HNE) en presencia de concentraciones variables de nanopartículas de PLGA portadoras de una carga útil de ARNip de Hes1.
La FIG. 9 es un gráfico de barras que representa la media ± ETM del número de células ciliadas presentes en sáculos de ratones P3 CD-1 cultivados después de una lesión inducida por toxina (neomicina) en presencia de concentraciones variables de (1) nanopartículas de PLGA portadoras de una carga útil de ARNip de m A p K1 o (2) ARNip de MAPK1 transfectado.
Descripción detallada
Como se usa en el presente documento, "oído interno" incluye, pero sin limitación, las siguientes estructuras: laberinto auditivo; laberinto vestibular, que incluye el ganglio vestibular, los conductos cocleares y el saco endolinfático; tejidos cocleares, que incluyen el órgano de Corti, el ganglio espiral y el ligamento espiral; tejidos del conducto endolinfático; tejidos de la estría vascular; tejidos del utrículo que incluyen máculas urticulares y manchas saculares; y tejido epitelial de la cresta ampular.
Como se usan en el presente documento, los términos "un/o" y "una" significan "uno/a o más".
Como se usa en el presente documento, la expresión "agente activo" significa un agente terapéutico, que incluye, pero sin limitación, agentes quimioterápicos, agentes radioterápicos, agentes genoterápicos tales como moléculas de ARNip u otros ácidos nucleicos, un agente para interactuar con una proteína intracelular o de superficie, una cadena proteínica o peptídica, un péptido u hormona esteroidea, un ligando soluble o insoluble, o un hidrato de carbono.
Como se usa en el presente documento, el término "gen" significa una unidad de ADN que codifica un producto génico tal como un ARNm, una proteína funcional, un polipéptido o un péptido. Por tanto, la expresión "expresión génica" significa la producción de un producto génico. Por ejemplo, el ARNip modifica la expresión génica al disminuir la cantidad de ARNm disponible para la producción de una proteína.
Como se usa en el presente documento, la expresión "grupo de moléculas de ARNip" significa dos o más moléculas de ARNip diferentes (dirigidas a diferentes subsecuencias en el ARNm diana) combinadas entre sí en una carga útil o muestra común. Asimismo, se ha de entender que un conjunto consistirá en múltiples copias de cada una de las diferentes moléculas de ARNip (es decir, 100 copias de la molécula de ARNip 1 y 100 copias de la molécula de ARNip 2 constituyen un conjunto de moléculas de ARNip).
Los elementos de la presente divulgación se dirigen a composiciones y métodos de reemplazo, regeneración o protección de las células ciliadas del oído interno. En un punto preferido, una composición para la regeneración de células ciliadas comprende una nanopartícula biodegradable que contiene una cantidad suficiente de ARNip para disminuir los niveles de ARNm asociados con el gen Hes1, Hes5 o MAPK1. Se ha demostrado que Hes1 y Hes5 desempeñan un papel crucial en la regulación de la proliferación y diferenciación de las células ciliadas sensoriales, como lo demuestra Zine et al., J Neurosci. 1 de julio;21(13):4712-20 (2001). Sin embargo, el potencial de Hes1 y/o Hes5 como diana terapéutica para la regeneración de las células ciliadas sensoriales no está claro según los estudios algo contradictorios realizados por Batts et al., Hear Res 249(1-2): 15-22 (2009) y Hartman et al., JARO 10: 321-340 (2009).
En un punto relacionado, se describe una composición para la protección de las células ciliadas. La composición comprende una nanopartícula biodegradable que contiene moléculas de ARNip dirigidas a varios genes que participan en la muerte celular o apoptosis. Se activa una variedad de vías de muerte celular después de una lesión en la cóclea, así como en los órganos de equilibrio del oído interno, que incluyen procesos de envejecimiento coclear y presbicia. La inhibición de estos procesos de muerte celular puede prevenir un grado de lesión, aumentando así la eficacia de las estrategias de tratamiento regenerativo descritas. En otras palabras, las estrategias de tratamiento que pueden detener o prevenir la activación en curso o futura de estos procesos de muerte celular mejorarán los tratamientos regenerativos o servirán como un tratamiento útil cuando se apliquen antes o al mismo tiempo que las estrategias regenerativas.
Algunos ejemplos de genes de muerte celular a los que podría dirigirse el uso de los puntos de la divulgación actual incluyen: proteínas y vías de muerte celular mediadas por caspasa; la familia de proteínas del factor de necrosis tumoral (TNF, Tumor Necrosis Factor); la vía de señalización de JNK (cascada de señales de muerte celular de la proteína cinasa 1 activada por mitógenos (MAPK1) y cinasa c-Jun-N-terminal (JNK, c-Jun-N-terminal Kinase)); mediadores proteínicos y peptídicos de la muerte celular programada similar a la necrosis; proteínas asociadas con la vía poli(ADP-ribosa)polimerasa-1 (PARP-1) necesaria para la liberación del factor inductor de apoptosis (AIF, Apoptosis-Inducing Factor) de las mitocondrias en la apoptosis independiente de la caspasa; factores tróficos tales como GDNF, FGF, BDNF; proteínas que detienen los procesos de muerte celular causados por una lesión en el oído interno, tales como el péptido inhibidor de la muerte celular AM-111; y proteínas y péptidos asociados con el programa de apoptosis mitocondrial dependiente de Bak. Otras posibles dianas incluyen Bax, Bcl-xl, Bcl-2 y TNFR1, calpaína I y calpaína II, y catepsina D activa. Usando los puntos divulgados en el presente documento, se pueden inhibir múltiples vías de muerte celular mediante el uso de múltiples ARNip en una sola carga útil de nanopartículas o, como alternativa, utilizando dos o más nanopartículas, cada una de las cuales tiene una carga útil diferente de ARNip. Asimismo, las cargas útiles de nanopartículas de la presente divulgación pueden incluir ARNip dirigidos a genes que participan en las vías de muerte celular junto con ARNip dirigidos a Hes1 o Hes5.
En un aspecto preferido de este punto, se carga una nanopartícula biodegradable con suficiente ARNip para disminuir la expresión de MAPK1. La lesión coclear puede provocar la muerte celular programada (apoptosis). La lesión puede deberse a un traumatismo mecánico, traumatismo por explosión, traumatismo acústico, infección, inflamación, toxinas, agentes quimioterápicos tales como cisplatino, determinados antibióticos tales como los incluidos en la familia de los aminoglucósidos, y el proceso de envejecimiento. La vía de señalización de JNK y MAPK participa en la muerte celular programada en la mayoría de estos procesos patológicos. Por lo tanto, la inhibición de los procesos de muerte celular asociados con la activación de JNK y MAPK constituyen un posible armamento terapéutico.
