ES2938734T3 - Procedure for the manufacture of analogues of GLP-1 - Google Patents
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Abstract
La presente invención proporciona un proceso para la fabricación de análogos de GLP-1 con alto rendimiento y pureza por condensación de fragmentos en fase sólida. En particular, describe una síntesis convergente por condensación de un fragmento A de pseudoprolina C-terminal con un fragmento B unido a un soporte sólido, seguida de desprotección y escisión del soporte y purificación final para producir el péptido deseado. La invención proporciona además productos intermedios útiles en el proceso de fabricación. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)The present invention provides a process for the manufacture of GLP-1 analogues with high yield and purity by condensation of fragments in solid phase. In particular, it describes a convergent synthesis by condensation of a C-terminal pseudoproline fragment A with a fragment B attached to a solid support, followed by deprotection and cleavage of the support and final purification to produce the desired peptide. The invention further provides intermediate products useful in the manufacturing process. (Automatic translation with Google Translate, without legal value)
Description
DESCRIPCIÓNDESCRIPTION
Procedimiento para la fabricación de análogos de GLP-1Procedure for the manufacture of analogues of GLP-1
Campo de la invenciónfield of invention
La presente invención se refiere a la síntesis de péptidos. En particular, se refiere a procedimientos para la fabricación de análogos de GLP-1. Más en particular, la presente invención se refiere a un procedimiento para la fabricación de liraglutida y semaglutida mediante condensación de fragmentos peptídicos.The present invention relates to the synthesis of peptides. In particular, it relates to processes for the manufacture of GLP-1 analogues. More particularly, the present invention relates to a process for the manufacture of liraglutide and semaglutide by condensation of peptide fragments.
Antecedentes de la invenciónBackground of the invention
El péptido similar al glucagón-1 (GLP-1) es una hormona peptídica que se produce de manera natural con una de las actividades insulinotrópicas más potentes. GLP-1 forma parte de un péptido más largo producido y procesado para dar GLP-1 en el páncreas y el intestino. Los agonistas del receptor del péptido similar al glucagón-1 (GLP-1), o análogos de GLP-1, son un grupo relativamente nuevo de fármacos inyectables para el tratamiento de la diabetes tipo 2. Una de sus ventajas con respecto a los secretagogos de insulina más antiguos, tales como las sulfonilureas o las meglitinidas, es que tienen un menor riesgo de provocar hipoglucemia.Glucagon-like peptide-1 (GLP-1) is a naturally occurring peptide hormone with one of the most potent insulinotropic activities. GLP-1 is part of a larger peptide produced and processed into GLP-1 in the pancreas and intestine. Glucagon-like peptide-1 (GLP-1) receptor agonists, or GLP-1 analogues, are a relatively new group of injectable drugs for the treatment of type 2 diabetes. One of their advantages over secretagogues older insulin medications, such as sulfonylureas or meglitinides, is that they have a lower risk of causing hypoglycemia.
La liraglutida y la semaglutida son ambos péptidos altamente similares de 30 aminoácidos de longitud, que difieren sólo en el aminoácido en la posición 2 (aa2 , que es alanina, Ala, en liraglutida y ácido a -aminoisobutírico, Aib, en semaglutida) y en la cadena lateral unida a la lisina en la posición 20 (Lys20), es decir, el resto de unión a albúmina lipófilo. Unido al grupo s-amino de tal lisina, la liraglutida tiene un ácido palmítico espaciado con Glu (indicado como Pal-Glu), mientras que la semaglutida porta un ácido glutámico-octadecanoico acilado más un espaciador adicional. La liraglutida y la semaglutida se representan mediante el uso del “código de tres letras” para aminoácidos/péptidos, según lo siguiente:Liraglutide and semaglutide are both highly similar peptides 30 amino acids in length, differing only in the amino acid at position 2 (aa 2 , which is alanine, Ala, in liraglutide and α-aminoisobutyric acid, Aib, in semaglutide) and on the side chain attached to lysine at position 20 (Lys 20 ), ie, the lipophilic albumin-binding moiety. Attached to the s-amino group of such a lysine, liraglutide has a Glu-spaced palmitic acid (indicated as Pal-Glu), whereas semaglutide carries an acylated glutamic-octadecanoic acid plus an additional spacer. Liraglutide and semaglutide are represented by using the “three-letter code” for amino acids/peptides, as follows:
1 5 10 15 201 5 10 15 20
His-Xi-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2)-25 30 31His-Xi-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X 2 )-25 30 31
Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-GlyGlu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly
en el que la numeración de residuos de aminoácido comienza con 1, lo que indica histidina N-terminal, y acaba con 31, lo que indica glicina C-terminal,wherein amino acid residue numbering begins with 1, indicating N-terminal histidine, and ends with 31, indicating C-terminal glycine,
y en el queand in which
en liraglutida (SEQ ID NO: 1)in liraglutide (SEQ ID NO: 1)
X1 es Ala yX 1 is Wing and
X2 es N-(1-oxohexadecil)-L-y-glutamilo (también indicado como Pal-Glu), representado aquí a continuaciónX2 is N-(1-oxohexadecyl)-L-y-glutamyl (also denoted as Pal-Glu), pictured here below
yand
en semaglutida (SEQ ID NO: 2)in semaglutide (SEQ ID NO: 2)
X1 es Aib (ácido a -aminoisobutírico) yX1 is Aib (α-aminoisobutyric acid) and
X2 es N-(17-carboxi-1 -oxoheptadecil)-L-y-glutamil-2-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]acetil-2-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]acetilo, representado aquí a continuación X2 is N-(17-carboxy-1-oxoheptadecyl)-Ly-glutamyl-2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]acetyl-2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]acetyl, pictured herein below
y en el que X2 se une al grupo s-amino de Lys20 a través del enlace amida cuando se indica por Alternativamente, los dos péptidos anteriores, o cualquier fragmento de los mismos, se representan a lo largo de la presente solicitud mediante el uso del “código de una letra” para aminoácidos/péptidos, según la fórmula I:and wherein X2 is attached to the s-amino group of Lys 20 via the amide bond when indicated by Alternatively, the above two peptides, or any fragment thereof, are represented throughout the present application by the use of the “one-letter code” for amino acids/peptides, according to formula I:
HX1EGTFTSDVSSYLEGQAAK(X2)EFIAWLVRGRG (I)HX1EGTFTSDVSSYLEGQAAK(X2)EFIAWLVRGRG (I)
en el que X1 y X2 son tal como se definieron anteriormente, respectivamente.wherein X1 and X2 are as defined above, respectively.
En una opción adicional, los dos péptidos anteriores, o cualquier fragmento de los mismos, se representan a lo largo de la presente solicitud mediante el uso de su estructura química.In a further option, the above two peptides, or any fragment thereof, are represented throughout the present application by use of their chemical structure.
A continuación en el presente documento, también se harán referencia a los fragmentos por sus posiciones correspondientes en la secuencia mencionada anteriormente. Por ejemplo, un “fragmento (1-16)” se refiere a la secuencia peptídica que consiste en los aminoácidos presentes en la secuencia anterior en las posiciones 1 a 16. La preparación de análogos de GLP-1 se ha descrito en varias solicitudes de patente. Se siguieron enfoques tanto basados en SPPS (síntesis de péptidos en fase sólida) secuencial como basados en fragmentos. Cabe señalar que la estructura ramificada de liraglutida y semaglutida y su baja solubilidad acuosa impiden drásticamente su síntesis y purificación.Hereinafter, the fragments will also be referred to by their corresponding positions in the aforementioned sequence. For example, a "fragment (1-16)" refers to the peptide sequence consisting of the amino acids present in the above sequence at positions 1 to 16. The preparation of GLP-1 analogs has been described in several patent applications. patent. Both sequential and fragment-based SPPS (solid phase peptide synthesis)-based approaches were followed. It should be noted that the branched structure of liraglutide and semaglutide and their low aqueous solubility drastically impede their synthesis and purification.
En una síntesis de péptidos basada en fragmentos, el grupo carboxílico C-terminal de uno de los dos fragmentos que reaccionan debe activarse antes del acoplamiento. Sin embargo, la activación de los grupos carboxílicos C-terminales de los fragmentos peptídicos puede conducir a la formación de éster activado y oxazolona, que pueden racemizarse fácilmente en las condiciones básicas durante el acoplamiento (N. L. Benoiton. Chemistry of Peptide Synthesis. Tailor and Francis Group. 2006). Por tanto, los péptidos en bruto así obtenidos contienen impurezas correspondientes al producto isomerizado. Dado que las impurezas isoméricas tienen tiempos de retención muy similares a los del péptido diana requerido, es muy difícil separar estas impurezas de dicho péptido. Una forma de abordar este problema fue dividir la secuencia peptídica de los análogos de GLP-1 en posiciones Gly4 y/o Gly16 y acoplar los fragmentos en una etapa final (tal como se da a conocer, por ejemplo, en los documentos CN104004083 y WO2016046753).In a fragment-based peptide synthesis, the C-terminal carboxylic group of one of the two reacting fragments must be activated prior to coupling. However, activation of the C-terminal carboxylic groups of peptide fragments can lead to the formation of activated ester and oxazolone, which can readily racemize under basic conditions during coupling (NL Benoiton. Chemistry of Peptide Synthesis. Tailor and Francis Group. 2006). Therefore, the crude peptides thus obtained contain impurities corresponding to the isomerized product. Since isomeric impurities have very similar retention times to the required target peptide, it is very difficult to separate these impurities from said peptide. One way to address this problem was to split the peptide sequence of the GLP-1 analogs at Gly 4 and/or Gly 16 positions and assemble the fragments in a final step (as disclosed, for example, in CN104004083 and WO2016046753).
Sin embargo, la solubilidad extremadamente baja del fragmento protegido (1-16) en los disolventes comúnmente usados en la síntesis de péptidos hace que el acoplamiento final con el fragmento (1-16) fragmento (17-31) de esquema sea muy difícil, especialmente cuando el fragmento C-terminal (es decir, el fragmento (17-31)) se inmoviliza sobre un soporte sólido.However, the extremely low solubility of the protected fragment (1-16) in the solvents commonly used in peptide synthesis makes final coupling with the schematic fragment (1-16) fragment (17-31) very difficult, especially when the C-terminal fragment (ie, fragment (17-31)) is immobilized on a solid support.
Además, los péptidos largos como la liraglutida y la semaglutida son propensos a la agregación intermolecular de las cadenas peptídicas. Este problema, junto con el plegamiento de péptidos intramolecular, es particularmente grave durante la síntesis de péptidos, disminuyendo la eficiencia de los acoplamientos y desprotecciones de aminoácidos, dando lugar a la formación de muchos productos secundarios o incluso a la imposibilidad de obtener el péptido diana. El documento WO 2017/127007 da a conocer un procedimiento para la preparación de liraglutida, en el que un fragmento protegido que comprende un dipéptido de pseudoprolina interno se acopla a un fragmento de liraglutida protegido.Furthermore, long peptides such as liraglutide and semaglutide are prone to intermolecular aggregation of peptide chains. This problem, along with intramolecular peptide folding, is particularly serious during peptide synthesis, decreasing the efficiency of amino acid couplings and deprotections, leading to the formation of many side products or even the impossibility of obtaining the target peptide. . WO 2017/127007 discloses a process for the preparation of liraglutide, wherein a protected fragment comprising an internal pseudoproline dipeptide is coupled to a protected liraglutide fragment.
Por tanto, sigue existiendo la necesidad de desarrollar un procedimiento eficaz, simple e industrialmente viable para preparar liraglutida y semaglutida. Por tanto, es muy deseable un procedimiento mejorado para superar los problemas de síntesis no resueltos por la técnica anterior y para proporcionar ambos péptidos con alto rendimiento y con un perfil de impurezas favorable.Therefore, there remains a need to develop an efficient, simple and industrially viable process for preparing liraglutide and semaglutide. Therefore, an improved process is highly desirable to overcome the synthesis problems not solved by the prior art and to provide both peptides in high yield and with a favorable impurity profile.
En el presente documento se describe una síntesis en fase sólida nueva y mejorada de liraglutida y semaglutida que hace uso de un enfoque convergente que implica una etapa final de acoplamiento de fragmentos, en la que el fragmento A N-terminal tiene una pseudoprolina en el sitio reactivo C-terminal, según el esquema general 1: fragmento A - pseudoprolina -COOH N H ?-fragmento B - soporte sólidoDescribed herein is a new and improved solid-phase synthesis of liraglutide and semaglutide that makes use of a convergent approach involving a final fragment ligation step, in which the N-terminal A fragment has a pseudoproline at the site. C-terminal reagent, according to general scheme 1: fragment A - pseudoproline -COOH NH ?-fragment B - solid support
péptido finalend peptide
En particular, se diseña una estrategia en la que el fragmento de pseudoprolina N-terminal protegido (o fragmento A) se prepara mediante SPPS y luego se escinde del soporte sólido, mientras se mantienen las protecciones de cadenas laterales y el grupo a -amino, y el fragmento C-terminal soportado sobre el sólido (o fragmento B) se prepara mediante SPPS o CSPPS (SPPS convergente) y sólo se desprotege su grupo a -amino antes del acoplamiento del fragmento final. El péptido secuenciado completo finalmente se escinde del soporte sólido y se desprotege, y opcionalmente se purifica para obtener liraglutida o semaglutida pura, respectivamente. Sorprendentemente, se encontró que el uso de pseudoprolina en el extremo C-terminal en el presente enfoque basado en fragmentos reduce eficazmente la formación de impurezas de modo que el péptido en bruto obtenido pueda purificarse más fácilmente para dar el péptido final con un alto rendimiento total.In particular, a strategy is devised in which the protected N-terminal pseudoproline fragment (or fragment A) is prepared by SPPS and then cleaved from the solid support, while maintaining the side chain protections and the a-amino group, and the solid supported C-terminal fragment (or fragment B) is prepared by SPPS or CSPPS (converging SPPS) and only its α-amino group is deprotected prior to ligation of the final fragment. The complete sequenced peptide is finally excised from the solid support and deprotected, and optionally purified to obtain pure liraglutide or semaglutide, respectively. Surprisingly, it was found that the use of pseudoproline at the C-terminus in the present fragment-based approach effectively reduces the formation of impurities so that the obtained crude peptide can be more easily purified to give the final peptide in high overall yield. .
Objeto de la invenciónObject of the invention
Un objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento en fase sólida mejorado para la preparación de análogos de g LP-1, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, que dé como resultado péptidos en bruto con un alto rendimiento y un buen perfil de impurezas, facilitando la purificación final.An object of the present invention is to provide an improved solid phase process for the preparation of g LP-1 analogues, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, which results in crude peptides with high yield and good performance profile. impurities, facilitating the final purification.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento eficaz, simple e industrialmente viable para preparar liraglutida y semaglutida.Another object of the present invention is to provide an efficient, simple and industrially feasible process for preparing liraglutide and semaglutide.
Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un procedimiento para preparar liraglutida y semaglutida con mayor rendimiento y pureza que los logrados en el estado de la técnica.A further object of the present invention is to provide a process for preparing liraglutide and semaglutide in higher yield and purity than those achieved in the state of the art.
Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar productos intermedios peptídicos útiles para la síntesis de liraglutida o semaglutida, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.A further object of the present invention is to provide peptide intermediates useful for the synthesis of liraglutide or semaglutide, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
Sumario de la invenciónSummary of the invention
La presente invención proporciona un método convergente para la preparación de algunos análogos de GLP-1 en síntesis en fase sólida, que comprende la etapa final de acoplar un primer fragmento peptídico N-terminal protegido caracterizado por tener una pseudoprolina en el sitio reactivo C-terminal (fragmento A de pseudoprolina N-terminal protegido), con un segundo fragmento peptídico C-terminal protegido (fragmento B) unido a un soporte sólido.The present invention provides a convergent method for the preparation of some GLP-1 analogues in solid phase synthesis, comprising the final step of coupling a first N-terminal protected peptide fragment characterized by having a pseudoproline at the C-terminal reactive site. (N-terminal protected pseudoproline fragment A), with a second C-terminal protected peptide fragment (fragment B) attached to a solid support.
El fragmento A tiene un sitio reactivo de pseudoprolina C-terminal y está protegido en su grupo a -amino N-terminal. El fragmento A está protegido preferiblemente en sus cadenas laterales de aminoácidos.Fragment A has a C-terminal pseudoproline reactive site and is protected at its N-terminal α-amino group. Fragment A is preferably protected on its amino acid side chains.
