ES2937710A1 - Biomarcadores epigenéticos para la transición entre el fenotipo de obesidad metabólicamente sana al fenotipo de obesidad metabólicamente no sana - Google Patents

Abstract

Biomarcadores epigenéticos para la transición entre el fenotipo de obesidad metabólicamente sana al fenotipo de obesidad metabólicamente no sana. La presente invención comprende un método para la predicción de progresión de MHO a MUO mediante marcadores epigenéticos en sitios CpG de genes y pseudogenes y un Kit para la realización del mismo.

Description

DESCRIPCIÓN

Biomarcadores epigenéticos para la transición entre el fenotipo de obesidad metabólicamente sana al fenotipo de obesidad metabólicamente no sana

Antecedentes de la invención

La obesidad ha alcanzado proporciones epidémicas en todo el mundo y al menos 2,8 millones de personas mueren cada año como consecuencia del sobrepeso o la obesidad. Según la Organización Mundial de la Salud, la prevalencia de la obesidad casi se ha triplicado desde 1975 [1].

La obesidad se asocia a un mayor riesgo de desarrollar síndrome metabólico, diabetes de tipo 2 (DT2) y enfermedades cardiovasculares, lo que supone un aumento de la mortalidad. Sin embargo, no todas las personas con obesidad presentan el patrón habitual de complicaciones metabólicas. Este fenotipo se ha definido como obesidad metabólicamente sana (MHO) y su tasa de prevalencia varía ampliamente, oscilando entre el 10% y el 35% según los criterios utilizados y la población estudiada [2,3].

El fenotipo MHO puede progresar a un estado no saludable conocido como obesidad metabólicamente no saludable (MUO). Se ha sugerido que esta progresión podría ser una cuestión de tiempo [4], aunque hay evidencias que sugieren que un porcentaje relevante de individuos con MHO mantienen su estado a lo largo del tiempo [5].

A pesar del creciente interés por estos grupos de sujetos, existe un gran desconocimiento sobre los factores que determinan que algunos sujetos obesos estén protegidos de desarrollar complicaciones metabólicas. Diferentes estudios proponen que una mayor sensibilidad a la insulina, una distribución específica de la grasa, una menor infiltración de células inmunitarias en el tejido adiposo y, en consecuencia, un patrón de secreción de citoquinas y adipocinas metabólicamente beneficioso, podrían ser algunos de los mecanismos implicados en la génesis de la MHO [6,7].

Se estima que el 40-70% de la obesidad y las enfermedades metabólicas tienen un componente hereditario, pero los grandes estudios de asociación del genoma completo (GWAS) han demostrado que sólo el 20% de las variantes en los genes relacionados con la obesidad pueden explicar la predisposición a esta condición [8]. Por lo tanto, se ha sugerido que los procesos epigenéticos pueden tener un papel en la regulación de las enfermedades metabólicas. La metilación del ADN es uno de los principales mecanismos epigenéticos, y puede alterar la expresión de los genes sin cambiar la secuencia del ADN mediante la adición de grupos metilo en los residuos de citosina. Este campo es aún reciente, pero está atrayendo el interés de diversas áreas como la oncología y los trastornos metabólicos como la obesidad.

Estudios previos han evaluado la relación entre variantes epigenéticas y enfermedades metabólicas como la obesidad y la DT2 [9]. Se ha sugerido que la obesidad está relacionada con diferentes niveles de metilación en las células sanguíneas en comparación con las de cohortes sanas [10-12]. Asimismo, los datos de metilación del ADN del tejido adiposo muestran que la variación epigenética está implicada en las comorbilidades asociadas a la obesidad y a la DT2 [13,14].

Breve descripción de la invención

El objeto de la presente invención es proporcionar marcadores epigenéticos que puedan predecir la progresión de MHO a MUO

Actualmente, la identificación de los parámetros que pueden predecir el deterioro metabólico del fenotipo MHO hacia un fenotipo no saludable o el mantenimiento del estado metabólico saludable a lo largo del tiempo es objeto de debate. Entre estos factores, ha destacado el papel de la epigenética en la estabilidad del fenotipo MHO.