En un punto preferido, el agente activo utilizado para disminuir la expresión del gen diana es ARNip. Las moléculas de ARNip dirigidas a ARNm de Hes1, Hes5 y MAPK1, por ejemplo, se pueden obtener de cualquier número de fuentes, incluida Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). En general, las moléculas de ARNip descritas en el presente documento son moléculas de ARN de doble hebra de 19-25 nucleótidos de longitud con un saliente de dos nucleótidos en el extremo 3' de cada cadena. Cabe señalar que estas moléculas de ARNip se pueden producir endógenamente en una célula a través de la transfección de varios ADN de plásmido que codifican un precursor (ARN de horquilla corta) para las moléculas de ARNip deseadas o mediante otros diferentes métodos conocidos por un experto en la materia. Las moléculas de ARNip preferidas dirigidas a Hes1, Hes5 y MAPK1 se describen con más detalle en los ejemplos proporcionados a continuación.
En un punto preferido, las moléculas de ARNip se incorporan a una nanopartícula (10-300 nm según las mediciones de ETM) de un polímero biocompatible y biodegradable tal como PLGA mediante el método descrito por Woodrow et al. Nature Materials. 8(6):526-33 (2009). El método descrito por Woodrow et al. permite la carga de varios cientos a 1000 moléculas de ARNip por nanopartícula (varios microgramos por miligramo de polímero), lo que se ha demostrado que silencia eficazmente la expresión del gen diana in vivo. Sin embargo, la divulgación no debe limitarse a PLGA y podría utilizarse cualquier polímero biocompatible y biodegradable conocido por un experto en la materia siempre que pueda encapsular y suministrar suficientemente el agente regulador de la expresión génica al tejido diana sin rechazo. En un punto, las nanopartículas se cargan con grupos de dos o más moléculas de ARNip, cada una dirigida específicamente a una subsecuencia de nucleótidos diferente de la molécula de ARNm diana.
Resumiendo, el método descrito en Woodrow et al. implica una técnica de evaporación de disolvente de doble emulsión. Las moléculas de ARNip se estabilizan mediante poliaminas naturales tales como la espermidina (Spe). La formación del complejo entre ARNip y Spe se lleva a cabo a temperatura ambiente durante 15 minutos en un agitador rotatorio. El ARNip (25-200 nmoles) se combina con Spe en una proporción molar del nitrógeno de Spe con respecto al polinucleótido fosfato (proporción de N/P) de 3:1, 8:1 y 15:1. Se emulsionan doscientos microlitros de solución estabilizada de ARNip (carga útil terapéutica) en tampón Tris-EDTA en 2 ml de solución de PLGA (100 mg) y cloroformo durante 60 segundos en hielo utilizando un homogeneizador ultrasónico de sonda para formar una emulsión primaria de agua en aceite. Esta emulsión primaria se vuelve a emulsionar mediante la adición de 6 ml de alcohol polivinílico (PVA) al 2 %. El sistema se homogeneiza con ultrasonidos nuevamente durante 5 minutos y se agita durante aproximadamente 3 a 6 horas para permitir que se evapore el cloroformo. La solución de nanopartículas resultante se centrifuga a 15.000 rpm durante 30 minutos a 4 °C. Las partículas se lavan con agua nanopura para eliminar cualquier exceso de PVA. El sedimento de nanopartículas resultante se dispersa en un volumen deseado de agua nanopura y se liofiliza durante 48 horas y se almacena a -20 °C hasta su uso. La concentración de PVA utilizada para formar la emulsión, así como la amplitud y la duración de la homogeneización con ultrasonidos se pueden optimizar para formular partículas que tengan el tamaño y la carga deseados de las moléculas de ARNip. En una estrategia alternativa, la carga útil de ARNip en la nanopartícula se puede formular como un espiegelmer según lo descrito por Vater y Klussmann, Curr Opin Drug Discov Devel 6(2):253-61 (2003). Esta formulación retrasa la degradación intracelular del ARN.
En otro punto, la nanopartícula comprende además una partícula sensible magnéticamente tal como SPION. En este punto, la partícula magnética permite el movimiento o transporte controlado de la nanopartícula mediante la aplicación de un gradiente magnético en una ubicación deseada del oído interno. Por otra parte, la adición de SPION a la composición de nanopartículas hace que las partículas sean visibles en una resonancia magnética, lo que permite confirmar la ubicación de las nanopartículas en el tejido apropiado. Estas características y ventajas se describen con más detalle en Wassel et al., Colloids and Surfaces A: Physiochem Eng. Aspects 292: 125-130 (2007).
SPION se puede incorporar a un complejo de nanopartículas de PLGA mediante el método descrito anteriormente de Woodrow et al. Específicamente, las SPION, en un intervalo de aproximadamente 5-10 mg/ml, se pueden dispersar en la solución de PLGA y cloroformo junto con las moléculas de ARNip como se ha descrito anteriormente. Se ha de entender que la SPION es la partícula sensible magnéticamente preferida, sin embargo, se ha de entender que la presente divulgación no se limita a la misma y podrían usarse otras partículas magnéticas que hagan que la nanopartícula responda magnéticamente y permitan su visualización mediante MRI. La SPION se puede incorporar a cualquiera de los complejos de nanopartículas y ARNip descritos en el presente documento.
En otro punto, se añade un agente a la nanopartícula que inducirá la proliferación de las células de sostén del oído interno. La regeneración de células ciliadas a través del silenciamiento de Hes1 produce la transformación de las células de sostén del órgano de Corti en células ciliadas sensoriales. Por consiguiente, esta transformación puede disminuir la cantidad de células de sostén, lo que podría producir una pérdida de integridad y funcionalidad en el órgano de Corti. Como tal, el presente punto incluye tratar primero las células del oído interno con una molécula que inducirá la proliferación de las células de sostén. Por tanto, además del ARNip, el complejo de nanopartículas, con o sin SPION, como alternativa, puede incluir moléculas a una dosis terapéuticamente eficaz que contribuiría al efecto regenerativo aumentando la proliferación de las células de sostén. Por ejemplo, esta proliferación podría inducirse al mejorar la actividad de Skp2, disminuir la actividad de p27Kip1 o regular a la baja otros inhibidores de la progresión y proliferación del ciclo celular que aún no se han descubierto.
En otro aspecto de este punto, se podría utilizar trombina para inducir la proliferación de las células de sostén. La trombina regula al alza Skp2, las ciclinas D y A, y MiR-222, lo que disminuye eficazmente la actividad de p27Kip1. Por lo tanto, en un punto, la trombina, ya sea como una proteína administrada por separado o como una carga útil terapéutica que se combina con la carga útil de ARNip en una nanopartícula. La trombina se administra preferentemente 24-48 horas antes de la administración del ARNip. En el caso de que las moléculas de trombina y ARNip se combinen como una carga útil doble en una sola nanopartícula, la trombina y el ARNip se incorporan preferentemente de tal manera que provoquen la liberación de la trombina 24-48 horas antes que la del ARNip. La trombina se incluiría en el complejo de nanopartículas en aproximadamente un 1-2 % p/p.