El fragmento A se selecciona del grupo que consiste en:Fragment A is selected from the group consisting of:
His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser(y z’zpro),His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser(y z'zpro),
denominado fragmento A (1-8) o SEQ ID NO: 3,called fragment A (1-8) or SEQ ID NO: 3,
His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(^ zzpro),His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(^ zzpro),
denominado fragmento A (1-11) o SEQ ID NO: 4,referred to as fragment A(1-11) or SEQ ID NO: 4,
His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser(^ zzpro),His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser(^ zzpro),
denominado fragmento A (1-12) o SEQ ID NO: 5,referred to as fragment A(1-12) or SEQ ID NO: 5,
His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr(^ zzpro),His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr(^ zzpro),
denominado fragmento A (1-7) o SEQ ID NO: 6,referred to as fragment A(1-7) or SEQ ID NO: 6,
y and
His-Xi-Glu-Gly-Thr(^z’zpro), denominado fragmento A (1-5) o SEQ ID NO: 7,His-Xi-Glu-Gly-Thr(^z'zpro), referred to as fragment A(1-5) or SEQ ID NO: 7,
en los que X1 es Ala para liraglutida y Aib para semaglutida, ywhere X 1 is Ala for liraglutide and Aib for semaglutide, and
en los que aa(^zzpro) indica que el aminoácido C-terminal (aa), preferiblemente Ser o Thr, está protegido con pseudoprolina, según la siguiente fórmula:wherein aa(^zzpro) indicates that the C-terminal amino acid (aa), preferably Ser or Thr, is protected with pseudoproline, according to the following formula:
en la quein which
Y es hidrógeno para Ser y metilo (Me) para Thr,Y is hydrogen for Ser and methyl (Me) for Thr,
Z es hidrógeno o metilo (Me), yZ is hydrogen or methyl (Me), and
R1 es la cadena lateral del aminoácido al lado del aminoácido protegido con pseudoprolina.R 1 is the side chain of the amino acid next to the pseudoproline protected amino acid.
La anotación de número de fragmento entre paréntesis, por ejemplo, (1-8), simplemente indica la posición del fragmento con respecto a la secuencia peptídica completa.The fragment number annotation in parentheses, eg, (1-8), simply indicates the position of the fragment with respect to the complete peptide sequence.
Por tanto, por ejemplo, aa-Ser(^Me'Mepro) indica:Therefore, for example, aa-Ser(^Me'Mepro) indicates:
en la que R1 es la cadena lateral de aa, ywhere R 1 is the side chain of aa, and
Thr-Ser(^zzpro) en el fragmento A (1-8) tal como se definió anteriormente indica:Thr-Ser(^zzpro) in fragment A(1-8) as defined above indicates:
en la que Z es tal como se definió anteriormente.where Z is as defined above.
La estereoquímica no se define en las estructuras anteriores por simplicidad. Siempre se usan L-aminoácidos si no se indica lo contrario.Stereochemistry is not defined in the above structures for simplicity. L-amino acids are always used unless otherwise indicated.
El fragmento B está unido a una resina, o soporte sólido, en su aminoácido C-terminal, es decir, glicina 31 (Gly31). El soporte sólido se selecciona preferiblemente de resina de Wang, resina de cloruro de 2-clorotritilo (CTC), resina de cloruro de tritilo, resina de m Bh y de 4-MeO-MBH. El soporte sólido se selecciona más preferiblemente de resina de Wang, resina de cloruro de 2-clorotritilo (CTC) y resina de cloruro de tritilo. El fragmento B está protegido preferiblemente en sus cadenas laterales de aminoácidos, incluyendo el resto X2 de Lys20. Fragment B is attached to a resin, or solid support, at its C-terminal amino acid, ie, glycine 31 (Gly31). The solid support is preferably selected from Wang's resin, 2-chlorotrityl chloride (CTC) resin, trityl chloride resin, mBh resin and 4-MeO-MBH. The solid support is more preferably selected from Wang's resin, 2-chlorotrityl chloride (CTC) resin and trityl chloride resin. Fragment B is preferably protected on its amino acid side chains, including the X 2 residue of Lys20.
El fragmento B se selecciona del grupo que consiste enFragment B is selected from the group consisting of
Asp-Val-Ser-Ser-Try-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-resina, denominado fragmento B (9-31) o SEQ ID NO: 8,Asp-Val-Ser-Ser-Try-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-resin , referred to as fragment B(9-31) or SEQ ID NO: 8,
Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-resina, denominado fragmento B (12-31) o SEQ ID NO: 9,Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-resin, called fragment B (12 -31) or SEQ ID NO: 9,
Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-resina, denominado fragmento B (13-31) o SEQ ID NO: 10,Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-resin, called fragment B (13-31 ) or SEQ ID NO: 10,
Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-resina, denominado fragmento B (8-31) o s Eq ID NO: 11,Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly -resin, designated fragment B(8-31) or s Eq ID NO: 11,
yand
Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Glyresina, denominado fragmento B (6-31) o SeQ ID NO: 12,Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly -Arg-Glyresin, designated fragment B(6-31) or SeQ ID NO: 12,
en los quein which
X2 es N-(1-oxohexadecil)-L-y-glutamilo (Pal-Glu) para liraglutida, yX2 is N-(1-oxohexadecyl)-L-y-glutamyl (Pal-Glu) for liraglutide, and
X2 es N-(17-carboxi-1-oxoheptadecil)-L-y-glutamil-2-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]acetil-2-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]acetilo para semaglutida, opcionalmente protegida.X2 is N-(17-carboxy-1-oxoheptadecyl)-L-y-glutamyl-2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]acetyl-2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]acetyl to semaglutide, optionally protected .
Se acoplan el fragmento A y el fragmento B, de modo que se obtiene la secuencia completa o bien de liraglutida o bien de semaglutida. El péptido de 30 aa obtenido, preferiblemente con cadena lateral protegida, se desprotege y/o escinde luego del soporte sólido para obtener el péptido en bruto. Tal péptido en bruto se purifica opcionalmente para obtener liraglutida o semaglutida pura. El método de la presente invención proporciona liraglutida y semaglutida con un alto rendimiento y una alta pureza.Fragment A and fragment B are ligated so that the complete sequence of either liraglutide or semaglutide is obtained. The obtained 30 aa peptide, preferably with protected side chain, is then deprotected and/or cleaved from the solid support to obtain the crude peptide. Such crude peptide is optionally purified to obtain pure liraglutide or semaglutide. The method of the present invention provides liraglutide and semaglutide in high yield and high purity.
Además, la presente invención proporciona los fragmentos intermedios A y B y métodos para su preparación.Furthermore, the present invention provides intermediate fragments A and B and methods for their preparation.
Descripción detallada de la invenciónDetailed description of the invention
La presente invención da a conocer un nuevo método para preparar un análogo de GLP-1 con alto rendimiento y pureza. En particular, consiste en un enfoque convergente sobre la fase sólida. Más en particular, el acoplamiento final involucra un fragmento peptídico (fragmento A) caracterizado por tener una pseudoprolina en el sitio reactivo C-terminal.The present invention provides a new method for preparing a GLP-1 analogue in high yield and purity. In particular, it consists of a convergent approach on the solid phase. More particularly, the final coupling involves a peptide fragment (fragment A) characterized as having a pseudoproline at the C-terminal reactive site.
Las pseudoprolinas fueron desarrolladas por Mutter en 1992 (T. Haack, M. Mutter, Serine derived oxazolidines as secondary structure disrupting, solubilizing building blocks in peptide synthesis, Tetrahedron Lett. 1992, 33, 1589 1592). Sorprendentemente, se ha descubierto que el uso de pseudoprolina en el extremo C-terminal en el presente enfoque basado en fragmentos reduce eficazmente la cantidad de impurezas formadas, lo que lleva al procedimiento mejorado que es objeto de la presente invención. Tal método reduce sustancialmente la formación de impurezas de modo que el péptido en bruto obtenido puede purificarse fácilmente para dar el péptido final con un alto rendimiento total.Pseudoprolines were developed by Mutter in 1992 (T. Haack, M. Mutter, Serine derived oxazolidines as secondary structure disrupting, solubilizing building blocks in peptide synthesis, Tetrahedron Lett. 1992, 33, 1589-1592). Surprisingly, it has been found that the use of pseudoproline at the C-terminus in the present fragment-based approach effectively reduces the amount of impurities formed, leading to the improved process that is the subject of the present invention. Such a method substantially reduces the formation of impurities so that the crude peptide obtained can be easily purified to give the final peptide in high overall yield.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona los fragmentos peptídicos A y B requeridos y el método para prepararlos. Tal síntesis se realiza mediante SPPS convencional o mediante CSPPs , ambos mediante el uso de un sistema de reactivos de acoplamiento.In a further aspect, the present invention provides the requisite A and B peptide fragments and the method of preparing them. Such synthesis is carried out by conventional SPPS or by CSPPs, both through the use of a coupling reagent system.
El término “fragmento peptídico” o “fragmento” describe un péptido con una secuencia de aminoácidos parcial, con referencia a la secuencia de liraglutida o semaglutida. Puede unirse opcionalmente a una resina en su aminoácido C-terminal. Un fragmento peptídico puede estar protegido o no protegido. Un fragmento peptídico puede tener una pseudoprolina en su extremo C-terminal o en una posición interna en la secuencia de aminoácidos.The term "peptide fragment" or "fragment" describes a peptide with a partial amino acid sequence, with reference to the sequence of liraglutide or semaglutide. It can optionally be attached to a resin at its C-terminal amino acid. A peptide fragment may be protected or unprotected. A peptide fragment may have a pseudoproline at its C-terminus or at a position internal to the amino acid sequence.
El término “fragmento peptídico protegido” o “fragmento protegido” describe un fragmento peptídico que puede portar independientemente grupos protectores en sus cadenas laterales de aminoácidos, o grupos laterales, y/o en su grupo a -amino.The term "protected peptide fragment" or "protected fragment" describes a peptide fragment that can independently carry protecting groups on its amino acid side chains, or side groups, and/or on its a-amino group.
Un fragmento, o fragmento peptídico, también puede indicarse con una secuencia de aminoácidos específica, como aa1-aa2-...-aan A fragment, or peptide fragment, can also be indicated with a specific amino acid sequence, such as aa1-aa2-...-aan
en la que aaX es el código de tres letras del aminoácido en la posición x, y en la que no está definida la presencia o no de grupos protectores, o bien en las cadenas laterales o bien en el grupo a -amino. Se conoce en la técnica la necesidad de proteger las cadenas laterales de los aminoácidos durante la síntesis de péptidos en determinadas condiciones y se han descrito diversas estrategias para identificar estrategias de protección adecuadas.in which aaX is the three-letter code of the amino acid in position x, and in which the presence or absence of protecting groups is not defined, either in the side chains or in the a-amino group. The need to protect amino acid side chains during peptide synthesis under certain conditions is known in the art and various strategies have been described to identify suitable protection strategies.
Si en esta descripción para una secuencia de aminoácidos específica (fragmento) los grupos protectores de las cadenas laterales se mencionan específicamente entre paréntesis que acompañan al código de tres letras del aminoácido, se entiende que los aminoácidos restantes que se representan con un código de tres letras simple están desprotegidos.If in this description for a specific amino acid sequence (fragment) side chain protecting groups are specifically mentioned in parentheses accompanying the three-letter amino acid code, it is understood that the remaining amino acids that are represented by a three-letter code simple are checked out.
Cuando el fragmento se indica conWhen the fragment is indicated with
aa1-aa2-...-aan-OHaa1-aa2-...-aan-OH
se pretende que el aminoácido C-terminal aan tenga un ácido carboxílico libre.the C-terminal amino acid aan is intended to have a free carboxylic acid.
Cuando el fragmento se indica conWhen the fragment is indicated with
H-aa1-aa2-...-aanH-aa1-aa2-...-aan
se pretende que el aminoácido N-terminal aa1 tenga un grupo a -amino libre.the N-terminal aa1 amino acid is intended to have a free a-amino group.
Cuando el fragmento se indica conWhen the fragment is indicated with
aa1-aa2-...-aan(^z,zpro)-OHaa1-aa2-...-aan(^z,zpro)-OH
se pretende que el aminoácido C-terminal aan esté protegido con pseudoprolina y tenga un ácido carboxílico libre, según la siguiente estructura:the C-terminal amino acid aan is intended to be protected with pseudoproline and have a free carboxylic acid, according to the following structure:
en la que R1 es la cadena lateral de aa(n-1), y aan(^zzpro)-OH puede serwhere R 1 is the side chain of aa(n-1), and aan(^zzpro)-OH can be
Ser(^ zzpro)-OH, en la que Y es hidrógeno, y Z es hidrógeno o Me, oSer(^ zzpro)-OH, where Y is hydrogen, and Z is hydrogen or Me, or
Thr(^zzpro)-OH, en la que Y es Me, y Z es hidrógeno o Me.Thr(^zzpro)-OH, where Y is Me, and Z is hydrogen or Me.
Pseudoprolinas, como dipéptidos con a -amino protegido, están disponibles comercialmente. Por ejemplo, los siguientes dipéptidos de pseudoprolina se usan para llevar a cabo la presente invención:Pseudoprolines, as α-amino protected dipeptides, are commercially available. For example, the following pseudoproline dipeptides are used in carrying out the present invention:
P-Thr(fBu)-ser(v zzpro)8-OHP-Thr(fBu)-ser(v zzpro)8-OH
P-Val-Ser(^zzpro)11-OHP-Val-Ser(^zzpro)11-OH
P-Ser-Ser(^zzpro)12-OHP-Ser-Ser(^zzpro)12-OH
P-Phe-Thr(^zzpro)7-OHP-Phe-Thr(^zzpro)7-OH
P-Gly-Thr(^ zzpro)5-OHP-Gly-Thr(^ zzpro)5-OH
en los que P es un grupo protector de a -amino, y Z es tal como se definió anteriormente.wherein P is an α-amino protecting group, and Z is as defined above.
Preferiblemente, los dipéptidos de pseudoprolina usados para llevar a cabo la presente invención se seleccionan del grupo que consiste en: Preferably, the pseudoproline dipeptides used to carry out the present invention are selected from the group consisting of:
Fmoc-Thr(fBu)-Ser(V Me'Mepro)8-OHFmoc-Thr(fBu)-Ser(VMe'Mepro)8-OH
Fmoc-Thr(tBu)-Ser(y HHpro)8-OHFmoc-Thr(tBu)-Ser(and HHpro)8-OH
Fmoc-Val-Ser(y Me’Mepro)11-OHFmoc-Val-Ser(and Me'Mepro)11-OH
Fmoc-Val-Ser(^ HHpro)11-OHFmoc-Val-Ser(^HHpro)11-OH
Fmoc-Ser(tBu)-Ser(y MeMepro)12-OHFmoc-Ser(tBu)-Ser(and MeMepro)12-OH
Fmoc-Ser(tBu)-Ser(y HHpro)12-OHFmoc-Ser(tBu)-Ser(and HHpro)12-OH
Fmoc-Phe-Thr(y MeMepro)7-OHFmoc-Phe-Thr(and MeMepro)7-OH
Fmoc-Phe-Thr(y HHpro)7-OHFmoc-Phe-Thr(and HHpro)7-OH
Fmoc-Gly-Thr(^ MeMepro)5-OH yFmoc-Gly-Thr(^MeMepro)5-OH and
Fmoc-Gly-Thr(y HHpro)5-OHFmoc-Gly-Thr(and HHpro)5-OH
La introducción de pseudoprolinas en una secuencia peptídica puede realizarse en fase sólida en condiciones de acoplamiento convencionales. Una vez que el péptido se escinde de la resina por acidólisis, la pseudoprolina se hidroliza, proporcionando los dos aminoácidos nativos correspondientes.The introduction of pseudoprolines into a peptide sequence can be carried out on a solid phase under standard coupling conditions. Once the peptide is cleaved from the resin by acidolysis, the pseudoproline is hydrolyzed, yielding the two corresponding native amino acids.
El término “resina” o “soporte sólido” describe un polímero insoluble funcionalizado al que puede unirse un aminoácido o un fragmento peptídico y que es adecuado para la elongación de aminoácidos hasta que se obtiene la secuencia deseada completa.The term "resin" or "solid support" describes a functionalized insoluble polymer to which an amino acid or peptide fragment can be attached and which is suitable for the elongation of amino acids until the complete desired sequence is obtained.
La SPPS puede definirse como un procedimiento en el que un péptido anclado por su aminoácido C-terminal a una resina se ensambla mediante la adición secuencial de los aminoácidos opcionalmente protegidos que constituyen su secuencia. Comprende cargar un primer aminoácido, o péptido, o dipéptido de pseudoprolina con a -amino protegido tal como se definió anteriormente, en una resina y es seguido por la repetición de una secuencia de etapas denominada ciclo, o etapa de elongación, que consiste en la escisión del grupo protector de a -amino y el acoplamiento del aminoácido protegido subsiguiente.SPPS can be defined as a procedure in which a peptide anchored by its C-terminal amino acid to a resin is assembled by sequential addition of the optionally protected amino acids that constitute its sequence. It comprises loading a first amino acid, or peptide, or dipeptide of pseudoproline with α-amino protected as defined above, on a resin and is followed by the repetition of a sequence of steps called the cycle, or elongation step, consisting of the cleavage of the α-amino protecting group and subsequent protected amino acid attachment.