La metilación del ADN representa la principal modificación epigenética a nivel de regulación transcripcional. La función de la metilación del ADN parece variar con el contexto genómico (sitios de inicio de la transcripción, cuerpos de los genes, elementos reguladores); de este modo, la metilación del ADN de los promotores de los genes suele asociarse con el silenciamiento transcripcional, mientras que la metilación de los cuerpos de los genes se ha asociado con el aumento de la transcripción [15].

Estudios previos han investigado las alteraciones de la metilación del ADN en el tejido adiposo en relación con la obesidad, la resistencia a la insulina y la inflamación sistémica [16,17], destacando la relevancia de este mecanismo epigenético en la obesidad y las comorbilidades asociadas. Además, se han descrito modificaciones en el perfil de metilación de las células sanguíneas asociadas a la obesidad y al síndrome metabólico [18,19]. Sin embargo, hasta donde sabemos, no hay ningún estudio previo que evalúe los cambios de metilación a largo plazo en pacientes con obesidad según su estado metabólico.

Nuestros resultados mostraron 26 sitios CpG metilados diferencialmente, tanto en el inicio, como en el seguimiento durante 11 años, asociados a 19 genes o pseudogenes, con un papel potencial en la estabilidad del fenotipo MHO.

Entre las vías alteradas por estas diferencias en la metilación, destacan las vías relacionadas con el sistema inmunitario, que podrían estar implicadas en la progresión del MHO hacia un estado no saludable. Es conocido que la obesidad se caracteriza por un estado inflamatorio crónico de bajo grado acompañado de una infiltración de macrófagos en el tejido adiposo. Se ha demostrado que tanto la obesidad como la DT2 provocan una desregulación del sistema inmunitario [20,21]. En nuestra población, los sitios CpG localizados en los genes HLA-DRB1 y HLA-DQB2 se mostraron hipermetilados, siendo mayor la metilación en el grupo MHO estable. Estos genes pertenecen al complejo del antígeno leucocitario humano (HLA) de clase 11, que forma parte de la maquinaria de procesamiento y presentación de antígenos, y es una piedra angular del sistema inmunitario adaptativo. En un estudio anterior, el tejido adiposo de pacientes con obesidad y síndrome metabólico mostró una mayor expresión de los componentes del HLA clase II [22]. En los adipocitos de sujetos con obesidad, se ha demostrado que el HLA de clase II desempeña un papel en el desencadenamiento de la inflamación. De hecho, se ha sugerido que la inmunidad adaptativa tiene un papel en la aparición y progresión de la inflamación y en la resistencia a la insulina en el tejido adiposo asociado a la obesidad [23]. El genotipado de SNPs ha demostrado el papel del HLA-DRB1 en la DT2 [24]. Se ha sugerido que algunos polimorfismos de HLA-DRB1 son protectores de la DT2; el hipotético mecanismo parece ser un papel protector contra la pérdida de secreción de insulina producida por la autoinmunidad [25]. Además, en adolescentes obesos, el desarrollo de la resistencia a la insulina se asoció a una disminución de HLA- DRB1 [26].

El resto de los genes asociados a los sitios de metilación divulgados están implicados en una amplia gama de procesos biológicos, subrayando las funciones de los potenciales biomarcadores que podrían predecir la progresión hacia un estado no saludable en el seguimiento a largo plazo. Nuestros resultados mostraron que una mayor metilación en cg20707527 (gen ZFPM2) y una menor metilación en cg11445109 (gen CYP2E1) podrían tener un papel en la estabilidad del fenotipo saludable en la obesidad.

En nuestro estudio, la metilación en el gen ZFPM2 mostró una tendencia diferente entre los grupos; nuestros resultados describieron dos sitios CpG que estaban hipermetilados en MHO estable, mientras que en MHO inestable, dichos sitios CpG se encontraron hipometilados tanto al inicio como a los 11 años de seguimiento. ZFPM2, también conocido como FOG2, codifica un factor de transcripción con motivo de dedo de zinc que regula la actividad de la proteína GATA, incluida la GATA4, que está implicada en la función cardíaca y la modulación de la angiogénesis [27]; Sin embargo, también se ha sugerido que FOG2 puede desempeñar otras funciones. Estudios anteriores han asociado variantes genéticas de ZFPM2 con la hipercolesterolemia y el síndrome metabólico [28,29]. En modelos animales, se ha demostrado que el desencadenamiento de la inflamación conduce a una disminución de la expresión de FOG2 en los hepatocitos [30]. En otro estudio, se demostró que el FOG2 hepático atenúa la sensibilidad a la insulina al promover la glucogenólisis [31].