Otra molécula que puede beneficiarse del efecto regenerador de silenciar el gen Hes1 es el micro ARN MiR-222. El MiR-222 induce la proliferación de las células de sostén mediante la regulación a la baja de p27Kip1. Por tanto, un elemento alternativo incluye la adición de una cantidad terapéuticamente eficaz de MiR-222 en el complejo de nanopartículas. Para obtener el beneficio completo de MiR-222, se libera de la partícula antes de la liberación del ARNip.
En otro punto más, el complejo de nanopartículas comprende además una decoración peptídica superficial para el receptor de virus de Coxsackie y adenovirus u otro péptido que mejore la transfección.
En otro aspecto de la presente divulgación, se describe un método para regenerar células ciliadas sensoriales del oído interno. El método comprende la etapa de aplicar una solución en el oído interno, en donde dicha solución comprende un agente activo suficiente para disminuir la expresión de genes diana seleccionados del grupo que consiste en Hes1, Hes5 y MAPK1. En un punto preferido, el agente activo comprende moléculas de ARNip encapsuladas en una nanopartícula. De hecho, en este método, se puede utilizar cualquiera de los complejos de nanopartículas y ARNip descritos en el presente documento.
La solución puede ser cualquier solución estéril compatible con el oído interno. Lo ideales que la solución sea isotónica con la perilinfa del laberinto. En un punto preferido, la solución es perilinfa artificial que, como se describe en Chen et al., J Control Release, 110(1): 1-19 (2006). Resumiendo, la perilinfa artificial, por ejemplo, consiste en: NaCl (120 mM); KCl (3,5 mM); CaCl2 (1,5 mM); glucosa (5,5 mM); y HEPES (20 mM). El pH de la perilinfa artificial se puede ajustar con NaOH a 7,5. Otras posibilidades incluirían dextrosa al 5 % en agua esterilizada, solución salina fisiológica estéril o solución salina fisiológica tamponada con fosfato.
Los volúmenes de infusión están preferentemente en el intervalo de 1-100 μl infundidos lentamente durante un período de 10 a 100 minutos. Por otra parte, la infusión podría extenderse mediante un aparato de microinfusión en el intervalo de 1-20 μl por hora durante días o semanas si fuera necesario. Si es necesario, se pueden repetir varias infusiones.
En un punto preferido, la solución comprende nanopartículas portadoras de una carga útil de ARNip suspendida en las mismas. La suspensión de nanopartículas se puede preparar mezclando la cantidad necesaria de nanopartículas en la solución en un intervalo de concentración de 0,5 a 5 mg/ml. Puede homogeneizarse con ultrasonidos durante unos segundos para dispersar las nanopartículas en la solución y almacenarse en un intervalo de 2 a 4 °C para evitar cualquier agregación de nanopartículas.
La solución se puede aplicar al oído interno mediante varios métodos diferentes. En un punto, la solución se puede administrar mediante inyección directa a través de la membrana de ventana redonda (MVR) o por infusión a través de una cánula temporal o permanente colocada a través de la MVR. La infusión o inyección puede ser asistida a través de la conexión de una bomba de microinfusión, un aparato de diálisis o un sistema de intercambio de fluidos. También se podría aplicar una tecnología de inyección o infusión similar a la ventana ovalada y/o al ligamento o anillo de la ventana ovalada. Las inyecciones o infusiones podrían realizarse además a través de una cocleostomía u otra abertura en el laberinto óseo tal como uno de los canales semicirculares. Como alternativa, se podría retirar el hueso cortical sobre el laberinto y aplicar un gel que contenga partículas sobre el hueso decorticado para su administración intraósea. Las partículas también podrían suministrarse sistémicamente mediante la administración intravenosa o intraarterial.
En otro punto, la administración de las nanopartículas implica el uso de un microcatéter, tal como el catéter intraoído de ventana redonda (RW McCath™). En este método, dicho catéter se introduce (tal como a través de una timpanotomía directa o endoscópicamente) en el oído medio desde el canal auditivo y la punta distal del catéter se coloca inmediatamente adyacente a la membrana de la ventana redonda. A continuación, se pasa la solución de nanopartículas por el interior del catéter y se asocia íntimamente con la membrana de ventana redonda, lo que facilita la difusión de la solución de nanopartículas en el oído interno. Estos microcatéteres permiten la administración continua y controlada de fármacos a la membrana de la ventana redonda del oído medio y pueden permanecer colocados hasta veintinueve días (según el protocolo de uso de los microcatéteres).
En otro punto, la solución de nanopartículas se puede aplicar en el oído medio, en donde el método comprende además la etapa de aplicar una fuerza magnética para mejorar el transporte de las partículas a través de la membrana de la ventana redonda y hacia el oído interno. En este punto, la nanopartícula cargada con ARNip comprende además SPION u otras partículas sensibles magnéticamente. El uso de fuerza magnética para dirigir nanopartículas hacia el oído interno se ha descrito en la patente de Estados Unidos n.° 7.723.311 y las publicaciones de solicitud de patente de Estados Unidos n.° US 2004/0133099 y US 2005/0271732. Preferentemente, la solución que contiene las nanopartículas se administraría en el oído medio en la superficie de la membrana de ventana redonda (MVR), en donde se aplica una fuerza magnética para impulsar las nanopartículas a través de la MVR y hacia la región del oído interno. Como alternativa, el suministro mejorado mediante la fuerza magnética se puede aplicar en el nicho de la ventana ovalada (VO) y al ligamento anular.
Más específicamente, el suministro en el oído medio de nanopartículas sensibles magnéticamente se ve facilitado por, por ejemplo, una inyección transtimpánica de la solución de nanopartículas en el oído medio (tal como a través de la membrana timpánica mediante un enfoque de timpanotomía). Con este fin, se inserta una jeringa de tuberculina de un centímetro cúbico unida a una aguja espinal de calibre 27 en la membrana timpánica para el suministro intratimpánico de nanopartículas. El suministro del oído medio al oído interno, a través de la membrana de la ventana redonda, es promovido por un campo magnético colocado externamente en el canal auditivo que impulsa las nanopartículas sensibles magnéticamente a través de la membrana de la ventana redonda hacia los fluidos del oído interno.
Como alternativa, se podrían colocar potentes imanes permanentes en la superficie del laberinto óseo dentro del oído medio o la cavidad mastoidea como un método para capturar magnéticamente las partículas y concentrarlas en la circulación del oído interno.
En un punto alternativo, se utiliza la exposición al sonido de alta o baja frecuencia en el oído para mejorar aún más el suministro de partículas o fármacos a través de la MVR o la VO.