La formación de un enlace peptídico entre dos aminoácidos, o entre un aminoácido y un fragmento peptídico, o entre dos fragmentos peptídicos, puede implicar dos etapas. En primer lugar, la activación del grupo carboxilo libre durante un tiempo que oscila entre 5 minutos y 2 horas, luego el ataque nucleofílico del grupo amino en el grupo carboxílico activado.The formation of a peptide bond between two amino acids, or between an amino acid and a peptide fragment, or between two peptide fragments, may involve two steps. First, the activation of the free carboxyl group for a time ranging from 5 minutes to 2 hours, then the nucleophilic attack of the amino group on the activated carboxylic group.
El ciclo puede repetirse secuencialmente hasta que se logre la secuencia deseada del péptido.The cycle can be repeated sequentially until the desired peptide sequence is achieved.
Finalmente, se desprotege el péptido y/o se escinde de la resina.Finally, the peptide is deprotected and/or cleaved from the resin.
Como referencia para SPPS, véase, por ejemplo, Knud J. Jensen et al. (eds.), Peptide Synthesis and Applications, Methods in Molecular Biology, vol. 1047, Springer Science, 2013.As a reference for SPPS, see, for example, Knud J. Jensen et al. (eds.), Peptide Synthesis and Applications, Methods in Molecular Biology, vol. 1047, Springer Science, 2013.
En un aspecto preferido de la presente invención, se usa una resina sensible a los ácidos. Más preferiblemente, se selecciona de resina de Wang, resina de cloruro de 2-clorotritilo (CTC), resina de cloruro de tritilo, resina de MBH y de 4-MeO-BH. Más preferiblemente, la resina se selecciona de resina de Wang, resina de cloruro de 2-clorotritilo (CTC) y resina de cloruro de tritilo.In a preferred aspect of the present invention, an acid sensitive resin is used. More preferably, it is selected from Wang resin, 2-chlorotrityl chloride (CTC) resin, trityl chloride resin, MBH resin and 4-MeO-BH. More preferably, the resin is selected from Wang resin, 2-chlorotrityl chloride (CTC) resin and trityl chloride resin.
Incluso más preferiblemente, se usan las resinas de Wang y MBH para la preparación del fragmento B y, por tanto, están involucradas en el acoplamiento del fragmento A con el fragmento B. Incluso más preferiblemente, se usa la resina de Wang para la preparación del fragmento B y, por tanto, está involucrada en el acoplamiento del fragmento A con el fragmento B.Even more preferably, the resins of Wang and MBH are used for the preparation of fragment B and are therefore involved in the coupling of fragment A to fragment B. Even more preferably, the resin of Wang is used for the preparation of fragment B. fragment B and is therefore involved in the coupling of fragment A with fragment B.
Preferiblemente, se usa la resina de CTC para la preparación del fragmento A, y el fragmento A se escinde de la resina antes de acoplarse con el fragmento B.Preferably, CTC resin is used for the preparation of fragment A, and fragment A is cleaved from the resin prior to coupling with fragment B.
En un aspecto preferido de la presente invención, la carga del primer aminoácido C-terminal en la resina de Wang se lleva a cabo después de hinchar la resina en un disolvente adecuado, preferiblemente DMF, filtrar la resina y añadir a la resina la disolución del aminoácido protegido con un agente activador, tal como una carbodiimida, en presencia de una base, tal como dimetilaminopiridina (DMAP). En caso de usar una resina de cloruro de tritilo, y en particular la resina de CTC, después de hinchar la resina en un disolvente adecuado, preferiblemente DCM, y filtrar la resina, se añade una disolución del aminoácido protegido con una base orgánica, preferiblemente diisopropiletilamina (DIEA). En un aspecto preferido adicional de la presente invención, para la preparación del fragmento A, la primera etapa es la carga del dipéptido de pseudoprolina adecuado en la resina de CTC, después de hinchar la resina en un disolvente adecuado, preferiblemente DCM.In a preferred aspect of the present invention, loading of the first C-terminal amino acid into the Wang resin is carried out after swelling the resin in a suitable solvent, preferably DMF, filtering the resin, and adding the resin solution to the resin. amino acid protected with an activating agent, such as a carbodiimide, in the presence of a base, such as dimethylaminopyridine (DMAP). In case of using a trityl chloride resin, and in particular the CTC resin, after swelling the resin in a suitable solvent, preferably DCM, and filtering the resin, it is add a solution of the amino acid protected with an organic base, preferably diisopropylethylamine (DIEA). In a further preferred aspect of the present invention, for the preparation of fragment A, the first step is the loading of the appropriate pseudoproline dipeptide onto the CTC resin, after swelling the resin in a suitable solvent, preferably DCM.
En un aspecto preferido de la presente invención, después de cargar en la resina el primer aminoácido C-terminal o el dipéptido de pseudoprolina, se realiza una etapa adicional para bloquear los sitios sin reaccionar para evitar secuencias truncadas y cualquier reacción secundaria. Tal etapa a menudo se denomina “tapado”.In a preferred aspect of the present invention, after loading the first C-terminal amino acid or pseudoproline dipeptide onto the resin, an additional step is performed to block unreacted sites to prevent truncated sequences and any side reactions. Such a stage is often referred to as "capping."
El tapado se logra mediante un breve tratamiento de la resina cargada con un gran exceso de un reactivo sin impedimentos altamente reactivo, que se elige según los sitios sin reaccionar que va a taparse. Cuando se usa una resina de Wang, los sitios sin reaccionar son grupos hidroxilo, que preferiblemente se tapan mediante tratamiento con un derivado ácido, tal como un anhídrido, en un medio básico, por ejemplo, con una mezcla de DMF/DIEA/Ac2O, preferiblemente con una composición 17/2/1 v/v/v o con una composición 5/2/1 v/v/v, o con una disolución en DMF al 10% de Ac2O.Capping is accomplished by a brief treatment of the loaded resin with a large excess of a highly reactive unhindered reagent, which is chosen based on the unreacted sites to be capped. When a Wang resin is used, the unreacted sites are hydroxyl groups, which are preferably capped by treatment with an acid derivative, such as an anhydride, in a basic medium, for example, with a DMF/DIEA/Ac2O mixture, preferably with a 17/2/1 v/v/v composition or with a 5/2/1 v/v/v composition, or with a 10% Ac2O solution in DMF.
Cuando se usa una resina de CTC, los sitios sin reaccionar son cloros, que preferiblemente se tapan mediante tratamiento con un alcohol en un medio básico, por ejemplo, con una mezcla de DCM/DIEA/MeOH, preferiblemente con una composición 17/2/1 v/v/v. Luego, después de lavar con DCM, la resina se trata adicionalmente con mezcla de DCM/DIEA/Ac2O, preferiblemente con una composición 17/2/1 v/v/v, para tapar los grupos hidroxilo posiblemente resultantes de la hidrólisis de cloro.When using a CTC resin, the unreacted sites are chloros, which are preferably capped by treatment with an alcohol in a basic medium, for example with a DCM/DIEA/MeOH mixture, preferably with a 17/2/ 1 v/v/v. Then, after washing with DCM, the resin is further treated with DCM/DIEA/Ac2O mixture, preferably with a 17/2/1 v/v/v composition, to cap hydroxyl groups possibly resulting from chlorine hydrolysis.
Como alternativa a la carga del primer aminoácido C-terminal, se usan resinas precargadas en la preparación de fragmentos peptídicos. Estas son resinas de Wang/CTC comercialmente disponibles con L- o D-aminoácidos protegidos con Fmoc unidos. Por consiguiente, por ejemplo, la resina Fmoc-Gly de Wang se usa preferiblemente para la síntesis del fragmento B, y la resina Fmoc-pseudoprolina puede usarse para la síntesis del fragmento A. En un aspecto preferido de la presente invención, la carga del primer aminoácido C-terminal en la resina se determina espectrofotométricamente, tal como se describe, por ejemplo, en Knud J. Jensen et al. (eds.), Peptide Synthesis and Applications, Methods in Molecular Biology, vol. 1047, Springer Science, 2013.As an alternative to loading the first C-terminal amino acid, preloaded resins are used in the preparation of peptide fragments. These are commercially available Wang/CTC resins with attached Fmoc-protected L- or D-amino acids. Therefore, for example, Wang's Fmoc-Gly resin is preferably used for the synthesis of fragment B, and Fmoc-pseudoproline resin can be used for the synthesis of fragment A. In a preferred aspect of the present invention, charging of the The first C-terminal amino acid on the resin is determined spectrophotometrically, as described, for example, in Knud J. Jensen et al. (eds.), Peptide Synthesis and Applications, Methods in Molecular Biology, vol. 1047, Springer Science, 2013.
En un aspecto preferido de la presente invención, cada aminoácido puede protegerse en su grupo a -amino y/o en sus grupos funcionales de cadena lateral.In a preferred aspect of the present invention, each amino acid may be protected at its α-amino group and/or at its side chain functional groups.
Preferiblemente, el grupo protector de los grupos a -amino de los aminoácidos que se usa para la SPPS es del tipo carbamato. Los grupos protectores más preferidos son el grupo 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), que puede eliminarse en condiciones básicas, y el grupo terc-butiloxicarbonilo (Boc), que puede eliminarse en condiciones ácidas.Preferably, the protecting group of the α-amino groups of the amino acids that is used for the SPPS is of the carbamate type. The most preferred protecting groups are the 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) group, which can be removed under basic conditions, and the tert-butyloxycarbonyl (Boc) group, which can be removed under acidic conditions.
Los grupos funcionales de la cadena lateral de los aminoácidos se protegen opcionalmente con grupos que son generalmente estables durante las etapas de acoplamiento y durante la eliminación del grupo protector de a -amino, y que, a su vez, pueden retirarse en condiciones adecuadas. Tales condiciones adecuadas son generalmente opuestas a las condiciones en las que se desprotegen los grupos a -amino. Los grupos protectores de los grupos funcionales de la cadena lateral de los aminoácidos que se usan en la presente divulgación pueden eliminarse generalmente en condiciones ácidas opuestas a las condiciones básicas generalmente usadas para desproteger los grupos protectores Fmoc.The amino acid side chain functional groups are optionally protected with groups which are generally stable during the coupling steps and during removal of the α -amino protecting group, and which, in turn, can be removed under suitable conditions. Such suitable conditions are generally the opposite of the conditions under which the α-amino groups are deprotected. The protecting groups of the amino acid side chain functional groups used in the present disclosure can generally be removed under acidic conditions as opposed to the basic conditions generally used to deprotect Fmoc protecting groups.
En un aspecto preferido de la presente invención, tales grupos protectores de cadena lateral se especifican por aminoácido individual que se produce en la secuencia de análogo de GLP-1 relevante, tal como sigue:In a preferred aspect of the present invention, such side chain protecting groups are specified by individual amino acid occurring in the relevant GLP-1 analogue sequence, as follows:
el grupo arginina (Arg) guanidinio se protege preferiblemente mediante un grupo protector seleccionado del grupo que consiste en metoxi-2,3,6-trimetilbencenosulfonilo (Mtr), 2,2,5,7,8-pentametilcromanil-6-sulfonilo (Pmc) y 2,2,4,6,7-pentametil-dihidrobenzofuran-5-sulfonilo (Pbf), todos eliminables en condiciones ácidas; más preferiblemente, se usa el grupo Pbf;the arginine (Arg)guanidinium group is preferably protected by a protecting group selected from the group consisting of methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl (Mtr), 2,2,5,7,8-pentamethylchromanyl-6-sulfonyl (Pmc ) and 2,2,4,6,7-pentamethyl-dihydrobenzofuran-5-sulfonyl (Pbf), all eliminable under acidic conditions; more preferably, the Pbf group is used;
el grupo hidroxilo de serina (Ser), treonina (Thr) o tirosina (Tyr) se protege preferiblemente mediante un grupo seleccionado del grupo que consiste en tritilo (Trt), terc-butildimetilsililo (TBDMS) y terc-butilo (tBu); más preferiblemente, se usa el grupo tBu;the hydroxyl group of serine (Ser), threonine (Thr) or tyrosine (Tyr) is preferably protected by a group selected from the group consisting of trityl (Trt), tert-butyldimethylsilyl (TBDMS) and tert-butyl (tBu); more preferably, the group tBu is used;
el grupo carboxílico de ácido glutámico (Glu) o aspártico (Asp) se protege preferiblemente mediante un grupo seleccionado del grupo que consiste en 2-fenilisopropilo (2-Phi-Pr), éster tBu, éster bencílico (OBzl), éster alílico (OAII); más preferiblemente, se usa el éster tBu;the carboxylic group of glutamic (Glu) or aspartic (Asp) acid is preferably protected by a group selected from the group consisting of 2-phenylisopropyl (2-Phi-Pr), tBu ester, benzyl ester (OBzl), allyl ester (OAII ); more preferably, the tBu ester is used;
el nitrógeno de indol de triptófano (Trp) se protege preferiblemente mediante un grupo seleccionado del grupo que consiste en terc-butiloxicarbonilo (Boc), formilo (For); más preferiblemente, se usa el grupo terc-butiloxicarbonilo (Boc); the indole nitrogen of tryptophan (Trp) is preferably protected by a group selected from the group consisting of tert-butyloxycarbonyl (Boc), formyl (For); more preferably, the tert-butyloxycarbonyl (Boc) group is used;
el nitrógeno de imidazol de histidina (His) se protege preferiblemente mediante un grupo seleccionado del grupo que consiste en ferc-butiloxicarbonilo (Boc), monometoxitritilo (Mmt), 3-metoxibenciloximetilo (MBom), 2-clorotritilo (Clt), tritilo (Trt); más preferiblemente, se usa el grupo tritilo (Trt).the histidine imidazole nitrogen (His) is preferably protected by a group selected from the group consisting of ferrc-butyloxycarbonyl (Boc), monomethoxytrityl (Mmt), 3-methoxybenzyloxymethyl (MBom), 2-chlorotrityl (Clt), trityl (Trt ); more preferably, the trityl (Trt) group is used.
Se usan generalmente L-aminoácidos protegidos comercialmente disponibles. En cuanto a la introducción del resto de unión a albúmina lipófilo X2 en Lys20, en la preparación de liraglutida se usa el Fmoc-Lys(Pal-Glu-OfBu)-OH disponible comercialmente representado aquí a continuación:Commercially available protected L-amino acids are generally used. As for the introduction of the lipophilic albumin-binding moiety X 2 into Lys20, the commercially available Fmoc-Lys(Pal-Glu-OfBu)-OH depicted here below is used in the preparation of liraglutide:
En la preparación de semaglutida, se usa el derivado de lisina protegido representado aquí a continuación:In the preparation of semaglutide, the protected lysine derivative depicted here below is used:
Tal derivado está disponible comercialmente, y su preparación también se describe, por ejemplo, en el documento CN104356224. Tal derivado también se indica como Fmoc-Lys[(fBuOOC-(CH2)16-CO-yGlu-OfBu)-AEEA-AEEA]-OH, en la que AEEA representa 2-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]acetilo.Such a derivative is commercially available, and its preparation is also described, for example, in CN104356224. Such a derivative is also indicated as Fmoc-Lys[(fBuOOC-(CH 2 ) 16 -CO-yGlu-OfBu)-AEEA-AEEA]-OH, where AEEA represents 2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy] acetyl.
Los grupos protectores de ésteres tBu de los bloques de construcción del resto X2 son todos eliminables en condiciones ácidas y, por tanto, se escinden al final del procedimiento de preparación.The tBu ester protecting groups of the X 2 moiety building blocks are all removable under acidic conditions and are therefore cleaved at the end of the preparation process.
En un aspecto preferido de la presente invención, las etapas de acoplamiento se realizan en presencia de un reactivo de acoplamiento.In a preferred aspect of the present invention, the coupling steps are performed in the presence of a coupling reagent.
Preferiblemente, el reactivo de acoplamiento se selecciona del grupo que consiste en N-hidroxisuccinimida (NHS), N,N’-diisopropilcarbodiimida (DIC), N,N’-diciclohexilcarbodiimida (DCC), hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-iloxi)tripirrolidinofosfonio (PyBOP), hexafluorofosfato de 2-(7-aza-1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HATU), hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HBTU) y etildimetilaminopropilocarbodiimida (EDC). Más preferiblemente, la reacción se lleva a cabo en presencia de N,N’-diisopropilcarbodiimida.Preferably, the coupling reagent is selected from the group consisting of N-hydroxysuccinimide (NHS), N,N'-diisopropylcarbodiimide (DIC), N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC), (benzotriazol-1-yloxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP), 2-(7-aza-1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU), 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1 hexafluorophosphate ,1,3,3-tetramethyluronium (HBTU) and ethyldimethylaminopropylcarbodiimide (EDC). More preferably, the reaction is carried out in the presence of N,N'-diisopropylcarbodiimide.