El gen CYP2E1 mostró una alta proporción de sitios diferencialmente metilados y tendía a estar hipometilado tanto en la MHO estable como en la inestable. Además, los niveles de hipometilación eran mayores en las MHO estables. CYP2E1 pertenece a la superfamilia de enzimas, xenobióticos y sustancias endógenas [32]. El aumento de la actividad del CYP2E1 puede promover el estrés oxidativo debido a su capacidad de producir un exceso de especies reactivas de oxígeno [33]. Esta inducción se ha descrito a nivel hepático en pacientes con hígado graso no alcohólico [34]. Además, se ha demostrado que la actividad del CYP2E1 es mayor en pacientes con obesidad [35] y en un modelo animal de síndrome metabólico [36]. Aunque los resultados son contradictorios, algunos estudios han sugerido un aumento de la actividad del CYP2E1 en pacientes con DT2 [37], y tanto la glucosa como la insulina pueden modular su actividad [38]. Todos estos datos sugieren que el CYP2E1 tiene un papel potencial en las alteraciones metabólicas con un componente inflamatorio.

De acuerdo con lo anterior, otro objeto de la invención es el desarrollo de un chip de detección de marcadores de metilación que permita predecir si un paciente obeso va a evolucionar de un paciente metabólicamente sano a uno metabólicamente enfermo. Se trataría de un kit que mide la metilación de los sitios CpGs seleccionados (4-8 sitios) a partir de una muestra de sangre, y simultáneamente. Este chip o kit permitiría identificar si un sujeto con obesidad va a desarrollar un síndrome metabólico (con las complicaciones que ello conlleva). Los sitios observados, propuestos como biomarcadores, se han mantenido estables en el tiempo, lo que nos garantiza la capacidad de predicción de estas marcas en cualquier momento.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. PCA en el inicio y en el seguimiento a los 11 años. (A) PCA realizado en el conjunto de datos de seguimiento a los 11 años. (B) PCA de los sitios de metilación más importantes de 11 años de seguimiento del inicio.

Figura 2 Niveles de metilación de 26 sitios CpG metilados significativamente identificados en la selección de doble PCA al inicio y a los 11 años de seguimiento.

Figura 3. Principales rutas relacionadas con los sitios CpG metilados significativamente diferentes. Barras azules: rutas bioquímicas con sitios CpGs hipermetilados en MHO estable. Barras verdes: rutas bioquímicas con sitios CpGs hipermetilados en MHO inestable. Se realizó un análisis de red para examinar las interrelaciones entre estos genes. Casi la mitad de ellos estaban relacionados en una red única con factores de transcripción y reguladores de transcripción (AHR, SIP1 o HNF4A) como nodos principales (Figura 4).

Figura 4. Red genética de interacciones relacionadas con los sitios CPGs más relevantes.

Figura 5. Los 10 principales términos de la Ontología Génica (GO) más enriquecidos según los genes diferencialmente metilados en los grupos de MHO estable y MHO inestable. Los términos GO enriquecidos se clasificaron en (a) procesos biológicos, (b) función molecular y (c) componentes celulares. Los datos se presentan como puntuaciones enriquecidas expresadas como -log10 (valor p).

EJEMPLOS

Materiales y Métodos

Diseño y sujetos

Este estudio forma parte del estudio Pizarra, cuyos detalles se han publicado anteriormente [4,39]. Brevemente, el estudio Pizarra es un estudio prospectivo basado en una cohorte de población, de 1.051 sujetos de 18 a 65 años de edad de Pizarra, una ciudad de la provincia de Málaga (Andalucía, sur de España). La cohorte fue reevaluada tras 11 años, y un total de 547 individuos completaron el seguimiento. Se obtuvieron de muestras de sangre, tanto en el inicio como a los 11 años, de 276 de los 547 individuos que completaron el seguimiento. De ellos, 137 pacientes eran obesos, tanto en el inicio como en el seguimiento de 11 años. Entre los 137 pacientes, 58 fueron clasificados como MHO en el inicio. Tras el emparejamiento por edad, se seleccionaron 18 pacientes para ser incluidos en el estudio.