En otro punto más del método, la solución de nanopartículas se administra en el momento de la colocación de un implante coclear o cualquier otro dispositivo intracoclear o en otra ocasión de apertura de la cóclea. El tratamiento podría realizarse en el momento de la colocación del dispositivo para aprovechar la cocleostomía necesaria para la inserción del dispositivo. Como alternativa, los agentes terapéuticos de la presente solicitud podrían infundirse a través de un catéter de suministro de fármacos integrado en un dispositivo, como un dispositivo insertado por separado, o como un recubrimiento polimérico de liberación lenta en el dispositivo que se inserta en la cóclea. En este ejemplo, se podría diseñar un electrodo de implante coclear con una cánula de suministro de fármacos incorporada y una microbomba conectada como parte del dispositivo implantado.
En otro punto, la nanopartícula portadora del agente terapéutico adecuado podría inyectarse en el momento de la inserción del implante coclear con una cánula temporal, a través de una cánula incorporada que se inserta a través de la cocleostomía o a través de la membrana de la ventana redonda. Como alternativa, la superficie del electrodo del implante coclear podría recubrirse con un polímero de nanopartículas que contenga el ARNip deseado para la liberación lenta por difusión. El recubrimiento es preferentemente un recubrimiento polimérico para proteger y controlar la liberación del ARNip. Por ejemplo, se puede utilizar PEG, PLGA o una combinación de los mismos de acuerdo con las necesidades de liberación del fármaco. Independientemente, el recubrimiento debe ser biocompatible y ser capaz de sobrevivir a los procedimientos de esterilización y poseer un período de validez prolongado.
Ejemplos
La composición y los métodos divulgados en el presente documento se proponen para el tratamiento de trastornos tanto de la audición como del equilibrio. Los ejemplos proporcionados a continuación proporcionan datos científicos para respaldar el uso de la composición y los métodos divulgados en el reemplazo, la protección y/o la regeneración de las células ciliadas sensoriales del oído interno, y más concretamente de las células ciliadas del epitelio sensorial del laberinto coclear o vestibular. Estas nuevas células ciliadas tienen una orientación anatómica lo suficientemente normal como para ser funcionales a fin de mejorar el equilibrio y el sentido de la audición.
Para todos los siguientes ejemplos que incluyen el uso de moléculas de ARNip dirigidas a ARNm de Hes1 (ARNip de Hes1) y ARNm de Hes5 (ARNip de Hes5), se utilizó un grupo de tres moléculas de ARNip. Para las moléculas de ARNip dirigidas a ARNm de MAPK1 (ARNip de MAPK1) de los ejemplos, se utilizó una sola molécula de ARN. Las secuencias de las moléculas de ARNip utilizadas en los siguientes ejemplos se proporcionan en las Tablas 1, 2 y 3. Las moléculas de ARNip de Hes1 y ARNip de Hes5 se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Las moléculas de ARNip de MAPK1 se sintetizaron utilizando GenScript. El método descrito anteriormente con respecto a la formulación de la nanopartícula de PLGA con ARNip (Woodrow et al.) se usó para todos los ejemplos pertinentes.
TABLA 1: n i r m l l ARNi H 1
Figure imgf000008_0001
TABLA 2: n i r ARNi H
Figure imgf000008_0002
TABLA : n i r ARNi MAPK1
Figure imgf000008_0003
EJEMPLO 1
El objetivo de este estudio era demostrar que la disminución de la expresión de Hes1 produce un mayor número de células ciliadas y haces ciliados después de la muerte celular inducida por neomicina.
Se explantaron máculas utriculares de cobayas de 300 gramos, se cultivaron in vitro durante 1 día, y se expusieron a neomicina durante 48 horas y, a continuación, se trataron con ARNip aleatorio (control) o de Hes1 (20 nmolar), y se cultivaron durante otros 5 días. Los tejidos se evaluaron con microscopía confocal y microscopía electrónica de transmisión (MET).
La figura 1 muestra imágenes de MET tomadas de utrículos del grupo de control de ARN aleatorio (A, E), grupo de tratamiento con neomicina (B, F) y grupo de tratamiento con neomicina más ARNip de Hes1 (C, D, G, H). Las imágenes de la fila inferior son de mayor aumento que las imágenes de la fila superior. Se encuentran dos capas de células en el utrículo del grupo de control normal (A). Las células ciliadas (tipo 1-T1 y tipo 2-T2, capa superior) muestran haces ciliados (flechas en A, E) y placas cuticulares (estrellas en A, E). Las células de sostén (punta de flecha en A) entran en contacto con la membrana basal. Se encuentra una célula ciliada en el utrículo del grupo de tratamiento de neomicina, no se muestra un haz ciliado en el vértice de esta célula (CC en B). Se ha formado una banda continua de microfilamentos en el vértice de las células de esta región (estrellas en B y F). Se observaron pocos haces ciliados (flecha en F). Se encuentran dos capas de células en algunas regiones de las máculas utriculares del grupo de tratamiento de neomicina más ARNip de Hes1 (C). Las células ciliadas de la capa superior tienen haces ciliados (flechas en C y G) y placas cuticulares (estrellas en C y G), mientras que las células de sostén se encuentran en una capa inferior (punta de flecha en C). También se encuentra una capa de células en algunas regiones de las máculas utriculares del grupo de tratamiento de neomicina más ARNip (D y H). Estas células tienen haces de células ciliadas (flechas en H) y placas cuticulares (estrella en H) y, sin embargo, están en contacto directo con la membrana basal (D). Las barras de escala en A-H son de 2 micrómetros.
Los resultados proporcionados en la siguiente FIG. 1 demuestran que la reducción de la expresión de Hes1 tras la muerte de las células ciliadas inducida por neomicina, aumenta el número de células ciliadas y haces ciliados de las máculas utriculares de cobaya explantadas.
EJEMPLO 2
El fin de este estudio era demostrar la capacidad de suministrar nanopartículas de PLGA que contienen ADN plasmídico-luciferasa (ADNp) y SPION a través de la membrana de ventana redonda (MVR) de cobayas in vivo utilizando fuerzas magnéticas externas.
Se colocaron dos microlitros de solución que contenían nanopartículas de PLGA portadoras de carga útil de ADNp y SPION en la MVR de un oído para cada una de las 12 cobayas adultas analizadas, y se expusieron 6 de las 12 cobayas a fuerzas magnéticas externas estimadas en alrededor de 0,4 Tesla. A continuación, se aislaron cuidadosamente los nichos de MVR y la cóclea de los sujetos, se separaron y se expusieron a la degradación de la proteasa K durante 12 horas a 50 °C en SDS al 0,1 %, tampón Tris-EDTA (pH 8,0). A continuación, se extrajo ADNp de estos tejidos mediante desnaturalización con fenol-cloroformo de las proteínas sobrantes y se precipitó con etanol enfriado previamente durante la noche. Se volvió a suspender el ADNp total en 100 μl y se usaron 5 μl en cada reacción de RT-PCR. Las PCR se configuraron utilizando Invitrogen mezcla maestra de PCR Express One-Step SYBR Green en reacciones de 20 μl. Los cebadores se diseñaron mediante el software Genscript (cebador directo de luciferasa 5'-TGGAGAGCAACTGCATAAGG-3' y cebador inverso 5'-CGTTTCATAGCTTCTGCCAA-3'). Al mismo tiempo, se generó una curva patrón ejecutando la misma RT-PCR con plantillas de diluciones en serie de ADNp-luciferasa (0,01 μg~1 ng/ml). Las curvas de fusión y las PCR se ejecutaron en una máquina Eppendorf Realplex y los resultados se analizaron con el software de procesamiento de datos Realplex. La cantidad absoluta de ADNp en cada muestra se calculó en base a la curva patrón. Cada muestra se procesó en triplete y se eliminaron del análisis los valores de umbral de ciclo que diferían en una desviación típica superior a 0,5, antes de promediarse para calcular la cantidad de ADNp.