En un aspecto preferido de la presente invención, las etapas de acoplamiento se realizan también en presencia de un aditivo. La presencia de un aditivo, cuando se usa en la reacción de acoplamiento, reduce la pérdida de configuración en el residuo de ácido carboxílico, aumenta las tasas de acoplamiento y reduce el riesgo de racemización.In a preferred aspect of the present invention, the coupling steps are also carried out in the presence of an additive. The presence of an additive, when used in the coupling reaction, reduces configuration loss at the carboxylic acid residue, increases coupling rates, and reduces the risk of racemization.
Preferiblemente, el aditivo se selecciona del grupo que consiste en 1-hidroxibenzotriazol (HOBt), N-óxido de 2-hidroxipiridina, N-hidroxisuccinimida (NHS), 1-hidroxi-7-azabenzotriazol (HOAt), endo-N-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboxamida, 5-(hidroxiimino)1,3-dimetilpirimidina-2,4,6-(1H,3H,5H)-triona (Oxyma-B) y 2-ciano-2-hidroxiiminoacetato de etilo (OxymaPure). Más preferiblemente, el aditivo se selecciona del grupo que consiste en 1-hidroxibenzotriazol (HOBt), N-óxido de 2-hidroxipiridina, N-hidroxisuccinimida (NHS), 1-hidroxi-7-azabenzotriazol (HOAt), endo-N-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboxamida, y 2-ciano-2-hidroxiimino-acetato de etilo (OxymaPure). Incluso más preferiblemente, la reacción se lleva a cabo en presencia de 2-ciano-2-hidroxiimino-acetato.Preferably, the additive is selected from the group consisting of 1-hydroxybenzotriazole (HOBt), 2-hydroxypyridine N-oxide, N-hydroxysuccinimide (NHS), 1-hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAt), endo-N-hydroxy- 5-norbornene-2,3-dicarboxamide, 5-(hydroxyimino)1,3-dimethylpyrimidine-2,4,6-(1H,3H,5H)-trione (Oxyma-B) and 2-cyano-2-hydroxyiminoacetate ethyl (OxymaPure). More preferably, the additive is selected from the group consisting of 1-hydroxybenzotriazole (HOBt), 2-hydroxypyridine N-oxide, N-hydroxysuccinimide (NHS), 1-hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAt), endo-N-hydroxy -5-norbornene-2,3-dicarboxamide, and ethyl 2-cyano-2-hydroxyimino-acetate (OxymaPure). Even more preferably, the reaction is carried out in the presence of 2-cyano-2-hydroxyimino-acetate.
En un aspecto preferido, las etapas de acoplamiento se realizan en presencia de un detergente. Los detergentes preferidos para el acoplamiento de fragmentos según la síntesis descrita son detergentes no iónicos, por ejemplo, Triton X-100 (también denominado TX-100 o terc-octilfenil éter de polietilenglicol) o Tween 20, y lo más preferiblemente Triton X-100. Por ejemplo, se usa TX-100 como disolución al 1% en DMF:DCM 50:50 v/v. In a preferred aspect, the coupling steps are carried out in the presence of a detergent. Preferred detergents for fragment coupling according to the described synthesis are nonionic detergents, for example, Triton X-100 (also called TX-100 or polyethylene glycol tert-octylphenyl ether) or Tween 20, most preferably Triton X-100 . For example, TX-100 is used as a 1% solution in DMF:DCM 50:50 v/v.
En un aspecto preferido de la presente invención, las etapas de acoplamiento se realizan en un disolvente seleccionado del grupo que consiste en DMF, DCM, t Hf , NMP, DMA o mezclas de los mismos. Más preferiblemente, el acoplamiento se lleva a cabo en DMF cuando se usa una resina de Wang, y se lleva a cabo en DCM cuando se usa una resina de CTC.In a preferred aspect of the present invention, the coupling steps are performed in a solvent selected from the group consisting of DMF, DCM, tHf , NMP, DMA, or mixtures thereof. More preferably, the coupling is carried out in DMF when using a Wang resin, and is carried out in DCM when using a CTC resin.
En un aspecto preferido de la presente invención, las etapas de acoplamiento se llevan a cabo a una temperatura que puede variar en el intervalo de 10-70°C. Preferiblemente, la temperatura varía en el intervalo de desde temperatura ambiente (es decir, 20°C) hasta 50°C, más preferiblemente la temperatura varía en el intervalo de 35-45°C, incluso más preferiblemente la etapa de acoplamiento se lleva a cabo a 40°C.In a preferred aspect of the present invention, the coupling steps are carried out at a temperature that can vary in the range of 10-70°C. Preferably the temperature ranges from room temperature (ie 20°C) to 50°C, more preferably the temperature ranges from 35-45°C, even more preferably the coupling step is carried out out at 40°C.
En un aspecto preferido de la presente invención, los grupos protectores de a -amino se escinden en condiciones básicas. En particular, el grupo protector Fmoc se escinde mediante tratamiento con una amina secundaria adecuada seleccionada del grupo que consiste en piperidina, pirrolidina, piperazina y DBU, preferiblemente piperidina. Más preferiblemente, se lleva a cabo desprotección de Fmoc usando una disolución al 20% de piperidina en DMF.In a preferred aspect of the present invention, the α-amino protecting groups are cleaved under basic conditions. In particular, the Fmoc protecting group is cleaved by treatment with a suitable secondary amine selected from the group consisting of piperidine, pyrrolidine, piperazine and DBU, preferably piperidine. More preferably, Fmoc deprotection is carried out using a 20% solution of piperidine in DMF.
En otro aspecto preferido de la presente invención, los grupos protectores de a -amino se escinden en condiciones ácidas. En particular, el grupo protector Boc se escinde mediante tratamiento con una disolución ácida fuerte, por ejemplo, con ácido trifluoroacético (TFA), ácido clorhídrico (HCI) o ácido fosfórico (H3PO4). Más preferiblemente, se lleva a cabo desprotección de Boc durante la escisión del péptido o fragmento peptídico de la resina mediante tratamiento con una mezcla basada en TFA, que se selecciona según el tipo de resina. Por ejemplo, se usa una mezcla de TFA/agua/fenol/TIS (v/v/v/v 88/5/5/2) para una resina de Wang, en la que TIS es un eliminador, tal como también se describe a continuación.In another preferred aspect of the present invention, the α-amino protecting groups are cleaved under acidic conditions. In particular, the Boc protecting group is cleaved by treatment with a strong acid solution, for example with trifluoroacetic acid (TFA), hydrochloric acid (HCl) or phosphoric acid (H3PO4). More preferably, Boc deprotection is carried out during cleavage of the peptide or peptide fragment from the resin by treatment with a TFA-based mixture, which is selected according to the type of resin. For example, a mixture of TFA/water/phenol/TIS (v/v/v/v 88/5/5/2) is used for a Wang resin, where TIS is a scavenger, as also described next.
En un aspecto preferido de la presente invención, una vez que el fragmento peptídico o péptido final deseado se ha obtenido según SPPS o CSPPS tal como se describió anteriormente y se une a su soporte sólido, se realiza la desprotección y/o escisión final de tal soporte sólido. Preferiblemente, tal etapa se realiza usando una mezcla específica individualizada para la resina usada, en condiciones ácidas o ligeramente ácidas.In a preferred aspect of the present invention, once the desired final peptide or peptide fragment has been obtained according to SPPS or CSPPS as described above and is attached to its solid support, final deprotection and/or cleavage of such is performed. solid support. Preferably, such a step is carried out using a specific mixture individualized for the resin used, under acidic or slightly acidic conditions.
Cuando se usa una resina de CTC, la etapa de escisión se realiza preferiblemente mediante tratamiento usando una mezcla de HFIP:DCM (30:70 v/v) o disolución de TFA al 1-2% v/v en DCM. En particular, cuando se usa una resina de CTC en la preparación del fragmento A u otro fragmento, tal escisión no elimina el grupo protector de a -amino ni los grupos protectores de cadena lateral, dando, por tanto, un fragmento completamente protegido, listo para reaccionar en su ácido carboxílico C-terminal libre.When using a CTC resin, the cleavage step is preferably performed by treatment using a mixture of HFIP:DCM (30:70 v/v) or 1-2% v/v TFA solution in DCM. In particular, when a CTC resin is used in the preparation of fragment A or another fragment, such cleavage does not remove the α-amino protecting group or side chain protecting groups, thus giving a fully protected, ready fragment. to react into its free C-terminal carboxylic acid.
Cuando se usa una resina de Wang, el tratamiento con una mezcla de escisión, que comprende TFA y eliminadores, proporciona tanto la desprotección de cadenas laterales, incluyendo desprotección del resto X2, como la escisión de la resina. En particular, cuando se usa una resina de Wang en la preparación del fragmento B, la escisión final produce el análogo de GLP-1 en bruto. Los eliminadores son sustancias, tales como, por ejemplo, anisol, tioanisol, triisopropilsilano (TIS), 1,2-etanoditiol y fenol, que pueden minimizar la modificación o destrucción de las cadenas laterales sensibles desprotegidas, tales como las de los residuos de arginina, en el entorno de escisión. Tal paso de escisión/desprotección se realiza preferiblemente usando una mezcla de TFA/tioanisol/anisol/dodecanotiol, por ejemplo, con una composición v/v/v/v 90/5/2/3, o una mezcla de TFA/agua/fenol/TIS, por ejemplo, con v/v/v/v 88/5/5/2.When using a Wang resin, treatment with a cleavage mixture, comprising TFA and scavengers, provides for both side chain deprotection, including deprotection of the X2 moiety, and cleavage from the resin. In particular, when a Wang resin is used in the preparation of fragment B, the final cleavage produces the crude GLP-1 analog. Scavengers are substances, such as, for example, anisole, thioanisole, triisopropylsilane (TIS), 1,2-ethanedithiol, and phenol, that can minimize the modification or destruction of sensitive unprotected side chains, such as those of arginine residues. , in the cleavage environment. Such a cleavage/deprotection step is preferably performed using a TFA/thioanisole/anisole/dodecanethiol mixture, for example with a composition v/v/v/v 90/5/2/3, or a TFA/water/ phenol/TIS, for example, with v/v/v/v 88/5/5/2.
En un aspecto preferido de la presente invención, el péptido en bruto obtenido mediante escisión de la resina ya sea un fragmento o un análogo de GLP-1 final, se purifica para aumentar su pureza.In a preferred aspect of the present invention, the crude peptide obtained by cleavage from the resin, whether it is a final GLP-1 fragment or analog, is purified to increase its purity.
Para este fin, se carga una disolución del péptido en una columna de HPLC con una fase estacionaria adecuada, preferiblemente sílice modificada C18 o C8, y se hace pasar a través de la columna una fase móvil acuosa que comprende un disolvente orgánico, preferiblemente acetonitrilo o metanol. Se aplica un gradiente de la fase móvil, si es necesario. El péptido con la pureza deseada se recoge y, opcionalmente, se liofiliza.For this purpose, a solution of the peptide is loaded onto an HPLC column with a suitable stationary phase, preferably C18 or C8 modified silica, and an aqueous mobile phase comprising an organic solvent, preferably acetonitrile or methanol. A mobile phase gradient is applied, if necessary. Peptide with the desired purity is collected and optionally lyophilized.
Por consiguiente, la presente invención proporciona un método convergente para la preparación de liraglutida o semaglutida en síntesis en fase sólida, en el que el método comprende el acoplamiento final de al menos un fragmento A de pseudoprolina N-terminal protegido con un fragmento B C-terminal protegido, seguido de desprotección simultánea o secuencial y escisión a partir del soporte sólido, y opcionalmente purificación final por cromatografía.Accordingly, the present invention provides a convergent method for the preparation of liraglutide or semaglutide in solid phase synthesis, wherein the method comprises final coupling of at least one N-terminal protected pseudoproline fragment A with a C-fragment B. capped end, followed by simultaneous or sequential deprotection and cleavage from the solid support, and optionally final purification by chromatography.
La presente invención proporciona además fragmentos intermedios A y B y métodos para su preparación.The present invention further provides intermediate fragments A and B and methods for their preparation.
En un aspecto, el fragmento A es un fragmento N-terminal del péptido análogo de GLP-1 deseado, que tiene una pseudoprolina en el sitio reactivo C-terminal. En un aspecto preferido, el fragmento A está protegido en su grupo a -amino, incluso más preferiblemente con un grupo Boc. En otro aspecto preferido, el fragmento A está protegido en sus grupos funcionales de cadena lateral con grupos protectores adecuados. In one aspect, fragment A is an N-terminal fragment of the desired GLP-1 analog peptide, having a pseudoproline at the C-terminal reactive site. In a preferred aspect, fragment A is protected at its a-amino group, even more preferably with a Boc group. In another preferred aspect, fragment A is protected at its side chain functional groups with suitable protecting groups.
El fragmento A se selecciona del grupo que consiste en:Fragment A is selected from the group consisting of:
His-Xi-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser(vzzpro), denominado fragmento A (1-8),His-Xi-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser(vzzpro), called fragment A (1-8),
His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(^z’zpro), denominado fragmento A (1-11),His-X 1 -Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(^z'zpro), designated fragment A (1-11),
His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser(^zzpro), denominado fragmento A (1-12),His-X 1 -Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser(^zzpro), called fragment A (1-12),
His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr(^zzpro), denominado fragmento A (1-7),His-X 1 -Glu-Gly-Thr-Phe-Thr(^zzpro), called fragment A (1-7),
yand
His-X1-Glu-Gly-Thr(^zzpro), denominado fragmento A (1-5)His-X 1 -Glu-Gly-Thr(^zzpro), called fragment A (1-5)
en los que X1 es Ala para liraglutida y Aib para semaglutida, ywhere X 1 is Ala for liraglutide and Aib for semaglutide, and
en los que (^zzpro) indica la pseudoprolina usada, y tiene el significado tal como se definió anteriormente. Preferiblemente, el fragmento A se selecciona del grupo que consiste enwherein (^zzpro) indicates the pseudoproline used, and has the meaning as defined above. Preferably, fragment A is selected from the group consisting of
Boc-His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser(^MeMepro),Boc-His-X 1 -Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser(^MeMepro),
Boc-His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(^MeMepro),Boc-His-X 1 -Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(^MeMepro),
Boc-His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser(^MeMepro),Boc-His-X 1 -Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser(^MeMepro),
Boc-His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr(^MeMepro)Boc-His-X 1 -Glu-Gly-Thr-Phe-Thr(^MeMepro)
yand
Boc-His-X1-Glu-Gly-Thr(yMe,Mepro),Boc-His-X 1 -Glu-Gly-Thr(yMe,Mepro),
en los que X1 y (^MeMepro) son tal como se definieron anteriormente.where X 1 y (^MeMepro) are as defined above.
Más preferiblemente, para la preparación de liraglutida, el fragmento A se selecciona del grupo que consiste en: Boc-His(Trt)1-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(yMeMepro)8-OH,More preferably, for the preparation of liraglutide, fragment A is selected from the group consisting of: Boc-His(Trt)1-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser (yMeMepro)8-OH,
Boc-His(Trt)1-Ala-Glu(OfBu)-Gly-Thr(f-Bu)-Phe-Thr(f-Bu)-Ser(f-Bu)-Asp(Of'Bu)-Val-Ser(njMe'Mepro)11-OH,Boc-His(Trt)1-Ala-Glu(OfBu)-Gly-Thr(f-Bu)-Phe-Thr(f-Bu)-Ser(f-Bu)-Asp(Of'Bu)-Val-Ser (njMe'Mepro)11-OH,
Boc-His(Trt)1-Ala-Glu(OfBu)-Gly-Thr(f-Bu)-Phe-Thr(f-Bu)-Ser(f-Bu)-Asp(Of'Bu)-Val-Ser(f-Bu)-Ser(njMe'Mepro)12-OH,Boc-His(Trt)1-Ala-Glu(OfBu)-Gly-Thr(f-Bu)-Phe-Thr(f-Bu)-Ser(f-Bu)-Asp(Of'Bu)-Val-Ser (f-Bu)-Ser(njMe'Mepro)12-OH,
Boc-His(Trt)1-Ala-Glu(OfBu)-Gly-Thr(fBu)-Phe-Thr(^MeMepro)7-OH,Boc-His(Trt)1-Ala-Glu(OfBu)-Gly-Thr(fBu)-Phe-Thr(^MeMepro)7-OH,
Boc-His(Trt)1-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(^MeMepro)5-OH,Boc-His(Trt)1-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(^MeMepro)5-OH,
Boc-His(Trt)1-Aib-Glu(OfBu)-Gly-Thr(fBu)-Phe-Thr(fBu)-Ser(yMeMepro)8-OH,Boc-His(Trt)1-Aib-Glu(OfBu)-Gly-Thr(fBu)-Phe-Thr(fBu)-Ser(yMeMepro)8-OH,
Boc-His(Trt)1-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(f-Bu)-Phe-Thr(f-Bu)-Ser(f-Bu)-Asp(Of'Bu)-Val-Ser(njMe'Mepro)11-OH,Boc-His(Trt)1-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(f-Bu)-Phe-Thr(f-Bu)-Ser(f-Bu)-Asp(Of'Bu)-Val-Ser (njMe'Mepro)11-OH,
Boc-His(Trt)1-Aib-Glu(Oí'Bu)-Gly-Thr(í'Bu)-Phe-Thr(í'Bu)-Ser(í'Bu)-Asp(OfBu)-\/al-Ser(í'Bu)-Ser(njMe'Mepro)12-OH,Boc-His(Trt)1-Aib-Glu(Oí'Bu)-Gly-Thr(í'Bu)-Phe-Thr(í'Bu)-Ser(í'Bu)-Asp(OfBu)-\/al -Ser(í'Bu)-Ser(njMe'Mepro)12-OH,
Boc-His(Trt)1-Aib-Glu(OfBu)-Gly-Thr(fBu)-Phe-Thr(^MeMepro)7-OH, yBoc-His(Trt)1-Aib-Glu(OfBu)-Gly-Thr(fBu)-Phe-Thr(^MeMepro)7-OH, and
Boc-His(Trt)1-Aib-Glu(OfBu)-Gly-Thr(^MeMepro)5-OH.Boc-His(Trt)1-Aib-Glu(OfBu)-Gly-Thr(^MeMepro)5-OH.