Se obtuvo el consentimiento informado de cada participante y el estudio fue aprobado por el comité de ética médica del Hospital Regional Universitario Carlos Haya de Málaga.

Criterios de clasificación

Se utilizaron los criterios NCEP ATPIII para clasificar a los sujetos según su estado metabólico [40]. Se consideraron como MHO si tenían obesidad abdominal (perímetro de cintura >102 cm en hombres y >88 cm en mujeres) y estaban presentes <2 de los criterios de síndrome metabólico del NCEP ATPIII: presión arterial sistólica > = 135 mmHg o presión arterial diastólica >=85 mmHg; concentración de glucosa plasmática en ayunas >= 100 mg/dl; concentración de HDL-C <40 mg/dl en hombres y <50 mg/dl en mujeres; concentración de TG plasmáticos en ayunas >= 150 mg/dl; o tratamiento con medicamentos antihipertensivos, hipolipemiantes o reductores de la glucosa.

Para este estudio, se seleccionó un subgrupo de 18 sujetos con MHO al inicio del estudio para realizar un análisis de metilación del ADN a nivel genómico. De ellos, 9 sujetos con MHO desarrollaron complicaciones metabólicas a los 11 años de seguimiento (MHO inestable; n=9), mientras que el otro subconjunto de muestras permaneció metabólicamente sano a los 11 años de seguimiento (MHO estable; n = 9).

Procedimientos

Se realizaron mediciones de peso y altura al inicio y a los 11 años de seguimiento. El índice de masa corporal (IMC) se calculó como: peso (kg)/altura2 (m2). La presión arterial se midió dos veces con un esfigmomanómetro con un intervalo de 5 minutos entre las mediciones y se utilizó la media de las dos mediciones en los análisis.

En el inicio y en el seguimiento tras 11 años, se recogieron muestras de sangre tras un ayuno de 10-12 horas. Se separó el suero, y las muestras de sangre y suero se congelaron inmediatamente a -80 °C hasta su análisis. Las variables bioquímicas se midieron por duplicado. La glucosa en sangre se midió con el método de la glucosa oxidasa (Bayer, leverkusen, Alemania). Se utilizaron métodos enzimáticos para medir el colesterol total, los triglicéridos y el colesterol de lipoproteínas de alta densidad.

Ensayo de metilación del ADN

El ADN se extrajo de la sangre periférica utilizando el QlAmp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. La concentración de ADN se cuantificó con un fluorómetro Qubit 3 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) mediante un Kit de ensayo de fluoromotría dsADN HS (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).

Después de la cuantificación, un total de 500 ng de ADN genómico se trataron con bisulfito utilizando un kit de metilación de ADN Zymo EZ-96 (Zymo Research Corp, lrvine, CA, USA) y se purificaron utilizando un kit de limpieza de ADN (Zymo Research Corp, lrvine, CA, USA).

Se estudiaron más de 850.000 sitios de metilación con el kit de chips de metilación EPlC lnfinium (lllumina, San Diego, CA, EE.UU.) siguiendo el protocolo de metilación del ensayo HD de lnfinium, y los datos brutos se obtuvieron con el software iS (lllumina).

Análisis de los datos de metilación

Se utilizó el lenguaje de programación estadística R 3.5.1 (https://www.r-project.org/, consultado el 1 de abril de 2021) para realizar el análisis de los datos de metilación. Los archivos de datos brutos (archivos idat) se leyeron con el paquete minfi [41] para calcular los valores 3 brutos. Se utilizó la normalización normal-exponencial fuera de banda (NOOB) [42] para corregir el fondo. Se eliminaron del análisis las sondas situadas en cromosomas sexuales o cerca de SNPs. También se eliminaron las sondas de baja calidad (aquellas con un valor p de detección >0,01 en al menos el 10% de las muestras). Por último, se aplicó la normalización de cuantiles de mezcla beta (BMlQ) [43] para corregir los dos diseños diferentes de cuentas en los microarrays. Para el análisis de metilación diferencial, transformamos los valores 3 en valores M.