La figura 2 proporciona un gráfico de barras que compara el control y el transporte asistido magnéticamente. Los resultados se expresan como la media de seis experimentos (seis animales de control sin exposición al imán y 6 animales con exposición al imán) ± ETM (error típico de la media). La comparación estadística se realizó utilizando pares, (A-B) prueba de la t de Student bilateral para datos emparejados.
Los resultados de la Figura 2 demuestran que la aplicación de fuerza magnética externa produjo un aumento significativo de 3,5 veces en el suministro perilinfático/coclear del ADNp (p < 0,05). Adicionalmente, no se encontró ADNp en los oídos de los animales opuestos al oído quirúrgico donde se aplicó el ADNp. Esto confirma el transporte exitoso de una carga útil de ácido nucleico a través de la MVR mediante este método.
EJEMPLO 3
El fin de este estudio era confirmar si el ARNip de Hes1 suministrado en el tejido utricular de cobaya explantado era eficaz para aumentar la producción de nuevas células ciliadas (células ciliadas de aspecto inmaduro) después de una lesión inducida por neomicina o 4-HNE.
Se disecaron utrículos de cobayas pigmentadas de seis semanas de vida y se expusieron a las toxinas neomicina (1 mM) o 4-HNE (200 μM) siguiendo la metodología general descrita por Quint et al., HearRes 118(1-2): 157-67 (1998).
48 horas después, se colocaron los cultivos en un medio exento de toxinas y se transfectaron con ARNip de Hes1 (24 μmoles/20 nM) o ARNbc aleatorios (24 μmoles) (control) mediante el agente de transfección jet SI (PolyplusTransfection Inc., Nueva York, NY) durante 24 horas. A continuación, se cultivaron los tejidos otros tres días en medio nuevo sin ARNip. Se fijaron los utrículos en paraformaldehído al 4 % durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavaron 3 veces con PBS, se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,05 % en PBS durante 30 minutos y luego se lavaron 3 veces en PBS. Se marcaron los explantes con faloidina conjugada con TRITC (3 μg/ml), durante 45 minutos a oscuras a temperatura ambiente. Se observaron células ciliadas (Cc ) marcadas con faloidina mediante un microscopio epifluorescente Olympus BX-51 con un filtro de excitación amarillo ajustado a de 560 a 590 nm. Se contaron las células ciliadas de aspecto inmaduro (CCAI) de 6 a 10 campos de 2500 μm2 por cada explante (n = 3-4 utrículos por condición). Las CCAI tenían haces de estereocilios uniformes muy cortos con o sin un cinocilio prominente. Las CCAI se cuantificaron y expresaron como el valor medio ± ETM (error típico de la media). Se usó ANOVA con una prueba a posteriori de mínima diferencia significativa para comparar las medias entre diferentes condiciones. Se consideró significativo un valor p < 0,05.
La figura 3 proporciona resultados cuantitativos del número de CCAI en explantes expuestos a toxinas tratados con ARNip de Hes1 en comparación con explantes expuestos a toxinas no tratados con ARNip de Hes1 y utrículos explantados tratados con ARNip aleatorio (controles no expuestos a la toxina).
Los datos de la figura 3 demuestran que la aplicación de ARNip de Hes1 aumenta significativamente el número de nuevas células ciliadas (CCAI) en tejido utricular de cobaya adulta explantado que ha sido tratado con neomicina o 4-HNE (p ≤ 0,001). Los datos de control demuestran que, en condiciones normales y después de una lesión por toxina, las células sólo tienen una capacidad natural limitada para producir nuevas células ciliadas. Sin embargo, el silenciamiento de la expresión del gen Hes1 aumenta significativamente la capacidad de las células para producir nuevas células ciliadas.
EJEMPLO 4
El objetivo de este estudio era determinar si es posible visualizar las nanopartículas de PLGNSPION de forma no invasiva mediante IRM de 7 teslas.
Se tomaron IRM de 7 teslas de cobayas (a) no expuestas a una nanopartícula (cóclea de control del oído opuesto al que estuvo expuesto a la nanopartícula), (b) solución administrada en la MVR que contenía nanopartículas de PLGNSPION en ausencia de fuerza magnética y (c) solución administrada en la m Vr que contenía nanopartículas de PLGNSPION en presencia de fuerza magnética. La cóclea se recogió inmediatamente después de una exposición de 45 minutos a nanopartículas de PLGA-SPION y se sometió a IRM de 7 teslas según lo descrito por Towner et al., Molecular Imaging 6(1): 18-29 (2007); Towner et al., Tissue Eng Part A, 7 de agosto (2009) [publicación electrónica previa a la impresión]; Towner et al., Tissue Eng Part A, 10 de enero (2010) [publicación electrónica previa a la impresión] (en lo sucesivo denominadas colectivamente las "referencias de Towner"). Aunque las imágenes de las FIGs . 4 y 5 se tomaron de la cóclea extraída, las referencias de Towner a la luz de los resultados del Ejemplo 4 demuestran adecuadamente la posibilidad de crear imágenes in vivo mediante el complejo de nanopartículas de PLGNSPION. Se registraron los valores del mapa de T1 y T2 y los resultados se representan en las FIGs .4 y 5.
Como se ha demostrado en las FIGS. 4 y 5, hubo una disminución en los valores de T1 y T2 en el giro basal de la cóclea en animales expuestos a las nanopartículas de PLGNSPION. Por otra parte, esta disminución de T1 y T2 se vio favorecida por la presencia de un campo magnético externo. Esto indica la presencia de nanopartículas en la cóclea y proporciona la prueba de que es posible utilizar dicho sistema de detección para confirmar la exposición del tejido a la nanopartícula. Por otra parte, este estudio demuestra que se puede utilizar la aplicación de una fuerza magnética externa para concentrar nanopartículas de PLGNSPION en una determinada región del oído interno.
EJEMPLO 5
El objetivo de este estudio era demostrar que las moléculas de ARNip de Hes1 utilizadas en los presentes estudios son eficaces para disminuir los niveles de ARNm de Hes1.