Incluso más preferiblemente, el fragmento A es Even more preferably, fragment A is
Boc-His(Trt)1-Ala-Glu(OfBu)-Gly-Thr(fBu)-Phe-Thr(fBu)-Ser(^ Me’Mepro)8-OH, también denominado fragmento 4, que es una forma especificada del fragmento A (1-8).Boc-His(Trt)1-Ala-Glu(OfBu)-Gly-Thr(fBu)-Phe-Thr(fBu)-Ser(^ Me'Mepro)8-OH, also called fragment 4, which is a specified form from fragment A (1-8).
En otra realización, en la que se pretende la preparación de semaglutida, el fragmento A es preferiblemente Boc-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser(y MeMepro)In another embodiment, where the preparation of semaglutide is intended, fragment A is preferably Boc-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser(and MeMepro)
e incluso más preferiblementeand even more preferably
Boc-His(Trt)1-Aib-Glu(OfBu)-Gly-Thr(fBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(^ MeMepro)8-OH, también denominado fragmento 7, que es una forma especificada del fragmento A (1-8).Boc-His(Trt)1-Aib-Glu(OfBu)-Gly-Thr(fBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(^MeMepro)8-OH, also called fragment 7, which is a specified form of the fragment A(1-8).
El fragmento A se prepara o bien mediante SPPS por etapas o bien mediante LPPS. Por ejemplo, el fragmento A se prepara en fase sólida comenzando con la carga en una resina del dipéptido de pseudoprolina C-terminal adecuado, por ejemplo, Fmoc-Thr(tBu)-Ser(^ MeMepro)8-OH, y el posterior alargamiento de la cadena peptídica acoplando los aminoácidos de secuencia uno a uno, alternando etapas de acoplamiento y de desprotección del grupo a -amino. Preferiblemente, se usa SPPS de Fmoc por etapas en una resina de CTC en la preparación del fragmento A, y la síntesis se completa usando un último aminoácido protegido con Boc, es decir, Boc-His(Trt)-OH. Una vez se ha completado su secuencia, el fragmento A se escinde del soporte sólido mientras conserva tanto el grupo a -amino como los grupos protectores de cadena lateral.Fragment A is prepared either by stepwise SPPS or by LPPS. For example, fragment A is prepared on a solid phase by starting with loading onto a resin the appropriate C-terminal pseudoproline dipeptide, eg, Fmoc-Thr(tBu)-Ser(^MeMepro)8-OH, and subsequent elongation. of the peptide chain coupling the amino acids of sequence one by one, alternating stages of coupling and deprotection of the a-amino group. Preferably, stepwise Fmoc SPPS on a CTC resin is used in the preparation of fragment A, and the synthesis is completed using a Boc-protected last amino acid, ie, Boc-His(Trt)-OH. Upon completion of its sequencing, fragment A is excised from the solid support while retaining both the α-amino group and side chain protecting groups.
Como ejemplos para la preparación del fragmento A, la preparación del fragmento 4 y del fragmento 7 se describen en los ejemplos de la presente divulgación.As examples for the preparation of fragment A, the preparation of fragment 4 and fragment 7 are described in the examples of the present disclosure.
De manera análoga, todos los fragmentos A definidos anteriormente se preparan de manera similar.Similarly, all of the A fragments defined above are prepared in a similar manner.
En otra realización, el fragmento B es un fragmento C-terminal del péptido de análogo de GLP-1 deseado, unido a un soporte sólido, que es preferiblemente una resina de Wang. En otras realizaciones preferidas, el soporte sólido es una resina de MBH.In another embodiment, fragment B is a C-terminal fragment of the desired GLP-1 analog peptide, attached to a solid support, which is preferably a Wang resin. In other preferred embodiments, the solid support is a MBH resin. .
El fragmento B se selecciona del grupo que consiste enFragment B is selected from the group consisting of
Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2 )-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-resina de Wang,Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X 2 )-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly- wang Resin,
Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2 )-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-resina de Wang,Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X 2 )-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-Wang's resin,
Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2 )-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-resina de Wang,Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X 2 )-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-Wang's resin,
Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2 )-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu--Val-Arg-Gly-Arg-Gly-resina de Wang, Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X 2 )-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu--Val-Arg-Gly-Arg -Wang's Gly-resin,
yand
Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2 )-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly- resina de Wang, en los quePhe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X 2 )-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg- Gly-Arg-Gly- resin of Wang, in which
X2 es N-(1-oxohexadecil)-L-y-glutamilo (Pal-Glu) para la síntesis de liraglutida, yX2 is N-(1-oxohexadecyl)-L-y-glutamyl (Pal-Glu) for the synthesis of liraglutide, and
X2 es N-(17-carboxi-1-oxoheptadecil)-L-y-glutamil-2-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]acetil-2-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]acetilo para la síntesis de semaglutida.X2 is N-(17-carboxy-1-oxoheptadecyl)-L-y-glutamyl-2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]acetyl-2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]acetyl for the synthesis of semaglutide .
Preferiblemente, para la preparación de liraglutida, el fragmento B se selecciona del grupo que consiste en H-Asp(OtBu)9-Val-Ser(tBu)-Ser(fBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OtBu)-Glu(OfBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(NínBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-res¡na de Wang,Preferably, for the preparation of liraglutide, fragment B is selected from the group consisting of H-Asp(OtBu)9-Val-Ser(tBu)-Ser(fBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OtBu )-Glu(OfBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(NínBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-res¡na de Wang,
también denominado fragmento 3, also called fragment 3,
H-Ser(tBu)-Tyr(íBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OfBu)-Glu(OíBu)-Phe-Ile-Ala-Trp([\rBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-resinadeWang, H-Ser(tBu)-Tyr(íBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OfBu)-Glu(OíBu)-Phe-Ile-Ala- Trp([\rBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-resin of Wang,
H-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(N,nBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-res¡na de Wang, H-Ser(tBu)-Asp(OtBu)9-Val-Ser(tBu)-Ser(íBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OfBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(N/í’Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-resina de Wang H-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(N,nBoc )-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-Wang resin, H-Ser(tBu)-Asp(OtBu)9-Val-Ser(tBu)-Ser(íBu) -Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OfBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(N/í' Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-Wang's resin
yand
H-Phe-Thr(fBu)-Ser(tBu)-Asp(0fBu)9-Val-Ser(íBu)-Ser(tBu)-Tyr(fBu)-Leu-G lu(0tBu)-G ly16-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(N"IBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg( Pbf)-Gly31-resinade Wang.H-Phe-Thr(fBu)-Ser(tBu)-Asp(0fBu)9-Val-Ser(íBu)-Ser(tBu)-Tyr(fBu)-Leu-G lu(0tBu)-Gly16-Gln( Trt)-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(N"IBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg( Pbf)- Gly31-resin from Wang.
Incluso más preferiblemente, para la preparación de liraglutida, el fragmento B es:Even more preferably, for the liraglutide preparation, fragment B is:
H-Asp(OfBu)9-Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OfBu)-Glu(OfBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(N'nBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-resina de Wang,H-Asp(OfBu)9-Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OfBu )-Glu(OfBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(N'nBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-Wang resin,
también denominado fragmento 3, que es una forma especificada del fragmento B (9-31).also called fragment 3, which is a specified form of fragment B (9-31).
En otra realización en la que se pretende la preparación de semaglutida, el fragmento B es preferiblemente Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys[(ROOC-(CH2)i6-CO-yGlu-OR0-AEEA-AEEA]-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-resina,In another embodiment where preparation of semaglutide is intended, fragment B is preferably Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys[(ROOC-(CH2)i6- CO-yGlu-OR0-AEEA-AEEA]-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-resin,
en el que R y R', iguales o diferentes, son grupos protectores de ácido carboxílico, preferiblemente ésteres; más preferiblemente el fragmento B eswherein R and R', the same or different, are carboxylic acid protecting groups, preferably esters; more preferably fragment B is
H-Asp(OfBu)9-Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys[(fBuOOC-(CH2)16-CO-yGlu-OfBu)-AEEA-AEEA]-Glu-(OfBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(NmBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-resina de MBH, también denominado fragmento 6, que es una forma especificada del fragmento B (9-31).H-Asp(OfBu) 9 -Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys[(fBuOOC-(CH2 )16-CO-yGlu-OfBu)-AEEA-AEEA]-Glu-(OfBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(NmBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly 31 -MBH resin, also called fragment 6, which is a specified form of fragment B (9-31).
El fragmento B se prepara o bien mediante SPPS por etapas o mediante CSPPS, o bien mediante LPPS. Por ejemplo, el fragmento B se prepara en fase sólida comenzando con la carga en la resina del aminoácido C-terminal protegido, es decir Gly31, y el posterior alargamiento de la cadena peptídica acoplando los aminoácidos de secuencia uno a uno, alternando etapas de acoplamiento y de desprotección de grupo a -amino. Alternativamente, el fragmento B se prepara mediante CSPPS acoplando dos o más fragmentos peptídicos.Fragment B is prepared either by stepwise SPPS or by CSPPS, or by LPPS. For example, fragment B is prepared in solid phase starting with the loading on the resin of the protected C-terminal amino acid, that is to say Gly 31 , and the subsequent elongation of the peptide chain by coupling the sequence amino acids one by one, alternating steps of coupling and deprotection of a -amino group. Alternatively, fragment B is prepared by CSPPS by coupling two or more peptide fragments.
En una realización preferida de la presente invención, la preparación del fragmento B comprende acoplar el fragmento C N-terminal adecuado al fragmento D C-terminal, según el esquema 2: In a preferred embodiment of the present invention, the preparation of fragment B comprises coupling the appropriate N-terminal fragment C to the C-terminal fragment D, according to scheme 2:
fragmento C-COOH NF^-fragmento D-soporte sólidofragment C-COOH NF^-fragment D-solid support
NH^-fragmento B - soporte sólidoNH^-fragment B - solid support
El fragmento D está unido a un soporte sólido a través de Gly31 y está protegido preferiblemente en sus cadenas laterales de aminoácidos. En una realización preferida de la presente invención, el fragmento D esFragment D is attached to a solid support via Gly 31 and is preferably protected on its amino acid side chains. In a preferred embodiment of the present invention, fragment D is
Gln17-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly31-resina, también denominado fragmento D (17 31) o SEQ ID NO: 13.Gln 17 -Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly 31 -resin, also called fragment D(17 31) or SEQ ID NO: 13.
El fragmento C es un fragmento adecuado seleccionado del grupo que consiste en:Fragment C is a suitable fragment selected from the group consisting of:
Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly, denominado fragmento C (9-16) o SEQ ID NO: 14,Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly, designated fragment C(9-16) or SEQ ID NO: 14,
Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly, denominado fragmento C (12-16) o SEQ ID NO: 15,Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly, designated fragment C(12-16) or SEQ ID NO: 15,
Tyr-Leu-Glu-Gly, denominado fragmento C (13-16) o SEQ ID NO: 16,Tyr-Leu-Glu-Gly, designated fragment C(13-16) or SEQ ID NO: 16,
Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly, denominado fragmento C (8-16) o SEQ ID NO: 17,Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly, designated fragment C(8-16) or SEQ ID NO: 17,
yand
Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly, denominado fragmento C (6-16) o SEQ ID NO: 18.Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly, designated fragment C(6-16) or SEQ ID NO: 18.
El fragmento C tiene una glicina C-terminal que se hace reaccionar de manera conveniente para formar el enlace amida requerido en las condiciones comentadas anteriormente. El fragmento C también está preferiblemente protegido en sus cadenas laterales de aminoácidos y en su grupo a -amino.Fragment C has a C-terminal glycine which is conveniently reacted to form the required amide bond under the conditions discussed above. Fragment C is also preferably protected at its amino acid side chains and at its a-amino group.
El fragmento C se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en:Fragment C is preferably selected from the group consisting of:
Fmoc-Asp(OfBu)9-Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-OH,Fmoc-Asp(OfBu) 9 -Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly 16 -OH,
Fmoc-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-OH,Fmoc-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly 16 -OH,
Fmoc-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-OH,Fmoc-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly 16 -OH,
Fmoc-Ser(fBu)-Asp(OfBu)9-Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-OHFmoc-Ser(fBu)-Asp(OfBu) 9 -Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly 16 -OH
yand
Fmoc-Phe-Thr(fBu)-ser(fBu)-Asp(OfBu)9-Val-ser(fBu)-ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-OH.Fmoc-Phe-Thr(fBu)-ser(fBu)-Asp(OfBu) 9 -Val-ser(fBu)-ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly 16 -OH.
Lo más preferiblemente, el fragmento C esMost preferably, fragment C is
Fmoc-Asp(OfBu)9-Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-OH, también denominado fragmento 2.Fmoc-Asp(OfBu) 9 -Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly 16 -OH, also called fragment 2.
Tal fragmento C se usa convenientemente para la preparación de tanto liraglutida como semaglutida, tal como se describirá en los ejemplos de la presente divulgación.Such fragment C is conveniently used for the preparation of both liraglutide and semaglutide, as will be described in the examples of the present disclosure.
En una realización más preferida de la presente invenciónIn a more preferred embodiment of the present invention
Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-resina de Wang se obtiene mediante una estrategia de acoplamiento de fragmento C (9-16) fragmento D (17-31), preferiblemente acoplandoAsp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-resin of Wang is obtained by a fragment C (9-16) fragment D (17-31) docking strategy, preferably docking
Asp9-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly16-OHAsp 9 -Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly 16 -OH
con with
H-Gln-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly31resinaH-Gln-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly 31 resin
en la quein which
X2 es N-(1-oxohexadecil)-L-y-glutamilo para la síntesis de liraglutida, yX2 is N-(1-oxohexadecyl)-L-y-glutamyl for the synthesis of liraglutide, and
X2 es N-(17-carboxi-1-oxoheptadecil)-L-y-glutamil-2-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]acetil-2-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]acetilo para la síntesis de semaglutida;X2 is N-(17-carboxy-1-oxoheptadecyl)-L-y-glutamyl-2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]acetyl-2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]acetyl for the synthesis of semaglutide ;
y en la que la resina preferiblemente es una resina de Wang.and wherein the resin is preferably a Wang resin.
En una realización incluso más preferida, si se pretende la preparación de liraglutida, se obtiene el fragmento 3 preferido (es decir, H-Asp(OfBu)9-Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OfBu)-Glu(OfBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(N'"Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-resina de Wang) mediante una estrategia de acoplamiento de fragmento C (9-16) fragmento D (17-31), preferiblemente acoplandoIn an even more preferred embodiment, if preparation of liraglutide is intended, the preferred fragment 3 is obtained (ie, H-Asp(OfBu) 9 -Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)- Leu-Glu(OtBu)-Gly 16 -Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OfBu)-Glu(OfBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(N'"Boc)-Leu-Val -Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly 31 -Wang's resin) by a fragment C (9-16) fragment D (17-31) coupling strategy, preferably coupling
Fmoc-Asp(OfBu)9-Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OfBu)-Gly16-OH (fragmento 2) conFmoc-Asp(OfBu) 9 -Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OfBu)-Gly 16 -OH (fragment 2) with
H-Gln(Trt)17-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OfBu)-Glu-(OfBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(NmBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-resina de Wang, fragmento 1, un fragmento especificado D (17-31).H-Gln(Trt) 17 -Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OfBu)-Glu-(OfBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(NmBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg (Pbf)-Gly 31 -Wang's resin, fragment 1, a specified fragment D (17-31).