Análisis estadístico

El análisis comparación estadística se realizaron utilizando el software R (3.5.1), para estudiar las diferencias en las variables antropométricas y bioquímicas se empleó la prueba de Kruskall-Wallis para los datos continuos y la prueba de chi-cuadrado para los datos categoriales. Los datos se expresan como media ± desviación estándar o como porcentaje. Los valores fueron estadísticamente significativos cuando p <0,05.

Análisis de componentes principales (PCA)

Se obtuvieron dos conjuntos de datos completos de sitios CpGs normalizados en el inicio y tras 11 años. El análisis de componentes principales (PCA) se implementó utilizando la implementación nativa de R a través del software R Studio 1.2.5033 (versión 3.5.1). El PCA clásico puede considerarse como un enfoque basado en la proyección para encontrar el espacio de baja dimensión que mejor representa una nube de puntos de alta dimensión [44]. En primer lugar, realizamos el PCA en el conjunto de datos del seguimiento de 11 años y utilizamos los sitios CpG más importantes en ambos componentes como subconjuntos para el conjunto de datos. Se seleccionó alrededor del 1% de ellos (8200 sitios CpG). Estos sitios se analizaron en el inicio y se seleccionaron aquellos con una contribución superior al 0,04% (la mitad del valor máximo de contribución de la mejor variable) en el componente 1 y el 0,25% en el componente 2 y se utilizaron para establecer los cambios de metilación a través del seguimiento de la población del estudio.

Para validar la importancia de los sitios CpG seleccionados en el PCA, se realizó un análisis comparativo para cada sitio. Las diferencias entre grupos se establecieron mediante la prueba de Kruskal-Wallis.

Los sitios CpG diferencialmente metilados identificados tanto al inicio como tras el seguimiento de 11 años se utilizaron para realizar una regresión logística por pasos sucesivos hacia atrás para evaluar el poder de predicción de estos sitios en la progresión a un estado de obesidad metabólicamente no saludable.

Ensayos de rutas y ontología génica.

Estos sitios CpG se estudiaron utilizando dos enfoques diferentes; por un lado, se utilizó la ontología génica (GO) para determinar los principales procesos asociados a los sitios CpG seleccionados mediante el uso de AmiGO, una aplicación web que permite a los usuarios consultar, navegar y visualizar ontologías y anotaciones de productos génicos relacionados (asociación) [45]. Por otra parte, los sitios CpG seleccionados se analizaron mediante el software de análisis de rutas QIAGEN Ingenuity. Este software nos permitió determinar qué rutas canónicas estaban relacionadas con los sitios CpG seleccionados y establecer los procesos más relevantes alterados en ambos grupos en el seguimiento. Finalmente, el análisis estadístico se realizó mediante el software R (versión 3.5.1).

Resultados

La Tabla 1 muestra las variables metabólicas empleadas para clasificar los pacientes incluidos en el estudio. Brevemente, los pacientes fueron considerados como MHO si tenían obesidad abdominal y estaban presentes <2 de los criterios del síndrome metabólico NCEP ATPIII. Al inicio, los niveles de triglicéridos eran significativamente más altos en el grupo de MHO inestable (p = 0,001). No se encontraron diferencias estadísticas para el resto de las variables estudiadas. A los 11 años de seguimiento, los valores de glucosa en ayunas (p = 0,01), de presión arterial diastólica (p = 0,0159) y de presión arterial sistólica (p = 0,024) fueron significativamente mayores en el grupo de MHO inestable.

Tabla 1 Características antropométricas y bioquímicas de los sujetos incluidos en el estudio.

Los datos se expresan como media±desviación estándar, o como (porcentaje). Los valores p para los datos continuos se calcularon mediante la prueba de Kruskal-Wallis, y para los datos categóricos se calcularon mediante la prueba de chi-cuadrado o la prueba exacta de Fisher si la frecuencia era <5. IMC: índice de masa corporal. Colesterol HDL: colesterol de lipoproteínas de alta densidad DBP: presión arterial diastólica. SBP: presión arterial sistólica. Trat. HTA: tratamiento de la hipertensión arterial.