Se diseccionaron tejidos cocleares de crías de ratón P3 CD-1 y se cultivaron en una placa de 35 mm con gotas de gel de colágeno en el fondo. Después de la incubación inicial durante 24 horas, se transfectaron las cócleas con ARNip de HES1 (20 nM) mediante reactivos de transfección jetSI (Polyplus Inc.). Los tejidos de control se trataron con la misma concentración de ARNip aleatorio. Dos días después, se colocaron todos los tejidos en medio nuevo. Los cultivos se mantuvieron durante 7 días in vitro. Se lavaron los cultivos organotípicos cocleares en PBS y se extrajeron los RNA totales con reactivo TRIzol (Invitrogen). Los niveles de ARNm de Hes1 se analizaron mediante qRT-PCR en una máquina de PCR Eppendorf realplex.
Como se muestra en la figura 6, las moléculas de ARNip de Hes1 utilizadas en este estudio produjeron una disminución de aproximadamente el 75 % en el ARNm de Hes1.
EJEMPLO 6
El fin de este estudio era determinar si el ARNip de Hes1 es eficaz para aumentar el número de células ciliadas en la cóclea después de una lesión con 4-HNE.
Se diseccionó el órgano de Corti de crías de ratón P3 CD-1 y se cultivaron en gotas de gel de colágeno en placas de Petri de 35 mm en DMEM más suplemento de insulina-transferrinaselenito (Sigma I-884). Se añadió 4-hidroxinonenal (4-HNE) (200 |j M) al medio de cultivo 24 horas más tarde y los tejidos de control se mantuvieron en medio sin fármaco. Después de 24 horas, se transfectaron los tejidos con ARNip de Hes1 (20 nM en 1,2 ml) (24 pmol) mediante reactivos de transfección jetSI (Polyplus) a 2 mM y, a continuación, se añadieron al medio de DMEM. Se aplicó medio recién preparado sin ARNip o 4-HNE a todos los tejidos 48 horas más tarde. Después de cultivar durante otros 2 días, se recogieron todos los tejidos y se fijaron con paraformaldehído al 4 %, y se inmunotiñeron con el anticuerpo contra la miosina VIIa y faloidina-TRITC (tinción con actina F). El recuento y la identificación de las células ciliadas se llevaron a cabo mediante microscopía de fluorescencia (microscopio de fluorescencia Olympus BX 51) con un objetivo de 40 aumentos. Para ser contada como una célula ciliada después de la exposición a la toxina, la célula tenía que mostrar una placa cuticular, expresar la miosina 7 y tener un haz de estereocilios.
En el órgano de Corti, la transfección de ARNip de Hes1 produjo un aumento de células ciliadas en el órgano de Corti tras la lesión con 4-HNE. Como se muestra en la figura 7, 4-HNE disminuyó significativamente (p < 0,05) el número de células ciliadas de la cóclea. La inhibición de la expresión del gen Hes1 a través de iARN produjo una regeneración significativa (p < 0,05) de las células ciliadas después de la lesión. Estos resultados demuestran que la reducción de la expresión de Hes1 es eficaz para aumentar el número de células ciliadas en el órgano de Corti en condiciones normales, así como en respuesta a lesiones con 4-HNE.
EJEMPLO 7
El fin de este experimento es demostrar que las nanopartículas de PLGA cargadas con ARNip de Hes1 son eficaces para aumentar el número de células ciliadas después de una lesión.
Se diseccionaron órganos de Corti de crías de ratón P3 CD-1 y se cultivaron en gotas de gel de colágeno en placas de Petri de 35 mm en DMEM más suplemento de insulina-transferrinaselenito (Sigma I-884). Se examinaron las siguientes condiciones experimentales: (1) Control (n = 6); (2) 4-HNE (200 j M) (n = 6); (3) nanopartículas de PLGA (NP) cargadas con ARNip de Hes1 (50 jg/m l) (n = 6); (4) 4-Hn E (200 j M) NP de Plg A cargadas con ARNip de Hes1 (1 jg/m l) (n = 6); (5) 4-HNE (200 j M) NP de PLGA cargadas con ARNip de Hes1 (10 jg/m l) (n = 6); (6) 4-HNE (200 j M) NP de PLGA cargadas con ARNip de Hes1 (50 jg/m l) (n = 6); (7) 4-HNE (200 j M) NP de PLGA cargadas con ARNip de Hes1 (100 jg/m l) (n = 2); (8) 4-HNE (200 j M) n P de PLg A cargadas con ARNip aleatorio de control (ARN aleatorio) (50 jg/m l) (n = 6); (9) 4-HNE (200 j M) NP de PLGA cargadas con ARN aleatorio (100 jg/m l) (n = 1). Las células se incubaron durante 24 horas en medio de cultivo con o sin 4-HNE (200 j M) y luego se trataron con nanopartículas de PLGA cargadas con ARNip o ARN aleatorio de Hes1. El medio de cultivo se reemplazó cada 48 horas, de modo que las células se expusieron a tres rondas de tratamiento con nanopartículas de PLGA que contenían ARNip. Todos los tejidos se recogieron el día 8, se fijaron con paraformaldehído al 4 % y se inmunotiñeron con anticuerpo contra la miosina VIIa y faloidina-TRITC (tinción con actina F). Las células ciliadas internas y externas del giro medio del OC se contaron e identificaron mediante microscopía de fluorescencia (microscopio de fluorescencia Olympus BX 51) con un objetivo de 40 aumentos. Para ser contada como una célula ciliada después de la exposición a la toxina, la célula debía demostrar las siguientes características: (1) una placa cuticular; (2) expresión de miosina 7; (3) un haz de estereocilios.
La figura 8 demuestra el número de células ciliadas internas (CCI) y externas (CCE) del giro medio de los cultivos de OC de los diversos grupos experimentales descritos anteriormente. Los datos se expresan como la media DT. La exposición a 4-HNE redujo significativamente los números de CCE en comparación con los controles normales. El tratamiento de cultivos de OC no dañados por ototoxinas con nanopartículas de ARNip de Hes1 (NP de Hes1) únicamente (50 jg/m l) aumentó el número de células ciliadas en comparación con el control normal (p = 0,02). El tratamiento de cultivos de OC dañados por ototoxinas (4-HNE 200 j M) con 50 o 100 jg/m l de NP de Hes1 aumentó significativamente el número de CCE en comparación con dosis más bajas de NP de Hes1 (1 o 10 jg/ml, p = 0,0001). Como era de esperar, las nanopartículas de ARN aleatorio (50 o 100 jg/m l) no tuvieron impacto en el número de células ciliadas en el OC expuesto a 4-HNE.
En conclusión, el tratamiento con nanopartículas de PLGA encapsuladas con ARNip de Hes1 aumentó el número de células ciliadas en el órgano de Corti.
EJEMPLO 8
El fin de este estudio era determinar si el ARNip dirigido a MAPK1 asistido por el agente de transfección jetSI (ARNip de MAPK1) o las nanopartículas de PLGA (NP cargadas con ARNip de MAPK1) es eficaz para prevenir la muerte de las células ciliadas en los sáculos después de una lesión con neomicina.