Luego, el fragmento B con a -amino protegido (9-31) así obtenido se trata para escindir el grupo Fmoc en condiciones básicas tal como se describió anteriormente para proporcionar el fragmento 3 tal como se definió.Then, the α-amino protected fragment B (9-31) thus obtained is treated to cleave the Fmoc group under basic conditions as described above to give fragment 3 as defined.
En otra realización preferida, si se pretende la preparación de semaglutida, se obtiene el fragmento 6 preferido (es decir, H-Asp(OfBu)9-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys[(fBuOOC-(CH2)16-CO-yGlu-OfBu)-AEEA-AEEA]-Glu-(OfBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(N'"Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-resina de MBH) mediante una estrategia de acoplamiento de fragmento C (9-16) fragmento D (17-31), preferiblemente acoplando Fmoc-Asp(OfBu)9-Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OfBu)-Gly16-OH (fragmento 2)In another preferred embodiment, if preparation of semaglutide is intended, preferred fragment 6 is obtained (ie, H-Asp(OfBu) 9 -Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu- Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys[(fBuOOC-(CH2)16-CO-yGlu-OfBu)-AEEA-AEEA]-Glu-(OfBu)-Phe-Ile-Ala- Trp(N'"Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly 31 -MBH resin) using a fragment C (9-16) fragment D (17-31) docking strategy ), preferably coupling Fmoc-Asp(OfBu) 9 -Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OfBu)-Gly 16 -OH (fragment 2)
conwith
H-Gln(Trt)17-Ala-Ala-Lys[(fBuOOC-(CH2)16-CO-yGlu-OfBu)-AEEA-AEEA]-Glu(OfBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(NmBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-O-resina de MBH, fragmento 5, un fragmento especificado D (17-31).H-Gln(Trt) 17 -Ala-Ala-Lys[(fBuOOC-(CH2)16-CO-yGlu-OfBu)-AEEA-AEEA]-Glu(OfBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(NmBoc)- Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly 31 -O-MBH resin, fragment 5, a specified fragment D(17-31).
Luego, el fragmento B con a -amino protegido (9-31) así obtenido se trata para escindir el grupo Fmoc en condiciones básicas tal como se describió anteriormente para proporcionar el fragmento 6 tal como se definió anteriormente.Then, the α-amino protected fragment B (9-31) thus obtained is treated to cleave the Fmoc group under basic conditions as described above to give fragment 6 as defined above.
Como ejemplo para la preparación del fragmento B, la preparación del fragmento 3 y del fragmento 6 se describen en los ejemplos de la presente divulgación, incluyendo la preparación del fragmento 1, fragmento 5 y fragmento 2. De manera análoga, todos los fragmentos B definidos anteriormente se preparan acoplando un fragmento C adecuado y un fragmento D adecuado tal como se definió anteriormente.As an example for the preparation of fragment B, the preparation of fragment 3 and fragment 6 are described in the examples of the present disclosure, including the preparation of fragment 1, fragment 5 and fragment 2. Analogously, all defined fragment Bs above are prepared by coupling a suitable fragment C and a suitable fragment D as defined above.
La realización más preferida del método para preparar liraglutida es un método según la reivindicación 1 en el que: el fragmento A es His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser(y zzpro), denominado fragmento A (1-8), más preferiblemente Boc-His(Trt)1-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(^ MeMepro)8-OH, también denominado fragmento 4; y el fragmento B es Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-resina, denominado fragmento B (9-31),The most preferred embodiment of the method for preparing liraglutide is a method according to claim 1 wherein: fragment A is His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser(y zzpro), referred to as fragment A(1- 8), more preferably Boc-His(Trt) 1 -Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(^MeMepro) 8 -OH, also referred to as fragment 4; and fragment B is Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg- Gly-Arg-Gly-resin, designated fragment B(9-31),
más preferiblemente H-Asp(OfBu)9-Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OfBu)-Gly16-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OfBu)-Glu(OfBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(N'"Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-resina de Wang, también denominado fragmento 3.more preferably H-Asp(OfBu) 9 -Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OfBu)-Gly 16 -Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Pal- Glu-OfBu)-Glu(OfBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(N'"Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly 31 -Wang resin, also called fragment 3.
Lo más preferido en esta configuración es que el fragmento C sea Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly, denominado fragmento C (9-16), más preferiblemente Fmoc-Asp(OfBu)9-Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-OH, también denominado fragmento 2; yMost preferred in this configuration is that fragment C is Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly, designated fragment C(9-16), more preferably Fmoc-Asp(OfBu) 9 -Val-Ser (fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly 16 -OH, also referred to as fragment 2; and
el fragmento D sea Gln17-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly31-resina, también denominado fragmento D (17-31), fragment D is Gln 17 -Ala-Ala-Lys(Pal-Glu)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly 31 -resin, also called fragment D (17- 31),
más preferiblemente H-Gln(Trt)17-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OfBu)-Glu-(OfBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(N'nBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-resina de Wang, también denominado fragmento 1.more preferably H-Gln(Trt) 17 -Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OfBu)-Glu-(OfBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(N'nBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf) -Gly-Arg(Pbf)-Gly 31 -Wang's resin, also called fragment 1.
La realización más preferida del método para preparar semaglutida es un método según la reivindicación 1 en el que,The most preferred embodiment of the method for preparing semaglutide is a method according to claim 1 wherein,
el fragmento A es His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser(y zzpro), denominado fragmento A (1-8), más preferiblemente Boc-His(Trt)1-Aib-Glu(OfBu)-Gly-Thr(fBu)-Phe-Thr(fBu)-Ser(^ MeMepro)8-OH, también denominado fragmento 7; y el fragmento B es Asp-Val-ser-ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys[(ROOC-(CH2)16-CO-yGlu-OR')-AEEA-AEEA]-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-resina, denominado fragmento B (9-31),fragment A is His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser(y zzpro), designated fragment A(1-8), more preferably Boc-His(Trt) 1 -Aib-Glu(OfBu)- Gly-Thr(fBu)-Phe-Thr(fBu)-Ser(^MeMepro) 8 -OH, also called fragment 7; and fragment B is Asp-Val-ser-ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys[(ROOC-(CH2)16-CO-yGlu-OR')-AEEA-AEEA]- Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-resin, designated fragment B (9-31),
más preferiblemente H-Asp(OfBu)9-Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys[(fBuOOC-(CH2)16-CO-yGlu-OfBu)-AEEA-AEEA]-Glu-(OfBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(N'nBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-resina de MBH, también denominado fragmento 6.more preferably H-Asp(OfBu) 9 -Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys[(fBuOOC- (CH2)16-CO-yGlu-OfBu)-AEEA-AEEA]-Glu-(OfBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(N'nBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf )-Gly 31 -resin from MBH, also called fragment 6.
Lo más preferido en esta configuración es que el fragmento C sea Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly, denominado fragmento C (9-16), más preferiblemente Fmoc-Asp(OfBu)9-Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-OH, también denominado fragmento 2; yMost preferred in this configuration is that fragment C is Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly, designated fragment C(9-16), more preferably Fmoc-Asp(OfBu) 9 -Val-Ser (fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly 16 -OH, also referred to as fragment 2; and
el fragmento D sea Gln17-Ala-Ala-Lys[(ROOC-(CH2)16-CO-yGlu-OR')-AEEA-AEEA]-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly31-resina, también denominado fragmento D (17-31), en el que R y R', iguales o diferentes, son grupos protectores de ácido carboxílico, preferiblemente ésteres,fragment D is Gln 17 -Ala-Ala-Lys[(ROOC-(CH2)16-CO-yGlu-OR')-AEEA-AEEA]-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg- Gly-Arg-Gly 31 -resin, also referred to as fragment D(17-31), wherein R and R', the same or different, are carboxylic acid protecting groups, preferably esters,
más preferiblemente H-Gln(Trt)17-Ala-Ala-Lys[(tBuOOC-(CH2)16-CO-yGlu-OfBu)-AEEA-AEEA]-Glu(OfBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(N,nBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-O-resina de MBH, fragmento 5.more preferably H-Gln(Trt) 17 -Ala-Ala-Lys[(tBuOOC-(CH2)16-CO-yGlu-OfBu)-AEEA-AEEA]-Glu(OfBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(N ,nBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly 31 -O-resin from MBH, fragment 5.
El método convergente basado en fragmentos para la preparación de análogos de GLP-1 descrito anteriormente proporciona el péptido final unido a la resina deseado, que se trata para una etapa de desprotección simultánea o secuencial y/o escisión para obtener el péptido en bruto, que opcionalmente se purifica adicionalmente.The convergent fragment-based method for the preparation of GLP-1 analogues described above provides the final desired resin-bound peptide, which is treated for a simultaneous or sequential deprotection and/or cleavage step to obtain the crude peptide, which optionally further purified.
AbreviaturasAbbreviations
SPPS Síntesis de péptidos en fase sólidaSPPS Solid Phase Peptide Synthesis
LPPS Síntesis de péptidos en fase líquidaLPPS Liquid Phase Peptide Synthesis
CSPPS Síntesis convergente de péptidos en fase sólidaCSPPS Convergent Solid Phase Peptide Synthesis
CTC Cloruro de 2-cloro-tritiloCTC 2-chloro-trityl chloride
MBH 4-MetilbenzhidriloMBH 4-Methylbenzhydryl
4-MeO-BH 4-Metoxibenzhidrilo4-MeO-BH 4-Methoxybenzhydryl
AEEA 2-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]acetiloAEEA 2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]acetyl
Fmoc 9-FluorenilmetoxicarboniloFmoc 9-Fluorenylmethoxycarbonyl
Boc Tere-butiloxicarboniloBoc Tere-butyloxycarbonyl
Trt Tritil(trifenilmetilo)Trt Trityl(triphenylmethyl)
tBu Tere-butilotBu Tere-butyl
Pbf 2,2,4,6,7-Pentametil-dihidrobenzofuran-5-sulfoniloPbf 2,2,4,6,7-Pentamethyl-dihydrobenzofuran-5-sulfonyl
eq. Equivalenteeq. Equivalent
h Hora/sh Hour/s
min Minuto/smin Minute/s
HPLC Cromatografía de líquidos de alto rendimiento HPLC High Performance Liquid Chromatography
DIEA/DIPEA N,N-DiisopropiletilaminaDIEA/DIPEA N,N-Diisopropylethylamine
DBU 1,8-Diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enoDBU 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene
DMAP 4-DimetilaminopiridinaDMAP 4-Dimethylaminopyridine
TFA Ácido trifluoroacéticoTFA Trifluoroacetic acid
TIS TriisopropilsilanoTIS Triisopropylsilane
Ac2O Anhídrido acéticoAc 2 O Acetic anhydride
DMF N,N-DimetilformamidaDMF N,N-Dimethylformamide
DMA N,N-DimetilacetamidaDMA N,N-Dimethylacetamide
DCM DiclorometanoDCM Dichloromethane
THF TetrahidrofuranoTHF Tetrahydrofuran
NMP N-Metil-2-pirrolidinonaNMP N-Methyl-2-pyrrolidinone
MTBE Metil-ferc-butil éterMTBE Methyl-ferc-butyl ether
DIPE Diisopropil éterDIPE Diisopropyl ether
MeOH MetanolMeOH Methanol
HFIP Hexafluoro-2-propanolHFIP Hexafluoro-2-propanol
TBDMS Terc-butil-dimetil-sililoTBDMS Tert-butyl-dimethyl-silyl
DIC N,N'-DiisopropilcarbodiimidaDIC N,N'-Diisopropylcarbodiimide
DCC N,N'-DiciclohexilcarbodiimidaDCC N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide
EDC N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimidaEDC N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide
HOBt 1-HidroxibenzotriazolHOBt 1-Hydroxybenzotriazole
HOAt 1-Hidroxi-7-azabenzotriazolHOAt 1-Hydroxy-7-azabenzotriazole
NHS N-HidroxisuccinimidaNHS N-Hydroxysuccinimide
TBTU Tetrafluoroborato de O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronioTBTU O-(benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate
HBTU Hexafluorofosfato de O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronioO-(benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate HBTU
HATU Hexafluorofosfato de 2-(7-aza-1H-benzotriazol-1 -il)-1,1,3,3-tetrametiluronioHATU 2-(7-aza-1H-benzotriazol-1 -yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate
PyBOP Hexafluorofosfato de (benzotriazol-1 -iloxi)tripirrolidinofosfonioPyBOP (Benzotriazol-1 -yloxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate
OxymaPure 2-ciano-2-hidroxiimino-acetato de etiloOxymaPure 2-cyano-2-hydroxyimino-ethyl acetate
Oxyma-B 5-(Hidroxiimino)1,3-dimetilpirimidina-2,4,6-(1 H,3H,5H)-trionaOxyma-B 5-(Hydroxyimino)1,3-dimethylpyrimidine-2,4,6-(1H,3H,5H)-trione
TX-100 Triton X-100, también denominado terc-octilfenil éter de polietilenglicolTX-100 Triton X-100, also called polyethylene glycol tert-octylphenyl ether
Ejemplosexamples
Se proporcionan parámetros experimentales detallados adecuados para la preparación de liraglutida y semaglutida según la presente invención mediante los siguientes ejemplos, que se pretende que sean ilustrativos y no limitativos de todas las posibles realizaciones de la invención. Detailed experimental parameters suitable for the preparation of liraglutide and semaglutide according to the present invention are provided by the following examples, which are intended to be illustrative and not limiting of all possible embodiments of the invention.
Ejemplo 1Example 1
Preparación de liraglutidaLiraglutide preparation
Etapa 1. Preparación del fragmento 1, un fragmento D (17-31),Step 1. Preparation of fragment 1, a fragment D (17-31),
H-Gln(Trt)17-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OfBu)-Glu(OfBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(N'nBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-resina de WangH-Gln(Trt)17-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OfBu)-Glu(OfBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(N'nBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly- Arg(Pbf)-Gly31-Wang's resin
La síntesis del fragmento peptídico 1 se llevó a cabo a temperatura ambiente mediante SPPS de Fmoc por etapas usando 0,25 g de resina de Wang (0,75 mmol/g). Después de hinchar la resina en 2 ml de DMF, se añadieron Fmoc-Gly-OH, DIC y DMAP (4, 2 y 0,1 eq. Respectivamente, referidos a la carga de la resina) en DMF. Después de 1 h, los grupos hidroxilo sin reaccionar de la resina se taparon mediante tratamiento con mezcla de DMF/DIPEA/Ac2O (v/v/v 5/2/1) durante 30 minutos. Se realizó desprotección de Fmoc con disolución al 20% de piperidina en DMF (2 * 2 ml, 5 min y 15 min) y se lavó la resina con DMF (4 * 2 ml). Se comprobó el grado de sustitución mediante medición de la adsorción UV de la disolución recogida después de la desprotección de Fmoc y se encontró que era de 0,53 mmol/g. Se preactivaron aminoácidos protegidos con Fmoc (exceso de cuatro veces con respecto a la carga de la resina) con la mezcla de DIC (4 eq) y 2-ciano-2-(hidroxiimino)acetato de etilo (OxymaPure, 4 eq) y posteriormente se acoplaron con la resina en 60 min. La finalización del acoplamiento se monitorizó mediante prueba de ninhidrina. En caso de reacción incompleta se repitió el acoplamiento. Para la introducción de Fmoc-Lys(Pal-Glu-OfBu)-OH en la secuencia peptídica se llevó a cabo doble acoplamiento usando 3 eq. Y 1,5 eq. De dipéptido palmitoilado (9 h y 5 h, respectivamente). Al final de cada acoplamiento, se acilaron las cadenas peptídicas sin reaccionar con anhídrido acético (10 eq) en presencia de DIPEA (10 eq.). Se llevaron a cabo desprotecciones de Fmoc intermedio usando disolución al 20% de piperidina en DMF (2 * 2 ml, 5 min y 15 min) con posterior lavado de la resina con DMF (4 * 2 ml). Después de la finalización de la síntesis se lavó la resina con DCM y se secó.Synthesis of peptide fragment 1 was carried out at room temperature by stepwise Fmoc SPPS using 0.25 g of Wang's resin (0.75 mmol/g). After swollen the resin in 2 ml of DMF, Fmoc-Gly-OH, DIC and DMAP (4, 2 and 0.1 eq. respectively, based on resin loading) in DMF were added. After 1h, unreacted hydroxyl groups on the resin were capped by treatment with DMF/DIPEA/Ac2O (v/v/v 5/2/1) mixture for 30 minutes. Fmoc deprotection was performed with 20% piperidine solution in DMF (2*2 mL, 5 min and 15 min) and the resin was washed with DMF (4*2 mL). The degree of substitution was checked by measuring the UV adsorption of the collected solution after Fmoc deprotection and found to be 0.53 mmol/g. Fmoc-protected amino acids (4-fold excess relative to resin loading) were preactivated with the mixture of DIC (4 eq) and ethyl 2-cyano-2-(hydroxyimino)acetate (OxymaPure, 4 eq) and subsequently they were coupled with the resin in 60 min. Completion of coupling was monitored by ninhydrin test. In case of incomplete reaction, the coupling was repeated. For the introduction of Fmoc-Lys(Pal-Glu-OfBu)-OH into the peptide sequence double coupling was carried out using 3 eq. and 1.5 eq. From palmitoylated dipeptide (9 h and 5 h, respectively). At the end of each coupling, unreacted peptide chains were acylated with acetic anhydride (10 eq) in the presence of DIPEA (10 eq). Intermediate Fmoc deprotections were carried out using 20% piperidine solution in DMF (2*2 mL, 5 min and 15 min) followed by washing the resin with DMF (4*2 mL). After completion of the synthesis, the resin was washed with DCM and dried.