Análisis de componentes principales

El análisis de componentes principales (PCA) se llevó a cabo utilizando la doble selección de loci con CpG metilados. En primer lugar, se seleccionaron los sitios CpG que discriminaban claramente las dos poblaciones tras 11 años de seguimiento; en esta selección, ambos componentes explicaban alrededor del 58% de la varianza (Figura 1A). En este paso, se seleccionaron un total de 8200 (1%) loci con CpG diferencialmente metilados de 815.389 sondas, basándose en los criterios de contribución de los componentes. Estos sitios CpG se analizaron al inicio para determinar los marcadores que discriminaban entre las dos poblaciones tanto al inicio como al final del seguimiento (Figura 1B). A continuación, se seleccionaron los sitios CpG de cada componente cuyos valores de contribución eran relevantes. En el inicio, se seleccionaron los sitios con una contribución superior al 0,04% (la mitad del valor máximo de contribución de la mejor variable) en el componente 1 y el 0,25% (la mitad de la contribución máxima) en el componente 2 y se utilizaron para establecer los cambios de metilación durante el seguimiento en la población de estudio.

Finalmente, se seleccionaron 26 sitios CpG significativamente metilados para su posterior análisis. La mayoría de ellos (quince) estaban hipermetilados en la población de MHO estable en comparación con la población de MHO inestable tanto al inicio como tras el seguimiento de 11 años, mientras que 11 estaban hipometilados. Las diferencias entre los valores medios de metilación en ambas poblaciones en los dos momentos del estudio se muestran en la Figura 2.

Genes metilados diferencialmente

Un total de 17 genes y 2 pseudogenes estaban relacionados con los 26 sitios CpG identificados en la selección del doble PCA. Los diez primeros sitios CpG significativamente metilados estaban asociados a ocho genes únicos o pseudogenes; dos eran pseudogenes, a saber, la proteína nucleolar que interactúa con el dominio FHA (NIPFK3) y DTX2P1- UPK3BP1-PMS2P11. El resto de los sitios eran genes únicos, como la proteína de dedo de zinc, miembro de la familia 2 de FOG (ZFMP2), el miembro 1 de la subfamilia E de la familia 2 del citocromo P450 (CYP2E1), el complejo mayor de histocompatibilidad, clase II, DQ beta 1 y beta 2 (HLA-DQB1 y HLA-DQB2), la familia de transportadores de solutos 1 (SLC1A1) y la fosfolipasa C zeta 1 (PLCZ1). Las características de estos loci con CpG, incluyendo el ID de la sonda, la localización, la región del gen o la dirección de la metilación, se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2. Los diez principales sitios CpG metilados significativamente en MHO estable y MHO inestable a lo largo del estudio.

Se realizó un análisis más profundo de estos diecinueve genes únicos (diecisiete genes y dos pseudogenes). Todos los sitios CpG de cada uno de estos genes, así como las secuencias flanqueadas, se obruvieron del genoma de la UCSC y se comprobó si se detectaban en el Methylation EPIC Bead. Se analizaron los sitios CpG descritos en cada gen para investigar hasta qué punto estos genes presentan múltiples sitios CpG diferentes en nuestra población.

Catorce de los diecinueve genes identificados (73,6%) mostraron sitios CpG múltiples y significativos. El gen con la mayor diferencia de metilación fue el CYP2E1 con el 50% de los sitios CpG obtenidos metilados de forma diferente en el MHO estable y el MHO inestable, seguido del HLA-DRB1 (33%), ZBTB45 (16%), HOOK3(14%), PLCZ1 (14%), SLC1A1 (12%), MUC2 (12%), ZFPM2 (12. 5%) y HLA-DQB2 (8%), y se identificaron varias secuencias flanqueadas como diferencialmente metiladas en MUC2. Ninguna de las secuencias flanqueadas se encontró significativamente metilada de forma diferencial en el resto de los genes. Los sitios CpG diferencialmente metilados en estos genes se muestran en la Tabla 3.