Se diseccionaron sáculos de crías de ratón P3 CD-1 y se cultivaron en gotas de gel de colágeno en placas de Petri de 35 mm en DMEM más suplemento de insulina-transferrinaselenito (Sigma I-884). Después de 24 horas, se reemplazó el medio de cultivo por un medio de cultivo que tenía una concentración final de neomicina 4 mM en ausencia o presencia de ARNip de MAPK1 (reactivo de transfección convencional: 25 nM; 50 nM; 75 nM; y 100 nM) (nanopartícula de PLGA: 167 |jg/ml; 333 jg/ml; 500 |jg/ml; y 667 jg/ml). Los grupos de control se mantuvieron en medio sin fármaco. Después de cultivar durante un total de 8 días, se recogieron todos los explantes y se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavaron 3 veces con PBS, se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,05 % en PBS durante 30 minutos y luego se lavaron 3 veces en PBS. Los explantes se marcaron con faloidina conjugada con TRITC (3 jg/m l) durante 45 minutos a oscuras a temperatura ambiente. Las CC marcadas con faloidina se observaron usando un microscopio epifluorescente Olympus bX-51 con un filtro de excitación amarillo ajustado a de 560 a 590 nm. Se contaron las células ciliadas (CC) de cuatro campos de 2500 jm 2 por cada explante (n = 3-5 sáculos por condición). Las CC se cuantificaron y expresaron como el valor medio ± ETM (error típico de la media). Se usó ANOVA con una prueba a posteriori de mínima diferencia significativa para comparar las medias entre diferentes condiciones. Se consideró significativo un valor p < 0,05.
La FIG. 9 representa los números de células ciliadas en cultivos organotípicos de sáculos en control normal, neomicina (4 mM), neomicina (4 mM) ARNip de MAPK1 y neomicina (4 mM) NP cargadas con ARNip de MAPK1. El tratamiento con neomicina (4 mM) disminuyó significativamente el número de células ciliadas en todos los grupos en comparación con los controles (p < 0,01). Sin embargo, el tratamiento con ARNip de MAPK1 (50 nM o 75 nM, p < 0,05) o NP cargadas con ARNip de MAPK1 (167 jg/ml, 333 jg/ml, 500 jg/m l o 667 jg/m l) aumentó significativamente (p < 0,05) el número de células ciliadas supervivientes en comparación con el tratamiento con neomicina (4 mM) sola. El aumento de la concentración de ARNip de MAPK1 o NP cargadas con ARNip de MAPK1 no afectó significativamente el número de células ciliadas (p > 0,05). Estos resultados indican que el ARNip de MAPK1 administrado con agente de transfección convencional o encapsulado en nanopartículas de PLGA previene con éxito la muerte de las células ciliadas provocada por la neomicina en cultivos organotípicos de sáculos.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Una composición para usar en el tratamiento de reemplazo, regeneración o protección de las células ciliadas del oído interno, en donde dicha composición comprende un agente activo que comprende una molécula de ARNip que disminuye la expresión de un gen Hes1 en un tejido del oído interno, en donde el agente activo comprende una o más de:
(i) una molécula de ARNip que comprende la SEQ ID NO: 3;
(ii) una molécula de ARNip que comprende la SEQ ID NO: 4;
(iii) una molécula de ARNip que comprende la SEQ ID NO: 5;
(iv) una molécula de ARNip que comprende la SEQ ID NO: 6;
(v) una molécula de ARNip que comprende la SEQ ID NO: 7; y
(vi) una molécula de ARNip que comprende la SEQ ID NO: 8.
2. La composición para el uso de la reivindicación 1, en donde la molécula de ARNip se incorpora a una nanopartícula.
3. La composición para el uso de la reivindicación 2, en donde dicha nanopartícula comprende un polímero biodegradable.
4. La composición para el uso de la reivindicación 3, en donde el polímero biodegradable comprende PLGA.
5. La composición para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde dichas nanopartículas comprenden además partículas de óxido de hierro superparamagnético.
6. La composición para el uso de cualquier reivindicación anterior, en donde el agente activo comprende una mezcla de dos o más moléculas de ARNip diferentes.
7. La composición para usar de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, comprendiendo el tratamiento aplicar la composición, que es una solución que comprende el agente activo, en una región del oído interno en una cantidad eficaz para disminuir la expresión del gen Hes1.
8. La composición para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el tratamiento comprende:
(a) aplicar la composición, que es una solución, en una región del oído medio; comprendiendo dicha solución nanopartículas y un vehículo farmacéuticamente aceptable, teniendo dichas nanopartículas óxido de hierro superparamagnético incorporado en su interior y el agente activo en una cantidad eficaz para disminuir la expresión del gen Hes1; y
(b) aplicar una fuerza magnética para potenciar el transporte de las nanopartículas a través de la membrana de ventana redonda u ovalada del oído interno hacia una región del oído interno.
9. La composición para usar de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la aplicación es mediante inyección directa a través de la membrana de ventana redonda u ovalada del oído interno.
10. La composición para usar de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la aplicación es mediante una inyección transtimpánica.
11. La composición para el uso de cualquier reivindicación anterior, en donde el agente activo comprende además una o más de (i) una molécula de ARNip que disminuye la expresión de un gen Hes5 y (ii) una molécula de ARNip que disminuye la expresión de un gen MAPK1.
12. La composición para el uso de la reivindicación 11, en donde:
(I) la molécula de ARNip que disminuye la expresión del gen Hes5 comprende (i) la SEQ ID NO: 9, (ii) la SEQ ID NO: 10, (iii) la SEQ ID NO: 11, (iv) la SEQ ID NO: 12, (v) la SEQ ID NO: 13, (vi) la SEQ ID NO: 14 o (vii) combinaciones de cualquiera de estas; y/o
(II) la molécula de ARNip que disminuye la expresión del gen MAKP1 comprende (i) la SEQ ID NO: 15, (ii) la SEQ ID NO: 16 o (iii) una combinación de estas.