Etapa 2. Preparación del fragmento 2, un fragmento C (9-16),Step 2. Preparation of fragment 2, a fragment C(9-16),
Fmoc-Asp(OfBu)9-Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OfBu)-Gly16-OHFmoc-Asp(OfBu) 9 -Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OfBu)-Gly 16 -OH
La síntesis del fragmento peptídico se llevó a cabo mediante SPPS por etapas usando resina de cloruro de 2-clorotritilo (resina de CTC) (0,25 g, 1,6 mmol/g). Después de hinchar la resina usando 3 ml de DCM, se añadieron Fmoc-Gly-OH y DIEA (0,8 y 3 eq., con respecto a la carga de la resina) en DCM. La mezcla de reacción se agitó durante 1 hora y se eliminó el disolvente por filtración. Los sitios sin reaccionar de la resina se taparon usando una mezcla de DCM/DIPEA/MeOH (v/v/v 17/2/1) durante 30 minutos. Después de lavar con DCM (3 * 5 ml) se trató la resina con una mezcla de DCM/DIPEA/Ac2O (v/v 5/2/1) durante 30 minutos. Se comprobó la carga de la resina mediante medición de la adsorción UV de la disolución después de la desprotección de Fmoc y se encontró que era de 1,08 mmol/g. Luego se preactivaron Fmoc-Glu(OfBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(fBu)-OH, Fmoc-Ser(fBu)-OH, Fmoc-Ser(fBu)-OH, Fmoc-Val-OH y Fmoc-Asp(OfBu)-OH (exceso de tres veces con respecto a la carga de la resina) mediante DIC (exceso de tres veces) y OxymaPure (exceso de tres veces) y se acoplaron consecutivamente a la resina en 60 min. Se llevaron a cabo desprotecciones de Fmoc intermedio usando disolución al 20% de piperidina en DMF (2 x 2 ml, 5 min y 15 min) con posterior lavado de la resina con DMF (4 * 2 ml). Después de la finalización de la síntesis se lavó la resina con DCM. Se escindió el péptido protegido de la resina mediante el tratamiento con 1 ml de TFA al 1% en DCM durante 2 min y se filtró la disolución en 2 ml de disolución al 10% de piridina en metanol. El procedimiento se repitió 4 veces. Luego se lavó la resina con DCM (3 * 2 ml), metanol (3 * 2 ml) y se concentraron las disoluciones combinadas hasta el 5% del volumen. Se precipitó el octapéptido protegido mediante adición de agua bajo un baño helado, se filtró, se lavó varias veces con agua y se secó. Rendimiento: 330 mg (90%), pureza por HPLC 91%Synthesis of the peptide fragment was carried out by stepwise SPPS using 2-chlorotrityl chloride resin (CTC resin) (0.25 g, 1.6 mmol/g). After swelling the resin using 3 mL of DCM, Fmoc-Gly-OH and DIEA (0.8 and 3 eq., based on resin loading) in DCM were added. The reaction mixture was stirred for 1 hour and the solvent was removed by filtration. Unreacted sites on the resin were capped using a mixture of DCM/DIPEA/MeOH (v/v/v 17/2/1) for 30 minutes. After washing with DCM (3*5 ml) the resin was treated with a mixture of DCM/DIPEA/Ac2O (v/v 5/2/1) for 30 minutes. Resin loading was checked by measuring the UV adsorption of the solution after Fmoc deprotection and found to be of 1.08 mmol/g. Fmoc-Glu(OfBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(fBu)-OH, Fmoc-Ser(fBu)-OH, Fmoc-Ser(fBu)-OH, Fmoc-Val-OH were then preactivated. and Fmoc-Asp(OfBu)-OH (3-fold excess over resin loading) by DIC (3-fold excess) and OxymaPure (3-fold excess) and sequentially coupled to the resin in 60 min. Intermediate Fmoc deprotections were carried out using 20% piperidine solution in DMF (2 x 2 ml, 5 min and 15 min) followed by washing the resin with DMF (4 * 2 ml). After completion of the synthesis the resin was washed with DCM. The protected peptide was cleaved from the resin by treatment with 1 ml of 1% TFA in DCM for 2 min and the solution was filtered through 2 ml of 10% pyridine solution in methanol. The procedure was repeated 4 times. The resin was then washed with DCM (3*2ml), methanol (3*2ml) and the combined solutions concentrated to 5% volume. The protected octapeptide was precipitated by adding water under an ice bath, filtered, washed several times with water and dried. Yield: 330 mg (90%), HPLC purity 91%
Etapa 3-a. Condensación de los fragmentos 1 y 2: preparación del fragmento 3, un fragmento B (9-31),Stage 3-a. Condensation of fragments 1 and 2: preparation of fragment 3, a fragment B (9-31),
H-Asp(OfBu)9-Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OfBu)-Glu(OfBu)-Phe-Ile-Ala-T rp(N'"Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-resina de WangH-Asp(OfBu)9-Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OfBu )-Glu(OfBu)-Phe-Ile-Ala-T rp(N'"Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-Wang's resin
Se hinchó el fragmento peptídico 1 obtenido en la etapa 1 en 2 ml de DMF. Se disolvió el fragmento 2 protegido (180 mg, 0,13 mmol, 1 eq.) en 7 ml de DMF, se preactivó con DIC (16 mg, 0,13 mmol), OxymaPure (40 mg, 0,27 mmol) y se acopló con el fragmento 1. Se agitó la reacción a 40°C y se monitorizó con HPLC. Se añadió otro 1 eq. De fragmento peptídico preactivado 2 (180 mg, 0,13 mmol) a 40°C y se agitó para completar la condensación. Se lavó entonces la resina con DMF (2 * 2 ml) y se tapó la función amino sin reaccionar residual con disolución al 10% de Ac2O en DMF (2 ml, 30 min).Peptide fragment 1 obtained in step 1 was swollen in 2 ml of DMF. Protected fragment 2 (180 mg, 0.13 mmol, 1 eq.) was dissolved in 7 mL DMF, preactivated with DIC (16 mg, 0.13 mmol), OxymaPure (40 mg, 0.27 mmol) and was coupled with fragment 1. The reaction was stirred at 40°C and monitored with HPLC. Another 1 eq. of preactivated peptide fragment 2 (180 mg, 0.13 mmol) at 40°C and stirred to complete condensation. The resin was then washed with DMF (2 * 2 ml) and residual unreacted amino function was capped with 10% Ac 2 O solution in DMF (2 ml, 30 min).
Por último, el grupo protector Fmoc se eliminó con disolución al 20% de piperidina en DMF (2 * 2 ml, 5 min y 15 min) con posterior lavado de la resina con DMF (3 * 2 ml).Finally, the Fmoc protecting group was removed with 20% piperidine solution in DMF (2 * 2 ml, 5 min and 15 min) with subsequent washing of the resin with DMF (3 * 2 ml).
Etapa 3-b. Condensación de los fragmentos 1 y 2 en presencia de un detergente: preparación del fragmento 3, un fragmento B (9-31),Stage 3-b. Condensation of fragments 1 and 2 in the presence of a detergent: preparation of fragment 3, a fragment B (9-31),
H-Asp(OfBu)9-Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OfBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OfBu)-Glu(OfBu)-Phe-Ile-Ala-T rp(N'"Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-resina de WangH-Asp(OfBu)9-Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OfBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OfBu )-Glu(OfBu)-Phe-Ile-Ala-T rp(N'"Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-Wang's resin
Se hinchó el fragmento peptídico 1 obtenido en la etapa 1 en 2 ml de una mezcla de DMF:DCM 50:50 v/v Triton X-100 al 1% (TX-100). Se disolvió el fragmento 2 protegido (267 mg, 0,195 mmol, 1,5 eq.) en 5,3 ml de DMF:DCM 50:50 v/v TX-100 al 1%, se preactivó con DIC (24,6 mg, 0,195 mmol), OxymaPure (27,7 mg, 0,195 mmol) y se acopló con el fragmento 1. Se agitó la reacción a 40°C y se monitorizó mediante HPLC. Se lavó entonces la resina con 2 ml de DMF:DCM 50:50 v/v TX-100 al 1% y con DMF (2 * 2 ml). Se tapó la función amino sin reaccionar residual con disolución al 10% de Ac2O en DMF (2 ml, 30 min).Peptide fragment 1 obtained in step 1 was swelled in 2 ml of a mixture of DMF:DCM 50:50 v/v 1% Triton X-100 (TX-100). Protected fragment 2 (267 mg, 0.195 mmol, 1.5 eq.) was dissolved in 5.3 mL of 1% DMF:DCM 50:50 v/v TX-100, preactivated with DIC (24.6 mg , 0.195 mmol), OxymaPure (27.7 mg, 0.195 mmol) and coupled with fragment 1. The reaction was shaken at 40°C and monitored by HPLC. The resin was then washed with 2 ml of DMF:DCM 50:50 v/v 1% TX-100 and with DMF (2*2 ml). Residual unreacted amino function was capped with 10% Ac 2 O solution in DMF (2 mL, 30 min).
Por último, el grupo protector Fmoc se eliminó con disolución al 20% de piperidina en DMF (2 * 2 ml, 5 min y 15 min) con posterior lavado de la resina con DMF (3 * 2 ml).Finally, the Fmoc protecting group was removed with 20% piperidine solution in DMF (2 * 2 ml, 5 min and 15 min) with subsequent washing of the resin with DMF (3 * 2 ml).
Etapa 4. Preparación del fragmento 4, un fragmento A (1-8),Step 4. Preparation of fragment 4, a fragment A (1-8),
Boc-His(Trt)1-Ala-Glu(OfBu)-Gly-Thr(fBu)-Phe-Thr(fBu)-Ser(v MeMepro)8-OH Boc-His(Trt)1-Ala-Glu(OfBu)-Gly-Thr(fBu)-Phe-Thr(fBu)-Ser(vMeMepro)8-OH
Se preparó el fragmento peptídico 4 de manera similar tal como se describe en la etapa 2. En primer lugar, la unión de Fmoc-Thr(fBu)-Ser(^ MeMepro)8-OH (0,8 eq.) a la resina de CTC (0,25 g, 1,6 mmol/g) en presencia de DIEA (3 eq) en DCM se llevó a cabo para dar la carga de 0,96 mmol/g. Luego se acoplaron consecutivamente Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(fBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OfBu)-OH, Fmoc-Ala-OH, y Boc-His(Trt)-OH (exceso de tres veces con respecto con la carga de la resina) a la resina en 6 0 min después de la preactivación con DIC (3 eq) y OxymaPure (3 eq.). La primera desprotección de Fmoc se llevó a cabo usando una disolución al 20% de piperidina en Dm F (3 x 2 ml, 3 min) con posterior lavado de la resina con DMF (4 x 2 ml). Para la desprotección de Fmoc de los otros aminoácidos, se realizaron dos tratamientos con disolución al 20% de piperidina en DMF (5 min y 15 min). Se escindió el octapéptido protegido de la resina usando el mismo procedimiento que se describió previamente (véase la etapa 2). Rendimiento: 270 mg (80%), pureza por HPLC 87%Peptide fragment 4 was prepared in a similar manner as described in step 2. First, binding of Fmoc-Thr(fBu)-Ser(^MeMepro) 8 -OH (0.8 eq.) to the resin of CTC (0.25 g, 1.6 mmol/g) in the presence of DIEA (3 eq) in DCM was carried out to give the loading of 0.96 mmol/g. Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(fBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OfBu)-OH, Fmoc-Ala-OH, and Boc-His(Trt)-OH were then consecutively coupled ( 3-fold excess with respect to resin loading) to the resin within 60 min after preactivation with DIC (3 eq.) and OxymaPure (3 eq.). The first Fmoc deprotection was carried out using a 20% solution of piperidine in DmF (3 x 2 ml, 3 min) with subsequent washing of the resin with DMF (4 x 2 ml). For the deprotection of Fmoc from the other amino acids, two treatments with 20% piperidine solution in DMF (5 min and 15 min) were performed. The protected octapeptide was cleaved from the resin using the same procedure as previously described (see step 2). Yield: 270 mg (80%), HPLC purity 87%
Etapa 5-a. Condensación de los fragmentos 3 y 4: preparación de liraglutida (1-31)Stage 5-a. Condensation of fragments 3 and 4: liraglutide preparation (1-31)
Se hinchó el fragmento 3 soportado sobre resina de peptidilo desprotegido con Fmoc obtenido en la etapa 3 (3-a o 3-b) en 2 ml de DMF. Se disolvió el fragmento 4 protegido (272 mg, 0,20 mmol, 1,5 eq.) en 7 ml de DMF, se preactivó con DIC (16 mg, 0,13 mmol), OxymaPure (40 mg, 0,27 mmol) y se acopló con el fragmento 3. Se agitó la reacción a 40°C y se monitorizó con HPLC. Se añadieron otros 1,5 eq. De fragmento 3 preactivado (270 mg, 0,20 mmol) y se agitaron a 40°C para completar la condensación. Se lavó entonces la resina con DMF (2 x 2 ml) y se tapó la función amino sin reaccionar residual con disolución al 10% de Ac2O en DMF (2 ml, 30 min). Entonces la resina se lavó finalmente dos veces con DCM (2 ml) y se secó.The Fmoc-deprotected peptidyl resin-supported fragment 3 obtained in step 3 (3-a or 3-b) was swelled in 2 ml of DMF. Protected fragment 4 (272 mg, 0.20 mmol, 1.5 eq.) was dissolved in 7 mL DMF, preactivated with DIC (16 mg, 0.13 mmol), OxymaPure (40 mg, 0.27 mmol ) and ligated with fragment 3. The reaction was stirred at 40°C and monitored with HPLC. Another 1.5 eq. of preactivated fragment 3 (270 mg, 0.20 mmol) and stirred at 40°C to complete the condensation. The resin was then washed with DMF (2 x 2 mL) and the residual unreacted amino function was capped with 10% Ac2O solution in DMF (2 mL, 30 min). Then the resin was finally washed twice with DCM (2 ml) and dried.
Etapa 5-b. Condensación de los fragmentos 3 y 4 en presencia de un detergente: preparación de liraglutida (1-31) Se hinchó el fragmento 3 soportado sobre resina desprotegido con Fmoc obtenido en la etapa 3 (3-a o 3-b) en 2 ml de una mezcla de DMF:Dc M 50:50 v/v TX-100 al 1%. Se disolvió el fragmento 4 protegido (270 mg, 0,195 mmol, 1,5 eq.) en 2,7 ml de DMF:DCM 50:50 v/v TX-100 al 1%, se preactivó con DIC (25 mg, 0,195 mmol), OxymaPure (28 mg, 0,195 mmol) y se acopló con el fragmento 3. Se agitó la reacción a 40°C y se monitorizó con HPLC. Se lavó entonces la resina con 2 ml de DMF:DCM 50:50 v/v TX-100 al 1% y con DMF (2 x 2 ml). Se tapó la función amino sin reaccionar residual con disolución al 10% de Ac2O en DMF (2 ml, 30 min). Luego la resina se lavó finalmente dos veces con DCM (2 ml) y se secó.Stage 5-b. Condensation of fragments 3 and 4 in the presence of a detergent: liraglutide preparation (1-31) The Fmoc-deprotected resin-supported fragment 3 obtained in step 3 (3-a or 3-b) was swelled in 2 ml of a DMF:Dc M mixture 50:50 v/v 1% TX-100. Protected fragment 4 (270 mg, 0.195 mmol, 1.5 eq.) was dissolved in 2.7 mL of 1% DMF:DCM 50:50 v/v TX-100, preactivated with DIC (25 mg, 0.195 mmol), OxymaPure (28 mg, 0.195 mmol) and coupled with fragment 3. The reaction was stirred at 40°C and monitored with HPLC. The resin was then washed with 2 ml of DMF:DCM 50:50 v/v 1% TX-100 and with DMF (2 x 2 ml). Residual unreacted amino function was capped with 10% Ac2O solution in DMF (2 mL, 30 min). Then the resin was finally washed twice with DCM (2 ml) and dried.