Biomarcador potencial de transición al estado no saludable

Se realizó una regresión logística por pasos sucesivos hacia atrás utilizando todos los sitios metilados para evaluar el poder de predicción de la diferente metilación en dichos sitios. El modelo final seleccionó dos sitios como los mejores marcadores para predecir el deterioro del MHO estable a un fenotipo no saludable. Así, un mayor nivel de metilación en el sitio cg20707527 en el gen ZFPM2 podría tener un efecto protector contra la progresión a MUO (OR: 0,21, 95%CI (0,067-0,667), p < 0. 0001); por el contrario, un mayor nivel de metilación del sitio cg11445109 en el gen CYP2E1 aumentaría la progresión del paciente a MUO (OR: 2,72, 95%CI (1,094-6,796), p < 0,0014). Como los niveles iniciales de triglicéridos eran significativamente diferentes, esta variable también se incluyó en el modelo; sin embargo, no fueron estadísticamente significativos.

Análisis de enriquecimiento

Los 26 sitios CpG diferencialmente metilados seleccionados a través de la doble selección PCA se anotaron mediante un análisis GO y sus funciones fueron clasificadas por procesos biológicos, función molecular y componentes celulares utilizando un análisis de enriquecimiento. Los 10 términos GO más importantes clasificados en procesos biológicos, funciones moleculares y componentes celulares se ilustran en la Figura 5. Los procesos biológicos se mostraron vinculados al proceso metabólico de una amplia variedad de sustratos como el compuesto halógeno, el benceno, el monoterpenoide, etc. Los procesos no relacionados con el metabolismo fueron el transporte de proteínas, la presentación de antígenos y la regulación del calcio citosólico. Mientras tanto, los componentes celulares se asociaron principalmente con el transporte entre membranas, especialmente el transporte de Golgi o las vesículas recubiertas de clatrina (Tabla 4).

Análisis de rutas

Por último, se utilizaron análisis de rutas para evaluar las rutas biológicas implicadas en las diferencias entre el estado de metilación en los pacientes con MHO estable y MHO inestable relacionadas con los 26 sitios CpG identificados en la selección del doble PCA. Los procesos inmunomediados podrían desempeñar un papel en la progresión hacia el estado no saludable, teniendo en cuenta que rutas específicas como la activación Th1 y Th2, la presentación de antígenos y la señalización del rechazo del aloinjerto mostraron estar hipermetiladas en la MHO estable (figura 3).

Tabla 3: sitios CpG diferencialmente metilados en el análisis en profundidad de los genes identificados en la doble selección PCA.

Tabla 4: Anotaciones de Ontología Génica de los 26 sitios CpG diferencialmente metilados.

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Claims (5)

REIVINDICACIONES

1. Método de predicción de progresión de obesidad metabólicamente sana a obesidad metabólicamente no sana que comprende detectar el estado de metilación del sitio CpG cg20707527 en el gen ZFPM2 y/o el sitio CpG cg11445109 en el gen CYP2E1, donde una menor metilación en el sitio CpG cg20707527 y una mayor metilación en el sitio CpG con respecto a los niveles de metilación de un individuo con obesidad metabólicamente sana predice la progresión de obesidad metabólicamente sana a obesidad metabólicamente no sana

2. Método de predicción de acuerdo con la reivindicación anterior que comprende detectar el estado de metilación de 10 sitios CpG asociados a 6 genes y 2 pseudogenes, siendo los sitios CpG:

- cg20707527 y cg15084585 en el gen ZFPM2,

- cg20022036 en el gen HLA-DRB1,

- cg26805839 en el gen SLC1A1,

- cg11445109 y cg05194426 en el gen CYP2E1

- cg07180987 en el gen HLA-DQB2

- cg07458466 en el gen PLCZ1

- cg20239921 en el pseudogen DTX2P1- UPK3BP1-PMS2P11 y

- cg25828445 en el pseudogen NIFKP3

donde una mayor metilación en los sitios CpG cg20707527, cg15084585, cg20022036, cg20239921, cg26805839, cg07180987 y cg07458466 con respecto a los niveles de metilación de un individuo con obesidad metabólicamente sana predice la ausencia de progresión de obesidad metabólicamente sana a obesidad metabólicamente no sana y,

donde una mayor metilación en los sitios CpG cg11445109, cg05194426, y cg25828445 con respecto a los niveles de metilación de un individuo con obesidad metabólicamente sana predice la progresión de obesidad metabólicamente sana a obesidad metabólicamente no sana

3. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde se emplea sangre periférica.

4. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el estado de metilación de los sitios CpG se determina simultáneamente.

5. Kit para para la realización del método descrito en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 a partir de una muestra de sangre periférica.