ES11790406T 2010-06-04 2011-06-02 Composición y método de regeneración o reemplazo de células ciliadas sensoriales del oído interno Active ES2952389T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US35162310P 2010-06-04 2010-06-04
PCT/US2011/038926 WO2011153348A2 (en) 2010-06-04 2011-06-02 Composition and method for inner ear sensory hair cell regeneration and replacement

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2952389T3 true ES2952389T3 (es) 2023-10-31

Family

ID=45067296

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES11790406T Active ES2952389T3 (es) 2010-06-04 2011-06-02 Composición y método de regeneración o reemplazo de células ciliadas sensoriales del oído interno

Country Status (8)

Country Link
US (2) US9101647B2 (es)
EP (1) EP2576781B1 (es)
JP (2) JP6088967B2 (es)
AU (3) AU2011261364B2 (es)
CA (1) CA2801535C (es)
ES (1) ES2952389T3 (es)
IL (2) IL223439A (es)
WO (1) WO2011153348A2 (es)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2012289865A1 (en) * 2011-08-03 2014-02-20 Quark Pharmaceuticals, Inc. Double-stranded oligonucleotide compounds for treating hearing and balance disorders
US9901616B2 (en) 2011-08-31 2018-02-27 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Apoptosis-targeting nanoparticles
CN104159572A (zh) * 2011-09-21 2014-11-19 耶路撒冷希伯来大学伊森姆研究发展有限公司 纳米递送系统
CN103182088B (zh) * 2011-12-28 2014-12-03 上海市第六人民医院 Plga修饰磁性纳米簇及其制备方法和应用
KR20140111673A (ko) 2012-01-12 2014-09-19 쿠아크 파마수티칼스 인코퍼레이티드 청력 및 균형 장애를 치료하기 위한 조합요법
WO2013123298A1 (en) 2012-02-17 2013-08-22 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Nanoparticles for mitochondrial trafficking of agents
WO2015138992A1 (en) 2014-03-14 2015-09-17 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Mitochondrial delivery of 3-bromopyruvate
US9512400B2 (en) * 2014-04-28 2016-12-06 The University Of Kansas Reprogramming of human whartons jelly cells to produce hair cells
WO2017210553A1 (en) * 2016-06-03 2017-12-07 Hough Ear Institute Combination therapies for inner ear sensory hair cell regeneration/replacement
US11331373B2 (en) 2017-02-10 2022-05-17 St. Jude Children's Research Hospital Combination therapy for treating disorders of the ear
US11883491B2 (en) 2017-05-03 2024-01-30 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Compositions and methods for prevention and treatment of hearing loss
AU2018291045A1 (en) * 2017-06-30 2020-02-13 Otomagnetics, Inc. Magnetic nanoparticles for targeted delivery
US11857551B1 (en) 2020-07-10 2024-01-02 Ting Therapeutics Llc Methods for the prevention and treatment of hearing loss

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003301077B2 (en) 2002-12-18 2009-12-24 Hough Ear Institute Otologic nanotechnology
AU2004215097A1 (en) * 2003-02-10 2004-09-10 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Regulation of gene expression by DNA interference
US7723311B2 (en) 2003-06-18 2010-05-25 Nanobiomagnetics, Inc. Delivery of bioactive substances to target cells
US8673634B2 (en) 2003-11-13 2014-03-18 Massachusetts Eye & Ear Infirmary Method for the treatment of hearing loss
WO2005116204A1 (ja) * 2004-05-11 2005-12-08 Rnai Co., Ltd. Ｒｎａ干渉を生じさせるポリヌクレオチド、および、これを用いた遺伝子発現抑制方法
US7404969B2 (en) 2005-02-14 2008-07-29 Sirna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle based compositions and methods for the delivery of biologically active molecules
US7741469B2 (en) 2006-04-05 2010-06-22 University Of Iowa Research Foundation Compositions for treating hearing loss and methods of use thereof
EP2231197A2 (en) 2007-12-19 2010-09-29 Ramot at Tel-Aviv University Ltd. Methods of generating expanded and re-differentiated adult islet beta cells for use in the treatment of diabetes
WO2009104051A2 (en) * 2007-12-31 2009-08-27 Lu Patrick Y Combinational therapeutics for treatment of prostate cancer using epoxy encapsulated magnetic particles and rnai medicine
EP2293800B1 (en) * 2008-06-06 2016-10-05 Quark Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treatment of ear disorders
PL2774608T3 (pl) * 2008-06-16 2020-05-18 Pfizer Inc. Polimerowe nanocząstki napełnione lekiem oraz sposoby ich wytwarzania i zastosowania
US8784870B2 (en) * 2008-07-21 2014-07-22 Otonomy, Inc. Controlled release compositions for modulating free-radical induced damage and methods of use thereof
JP4340744B2 (ja) * 2009-03-17 2009-10-07 株式会社ホソカワ粉体技術研究所 薬剤溶出型ステント

Also Published As

Publication number Publication date
AU2011261364A1 (en) 2013-01-24
AU2017203769A1 (en) 2017-06-22
JP2013527244A (ja) 2013-06-27
EP2576781A4 (en) 2014-08-13
CA2801535A1 (en) 2011-12-08
JP2017061491A (ja) 2017-03-30
US9732343B2 (en) 2017-08-15
IL223439A (en) 2017-05-29
IL251344A0 (en) 2017-05-29
JP6232487B2 (ja) 2017-11-15
WO2011153348A3 (en) 2012-03-15
US20160090594A1 (en) 2016-03-31
AU2015243034A1 (en) 2015-11-05
WO2011153348A2 (en) 2011-12-08
US9101647B2 (en) 2015-08-11
JP6088967B2 (ja) 2017-03-01
EP2576781A2 (en) 2013-04-10
AU2015243034B2 (en) 2017-07-06
AU2017203769B2 (en) 2018-11-15
AU2011261364B2 (en) 2015-07-16
CA2801535C (en) 2017-05-30
EP2576781B1 (en) 2023-06-21
US20130210889A1 (en) 2013-08-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2952389T3 (es) Composición y método de regeneración o reemplazo de células ciliadas sensoriales del oído interno
Hao et al. Inner ear drug delivery: recent advances, challenges, and perspective
Szeto et al. Inner ear delivery: Challenges and opportunities
Swan et al. Inner ear drug delivery for auditory applications
Mittal et al. Nanoparticle-based drug delivery in the inner ear: current challenges, limitations and opportunities
El Kechai et al. Recent advances in local drug delivery to the inner ear
Yang et al. Optimized phospholipid-based nanoparticles for inner ear drug delivery and therapy
Wise et al. Improved auditory nerve survival with nanoengineered supraparticles for neurotrophin delivery into the deafened cochlea
ES2661236T3 (es) Procedimientos, sistemas y composiciones para administración de microARN derivado de células/a base de vesículas
AU2018337076B2 (en) Method of treatment
Rathnam et al. Developments in bio-inspired nanomaterials for therapeutic delivery to treat hearing loss
JP2022180476A (ja) 内耳感覚有毛細胞の再生／置換のための併用療法
Micaletti et al. Microbubble-assisted ultrasound for inner ear drug delivery
KR20190089534A (ko) 내이에서의 약물전달용 나노입자
Mohammadian et al. Inner ear drug delivery using liposomes
Shepherd Rescuing the cochlea: the challenges
Macks Combinatorial Therapy of Rolipram and RhoA siRNA by Multifunctional Polymeric Nanocarrier for Traumatic Brain Injury
Zhang Potential Use of Polymersomes and Lipid Nanocapsules as Therapeutic Carriers in the Rat Inner Ear
KR20170050485A (ko) 내이에서의 약물전달용 나노입자