Etapa 6. Escisión y purificación de liraglutidaStage 6 . Cleavage and purification of liraglutide
Se suspendió la resina de peptidilo seca obtenida en la etapa 5-a en 2 ml de la mezcla de TFA/agua/fenol/TIS (v/v/v/v 88/5/5/2) y se agitó durante 4 h. Luego se filtró la resina y se lavó con 1 ml de TFA. Se recogieron las disoluciones y el péptido en bruto se precipitó en 5 ml de MTBE. Se lavó el precipitado varias veces con MTBE y se secó para obtener liraglutida en bruto con un rendimiento global de 375 mg (75%) y una pureza por HPLC del 81%. Se purificó la liraglutida en bruto con fase móvil A de TFA al 0,1%/agua y fase móvil B de TFA al 0,1%/acetonitrilo. Se recogieron las fracciones con pureza mayor del 99,0% y se liofilizaron para dar liraglutida purificada. Pureza por HPLC: 99,4%, rendimiento 112 mg (30%).The dried peptidyl resin obtained in step 5-a was suspended in 2 ml of the TFA/water/phenol/TIS mixture (v/v/v/v 88/5/5/2) and stirred for 4 h. . The resin was then filtered off and washed with 1 ml of TFA. Solutions were collected and the crude peptide was precipitated in 5 ml of MTBE. The precipitate was washed several times with MTBE and dried to obtain crude liraglutide in an overall yield of 375 mg (75%) and an HPLC purity of 81%. Crude liraglutide was purified with 0.1% TFA/water mobile phase A and 0.1% TFA/acetonitrile mobile phase B. Fractions with purity greater than 99.0% were collected and lyophilized to give purified liraglutide. HPLC purity: 99.4%, yield 112 mg (30%).
Ejemplo 2Example 2
Preparación de semaglutidaSemaglutide preparation
Etapa 1. Preparación del fragmento 5, un fragmento D (17-31)Step 1. Preparation of fragment 5, a fragment D (17-31)
H-Gln(Trt)17-Ala-Ala-Lys[(fBuOOC-(CH2)16-CO-YGlu-OfBu)-AEEA-AEEA]-Glu(OfBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(NínBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-O-resina de MBH H-Gln(Trt) 17 -Ala-Ala-Lys[(fBuOOC-(CH2)16-CO-YGlu-OfBu)-AEEA-AEEA]-Glu(OfBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(NinBoc)- Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly 31 -O-MBH resin
La síntesis del fragmento peptídico 5 se llevó a cabo a temperatura ambiente usando 0,5 g de H-Gly-O-resina de MBH (carga de 0,60 mmol/g). Se hinchó la resina en 3 ml de DMF y se usó para SPPS de Fmoc por etapas. Se preactivaron aminoácidos protegidos con Fmoc (exceso de dos veces con respecto a la carga de la resina) con la mezcla de DIC (2 eq.) y OxymaPure (2 eq.) durante 3 min y se acoplaron consecutivamente con la resina en 90 min. Los acoplamientos de Arg, Val, Trp, Ala24, Phe y Gln se repitieron con 1 eq. de la mezcla de acoplamiento durante 60 min. La introducción de la cadena lateral lipidada en la secuencia peptídica se llevó a cabo usando 1,5 eq. de Fmoc-Lys[(tBuOOC-(CH2)16-CO-yGlu-OtBu)-AEEA-AEEA]-OH, que se preactivó con 1,5 eq. de DIC y 1,5 eq. de OxymaPure y se acopló en 6 h a 40°C. La finalización del acoplamiento se monitorizó mediante prueba de ninhidrina. Al final de cada acoplamiento, se acetilaron las cadenas peptídicas sin reaccionar con anhídrido acético (3 eq.) en DMF y se lavaron con DMF (3 * 5 ml). Se llevaron a cabo desprotecciones de Fmoc intermedio usando disolución al 20% de piperidina en DMF (2 * 5 ml, 10 min) con posterior lavado de la resina con DMF (4 * 5 ml). Después de la finalización de la síntesis se lavó la resina con DCM y se secó.Synthesis of peptide fragment 5 was carried out at room temperature using 0.5 g of MBH H-Gly-O-resin (0.60 mmol/g loading). The resin was swollen in 3 ml DMF and used for Fmoc SPPS in stages. Fmoc-protected amino acids (2-fold excess relative to resin loading) were preactivated with the mixture of DIC (2 eq.) and OxymaPure (2 eq.) for 3 min and sequentially coupled to the resin in 90 min. . Arg, Val, Trp, Ala 24 , Phe and Gln ligations were repeated with 1 eq. of the coupling mixture for 60 min. The introduction of the lipid side chain into the peptide sequence was carried out using 1.5 eq. of Fmoc-Lys[(tBuOOC-(CH2)16-CO-yGlu-OtBu)-AEEA-AEEA]-OH, which was preactivated with 1.5 eq. of DIC and 1.5 eq. of OxymaPure and coupled in 6 h at 40°C. Completion of coupling was monitored by ninhydrin test. At the end of each coupling, unreacted peptide chains were acetylated with acetic anhydride (3 eq.) in DMF and washed with DMF (3*5 mL). Intermediate Fmoc deprotections were carried out using 20% piperidine solution in DMF (2*5 mL, 10 min) followed by washing the resin with DMF (4*5 mL). After completion of the synthesis, the resin was washed with DCM and dried.
Etapa 2. Preparación del fragmento 2, un fragmento C (9-16),Step 2. Preparation of fragment 2, a fragment C(9-16),
Fmoc-Asp(OtBu)9-Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-OH Véase la etapa 2 del ejemplo 1.Fmoc-Asp(OtBu) 9 -Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly 16 -OH See Step 2 of Example 1.
Etapa 3. Condensación de los fragmentos 5 y 2 en presencia de un detergente: preparación del fragmento 6, un fragmento B (9-31),Step 3. Condensation of fragments 5 and 2 in the presence of a detergent: preparation of fragment 6, a fragment B (9-31),
H-Asp(OfBu)9-Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys[(tBuOOC-(CH2)16-CO-yGlu-OfBu)-AEEA-AEEA]-Glu-(OfBu)-Phe-Ne-Ala-Trp(N'"Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-resina de MBHH-Asp(OfBu) 9 -Val-Ser(fBu)-Ser(fBu)-Tyr(fBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys[(tBuOOC-(CH2 )16-CO-yGlu-OfBu)-AEEA-AEEA]-Glu-(OfBu)-Phe-Ne-Ala-Trp(N'"Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf) -Gly 31 -MBH resin
Se hinchó resina desprotegida con Fmoc con fragmento peptídico 5 obtenido en la etapa 1 en 4 ml de una mezcla de DMF:DCM 50:50 v/v TX-100 al 1% a 40°C. La disolución del fragmento peptídico 2 protegido (765 mg, 0,56 mmol, 2 eq.) en 7 ml de la mezcla de DMF:DCM 50:50 v/v TX-100 al 1% se preactivó con DIC (16 mg, 0,56 mmol) y OxymaPure (88 mg, 0,56 mmol) a 40°C durante 15 min, luego se añadió a la resina y la mezcla de reacción se agitó durante 3,5 h a 40°C. La finalización del acoplamiento se monitorizó mediante prueba de ninhidrina. Se acetilaron las cadenas peptídicas sin reaccionar con 3 eq. de anhídrido acético en DMF y luego se lavó la resina peptídica con DMF (3 * 5 ml). Al final, el grupo protector Fmoc se eliminó con disolución al 20% de piperidina en DMF (2 * 5 ml, 10 min) con posterior lavado de la resina con DMF (4 * 5 ml).Fmoc-deprotected resin with peptide fragment 5 obtained in step 1 was swelled in 4 ml of a mixture of 1% DMF:DCM 50:50 v/v TX-100 at 40°C. The solution of protected peptide fragment 2 (765 mg, 0.56 mmol, 2 eq.) in 7 mL of the 1% DMF:DCM 50:50 v/v TX-100 mixture was preactivated with DIC (16 mg, 0.56 mmol) and OxymaPure (88 mg, 0.56 mmol) at 40°C for 15 min, then added to the resin and the reaction mixture was stirred for 3.5 h at 40°C. Completion of coupling was monitored by ninhydrin test. Unreacted peptide chains were acetylated with 3 eq. of acetic anhydride in DMF and then the peptide resin was washed with DMF (3*5 ml). At the end, the Fmoc protecting group was removed with 20% piperidine solution in DMF (2*5 mL, 10 min) with subsequent washing of the resin with DMF (4*5 mL).
Etapa 4. Preparación del fragmento 7, un fragmento A (1-8),Step 4. Preparation of fragment 7, a fragment A (1-8),
Boc-His(Trt)1-Aib-Glu(OfBu)-Gly-Thr(fBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(^MeMepro)8-OH Boc-His(Trt)1-Aib-Glu(OfBu)-Gly-Thr(fBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(^MeMepro)8-OH
La síntesis del fragmento peptídico 7 se llevó a cabo usando 1 g de resina de CTC (carga de 1,6 mmol/g). Después de hinchar la resina en 10 ml de DCM, se añadió una disolución de Fmoc-Thr(fBu)-Ser(^MeMepro)8-OH y DIEA (0,8 y 3 eq., con respecto a la carga de la resina) en 5 ml de DCM. La mezcla de reacción se agitó durante 16 horas y se eliminó el disolvente por filtración. Los sitios sin reaccionar de la resina se taparon usando una disolución de MeOH (3 eq.) y DIEA (3 eq.) en 5 ml de DCM durante 15 minutos. Después de lavar con DCM (2 x 10 ml) se trató la resina con una disolución de anhídrido acético (3 eq.) y DIEA (3 eq.) en 10 ml de DCM durante 15 minutos, se lavó con DMF (3 x 10 ml), DCM (3 x 10 ml) y se secó. Se comprobó la carga de la resina mediante medición de la adsorción UV de la disolución después de la desprotección de Fmoc y se encontró que era de 1,3 mmol/g. Luego se preactivaron Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(fBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OfBu)-OH, Fmoc-Ala-OH y Boc-His(Trt)-OH (2 eq.) mediante 2 eq. de DIC y 2 eq. de OxymaPure durante 3 min y se acoplaron consecutivamente con la resina en 90 min. En el caso de His, Oxyma-B reemplazó OxymaPure y se redujo el tiempo de preactivación hasta 1 min a 0°C. Se llevaron a cabo desprotecciones de Fmoc intermedio usando disolución al 20% de piperidina en DMF (2 x 10 ml, 10 min) con posterior lavado de la resina con DMF (4 x 10 ml). Después de la finalización de la síntesis se lavó la resina con DCM (2 x 10 ml) y se secó. Se escindió el péptido protegido de la resina mediante tratamiento con 3 ml de TFA al 1,5% en DCM durante 2 min y se filtró la disolución en 3 ml de disolución al 10% de piridina en metanol. El procedimiento se repitió 4 veces y se concentraron las disoluciones combinadas hasta el 30% del volumen. El péptido protegido se precipitó mediante adición de agua bajo un baño helado, se filtró, se lavó varias veces con agua y se secó. Rendimiento: 960 mg (77%).The synthesis of peptide fragment 7 was carried out using 1 g of CTC resin (1.6 mmol/g loading). After swollen the resin in 10 mL of DCM, a solution of Fmoc-Thr(fBu)-Ser(^MeMepro)8-OH and DIEA (0.8 and 3 eq., based on resin loading) was added. ) in 5 mL of DCM. The reaction mixture was stirred for 16 hours and the solvent was removed by filtration. Unreacted sites on the resin were capped using a solution of MeOH (3 eq) and DIEA (3 eq) in 5 ml DCM for 15 min. After washing with DCM (2 x 10 ml) the resin was treated with a solution of acetic anhydride (3 eq.) and DIEA (3 eq.) in 10 ml of DCM for 15 minutes, washed with DMF (3 x 10 ml), DCM (3 x 10 ml) and dried. Resin loading was checked by measuring the UV adsorption of the solution after Fmoc deprotection and found to be 1.3 mmol/g. Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(fBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OfBu)-OH, Fmoc-Ala-OH and Boc-His(Trt)-OH were then preactivated (2 eq .) by 2 eq. of DIC and 2 eq. of OxymaPure for 3 min and sequentially coupled to the resin in 90 min. In the case of His, Oxyma-B replaced OxymaPure and the preactivation time was reduced to 1 min at 0°C. Intermediate Fmoc deprotections were carried out using 20% piperidine solution in DMF (2 x 10 mL, 10 min) followed by washing the resin with DMF (4 x 10 mL). After completion of the synthesis the resin was washed with DCM (2 x 10 ml) and dried. The protected peptide was cleaved from the resin by treatment with 3 ml of 1.5% TFA in DCM for 2 min and the solution was filtered through 3 ml of 10% pyridine solution in methanol. The procedure was repeated 4 times and the combined solutions were concentrated to 30% volume. The protected peptide was precipitated by adding water under an ice bath, filtered, washed several times with water and dried. Yield: 960 mg (77%).
Etapa 5. Condensación de los fragmentos 6 y 7: preparación de semaglutida (1-31)Step 5. Condensation of fragments 6 and 7: preparation of semaglutide (1-31)
Se hinchó el fragmento 6 soportado sobre resina de peptidilo desprotegido con Fmoc obtenido en la etapa 3 en 2 ml de la mezcla de DMF:DCM 50:50 v/v TX-100 al 1% a 40°C. Se preactivó la disolución del fragmento peptídico 7 protegido (780 mg, 0,56 mmol, 2 eq.) en 7 ml de la mezcla de DMF:DCM 50:50 v/v TX-100 al 1% con DIC (16 mg, 0,56 mmol) y OxymaPure (88 mg, 0,56 mmol) a 40°C durante 15 min. Luego la mezcla de acoplamiento se añadió a la resina y la mezcla de reacción se agitó durante 3,5 h a 40°C. La finalización del acoplamiento se monitorizó mediante prueba de ninhidrina. Se acetilaron las cadenas peptídicas sin reaccionar con 3 eq. de anhídrido acético en DMF y se lavó la resina peptídica con DMF (3 x 5 ml), DCM (2 x 5 ml) y se secó.The Fmoc-deprotected peptidyl resin-supported fragment 6 obtained in step 3 was swelled in 2 ml of the mixture of DMF:DCM 50:50 v/v 1% TX-100 at 40°C. Dissolution of protected peptide fragment 7 (780 mg, 0.56 mmol, 2 eq.) in 7 mL of the 1% DMF:DCM 50:50 v/v TX-100 mixture was preactivated with DIC (16 mg, 0.56 mmol) and OxymaPure (88 mg, 0.56 mmol) at 40°C for 15 min. The coupling mixture was then added to the resin and the reaction mixture was stirred for 3.5h at 40°C. Completion of coupling was monitored by ninhydrin test. Unreacted peptide chains were acetylated with 3 eq. of acetic anhydride in DMF and the peptide resin was washed with DMF (3 x 5 ml), DCM (2 x 5 ml) and dried.
Etapa 6. Escisión y purificación de semaglutidaStep 6. Cleavage and purification of semaglutide
Se suspendió la resina de peptidilo seca obtenida en la etapa 5 en 5 ml de la mezcla de TFA/agua/fenol/TIS (v/v/v/v 88/5/5/2) y se agito durante 1 h a 0°C y 3 h a TA. Luego se filtró la resina y se lavó con 1 ml de TFA. Se recogieron las disoluciones y el péptido en bruto se precipitó en 25 ml de DIPE. Se lavó el precipitado varias veces con DIPE y se secó para obtener semaglutida en bruto con un rendimiento global de 0,7 g (61%) y una pureza por HPLC del 74%. Se purificó la semaglutida en bruto con fase móvil A de TFA al 0,1%/agua y fase móvil B de TFA al 0,1%/acetonitrilo. Las fracciones con pureza mayor del 99,0% se recogieron y se liofilizaron para dar semaglutida purificada. Pureza por HPLC: 99,1%, rendimiento 196 mg (28%). The dried peptidyl resin obtained in step 5 was suspended in 5 ml of the TFA/water/phenol/TIS mixture (v/v/v/v 88/5/5/2) and stirred for 1 h at 0° C and 3 h at RT. The resin was then filtered off and washed with 1 ml of TFA. Solutions were collected and the crude peptide was precipitated in 25 ml of DIPE. The precipitate was washed several times with DIPE and dried to obtain crude semaglutide in an overall yield of 0.7 g (61%) and an HPLC purity of 74%. Crude semaglutide was purified with 0.1% TFA/water mobile phase A and 0.1% TFA/acetonitrile mobile phase B. Fractions with purity greater than 99.0% were collected and lyophilized to give purified semaglutide. HPLC purity: 99.1%, yield 196 mg (28%).
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